JP2024516962A - 安定性が改善された抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ - Google Patents
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Abstract
本開示は、安定性が改善された抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ、当該Ｆａｂをコードする核酸、当該核酸を含む宿主細胞及びベクター、ならびにＴＳＬＰ関連状態の治療に当該Ｆａｂを使用する方法に関する。
Description
本開示は、安定性が改善された抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ、当該Ｆａｂをコードする核酸、当該核酸を含む宿主細胞及びベクター、ならびに疾患の治療に当該Ｆａｂを使用する方法に関する。
胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）は、ＩＬ－７Ｒａサブユニット及びＴＳＬＰ－Ｒ（一般的なｙ受容体様鎖に類似するユニークな構成要素）からなるヘテロ二量体受容体を通じてシグナルを伝達するサイトカインである。（Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１（１）：５９－６４）。ＴＳＬＰは、胸腺、肺、皮膚、腸、及び扁桃内の上皮細胞、ならびに気道平滑筋細胞、肺線維芽細胞、及び間質細胞により発現される（Ｅｄｗａｒｄｓ，２００８，Ｄｒｕｇ ｎｅｗｓ ＆ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ２１，３１２－３１６；Ｈｅ ａｎｄ Ｇｅｈａ，２０１０，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１８３，１３－２４；Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７，３３６－３４３）。
これらの細胞は、炎症性刺激に応答してＴＳＬＰを産生し、ＴＳＬＰは、複数の自然免疫細胞（樹状細胞（Ｓｏｕｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３，６７３－６８０）、単球（Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７，３３６－３４３）、及びマスト細胞（Ａｌｌａｋｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０４，２５３－２５８）を含む）に対するその活性を通じてアレルギー炎症応答を駆動する。ＴＳＬＰ－Ｒ及びＩＬ－７Ｒａの発現がともに最も高いことが知られている細胞集団は、骨髄性樹状細胞である（Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７，３３６－３４３）。
ＴＳＬＰは、ナイーブＴ細胞の増殖を促進し、それらが高レベルのＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を発現するＴｈ２細胞に分化するのを推進することができる（Ｏｍｏｒｉ ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７８，１３９６－１４０４）。喘息性肺上皮細胞及び慢性アトピー性皮膚炎病変では高レベルのＴＳＬＰ発現が見出されており、このことからＴＳＬＰのアレルギー性炎症における役割が示唆される（Ｚｉｅｇｌｅｒ ａｎｄ Ａｒｔｉｓ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１，２８９－２９３）。さらに最近のエビデンスにより、ＴＳＬＰは、Ｔｈ１７細胞の分化及びＴｈ１７駆動型炎症プロセスと関連付けられている（Ｈａｒｔｇｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ６３，１８７８－１８８７；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９，８９－１００；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ７６，３３－４５）。慢性アレルギー性（アトピー性）喘息がしばしばＴｈ２型炎症によって特徴付けられるのに対し、非アレルギー性喘息性炎症は主に、Ｔｈ１及びＴｈ１７混在サイトカイン環境を伴った好中球性である。喘息における慢性炎症の結果としては、気管支過剰反応性（ＢＨＲ）、粘液過剰産生、気道壁再形成、及び気道狭窄が挙げられる（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ ａｎｄ Ｈａｍｍａｄ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，４５－５６）。ＴＳＬＰは、アレルギー性喘息応答の開始及び維持／増強に関与することが示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４，８２７－８３８）。より最近では、ＴＳＬＰシグナル伝達は、局所抗原チャレンジに対する記憶Ｔ細胞の想起応答に必要とされることも分かっている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３５，７８１－７９１ ｅ７８３）。
テゼペルマブは、ＴＳＬＰに結合してＴＳＬＰ受容体複合体との相互作用を防止するヒト免疫グロブリンＧ２（ｌｇＧ２）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。軽度アトピー性喘息患者における概念実証試験では、テゼペルマブが、吸入アレルゲンチャレンジ後の早期及び後期の喘息応答を阻害し、Ｔｈ２炎症のバイオマーカーを抑制することが実証された。重度の制御されない喘息を有する成人及び青年の患者におけるテゼペルマブの評価試験（ＮＣＴ０３３４７２７９）が最近終了し、年率換算喘息増悪率（ＡＥＲＲ）の低減［時間枠：ベースラインから第５２週］という主要評価項目を達成した。
ＣＳＪ１１７は、ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）に対する強力な中和抗体フラグメントであり、硬質カプセル中のＰｕｌｍｏＳｏｌ（商標）操作粉末として乾燥粉末吸入器による肺への送達用に製剤化されている（Ｇａｕｖｒｅａ ｅｔ ａｌ ＥＲＳ ２０２０ ５６：Ｓｕｐｐｌ．６４，３６９０）。
そのため、喘息などの炎症性疾患の治療でＴＳＬＰを標的とすることは臨床的に検証済みである。大半の喘息患者が吸入によるセルフメディケーションに慣れていることを考慮すれば、吸入によるＴＳＬＰアンタゴニストの投与は興味深い。
本開示は、この台頭しつつある医薬分類において、既存の治療選択肢（特に吸入によるもの）を基礎に進めることを目的とする。
驚くべきことに、本開示は、テゼペルマブのＣＨ１ドメインに複数の変異を起こし、この分子をＦａｂに変換することにより、加速安定性条件下（１×ＰＢＳ中、４５℃で２週間）で凝集が低減することを見出した。１×ＰＢＳ中の加速安定性試験は、ｉｎ ｖｉｖｏ血清安定性のおおよその近似として使用されることがある。
治療用に投与される抗体の多くは、１４日（２週間）を超える半減期を有する。Ｆａｂは、ｍＡｂよりもサイズが小さく、エアロゾル化した後の肺における体内分布が改善されることを考慮すると、吸入送達用により好ましい可能性がある。吸入により投与されるとはいえ、血清安定性は、肺に投与されるタンパク質ベースアンタゴニストにとって依然意義のある因子である。そのため、例示的なＦａｂの加速安定性の改善は、ＴＳＬＰ関連状態の治療に使用する際に有利であり得る。
したがって、１つの態様において、本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載のＦａｂをコードする核酸を提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載のＦａｂの治療有効量を対象に投与することを含む治療方法を提供する。
別の態様において、本開示は、治療に使用するための本明細書に記載のＦａｂを提供する。
別の態様において、本開示は、治療における本明細書に記載のＦａｂの使用を提供する。
別の態様において、本開示は、治療に使用する医薬の製造における本明細書に記載のＦａｂの使用を提供する。
定義
「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）実体という用語は、１つ以上のその実体を指すことに留意されたい。例えば、「１つの抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ」は、１つ以上の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを表すものと理解する。
「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）実体という用語は、１つ以上のその実体を指すことに留意されたい。例えば、「１つの抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ」は、１つ以上の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを表すものと理解する。
「抗体」は最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、このような構造には、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメント（ただし、所望の抗原結合活性を示す場合に限る）が含まれる。
「抗体フラグメント」は抗体の抗原結合部分を含み、これには、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、ＣＤＲ移植抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体フラグメント、キメラ抗体、ダイアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体、キレート化組換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小型モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、シングルドメイン抗体（ラクダ化抗体を含む）、ＶＨＨ含有抗体、またはこれらのバリアントもしくは誘導体、及びポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部（例えば、１、２、３、４、５、もしくは６個のＣＤＲ配列）を含むポリペプチド（ただし、抗体が所望の生物学的活性を保持する場合に限る）が含まれる。
「Ｆａｂ」とは、ＶＨ－ＣＨ１及びＶＬ－ＣＬ対合を含む抗体フラグメントを指す。この用語は、典型的に高い配列変動性に関連する配列領域以外でＦａｂ内にノンカノニカルな配列バリアント（例えば、アミノ酸置換、欠失、または挿入）を含むＦａｂを包含する。例えば、Ｆａｂバリアントとしては、ＶＨもしくはＶＬフレームワーク領域またはＣＨ１もしくはＣＬドメインにおけるノンカノニカルなアミノ酸または配列の変化を含むＦａｂが挙げられる。このような変化は、ノンカノニカルなシステインまたは他の誘導体化可能なアミノ酸の存在を含むことがあり、これらは、当該Ｆａｂバリアントを異種部分と結合体化させるために使用することができる。他のこのような変化としては、ノンカノニカルなポリペプチドリンカー（２つのドメイン間を共有結合的に架橋するポリペプチド配列）の存在が挙げられる。例えば、Ｆａｂバリアントは、Ｆａｂを単一のポリペプチド鎖として発現させることができるようにＣＨ１ドメインをＶＬドメインにまたはＣＬドメインをＶＨドメインに共有結合させるリンカーポリペプチドを含むことができる。
「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技法を用いて構築され少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを保有する細胞を指す。組換え宿主から抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを単離するプロセスの説明において、「細胞」及び「細胞培養物」という用語は、別段の明確な指示がない限り、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂの供給源を示すために互換的に使用される。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収とは、スピンダウンした全細胞からの回収か、または培地及び浮遊細胞の両方を含む細胞培養物からの回収のいずれかを意味し得る。
「単離された」とは、自然界に見出されない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物を指す。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または粗製物には、もはや天然に見出される形態ではない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。
「医薬組成物」とは、有効成分（例えば、本明細書で開示する抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ）の生物学的活性を有効にする形態をとり、当該組成物を投与する対象にとって許容できないほど毒性である追加の構成要素を含まない調製物を指す。このような組成物は無菌であり得る。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、これにはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、もしくは塩基、及び／またはこれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド（例えば、メチル化ヌクレオチド及びそのアナログ）を含むことができる。前述の説明は、本明細書で言及される全てのポリヌクレオチド（ＲＮＡ及びＤＮＡを含む）に適用される。
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって生成されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。操作宿主細胞内で発現した組換え的に生成されたポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的において単離されているとみなされ、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブまたは組換えポリペプチドであるとみなされる。本明細書で開示するポリペプチドは、当技術分野で知られている方法を用いて組換え的に生成することができる。代替的に、本明細書で開示するタンパク質及びペプチドは、化学的に合成することができる。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、対象が「健康な対象」と定義される場合を除き、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象としては、ヒト、飼育動物、家畜、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどが挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
「治療する」または「治療」とは、治療的処置及び予防的または防止的手段の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害を防止したり遅らせたり（軽減したり）することである。有益なまたは望ましい臨床的結果としては、以下に限定されるものではないが、症状の軽減、疾患程度の減弱、疾患状態の安定化（すなわち、悪化していないこと）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、及び軽快（部分的または全体的）が挙げられ、検出可能なものも検出不可能なものも含まれる。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間に比べて生存期間を延長することも意味する場合がある。治療が必要な者としては、状態もしくは障害を既に有する者、ならびに状態もしくは障害を有する傾向にある者、または状態もしくは障害を防止する必要がある者が挙げられる。
「治療有効量」とは、対象または哺乳類の疾患または障害を「治療」するのに有効な、本明細書で開示する抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは他の薬物の量を指す。
「ＴＳＬＰ」とは、胸腺間質性リンパ球新生因子を指す。ＴＳＬＰは、ＩＬ－７Ｒａサブユニット及びＴＳＬＰ－Ｒ（一般的なｙ受容体様鎖に類似するユニークな構成要素）からなるヘテロ二量体受容体を通じてシグナルを伝達するサイトカインである。（Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１（１）：５９－６４）。ＴＳＬＰは、胸腺、肺、皮膚、腸、及び扁桃内の上皮細胞、ならびに気道平滑筋細胞、肺線維芽細胞、及び間質細胞により発現される（Ｅｄｗａｒｄｓ，２００８，Ｄｒｕｇ ｎｅｗｓ ＆ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ２１，３１２－３１６；Ｈｅ ａｎｄ Ｇｅｈａ，２０１０，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１８３，１３－２４；Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７，３３６－３４３）。これらの細胞は、炎症性刺激に応答してＴＳＬＰを産生し、ＴＳＬＰは、複数の自然免疫細胞（樹状細胞（Ｓｏｕｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３，６７３－６８０）、単球（Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７，３３６－３４３）、及びマスト細胞（Ａｌｌａｋｈｖｅｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０４，２５３－２５８）を含む）に対するその活性を通じてアレルギー炎症応答を駆動する。ＴＳＬＰ－Ｒ及びＩＬ－７Ｒａの発現がともに最も高いことが知られている細胞集団は、骨髄性樹状細胞である（Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７，３３６－３４３）。
ＴＳＬＰは、ナイーブＴ細胞の増殖を促進し、それらが高レベルのＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３を発現するＴｈ２細胞に分化するのを推進することができる（Ｏｍｏｒｉ ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７８，１３９６－１４０４）。喘息性肺上皮細胞及び慢性アトピー性皮膚炎病変では高レベルのＴＳＬＰ発現が見出されており、このことからＴＳＬＰのアレルギー性炎症における役割が示唆される（Ｚｉｅｇｌｅｒ ａｎｄ Ａｒｔｉｓ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１，２８９－２９３）。さらに最近のエビデンスにより、ＴＳＬＰは、Ｔｈ１７細胞の分化及びＴｈ１７駆動型炎症プロセスと関連付けられている（Ｈａｒｔｇｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ６３，１８７８－１８８７；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｙ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９，８９－１００；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ７６，３３－４５）。慢性アレルギー性（アトピー性）喘息がしばしばＴｈ２型炎症によって特徴付けられるのに対し、非アレルギー性喘息性炎症は主に、Ｔｈ１及びＴｈ１７混在サイトカイン環境を伴った好中球性である。喘息における慢性炎症の結果としては、気管支過剰反応性（ＢＨＲ）、粘液過剰産生、気道壁再形成、及び気道狭窄が挙げられる（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ ａｎｄ Ｈａｍｍａｄ，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，４５－５６）。ＴＳＬＰは、アレルギー性喘息応答の開始及び維持／増強に関与することが示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４，８２７－８３８）。より最近では、ＴＳＬＰシグナル伝達は、局所抗原チャレンジに対する記憶Ｔ細胞の想起応答に必要とされることも分かっている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３５，７８１－７９１ ｅ７８３）。
「ベクター」とは、宿主細胞内に１つ以上の目的遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達可能であり、またいくつかの態様では発現可能であるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、限定されるものではないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、及び生産者細胞などのある特定の真核細胞が挙げられる。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ
本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂを提供する。
実施例では、これらの配列特性を有するＦａｂが、同様のＶＨ及びＶＬドメイン配列を有する全長抗体と比較して、加速安定性試験条件下で安定性が改善されたことが示されている。安定性が改善された例示的なＦａｂを、本明細書ではＦａｂ１と称する。
いくつかの場合において、本開示は、Ｆａｂ１と同等の安定性を有するＦａｂを提供する。いくつかの場合において、この同等の安定性とは、加速安定性試験条件下での同等の安定性である。いくつかの場合において、加速安定性試験条件は、１×ＰＢＳ、４５℃、２週間である。いくつかの場合において、加速試験条件下でのＦａｂの濃度は約０．８ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの場合において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する重鎖を含む。いくつかの場合において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖を含む。いくつかの場合において、Ｆａｂは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、Ｆａｂは、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの場合において、Ｆａｂは配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの場合において、Ｆａｂは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する軽鎖とを含む。いくつかの場合において、Ｆａｂは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、Ｆａｂは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖とを含む。いくつかの場合において、Ｆａｂは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、本開示は、配列番号１の重鎖を含む抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの場合において、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する重鎖を含む抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖を含む。いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖を含む。いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有する軽鎖とを含む。いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖と、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖とを含む。いくつかの場合において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ１と同等の安定性を含む。
ヌクレオチド
本開示は、本明細書で開示するＦａｂ及び抗原結合フラグメントをコードする核酸（または「ポリヌクレオチド」）も提供する。
本開示は、本明細書で開示するＦａｂ及び抗原結合フラグメントをコードする核酸（または「ポリヌクレオチド」）も提供する。
本明細書で開示するポリヌクレオチドはさらに、例えば、本明細書に記載のコードポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチドをコードする、さらなる核酸を含むことができる。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の方法によって生成または製造することができる。例えば、Ｆａｂのヌクレオチド配列が既知である場合、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドは、（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載のように）化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築することができ、簡潔に説明すると、これは、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂをコードする配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーションと、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅とを含む。
代替的に、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドは、好適な供給源の核酸から生成してもよい。Ｆａｂをコードする核酸を含むクローンを利用できないがＦａｂの配列が既知である場合、Ｆａｂをコードする核酸は、化学的に合成するか、または好適な供給源から得ることができ、例えば、配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、または目的の特定の配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングにより行われる。ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、次に、当技術分野で周知されている任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
Ｆａｂのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が決定したら、そのヌクレオチド配列は、当技術分野で周知されているヌクレオチド配列の操作のための方法、例えば、組換えＤＮＡ技法、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に記載の技法を参照（これらはいずれも参照により全体として本明細書に援用される））を用いて操作して、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／または挿入を作出するために、異なるアミノ酸配列を有するＦａｂを生成することができる。
Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成されてもよく、これらは修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであっても、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。例えば、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、一本鎖、もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域及び二本鎖領域の混合であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成されてもよい。さらに、当該Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成されてもよい。また、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドは、安定性や他の理由のために修飾されている１つ以上の修飾された塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでもよい。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの例外的な塩基が挙げられる。様々な修飾がＤＮＡ及びＲＮＡに行われ得るため、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）の非天然バリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することにより、作出することができる。変異は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介性変異誘発などの標準的な技法によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
製造方法
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量のＦａｂ生成のために使用することができる宿主細胞に導入するために、発現ベクターに挿入される。そのため、本明細書で定義するＦａｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含む宿主細胞は、本明細書に包含される。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量のＦａｂ生成のために使用することができる宿主細胞に導入するために、発現ベクターに挿入される。そのため、本明細書で定義するＦａｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含む宿主細胞は、本明細書に包含される。
Ｆａｂまたは抗原結合フラグメントの組換え発現には、Ｆａｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要となる。本開示のＦａｂをコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知されている技法を用いて組換えＤＮＡ技術により、Ｆａｂ生成のためのベクターを生成することができる。
ＦａｂをコードするＤＮＡ配列は、周知の方法に従って逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを用いて同時または別々のいずれでも作製することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーにより、または公開されたＤＮＡ及びアミノ酸配列に基づいたより特異的なプライマーにより、開始することができる。ＰＣＲは、抗体可変軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離するために使用することもできる。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ（例えば、マウス定常領域プローブ）により、スクリーニングすることができる。
したがって、Ｆａｂコードヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。当業者に周知されている方法を使用して、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂコード配列と、適切な転写及び翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築することができる。このような方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本開示は、プロモーターに作用可能に結合した本開示のＦａｂをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
本開示の目的において、多数の発現ベクターシステムを用いることができる。例えば、ある種類のベクターは、動物ウイルス（例えば、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス）に由来するＤＮＡエレメントを利用する。他のベクターは、内部リボソーム結合部位を伴ったポリシストロニックシステムの使用を伴う。さらに、ＤＮＡを染色体に組み込んだ細胞は、形質移入宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより、選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性を提供することができる。選択マーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接結合することも、共形質転換によって同じ細胞に導入することもできる。ｍＲＮＡの最適な合成には、さらなるエレメントも必要になり得る。このようなエレメントとしては、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを挙げることができる。
真核細胞において発現を誘発可能な任意の発現ベクターを本開示で使用することができる。好適なベクターの例としては、限定されるものではないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ １／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、及びｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能）、及びプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）から入手可能）が挙げられる。一般的に、発現細胞のために多数の形質転換細胞をスクリーニングする。
より一般的には、ＦａｂをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されたら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知されている様々なの技法によって達成することができる。このような技法としては、限定されるものではないが、形質移入（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、及びインタクトウイルスによる感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ（１９８８）“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｖｅｃｔｏｒｓ，ｅｄ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０－４７２）を参照。典型的には、宿主へのプラスミド導入はエレクトロポレーションにより行われる。発現コンストラクトを有する宿主細胞を、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂの生成に適した条件下で成長させ、タンパク質合成をアッセイする。例示的なアッセイ技法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
発現ベクターを従来の技法によって宿主細胞に形質移入し、従来の技法によって形質移入細胞を培養して、本明細書に記載の方法で使用するための抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを生成する。したがって、本開示は、異種プロモーターに作用可能に結合している本開示のＦａｂ、例えば、重鎖もしくは軽鎖、または可変重鎖もしくは可変軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。
１つの場合において、当該宿主細胞を含む培養基が提供される。１つの場合において、当該培養基を含む発酵容器が提供される。
いくつかの場合において、培養基及び発酵容器は、本明細書で定義するＦａｂを生成する方法を行うのに適している。
様々な宿主発現ベクターシステムを利用して、本明細書に記載の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを発現させることができる。このような宿主発現システムは、目的コード配列を生成し、続いて精製することができるビヒクルに相当するが、さらに、適切なヌクレオチドコード配列によって形質転換または形質移入したときに本開示の分子をｉｎ ｓｉｔｕで発現することができる細胞にも相当する。これらの宿主発現システムとしては、以下に限定されるものではないが、コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞システム；コード配列を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞システム；あるいは、哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、より好ましくは真核細胞がＦａｂの発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞と、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターとの組合せは、抗体における有効な発現システムである（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳類起源であることが多い。当業者は、発現すべき所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１３（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生物）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－ｌｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ならびに２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。典型的には、宿主細胞株は、商業的サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または公開文献から利用可能である。
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するもの、または遺伝子産物を所望される特定の様式で修飾しプロセシングするものを選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための、特徴的かつ特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主システムは、発現した外部タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするように選択することができる。この目的に向けて、適正な一次転写物のプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。
長期においては、組換えタンパク質の高収率の生成、安定した発現が好ましい。例えば、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを安定して発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により調節されたＤＮＡ及び選択マーカーを用いて、宿主細胞を形質転換させることができる。外部ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、濃縮培地で１～２日間成長させることができ、次に選択的培地に切り替える。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が安定してプラスミドを染色体に統合し、成長して、細胞株にクローニングさせ増やすことができる増殖巣を形成することができるようにする。この方法は、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを安定して発現する細胞株の作製に有利に使用することができる。
限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ａｎｄ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））を含む多数の選択システムを使用することができ、これらの遺伝子をそれぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、ａｐｒｔ－細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子に対する選択の基盤として使用することができる：メトトレキサートへの耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２１（１９８１））；ミコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０１２（１９８１））；アミノグリコシドＧ－４１８への耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．５２：５７３－５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３）；及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １３（５）：１５５－２１５（Ｍａｙ，１９９３）；及びハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４１（１９８４）。使用され得る組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”ｉｎ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されており、これらは参照により全体として本明細書に援用される。
Ｆａｂの発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ（１９８７）“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）Ｖｏｌ．３を参照）。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを発現するベクターシステムのマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養下で存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域は抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ遺伝子に関連するため、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂの産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．３：２５１（１９８３））。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ生成は、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養の技法は当技術分野で知られており、これには（例えば、エアリフトリアクター及び連続撹拌リアクターでの）均質浮遊培養、または（例えば、中空ファイバー、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、もしくはセラミックカートリッジでの）固定化もしくは捕捉細胞培養が含まれる。必要及び／または所望に応じて、ポリペプチドの溶液は、通例のクロマトグラフィー法（例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ－セルロースにおけるクロマトグラフィー、または（免疫）アフィニティークロマトグラフィー）により、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成後、または本明細書に記載のＨＩＣクロマトグラフィーステップの前または後に、精製することができる。
本開示の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂをコードする遺伝子は、非哺乳類細胞（例えば、昆虫、細菌、酵母、または植物細胞）で発現させることもできる。核酸を容易に取り込む細菌としては、腸内細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーが挙げられる。さらに、細菌で発現させると、典型的には、異種ポリペプチドが封入体の一部となることが理解されよう。異種ポリペプチドは、単離し、精製し、機能的分子に構築しなければならない。四価形態の抗体が所望される場合、サブユニットは自己集合して四価抗体となる（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
細菌システムでは、発現させる抗ＴＳＬＰ Ｆａｂについて意図された使用に応じて、複数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、Ｆａｂの医薬組成物の生成のためにこのようなタンパク質を大量に産生しようとする場合、容易に精製される融合タンパク質産物が高レベルに発現するように方向付けるベクターが望ましいと考えられる。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））（コード配列は、融合タンパク質が生成されるようにベクター内にｌａｃＺコード領域とインフレームで個別にライゲーションされ得る）、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．ｉＪ：３１０１－３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ａｎｄ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３－５５０９（１９８９））などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用することができる。概して、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞からの精製は、マトリックスグルタチオン－アガロースビーズに吸着及び結合させ、次に遊離グルタチオンの存在下で溶離させることにより、容易に行うことができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、これにより、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出させることができる。
原核生物に加えて真核微生物も使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（すなわち一般的なパン酵母）が真核微生物の中で最も一般的に使用されているが、他の多数の株（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｎｓ）も一般的に利用可能である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現については、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｇｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｈ，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １０：１５１（１９８０））が一般的に使用されている。このプラスミドには既にＴＲＰ１遺伝子が含まれ、この遺伝子は、トリプトファンにおいて成長する能力が欠如した酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４－１の選択マーカーをもたらす（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ病変が存在すると、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換を検出するための有効な環境がもたらされる。
昆虫システムでは、典型的には、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外部遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で成長する。Ｆａｂコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
本開示のＦａｂを組換え発現させたら、これを、当技術分野で知られている免疫グロブリン分子を精製する任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡの後の特異的抗原に対する親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の差によって、またはタンパク質精製における他の任意の標準的技法によって精製することができる。代替的に、本開示の抗体の親和性を高めるための好ましい方法が、米国特許出願公開第２００２ ０１２３０５７ Ａ１号で開示されている。
治療の方法
本開示はまた、治療の方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの場合において、この方法は、ＴＳＬＰ関連状態の治療のために行われる。
本開示はまた、治療の方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの場合において、この方法は、ＴＳＬＰ関連状態の治療のために行われる。
また、本開示は、治療に使用するための本明細書に記載の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは医薬組成物も提供する。いくつかの場合において、療法は、ＴＳＬＰ関連状態の治療である。
本開示は、疾患の治療に使用するための医薬の製造における抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは医薬組成物の使用も提供する。いくつかの場合において、この疾患はＴＳＬＰ関連状態である。
本開示は、療法における抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは医薬組成物の使用も提供する。いくつかの場合において、療法は、ＴＳＬＰ関連状態の治療である。
いくつかの場合において、ＴＳＬＰ関連状態はＴＳＬＰ関連炎症状態である。いくつかの場合において、ＴＳＬＰ関連炎症状態は、喘息、敗血症、敗血症性ショック、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性鼻副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性食道炎、関節リウマチ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、ＣＯＰＤオーバーラップ症候群（ＡＣＯＳ）、慢性気管支炎、肺気腫、鼻茸を伴うもしくは伴わない慢性鼻副鼻腔炎、血管炎、ＧｖＨＤ、ぶどう膜炎、慢性特発性蕁麻疹、副鼻腔炎、または膵炎から選択される。
いくつかの場合において、ＴＳＬＰ関連炎症状態は喘息である。
喘息は、気道の複雑で不均質な炎症性疾患であり、可変で反復性の症状と、可逆的な気流閉塞と、気管支痙攣とを特徴とする。
喘息の症状としては、喘鳴、咳、胸部圧迫感、及び息切れを挙げることができる。症状は、アレルゲンまたは刺激物への曝露によって引き起こされ得る。喘息は、アレルゲンによって症状が誘発されるか（アトピー性）誘発されないか（非アトピー性）に基づき、アトピー性（外因性）及び非アトピー性（内因性）に分類することができる。急性の喘息の増悪は、一般的には「喘息発作」と称される。喘息発作中に起こり得るさらなる徴候としては、呼吸補助筋（頸部の胸鎖乳突筋及び斜角筋）の使用が挙げられ、奇脈（吸気時に弱く呼気時に強くなる脈拍）及び胸部の過膨張が認められることがある。青色の皮膚及び爪が酸素の欠如により生じることがある。これらの正の治療応答に加えて、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂによる治療を受ける対象は、疾患に関連するこれらの症状のうちの１つ以上において有益な効果または改善を経験し得る。
臨床応答は、スクリーニング技法（例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線画像診断、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）解析、組織学、肉眼病理所見、及び血液化学（限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどによって検出可能な変化を含む））を用いて評価することができる。
本明細書で開示するＦａｂは、炎症性疾患に対する任意の既知の療法と組み合わせて使用することができ、このような療法には、炎症性疾患（例えば、喘息またはＣＯＰＤ）の治療に有用であることが知られている、または使用されてきたもしくは現在使用されている任意の薬剤または薬剤の組合せが含まれる。本明細書に記載のＦａｂと組み合わせて投与することができる例示的な活性薬剤としては、限定されるものではないが、吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）、気管支拡張剤（長時間作用性ベータアゴニスト（ＬＡＢＡ）、長時間作用性抗ムスカリンアゴニスト（ＬＡＭＡ）、短時間作用性ベータアゴニスト（ＳＡＢＡ）、及びムスカリン性β２アゴニスト（ＭＡＢＡ）を含む）、抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン薬、ＰＤＥ－４阻害剤、ヤヌスキナーゼ阻害剤、ならびにホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤が挙げられる。
「組合せ」という用語は、１つの投与単位形態における固定された組合せ、あるいは抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ及び組合せパートナー（例えば、別の薬物（「治療剤」もしくは「助剤」とも称される））が、同時に独立して、または時間間隔内で別々に（特に、このような時間間隔が、組合せパートナーが協力的な効果（例えば、相乗効果）を示すことを可能にする場合）投与され得る組合せ投与のいずれかを指す。単一の構成要素は、キットにパッケージ化されても、別々であってもよい。構成要素（例えば、粉末または液体）の一方または両方を、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。本明細書で利用する場合、「共投与」または「組合せ投与」などの用語は、選択された組合せパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば、患者）に投与することの包含を意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路により、または同時に投与されるとは限らない治療レジメンを含むことが意図されている。本明細書で使用する場合、「医薬の組合せ」という用語は、複数の治療剤の混合または組合せの結果生じる生成物を意味し、治療剤の固定された及び固定されていない組合せのいずれも含む。「固定された組合せ」という用語は、治療剤（例えば、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ）及び組合せパートナーの両方が、単一の実体または投与量の形態で患者に同時に投与されることを意味する。「固定されていない組合せ」という用語は、治療剤（例えば、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ）及び組合せパートナーの両方が、同時に、同時発生的に、または特定の時間制限なしで順次に、別々の実体として患者に投与されることを意味し、このような投与により、患者の体内に治療的に有効なレベルの２つの化合物が提供される。また後者は、カクテル療法（例えば、３つ以上の治療剤の投与）にも適用される。
「組合せ療法」という用語は、本開示に記載の治療状態または障害を治療するために、２つ以上の治療剤を投与することを指す。このような投与は、例えば、固定比率の有効成分を有する単一のカプセルにおいて、これらの治療剤を実質的に同時に共投与することを包含する。代替的に、このような投与は、各有効成分ごとに複数の、すなわち別々の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末、及び液体）で共投与することを包含する。粉末及び／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。さらに、このような投与は、各タイプの治療剤を、ほぼ同時に、または異なる時間に、順次使用することも包含する。いずれの場合においても、治療レジメンは、本明細書に記載の状態または障害の治療において、薬物の組合せの有益な効果をもたらす。
組成物
本明細書で開示する医学的な使用及び方法における抗ＴＳＬＰ Ｆａｂは、医薬組成物の形態で対象に投与することができる。
本明細書で開示する医学的な使用及び方法における抗ＴＳＬＰ Ｆａｂは、医薬組成物の形態で対象に投与することができる。
いくつかの場合において、本明細書における「抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ」への任意の言及は、ある／その抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを含む医薬組成物を指し得る。
いくつかの場合において、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたはその医薬組成物は、ヒトまたは他の動物に、前述の治療方法／医学的使用に従って、治療効果をもたらすのに十分な量で投与することができる。
いくつかの場合において、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたはその医薬組成物は、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを、既知の技法に従った従来の医薬的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の投与形態で、このようなヒトまたは他の動物に投与することができる。
当業者であれば、医薬的に許容される担体または希釈剤の形態及び特性は、組み合わされる有効成分の量、投与経路、及び他の周知された変数によって規定されることを認識するであろう。
いくつかの場合において、医薬組成物は、医薬的に許容される無毒性の無菌担体（例えば、生理的食塩水、無毒性の緩衝液、防腐剤など）を含むように製剤化される。いくつかの場合において、医薬組成物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、及び乳濁液を含むことができる。本明細書で開示する治療方法での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
いくつかの場合において、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたはその医薬組成物の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入、または局所である。いくつかの場合において、非経口投与という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、経直腸投与、または経膣投与を含む。
いくつかの場合において、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたはその医薬組成物は、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。
いくつかの場合において、当該医薬組成物を調製するための本明細書で挙げた成分は、キットの形態でパッケージ化され、販売することができる。このようなキットは、いくつかの場合において、関連する医薬組成物が、疾患または障害に罹患しているまたは罹患しやすい対象の治療に有用であることを示す、ラベルまたは添付文書を有する。
実施例１
テゼペルマブについての安定性試験を１×ＰＢＳ中で４℃または４５℃で実施した。１ｍｇ／ｍｌのテゼペルマブを含む溶液を欠く条件下で２週間保存した。
テゼペルマブについての安定性試験を１×ＰＢＳ中で４℃または４５℃で実施した。１ｍｇ／ｍｌのテゼペルマブを含む溶液を欠く条件下で２週間保存した。
その結果、Ｄ－ＰＢＳ中４５℃で２週間放置後、１０％の単量体損失が観察された（図１）。単量体損失％、凝集％、フラグメント化％を、ＨＰ－ＳＥＣクロマトグラムから曲線下面積（ＡＵＣ）を定量化することによって算出した。溶出体積に基づいて、ピークを単量体、凝集体、フラグメント化産物として割り当てた。ＡＵＣは、ＨＰ ＳＥＣ解析ソフトウェアとともに提供される標準的な解析ツールを用いて算出することができる。
テゼペルマブの重鎖相補性決定領域及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ＣＨ１ドメインに複数の変異を有するＦａｂを構築した。このＦａｂを本明細書ではＦａｂ１と称する。Ｆａｂ１の安定性を、テゼペルマブについて上述したように解析した。結果を図２に示す。
驚くべきことに、Ｆａｂ１は、０．８ｍｇ／ｍｌで２週間保存したときに、加速安定性試験条件下（４５℃で１×ＰＢＳ）で安定性特性の改善を示した。
実施例２：Ｆａｂ１はヒト及びカニクイザルＴＳＬＰにｐＭ親和性で結合する
ＢＩＡｃｏｒｅにより定量するＴＳＬＰに対するＦａｂ１結合の親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ ＳＰＲ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ））を用いて、組換え哺乳類細胞発現ヒト及びカニクイザルＴＳＬＰに対するＦａｂ１の特異性及び親和性を定量した。
ＢＩＡｃｏｒｅにより定量するＴＳＬＰに対するＦａｂ１結合の親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ ＳＰＲ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ））を用いて、組換え哺乳類細胞発現ヒト及びカニクイザルＴＳＬＰに対するＦａｂ１の特異性及び親和性を定量した。
Ｓ Ｓｅｒｉｅｓ Ｃ１バイオセンサーチップ、アミンカップリングキット、ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水ベース緩衝液、及び再生緩衝液をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手し、製造業者の指示に従って使用した。Ｄ－ＰＢＳで再構成した凍結乾燥ストレプトアビジンを使用して、ストレプトアビジン表面を調製した。簡潔に説明すると、ストレプトアビジンを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５で４μｇ ｍＬ－１に希釈し、標準的なアミンカップリング法を使用してＳ Ｓｅｒｉｅｓ Ｃ１バイオセンサーチップの２つのフローセル表面に共有結合的に固定化した。最終的に、１７０レスポンスユニット（ＲＵ）のストレプトアビジン表面を達成した。また、アミンカップリング試薬を使用して、ストレプトアビジンが固定化されていない対照ブランク表面を調製して、各フローセル内の参照表面として使用した。次いで、Ｎ末端タグ付きビオチン化ＴＳＬＰ（ヒト及びカニクイザル）を各ストレプトアビジン表面に滴定して、飽和状態で＜１００ ＲＵのＦａｂ１結合となるようにした（Ｒｍａｘ）。アナライト結合を低レベルにすることで、特に、カイネティクス測定ステップ中に使用される比較的高速の５０μＬ ｍｉｎ－１のアッセイ流量と組み合わせた場合、マストランスポートにより引き起こされるアーティファクトが確実に最小限に抑えられた。単量体化したＦａｂ１の希釈液（１．２５～２０ｎＭの範囲のＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の２倍希釈液）（Ｍｕｌｔｉ－Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を５０μＬ ｍｉｎ－１のアッセイ流量で注入し、２分間の会合及び１０分間の解離とした。最終的なセンサーグラムセットのダブルリファレンス処理を可能にするため、実験中、同じ条件下で緩衝液のみの注入を複数回行った。
１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）を３０秒パルスで２回流すことによって、チップ表面を完全に再生した。１：１ラングミュアモデルを用いて結合親和性及び動態を定量した。
表１に示す結果から、Ｆａｂ１が、固定化したヒト及びカニクイザルＴＳＬＰと同様の親和性（２倍以内；それぞれ４６ｐＭ及び８８ｐＭ）で結合することが示されている。
キネティック排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）による結合親和性の定量。
ＫｉｎＥｘＡ ３２００装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ，ＵＳＡ）を用いて、ヒト及びカニクイザルＴＳＬＰに対するＦａｂ１の溶液相結合親和性（ＫＤ）も定量し、得られたデータをＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．１１を用いて処理した。ＫｉｎＥｘＡの方法論は概説されている（Ｄａｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒａｕｌｔ，２００４）。
ＫｉｎＥｘＡ ３２００装置（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ，ＵＳＡ）を用いて、ヒト及びカニクイザルＴＳＬＰに対するＦａｂ１の溶液相結合親和性（ＫＤ）も定量し、得られたデータをＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．１１を用いて処理した。ＫｉｎＥｘＡの方法論は概説されている（Ｄａｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｂｒａｕｌｔ，２００４）。
Ｆａｂ１を、ヒト及びカニクイザルＴＳＬＰの濃度を変えながら平衡に達するまでプレミックスした（２倍系列希釈法を用いて、少なくとも１２の濃度のヒト及びカニクイザルＴＳＬＰを各々調製した）。次にＫｉｎＥｘＡ装置を用いて、ヒトＴＳＬＰコートビーズを用いて遊離Ｆａｂを捕捉し、未結合物質を洗い流し、市販の種特異的抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識マウス抗ヒト重鎖及び軽鎖特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ ２０９－６０５－０８８））を用いて結合Ｆａｂ１を蛍光的に検出することにより、遊離Ｆａｂ１の量を測定した。ヒトＴＳＬＰに対するＦａｂ１のＫＤを、１０００ｐＭ（塗りつぶした菱形）、５００ｐＭ（塗りつぶした逆三角形）、または４０ｐＭ（白抜きの四角形）の固定Ｆａｂ１濃度溶液へのヒトＴＳＬＰ滴定に由来する３つのデータセットにグローバル１：１フィットを行うことにより、抽出した（図３）。カニクイザルＴＳＬＰに対するＦａｂ１のＫＤを、１０００ｐＭ（塗りつぶした菱形）または４０ｐＭ（白抜きの四角形）の固定Ｆａｂ１濃度溶液へのカニクイザルＴＳＬＰ滴定に由来する２つのデータセットにグローバル１：１フィットを行うことにより、抽出した（図４）。
ヒト及びカニクイザルの各々のＴＳＬＰ濃度で検出した遊離Ｆａｂ１の量を、ＴＳＬＰの滴定濃度に対しプロットした（それぞれ図３及び４）。ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使用して平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。表２に示す結果は、Ｆａｂ１が、遊離溶液中でカニクイザルＴＳＬＰに結合するよりも１．７倍高い親和性でヒトＴＳＬＰに結合することを示している。
実施例３：Ｆａｂ１及びテゼペルマブは同様の結合特性によりＴＳＬＰに結合する
Ｆａｂ１のヒトＴＳＬＰに対する結合特性をテゼペルマブと直接比較した。
Ｆａｂ１のヒトＴＳＬＰに対する結合特性をテゼペルマブと直接比較した。
均質蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（登録商標）、Ｃｉｓｂｉｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）ベースのＴＳＬＰ：ｍＡｂ結合アッセイを用いて、Ｆａｂ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合効力を定量した。ストレプトアビジンクリプテートをビオチン化ＴＳＬＰの検出に使用した。簡潔に説明すると、非標識Ｆａｂ１の試料をＨＴＲＦアッセイに滴定して、ビオチン化Ｈｉｓ－Ａｖｉ ヒトＴＳＬＰへの結合についてＤｙＬｉｇｈｔ標識テゼペルマブと競合させた。また、非標識テゼペルマブ及びＤｙＬｉｇｈｔ標識テゼペルマブを陽性対照として用いた競合アッセイも実施した。
その結果、Ｆａｂ１が、ヒトＴＳＬＰへの結合についてテゼパルマブと競合し、テゼパルマブと同様の効力でヒトＴＳＬＰに結合することが示されている（ＩＣ５０：Ｆａｂ１：０．３８ｎＭ；テゼパルマブ：０．２３ｎＭ（図５））。
実施例４：Ｆａｂ１は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）アッセイでＴＳＬＰ活性を中和する
次に、ＴＳＬＰに結合するＦａｂ１が一次細胞アッセイで機能的遮断活性を有するかどうかを、Ｆａｂ１で処置した際のＰＢＭＣからのＴＳＬＰ誘導性ＣＣＬ１７放出を測定することにより、決定した。
次に、ＴＳＬＰに結合するＦａｂ１が一次細胞アッセイで機能的遮断活性を有するかどうかを、Ｆａｂ１で処置した際のＰＢＭＣからのＴＳＬＰ誘導性ＣＣＬ１７放出を測定することにより、決定した。
ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で確立した献血プログラム下で、健康なドナーから血液を入手した。フィコール勾配を使用する標準的な手順で、末梢血単核細胞を単離した。簡潔に述べると、ＰＢＳで希釈した２０ｍｌの血液（血液１０ｍｌ：ＰＢＳ３０ｍｌ）を１５ｍｌのフィコール上に重層した。チューブを４００ｇで４０分間、室温でブレーキなしで遠心した。ＰＢＭＣ層を回収し、細胞を５０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣを、血球計数及び死細胞を除外するトリパンブルーを使用して計数し、培養培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ）中に再懸濁した後、９６ウェルプレートにプレーティングした。ＴＳＬＰ結合抗体フラグメントＦａｂ１の存在下でＴＳＬＰ（０．５ｎｇ／ｍｌ）により細胞を４８時間刺激した。ＴＳＬＰ結合抗体であるテゼペルマブを陽性対照として使用するアッセイも実施した。４８時間後、上清を除去し、Ｒ＆ＤデュオセットＥＬＩＳＡを製造元のプロトコルに従って使用して、ＣＣＬ１７の産生についてアッセイした。６例のドナーを用いて３回の独立した実験で実験を実施した。
その結果、Ｆａｂ１が、１．３９ｎＭのＩＣ５０でＰＢＭＣからのＣＣＬ１７生成を阻害することが示された（図６）。
配列
配列番号１（Ｆａｂ１重鎖）
ＱＭＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＨＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＰＱＷＥＬＶＨＥＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫ
配列番号２（Ｆａｂ１軽鎖）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＬＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＷＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＧＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
配列番号１（Ｆａｂ１重鎖）
ＱＭＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＴＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＨＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＴＲＤＮＳＫＮＴＬＮＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＰＱＷＥＬＶＨＥＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫ
配列番号２（Ｆａｂ１軽鎖）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＴＣＧＧＮＮＬＧＳＫＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤＳＤＲＰＳＷＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＧＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＳＳＳＤＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
Claims (16)
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含むＦａｂ。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含むＦａｂ。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖とを含むＦａｂ。
- 前記ＦａｂがＩｇＧ１ Ｆａｂである、請求項１～３のいずれかに記載のＦａｂ。
- 前記Ｆａｂが、４５℃で少なくとも２週間安定している、請求項１～４のいずれかに記載のＦａｂ。
- 前記Ｆａｂが、０．８ｍｇ／ｍｌの濃度における１×ＰＢＳ中で安定している、請求項５に記載のＦａｂ。
- 前記Ｆａｂが、１×ＰＢＳ中４５℃で２週間インキュベートした後に１０％未満の単量体損失を示し、単量体がＨＰ－ＳＥＣにより定量される、先行請求項のいずれかに記載のＦａｂ。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載のＦａｂを含む医薬組成物。
- 請求項１～７のいずれかに記載のＦａｂをコードする核酸。
- 請求項９に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項９に記載の核酸または請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項１～７のいずれかに記載のＦａｂを生成する方法であって、請求項７に記載の宿主細胞を培養することと、前記Ｆａｂを発現させることと、前記Ｆａｂを精製することとを含む、前記方法。
- 請求項１２に記載の方法から得ることができるＦａｂ。
- 治療に使用するための、請求項１～７のいずれかに記載のＦａｂ。
- ＴＳＬＰ関連状態の治療に使用するための、請求項１～７のいずれかに記載のＦａｂ。
- 前記ＴＳＬＰ関連状態が喘息である、請求項１５に記載の使用のためのＦａｂ。
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