KR20230172508A - 안정성이 개선된 항-tslp fab - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 안정성이 개선된 항-TSLP Fab, 상기 Fab를 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포 및 벡터, 및 TSLP 관련 질환의 치료에서 상기 Fab를 사용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 개시내용은 개선된 안정성을 갖는 항-TSLP Fab, Fab를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 숙주 세포 및 벡터, 및 질환의 치료에 Fab를 사용하는 방법에 관한 것이다.
흉선 기질 림포포이에틴(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)은 공통 y-수용체 유사 사슬에 상동성을 갖는 독특한 성분인 IL-7Ra 서브유닛 및 TSLP-R로 이루어진 이종이량체 수용체를 통해 신호를 전달하는 사이토카인이다(Pandey 등, Nat. Immunol. 2000, 1(1):59-64). TSLP는 흉선, 폐, 피부, 장, 및 편도에서의 상피 세포뿐만 아니라 기도 평활근 세포, 폐 섬유모세포 및 기질 세포에 의해 발현된다. (Edwards, 2008, Drug news & perspectives 21, 312-316; He 및 Geha, 2010, Annals of the New York Academy of Sciences 1183, 13-24; Reche 등, 2001, Journal of immunology 167, 336-343).
이들 세포는 전염증성 자극에 반응하여 TSLP를 생성하고, TSLP는 수지상 세포(Soumelis 등, 2002, Nature immunology 3, 673-680), 단핵구(Reche 등, 2001, Journal of immunology 167, 336-343) 및 비만 세포(Allakhverdi 등, 2007, The Journal of Experimental Medicine 204, 253-258)를 포함하는 다수의 선천성 면역 세포에 대한 그의 활성을 통해 알레르기성 염증 반응을 유도한다. TSLP-R 및 IL-7Ra 모두의 발현이 가장 높은 것으로 알려진 세포 집단은 골수성 수지상 세포이다 (Reche 등, 2001, Journal of immunology 167, 336-343).
TSLP는 나이브 T 세포의 증식을 촉진하고, 높은 수준의 iL-4, IL-5 및 IL-13을 발현하는 Th2 세포로의 이들의 분화를 유도할 수 있다 (Omori 및 Ziegler, 2007, Journal of immunology 178, 1396-1404). 높은 수준의 TSLP 발현이 천식 폐 상피 세포 및 만성 아토피 피부염 병태에서 발견되었으며, 이는 알레르기성 염증에서 TSLP에 대한 역할을 시사한다 (Ziegler 및 Artis, 2010, Nature immunology 11, 289-293). 보다 최근의 증거는 TSLP가 Thl7 세포의 분화 및 Thl7-유도된 염증 과정에 있음을 시사한다 (Hartgring 등, 2011, Arthritis and rheumatism 63, 1878-1887; Tanaka 등, 2009, Clinical and experimental allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 39, 89-100; Wu 등, 2014, Journal of molecular and cellular cardiology 76, 33-45). 만성 알레르기성 (아토피성) 천식은 종종 Th2-유형 염증을 특징으로 하는 반면, 비-알레르기성 천식 염증은 주로 혼합 Thl 및 Thl7 사이토카인 환경을 갖는 호중구성 염증이다. 천식에서 만성 염증의 결과는 기관지 과반응성(BHR), 점액 과생성, 기도벽 리모델링 및 기도 좁아짐(Lambrecht 및 Hammad, 2014, Nature immunology 16, 45-56)을 포함한다. TSLP는 알레르기성 천식 반응의 개시 및 유지/증진에 관여하는 것으로 나타났다 (Wang 등, 2006, Immunity 24, 827-838). 보다 최근에, TSLP 신호전달은 또한 국소 항원 공격에 대한 기억 T-세포의 회상 반응에 필요한 것으로 밝혀졌다 (Wang 등, 2015, The Journal of allergy and clinical immunology 135, 781-791 e783).
테제펠루맙은 TSLP에 결합하는 인간 면역글로불린 G2 (lgG2) 모노클로날 항체 (mAb)로서, TSLP 수용체 복합체와의 상호작용을 방지한다. 경증의 아토피성 천식 환자에서 개념 증명 연구는 테제펠루맙이 초기 및 후기 천식 반응을 억제하고 흡입 알레르겐 공격 후 Th2 염증의 바이오마커를 억제한다는 것을 보여주었다. 중증의 통제되지 않는 천식을 가진 성인 및 청소년의 테제펠루맙을 평가하기 위한 연구 (NCT03347279)는 최근에 결론이 내려졌고 연간 천식 악화 속도 (AERR)를 감소시키는 1차 종점을 충족시켰다 [시간 프레임: 52주까지의 기준선].
CSJ117은 건조 분말 흡입기를 통해 폐로 전달하기 위해 경질 캡슐에 담긴 PulmoSol™ 조작 분말로서 제제화된, 인간 흉선 기질 림포포이에틴(TSLP)에 대한 강력한 중화 항체 단편이다 (Gauvrea 등 ERS 2020 56: Suppl. 64, 3690).
따라서 천식과 같은 염증성 질환의 치료에서 TSLP를 표적화하는 것은 임상적으로 검증되었다. 천식 환자의 대다수가 흡입을 통한 자가-의약에 사용된다는 점을 고려할 때, 흡입을 통한 TSLP 길항제의 투여는 흥미롭다.
본 개시내용은 특히 이러한 신생 부류의 의약에서의 흡입을 통한 기존의 치료 옵션을 기초로 구축되는 것을 목적으로 한다.
본 개시내용은 놀랍게도 테제펠루맙의 CH1 도메인에서 다수의 돌연변이를 만들고 분자를 Fab로 전환시키는 것이 가속화된 안정성 조건 하에서 (1 x PBS 중, 45 ℃에서 2주간) 응집을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 1 x PBS 중의 가속화된 안정성 연구는 때때로 생체내 혈청 안정성의 대략적인 근사치로 사용된다.
치료를 위해 투여되는 대부분의 항체는 14일(2주)을 초과하는 반감기를 갖는다. Fab는 크기가 더 작고 에어로졸화 후 폐 내 생체 분포가 향상된다는 점을 고려하면 흡입 전달을 위해 mAb보다 바람직할 수 있다. 흡입을 통해 투여됨에도 불구하고, 대부분의 활성제가 궁극적으로 혈청으로 분할될 수 있기 때문에, 혈청 안정성은 여전히 폐에 투여되는 단백질-기반 길항제에 대한 관련 인자이다. 따라서, 예시적인 Fab의 개선된 가속된 안정성은 TSLP 관련 병태의 치료에 사용될 때 유리할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 Fab를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 Fab를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 Fab를 암호화하는 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 Fab의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한 본원에 기재된 Fab를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 요법에서 본원에 기재된 Fab의 사용을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 요법에 사용하기 위한 의약의 제조에서 본원에 기재된 Fab의 사용을 제공한다.
도 1은 4℃(A)및 45℃(B)에서 1 x PBS 중 ~ 1 mg/ml 테제펠루맙의 2주 가속화된 안정성 분석을 보여준다. 플롯은 할당된 시간 동안 각 온도에서 배양한 후 테제펠루맙의 HP-SEC 트레이스를 보여준다. 표 (C)는 IgG1 이소타입 대조군 NIP228의 결과와 함께, 테제펠루맙에 대한 % 단량체 손실 및 % 응집체 형성을 명시한다.
도 2는 4℃(A)및 45℃(B)에서 1 x PBS 중 ~0.8 mg/ml Fab1의 2주 가속화된 안정성 분석을 보여준다. 플롯은 할당된 시간 동안 각각의 온도에서 인큐베이션 후의 Fab1의 HP-SEC 트레이스를 나타낸다. 표 (C)는 Fab 이소타입 대조군 R347의 결과와 함께, Fab1에 대한 %단량체 손실 및 %응집체 형성을 명시한다.
도 3은 KinExA에 의해 측정된 hu TSLP에 대한 Fab 1 결합을 보여준다.
도 4는 KinExA에 의해 측정된 cyno TSLP에 대한 Fab1 결합을 보여준다
도 5는 HTRF 분석을 이용한 측정으로서 hu TSLP에 대한 Fab 1의 경쟁적 결합을 보여준다
도 6은 Fab 1이 TSLP로 공격받은 PBMC로부터의 CCL17 방출을 억제함을 보여준다
도 2는 4℃(A)및 45℃(B)에서 1 x PBS 중 ~0.8 mg/ml Fab1의 2주 가속화된 안정성 분석을 보여준다. 플롯은 할당된 시간 동안 각각의 온도에서 인큐베이션 후의 Fab1의 HP-SEC 트레이스를 나타낸다. 표 (C)는 Fab 이소타입 대조군 R347의 결과와 함께, Fab1에 대한 %단량체 손실 및 %응집체 형성을 명시한다.
도 3은 KinExA에 의해 측정된 hu TSLP에 대한 Fab 1 결합을 보여준다.
도 4는 KinExA에 의해 측정된 cyno TSLP에 대한 Fab1 결합을 보여준다
도 5는 HTRF 분석을 이용한 측정으로서 hu TSLP에 대한 Fab 1의 경쟁적 결합을 보여준다
도 6은 Fab 1이 TSLP로 공격받은 PBMC로부터의 CCL17 방출을 억제함을 보여준다
정의
용어 "a" 또는 "an" 독립체는 그 독립체 중 하나 이상을 지칭하고, 예를 들어 "항-TSLP Fab"는 하나 이상의 항-TSLP Fab을 나타내는 것으로 이해된다는 것에 유의해야 한다.
"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하지만 이에 국한되지 않는 다양한 항체 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 특히 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 (dAb), 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, CDR 이식된 항체, 단일 쇄 항체 (scFv), 단일 쇄 항체 단편, 키메라 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 선형 항체; 킬레이팅 재조합 항체, 트리바디 또는 바이바디, 인트라바디, 나노바디, 소형 모듈 면역약학적 (SMIP), 항원 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질, 단일 도메인 항체 (낙타화 항체 포함), VHH 함유 항체, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함하는 항체의 항원 결합 부분, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 유지하는 한, 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부, 예컨대 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 CDR 서열을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.
"Fab"는 VH-CH1 및 VL-CL 쌍을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 상기 용어는 전형적으로 높은 서열 가변성과 관련된 서열 영역 외부의 Fab 내에서 아미노산 치환, 결실 또는 삽입과 같은 비 표준 서열 변이체를 포함하는 Fab를 포함한다. 예를 들어, Fab 변이체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역 또는 CH1 또는 CL 도메인에서 비 표준 아미노산 또는 서열 변화를 포함하는 Fab를 포함한다. 이러한 변화는 상기 Fab 변이체를 이종 모이어티에 접합시키는데 사용될 수 있는 비정규 시스테인 또는 다른 유도체화 가능한 아미노산의 존재를 포함할 수 있다. 다른 이러한 변화는 2개의 도메인 사이에서 공유적으로 가교되는 폴리펩티드 서열인 비정규 폴리펩티드 링커의 존재를 포함한다. 예를 들어, Fab 변이체는 Fab가 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현될 수 있도록 CH1 도메인을 VL 도메인에, 또는 CL 도메인을 VH 도메인에 공유 부착시키는 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
"숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 구축되고 적어도 하나의 이종 유전자를 암호화하는 벡터를 보유하는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 항-TSLP Fab의 단리를 위한 공정의 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 명확하게 특정되지 않는 한 항-TSLP Fab의 공급원을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 즉, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 스핀 다운된 전체 세포 또는 배지 및 현탁된 세포 둘 다를 함유하는 세포 배양물로부터 일어날 수 있다.
"단리된"은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물을 지칭한다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 이들이 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
"제약 조성물"은 활성 성분 (예를 들어, 본원에 개시된 항-TSLP Fab)의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태의 제제를 지칭하고, 조성물이 투여될 대상체에 허용 가능하지 않게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 멸균될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여, 본원에서 언급된 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
"재조합" 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 재조합 방식으로 생산된 폴리펩티드들 및 조작된 숙주 세포들에서 발현된 단백질들은 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주되며, 이는 임의의 적절한 기술에 의해 분리, 분별, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드들이다. 본원에 개시된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 제조될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 단백질 및 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다.
"대상체" 또는 "개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 대상체가 '건강한 대상체'로 정의되는 경우를 제외하고 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 대상, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간; 가축; 농장 동물; 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 쥐, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 대상체는 인간이다.
"처치" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 예방적 조치를 모두 지칭하며, 여기서 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 장애를 방지하거나 늦추기(완화하기) 위한 것이다. 유익하거나 또는 원하는 임상 결과는, 검출가능하거나 또는 검출가능하지 않은, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 완화(부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이들로 국한되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료를 필요로 하는 이들은 이미 병태 또는 장애를 갖는 것뿐만 아니라 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 것들 또는 병태 또는 장애가 방지되어야 하는 것들을 포함한다.
"치료적 유효량"은 본원에 개시된 항-TSLP Fab 또는 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "처치"하는데 효과적인 다른 약물의 양을 지칭한다.
"TSLP"는 흉선 기질 림포포이에틴을 지칭한다. TSLP는 IL-7Ra 서브유닛 및 TSLP-R로 구성된 이종이량체 수용체를 통해 신호를 전달하는 사이토킨이며, 이는 공통 g-수용체 유사 사슬에 대한 상동성을 갖는 독특한 성분이다(Pandey 등, Nat. Immunol. 2000, l(l):59-64). TSLP는 흉선, 폐, 피부, 장 및 편도에서의 상피 세포뿐만 아니라 기도 평활근 세포, 폐 섬유모세포 및 기질 세포에 의해 발현된다 (Edwards, 2008, Drug news & perspectives 21, 312-316; He 및 Geha, 2010, Annals of the New York Academy of Sciences 1183, 13-24; Reche 등, 2001, Journal of immunology 167, 336-343). 이들 세포는 전염증성 자극에 반응하여 TSLP를 생성하고, TSLP는 수지상 세포(Soumelis 등, 2002, Nature immunology 3, 673-680), 단핵구(Reche 등, 2001, Journal of immunology 167, 336-343) 및 비만 세포(Allakhverdi 등, 2007, The Journal of Experimental Medicine 204, 253-258)를 포함하는 다수의 선천성 면역 세포에 대한 그의 활성을 통해 알레르기성 염증 반응을 유도한다. TSLP-R 및 IL-7Ra 모두의 발현이 가장 높은 것으로 알려진 세포 집단은 골수성 수지상 세포이다 (Reche 등, 2001, Journal of immunology 167, 336-343).
TSLP는 나이브 T 세포의 증식을 촉진하고, 높은 수준의 IL-4, IL-5 및 IL-13을 발현하는 Th2 세포로의 이들의 분화를 유도할 수 있다 (Omori 및 Ziegler, 2007, Journal of immunology 178, 1396-1404). 높은 수준의 TSLP 발현이 천식 폐 상피 세포 및 만성 아토피 피부염 병태에서 발견되었으며, 이는 알레르기성 염증에서 TSLP에 대한 역할을 시사한다(Ziegler 및 Artis, 2010, Nature immunology 11, 289-293). 보다 최근의 증거는 TSLP가 Th17 세포의 분화 및 Th17-유도된 염증 과정과 관련되어 있음을 시사한다(Hartgring 등, 201 1, Arthritis and rheumatism 63, 1878-1887; Tanaka 등, 2009, Clinical and experimental allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 39, 89-100; Wu 등, 2014, Journal of molecular and cellular cardiology 76, 33-45). 만성 알레르기성 (아토피성) 천식은 종종 Th2 유형 염증을 특징으로 하는 반면, 비 알레르기성 천식 염증은 혼합된 Th1 및 Th17 사이토카인 환경을 가진 주로 호중구성을 나타낸다. 천식에서 만성 염증의 결과는 기관지 과반응성(BHR), 점액 과생성, 기도벽 리모델링 및 기도 좁아짐 (Lambrecht 및 Hammad, 2014, Nature immunology 16, 45-56)을 포함한다. TSLP는 알레르기성 천식 반응의 개시 및 유지/증진에 관여하는 것으로 나타났다(Wang 등, 2006, Immunity 24, 827-838). 보다 최근에, TSLP 신호전달은 또한 국소 항원 공격에 대한 기억 T-세포의 회상 반응에 요구되는 것으로 밝혀졌다 (Wang 등, 2015, The Journal of allergy and clinical immunology 135, 781-791 e783).
"벡터"는 숙주 세포에서 관심 있는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있고, 일부 측면에서는 발현시킬 수 있는 구조체를 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
항-TSLP Fab
본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab를 제공한다.
실시예는 이들 서열 특징을 갖는 Fab가 유사한 VH 및 VL 도메인 서열을 갖는 전장 항체에 비해 가속화된 안정성 연구 조건 하에서 개선된 안정성을 갖는다는 것을 보여준다. 개선된 안정성을 갖는 예시적인 Fab는 본원에서 Fab 1로 지칭된다.
일부 경우에, 본 개시내용은 Fab 1과 동등한 안정성을 갖는 Fab를 제공한다. 일부 경우에, 동등한 안정성은 가속화된 안정성 연구 조건 하에서의 동등한 안정성이다. 일부 경우에, 가속화된 안정성 연구 조건은 1 X PBS 중 45℃에서 2주 동안이다. 일부 경우에, 가속화된 연구 조건 하에서의 Fab의 농도는 ~0.8 mg/ml이다.
일부 경우에, Fab는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함한다. 일부 예에서, Fab는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함한다. 일부 경우에, Fab는 Fab 1과 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, Fab는 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, Fab는 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, Fab는 Fab 1과 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, Fab는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, Fab는 Fab 1과 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, Fab는 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, Fab는 Fab 1과 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, 본 개시내용은 서열번호 1의 중쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 경우에, 본 개시내용은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab 1에 대한 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab 1에 대한 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab 1에 대한 동등한 안정성을 포함한다.
일부 경우에, 항원 결합 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다. 일부 경우에, 항원 결합 단편은 Fab 1에 대한 동등한 안정성을 포함한다.
뉴클레오티드
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 Fab 및 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 (또는 "폴리뉴클레오티드")을 제공한다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 본원에 기재된 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, Fab의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있는 경우, 항-TSLP Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있으며 (예를 들어, Kutmeier 등, Bio Techniques 17:242 (1994)에 기재된 바와 같음), 이는 간단히, 항-TSLP Fab를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 및 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
대안적으로, 항-TSLP Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원의 핵산으로부터 생성될 수 있다. Fab를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론이 이용 가능하지 않지만 Fab의 서열이 공지되어 있는 경우, Fab를 암호화하는 핵산은 예를 들어, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 또는 특정 관심 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 화학적으로 합성되거나 또는 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 이어서, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당업계에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
Fab의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 그의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열의 조작을 위해 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등(예를 들어, Sambrook 등 (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 Ausubel 등, eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)에 기재된 기술 참조, 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)을 사용하여 상이한 아미노산 서열을 갖는 Fab를 생성하기 위해, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 생성하기 위해 조작될 수 있다.
Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 구성될 수 있으며, 이는 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있다. 예를 들어, 항-TSLP Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는, 보다 전형적으로, 이중 가닥일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합물로 구성될 수 있다. 또한, 상기 Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 항-TSLP Fab를 인암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 안정성 또는 다른 이유로 하나 이상의 변형된 염기 또는 변형된 DNA 또는 RNA 골격을 함유할 수 있다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 특이한 염기를 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA에 대해 이루어질 수 있으며, 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
면역글로불린(예를 들어, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)으로부터 유래된 폴리펩티드의 비 천연 변이체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는, 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 암호화된 단백질 내로 도입되도록 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기술, 예컨대 부위 지정 돌연변이유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비 필수적 아미노산 잔기에서 이루어진다.
제조 방법
항-TSLP Fab 또는 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 목적하는 양의 Fab를 생성하는데 사용될 수 있는 숙주 세포 내로 도입되기 위해 발현 벡터 내에 삽입된다. 이와 같이, 본원에 정의된 Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 포함된다.
Fab 또는 항원 결합 단편의 재조합 발현은 Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축을 필요로 한다. 일단 본 개시내용의 Fab를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, Fab의 생성을 위한 벡터는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.
Fab를 암호화하는 DNA 서열은 공지된 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 폴리머라제를 사용하여 동시에 또는 별도로 제조할 수 있다. PCR은 컨센서스 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 DNA 및 아미노산 서열에 기초한 보다 특이적인 프라이머에 의해 개시될 수 있다. PCR은 또한 항체 가변 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 클론을 단리하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우, 라이브러리는 컨센서스 프라이머 또는 보다 큰 상동성 프로브, 예컨대 마우스 불변 영역 프로브에 의해 스크리닝될 수 있다.
따라서, Fab 암호화 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 기재된다. 당업자에게 잘 알려진 방법은 항-TSLP Fab 암호화 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 생체외 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 개시내용의 Fab를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.
본 개시의 목적을 위해, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 부류의 벡터는 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 (RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론계의 사용을 포함한다. 추가적으로, DNA를 그들의 염색체로 통합시킨 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 영양요구성 숙주에 대한 원영양체, 살생물제 내성 (예를 들어, 항생제) 또는 구리와 같은 중금속에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나, 또는 공형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. mRNA의 최적 합성을 위해 추가 요소가 또한 필요할 수 있다. 이들 요소는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
진핵 세포에서 발현을 유도할 수 있는 임의의 발현 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예는 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF 1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, 및 pZeoSV2 (캘리포니아 샌디에고 소재의 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 입수 가능함), 및 플라스미드 pCI (위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega)로부터 입수 가능함)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 일반적으로, 많은 수의 형질전환된 세포를 발현하는 세포에 대해 스크리닝한다.
보다 일반적으로, 일단 Fab를 암호화하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포 내로의 플라스미드의 도입은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있으며, 이들은 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 외피보유 DNA와의 세포 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스로의 감염을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vector" in Vectors, ed. Rodriguez 및 Denhardt (Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472을 참조한다. 전형적으로, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 이루어진다. 발현 구조체를 포함하는 숙주 세포를 항-TSLP Fab의 생산에 적합한 조건 하에 성장시키고, 단백질 합성에 대해 분석하였다. 예시적인 분석 기술은 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사능면역분석 (RIA), 또는 형광 활성화 세포 분류기 분석 (FACS), 면역조직화학 등을 포함한다.
발현 벡터를 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에 옮긴 다음, 형질감염된 세포를 통상적인 기법에 의해 배양하여 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 항-TSLP Fab를 생성한다. 따라서, 본 개시내용은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본 개시내용의 Fab, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄, 또는 가변 중쇄 또는 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
하나의 경우에, 상기 숙주 세포를 포함하는 배양 배지가 제공된다. 하나의 경우에, 상기 배양 배지를 포함하는 발효 용기가 제공된다.
일부 경우에, 배양 배지 및 발효 용기는 본원에 정의된 Fab를 생산하는 방법을 수행하는데 적합하다.
다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에 기재된 항-TSLP Fab를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주 발현 시스템은 관심 있는 암호화 서열이 생성되고 후속적으로 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질전환되거나 형질감염될 때, 계내(in situ)에서 본 개시내용의 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균 (예를 들어, 대장균, B. 서브틸리스)과 같은 미생물; 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스, 피키아); 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포)을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다.
대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아 세포, 더욱 바람직하게는, 진핵 세포가 Fab의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간 초기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께, 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells; CHO)와 같은 포유동물 세포가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking 등, Gene 45:101 (1986); Cockett 등, Bio/Technology 8:2 (1990)).
단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 종종 포유동물 기원이다; 당업자는 그 안에서 발현될 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정할 수 있는 능력을 인정받는다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO (중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB13 (중국 햄스터 난소 세포주, DHFR 마이너스), HELA (인간 자궁경부 암종), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), VERO, BHK (아기 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610 (중국 햄스터 섬유아세포) BALBC/3T3 (마우스 섬유아세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/0 (마우스 골수종), P3 times.63-Ag3.653 (마우스 골수종), BFA-lclBPT (소 내피 세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장)을 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 숙주 세포주는 상업적 서비스인 American Tissue Culture Collection 또는 공개된 문헌으로부터 통상적으로 입수가능하다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 이러한 단백질 생성물의 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메커니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 개질 및 가공을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 1차 전사체, 글리코실화, 및 유전자 생성물의 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기구를 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.
재조합 단백질의 장기적, 고수율 생산을 위해서는, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항-TSLP Fab를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장하도록 허용될 수 있고, 그 후 선택 배지로 스위칭된다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정하게 통합시키고, 이어서 클로닝되고 세포주 내로 확장될 수 있는 초점을 형성하도록 성장하게 한다. 이 방법은 유리하게는 항-TSLP Fab를 안정적으로 발현하는 세포주들을 조작하는데 사용될 수 있다.
단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler 등, Cell 13:223 (1977)), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska 및 Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992))를 포함하지만 이에 국한되지 않는 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있고, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy 등, Cell 22:817 (1980)) 유전자가 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성은 다음 유전자에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler 등, Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1521 (1981)); 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt (Mulligan 및 Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2012 (1981)); 아미노글리코사이드 G-418에 저항성을 부여하는 neo Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu 및 Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan 및 Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 13(5): 155-215 (May, 1993); 및 하이그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 hygro (Santerre 등, Gene 30: 141 (1984)). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 분야에 일반적으로 알려진 방법은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 Ausubel 등 (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli 등 (eds) (1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 및 13; Colberre-Garapin 등 (1981) J. Mol. Biol. 150: 1에 기재되어 있다.
Fab의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (검토를 위해, Bebbington 및 Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press, NY) Vol. 3 참고. 항-TSLP Fab를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭될 수 있는 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항-TSLP Fab 유전자와 관련되기 때문에, 항-TSLP Fab의 생성도 증가할 것이다 (Crouse et ah, Mol. Cell. Biol. 3:251 (1983)).
생체외 생산은 원하는 폴리펩티드를 대량으로 제공하기 위해 스케일 업(scale-up)을 허용한다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포 배양을 위한 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 에어리프트 반응기 또는 연속 교반기 반응기에서 균질한 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐, 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지에서 고정화되거나 포획된 세포 배양을 포함한다. 필요한 경우 및/또는 목적하는 경우, 폴리펩티드의 용액은 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE 셀룰로스 상에서의 크로마토그래피 또는 (면역) 친화성 크로마토그래피로 정제될 수 있고, 예를 들어 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적인 생합성 후 또는 본원에 기재된 HIC 크로마토그래피 단계 전 또는 후에 정제될 수 있다.
본 개시내용의 항-TSLP Fab를 암호화하는 유전자는 또한 비-포유동물 세포, 예컨대 곤충, 박테리아 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 핵산을 쉽게 흡수하는 박테리아는 대장균 또는 살모넬라 균주와 같은 장내세균과; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 세균과; 폐렴구균(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)의 구성원을 포함한다. 박테리아에서 발현될 때, 이종 폴리펩티드는 전형적으로 봉입체의 일부가 된다는 것이 추가로 인정되어야 할 것이다.\ 이종 폴리펩티드는 단리되고, 정제된 다음, 기능성 분자로 조립되어야 한다. 항체의 4가 형태가 바람직한 경우, 서브유닛은 이어서 4가 항체로 자가 조립될 것이다 (WO 02/096948 A2).
박테리아 시스템에서, 발현되는 항-TSLP Fab에 대해 의도된 용도에 따라 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 단백질이 생산되어야 하는 경우, Fab의 약제학적 조성물의 생성을 위해, 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터에는 대장균 발현 벡터 pUR278 (Ruther 등, EMBO J. 2: 1791 (1983)) (여기서, 암호화 서열은 융합 단백질이 생성되도록 lacZ 암호화 영역과 함께 프레임 내 벡터에 개별적으로 결찰될 수 있음); pIN 벡터 (Inouye 및 Inouye, Nucleic Acids Res. iJ:3101-3109 (1985); Van Heeke 및 Schuster, J. Biol Chem. 24:5503-5509 (1989)); 이와 유사한 것이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. pGEX 벡터는 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 흡착 및 결합한 후 자유 글루타티온의 존재 하에서 용출함으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 잔기로부터 방출될 수 있도록 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 설계된다.
원핵생물 외에도 진핵생물 미생물이 사용될 수도 있다. 많은 다른 균주, 예를 들어 피키아 파스 톤(Pichia pas tons)이 일반적으로 이용가능하지만 사카로마이세스 세레비지애(saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 빵 효모가 진핵 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다.
사카로마이세스 내에서의 발현을 위하여, 플라스미드 YRp7을 통상적으로 사용하며, 예를 들면 (Stinchcomb et ah, Nature 282:39 (1979); Kingsman 등, Gene 7:141 (1979); Tschmper 등, Gene 10:151 (1980)) 등을 사용한다. 이 플라스미드는 이미 TRP1 유전자를 함유하고 있으며, 이는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC 제44076호 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 병태의 존재는 트립토판의 부재하에 성장에 의한 변형을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다.
곤충 시스템에서는 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 일반적으로 AcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)를 사용한다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 자란다. Fab 암호화 서열은 개별적으로 바이러스의 비필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자) 내로 클로닝될 수 있고, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓일 수 있다.
본 개시내용의 Fab가 재조합적으로 발현되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 이후의 특이적 항원에 대한 친화도, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 항체의 친화도를 증가시키기 위한 바람직한 방법은 미국 특허 출원 공개 제20020123057A1호에 개시되어 있다.
치료 방법
본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 항-TSLP Fab 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 일부 경우에, 상기 방법은 TSLP-관련 병태의 치료를 위한 것이다.
본 개시내용은 또한 요법에서 사용하기 위한 본원에 기재된 항-TSLP Fab 또는 제약 조성물을 제공한다. 일부 경우에, 요법은 TSLP-관련 병태의 치료이다.
본 개시내용은 또한 질환의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서의 항-TSLP Fab 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다. 일부 경우에, 질환은 TSLP-관련 병태이다.
본 개시내용은 또한 요법에서 항-TSLP Fab 또는 제약 조성물의 용도를 제공한다. 일부 경우에, 요법은 TSLP-관련 병태의 치료이다.
일부 경우에, TSLP-관련 병태는 TSLP-관련 염증 병태이다. 일부 예에서, TSLP 관련 염증 병태은 천식, 패혈증, 패혈성 쇼크, 아토피 피부염, 알레르기성 비염, 알레르기성 비부비동염, 알레르기성 결막염, 호산구성 식도염, 류마티스성 관절염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 천식, COPD 중첩 증후군(ACOS), 만성 기관지염, 폐기종, 비폴립이 있거나 없는 만성 비부비동염, 혈관염, GvHD, 포도막염, 만성 특발성 두드러기, 부비동염 또는 췌장염으로부터 선택된다.
일부 경우에, TSLP-관련 염증 병태는 천식이다.
천식은 가변적이고 반복되는 증상, 가역적인 기류 폐쇄 및 기관지 경련을 특징으로 하는 복잡한 이종성 기도 염증성 질환이다.
천식 증상으로는 천명, 기침, 가슴 조임, 호흡 곤란 등이 있을 수 있다. 알레르겐이나 자극물에 노출되면 증상이 촉발될 수 있다. 천식은 알레르겐(아토피)에 의한 증상 유무에 따라 아토피(외인성) 또는 비아토피(내인성)로 구분할 수 있다. 급성 천식 악화는 일반적으로 "천식 발작"으로 지칭된다. 천식 발작 동안 발생할 수 있는 추가 징후로는 호흡의 보조근(흉골유양증 및 목의 비늘근)의 사용, 역설적인 맥박(들숨 동안 더 약하고 날숨 동안 더 강한 맥박) 및 흉부의 과도한 팽창이 있을 수 있다. 피부 및 손발톱의 푸른색은 산소 부족으로 인해 발생할 수 있다. 이러한 긍정적인 치료적 반응에 더하여, 항-TSLP Fab로 치료를 받고 있는 대상체는 질환과 관련된 이들 증상 중 하나이상에서 유익한 효과 또는 개선을 경험할 수 있다.
임상 반응은 예컨대 자기 공명 영상화 (MRI) 스캔, x-방사선 영상화, 컴퓨터 단층촬영 (CT) 스캔, 유세포 분석 또는 형광 활성화 세포 분류기 (FACS) 분석, 조직학, 전체 병리학, 및 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출가능한 변화를 포함하지만 이에 국한되지 않는, 혈액 화학, 및 이와 유사한 스크리닝 기술을 사용하여 평가될 수 있다.
본원에 개시된 Fab는 염증성 질환, 예를 들어 천식 또는 COPD의 치료를 위해 유용한 것으로 공지되거나, 사용되었거나 현재 사용 중인 임의의 작용제 또는 작용제의 병용물을 포함하는 염증성 질환에 대한 임의의 공지된 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 본원에 기술된 Fab와 함께 투여될 수 있는 예시적인 활성제에는 흡입 코르티코스테로이드(ICS), 기관지 확장제(지속성 베타 작용제(LABA), 지속성 항무스카린 작용제(LAMA), 속효성 베타 작용제(SABA) 및 무스카린성 β2 작용제(MABA) 포함), 항히스타민제, 항틸레코트리엔, PDE-4 억제제, 야누스 키나제 억제제 및 포스포이노시티드 3-키나제 억제제가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
용어 "병용물(combination)"은 하나의 투여 단위 형태의 고정된 병용물 또는 병용 투여를 지칭하며, 여기서 항-TSLP Fab 및 병용 파트너(예를 들어, "치료제" 또는 "공동제제"로도 지칭되는 다른 약물)는 동시에 또는 시간 간격 내에 개별적으로 독립적으로 투여될 수 있으며, 특히 이들 시간 간격은 병용 파트너가 협력적, 예를 들어, 상승적 효과를 나타내는 것을 허용한다. 단일 구성요소는 키트에 또는 별도로 포장될 수 있다. 성분(예를 들면, 분말 또는 액체) 중 하나 또는 둘 모두는 투여 전에 원하는 용량으로 재구성 또는 희석될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "공동 투여(co-administration)" 또는 "병용 투여(combined administration)" 등은 필요한 단일 대상(예를 들어, 환자)에 대한 선택된 병용 파트너의 투여를 포함하는 것을 의미하며, 제제가 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되지 않는 치료 요법을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용하는 용어 "약제학적 병용물"이란 하나 이상의 치료제를 혼합 또는 조합하여 얻어지는 산물을 의미하며, 치료제의 고정 및 비고정 병용물을 모두 포함하는 것을 의미한다. "고정적 병용물"이란 치료제, 예를 들어 항-TSLP Fab 및 병용 파트너가 모두 단일 개체 또는 투여량의 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 말한다. 용어 "비-고정적 병용물"은 치료제, 예를 들면, 항-TSLP Fab 및 병용 파트너 둘 모두가 특정한 시간 제한 없이 동시에, 동시에 또는 순차적으로 별개의 엔티티로서 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 이러한 투여는 환자의 체내에서 두 화합물의 치료적 유효 수준을 제공한다. 후자는 칵테일 요법, 예를 들면 3종 이상의 치료제의 투여에도 적용된다.
용어 "병용 요법"은 본 발명에 기재된 치료 상태 또는 장애를 치료하기 위해 2 이상의 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시 방식으로, 예컨대 고정된 비율의 활성 성분을 갖는 단일 캡슐에서 이러한 치료제의 공동-투여를 포함한다. 대안적으로, 이러한 투여는 각각의 활성 성분에 대해 다수의, 또는 별개의 용기(예를 들어, 정제, 캡슐, 분말 및 액체)에서 공동 투여를 포함한다. 분말 및/또는 액체는 투여 전에 원하는 용량으로 재구성 또는 희석될 수 있다. 또한, 이러한 투여는 대략 동시에 또는 상이한 시간에 순차적 방식으로 각각의 유형의 치료제를 사용하는 것을 포함한다. 어느 경우든, 치료 요법은 본원에 기재된 상태 또는 장애를 치료하는 데 있어서 약물 병용물의 유익한 효과를 제공할 것이다.
조성물
본원에 개시된 의학적 용도 및 방법에서의 항 TSLP Fab는 제약 조성물의 형태로 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에서 '항-TSLP Fab/상기 항-TSLP Fab'에 대한 임의의 언급은 또한 항-TSLP Fab/상기 항-TSLP Fab를 포함하는 약제학적 조성물을 지칭할 수 있다.
일부 경우에, 항-TSLP Fab 또는 그의 제약 조성물은 치료 효과를 생성하기에 충분한 양으로 상기 언급된 치료/의학적 사용 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.
일부 경우에, 항-TSLP Fab 또는 이의 약제학적 조성물은 공지된 기술에 따라 항-TSLP Fab를 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 배합함으로써 제조된 통상의 투여 형태로 이러한 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다.
제약상 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 성질은 이것이 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수에 의해 좌우된다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
일부 경우에, 약제학적 조성물은 생리식염수, 비독성 완충액, 보존제 등과 같은 약제학적으로 허용되는, 비독성, 멸균 담체를 포함하도록 제형화된다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에 사용하기에 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)에 기재되어 있다.
일부 경우에, 항-TSLP Fab 또는 그의 제약 조성물의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소에 의한 것일 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 사용되는 용어 비경구는 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다.
일부 경우에, 항-TSLP Fab 또는 그의 제약 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우에, 상기 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본원에 언급된 바와 같은 성분은 포장되어 키트 형태로 판매될 수 있다. 일부 경우에, 연관된 약제학적 조성물이 질환 또는 장애를 앓고 있거나 또는 질환 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 데 유용하다는 것을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 가질 것이다.
실시예
실시예 1
안정성 연구는 1 x PBS 중 4℃ 또는 45℃에서 테제펠루맙에 대해 수행되었다. 1 mg/ml의 테제펠루맙을 포함하는 용액을 각 조건 하에서 2주 동안 저장하였다.
결과는 D-PBS 중 45℃(도 1)에서 2주 후 10%의 단량체 손실이 관찰되었음을 보여준다. % 단량체 손실, % 응집체 및 % 단편화는 HP-SEC 크로마토그램으로부터 곡선 아래 면적 (AUC)을 정량화하여 계산하였다. 피크는 용리 부피에 기초하여 단량체, 응집물 또는 단편화 생성물로서 할당되었다. AUC는 HP SEC 분석 소프트웨어가 제공된 표준 분석 도구를 사용하여 계산할 수 있다.
CH1 도메인에 다중 돌연변이를 갖는 테제펠루맙 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 Fab를 구축하였다. 이 Fab는 본원에서 Fab 1로 지칭된다. Fab 1 안정성은 테제펠루맙에 대해 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
놀랍게도, Fab 1은 2주 동안 0.8 mg/ml로 저장시 가속화된 안정성 연구 조건 (1 x PBS 중 45℃에서) 하에 개선된 안정성 특성을 나타내었다.
실시예 2 - Fab1은 hu 및 cyno TSLP에 pM 친화도로 결합한다
BIAcore에 의해 결정된 TSLP에 대한 Fab
1
결합의 친화도
재조합 포유동물 세포-발현된 인간 및 cyno TSLP에 대한 Fab 1의 특이성 및 친화성을 Biacore 8K SPR 기구 (GE Healthcare, Little Chalfont, Bucks, UK)를 사용하여 결정하였다.
S 시리즈 C1 바이오센서 칩, 아민 커플링 키트, HEPES 완충 식염수-기반 완충액 및 재생 완충액은 GE Healthcare로부터 입수하였고 제조업체의 설명서에 따라 사용하였다. 스트렙타비딘 표면은 D-PBS로 재구성된 동결건조된 스트렙타비딘을 사용하여 제조하였다. 간단히 말해서, 스트렙타비딘을 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.5 중 4 μg mL-1로 희석하고, 표준 아민 커플링 방법에 의해 S 시리즈 C1 바이오센서 칩의 3개의 유동 세포 표면에 공유 고정시켰다. 170개의 반응 유닛(RU)의 최종 스트렙타비딘 표면이 달성되었다. 아민 커플링 시약을 또한 사용하여 고정화된 스트렙타비딘이 없는 대조군 블랭크 표면을 제조하여, 각각의 유동 셀 내에서 기준 표면으로서 작용하였다. 이어서, N-말단 태그된 비오티닐화된 TSLP (인간 및 cyno)를 각각의 스트렙타비딘 표면 상에 적정하여 포화 (Rmax)에서 100 RU 미만의 Fab1 결합을 가능하게 하였다. 낮은 수준의 분석물 결합은 특히 동역학 측정 단계 동안 사용된 비교적 빠른 50 μL min-1 분석 유속과 조합될 때 질량-수송 유도 아티팩트가 최소화되는 것을 보장하였다. 단량체화된 Fab1의 희석물 (다중 사이클 동역학) (1.25 내지 20 nM 범위의 HBS-EP+ 완충액에서의 2배 희석물)을 50 νL min-1 분석 유량으로, 결합 2분 및 10분 해리 동안 주입하였다. 최종 센서그램 세트의 이중 참조 처리를 허용하기 위해 실험 전반에 걸쳐 동일한 조건 하에서 다중 버퍼-전용 주입을 수행하였다.
10 mM 글리신 pH 1.7의 2개의 30초 펄스를 유동시킴으로써 칩 표면을 완전히 재생시켰다. 결합 친화도 및 동역학을 1:1 랭뮤어 모델을 사용하여 결정하였다.
표 1에 나타낸 결과는 Fab1이 고정화된 hu 및 cyno TSLP에 유사한 친화도 (각각 2-배 이내, 46 pM 및 88 pM)로 결합함을 입증한다.
표 1 BIAcore를 사용한 인간 및 시노몰구스 TSLP에 대한 Fab1의 친화도
결합 친화도는 동역학적 배제 분석(KinExA)에 의해 결정된다.
또한, 인간 및 cyno TSLP에 대한 Fab 1의 용액 상 결합 친화도(KD)를 KinExA 3200 기기(Sapidyne Instruments, Boise, Idaho, USA)를 사용하여 측정하고, 생성된 데이터를 KinExA Pro 소프트웨어 버전 4.1.11을 사용하여 처리하였다. KinExA 방법론이 검토되었다(Darling 및 Brault, 2004).
평형에 도달할 때까지 Fab 1을 다양한 농도의 hu 및 cyno TSLP 각각과 미리 혼합하였다 (각각의 hu 및 cyno TSLP의 적어도 12 농도는 2-배 연속 희석 방법을 사용하여 제조되었다.). 이어서, 자유 Fab 1의 양은 hu TSLP-코팅된 비드를 사용하여 자유 Fab를 포획하고, 결합되지 않은 물질을 세척하고, 시판되는 종 특이적 항체 (Alexa Fluor 647 표지된 마우스 항-인간 중쇄 및 경쇄 특이적 항체 (Jackson Immunoresearch 209-605-088))를 사용하여 결합된 Fab 1을 형광측정법으로 검출함으로써 KinExA 기기를 사용하여 측정되었다. hu TSLP에 대한 Fab 1의 KD를 hu TSLP 적정으로부터 1000 pM (채워진 다이아몬드), 500 pM (반전된 채워진 삼각형) 또는 40 pM (개방된 사각형) 고정된 Fab1 농도 용액 (도 3)으로 유도된 3개의 데이터세트에 1:1 전체 피팅함으로써 추출하였다. cyno TSLP에 대한 Fab 1의 KD를, cyno TSLP 적정으로부터 유도된 2개의 데이터세트에 대한 1:1 전체 피팅에 의해 1000 pM (채워진 다이아몬드) 또는 40 pM (개방된 정사각형) 고정된 Fab1 농도 용액 내로 추출하였다 (도 4).
각각의 hu 및 cyno TSLP 농도에서 검출된 자유 Fab 1의 양을 TSLP의 적정된 농도에 대해 플롯팅하였다(각각 도 3 및 4). KinExA 소프트웨어를 사용하여 평형 해리 상수(KD)를 계산하였다. 표 2에 나타낸 결과는 Fab1이 유리 용액에서 cyno TSLP에 결합하는 것보다 1.7배 더 높은 친화도로 인간 TSLP에 결합한다는 것을 입증한다.
표 2 KinExA를 사용한 hu 및 cyno TSLP에 대한 Fab
1
의 가용성 상 친화도
실시예 3 - Fab1 및 테제펠루맙은 유사한 결합 특성으로 TSLP에 결합한다
hu TSLP에 대한 Fab 1의 결합 특성을 테제펠루맙과 직접 비교하였다.
Fab 1의 생체외 결합 효능은 균질한 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 균질한 시간 분해 형광 (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF®, Cisbio International) 기반 TSLP: mAb-결합 분석을 사용하여 결정되었다. 스트렙타비딘 크립테이트는 비오티닐화된 TSLP의 검출을 위해 사용되었다. 간략히 설명하자면 표지되지 않은 Fab 1의 샘플을 HTRF 분석으로 적정하여 비오티닐화된 His-Avi hu TSLP에 대한 결합에 대해 DyLight 표지된 테제펠루맙과 경쟁하였다. 경쟁 분석은 또한 양성 대조군으로서 표지되지 않은 테제펠루맙 및 DyLight 표지된 테제펠루맙을 사용하여 수행되었다.
결과는 Fab 1이 테제팔루맙과 huTSLP와의 결합에 대해 경쟁하고, 테제팔루맙과 유사한 효능으로 hu TSLP와 결합함을 보여준다 (IC50: Fab1- 0.38nM; 테제팔루맙 - 0.23nM - 도 5).
실시예 4 - Fab 1은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분석에서 TSLP 활성을 중화시킨다
다음으로, Fab 1로 처리시 PBMC로부터의 TSLP-유도된 CCL17 방출을 측정함으로써 1차 세포 분석에서 TSLP에 대한 Fab 1 결합이 기능적 차단 활성을 갖는지 여부가 결정되었다.
혈액은 영국 캠브리지 소재의 MedImmune에서 설립된 혈액 공여 프로그램 하에 건강한 공여자로부터 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포는 피콜 구배(ficoll gradient)를 사용하여 표준 절차에 의해 분리되었다. 간략하게, PBS(10ml 혈액:30ml PBS)로 희석된 20ml의 혈액을 15ml 피콜 상에 층화하였다. 튜브를 브레이크 없이 실온에서 40분 동안 400g에서 스핀시켰다. PBMC 층을 수집하고, 세포를 50ml PBS로 2회 세척하였다. PBMC를 혈구계수기 및 트리판 블루를 사용하여 계수하여 죽은 세포를 배제하고 배양 배지 (10% 송아지 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI)에 재현탁시킨 후 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 TSLP-결합 항체 단편 Fab1의 존재 하에 48시간 동안 TSLP (0.5ng/ml)로 자극하였다. 분석은 또한 양성 대조군으로서 TSLP-결합 항체 테제펠루맙을 사용하여 수행되었다. 48시간 후, 상청액을 제거하고 제조업체의 프로토콜에 따라 R&D 듀오세트 ELISA를 사용하여 CCL17 생산에 대해 분석했다. 3개의 독립적인 실험에서 6개의 공여체를 사용하여 실험을 수행하였다.
결과는 Fab1이 1.39 nM의 IC50으로 PBMC로부터 CCL17 생성을 억제함을 보여준다 (도 6).
서열 번호
서열번호 1 (Fab 1 중쇄)
QMQLVESGGVQPGRSLLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYCARAPQHEAFDIWGQGTMVVSSATKGPSVFPLAFSSKSTSGGGTAALGCLVKDYFPEPVSWNSSGALTSGVHTFPAVLQSSGLSSVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKKKRVEPKSCDK
서열번호 2 (Fab 1 경쇄)
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SEQUENCE LISTING
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<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FAB1 HEAVY CHAIN
<400> 1
Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
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Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
Claims (16)
- 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, Fab.
- 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, Fab.
- 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, Fab.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fab는 IgG1 Fab인, Fab.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fab는 45℃에서 적어도 2주 기간 동안 안정한, Fab.
- 제 5 항에 있어서, 상기 Fab는 1 X PBS 중 0.8 mg/ml의 농도로 안정한, Fab.
- 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fab는 1 X PBS 중 45℃에서 2주 동안 인큐베이션한 후 10% 미만의 단량체 손실을 나타내며, 상기 단량체는 HP-SEC에 의해 결정되는, Fab.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 Fab를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 Fab를 암호화하는, 핵산.
- 제9항의 핵산을 포함하는, 벡터.
- 제9항의 핵산 또는 제10항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
- 제7항의 숙주 세포를 배양하는 단계, Fab를 발현시키는 단계, 및 Fab를 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 Fab를 생산하는 방법.
- 제12항의 방법으로부터 수득가능한, Fab.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한, Fab.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TSLP 관련 병태의 치료에 사용하기 위한, Fab.
- 제15항에 있어서, 상기 TSLP 관련 병태가 천식인 것인, 사용을 위한 Fab.
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