CN117099162A - 用于开发混合协议的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
一种开发预测模型的方法可包括确认用于该预测模型的混合协议参数、确认用于该预测模型的评估标准、选择用于该混合协议参数的测试值、确认为了生成该评估标准而需要执行的计算流体动力学(CFD)模拟、对测试值的每个组合进行该CFD仿真，从而生成对应于测试值的每个组合的评估标准、生成使该混合协议参数与该评估标准相关的潜在预测模型域、从该潜在预测模型域确认候选预测模型池、以及对该候选预测模型池进行排序。
Description
相关申请的交叉引用
本专利申请主张2021年3月26日提交的美国临时专利申请号63/166,504及2022年1月12日提交的美国临时专利申请号63/298,880的优先权，两者整体均通过引用而并入本文。
技术领域
本公开是关于用于开发及实施混合协议的系统和方法。本公开的一些方面是关于用于对与治疗学的生物生产相关的混合协议进行高通量评估的系统和方法。
背景技术
生物制药产品(例如抗体、融合蛋白、腺相关病毒(adeno-associated viruses，AAVs)、蛋白质、组织、细胞、多肽或其他生物来源的治疗产品)越来越多地用于感染性疾病、遗传疾病、自体免疫疾病及其他疾病的治疗及预防。生物制药产品的生产需要精确且一致的条件。为了确保包括生物制药产品在内的解决方案是一致的，可在整个制造过程中采用混合协议。混合协议可帮助维持溶液成分(例如生物制药产品、细胞废物、宿主蛋白质、细胞外营养物、其他分子)在生物制药产品的生产所涉及的各种溶液中的适当分布。
混合协议可包括混合容器的形状及尺寸、溶液内流体流动的方向及速率与溶液的物理化学性质的参数。可针对各类型的生物制药产品、混合容器几何形状、培养基成分及宿主细胞开发混合协议。生物制药产品、混合容器几何形状、培养基成分或宿主细胞的修改可能需要重新开发混合协议。开发混合协议的传统方法是时间及劳力密集型的，且可能导致劣质的混合协议。
发明内容
本公开的实施方式可针对一种开发预测模型的方法。该方法可包括确认用于预测模型的混合协议参数、确认用于预测模型的评估标准及/或选择用于混合协议参数的测试值。该方法还可包括确认为了生成评估标准而需要执行的计算流体动力学(computationfluid dynamics，CFD)模拟。该方法还可包括对每个测试值的组合进行CFD仿真，从而生成对应于测试值的各组合的评估标准。该方法还可包括生成使混合协议参数与评估标准相关联的潜在预测模型域、从潜在预测模型域确认候选预测模型池、及/或对候选预测模型池进行排序。
本公开的一些实施方式中，混合协议参数可包括叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器几何形状中的两项或更多项。评估标准可包括以下两项或更多项：流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、稳态混合时间、瞬时混合时间、停留时间分布、等值线剪切应变率(contour shear strain rate)、平均剪切应变率、暴露分析及功耗。所确认的CFD模拟可包括稳态流动分析、瞬时流动分析、混合时间分析及/或暴露分析。一些实施方式中，开发混合预测模型的方法可进一步包括在生成潜在预测模型域之后且在确认候选预测模型池之前，计算潜在预测模型域中每个潜在预测模型的方差膨胀因子，及从潜在预测模型域去除方差膨胀因子大于或等于共线性阈值的潜在预测模型，从而生成潜在预测模型的子集合。候选预测模型池可包括来自子集合的R2值高于子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、以及来自子集合的R2值高于子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型。对候选预测模型池进行排序可包括基于项数对候选预测模型池进行排序、基于R2值对候选预测模型池进行排序、或两者兼具。本公开的一些实施方式中，测试值为第一测试值，且开发预测模型的方法进一步包括使用来自候选预测模型池的候选预测模型，生成对应于第二测试值的组合的评估标准的估计值。此外，该方法可进一步包括：对第二测试值的组合进行CFD仿真，以生成对应于第二测试值的组合的评估标准、以及将对应于第二测试值的组合的评估标准与对应于第二测试值的组合的评估标准的估计值进行比较。
本公开的进一步实施方式可包括开发预测模型的方法。该方法可包括确认用于预测模型的第一、第二及第三混合协议参数、确认用于预测模型的第一及第二评估标准、选择用于第一混合协议参数的第一测试值，选择用于第二混合协议参数的第二测试值、及/或选择用于第三混合协议参数的第三测试值。该方法还可包括确认为了生成第一评估标准而需要执行的第一计算流体动力学(CFD)模拟、确认为了生成第二评估标准而需要执行的第二CFD模拟、通过对第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合进行第一CFD仿真，生成对应于第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合的第一评估标准、及/或通过对第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合进行第二CFD仿真，生成对应于第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合的第二评估标准。该方法还可包括生成使第一、第二及第三混合协议参数与第一评估标准相关联的第一预测模型的第一域及/或生成使第一、第二及第三混合协议参数与第二评估标准相关联的第二预测模型的第二域。
本公开的一些实施方式中，开发预测模型的方法可进一步包括为计算用于每个第一预测模型及每个第二预测模型的方差膨胀因子、从第一预测模型的第一域去除方差膨胀因子大于或等于三的第一预测模型，从而生成第一预测模型的第一子集合、从第二预测模型的第二域去除方差膨胀因子大于或等于三的第二预测模型，从而生成第一预测模型的第二子集合、确认候选第一预测模型的第一池，该第一池包括来自第一子集合的R2值高于第一子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、来自第一子集合的R2值高于第一子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型、及来自第一子集合的R2值高于第一子集合中的所有其他三变量模型的三变量模型、确认候选第二预测模型的第二池，该第二池包括来自第二子集合的R2值高于第二子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、来自第二子集合的R2值高于第二子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型、及来自第二子集合的R2值高于第二子集合中的所有其他三变量模型的三变量模型、选择用于第一混合协议参数的第四测试值、选择用于第二混合协议参数的第五测试值、选择用于第三混合协议参数的第六测试值、使用候选第一预测模型的第一池的每个候选第一预测模型，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的经估计的第一评估标准、通过对第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合进行第一CFD仿真，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第一评估标准、将由候选第一预测模型的第一池的每个候选第一预测模型生成的经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第一评估标准进行比较、使用候选第二预测模型的第二池的每个候选第二预测模型，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的经估计的第二评估标准、通过对第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合进行第二CFD仿真，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第二评估标准、以及将由候选第二预测模型的第二池的每个候选第二预测模型生成的经估计的第二评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第二评估标准进行比较、基于经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第一评估标准的比较，从候选第一预测模型的第一池选择第一预测模型、基于经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第一评估标准的比较，从候选第二预测模型的第二池选择第二预测模型、使用第一预测模型，确定对应于混合协议的第一评估标准、以及使用第二预测模型，确定对应于混合协议的第二评估标准。
本公开的进一步实施方式可包括对与混合协议相关的剪切应变进行建模的方法。该方法可包括确认预测模型的混合协议参数、选择用于混合协议参数的测试值、对测试值的每个组合进行计算流体动力学暴露分析，从而生成对应于测试值的每个组合的剪切应变、确认候选预测模型池、对候选预测模型池进行排序、从候选预测模型池选择预测模型、以及使用预测模型，于多个时间间隔评估混合协议的累积剪切应变，以生成剪切应变直方图数据。
本公开的一些实施方式中，一种对与混合协议相关的剪切应变进行建模的方法包括其中混合协议参数包括以下两项或更多项：叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器几何形状。对候选预测模型池进行排序包括基于项数对候选预测模型池进行排序、基于R2值对候选预测模型池进行排序、或两者兼具，且从候选预测模型池选择预测模型包括选择具有最高R2值的模型。混合协议可为与生物反应器中的生物制药产品相关联的混合协议。该方法可进一步包括使用剪切应变直方图数据以评估可见或次可见(sub-visible)粒子形成的风险。
附图说明
包含于本说明书中并构成本说明书一部分的附图示出了各种示例性实施方式，并且与本文叙述一同用于解释所公开的实施方式的原理。本文所述的实施方式或示例(例如组成物、制剂、方法等)的任何特征可与任何其他实施方式或示例进行组合，且所有此类组合都包含于本公开内容中。此外，所描述的系统和方法既不限于任何单一方面或其实施方式，也不限于这些方面和实施方式的任何组合或排列。为简洁起见，本文不单独讨论及/或说明某些排列及组合。
图1描绘根据本公开的方面的应变直方图。
图2以流程图的形式描绘根据本公开的方面的开发用于评估混合协议的预测模型的示例性方法。
图3A及3B是根据本公开的方面的混合容器的图形表示。
图4A是根据本公开的方面的流体流动向量场的视觉描绘。
图4B是根据本公开的方面的流体流动流线的视觉描绘。
图4C是根据本公开的方面的等值线剪切应变率的视觉描绘。
图5以流程图的形式描绘根据本公开的方面的用于建构潜在预测模型的示例性方法。
图6描绘根据本公开的方面的通过CFD分析确定的混合时间与通过预测模型确定的混合时间的关系图。
图7描绘根据本公开的方面的通过CFD分析确定的应变率与通过预测模型确定的应变率的关系图。
图8描绘根据本公开的方面的通过绘制预测模型而生成的应变率直方图。
图9A至9C是根据本公开的方面的聚集体形成的理论化机制的视觉描绘。
图10A是根据本公开的方面的垂直速度等值线的视觉描绘。
图10B是根据本公开的方面的体积－平均速度的视觉描绘。
图11描绘了根据本公开的方面的作为槽半径(tank radius)函数的垂直速度图。
【实施方式】
除非另有定义，否则本文使用的所有技术及科学术语与本公开所属领域中具有通常知识者所通常理解的含义相同。尽管任何合适的方法和材料(例如类似于或等同于本文所述者)可用于本公开的实践或测试，但于此描述特定的示例方法。所提及的所有出版物均通过引用并入本文。
如本文所用，术语“包括”、“包含”或其任何其他变形旨在涵盖非排他性的包含，使得包括组件列表的过程、方法、物品或设备不仅包括该等组件，还可能包括未明确列出的其他组件或此类过程、方法、物品或设备所固有的组件。术语“示例性”是在“示例”而非“理想”的意义上而使用。对于术语“例如”与“如”及其语法上等同的用词，除非另有明确说明，否则应理解为遵循用词“且不限于”。
如本文所用，术语“约”旨在说明因实验误差所引起的变化。当应用于数值时，术语“约”可表示与公开的数值相差+/-5％，除非已指定不同的变化。如本文所用，单数形式“一”及“该”包括复数的所指物，除非上下文另有明确规定。此外，所有范围应理解为包括端点，例如1公分(cm)至5cm将包括1cm、5cm的长度、以及1cm与5cm之间的所有距离。
应当注意，除非已指定不同的变化，否则本文公开或要求保护的所有数值(包括所有公开的值、限制及范围)可具有与公开数值的+/-5％的变化。
如本文所用，术语“多肽”是指具有超过约20个通过酰胺键共价链接的胺基酸的任何胺基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个胺基酸聚合物链(例如多肽)。因此，多肽可为蛋白质，且蛋白质可包含多个多肽以形成单一功能性生物分子。
转译后修饰可修饰或改变多肽的结构。例如，双硫键(例如半胱氨酸残基之间的S-S键)可在某些蛋白质转译后形成。一些双硫键对于多肽、免疫球蛋白、蛋白质、辅因子、基质等的正确的结构、功能及相互作用而言是不可或缺的。除了双硫键形成之外，蛋白质还可进行其他转译后修饰，例如脂化(例如豆蔻酰化(myristoylation)、棕榈酰化(palmitoylation)、法呢酰化(farnesoylation)、香叶基香叶酰化(geranylgeranylation)及糖基磷脂酰肌醇锚的形成(glycosylphosphatidylinositol(GPI)anchor formation)、烷基化(例如甲基化)、酰化、酰胺化、醣基化(例如在精氨酸、天冬酰胺酸、半胱胺酸、羟离胺酸、丝胺酸、苏胺酸、酪氨酸及/或色胺酸上添加醣基)及磷酸化(即在丝胺酸、苏胺酸、酪氨酸及/或组胺酸上添加磷酸根)。转译后修饰可影响疏水性、静电表面性质或其他多肽参与的决定表面间相互作用的性质。
如本文所用，术语“蛋白质”包括生物治疗性蛋白质、用于研究或治疗的重组蛋白质、陷阱蛋白质(trap proteins)和其他Fc融合蛋白、嵌合蛋白(chimeric proteins)、抗体、单株抗体、人类抗体、双特异性抗体、抗体片段、类抗体分子、奈米抗体、重组抗体嵌合体、细胞激素、化学激活素、肽激素等。感兴趣蛋白质(protein of interest，POI)可包括欲分离、纯化或以其他方式制备的任何多肽或蛋白质。POI可包括由细胞产生的多肽，包括抗体。
如本文所用，术语“抗体”包括由四个多肽链，即通过双硫键相互连接的两条重(H)链及两条轻(L)链组成的免疫球蛋白。通常，抗体具有超过100kDa的分子量，如130kDa与200kDa之间，如约140kDa、145kDa、150kDa、155kDa或160kDa。每条重链包含重链可变区(heavy chain variable region，本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(heavy chainconstant region)。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2及CH3。每条轻链包含一个轻链可变区(light chain variable region，本文缩写为LCVR或VL)及一个轻链恒定区(lightchain constant region)。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH及VL区可进一步细分为高变异性区域，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，散布着更为保守的区域，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由3个CDR及4个FR组成，从胺基端到羧基端依以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2及HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2及LCDR3)。
一类称为免疫球蛋白G(IgG)的免疫球蛋白，例如，在人类血清中很常见且包含四条多肽链—两条轻链及两条重链。每条轻链经由胱胺酸双硫键连接于一条重链，两条重链经由两个胱胺酸双硫键相互键结。其他种类的人类免疫球蛋白包括IgA、IgM、IgD及IgE。就IgG而言，存在四个次类别：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。每个次类别的恒定区不同，因此可能具有不同的效应子功能(effector function)。本文所述的一些实施方式中，POI可包含靶多肽(target polypeptide)，包括IgG。至少一个实施方式中，靶多肽包括IgG4。
如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶催化获得的、合成的或基因工程的多肽或醣蛋白。抗体的抗原结合片段可衍生自例如完整的抗体分子，其使用任何合适的标准技术如蛋白水解消化或重组基因工程技术，包括操作及表现DNA编码抗体可变且可选地恒定的结构域。此种DNA为已知的及/或从例如商业来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)直接可得的，或者可被合成。DNA可通过使用分子生物技术被定序或被化学地操作，例如将一个或多个可变及/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子、产生半胱胺酸残基、修饰、添加或删除胺基酸等等。
可使用基于重组细胞的生产系统来生产靶分子(例如靶多肽/抗体)，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤酵母属(Pichia sp.))或哺乳动物系统(例如CHO细胞及CHO衍生物如CHO-K1细胞)。术语“细胞”包括任何适合表现重组核酸序列的细胞。细胞包括原核生物及真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酵母菌(S.cerevisiae)、裂殖酵母菌(S.pombe)、嗜甲醇酵母菌(P.Pastoris)、嗜甲醇毕赤酵母菌(P.methylica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、经杆状病毒(bacculovirus)感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物如融合瘤或四源融合瘤(quadromas)。一些实施方式中，细胞可为人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。一些实施方式中，细胞可为真核细胞且可选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞特利氏细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞及衍生自前面提到的细胞的细胞株。一些实施方式中，细胞可包含一种或多种病毒基因，例如表现病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
术语“靶分子”在本文中可用于指靶多肽(例如抗体、抗体片段或其他蛋白质或蛋白质片段)，或旨在制造、分离、纯化及/或包含于药品中(例如腺相关病毒(AAV)或其他用于治疗用途的分子)。虽然根据本公开的方法可与靶多肽相关，但该等可适用于其他靶分子。例如，可根据合适的方法(例如深度过滤、亲和层析等)制备AAV，且可对包括AAV的混合物进行根据本公开的方法。在遵循本公开的一种或多种方法之前或之后，可对包括AAV的混合物进行额外的程序(例如，去除“空匣(empty cassettes)”或不包含靶序列的AAV)。
一些实施方式中，靶分子为抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单株抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)或四抗体(tetrabody)、Fab片段或F(ab')2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。一个实施方式中，抗体为IgG1抗体。一个实施方式中，抗体为IgG2抗体。一个实施方式中，抗体为IgG4抗体。一个实施方式中，抗体为嵌合IgG2/IgG4抗体。一个实施方式中，抗体为嵌合IgG2/IgG1抗体。一个实施方式中，抗体为嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
一些实施方式中，靶分子(例如抗体)选自抗程序性(anti-Programmed)细胞死亡1抗体(anti-Programmed Cell Death 1antibody)(例如美国专利申请公开号US2015/0203579A1所述的抗PDl抗体(anti-PD1 antibody))、抗程序性细胞死亡配体-1(anti-Programmed Cell Death Ligand-1)(例如美国专利申请公开号US2015/0203580A1所述的抗PD-L1抗体(anti-PD-L1 antibody))、抗Dll4抗体、抗血管生成素-2抗体(anti-Angiopoetin-2antibody)(例如美国专利号9402898所述的抗-ANG2抗体)、类抗血管生成素3抗体(anti-Angiopoetin-Like 3antibody)(例如美国专利号9018356所述的抗AngPtl3抗体)，抗血小板衍生的生长因子受体抗体(anti-platelet derived growth factorreceptor antibody)(例如美国专利号9265827所述的抗PDGFR抗体)、抗催乳素受体抗体(anti-Prolactin Receptor antibody)(例如美国专利号9302015所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(anti-Complement 5antibody)(例如美国专利申请公开号US2015/0313194A1所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(anti-epidermal growth factorreceptor antibody)(例如美国专利号9132192所述的抗EGFR抗体或美国专利申请公开号US2015/0259423A1所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌素克新-9抗体(anti-Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-9antibody)(例如美国专利号8062640或美国专利申请公开号US2014/0044730A1所述的抗PCSK9抗体)、抗生长及分化因子-8抗体(anti-Growth And Differentiation Factor-8antibody)(例如美国专利号8871209或9260515所述的抗GDF8抗体，也称为抗肌生长抑制素抗体(anti-myostatin antibody))、抗升糖素受体(例如美国专利申请公开号US2015/0337045A1或US2016/0075778A1所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白细胞介素4受体抗体(interleukin 4receptorantibody)(例如美国专利申请公开号US2014/0271681A1或美国专利号8735095或8945559所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(anti-interleukin 6receptor antibody)(例如美国专利号7582298、8043617或9173880所述的抗IL6R抗体)、抗白介素33(anti-interleukin 33)(例如美国专利申请公开号US20140271658A1或US2014/0271642A1所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(anti-Respiratory syncytial virus antibody)(例如美国专利申请号US2014/0271653A1所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(anti-Cluster ofdifferentiation 3)(例如美国专利申请公开号US2014/0088295A1与US20150266966A1以及美国申请号62/222605所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(anti-Cluster ofdifferentiation 20)(例如美国专利申请公开号US2014/0088295A1和US20150266966A1以及美国专利号7879984所述的抗CD20抗体)、抗分化簇48(anti-Cluster ofDifferentiation-48)(例如美国专利号9228014所述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(anti-Fel d1 antibody)(如美国专利号9079948所述)、抗中东呼吸道症候群病毒(anti-MiddleEast Respiratory Syndrome virus)(例如抗MERS抗体)、抗伊波拉病毒抗体(例如Regeneron的REGN-EB3)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗Erb3抗体、抗兹卡病毒抗体(anti-Zikavirus antibody)、抗淋巴细胞激活基因3(anti-Lymphocyte Activation Gene 3)(例如抗LAG3抗体或抗CD223抗体)及抗激活素A抗体(anti-Activin A antibody)。本段落提及的各项美国专利及美国专利公开均通过引用整体并入。
一些实施方式中，靶分子(例如双特异性抗体)选自抗CD3Ⅹ抗CD20双特异性抗体、抗CD3Ⅹ抗黏液素16双特异性抗体及抗CD3Ⅹ抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体。一些实施方式中，靶分子选自由阿利若单抗(alirocumab)、撒立鲁单抗(sarilumab)、法神单抗(fasinumab)、内斯瓦库单抗(nesvacumab)、杜匹单抗(dupilumab)、特里沃单抗(trevogrumab)、艾维那单抗(evinacumab)及瑞奴库单抗(rinucumab)构成的组。
一些实施方式中，靶分子是包含Fc部分和另一个结构域的重组蛋白(例如Fc融合蛋白)。一些实施方式中，Fc融合蛋白为受体Fc融合蛋白，其包含与Fc部分偶合的受体的一个或多个胞外结构域。一些实施方式中，Fc部分包含铰链区，后接IgG的CH2及CH3结构域。一些实施方式中，受体Fc融合蛋白含有结合单个配体或多个配体的两条或更多条不同的受体链。例如，Fc融合蛋白为TRAP蛋白，如IL-1trap(例如利纳西普(rilonacept)，其包含与融合至hIgGl的Fc的Il-1R1细胞外区域融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利号6927004，其全部内容通过引用并入本文)，或VEGF trap(例如阿柏西普(aflibercept)或ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept)，其包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Fltl的Ig结构域3的VEGF受体Flk1的Ig结构域2；参见美国专利号7087411和7279159，两者均通过引用整体而并入)。其他实施方式中，Fc融合蛋白为ScFv-Fc-融合蛋白，其包含一种或多种抗原结合域中的一者或多者，如与Fc部分偶合的抗体的可变重链片段及可变轻链片段。
术语“培养基”或“培养介质”是指用于培养细胞的营养溶液，通常提供促进细胞生长所需的营养物质，如碳水化合物能量源、必需胺基酸、微量元素、维生素等。培养基可含有萃取物，例如血清或蛋白胨(水解物)，它们提供支持细胞生长的原材料。一些实施方式中，培养基可包含酵母来源或黄豆萃取物代替动物来源的萃取物。化学成分确定的培养基是指所有化学成分均为已知的培养基。化学成分确定的培养基可完全不含动物来源的成分，如血清或动物来源的蛋白胨。培养基也可不含蛋白质。“新鲜培养基”可指尚未被引入细胞培养物及/或尚未被细胞培养物的细胞利用的培养基。新鲜培养基可包含通常的高营养等级且几乎没有废物。“用过的培养基”可指在细胞培养中已被细胞使用的培养基，且与新鲜培养基相比，通常可包括较低的营养等级与较高的水等级。
通常，混合协议可结合至生物制药产品制造的几个阶段中。例如，在宿主细胞的培养或生物药物产品的获取期间，可使用混合协议来确保所产生的生物药物产品、细胞、营养物、废物和培养基的其他成分的适当分布。混合协议可与被配置为执行混合协议的容器一起使用，该容器也被称为混合容器。一些实施方式中，生物反应器可用作混合容器。其他实施方式中，可在执行混合协议之前将培养液从生物反应器转移至不同类型的混合容器。
在获取生物制药产品(例如感兴趣蛋白质)之后，所获取的产品可以保持在溶液中。包括生物药物产品的溶液可经历一个或多个层析、过滤(例如超过滤、渗滤(diafiltration)或其组合)、纯化(例如病毒去活)步骤以提高生物药物产品的纯度及有效性。在所有阶段，可以采用混合协议来使溶液均质化及/或确保溶液成分的合适分布。除了上面讨论的应用之外，可使用混合协议来组合及/或稀释单独的生物容器、批次或批量。
此外，混合协议可应用于不包括感兴趣蛋白质的溶液。例如，上述生物制药产品制造步骤需要使用缓冲液、培养基和其他溶液。缓冲液、培养基和其他溶液的制备可包括使用一种或多种混合协议。
可监控取决于混合协议的生物制药产品或其制造过程的特定性质，以评估混合协议的参数对所得生物制药产品的影响。例如，与混合协议相关的流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、混合时间(例如稳态混合时间或瞬时混合时间)、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、曝露分析及/或功耗可用于评估混合协议的效用及/或功效。
混合协议可包括用于混合容器的操作参数，例如混合容器的尺寸、叶轮速度、作为总容量百分比的负载大小、溶液的黏度及/或描述混合协议需求的其他操作参数。一些实施方式中，当溶液(包括例如培养基、细胞、感兴趣蛋白质及/或其他分子)充分均质化时，完成混合协议。混合协议的持续时间，即溶液达到足够均匀性所需的时间，称为混合时间。溶液混合的程度可通过混合指数来量化。混合指数可定义为(例如感兴趣蛋白质或其他分子的)浓度的标准偏差与最终浓度的比率。混合时间可量化为在给定的混合协议下达到大约5％的混合指数所需的时间量。
在混合协议的传统开发中，感兴趣蛋白质和含有感兴趣蛋白质的培养基的物理化学性质被认为产生了潜在的混合协议。潜在的混合协议经由替代的混合研究进行测试，以绘制操作范围并收集混合时间数据。基于从操作范围的各个点收集的混合时间数据，可确定一种或多种候选混合协议。能够以剪切应力及过度混合研究进一步测试候选的混合协议。剪切应力及过度混合研究可生成产品质量数据，其可用于评估候选的混合协议。
剪切及过度混合研究必须在混合时间数据生成后进行，因为剪切应力及过度混合取决于混合时间。若由剪切应力及过度混合研究提供的产品质量数据表明混合协议不合适，则必须重新开始混合协议的开发以生成潜在的混合协议。此外，必须对新的潜在混合协议进行替代混合研究，以生成可用于进一步剪切应力及过度混合研究的混合时间数据。
混合协议的这种传统开发流程受到限制，因为必须执行替代混合研究以评估可能最终导致不利的产品质量数据的混合协议。为了确定是否应研究潜在的混合协议的传统开发流程的运行多个实验的要求会导致混合协议的时间及劳力密集型开发。此外，会影响所得到的生物制药产品质量的与实施的混合协议相关的事件如气液界面应力、夹杂空气以及可见或次可见颗粒形成的风险，在传统的开发流程中没有得到解决。
除了传统的混合协议开发流程未能解决混合协议的所有可能导致对所得生物制药产品产生不利后果的因素之外，按比例(scaled)的研究会导致过高的剪切应力。图1示出应变直方图，其表示与传统混合协议开发相关的按比例的剪切应力研究如何高估剪切应力。曲线610示出与经过验证的混合协议的制造条件的区域605相比较的一个按比例的剪切应力研究的应变直方图。换句话说，区域605代表经过验证的制药产品混合协议中的实际剪切应力，而曲线610代表按比例的研究的预测剪切应力。图1中的图显示与混合协议的典型操作范围相比，按比例的研究具有更高的剪切应力。
与传统混合协议开发相关的替代混合研究、剪切应力及过度混合研究并未量化气液界面应力、夹杂空气及可见或次可见颗粒形成的风险。因此，这些指标传统上是通过使用实际生物制药产品的全面调查来评估。使用产品进行全面调查既昂贵又耗时。全面调查的成本和时间限制降低了可重复性并增加了收集足够样本以减少采样变异性的难度。此外，与全面调查相关的探针可能影响与混合协议相关的流量，并提供不精确的数据。由于全面调查的性质特定于给定的混合协议的参数，因此全面调查需要经常重新验证。
本文公开的系统和方法可提供用于混合协议的改进的开发流程。例如，本文所述的系统和方法可允许开发能够对混合协议进行高通量评估的预测模型。可以生成预测模型，该模型可量化与混合协议相关的气液界面应力、夹杂空气以及可见或次可见颗粒形成的风险。
参考图2，开发用于评估混合协议的预测模型的方法200可包括映射设计空间201、构建实验设计(design of experiment，DOE)202的设计、进行计算流体动力学(CFD)分析203、建构候选预测模型204、及/或评估预测205。
映射设计空间201可包括确认将要被研究的混合协议参数。混合协议参数可包括“输入变量”或混合协议的方面，这些方面可被调整、改变、控制及/或监控以影响混合协议的结果。混合协议参数的示例包括但不限于叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸、混合容器几何形状及混合时间。
叶轮速度能够以每分钟转数(revolutions per minute，RPM)或最大叶轮速度的百分比来量化。批次大小可指混合容器装载的体积，作为混合容器容量的百分比。溶液黏度和溶液密度是特定于感兴趣蛋白质的参数。生产过程中，可在执行混合协议之前调节溶液黏度及密度以实现所需的黏度与密度参数。
除了上述潜在的混合协议参数之外，映射设计空间可包括确认潜在的混合容器尺寸及潜在的混合容器几何形状。混合容器可具有多种形状和尺寸。例如，混合容器可包括圆柱形、圆锥形、椭圆形、方形或该等的组合。混合容器几何形状的示例示于图3A和3B。图3A所示的混合容器100包括高度和宽度，其中高度大于宽度。图3B所示的混合容器100包括高度和宽度，其中宽度大于高度。混合容器100的高度与宽度的比例是混合容器几何形状的要素，且可影响混合容器100内流体流动的流型。
混合容器100可包括一个或多个能够提供搅拌的机构。例如，混合容器100可包括一个或多个能够在混合容器内提供流动的叶轮110。图3A所示的混合容器100包括一个布置在混合容器100一侧的叶轮110。图3B所示的混合容器100包括两个叶轮110，对称地设置在混合容器100的相对侧上。此外，或可替代地，混合容器100内的搅拌可由同心地安装的叶轮、波动袋(wave bag)、摇摆致动器(rocking actuator)或其他搅拌混合容器100内的溶液的设备提供。
尽管示例性混合容器几何形状示于图3A和3B，其仅为两个示例。一些实施方式中，混合容器100可包括设计成改变混合容器100内的流体流动的挡板或其他结构。包括其他比例、配置、形状及用于提供搅拌的机构的混合容器几何形状可与本文所述的系统和方法一起使用。
除了确认混合协议参数之外，映射设计空间201还可包括确认评估标准。评估标准可包括“输出变量”或混合协议的方面，这些方面取决于被选择用于混合协议参数的值。评估标准的示例包括但不限于流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、混合时间(例如稳态混合时间或瞬时混合时间)、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、暴露分析、功耗、压力、紊流消散率(turbulent dissipation rate)及科摩哥洛夫长度(Kolmogorov length)。
再次参考图2，开发用于评估混合协议的预测模型的方法200可包括构建DOE设计202。例如，可在确认混合协议参数及评估标准之后构建DOE设计。实验设计(Design ofExperiments，DOE)是指一种构建实验、模拟及/或测量的方法，能够确认多变量相互作用。DOE正如本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解，不再详细描述。
在开发用于评估混合协议的预测模型的上下文中，构建DOE设计202包括选择用于每个经确认的混合协议参数的测试值，并确认为了确定用于每组混合协议参数测试值的评估标准而必须执行的实验、模拟及测量。
例如，如果叶轮速度、批次大小、溶液黏度及混合容器大小被确认为四个混合协议参数，则构建DOE设计202包括选择用于叶轮速度、批次大小、溶液黏度及混合容器大小的测试值。一些实施方式中，可选择大约10至大约500个测试值，例如大约30至大约100个测试值用于每个混合协议参数。可选择其他数量，例如小于大约10个、或大约100至大约1000个测试值用于每个混合协议参数。后续CFD分析的准确性与选择用于每个混合协议参数的测试值的数量相关，且选择更多用于某些混合协议参数的测试值可提供更有意义的CFD分析。
再次参考图2，开发用于评估混合协议的预测模型的方法200可包括进行计算流体动力学(CFD)分析。例如，CFD分析可在用于每个经确认的混合协议参数的测试值之后进行，并确认为了确定用于每组混合协议参数测试值的评估标准而必须执行的实验、模拟及测量。
CFD分析可包括指示混合容器100内的流体流动的一种或多种模拟。例如，CFD分析可以包括稳定流动分析、短暂流动分析、混合时间分析及/或暴露分析。特别是，短暂流动分析可帮助评估从静止到稳态速度的加速时间、评估起泡、发泡或晃荡的可能性、以及量化表面变形(例如作为聚集体形成风险评估的一部分)。
CFD分析可基于流体流动模型的数学解，包括但不限于守恒定律、纳维－斯托克斯方程(Navier-Stokes equations)、欧拉方程、伯努利方程、压缩波方程(compression waveequations)、边界层方程、理想化流动(idealized flow)、势流、管道流(duct flow)、涡流形成、旋涡形成及紊流形成。CFD分析可由运行CFD分析软件如包括Star CCM、OpenFoam、Simulia及Ansys Workbench系统的程序的计算机系统执行。
在本公开的上下文中，为了确定混合容器几何形状如何影响评估标准，可将一种或多种混合容器几何形状编程至操作分析软件的计算器系统中。例如，混合容器100的尺寸和形状、以及用于引起搅拌的机构(例如叶轮110)的尺寸、形状及布置可被建模，以构筑上述各种流动模拟。
CFD分析的结果可包括向量图、流线图、应变率等值线图、应变直方图、流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、稳态混合时间、瞬时混合时间、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、暴露分析、功耗、压力、紊流消散率及/或科摩哥洛夫长度。
图4A示出作为CFD分析的结果生成的示例性向量图。向量图包括多个向量310。每个向量310的方向指示在向量位置处流体流动的方向，且向量的大小表明在向量位置处流体流动的速度。图4B示出作为CFD分析的结果生成的流线图。流线图包括多条流线320。每条流线代表与流动的速度向量相切的曲线，且表明流体要素(fluid element)在稳态下将行进至何处。
可以查看向量图及流线图以确定可影响混合协议的功效的停滞区域、涡流或其他流动结构。向量图、流线图或两者均可用于定性地比较不同的混合协议参数(例如不同的混合容器几何形状)。
图4C示出以黑色和白色描绘的应变率等值线图。实际上，应变率等值线图的不同区域可用不同的颜色表示。表1示出与标记区域331至336相关联的近似应变率以及可用于代表图4C及表1中所示应变率格子的示例性颜色。
表1－与图4C的区域相关的应变率的范围
| 区域号码 | 应变率范围(s-1) | 示例性颜色 |
| 331 | 18.0–19.1 | 红 |
| 332 | 15.8–17.9 | 橙 |
| 333 | 13.2–15.7 | 黄 |
| 334 | 5.5–13.1 | 绿 |
| 335 | 2.5–5.4 | 淡蓝 |
| 336 | 0–2.4 | 深蓝 |
表1中所示的应变率格子为一示例。应变率的分组及分布可根据CFD分析期间所观察到的应变率范围而改变。可从应变率等值线图中确定如应变直方图、平均应变率及峰值应变的评估标准。可分析应变率等值线图以确定混合容器中承受高等级应变的区域。
如前所述，混合协议的定量及定性评估标准(例如评估标准)可通过CFD分析来确定。通过CFD分析确定的评估标准对应于混合协议参数的一组测试值。评估标准与相应的混合协议参数的关系可用于评估混合协议参数的变化对混合协议的整体效用及/或功效的影响。
再次参考图2，开发用于评估混合协议的预测模型的方法200可包括建构候选预测模型204。例如，可在确定用于混合协议参数的相应测试值的评估标准后建构候选预测模型。对于每个经确认的评估标准，可选择一个或多个候选预测模型。
图5示出开发及排序用于评估标准的潜在预测模型的示例性方法。开发及排序潜在预测模型的方法可包括开发适用模型的域(步骤401)、去除重复模型及方差膨胀因子大于或等于共线性阈值的模型(步骤402)、确认候选模型池(步骤403)、以及基于复杂性与相关性对候选模型进行排序(步骤404)。开发及排序潜在预测模型的方法可应用于在DOE设计中确认的每个评估标准，以生成用于每个评估标准的候选预测模型的排序池。
开发及排序潜在的预测模型包括基于经确认的混合协议参数，开发用于给定的评估标准的适用模型的域。这种情况下，模型是指使评估标准与混合协议参数相关联的代数表式(algebraic expression)。在开发适用模型的域时，考虑混合协议参数之间的单变量、双变量、三变量及其他多变量关系。例如，可考虑混合协议参数的乘积、商、指数及其他多变量关系。适用模型的域也可包括已知的机械性或实验性关系。一些实施方式中，适用模型的域包括数以万计的模型，例如超过50000个潜在的预测模型。
在开发模型域之后，可去除具有重复参数的模型。例如，在开发使评估标准与混合协议参数相关联的代数表式时，可创建等效表式(equivalent expression)。这些等效表式在功能上可为能够从域中删除的重复项。可以计算每个剩余模型的方差膨胀因子(variance inflation factor，VIF)，且可从域中移除VIF大于或等于共线性阈值的模型。一些实施方式中，共线性阈值为四个或更少，如两个、三个或四个。在删除具有重复参数的模型及VIF大于或等于共线性阈值的模型后，剩余的模型子集可包括数百个模型。例如，剩余的模型子集合可包括少于或等于500个模型。
可从剩余的模型子集合中确认候选预测模型池。例如，候选预测模型池可包括单变量模型、双变量模型及三变量模型。来自候选预测模型池的每个候选预测模型可具有大于或等于大约0.70的R2值。一些实施方式中，来自候选预测模型池的每个候选预测模型可具有能够大于或等于大约以下值的R2值：0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.9或0.95。一些实施方式中，候选预测模型池包括具有最大R2值的单变量模型、具有最大R2值的双变量模型及具有最大R2值的三变量模型。在确认候选预测模型池之后，可根据复杂性及相关性对候选预测模型进行排序。例如，与从CFD分析获得的数据具有更高相关性(例如更高的R2值)的预测模型可根据相关性而排序更高，而具有较低复杂性(例如更少项)的预测模型可具有较正的复杂性排序。在以下的示例部分中描述评估潜在预测模型与CFD分析结果的相关性的更多示例。可以组合这两种排序，从而与自CFD分析获得的数据具有更高相关性(例如更高的R2值)且具有最低复杂性(例如更少项)的预测模型可比具有较低R2值及/或较复杂的预测模型排序更高。
在根据复杂性及相关性对预测模型进行排序之后，可根据期望的复杂性及相关性属性来选择预测模型。可针对其他混合协议参数测试值或混合协议类型进一步研究选定的预测模型。
再次参考图2，开发用于评估混合协议的预测模型的方法200可包括评估预测。可在混合协议参数测试值的增加的范围内测试候选预测模型，以生成预测的评估标准。
可将预测的评估标准与全面调查或CFD分析进行比较，以验证选定的预测模型。一旦针对评估标准及一组混合协议参数验证了预测模型，该模型便可用于以高通量方式评估数千种混合协议。能够以预测模型评估的混合协议的速率可解决最佳混合协议参数条件。
此外，或可替代地，可将来自文献的已知机械性或实验性关系与候选预测模型进行比较。如果通过添加来自已知的或实验性关系的项来改进候选预测模型的相关性，则可将该项并入候选预测模型中。
随着更多预测模型的生成及CFD分析数据库的增长，将生成用于每个经确认的评估标准的更精确的预测模型。所有混合协议参数的所有评估标准都能够以上述高通量方式进行评估，以确定哪些混合协议参数会导致足够的评估标准。
有利地，评估混合协议的高通量方式可显著节省确认适用于生产生物制药产品的混合协议的时间。
示例
示例1
以混合时间作为评估标准进行CFD混合时间分析，并将批次大小、叶轮速度及溶液黏度确定为混合协议参数。确定了一个候选预测模型，且通过方程1描述：
Tblend＝c1+c2X1+c3X3+c4X2X3 方程(1)
其中Tblend为混合时间，X1为批次大小，X2为叶轮速度，X3为溶液黏度，c1、c2、c3及c4为常数。对于混合协议参数的测试值，绘制由CFD确定的Tblend与由方程1确定的Tblend的图，并示于图6。图6还示出相关性为1:1的线及相关性为1:1的线周围的区域，以说明预测模型与CFD分析结果的相关性。与来自Flickinger and Nienow,Scale-Up,Stirred TankReactors,Encyclopedia of Industrial Biotechnology(2010)中的已知关系相比，预测模型与CFD分析的相关性更好。
示例2
以平均应变率作为评估标准，将批次大小、叶轮速度及溶液黏度确定为混合协议参数，进行了CFD应变等值线分析。确定了一个候选预测模型，并通过方程2描述：
其中γmean为平均应变率，X1为批次大小，X2为叶轮速度，c1、c2及c3为常数。对于混合协议参数的测试值，绘制由CFD确定的混合协议参数测试值的γmean与由方程2确定的γmean的图，并示于图7。图7还示出1:1相关的线及1:1相关的线周围的区域，以说明预测模型与CFD分析结果的相关性。基于Ladner et al.,CFD Supported Investigation ofShear Induced by Bottom-Mounted Magnetic Stirrer in Monoclonal AntibodyFormulation,Pharm.Res.35(11):215,September 25,2018.，通过添加项改进了预测模型的相关性。
示例3
应变率直方图可通过CFD分析而生成。然而，为一种测试值的组合生成应变率直方图是时间密集型的。更有效的方法可包括生成预测模型以描述累积应变(cumulativestrain)并基于预测模型绘制应变率直方图。使用预测模型生成的应变率直方图的示例示于图8。
参考图8，根据应变率的预测模型(方程2)，生成应变率直方图的点(例如t＝20、t＝40、t＝60、t＝75、t＝80和与t＝90的点)。这些点绘制于直方图中，如图8所示。与传统的基于CFD的暴露分析相比，由直方图描述的累积应变可更快地生成，且相关劳动更少。
示例4
在不受理论限制的情况下，可见和次可见粒子形成的可能机制示于图9A至9C。单独的蛋白质702(例如宿主细胞蛋白质、感兴趣蛋白质等)可存在于混合容器100内的溶液700中。如图9A所示，溶液700的表面710最初可不含蛋白质聚集体712。
蛋白质702可响应于吸附在气液界面(例如表面710)处的表面张力而变形。于变形时，蛋白质702的带电荷区域可以暴露。由于热力学环境，暴露的电荷区域可能会聚集。聚集的蛋白质可在表面710处形成网状物712，如图9B所示。当溶液700的表面710受到干扰时(例如因混合协议)，网状物712可能被破坏且被破坏的网状物712的碎片可能被吸入溶液700的主体中。
破碎的网状物碎片可与其他蛋白质702聚集，以形成更大的网状物712，其将再次破裂并被吸入溶液700的主体中。当蛋白质网状物的碎片达到足够的大小时，其被检测为溶液700内的大聚集体720，如图9C所示。大聚集体720可表现为可见颗粒且可使溶液700混浊。
解决颗粒形成风险的传统方法依赖流体动力剪切的研究。然而，流体动力剪切未考虑蛋白质聚集体的形成，且基于剪切的按比例的测试无法预测所有生产比例的评估标准。由于难以量化粒子形成的影响、过滤器性能的变化以及缺乏对溶液中可见及次可见粒子的长期行为的了解，粒子形成的风险仍为混合协议开发的障碍。
气液界面处的应力很可能是聚集体形成的主要因素。夹杂空气也有助于聚集体的形成。表面张力与自由能估计以及原子力显微镜观察支持夹杂空气在聚集体形成中的作用。固液界面应力、空蚀、核形成及热应力可能次要地促成聚集体的形成。
为了更好地量化粒子形成的风险，可根据本文描述的实施方式开发预测模型，该预测模型将粒子形成的风险描述为混合协议参数的函数。可能的混合协议参数包括聚集蛋白的特征、溶液的赋形剂特性及环境因素(例如温度、压力等)。
CFD分析可以确定垂直速度等值线和体积平均速度。图10A示出由CFD确定的垂直速度等值线的示例。图10B示出由CFD确定的体积平均速度的示例。本文中，体积平均速度是指液体表面附近的体积中的空间平均流体速度。
与前文所述的应变率等值线图(图4C)类似，实际上，垂直速度等值线图与体积平均速度的不同区域可由根据区域的速度分配的不同颜色来表示。表2示出可用于表示图10A所示的变化的垂直速度的区域的示例性颜色以及图10B所示的变化的体积平均垂直速度的区域。
表2－与图10A及10B的区域相关的示例性颜色
| 区域号码 | 示例性颜色 |
| 331 | 红 |
| 332 | 橙 |
| 333 | 黄 |
| 334 | 绿 |
| 335 | 淡蓝 |
| 336 | 深蓝 |
可绘制由CFD确定的垂直速度等值线与它们在混合容器中的位置的关系，以说明垂直速度的相对差异之间的关系作为位置的函数。例如，CFD分析可确定混合容器的每个计算单元的垂直速度值。可绘制垂直速度与沿着从混合容器中心的半径的线性位移的关系，如图11所示。每个测量801对应于具有垂直速度以及沿着混合容器的半径的位置的计算单元。加权平均值820可自各测量值801中确定，其中分配给每个测量值801的权重与对应于该测量值801的计算单元的体积相关。
可以使用上述技术开发用于评估聚集体形成风险的预测模型。例如，聚集蛋白的特征、溶液的赋形剂特性、环境因素与聚集体形成之间的关系可使用由CFD确定的垂直速度等值线或体积平均速度来确定。
通过以下非限制性项目进一步描述本公开。
项目1：一种开发预测模型的方法，该方法包括：
(a)确认用于该预测模型的混合协议参数；
(b)选择用于该混合协议参数的测试值；
(c)对每个测试值的组合进行计算流体动力学(CFD)模拟；
(d)生成与该混合协议参数相关的潜在预测模型域；及
(e)对与该混合协议参数相关的该潜在预测模型域进行排序。
项目2：如项目1的方法，进一步包括：
在步骤(a)之后确认用于该预测模型的评估标准；
确认为了在步骤(b)之后生成该评估标准而需要执行的CFD模拟；
在步骤(d)之后从该潜在预测模型域确认候选预测模型池；及
对该候选预测模型池进行排序。
项目3：如项目1或2中任一项的方法，其中该混合协议参数包括以下的两项或更多项：叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器几何形状。
项目4：如项目1的方法，其中该评估标准包括以下的两项或更多项：流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、稳态混合时间、瞬时混合时间、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、暴露分析及功耗。
项目5：如项目2或4中任一项的方法，其中该确认的CFD模拟包括稳态流动分析、瞬时流动分析、混合时间分析及/或暴露分析。
项目6：如项目2的方法，其进一步包括在生成潜在预测模型域之后且在确认候选预测模型池之前，
计算该潜在预测模型域中每个潜在预测模型的方差膨胀因子；及
从该潜在预测模型域去除方差膨胀因子大于或等于共线性阈值的潜在预测模型，从而生成潜在预测模型的子集合。
项目7：如项目6的方法，其中该候选预测模型池包括来自该子集合的R2值高于该子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、以及来自该子集合的R2值高于该子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型。
项目8：如项目2的方法，其中对该候选预测模型池进行排序包括基于项数对该候选预测模型池进行排序、基于R2值对该候选预测模型池进行排序、或两者兼具。
项目9：如项目1至8中任一项的方法，其中该测试值为第一测试值，且该方法进一步包括：
使用来自该候选预测模型池的候选预测模型，生成对应于第二测试值的组合的该评估标准的估计值。
项目10：如项目9的方法，其中该方法进一步包括：
对该第二测试值的组合进行该CFD仿真，以生成对应于该第二测试值的组合的评估标准；及
将对应于该第二测试值的组合的该评估标准与对应于该第二测试值的组合的该评估标准的该估计值进行比较。
项目11：一种开发预测模型的方法，该方法包括：
确认用于该预测模型的第一、第二及第三混合协议参数；
确认用于该预测模型的第一及第二评估标准；
选择用于该第一混合协议参数的第一测试值；
选择用于该第二混合协议参数的第二测试值；
选择用于该第三混合协议参数的第三测试值；
确认为了生成该第一评估标准而需要执行的第一计算流体动力学(CFD)模拟；
确认为了生成该第二评估标准而需要执行的第二CFD模拟；
通过对该第一测试值、该第二测试值及该第三测试值的每个组合进行该第一CFD模拟，生成对应于第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合的第一评估标准；
通过对第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合进行该第二CFD模拟，生成对应于第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合的第二评估标准；
生成使该第一、该第二及该第三混合协议参数与该第一评估标准相关联的第一预测模型的第一域；及
生成使该第一、该第二及该第三混合协议参数与该第二评估标准相关联的第二预测模型的第二域。
项目12：如项目11的方法，进一步包括：
计算用于每个第一预测模型及每个第二预测模型的方差膨胀因子；
从第一预测模型的该第一域去除方差膨胀因子大于或等于三的第一预测模型，从而生成第一预测模型的第一子集合；
从第二预测模型的该第二域去除方差膨胀因子大于或等于三的第二预测模型，从而生成第一预测模型的第一子集合；
确认候选第一预测模型的第一池，该第一池包括来自该第一子集合的R2值高于该第一子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、来自该第一子集合的R2值高于该第一子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型、及来自该第一子集合的R2值高于该第一子集合中的所有其他三变量模型的三变量模型；以及
确认候选第二预测模型的第二池，该第二池包括来自该第二子集合的R2值高于该第二子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、来自该第二子集合的R2值高于该第二子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型、及来自该第二子集合的R2值高于该第二子集合中的所有其他三变量模型的三变量模型。
项目13：如项目12的方法，进一步包括：
选择用于该第一混合协议参数的第四测试值；
选择用于该第二混合协议参数的第五测试值；
选择用于该第三混合协议参数的第六测试值；
使用候选第一预测模型的该第一池的每个候选第一预测模型，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的经估计的第一评估标准；
通过对第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合进行该第一CFD模拟，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第一评估标准；以及
将由候选第一预测模型的该第一池的每个候选第一预测模型生成的经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第一评估标准进行比较。
项目14：如项目13的方法，进一步包括：
使用候选第二预测模型的该第二池的每个候选第二预测模型，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的经估计的第二评估标准；
通过对第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合进行该第二CFD模拟，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第二评估标准；以及
将由候选第二预测模型的该第二池的每个候选第二预测模型生成的经估计的第二评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第二评估标准进行比较。
项目15：如项目14的方法，进一步包括：
基于该经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第一评估标准的比较，从候选第一预测模型的该第一池选择第一预测模型；
基于该经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第一评估标准的比较，从候选第二预测模型的该第二池选择第二预测模型；
使用该第一预测模型，确定对应于混合协议的第一评估标准；以及使用该第二预测模型，确定对应于混合协议的第二评估标准。
项目16：如项目9的方法，其中该第一及该第二评估标准选自包括项目的列表：流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、稳态混合时间、瞬时混合时间、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、暴露分析及功耗。
项目17：一种对与混合协议相关的剪切应变进行建模的方法，该方法包括：
确认用于预测模型的混合协议参数；
选择用于该混合协议参数的测试值；
对测试值的每个组合进行计算流体动力学暴露分析，从而生成对应于测试值的每个组合的剪切应变；
确认候选预测模型池；
对该候选预测模型池进行排序；
从该候选预测模型池选择预测模型；以及
使用该预测模型，于多个时间间隔评估该混合协议的累积剪切应变，以生成剪切应变直方图数据。
项目18：如项目17的方法，其中该混合协议参数包括以下两项或更多项：叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器几何形状。
项目19：如项目17的方法，其中该混合协议为与生物反应器中的生物制药产品相关联的混合协议。
项目20：如项目17的方法，进一步包括使用该剪切应变直方图数据以评估可见或次可见粒子形成的风险。
项目21：如项目17的方法，其中对该候选预测模型池进行排序包括基于项数对该候选预测模型池进行排序、基于R2值对该候选预测模型池进行排序、或两者兼具；且
从该候选预测模型池选择预测模型包括选择具有最高R2值的模型。
本领域技术人员将理解，本公开所基于的概念可容易地用作设计用于实现本公开多个目的的其他方法及系统的基础。因此，权利要求不应被认为受到前文描述的限制。
Claims (21)
1.一种开发预测模型的方法，该方法包括：
(a)确认用于该预测模型的混合协议参数；
(b)选择用于该混合协议参数的测试值；
(c)对每个测试值的组合进行计算流体动力学(CFD)模拟；
(d)生成与该混合协议参数相关的潜在预测模型域；及
(e)对与该混合协议参数相关的该潜在预测模型域进行排序。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：
在步骤(a)之后确认用于该预测模型的评估标准；
确认为了在步骤(b)之后生成该评估标准而需要执行的CFD模拟；
在步骤(d)之后从该潜在预测模型域确认候选预测模型池；及
对该候选预测模型池进行排序。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该混合协议参数包括以下的两项或更多项：叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器几何形状。
4.如权利要求2所述的方法，其中该评估标准包括以下的两项或更多项：流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、稳态混合时间、瞬时混合时间、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、暴露分析及功耗。
5.如权利要求2或4所述的方法，其中该确认的CFD模拟包括稳态流动分析、瞬时流动分析、混合时间分析及/或暴露分析。
6.如权利要求2所述的方法，其进一步包括在生成潜在预测模型域之后且在确认候选预测模型池之前，
计算该潜在预测模型域中每个潜在预测模型的方差膨胀因子；及
从该潜在预测模型域去除方差膨胀因子大于或等于共线性阈值的潜在预测模型，从而生成潜在预测模型的子集合。
7.如权利要求6所述的方法，其中该候选预测模型池包括来自该子集合的R2值高于该子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、以及来自该子集合的R2值高于该子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型。
8.如权利要求2所述的方法，其中对该候选预测模型池进行排序包括基于项数对该候选预测模型池进行排序、基于R2值对该候选预测模型池进行排序、或两者兼具。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该测试值为第一测试值，且该方法进一步包括：
使用来自该候选预测模型池的候选预测模型，生成对应于第二测试值的组合的该评估标准的估计值。
10.如权利要求9所述的方法，其中该方法进一步包括：
对该第二测试值的组合进行该CFD仿真，以生成对应于该第二测试值的组合的评估标准；及
将对应于该第二测试值的组合的该评估标准与对应于该第二测试值的组合的该评估标准的该估计值进行比较。
11.一种开发预测模型的方法，该方法包括：
确认用于该预测模型的第一、第二及第三混合协议参数；
确认用于该预测模型的第一及第二评估标准；
选择用于该第一混合协议参数的第一测试值；
选择用于该第二混合协议参数的第二测试值；
选择用于该第三混合协议参数的第三测试值；
确认为了生成该第一评估标准而需要执行的第一计算流体动力学(CFD)模拟；
确认为了生成该第二评估标准而需要执行的第二CFD模拟；
通过对第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合进行该第一CFD模拟，生成对应于第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合的第一评估标准；
通过对第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合进行该第二CFD模拟，生成对应于第一测试值、第二测试值及第三测试值的每个组合的第二评估标准；
生成使该第一、该第二及该第三混合协议参数与该第一评估标准相关联的第一预测模型的第一域；及
生成使该第一、该第二及该第三混合协议参数与该第二评估标准相关联的第二预测模型的第二域。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括：
计算用于每个第一预测模型及每个第二预测模型的方差膨胀因子；
从第一预测模型的该第一域去除方差膨胀因子大于或等于三的第一预测模型，从而生成第一预测模型的第一子集合；
从第二预测模型的该第二域去除方差膨胀因子大于或等于三的第二预测模型，从而生成第一预测模型的第二子集合；
确认候选第一预测模型的第一池，该第一池包括来自该第一子集合的R2值高于该第一子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、来自该第一子集合的R2值高于该第一子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型、及来自该第一子集合的R2值高于该第一子集合中的所有其他三变量模型的三变量模型；以及
确认候选第二预测模型的第二池，该第二池包括来自该第二子集合的R2值高于该第二子集合中的所有其他单变量模型的单变量模型、来自该第二子集合的R2值高于该第二子集合中的所有其他双变量模型的双变量模型、及来自该第二子集合的R2值高于该第二子集合中的所有其他三变量模型的三变量模型。
13.如权利要求12所述的方法，进一步包括：
选择用于该第一混合协议参数的第四测试值；
选择用于该第二混合协议参数的第五测试值；
选择用于该第三混合协议参数的第六测试值；
使用候选第一预测模型的该第一池的每个候选第一预测模型，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的经估计的第一评估标准；
通过对第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合进行该第一CFD模拟，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第一评估标准；以及
将由候选第一预测模型的该第一池的每个候选第一预测模型生成的经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第一评估标准进行比较。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包括：
使用候选第二预测模型的该第二池的每个候选第二预测模型，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的经估计的第二评估标准；
通过对第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合进行该第二CFD模拟，生成对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的第二评估标准；以及
将由候选第二预测模型的该第二池的每个候选第二预测模型生成的经估计的第二评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第二评估标准进行比较。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包括：
基于该经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第一评估标准的比较，从候选第一预测模型的该第一池选择第一预测模型；
基于该经估计的第一评估标准与对应于第四测试值、第五测试值及第六测试值的每个组合的该第一评估标准的比较，从候选第二预测模型的该第二池选择第二预测模型；
使用该第一预测模型，确定对应于混合协议的第一评估标准；以及
使用该第二预测模型，确定对应于混合协议的第二评估标准。
16.如权利要求9所述的方法，其中该第一及该第二评估标准选自包括以下项目的列表：流型、流体速度分布、流体流动向量场、流体流动流线、稳态混合时间、瞬时混合时间、停留时间分布、等值线剪切应变率、平均剪切应变率、暴露分析及功耗。
17.一种对与混合协议相关的剪切应变进行建模的方法，该方法包括：
确认用于预测模型的混合协议参数；
选择用于该混合协议参数的测试值；
对测试值的每个组合进行计算流体动力学暴露分析，从而生成对应于测试值的每个组合的剪切应变；
确认候选预测模型池；
对该候选预测模型池进行排序；
从该候选预测模型池选择预测模型；以及
使用该预测模型，于多个时间间隔评估该混合协议的累积剪切应变，以生成剪切应变直方图数据。
18.如权利要求17所述的方法，其中该混合协议参数包括以下两项或更多项：叶轮速度、批次大小、溶液黏度、溶液密度、混合容器尺寸及混合容器几何形状。
19.如权利要求17所述的方法，其中该混合协议为与生物反应器中的生物制药产品相关联的混合协议。
20.如权利要求17所述的方法，进一步包括使用该剪切应变直方图数据以评估可见或次可见粒子形成的风险。
21.如权利要求17所述的方法，其中对该候选预测模型池进行排序包括基于项数对该候选预测模型池进行排序、基于R2值对该候选预测模型池进行排序、或两者兼具；且
从该候选预测模型池选择预测模型包括选择具有最高R2值的模型。
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