TW202244475A - 用於開發混合準則的方法和系統 - Google Patents
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Abstract
一種開發預測模型的方法可包括確認用於該預測模型之混合準則參數、確認用於該預測模型之評估標準、選擇用於該混合準則參數之測試值、確認為了生成該評估標準而需要執行的計算流體動力學（CFD）模擬、對測試值的每個組合進行該CFD 模擬，從而生成對應於測試值的每個組合之評估標準、生成使該混合準則參數與該評估標準相關之潛在預測模型域、從該潛在預測模型域確認候選預測模型池、以及對該候選預測模型池進行排序。
Description
本專利申請主張2021年3月26日提交的美國臨時專利申請號63／166504及2022年1月12日提交的美國臨時專利申請號63／298880的優先權，兩者之整體均藉由引用而併入本文。
本公開是關於用於開發及實施混合準則之系統和方法。本公開的一些方面是關於用於對與治療學之生物生產相關的混合準則進行高通量評估之系統和方法。
生物製藥產品（例如抗體、融合蛋白、腺相關病毒 （adeno-associated viruses，AAVs）、蛋白質、組織、細胞、多肽或其他生物來源的治療產品）越來越多地用於感染性疾病、遺傳疾病、自體免疫疾病及其他疾病之治療及預防。生物製藥產品的生產需要精確且一致的條件。為了確保包括生物製藥產品在內的解決方案是一致的，可在整個製造過程中採用混合準則。混合準則可幫助維持溶液成分（例如生物製藥產品、細胞廢物、宿主蛋白質、細胞外營養物、其他分子）在生物製藥產品之生產所涉及的各種溶液中之適當分佈。
混合準則可包括混合容器的形狀及尺寸、溶液內流體流動的方向及速率與溶液之物理化學性質的參數。可針對各類型的生物製藥產品、混合容器幾何形狀、培養基成分及宿主細胞開發混合準則。生物製藥產品、混合容器幾何形狀、培養基成分或宿主細胞的修改可能需要重新開發混合準則。開發混合準則的傳統方法是時間及勞力密集型的，且可能導致劣質的混合準則。
本公開的實施方式可針對一種開發預測模型的方法。該方法可包括確認用於預測模型之混合準則參數、確認用於預測模型之評估標準及／或選擇用於混合準則參數之測試值。該方法還可包括確認為了生成評估標準而需要執行的計算流體動力學（computation fluid dynamics，CFD）模擬。該方法還可包括對每個測試值的組合進行CFD模擬，從而生成對應於測試值的各組合之評估標準。該方法還可包括生成使混合準則參數與評估標準相關聯之潛在預測模型域、從潛在預測模型域確認候選預測模型池、及／或對候選預測模型池進行排序。
本公開的一些實施方式中，混合準則參數可包括葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器幾何形狀中的兩項或更多項。評估標準可包括以下兩項或更多項：流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、穩態混合時間、暫態混合時間、停留時間分佈、等值線剪切應變率（contour shear strain rate）、平均剪切應變率、暴露分析及功率消耗。所確認之CFD模擬可包括穩態流動分析、暫態流動分析、混合時間分析及／或暴露分析。一些實施方式中，開發混合預測模型的方法可進一步包括在生成潛在預測模型域之後且在確認候選預測模型池之前，計算潛在預測模型域中每個潛在預測模型之變異數膨脹因子，及從潛在預測模型域去除變異數膨脹因子大於或等於共線性閾值之潛在預測模型，從而生成潛在預測模型之子集合。候選預測模型池可包括來自子集合之R
2值高於子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、以及來自子集合之R
2值高於子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型。對候選預測模型池進行排序可包括基於項數對候選預測模型池進行排序、基於R
2值對候選預測模型池進行排序、或兩者兼具。本公開的一些實施方式中，測試值為第一測試值，且開發預測模型的方法進一步包括使用來自候選預測模型池之候選預測模型，生成對應於第二測試值的組合之評估標準的估計值。此外，該方法可進一步包括：對第二測試值的組合進行CFD模擬，以生成對應於第二測試值的組合之評估標準、以及將對應於第二測試值的組合之評估標準與對應於第二測試值的組合之評估標準的估計值進行比較。
本公開的進一步實施方式可包括開發預測模型的方法。該方法可包括確認用於預測模型之第一、第二及第三混合準則參數、確認用於預測模型之第一及第二評估標準、選擇用於第一混合準則參數之第一測試值，選擇用於第二混合準則參數之第二測試值、及／或選擇用於第三混合準則參數之第三測試值。該方法還可包括確認為了生成第一評估標準而需要執行之第一計算流體動力學（CFD）模擬、確認為了生成第二評估標準而需要執行之第二CFD模擬、藉由對第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合進行第一CFD模擬，生成對應於第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合之第一評估標準、及／或藉由對第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合進行第二CFD模擬，生成對應於第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合之第二評估標準。該方法還可包括生成使第一、第二及第三混合準則參數與第一評估標準相關聯之第一預測模型的第一域及／或生成使第一、第二及第三混合準則參數與第二評估標準相關聯之第二預測模型的第二域。
本公開的一些實施方式中，開發預測模型的方法可進一步包括為計算用於每個第一預測模型及每個第二預測模型的變異數膨脹因子、從第一預測模型的第一域去除變異數膨脹因子大於或等於三的第一預測模型，從而生成第一預測模型的第一子集合、從第二預測模型的第二域去除變異數膨脹因子大於或等於三的第二預測模型，從而生成第二預測模型的第二子集合、確認候選第一預測模型的第一池，該第一池包括來自第一子集合之R
2值高於第一子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、來自第一子集合之R
2值高於第一子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型、及來自第一子集合之R
2值高於第一子集合中的所有其他三變量模型之三變量模型、確認候選第二預測模型的第二池，該第二池包括來自第二子集合之R
2值高於第二子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、來自第二子集合之R
2值高於第二子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型、及來自第二子集合之R
2值高於第二子集合中的所有其他三變量模型之三變量模型、選擇用於第一混合準則參數之第四測試值、選擇用於第二混合準則參數之第五測試值、選擇用於第三混合準則參數之第六測試值、使用候選第一預測模型的第一池之每個候選第一預測模型，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之經估計的第一評估標準、藉由對第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合進行第一CFD模擬，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第一評估標準、將由候選第一預測模型的第一池之每個候選第一預測模型生成的經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第一評估標準進行比較、使用候選第二預測模型的第二池之每個候選第二預測模型，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之經估計的第二評估標準、藉由對第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合進行第二CFD模擬，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第二評估標準、以及將由候選第二預測模型的第二池之每個候選第二預測模型生成的經估計的第二評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第二評估標準進行比較、基於經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第一評估標準的比較，從候選第一預測模型的第一池選擇第一預測模型、基於經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第一評估標準的比較，從候選第二預測模型的第二池選擇第二預測模型、使用第一預測模型，確定對應於混合準則之第一評估標準、以及使用第二預測模型，確定對應於混合準則之第二評估標準。
本公開的進一步實施方式可包括對與混合準則相關之剪切應變進行建模的方法。該方法可包括確認預測模型之混合準則參數、選擇用於混合準則參數之測試值、對測試值的每個組合進行計算流體動力學暴露分析，從而生成對應於測試值的每個組合之剪切應變、確認候選預測模型池、對候選預測模型池進行排序、從候選預測模型池選擇預測模型、以及使用預測模型，於多個時間間隔評估混合準則之累積剪切應變，以生成剪切應變直方圖數據。
本公開的一些實施方式中，一種對與混合準則相關之剪切應變進行建模的方法包括其中混合準則參數包括以下兩項或更多項：葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器幾何形狀。對候選預測模型池進行排序包括基於項數對候選預測模型池進行排序、基於R
2值對候選預測模型池進行排序、或兩者兼具，且從候選預測模型池選擇預測模型包括選擇具有最高R
2值的模型。混合準則可為與生物反應器中的生物製藥產品相關聯之混合準則。該方法可進一步包括使用剪切應變直方圖數據以評估可見或次可見（sub-visible）粒子形成之風險。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術及科學術語與本公開所屬領域中具有通常知識者所通常理解之含義相同。儘管任何合適的方法和材料（例如類似於或等同於本文所述者）可用於本公開的實踐或測試，但於此描述特定之示例方法。所提及的所有出版物均藉由引用併入本文。
如本文所用，術語「包括」、「包含」或其任何其他變體旨在涵蓋非排他性之包含，使得包括元件列表的過程、方法、物品或設備不僅包括該等元件，還可能包括未明確列出之其他元件或此類過程、方法、物品或設備所固有之元件。術語「示例性」是在「示例」而非「理想」的意義上而使用。對於術語「例如」與「如」及其語法上等義之詞，除非另有明確說明，否則應理解為遵循用詞「且不限於」。
如本文所用，術語「約」旨在說明因實驗誤差所引起的變化。當應用於數值時，術語「約」可表示與公開的數值相差+／- 5%，除非已指定不同的變化。如本文所用，單數形式「 一 」及「該」包括複數之所指物，除非上下文另有明確規定。此外，所有範圍應理解為包括端點，例如1公分（cm） 至5cm將包括1 cm、5 cm的長度、以及1 cm與5 cm之間的所有距離。
應當注意，除非已指定不同的變化，否則本文公開或要求保護的所有數值（包括所有公開的值、限制及範圍）可具有與公開數值的+／-5%之變化。
如本文所用，術語「多肽」是指具有超過約20個藉由醯胺鍵共價鏈接之胺基酸的任何胺基酸聚合物。蛋白質包含一個或多個胺基酸聚合物鏈（例如多肽）。因此，多肽可為蛋白質，且蛋白質可包含多個多肽以形成單一功能性生物分子。
轉譯後修飾可修飾或改變多肽的結構。例如，雙硫鍵（例如半胱氨酸殘基之間的 S-S 鍵）可在某些蛋白質轉譯後形成。一些雙硫鍵對於多肽、免疫球蛋白、蛋白質、輔因子、基質等之正確的結構、功能及相互作用而言是不可或缺的。除了雙硫鍵形成之外，蛋白質還可進行其他轉譯後修飾，例如脂化（例如豆蔻醯化（myristoylation）、棕櫚醯化（palmitoylation）、法呢醯化（farnesoylation）、香葉基香葉醯化（geranylgeranylation）及糖基磷脂醯肌醇錨的形成（glycosylphosphatidylinositol （GPI） anchor formation）、烷基化（例如甲基化）、醯化、醯胺化、醣基化（例如在精氨酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸、羥離胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪氨酸及／或色胺酸上添加醣基）及磷酸化（即在絲胺酸、蘇胺酸、酪氨酸及／或組胺酸上添加磷酸根）。轉譯後修飾可影響疏水性、靜電表面性質或其他多肽參與之決定表面間相互作用的性質。
如本文所用，術語「蛋白質」包括生物治療性蛋白質、用於研究或治療的重組蛋白質、陷阱蛋白質（trap proteins）和其他Fc融合蛋白、嵌合蛋白（chimeric proteins）、抗體、單株抗體、人類抗體、雙特異性抗體、抗體片段、 類抗體分子、奈米抗體、重組抗體嵌合體、細胞激素、化學激活素、肽激素等。感興趣蛋白質（protein of interest，POI）可包括欲分離、純化或以其他方式製備之任何多肽或蛋白質。POI可包括由細胞產生的多肽，包括抗體。
如本文所用，術語「抗體」包括由四個多肽鏈，即藉由雙硫鍵相互連接之兩條重（H）鏈及兩條輕（L）鏈組成的免疫球蛋白。通常，抗體具有超過100 kDa的分子量，如130 kDa與200 kDa之間，如約140 kDa、145 kDa、150 kDa、155 kDa或160 kDa。每條重鏈包含重鏈可變區（heavy chain variable region，本文縮寫為HCVR或VH）和重鏈恆定區（heavy chain constant region）。重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2 及CH3。每條輕鏈包含一個輕鏈可變區（light chain variable region，本文縮寫為LCVR或VL）及一個輕鏈恆定區（light chain constant region）。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。VH及VL區可進一步細分為高變異性區域，稱為互補決定區（complementarity determining region，CDR），散佈著更為保守的區域，稱為框架區（framework region，FR）。每個VH和VL由3個CDR及4個FR組成，從胺基端到羧基端依以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4（重鏈CDR可縮寫為HCDR1、 HCDR2及HCDR3；輕鏈CDR可縮寫為LCDR1、LCDR2及LCDR3）。
一類稱為免疫球蛋白 G （IgG）的免疫球蛋白，例如，在人類血清中很常見且包含四條多肽鏈—兩條輕鏈及兩條重鏈。每條輕鏈經由胱胺酸雙硫鍵連接於一條重鏈，兩條重鏈經由兩個胱胺酸雙硫鍵相互鍵結。其他種類的人類免疫球蛋白包括 IgA、IgM、IgD及IgE。就 IgG 而言，存在四個次類別：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。每個次類別的恆定區不同，因此可能具有不同的效應子功能（effector function）。本文所述的一些實施方式中，POI可包含靶多肽（target polypeptide），包括IgG。至少一個實施方式中，靶多肽包括IgG4。
如本文所用，術語「抗體」還包括完整抗體分子的抗原結合片段。如本文所用，術語抗體的「抗原結合部分」、抗體的「抗原結合片段」等包括特異性地結合抗原以形成複合物之任何天然存在的、酶催化獲得的、合成的或基因工程的多肽或醣蛋白。抗體的抗原結合片段可衍生自例如完整的抗體分子，其使用任何合適的標準技術如蛋白水解消化或重組基因工程技術，包括操作及表現DNA編碼抗體可變且可選地恆定之結構域。此種DNA為已知的及／或從例如商業來源、DNA庫（包括例如噬菌體-抗體庫）直接可得的，或者可被合成。DNA可藉由使用分子生物技術被定序或被化學地操作，例如將一個或多個可變及／或恆定結構域排列成合適的構型，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或刪除胺基酸等等。
可使用基於重組細胞的生產系統來生產靶分子（例如靶多肽／抗體），如昆蟲桿狀病毒系統、酵母系統（例如畢赤酵母屬（Pichia sp.））或哺乳動物系統（例如CHO細胞及CHO衍生物如CHO-K1細胞）。術語「細胞」包括任何適合表現重組核酸序列的細胞。細胞包括原核生物及真核生物（單細胞或多細胞）、細菌細胞（例如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈黴菌屬等之菌株）、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞（例如酵母菌（S. cerevisiae）、裂殖酵母菌（S. pombe）、嗜甲醇酵母菌（P. Pastoris）、嗜甲醇畢赤酵母菌（P.methylica ）等）、植物細胞、昆蟲細胞（例如SF-9、SF-21、經桿狀病毒（bacculovirus）感染之昆蟲細胞、粉紋夜蛾（Trichoplusiani）等）、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物如融合瘤或四源融合瘤（quadromas）。一些實施方式中，細胞可為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。一些實施方式中，細胞可為真核細胞且可選自以下細胞：CHO（例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO）、COS（例如COS-7）、視網膜細胞、Vero、CV1、腎臟（例如 HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK）、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60（例如BHK21）、Jurkat、Daudi、A431（表皮）、CV-1、U937、3T3、L 細胞、C127 細胞、SP2／0、NS-0、MMT 060562、塞特利氏細胞、BRL 3A 細胞、HT1080 細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及衍生自前面提到的細胞之細胞株。一些實施方式中，細胞可包含一種或多種病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞（例如PER.C6™細胞）。
術語「靶分子」在本文中可用於指靶多肽（例如抗體、抗體片段或其他蛋白質或蛋白質片段），或旨在製造、分離、純化及／或包含於藥品中（例如腺相關病毒 （AAV） 或其他用於治療用途的分子）。雖然根據本公開的方法可與靶多肽相關，但該等可適用於其他靶分子。例如，可根據合適的方法（例如深度過濾、親和層析等）製備 AAV，且可對包括AAV之混合物進行根據本公開的方法。在遵循本公開的一種或多種方法之前或之後，可對包括AAV之混合物進行額外的程序（例如，去除「空匣（empty cassettes）」或不包含靶序列之AAV）。
一些實施方式中，靶分子為抗體、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙抗體（diabody）、三抗體（triabody）或四抗體（tetrabody）、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4 抗體。一個實施方式中，抗體為IgG1抗體。一個實施方式中，抗體為IgG2抗體。一個實施方式中，抗體為IgG4抗體。一個實施方式中，抗體為嵌合IgG2／IgG4抗體。一個實施方式中，抗體為嵌合IgG2／IgG1抗體。一個實施方式中，抗體為嵌合IgG2／IgG1／IgG4抗體。
一些實施方式中，靶分子（例如抗體）選自抗程序性（anti-Programmed）細胞死亡1抗體（anti-Programmed Cell Death 1 antibody）（例如美國專利申請公開號US2015／0203579A1所述之抗PDl抗體（anti-PD1 antibody））、抗程序性細胞死亡配體-1（anti-Programmed Cell Death Ligand-1） （例如美國專利申請公開號US2015／0203580A1所述之抗PD-L1抗體（anti-PD-L1 antibody））、抗Dll4 抗體、抗血管生成素-2抗體（anti-Angiopoetin-2 antibody）（例如美國專利號9402898所述之抗-ANG2抗體）、類抗血管生成素3抗體（anti-Angiopoetin-Like 3 antibody）（例如美國專利號9018356所述之抗AngPtl3抗體），抗血小板衍生的生長因子受體抗體（anti-platelet derived growth factor receptor antibody）（例如美國專利號9265827所述之抗PDGFR抗體）、抗催乳素受體抗體（anti-Prolactin Receptor antibody）（例如美國專利號9302015所述之抗PRLR抗體） 、抗補體5抗體（anti-Complement 5 antibody）（例如美國專利申請公開號US2015／0313194A1所述之抗C5抗體）、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體（anti-epidermal growth factor receptor antibody）（例如美國專利號9132192所述之抗EGFR抗體或美國專利申請公開號US2015／0259423A1所述之抗EGFRvIII抗體）、抗前蛋白轉化酶枯草桿菌素克新-9抗體（anti-Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-9 antibody）（例如美國專利號8062640或美國專利申請公開號US2014／0044730A1所述之抗PCSK9抗體）、抗生長及分化因子-8抗體（anti-Growth And Differentiation Factor-8 antibody）（例如美國專利號8871209或9260515所述之抗GDF8抗體，也稱為抗肌生長抑制素抗體（anti-myostatin antibody））、抗升糖素受體（例如美國專利申請公開號US2015／0337045A1或US2016／0075778A1所述之抗GCGR抗體）、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、白細胞介素4受體抗體（interleukin 4 receptor antibody）（例如美國專利申請公開號US2014／0271681A1或美國專利號8735095或8945559所述之抗IL4R抗體）、抗白介素6受體抗體（anti-interleukin 6 receptor antibody）（例如美國專利號7582298、8043617或9173880所述之抗IL6R抗體）、抗白介素33（anti-interleukin 33）（例如美國專利申請公開號US20140271658A1或US2014／0271642A1所述之抗IL33抗體）、抗呼吸道合胞病毒抗體（anti-Respiratory syncytial virus antibody）（例如美國專利申請號US2014／0271653A1所述之抗RSV抗體）、抗分化簇3（anti-Cluster of differentiation 3）（例如美國專利申請公開號US2014／0088295A1與US20150266966A1以及美國申請號 62／222605所述之抗CD3抗體）、抗分化簇20（anti-Cluster of differentiation 20） （例如美國專利申請公開號US2014／0088295A1和US20150266966A1以及美國專利號7879984所述之抗CD20抗體）、抗分化簇48（anti-Cluster of Differentiation-48）（例如美國專利號9228014所述之抗CD48抗體）、抗 Fel d1抗體（anti-Fel d1 antibody）（如美國專利號9079948所述）、抗中東呼吸道症候群病毒（anti-Middle East Respiratory Syndrome virus）（例如抗MERS抗體）、抗伊波拉病毒抗體（例如Regeneron的REGN-EB3）、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗Erb3抗體、抗茲卡病毒抗體（anti-Zika virus antibody）、抗淋巴細胞激活基因3（anti-Lymphocyte Activation Gene 3）（例如抗LAG3抗體或抗CD223抗體）及抗激活素A抗體（anti-Activin A antibody）。本段落提及之各項美國專利及美國專利公開均藉由引用整體併入。
一些實施方式中，靶分子（例如雙特異性抗體）選自抗CD3 Ⅹ 抗CD20雙特異性抗體、抗CD3 Ⅹ 抗黏液素16雙特異性抗體及抗CD3 Ⅹ 抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體。一些實施方式中，靶分子選自由阿利若單抗（alirocumab）、撒立魯單抗（sarilumab）、法神單抗（fasinumab）、內斯瓦庫單抗（nesvacumab）、杜匹單抗（dupilumab）、特里沃單抗（trevogrumab）、艾維那單抗（evinacumab）及瑞奴庫單抗（rinucumab）組成之組。
一些實施方式中，靶分子是包含Fc部分和另一個結構域的重組蛋白（例如Fc融合蛋白）。一些實施方式中，Fc融合蛋白為受體Fc融合蛋白，其包含與Fc部分偶合之受體的一個或多個胞外結構域。一些實施方式中，Fc部分包含鉸鏈區，後接IgG的CH2及CH3結構域。一些實施方式中，受體Fc融合蛋白含有結合單個配體或多個配體之兩條或更多條不同的受體鏈。例如，Fc融合蛋白為TRAP蛋白，如IL-1 trap（例如利納西普（rilonacept），其包含與融合至hIgGl之Fc的Il-1R1細胞外區域融合之IL-1RAcP配體結合區；參見美國專利號6927004 ，其全部內容藉由引用併入本文），或VEGF trap（例如阿柏西普（aflibercept）或 ziv-阿柏西普（ziv-aflibercept），其包含與融合至hIgG1之Fc 的VEGF受體Fltl的Ig結構域3之VEGF受體Flk1的Ig結構域2；參見美國專利號7087411和7279159，兩者均藉由引用整體而併入）。其他實施方式中，Fc融合蛋白為ScFv-Fc-融合蛋白，其包含一種或多種抗原結合域中的一者或多者，如與Fc部分偶合之抗體的可變重鏈片段及可變輕鏈片段。
術語「培養基」或「培養介質」是指用於培養細胞的營養溶液，通常提供促進細胞生長所需的營養物質，如碳水化合物能量源、必需胺基酸、微量元素、維生素等。培養基可含有萃取物，例如血清或蛋白腖（水解物），它們提供支持細胞生長的原材料。一些實施方式中，培養基可包含酵母來源或黃豆萃取物代替動物來源之萃取物。化學成分確定的培養基是指所有化學成分均為已知之培養基。化學成分確定的培養基可完全不含動物來源的成分，如血清或動物來源的蛋白腖。培養基也可不含蛋白質。「新鮮培養基」可指尚未被引入細胞培養物及／或尚未被細胞培養物的細胞利用之培養基。新鮮培養基可包含通常之高營養等級且幾乎沒有廢物。「用過的培養基」可指在細胞培養中已被細胞使用的培養基，且與新鮮培養基相比，通常可包括較低的營養等級與較高的水等級。
通常，混合準則可結合至生物製藥產品製造的幾個階段中。例如，在宿主細胞的培養或生物藥物產品的獲取期間，可使用混合準則來確保所產生的生物藥物產品、細胞、營養物、廢物和培養基的其他成分之適當分佈。混合準則可與被配置為執行混合準則之容器一起使用，該容器也被稱為混合容器。一些實施方式中，生物反應器可用作混合容器。其他實施方式中，可在執行混合準則之前將培養液從生物反應器轉移至不同類型的混合容器。
在獲取生物製藥產品（例如感興趣蛋白質）之後，所獲取的產品可以保持在溶液中。包括生物藥物產品的溶液可經歷一個或多個層析、過濾（例如超過濾、滲濾（diafiltration）或其組合）、純化（例如病毒去活）步驟以提高生物藥物產品的純度及有效性。在所有階段，可以採用混合準則來使溶液均質化及／或確保溶液成分的合適分佈。除了上面討論的應用之外，可使用混合準則來組合及／或稀釋單獨之生物容器、批次或批量。
此外，混合準則可應用於不包括感興趣蛋白質之溶液。例如，上述生物製藥產品製造步驟需要使用緩衝液、培養基和其他溶液。緩衝液、培養基和其他溶液的製備可包括使用一種或多種混合準則。
可監控取決於混合準則的生物製藥產品或其製造過程的特定性質，以評估混合準則的參數對所得生物製藥產品之影響。例如，與混合準則相關的流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、混合時間（例如穩態混合時間或暫態混合時間）、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、曝露分析及／或功率消耗可用於評估混合準則的效用及／或功效。
混合準則可包括用於混合容器的操作參數，例如混合容器的尺寸、葉輪速度、作為總容量百分比的負載大小、溶液的黏度及／或描述混合準則需求之其他操作參數。一些實施方式中，當溶液（包括例如培養基、細胞、感興趣蛋白質及／或其他分子）充分均質化時，完成混合準則。混合準則的持續時間，即溶液達到足夠均勻性所需的時間，稱為混合時間。溶液混合的程度可藉由混合指數來量化。混合指數可定義為（例如感興趣蛋白質或其他分子之）濃度的標準偏差與最終濃度的比率。混合時間可量化為在給定之混合準則下達到大約5%的混合指數所需的時間量。
在混合準則的傳統開發中，感興趣蛋白質和含有感興趣蛋白質之培養基的物理化學性質被認為產生了潛在的混合準則。潛在的混合準則經由替代之混合研究進行測試，以繪製操作範圍並收集混合時間數據。基於從操作範圍的各個點收集之混合時間數據，可確定一種或多種候選混合準則。能夠以剪切應力及過度混合研究進一步測試候選之混合準則。剪切應力及過度混合研究可生成產品品質數據，其可用於評估候選之混合準則。
剪切及過度混合研究必須在混合時間數據生成後進行，因為剪切應力及過度混合取決於混合時間。若由剪切應力及過度混合研究提供的產品品質數據表明混合準則不合適，則必須重新開始混合準則的開發以生成潛在的混合準則。此外，必須對新的潛在混合準則進行替代混合研究，以生成可用於進一步剪切應力及過度混合研究之混合時間數據。
混合準則的這種傳統開發流程受到限制，因為必須執行替代混合研究以評估可能最終導致不利的產品品質數據之混合準則。為了確定是否應研究潛在的混合準則的傳統開發流程之運行多個實驗的要求會導致混合準則的時間及勞力密集型開發。此外，會影響所得到的生物製藥產品品質之與實施的混合準則相關的事件如氣液界面應力、夾雜空氣以及可見或次可見顆粒形成的風險，在傳統的開發流程中沒有得到解決。
除了傳統的混合準則開發流程未能解決混合準則的所有可能導致對所得生物製藥產品產生不利後果的因素之外，按比例（scaled）的研究會導致過高的剪切應力。圖1示出應變直方圖，其表示與傳統混合準則開發相關的按比例之剪切應力研究如何高估剪切應力。曲線610示出與經過驗證的混合準則之製造條件之區域605相比較的一個按比例之剪切應力研究的應變直方圖。換句話說，區域605代表經過驗證的製藥產品混合準則中的實際剪切應力，而曲線610代表按比例之研究的預測剪切應力。圖 1中的圖示顯示與混合準則的典型操作範圍相比，按比例之研究具有更高的剪切應力。
與傳統混合準則開發相關的替代混合研究、剪切應力及過度混合研究並未量化氣液界面應力、夾雜空氣及可見或次可見顆粒形成的風險。因此，這些指標傳統上是藉由使用實際生物製藥產品的全面調查來評估。使用產品進行全面調查既昂貴又耗時。全面調查的成本和時間限制降低了可重複性並增加了收集足夠樣本以減少採樣變異性的難度。此外，與全面調查相關的探針可能影響與混合準則相關的流量，並提供不精確的數據。由於全面調查的性質特定於給定之混合準則的參數，因此全面調查需要經常重新驗證。
本文公開的系統和方法可提供用於混合準則之改進的開發流程。例如，本文所述的系統和方法可允許開發能夠對混合準則進行高通量評估的預測模型。可以生成預測模型，該模型可量化與混合準則相關的氣液界面應力、夾雜空氣以及可見或次可見顆粒形成的風險。
參考圖2，開發用於評估混合準則之預測模型的方法200可包括映射設計空間201、構建實驗設計（design of experiment，DOE） 202之設計、進行計算流體動力學（CFD）分析203、建構候選預測模型204、 及／或評估預測 205。
映射設計空間201可包括確認將要被研究的混合準則參數。混合準則參數可包括「輸入變量」或混合準則的方面，這些方面可被調整、改變、控制及／或監控以影響混合準則的結果。混合準則參數的示例包括但不限於葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸、混合容器幾何形狀及混合時間。
葉輪速度能夠以每分鐘轉數（revolutions per minute，RPM）或最大葉輪速度的百分比來量化。批次大小可指混合容器裝載的體積，作為混合容器容量的百分比。溶液黏度和溶液密度是特定於感興趣蛋白質之參數。生產過程中，可在執行混合準則之前調節溶液黏度及密度以實現所需的黏度與密度參數。
除了上述潛在的混合準則參數之外，映射設計空間可包括確認潛在的混合容器尺寸及潛在的混合容器幾何形狀。混合容器可具有多種形狀和尺寸。例如，混合容器可包括圓柱形、圓錐形、橢圓形、方形或該等之組合。混合容器幾何形狀的示例示於圖3A和3B。圖3A所示的混合容器100包括高度和寬度，其中高度大於寬度。圖3B所示的混合容器100包括高度和寬度，其中寬度大於高度。混合容器100的高度與寬度的比例是混合容器幾何形狀的要素，且可影響混合容器100內流體流動的流型。
混合容器100可包括一個或多個能夠提供攪拌的機構。例如，混合容器100可包括一個或多個能夠在混合容器內提供流動的葉輪110。圖3A所示的混合容器100包括一個佈置在混合容器100一側的葉輪110。圖3B所示的混合容器100包括兩個葉輪 110，對稱地設置在混合容器 100 的相對側上。此外，或可替代地，混合容器 100 內的攪拌可由同心地安裝的葉輪、波動袋（wave bag）、搖擺致動器（rocking actuator）或其他攪拌混合容器 100 內的溶液之設備提供。
儘管示例性混合容器幾何形狀示於圖3A和3B，其僅為兩個示例。一些實施方式中，混合容器100可包括設計成改變混合容器100內的流體流動之擋板或其他結構。包括其他比例、配置、形狀及用於提供攪拌的機構之混合容器幾何形狀可與本文所述的系統和方法一起使用。
除了確認混合準則參數之外，映射設計空間201還可包括確認評估標準。評估標準可包括「輸出變量」或混合準則的方面，這些方面取決於被選擇用於混合準則參數的值。評估標準的示例包括但不限於流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、混合時間（例如穩態混合時間或暫態混合時間）、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、暴露分析、功率消耗、壓力、紊流消散率（turbulent dissipation rate）及科摩哥洛夫長度（Kolmogorov length）。
再次參考圖2，開發用於評估混合準則之預測模型的方法200可包括構建DOE設計202。例如，可在確認混合準則參數及評估標準之後構建DOE設計。實驗設計 （Design of Experiments，DOE） 是指一種構建實驗、模擬及／或測量的方法，能夠確認多變量相互作用。DOE正如本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解，不再詳細描述。
在開發用於評估混合準則之預測模型的上下文中，構建DOE設計202包括選擇用於每個經確認的混合準則參數之測試值，並確認為了確定用於每組混合準則參數測試值的評估標準而必須執行的實驗、模擬及測量。
例如，如果葉輪速度、批次大小、溶液黏度及混合容器大小被確認為四個混合準則參數，則構建DOE設計202包括選擇用於葉輪速度、批次大小、溶液黏度及混合容器大小的測試值。一些實施方式中，可選擇大約10至大約500個測試值，例如大約30至大約100個測試值用於每個混合準則參數。可選擇其他數量，例如小於大約 10個、或大約 100 至大約 1000個測試值用於每個混合準則參數。後續CFD分析的準確性與選擇用於每個混合準則參數之測試值的數量相關，且選擇更多用於某些混合準則參數之測試值可提供更有意義的CFD分析。
再次參考圖2，開發用於評估混合準則之預測模型的方法200可包括進行計算流體動力學（CFD）分析。例如，CFD 分析可在用於每個經確認之混合準則參數的測試值之後進行，並確認為了確定用於每組混合準則參數測試值的評估標準而必須執行的實驗、模擬及測量。
CFD分析可包括指示混合容器100內的流體流動之一種或多種模擬。例如，CFD分析可以包括穩定流動分析、短暫流動分析、混合時間分析及／或暴露分析。特別是，短暫流動分析可幫助評估從靜止到穩態速度的加速時間、評估起泡、發泡或晃蕩的可能性、以及量化表面變形（例如作為聚集體形成風險評估的一部分）。
CFD分析可基於流體流動模型的數學解，包括但不限於守恆定律、納維－斯托克斯方程 （Navier-Stokes equations）、歐拉方程式、白努利方程式、壓縮波方程式（compression wave equations）、邊界層方程式、理想化流動（idealized flow）、勢流、管道流（duct flow）、渦流形成、旋渦形成及紊流形成。CFD分析可由運行CFD分析軟體如包括Star CCM、OpenFoam、Simulia及Ansys Workbench系統的程序之計算機系統執行。
在本公開的上下文中，為了確定混合容器幾何形狀如何影響評估標準，可將一種或多種混合容器幾何形狀編程至操作分析軟體的計算機系統中。例如，混合容器100的尺寸和形狀、以及用於引起攪拌的機構（例如葉輪110）的尺寸、形狀及佈置可被建模，以構築上述各種流動模擬。
CFD分析的結果可包括向量圖、流線圖、應變率等值線圖、應變直方圖、流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、穩態混合時間、暫態混合時間、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、暴露分析、功率消耗、壓力、紊流消散率及／或科摩哥洛夫長度。
圖4A示出作為CFD分析的結果生成之示例性向量圖。向量圖包括多個向量310。每個向量310的方向指示在向量位置處流體流動的方向，且向量的大小表明在向量位置處流體流動的速度。圖4B示出作為CFD分析的結果生成之流線圖。流線圖包括多條流線320。每條流線代表與流動的速度向量相切之曲線，且表明流體要素（fluid element）在穩態下將行進至何處。
可以查看向量圖及流線圖以確定可影響混合準則之功效的停滯區域、渦流或其他流動結構。向量圖、流線圖或兩者均可用於定性地比較不同的混合準則參數（例如不同的混合容器幾何形狀）。
圖4C示出以黑色和白色描繪的應變率等值線圖。實際上，應變率等值線圖的不同區域可用不同的顏色表示。表1示出與標記區域331至336相關聯的近似應變率以及可用於代表圖4C 及表 1中所示應變率之分格的示例性顏色。
表 1 －與圖 4C 之區域相關的應變率之範圍
| 區域號碼 | 應變率範圍 （ s -1 ） | 示例性顏色 |
| 331 | 18.0–19.1 | 紅 |
| 332 | 15.8–17.9 | 橘 |
| 333 | 13.2–15.7 | 黃 |
| 334 | 5.5–13.1 | 綠 |
| 335 | 2.5–5.4 | 淡藍 |
| 336 | 0–2.4 | 深藍 |
表1中所示的應變率分格為一示例。應變率的分組及分佈可根據CFD分析期間所觀察到的應變率範圍而改變。可從應變率等值線圖中確定如應變直方圖、平均應變率及峰值應變的評估標準。可分析應變率等值線圖以確定混合容器中承受高等級應變的區域。
如前所述，混合準則的定量及定性評估標準（例如評估標準）可藉由CFD分析來確定。藉由 CFD 分析確定的評估標準對應於混合準則參數的一組測試值。評估標準與相應之混合準則參數的關係可用於評估混合準則參數的變化對混合準則的整體效用及／或功效的影響。
再次參考圖2，開發用於評估混合準則之預測模型的方法200可包括建構候選預測模型204。例如，可在確定用於混合準則參數的相應測試值之評估標準後建構候選預測模型。對於每個經確認的評估標準，可選擇一個或多個候選預測模型。
圖5示出開發及排序用於評估標準之潛在預測模型的示例性方法。開發及排序潛在預測模型的方法可包括開發適用模型之域（步驟401）、去除重複模型及變異數膨脹因子大於或等於共線性閾值的模型（步驟402）、確認候選模型池（步驟403）、以及基於複雜性與相關性對候選模型進行排序（步驟404）。開發及排序潛在預測模型的方法可應用於在DOE設計中確認的每個評估標準，以生成用於每個評估標準之候選預測模型的排序池。
開發及排序潛在的預測模型包括基於經確認的混合準則參數，開發用於給定之評估標準的適用模型之域。這種情況下，模型是指使評估標準與混合準則參數相關聯的代數表式（algebraic expression）。在開發適用模型之域時，考慮混合準則參數之間的單變量、雙變量、三變量及其他多變量關係。例如，可考慮混合準則參數的乘積、商、指數及其他多變量關係。適用模型之域也可包括已知的機械性或實驗性關係。一些實施方式中，適用模型之域包括數以萬計的模型，例如超過50000個潛在的預測模型。
在開發模型域之後，可去除具有重複參數的模型。例如，在開發使評估標準與混合準則參數相關聯的代數表式時，可創建等效表式（equivalent expression）。這些等效表式在功能上可為能夠從域中刪除之重複項。可以計算每個剩餘模型的變異數膨脹因子 （variance inflation factor，VIF），且可從域中移除VIF大於或等於共線性閾值之模型。一些實施方式中，共線性閾值為四個或更少，如兩個、三個或四個。在刪除具有重複參數的模型及VIF大於或等於共線性閾值的模型後，剩餘的模型子集可包括數百個模型。例如，剩餘的模型子集合可包括少於或等於500個模型。
可從剩餘的模型子集合中確認候選預測模型池。例如，候選預測模型池可包括單變量模型、雙變量模型及三變量模型。來自候選預測模型池的每個候選預測模型可具有大於或等於大約0.70之R
2值。一些實施方式中，來自候選預測模型池的每個候選預測模型可具有能夠大於或等於大約以下值的R
2值：0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.9或0.95。一些實施方式中，候選預測模型池包括具有最大R
2值的單變量模型、具有最大R
2值的雙變量模型及具有最大R
2值的三變量模型。在確認候選預測模型池之後，可根據複雜性及相關性對候選預測模型進行排序。例如，與從 CFD 分析獲得的數據具有更高相關性（例如更高的 R
2值）之預測模型可根據相關性而排序更高，而具有較低複雜性（例如更少項）的預測模型可具有較正的複雜性排序。在以下的示例部分中描述評估潛在預測模型與CFD分析結果之相關性的更多示例。可以組合這兩種排序，從而與自CFD分析獲得的數據具有更高相關性（例如更高的 R
2值）且具有最低複雜性（例如更少項）的預測模型可比具有較低 R
2值及／或較複雜的預測模型排序更高。
在根據複雜性及相關性對預測模型進行排序之後，可根據期望的複雜性及相關性屬性來選擇預測模型。可針對其他混合準則參數測試值或混合準則類型進一步研究選定之預測模型。
再次參考圖2，開發用於評估混合準則之預測模型的方法200可包括評估預測。可在混合準則參數測試值之增加的範圍內測試候選預測模型，以生成預測的評估標準。
可將預測的評估標準與全面調查或CFD分析進行比較，以驗證選定的預測模型。一旦針對評估標準及一組混合準則參數驗證了預測模型，該模型便可用於以高通量方式評估數千種混合準則。能夠以預測模型評估之混合準則的速率可解決最佳混合準則參數條件。
此外，或可替代地，可將來自文獻之已知機械性或實驗性關係與候選預測模型進行比較。如果藉由添加來自已知的或實驗性關係之項來改進候選預測模型的相關性，則可將該項併入候選預測模型中。
隨著更多預測模型的生成及CFD分析數據庫的增長，將生成用於每個經確認的評估標準之更精確的預測模型。所有混合準則參數的所有評估標準都能夠以上述高通量方式進行評估，以確定哪些混合準則參數會導致足夠的評估標準。
有利地，評估混合準則的高通量方式可顯著節省確認適用於生產生物製藥產品之混合準則的時間。
示例
示例
1
以混合時間作為評估標準進行CFD混合時間分析，並將批次大小、葉輪速度及溶液黏度確定為混合準則參數。確定了一個候選預測模型，且藉由方程式1描述：
T
blend= c
1+ c
2X
1+ c
3X
3+ c
4X
2X
3方程式（1）
其中 T
blend為混合時間，X
1為批次大小，X
2為葉輪速度，X
3為溶液黏度，c
1、c
2、c
3及c
4為常數。對於混合準則參數的測試值，繪製由CFD確定之 T
blend與由方程式1確定的T
blend之圖，並示於圖6。圖6還示出相關性為1:1之線及相關性為1:1之線周圍的區域，以說明預測模型與CFD分析結果之相關性。與來自Flickinger and Nienow,
Scale-Up, Stirred Tank Reactors, Encyclopedia of Industrial Biotechnology （2010） 中的已知關係相比，預測模型與CFD分析的相關性更好。
示例
2
以平均應變率作為評估標準，將批次大小、葉輪速度及溶液黏度確定為混合準則參數，進行了CFD應變等值線分析。確定了一個候選預測模型，並藉由方程式 2 描述：
方程式（2）
其中γ
mean為平均應變率，X
1為批次大小，X
2為葉輪速度，c
1、c
2及c
3為常數。對於混合準則參數的測試值，繪製由CFD確定的混合準則參數測試值之γ
mean與由方程式2確定的γ
mean之圖，並示於圖7。圖7還示出1:1相關之線及1:1相關之線周圍的區域，以說明預測模型與CFD分析結果之相關性。基於 Ladner et al.,
CFD Supported Investigation of Shear Induced by Bottom-Mounted Magnetic Stirrer in Monoclonal Antibody Formulation, Pharm. Res. 35（11）: 215, September 25, 2018.，藉由添加
項改進了預測模型的相關性。
示例
3
應變率直方圖可藉由CFD分析而生成。然而，為一種測試值之組合生成應變率直方圖是時間密集型的。更有效的方法可包括生成預測模型以描述累積應變（cumulative strain）並基於預測模型繪製應變率直方圖。使用預測模型生成的應變率直方圖之示例示於圖8。
參考圖8，根據應變率的預測模型（方程式2），生成應變率直方圖之點（例如t=20、t=40、t=60、t=75、t=80 和與t=90之點）。這些點繪製於直方圖中，如圖8所示。與傳統的基於CFD之暴露分析相比，由直方圖描述之累積應變可更快地生成，且相關之勞動更少。
示例
4
在不受理論限制的情況下，可見和次可見粒子形成之可能機制示於圖9A至9C。單獨的蛋白質702（例如宿主細胞蛋白質、感興趣蛋白質等）可存在於混合容器100內的溶液700中。如圖9A所示，溶液700的表面710最初可不含蛋白質聚集體712。
蛋白質702可響應於吸附在氣液界面（例如表面710）處之表面張力而變形。於變形時，蛋白質702的帶電荷區域可以暴露。由於熱力學環境，暴露的電荷區域可能會聚集。聚集的蛋白質可在表面710處形成網狀物712，如圖9B所示。當溶液700的表面710受到干擾時（例如因混合準則），網狀物712可能被破壞且被破壞的網狀物712的碎片可能被吸入溶液700的主體中。
破碎的網狀物碎片可與其他蛋白質702聚集，以形成更大的網狀物 712，其將再次破裂並被吸入溶液700的主體中。當蛋白質網狀物的碎片達到足夠的大小時 ，其被檢測為溶液700內的大聚集體720，如圖9C所示。大聚集體720可表現為可見顆粒且可使溶液700混濁。
解決顆粒形成風險的傳統方法依賴流體動力剪切的研究。然而，流體動力剪切未考慮蛋白質聚集體的形成，且基於剪切的按比例之測試無法預測所有生產比例的評估標準。由於難以量化粒子形成的影響、過濾器性能的變化以及缺乏對溶液中可見及次可見粒子的長期行為之了解，粒子形成的風險仍為混合準則開發的障礙。
氣液界面處的應力很可能是聚集體形成的主要因素。夾雜空氣也有助於聚集體的形成。表面張力與自由能估計以及原子力顯微鏡觀察支持夾雜空氣在聚集體形成中的作用。固液界面應力、空蝕、核形成及熱應力可能次要地促成聚集體的形成。
為了更好地量化粒子形成的風險，可根據本文描述的實施方式開發預測模型，該預測模型將粒子形成的風險描述為混合準則參數的函數。可能的混合準則參數包括聚集蛋白的特徵、溶液的賦形劑特性及環境因素（例如溫度、壓力等）。
CFD分析可以確定垂直速度等值線和體積平均速度。圖10A示出由CFD確定的垂直速度等值線之示例。圖10B示出由CFD確定的體積平均速度之示例。本文中，體積平均速度是指液體表面附近的體積中之空間平均流體速度。
與前文所述的應變率等值線圖（圖4C）類似，實際上，垂直速度等值線圖與體積平均速度的不同區域可由根據區域的速度分配之不同顏色來表示。表2示出可用於表示圖10A所示之變化的垂直速度的區域之示例性顏色以及圖10B所示之變化的體積平均垂直速度的區域。
表 2 －與圖 10A 及 10B 之區域相關的示例性顏色
| 區域號碼 | 示例性顏色 |
| 331 | 紅 |
| 332 | 橘 |
| 333 | 黃 |
| 334 | 綠 |
| 335 | 淡藍 |
| 336 | 深藍 |
可繪製由CFD確定之垂直速度等值線與它們在混合容器中之位置的關係，以說明垂直速度的相對差異之間的關係作為位置的函數。例如，CFD分析可確定混合容器的每個計算單元之垂直速度值。可繪製垂直速度與沿著從混合容器中心的半徑之線性位移的關係，如圖11所示。每個測量801對應於具有垂直速度以及沿著混合容器的半徑之位置的計算單元。加權平均值820可自各測量值801中確定，其中分配給每個測量值 801 的權重與對應於該測量值 801 之計算單元的體積相關。
可以使用上述技術開發用於評估聚集體形成風險的預測模型。例如，聚集蛋白的特徵、溶液的賦形劑特性、環境因素與聚集體形成之間的關係可使用由CFD確定的垂直速度等值線或體積平均速度來確定。
藉由以下非限制性項目進一步描述本公開。
項目1：一種開發預測模型的方法，該方法包括：
（a）確認用於該預測模型之混合準則參數；
（b）選擇用於該混合準則參數之測試值；
（c）對每個測試值的組合進行計算流體動力學 （CFD） 模擬；
（d）生成與該混合準則參數相關之潛在預測模型域；及
（e）對與該混合準則參數相關之該潛在預測模型域進行排序。
項目2：如項目1的方法，進一步包括：
在步驟（a）之後確認用於該預測模型之評估標準；
確認為了在步驟（b）之後生成該評估標準而需要執行的CFD模擬；
在步驟 （d） 之後從該潛在預測模型域確認候選預測模型池；及
對該候選預測模型池進行排序。
項目3：如項目1或2中任一項的方法，其中該混合準則參數包括以下之兩項或更多項：葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器幾何形狀。
項目4：如項目1的方法，其中該評估標準包括以下之兩項或更多項：流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、穩態混合時間、暫態混合時間、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、暴露分析及功率消耗。
項目5：如項目2或4中任一項的方法，其中該確認之CFD模擬包括穩態流動分析、暫態流動分析、混合時間分析及／或暴露分析。
項目6：如項目2的方法，其進一步包括在生成潛在預測模型域之後且在確認候選預測模型池之前，
計算該潛在預測模型域中每個潛在預測模型之變異數膨脹因子；及
從該潛在預測模型域去除變異數膨脹因子大於或等於共線性閾值之潛在預測模型，從而生成潛在預測模型之子集合。
項目7：如項目6的方法，其中該候選預測模型池包括來自該子集合之R
2值高於該子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、以及來自該子集合之R
2值高於該子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型。
項目8：如項目2的方法，其中對該候選預測模型池進行排序包括基於項數對該候選預測模型池進行排序、基於R
2值對該候選預測模型池進行排序、或兩者兼具。
項目9：如項目1至8中任一項的方法，其中該測試值為第一測試值，且該方法進一步包括：
使用來自該候選預測模型池之候選預測模型，生成對應於第二測試值的組合之該評估標準的估計值。
項目10：如項目9的方法，其中該方法進一步包括：
對該第二測試值的組合進行該CFD模擬，以生成對應於該第二測試值的組合之評估標準；及
將對應於該第二測試值的組合之該評估標準與對應於該第二測試值的組合之該評估標準的該估計值進行比較。
項目11：一種開發預測模型的方法，該方法包括：
確認用於該預測模型之第一、第二及第三混合準則參數；
確認用於該預測模型之第一及第二評估標準；
選擇用於該第一混合準則參數之第一測試值；
選擇用於該第二混合準則參數之第二測試值；
選擇用於該第三混合準則參數之第三測試值；
確認為了生成該第一評估標準而需要執行之第一計算流體動力學（CFD）模擬；
確認為了生成該第二評估標準而需要執行之第二CFD模擬；
藉由對該第一測試值、該第二測試值及該第三測試值的每個組合進行該第一CFD模擬，生成對應於第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合之第一評估標準；
藉由對第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合進行該第二CFD模擬，生成對應於第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合之第二評估標準；
生成使該第一、該第二及該第三混合準則參數與該第一評估標準相關聯之第一預測模型的第一域；及
生成使該第一、該第二及該第三混合準則參數與該第二評估標準相關聯之第二預測模型的第二域。
項目 12：如項目 11 的方法，進一步包括：
計算用於每個第一預測模型及每個第二預測模型的變異數膨脹因子；
從第一預測模型的該第一域去除變異數膨脹因子大於或等於三的第一預測模型，從而生成第一預測模型的第一子集合；
從第二預測模型的該第二域去除變異數膨脹因子大於或等於三的第二預測模型，從而生成第二預測模型的第二子集合；
確認候選第一預測模型的第一池，該第一池包括來自該第一子集合之R
2值高於該第一子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、來自該第一子集合之R
2值高於該第一子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型、及來自該第一子集合之R
2值高於該第一子集合中的所有其他三變量模型之三變量模型；以及
確認候選第二預測模型的第二池，該第二池包括來自該第二子集合之R
2值高於該第二子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、來自該第二子集合之R
2值高於該第二子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型、及來自該第二子集合之R
2值高於該第二子集合中的所有其他三變量模型之三變量模型。
項目13：如項目 12 的方法，進一步包括：
選擇用於該第一混合準則參數之第四測試值；
選擇用於該第二混合準則參數之第五測試值；
選擇用於該第三混合準則參數之第六測試值；
使用候選第一預測模型的該第一池之每個候選第一預測模型，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之經估計的第一評估標準；
藉由對第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合進行該第一CFD模擬，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第一評估標準；以及
將由候選第一預測模型的該第一池之每個候選第一預測模型生成的經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第一評估標準進行比較。
項目14：如項目13的方法，進一步包括：
使用候選第二預測模型的該第二池之每個候選第二預測模型，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之經估計的第二評估標準；
藉由對第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合進行該第二CFD模擬，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第二評估標準；以及
將由候選第二預測模型的該第二池之每個候選第二預測模型生成的經估計的第二評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第二評估標準進行比較。
項目15：如項目14的方法，進一步包括：
基於該經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第一評估標準的比較，從候選第一預測模型的該第一池選擇第一預測模型；
基於該經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第一評估標準的比較，從候選第二預測模型的該第二池選擇第二預測模型；
使用該第一預測模型，確定對應於混合準則之第一評估標準；以及
使用該第二預測模型，確定對應於混合準則之第二評估標準。
項目16：如項目9的方法，其中該第一及該第二評估標準選自包括以下之清單：流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、穩態混合時間、暫態混合時間、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、暴露分析及功率消耗。
項目17：一種對與混合準則相關之剪切應變進行建模的方法，該方法包括：
確認用於預測模型之混合準則參數；
選擇用於該混合準則參數之測試值；
對測試值的每個組合進行計算流體動力學暴露分析，從而生成對應於測試值的每個組合之剪切應變；
確認候選預測模型池；
對該候選預測模型池進行排序；
從該候選預測模型池選擇預測模型；以及
使用該預測模型，於多個時間間隔評估該混合準則之累積剪切應變，以生成剪切應變直方圖數據。
項目18：如項目17的方法，其中該混合準則參數包括以下兩項或更多項：葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器幾何形狀。
項目19：如項目17的方法，其中該混合準則為與生物反應器中的生物製藥產品相關聯之混合準則。
項目20：如項目17的方法，進一步包括使用該剪切應變直方圖數據以評估可見或次可見粒子形成之風險。
項目21：如項目17的方法，其中對該候選預測模型池進行排序包括基於項數對該候選預測模型池進行排序、基於R
2值對該候選預測模型池進行排序、或兩者兼具；且
從該候選預測模型池選擇預測模型包括選擇具有最高R
2值的模型。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解，本公開所基於的概念可容易地用作設計用於實現本公開的多個目的之其他方法及系統的基礎。因此，申請專利範圍不應被認為受到前文描述的限制。
100:混合容器
110:葉輪
200:開發用於評估混合準則之預測模型的方法
201:映射設計空間
202:構建實驗設計
203:進行計算流體動力學（CFD）分析
204:建構候選預測模型
205:評估預測
310:向量
320:流線
331:標記區域
332:標記區域
333:標記區域
334:標記區域
335:標記區域
336:標記區域
401:步驟
402:步驟
403:步驟
404:步驟
605:區域
610:曲線
700:溶液
702:蛋白質
710:表面
712:網狀物
720:大聚集體
801:測量值
820:加權平均值
包含於本說明書中並構成本說明書之一部分的圖式示出了各種示例性實施方式，並且與本文敘述一同用於解釋所公開之實施方式的原理。本文所述之實施方式或示例（例如組成物、製劑、方法等）的任何特徵可與任何其他實施方式或示例進行組合，且所有此類組合都包含於本公開內容中。此外，所描述之系統和方法既不限於任何單一方面或其實施方式，也不限於這些方面和實施方式的任何組合或排列。為簡潔起見，本文不單獨討論及／或說明某些排列及組合。
圖1描繪根據本公開的方面之應變直方圖。
圖2以流程圖的形式描繪根據本公開的方面之開發用於評估混合準則的預測模型之示例性方法。
圖3A及3B是根據本公開的方面之混合容器的圖形表示。
圖4A是根據本公開的方面之流體流動向量場的視覺描繪。
圖4B是根據本公開的方面之流體流動流線的視覺描繪。
圖4C是根據本公開的方面之等值線剪切應變率的視覺描繪。
圖5以流程圖的形式描繪根據本公開的方面之用於建構潛在預測模型的示例性方法。
圖6描繪根據本公開的方面之藉由CFD分析確定的混合時間與藉由預測模型確定的混合時間之關係圖。
圖7描繪根據本公開的方面之藉由CFD分析確定的應變率與藉由預測模型確定的應變率之關係圖。
圖8描繪根據本公開的方面之藉由繪製預測模型而生成的應變率直方圖。
圖9A至9C是根據本公開的方面之聚集體形成的理論化機制之視覺描繪。
圖10A是根據本公開的方面之垂直速度等值線的視覺描繪。
圖10B是根據本公開的方面之體積－平均速度的視覺描繪。
圖11描繪了根據本公開的方面之作為槽半徑（tank radius）函數的垂直速度圖。
110:葉輪
331:標記區域
332:標記區域
333:標記區域
334:標記區域
335:標記區域
336:標記區域
710:表面
Claims (21)
- 一種開發預測模型的方法，該方法之特徵在於包括： （a）確認用於該預測模型之混合準則參數； （b）選擇用於該混合準則參數之測試值； （c）對每個測試值的組合進行計算流體動力學 （CFD） 模擬； （d）生成與該混合準則參數相關之潛在預測模型域；及 （e）對與該混合準則參數相關之該潛在預測模型域進行排序。
- 如請求項1記載的方法，其進一步包括： 在步驟（a）之後確認用於該預測模型之評估標準； 確認為了在步驟（b）之後生成該評估標準而需要執行的CFD模擬； 在步驟 （d） 之後從該潛在預測模型域確認候選預測模型池；及 對該候選預測模型池進行排序。
- 如請求項1或2記載的方法，其中該混合準則參數包括以下之兩項或更多項：葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器幾何形狀。
- 如請求項2記載的方法，其中該評估標準包括以下之兩項或更多項：流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、穩態混合時間、暫態混合時間、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、暴露分析及功率消耗。
- 如請求項2或4記載的方法，其中該確認之CFD模擬包括穩態流動分析、暫態流動分析、混合時間分析及／或暴露分析。
- 如請求項2記載的方法，其進一步包括在生成潛在預測模型域之後且在確認候選預測模型池之前， 計算該潛在預測模型域中每個潛在預測模型之變異數膨脹因子；及 從該潛在預測模型域去除變異數膨脹因子大於或等於共線性閾值之潛在預測模型，從而生成潛在預測模型之子集合。
- 如請求項6記載的方法，其中該候選預測模型池包括來自該子集合之R 2值高於該子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、以及來自該子集合之R 2值高於該子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型。
- 如請求項2記載的方法，其中對該候選預測模型池進行排序包括基於項數對該候選預測模型池進行排序、基於R 2值對該候選預測模型池進行排序、或兩者兼具。
- 如請求項1至8中任一項記載的方法，其中該測試值為第一測試值，且該方法進一步包括： 使用來自該候選預測模型池之候選預測模型，生成對應於第二測試值的組合之該評估標準的估計值。
- 如請求項9記載的方法，其中該方法進一步包括： 對該第二測試值的組合進行該CFD模擬，以生成對應於該第二測試值的組合之評估標準；及 將對應於該第二測試值的組合之該評估標準與對應於該第二測試值的組合之該評估標準的該估計值進行比較。
- 一種開發預測模型的方法，該方法之特徵在於包括： 確認用於該預測模型之第一、第二及第三混合準則參數； 確認用於該預測模型之第一及第二評估標準； 選擇用於該第一混合準則參數之第一測試值； 選擇用於該第二混合準則參數之第二測試值； 選擇用於該第三混合準則參數之第三測試值； 確認為了生成該第一評估標準而需要執行之第一計算流體動力學（CFD）模擬； 確認為了生成該第二評估標準而需要執行之第二CFD模擬； 藉由對第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合進行該第一CFD模擬，生成對應於第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合之第一評估標準； 藉由對第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合進行該第二CFD模擬，生成對應於第一測試值、第二測試值及第三測試值的每個組合之第二評估標準； 生成使該第一、該第二及該第三混合準則參數與該第一評估標準相關聯之第一預測模型的第一域；及 生成使該第一、該第二及該第三混合準則參數與該第二評估標準相關聯之第二預測模型的第二域。
- 如請求項11記載的方法，進一步包括： 計算用於每個第一預測模型及每個第二預測模型的變異數膨脹因子； 從第一預測模型的該第一域去除變異數膨脹因子大於或等於三的第一預測模型，從而生成第一預測模型的第一子集合； 從第二預測模型的該第二域去除變異數膨脹因子大於或等於三的第二預測模型，從而生成第二預測模型的第二子集合； 確認候選第一預測模型的第一池，該第一池包括來自該第一子集合之R 2值高於該第一子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、來自該第一子集合之R 2值高於該第一子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型、及來自該第一子集合之R 2值高於該第一子集合中的所有其他三變量模型之三變量模型；以及 確認候選第二預測模型的第二池，該第二池包括來自該第二子集合之R 2值高於該第二子集合中的所有其他單變量模型之單變量模型、來自該第二子集合之R 2值高於該第二子集合中的所有其他雙變量模型之雙變量模型、及來自該第二子集合之R 2值高於該第二子集合中的所有其他三變量模型之三變量模型。
- 如請求項12記載的方法，進一步包括： 選擇用於該第一混合準則參數之第四測試值； 選擇用於該第二混合準則參數之第五測試值； 選擇用於該第三混合準則參數之第六測試值； 使用候選第一預測模型的該第一池之每個候選第一預測模型，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之經估計的第一評估標準； 藉由對第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合進行該第一CFD模擬，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第一評估標準；以及 將由候選第一預測模型的該第一池之每個候選第一預測模型生成的經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第一評估標準進行比較。
- 如請求項13記載的方法，進一步包括： 使用候選第二預測模型的該第二池之每個候選第二預測模型，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之經估計的第二評估標準； 藉由對第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合進行該第二CFD模擬，生成對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之第二評估標準；以及 將由候選第二預測模型的該第二池之每個候選第二預測模型生成的經估計的第二評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第二評估標準進行比較。
- 如請求項14記載的方法，進一步包括： 基於該經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第一評估標準的比較，從候選第一預測模型的該第一池選擇第一預測模型； 基於該經估計的第一評估標準與對應於第四測試值、第五測試值及第六測試值的每個組合之該第一評估標準的比較，從候選第二預測模型的該第二池選擇第二預測模型； 使用該第一預測模型，確定對應於混合準則之第一評估標準；以及 使用該第二預測模型，確定對應於混合準則之第二評估標準。
- 如請求項9記載的方法，其中該第一及該第二評估標準選自包括以下之清單：流型、流體速度分佈、流體流動向量場、流體流動流線、穩態混合時間、暫態混合時間、停留時間分佈、等值線剪切應變率、平均剪切應變率、暴露分析及功率消耗。
- 一種對與混合準則相關之剪切應變進行建模的方法，該方法包括： 確認用於預測模型之混合準則參數； 選擇用於該混合準則參數之測試值； 對測試值的每個組合進行計算流體動力學暴露分析，從而生成對應於測試值的每個組合之剪切應變； 確認候選預測模型池； 對該候選預測模型池進行排序； 從該候選預測模型池選擇預測模型；以及 使用該預測模型，於多個時間間隔評估該混合準則之累積剪切應變，以生成剪切應變直方圖數據。
- 如請求項17記載的方法，其中該混合準則參數包括以下兩項或更多項：葉輪速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器幾何形狀。
- 如請求項17記載的方法，其中該混合準則為與生物反應器中的生物製藥產品相關聯之混合準則。
- 如請求項17記載的方法，進一步包括使用該剪切應變直方圖數據以評估可見或次可見粒子形成之風險。
- 如請求項17記載的方法，其中對該候選預測模型池進行排序包括基於項數對該候選預測模型池進行排序、基於R 2值對該候選預測模型池進行排序、或兩者兼具；且 從該候選預測模型池選擇預測模型包括選擇具有最高R 2值的模型。
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