TW202244279A - 於固相介質上的環介導恆溫擴增(lamp) - Google Patents

Abstract

本揭示涉及一種環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成，其包括一實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與一固相反應介質之組合。本揭示還包括用於色度LAMP分析的系統，其包括一實質上非反應性固相反應介質及一非干擾性試劑混合物。本揭示還包括固相LAMP反應介質，其包括一基板；一黏合層，其配置在該基板上；一反應層，其配置在該黏合層上；及一展開層，其配置在該反應層上。本揭示還包括測試目標核苷酸序列的存在的方法，其包括提供一生物樣品，及將該樣品分配到一測試環境中，該測試環境具有一固相反應介質與一LAMP試劑混合物和一pH敏感性染料之組合。

Description

於固相介質上的環介導恆溫擴增(LAMP)

相關申請案

本申請請求提申日期2021年1月15日的美國臨時專利申請序列號63/138,316及63/138,318之權益，其每一個都通過引用併入本文。

本發明係有關於固相介質上的環介導恆溫擴增(LAMP)。

發明背景

聚合酶鏈反應(PCR)是一種分子生物技術，可以擴增核苷酸，用於各種分析目的。量化PCR (qPCR)是PCR之改進，其容許監測標靶核苷酸的擴增。診斷型qPCR已經應用於檢測感染性疾病、癌症及基因異常的指示性核苷酸。反轉錄PCR (RT-PCR)是qPCR之改進，其容許檢測目標RNA核苷酸。因為此能力，RT-PCR非常適合用於檢測病毒病原。然而，RT-PCR需使用相當大的設備，此在某些定點照護可能無法使用。此外，RT-PCR需要訓練有素的人員、嚴格的樣品製備及進行與獲得結果之時間。

相反的，環介導恆溫擴增(LAMP)是一種用於診斷鑑定目標核苷酸之較簡易的方法。特別是，LAMP是用於增加特定核苷酸序列之一次操作核酸擴增方法。除了使用恆溫加熱過程之外，LAMP還可使用簡單的目視輸出測試指示劑，如顏色變化，而不是PCR使用之較複雜的螢光指示劑。為了從RNA中識別出目標核苷酸，可使用類似RT-PCR之反轉錄LAMP (RT-LAMP)，如此可在鑑定病毒病原是否存在之診斷能力中使用。因為LAMP更簡易，可以較少的設備及樣品製備進行，因此更易於在定點照護中，如診所、急診室，甚至在移動的基礎上使用。

發明概要

本揭示涉及一種用於在固相介質上使用環介導恆溫擴增(LAMP)檢測目標核苷酸的技術(如，方法、系統及總成)。在一些態樣中，可以知道該目標核苷酸存在於感興趣的病原中。在病原是病毒的情況下，該LAMP分析可為反轉錄(RT) RT-LAMP分析。

在一些揭示的實施例中，一種LAMP反應總成可包含一實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與一固相反應介質之組合。在一個態樣中，該固相介質可為親水性、吸收性及多孔性的。

在一個態樣中，該固相介質可實質上不含鎂干擾劑。在另一個態樣中，該鎂干擾劑可包括含鎂化合物及會干擾鎂的螯合劑。

在另一個態樣中，該固相介質可為纖維素基介質。在一個態樣中，該纖維素基介質可具有約30至約600之間的表面積對厚度比。在另一個態樣中，該纖維素基介質可具有大於約1微米且小於約100微米的孔徑。在一個態樣中，該固相介質可包含紙。在另一個態樣中，該固相介質可包含玻璃纖維。在又一個態樣中，該固相介質可包含尼龍、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素或親水性聚四氟乙烯(PTFE)，或其等之組合。

在另一個態樣中，該LAMP反應總成可進一步包含一實質上不含鎂干擾劑及吸濕劑的黏合劑。在另一個態樣中，該LAMP反應總成可進一步包含比該固相反應介質更不親水之一展開層。

在另一個揭示的實施例中，一種製造如前述的LAMP反應總成的方法可包括結合該實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與該固相反應介質，使得該試劑混合物與該固相反應介質保持接觸。

在一個態樣中，該方法可包含使用一不變色添加劑控制變色。在另一個態樣中，該不變色添加劑可包含糖、緩衝劑、阻斷劑或其等之組合。在另一個態樣中，該不變色添加劑可包含糖，其包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣或其等之組合。在另一個態樣中，該不變色添加劑可包含阻斷劑，其包含牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合。

在另一個揭示的實施例中，一種進行LAMP分析的方法可包含提供如前述的LAMP反應總成、將一生物樣品施加到該反應總成、將該總成加熱到足以引發LAMP反應的溫度及將該溫度維持一段足以完成該LAMP反應的時間。在一個態樣中，該生物樣品可為唾液、黏液、血液、尿液、糞便、汗液、呼出氣冷凝物或其等之組合中的一或多種。在另一個態樣中，該生物樣品可為唾液。在一個態樣中，該方法可進一步包含檢測一病毒病原。在另一個態樣中，該LAMP分析可為反轉錄LAMP (RT-LAMP)。

在另一個揭示的實施例中，一種用於色度LAMP分析的系統可包含一實質上非反應性固相反應介質，及一非干擾性試劑混合物。在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可為親水性、吸收性及多孔性的。在另一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可實質上不含氧化劑、pH干擾劑或其等之組合。

在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可具有從約0.01mM至約5mM的緩衝能力。在另一個態樣中，當與pH敏感性染料組合時，該實質上非反應性固相反應介質在測試範圍內具有一最大吸收波長(λ _max) 。在另一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可包含纖維素或玻璃纖維。在另一個態樣中，該系統可進一步包含黏合劑、展開層、隔件、塑料載體或其等之組合。在一個態樣中，該黏合劑、展開層、隔件或塑料載體中的每一個可實質上不含氧化劑及pH干擾劑。在另一個態樣中，該非干擾性試劑混合物可進一步包含一或多種目標引子、DNA聚合酶或再溶解劑。

在另一個揭示的實施例中，一種使固相pH依賴性LAMP分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法，可包含提供使非LAMP反應產生的變色最小化之一固相反應介質，及在該固相反應介質上進行該LAMP分析。在一個態樣中，該方法可包含控制由非LAMP反應產生的質子引起的非LAMP產生的變色。在另一個態樣中，該方法可包含使用一不變色添加劑，控制非LAMP反應產生的變色。在一個態樣中，該不變色添加劑可包含糖、緩衝劑、阻斷劑或其等之組合。在另一個態樣中，該不變色添加劑可包含糖，該糖包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣或其等之組合中之一或多種。在另一個態樣中，該不變色添加劑可包含阻斷劑，該阻斷劑包含牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合。

在又另一個揭示的實施例中，一種使LAMP分析中的檢測位準(LOD)最大化的方法，可包含提供使非LAMP反應產物最小化的反應環境及試劑。

在又另一個揭示的實施例中，一種用於色度LAMP分析的系統可包含一固相反應介質與一LAMP試劑的組合，其當儲存在一選定溫度(如，約25℃之室溫)下時，維持該固相反應介質的色彩，其具有在該固相介質之初始色調的10%以內的色調。在一個態樣中，該組合在儲存超過以下一或多個時可維持色彩：30天、90天、365天、2年或5年。在另一個態樣中，該組合在儲存於約40%與90%之間的相對濕度下時可維持色彩。在另一個態樣中，該選定的溫度可為在約–20℃與約37℃之間之範圍內的任何溫度。

在又另一個揭示的實施例中，一種用於製造如前述的色度LAMP系統的方法，可包含結合該非干擾性試劑混合物與一實質上非反應性固相反應介質，使得該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質保持接觸。在一個態樣中，該方法可包含製備一含有該非干擾性試劑混合物之溶液，及將該試劑混合物塗佈在該實質上非反應性固相反應介質上。在另一個態樣中，該塗佈可包含將該溶液滴落、噴霧、浸漬、浸泡或霧化到該實質上非反應性固相反應介質上。在另一個態樣中，可使用捲對捲(R2R)方法將該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質結合。

在又另一個揭示的實施例中，一種固相LAMP反應介質可包含一基板；一黏合層，其配置在該基板上；一反應層，其配置在該黏合層上；或一展開層，其配置在該反應層上。在一個態樣中，該基板可為一光學透明材料。在另一個態樣中，該黏合層可實質上不含揮發性劑。在另一個態樣中，其中該黏合層可不連續地配置在該基板上。在另一個態樣中，該基板可為一光學透明的塑料載體。

在一個態樣中，該固相LAMP反應介質可進一步包含一測試區域。在一個態樣中，該測試區域可由至少兩個不連續的黏合層片段界定。在另一個態樣中，該測試區域可由至少三個不連續的黏合層片段界定。在另一個態樣中，該測試區域可由至少四個不連續的黏合層片段界定。

在一個態樣中，該固相LAMP反應介質可進一步包含至少一個實質上不含試劑的片段。在另一個態樣中，該反應層可包含一試劑，其包括一或多種目標引子、一DNA聚合酶或一再溶解劑。在另一個態樣中，該試劑可形成足夠進行LAMP反應的組合物。在一個態樣中，該反應層可為不連續的。

在另一個態樣中，該固相LAMP反應介質可進一步包含一展開層，其包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、聚酯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)或其等之組合中的一或多種。在一個態樣中，該展開層可為光學透明的。

在另一個態樣中，該固相LAMP反應介質可包含一隔件材料。在一個態樣中，該隔件材料可包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、聚苯乙烯、聚酯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)或其等之組合中的一或多種。在另一個態樣中，該隔件材料可定向在與該反應層相同的平面上且定向在該反應層的片段之間。在另一個態樣中，該反應層可具有表面積對厚度比為從約30至約600。在另一個態樣中，該反應層可具有從約0.05mm至約2mm的厚度。在另一個態樣中，該反應層可具有從約4mm至約12mm的寬度及從約4mm至約25mm的長度。在另一個態樣中，該反應層的片段之間的最小空間可在約1.8mm與約2.2mm之間。

在另一個揭示的實施例中，一種測試病毒病原之存在的方法，可包含提供來自一受試者之一唾液樣品，及將該樣品分配到一測試環境中，該測試環境具有一固相反應介質與一LAMP試劑混合物和一pH敏感性染料之組合。在一個態樣中，該方法可包含使能夠使該固相介質變色的揮發性劑、吸濕劑及非pH敏感劑的數量最小化。在另一個態樣中，該方法可包含提供足以促進LAMP反應之數量的一或多種目標引子、DNA聚合酶或再溶解劑。在另一個態樣中，該方法可包含提供足以促進反轉錄LAMP (RT-LAMP)反應之數量的反轉錄酶。在另一個態樣中，該方法可包含提供足以檢測該病毒病原之數量的一或多種目標引子。在另一個態樣中，該方法可包含在將該樣品分配到該測試環境中後不到一小時內產生一測試結果。

在又另一個揭示的實施例中，一種確認唾液樣品是否適合用固相LAMP反應進行測試的方法，可包含提供一固相反應介質，其具有至少一個測試位置或測試點及一陰性對照位置。在一個態樣中，該至少一個測試位置或測試點可包括一LAMP試劑與一pH敏感性染料之組合。在另一個態樣中，該陰性對照位置可包括一pH敏感性染料且可排除LAMP試劑。在另一個態樣中，該方法可包含將該唾液樣品施加到該固相反應介質上。在另一個態樣中，該方法可包含確認在該陰性對照位置上的pH敏感性染料的活化。

在一個態樣中，該pH敏感性染料可為酚紅、酚酞、石蕊紅質、溴瑞香草酚藍、萘酚酞、甲酚紅或其等之組合中的至少一種。在另一個態樣中，該LAMP試劑可實質上不含揮發性劑、影響pH的試劑、含鎂試劑或其等之組合。在另一個態樣中，該LAMP試劑可包含非干擾性LAMP試劑，包括DNA聚合酶、反轉錄酶、針對目標區域的引子，或其等之組合。

在另一個態樣中，該方法可進一步包含提供由至少二個不連續的黏合層片段界定之測試位置或測試點。在另一個態樣中，該方法可包含提供由至少三個不連續的黏合層片段界定之測試位置或點。

在又一個揭示的實施例中，一種使來自固相LAMP反應的陽性測試結果之準確度最大化的方法，可包含提供一固相反應介質，其具有至少三個測試位置或點，各包括一共同的pH敏感性染料及一LAMP試劑的組合，其中各位置包括來自一目標病原的不同引子序列。在一個態樣中，該方法可包含引發一LAMP反應。在另一個態樣中，該方法可包含當該等測試位置或點中之至少二個活化該pH敏感性染料並經歷從第一顏色到第二顏色的變化時，確認陽性測試結果。在另一個態樣中，該方法可進一步包括提供足以促進反轉錄LAMP反應之數量的反轉錄酶。

在一個態樣中，該pH敏感性染料可為酚紅、酚酞、石蕊紅質、溴瑞香草酚藍、萘酚酞、甲酚紅或其等之組合中的至少一種。在另一個態樣中，該LAMP試劑可實質上不含揮發性劑、影響pH的試劑、含鎂試劑或其等之組合。

在另一個態樣中，該目標病原可包含病毒病原、細菌病原、真菌病原或原生動物病原。在一個態樣中，該目標病原可包含病毒病原。在一個態樣中，該病毒病原可包含dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、正股ssRNA病毒、反股ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或ds-DNA-RT病毒。在一個態樣中，每個引子序列可配對來自包含H1N1、H2N2、H3N2、H1N1pdm09或SARS-CoV-2的病毒目標的序列。

在一個揭示的實施例中，一種測試目標核苷酸序列的存在的方法，可包含提供一生物樣品，將該樣品分配到一測試環境，該測試環境具有一固相反應介質與一環介導恆溫擴增(LAMP)試劑混合物和一pH敏感性染料之組合。

在另一個態樣中，該測試環境可實質上不含揮發性劑、影響pH的試劑、乾燥劑或其等之組合。在一個態樣中，該方法可包含以每秒約0.1℃的速率升高一測試環境的溫度。在另一個態樣中，該方法可包含在測試環境中提供具有變異小於1℃的加熱均勻性。在另一個態樣中，該方法可包含提供包含纖維素或玻璃纖維之一固相反應介質。在一個態樣中，該方法可包含提供足以促進反轉錄LAMP (RT-LAMP)反應之數量的反轉錄酶。

在一個態樣中，該生物樣品可為下列中之至少一種：唾液、黏液、血液、尿液或糞便、汗液、呼出氣冷凝物或其等之組合。在一個態樣中，該方法可包含使用唾液收集裝置、鼻拭子、血液收集裝置、尿液收集裝置、汗液收集裝置、呼出氣冷凝物收集裝置或糞便收集裝置中之一或多種來收集該生物樣品。

在另一個態樣中，該目標核苷酸序列可來自病毒病原、細菌病原、真菌病原或原生動物病原中的至少一種。在一個態樣中，該目標核苷酸序列可來自病毒病原。在一個態樣中，該病毒病原可選自於由下列所構成之群組：冠狀病毒科( Coronaviridae)、正黏液病毒科( Orthomyxoviridae)、副黏液病毒科( Paramyxoviridae)、小核糖核酸病毒科( Picornaviridae)、腺病毒科( Adenoviridae)及細小病毒科( parvoviridae)。在另一個態樣中，該病毒病原可選自於由下列所構成之群組：嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV-1)、嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、中東呼吸症候群(MERS)、流行性感冒及H1N1。在一個態樣中，該目標核苷酸序列可來自嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)病原。

在又另一個揭示的實施例中，一種生物樣品測試裝置可包含一基板，其接合一固相反應介質與一脫水環介導恆溫擴增(LAMP)試劑混合物和一脫水pH敏感性染料之組合，其中該裝置在室溫下儲存6個月後，提供至少約95%之測試準確度。在一個態樣中，該裝置在室溫下儲存12個月後，可提供至少約95%的測試準確度。在另一個態樣中，該裝置在室溫下儲存2年後，可提供至少約95%的測試準確度。

在又另一個揭示的實施例中，一種生物樣品測試系統可包含一基板，其接合一固相反應介質與一脫水環介導恆溫擴增(LAMP)試劑混合物和一脫水pH敏感性染料之組合，該外殼可操作以接收一生物樣品。在一個態樣中，該生物樣品測試系統可包含一加熱器，其組置成將該容器恆溫加熱到足以引發及維持該LAMP試劑混合物之間的LAMP反應之一內部溫度。在另一個態樣中，該生物樣品測試系統可包含一生物樣品，持續一段用於通過該pH敏感性染料產生測試結果的時間。

在一個態樣中，該基板可包含一光學透明材料。在另一個態樣中，該基板可以通過一黏合劑接合該固相反應介質。在另一個態樣中，該黏合劑可為實質上光學透明的。在另一個態樣中，該基板可包含一外殼的一部分。

在另一個態樣中，該生物樣品測試系統可包含一黏合層，其配置在該基板上；一反應層，其配置在該黏合層上；及一展開層，其配置在該反應層上。在一個態樣中，該生物樣品測試系統可進一步包含一隔件層，其定向在與該反應層相同的平面上。在另一個態樣中，該外殼可以靠著該基板配置。在另一個態樣中，該外殼可進一步靠著該展開層配置。在另一個態樣中，該外殼可實質上圍住該基板、黏合層、反應層及展開層。

實施例之說明

在描述本發明實施例之前，應理解本揭示不限於本文所揭示的特定結構、方法步驟或材料，而是擴展到相關領域的普通技術人員認可之其等同物。還應該理解，本文所使用的術語僅用於描述特定範例或實施例的目的，並不旨在進行限制。不同圖式中相同的符號表示相同的元件。在流程圖及過程中提供的數字是為了清楚地說明步驟及操作而提供的，並不一定表示特定的順序或排序。

此外，所描述的特徵、結構或特性可以在一個或多個實施例中以任何合適的方式組合。在以下描述中，提供了許多具體細節，例如組成物、劑型、處理等的例子，供對各種發明實施例的透徹理解。然而，相關領域的技術人員將認知到，這樣的詳細實施例不會限制本文闡述的總體發明概念，而僅僅是其代表。 定義

應當注意，本文中所使用的單數形式“一”、“一個”和“該”包括複數指稱物，除非上下文另有明確規定。因此，例如，提及“一賦形劑”包括提及一或多種此類賦形劑，及提及“該載體”包括提及一或多種此類載體。

本文中所使用的術語“配方”及“組成物”可互換使用，指二或多種化合物、元素或分子的混合物。在一些態樣中，術語“配方”及“組成物”可用於指一或多種活性劑與載體或其他賦形劑的混合物。

本文中所使用的術語“可溶性”是物質或試劑在其溶解於給定溶劑中的能力方面的量度或特性。物質或試劑在組成物的特定組分中的溶解度，意指該物質或試劑在特定溫度如約25℃或約37℃下溶解形成明顯透明的溶液的數量。

本文中所使用的術語“親脂性”意指不易溶於水的化合物。相反地，術語“親水性”意指可溶於水的化合物。

本文中所使用的術語“受試者”意指動物。在一個態樣中，該動物可為哺乳動物。在另一個態樣中，該哺乳動物可為人。

本文中所使用的術語“非液體”在用於指稱本文所揭示的組成物的狀態時，意指該組成物的物理狀態為半固體或固體。

本文中所使用的術語“固體”和“半固體”意指組成物在標準溫度及壓力下支撐其自身重量並具有足夠的黏度或結構而無法自由流動的物理狀態。半固體材料可在施加壓力下符合容器的形狀。

本文中所使用的術語“固相介質”意指非液體介質。在一個例子中，該非液體介質可為具有多孔表面之材料。在另一個例子中，該非液體介質可為具有纖維表面的材料。在又一個例子中，該非液體介質可為紙。

本文中所使用的術語“固相介質”、“固相基體”、“固相基板”、“固相測試基板”、“固相測試基板”等等，意指非液體介質、裝置、系統或環境。在一些態樣中，該非液體介質可實質上不含液體或完全不含液體。在一個例子中，該非液體介質可包含或為多孔材料或具有多孔表面的材料。在另一個例子中，該非液體介質可包含或為纖維材料或具有纖維表面的材料。在又一個例子中，該非液體介質可為紙。

本文中所使用的術語“不變色添加劑”意指可最小化或防止固相介質的顏色，由於在其上或其中發生LAMP反應的核苷酸擴增以外的原因，而從原始或起始顏色到不同顏色的顏色變化之添加劑。例如，在一個實施例中，與沒有不變色添加劑的情況下會發生的顏色變化相比，此一顏色變化可被最小化或減少。

本文中所使用的術語“非LAMP反應產生的變色”意指任何不是由LAMP反應的核苷酸擴增所引起的固相介質之變色(如，顏色從原始顏色變為另一種顏色)。在一些例子中，非LAMP反應產生的變色可意指由下列一或多種引起的固相介質之變色：揮發性劑、鎂干擾劑、氧化劑、由LAMP反應之擴增以外的原因產生的pH變化、乾燥或其等之組合。

本文中所使用的術語“揮發性劑”意指包括具有高蒸氣壓或低沸點的組成物之劑。在一個例子中，硫酸銨可為一種揮發性劑，因為氨會揮發而留下硫酸根。在一個例子中，當組成物在高於約30℃的溫度下處於氣相時，該組成物可具有高蒸氣壓。在一個例子中，當組成物在低於約80℃的溫度下之形式為氣相時，該組成物可具有低沸點。

本文中所使用的術語“乾燥劑”意指與沒有該試劑的固相介質的乾燥相比，會增強該固相介質的乾燥之試劑。

本文中所使用的術語“pH干擾劑”是可由LAMP反應擴增以外的原因影響反應、系統或環境之pH的試劑。在一個例子中，銨離子會從硫酸銨中揮發，而硫酸根離子可反應形成硫酸並在沒有來自LAMP反應的擴增之情況下影響反應的pH。

本文中所使用的術語“非pH敏感劑”是實質上不受pH變化影響的試劑。

在本揭示中，“包含”、“包含”、“含有”和“具有”等可具有美國專利法中賦予它們的含義，並且可意指“包括”、“包括”等，通常被解釋為開放式術語。術語“由……組成”或“由……組成”是封閉型術語，僅包括與此類術語結合明確列出的組件、結構、步驟等，以及符合美國專利法的內容。“基本上由……組成”或“基本上由……組成”具有美國專利法通常賦予它們的含義。特別是，這些術語大致上是封閉型術語，但容許包含不會對相關項目的基本和新穎特徵或功能產生重大影響的附加項目、材料、組件、步驟或元素。例如，如果以“基本上由...組成”的語言存在，則組成物中容許存在不影響組成物性質或特性的微量元素，即使該微量元素沒有在此類術語後的項目列表中明確列舉。當在書面說明中使用開放式術語，如“包含”或“包括”時，應理解其還應直接支持“基本上由……組成”的語言以及“由……組成”的語言，就像明確說明的那樣，反之亦然。

說明書和發明申請專利範圍中的術語“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等等，如果有的話，用於區分相似的元素，而不一定用於描述特定的排序或時間順序。應當理解，如此使用的任何術語在適當情況下是可互換的，使得本文描述的實施例能夠例如以除了本文所示或以其他方式描述的那些以外的排序操作。類似地，如果一種方法在本文中被描述為包括一系列步驟，那麼本文所呈現的這些步驟的順序不一定是可執行這些步驟的唯一順序，且於該方法中可能省略某些所述步驟及/或可能增加在此未描述的某些其他步驟。

本文中所使用的術語如“增加的”、“減少的”、“更好的”、“更差的”、“更高的”、“更低的”、“增強的”、“最大化的”、“最小化的”等比較術語，意指一裝置、組份、組成物或活性之性質，與在下列狀況下之其他裝置、組份、組成物或活性明顯不同：在周圍或相鄰區域中、在相似狀態下、在單一裝置或組成物中或多個可相比的裝置或組成物中、在一群或類型中、在多群或類型中或者與現有技術的已知狀態相比。

本文中所使用的術語“偶合”定義為以化學、機械、電氣或非電氣方式直接或間接連接。本文中所述彼此“相鄰”的物件，可為彼此實際接觸的、彼此緊密接近的，或彼此處於相同的一般地區或區域中的，視使用該短語的上下文而定。“直接偶合”的物件、結構、元件或特徵是彼此接觸並附著的。此外，如在本書面說明中使用的，應理解，當使用術語“偶合”時，也為“直接偶合”提供支持，反之亦然。

本文中所使用的術語“實質上”意指作用、特徵、性質、狀態、結構、項目或結果的完全或接近完全的範圍或程度。例如，“實質上”封閉的物件，意味著該物件完全封閉，或者是幾乎完全封閉。在某些情況下，偏離絕對完全之確切容許程度，可能取決於具體情況。但是，一般而言，完全的接近程度，將具有與獲得絕對完全和全面完全相同的總體結果。當用於否定含義時，“實質上”的使用同樣適用於意指完全或幾乎完全無作用、特徵、性質、狀態、結構、項目或結果。例如，“實質上不含”粒子的組成物，可為完全沒有粒子，或幾乎完全沒有粒子，以至於效果與完全沒有粒子一樣。換言之，“實質上不含”一成分或元素的組成物，實際上仍可能包含該項目，只要其沒有可測量的效果即可。

本文中所使用的術語“約”用於藉由提供一給定值可“略高於”或“略低於”端點，而為數值範圍端點提供靈活性。除非另有說明，否則根據特定數字或數值範圍使用術語“約”，也應理解為沒有術語“約”之此數字術語或範圍提供支持。例如，為了方便和簡潔起見，“約50埃至約80埃”的數值範圍亦應理解成為“50埃至80埃”的範圍提供支持。此外，應當理解，在本說明書中，即使使用術語“約”，也提供對實際數值的支持。例如，“約” 30應該被解釋為不僅為略高於和略低於30的值提供支持，也為30的實際數值提供支持。

本文中所使用的術語多個項目、結構元件、組成元素及/或材料，可為了方便而呈現在共同列表中。然而，這些列表應該被解釋為好像列表的個別成員都被單獨標識為一個單獨的和唯一的成員。因此，此類列表中的任何個別成員均不應在沒有相反的指示之情況下，僅基于其在一個共同組中的呈現而被解釋為事實上等同於同一列表中的任何其他成員。

濃度、數量、位準及其他數值數據可在本文中以範圍格式表示或呈現。應當理解，使用這種範圍格式僅僅是為了方便和簡潔，因此應靈活解釋為不僅包括明確列舉為範圍限制的數值，還包括該範圍內所涵蓋的所有個別數值或子範圍，或小數單位，就好像每個數值和子範圍都被明確地列舉了一樣。舉例說明，“約1至約5”的數值範圍應被解釋為不僅包括明確列舉的約1至約5的值，而且還包括該指示範圍內的個別值及子範圍。因此，該數值範圍包括諸如2、3和4的個別值及諸如從1-3、從2-4及從3-5等的子範圍，以及個別地1、2、3、4及5。同樣的原則適用於僅將一個數值作為最小值或最大值的範圍。此外，無論範圍的廣度或所描述的特徵如何，這種解釋應該都適用。

在整個說明書中對“例子”的引用，意味著結合該例子描述的特定特徵、結構或特性包括在至少一個實施例中。因此，貫穿本說明書的各個地方出現的短語“在一個例子中”不一定都指稱相同的實施例。 實施例

許多病原(如，嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)，引起COVID-19之病毒)之分子測試可能受限於實驗室，因此在提供結果方面會有顯著的延遲時間(＞24小時)，阻礙其等於定點照護環境中的採用。僅管在發展SARS-CoV-2之定點照護測試方面做了很多的嘗試，但仍有一些限制：i)可擴展性(每周之測試需求量以百萬計，但以此規模製造新測試有困難)、ii)樣品處理(當使用唾液時，許多測試仍使用萃取操作)及iii)易讀性(分子測試常使用螢光，因此需使用螢光讀取器報告結果)。

目前的測試方法可藉由使用紙質裝置及反轉錄環介導恆溫擴增(RT-LAMP)之定點照護測試克服，其可使用稀釋的唾液(如，5 % v/v於水中)作為樣品，在60分鐘內，有病原(如，SARS-CoV-2)存在之情況下報告顏色改變。RT-LAMP是一種在恆溫下進行，特別是於感染急性期間具有適當診斷性能之核酸擴增技術。因為RT-LAMP可在恆溫下進行，所以不必使用昂貴的熱環循設備。此外，LAMP產品之現有的比色報告劑不使用螢光讀取器。因此，此測試適合用於定點照護環境且能夠快速發展及擴大規模，使其適合用於突發公共衛生事件。

RT-LAMP可在微流紙質分析裝置(μPADs)上實施，以檢測各種病原(如，SARS-CoV-2)，在此可使用可攜式電子裝置進行影像分析，以便區分陽性與陰性反應。在一個例子中，紙上之高對比RT-LAMP反應可提供肉眼可見的顏色變化。此外，為防止樣品間的相互影響(crosstalk)，可使用聚苯乙烯隔件取代使用蠟印刷(其可能具有精準對齊的印刷區域及分配試劑)。聚苯乙烯隔件易於捲對捲製造供擴大生產。

基於核酸的COVID-19診斷方法使用預處理來提供結果。如本文之揭示，SARS-CoV-2之紙上比色檢測可用最少的預處理進行。該裝置可具有在無預擴增之情況下於紙上檢測SARS-CoV-2之靈敏度及特異性。在溶液中進行的其它分析法，可能無法如紙質分析法一樣在製造期間擴張。此外，本文所揭示的分析法使用可在數秒內完成之稀釋操作，然而其它分析法使用如蛋白酶處理、熱去活性及/或RNA萃取之各種操作來檢測SARS-CoV-2 (操作完成至少10分鐘且使用額外的設備)。 固相介質上 LAMP 反應的材料總成

由於涉及性能要求，在固相介質上進行LAMP反應可能很難。例如，為了最大限度地提高測試準確度，固相介質應在不會干擾LAMP反應或 LAMP反應指示劑之情況下支持LAMP反應。從更高層次講，固相介質係用生物樣品水合，以容許LAMP反應進行，然後讀取結果。但是，各式各樣的試劑會干擾LAMP的反應或隨後的結果讀取。為了使錯誤最小化，可注意盡可能減少或避免與提供生物樣品、用樣品水合固相介質、將LAMP試劑整合到固相介質中、進行LAMP分析並獲得清晰易讀的測試輸出信號相關可能出現的挑戰。

考慮到上述背景，在一個揭示的實施例中，一種環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成可包含一實質上不含吸濕劑之LAMP試劑混合物與一固相反應介質的組合。該LAMP試劑混合物，當實質上不含吸濕劑時，可最小化或避免該固相反應介質乾燥過程中發生的困難。當使用吸濕劑時，它們或該固相反應介質可能不會完全乾燥，或在儲存時可能會再水化到一定程度，並且可能會干擾該固相反應介質的原始顏色，這可能會使LAMP方法的測試結果產生偏差。

在一個實施例中，吸濕劑可為在25℃下約40%至約90%相對濕度(RH)之間時吸收超過約10重量%的試劑。在一個態樣中，吸濕劑可包含但不限於甘油、乙醇、甲醇、氯化鈣、氯化鉀、硫酸鈣等或其等之組合中的一或多種。在一些例子中，含有吸濕劑(如，甘油)之LAMP反應會導致固相介質中試劑的不穩定，因為吸濕劑會吸引水。因此，應避免固相反應介質中吸濕劑過量。

再者，在另一個態樣中，該實質上不含吸濕劑之LAMP試劑混合物可包含DNA聚合酶、反轉錄酶、目標引子或其等之組合中的一或多種。當該LAMP反應是LAMP反應或反轉錄LAMP (RT-LAMP)反應時，可包含DNA聚合酶。此外，當該LAMP反應是RT-LAMP反應時，該實質上不含吸濕劑之LAMP試劑可進一步包含用於將RNA反轉錄成cDNA之反轉錄酶。

在一個態樣中，該固相反應介質可實質上不含鎂干擾劑。鎂可通過幾種方式干擾LAMP反應。首先，鎂可為DNA聚合酶的輔助因子且應在一目標濃度範圍內嚴密監測，以容許DNA聚合酶促進LAMP反應。其次，當LAMP反應使用鎂敏感性指示劑時，那麼鎂干擾劑會使LAMP反應的結果無效或使結果分析複雜化。

因此，在另一個態樣中，該鎂干擾劑可包括含鎂化合物及會干擾鎂的螯合劑。在一個態樣中，該鎂干擾劑可實質上不含鎂，包括但不限於：Mg ²⁺、Mg ¹⁺、碳酸鎂、氯化鎂、檸檬酸鎂、氫氧化鎂、氧化鎂、硫酸鎂、硫酸鎂七水合物等或其等之組合。由於某些固相反應介質可能具有一些緩衝能力、殘留離子或螯合劑會干擾鎂，因此鎂(BST酶(如，DNA聚合酶)的輔助因子)的濃度可能會受到影響並干擾LAMP反應。因此，鎂的濃度應控制在一目標鎂範圍內，以促進LAMP反應。在一個態樣中，該組合物可含少於下列中之一或多個的鎂：1.0重量%、0.5重量%、0.1重量%或0.01重量%。

該固相反應介質可具有多種促進LAMP反應的特性。在一個態樣中，該固相反應介質可為親水性、吸收性、多孔性及惰性的。當液滴的表面及邊緣之間的接觸角小於約90度時，固相反應介質可為親水性的。通過紙可以吸收一定量的液體的程度來衡量，該固相反應介質可為吸收性的。當該固相反應介質具有大於至少1微米且小於或等於約100微米、約75微米、約50微米、約25微米、約10微米、約5微米或約1微米中之一或多個之孔徑時，該固相反應介質可為多孔性的。當該介質不會干擾LAMP反應時，該固相反應介質可為惰性的。當該介質不會干擾由LAMP反應產生的指示時，該固相反應介質也可為惰性的。

該固相反應介質可以包含或包括各種材料。在一個態樣中，該固相反應介質可包含尼龍、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、親水性聚四氟乙烯(PTFE)等或其等之組合中的一或多種。在另一個態樣中，該固相反應介質可為纖維素基介質，如1級層析紙、222級層析紙等或其等之組合。

除了該固相反應介質的材料類型外，該固相反應介質還可具有多種可以適應或增強LAMP反應及避免干擾LAMP反應產生的指示或信號輸出之物理特性。在一個態樣中，該固相反應介質可具有約30至約600之間的表面積對厚度比。在另一個態樣中，該固相反應介質可具有約60至約400之間的表面積對厚度比。在一個態樣中，該固相反應介質可具有約100至約200之間的表面積對厚度比。在另一個態樣中，該固相反應介質可為具有表面積對厚度比介於約30與約600之間的纖維素基介質。在一個態樣中，該纖維素基介質可具有大於至少1微米且小於或等於約100微米、約75微米、約50微米、約25微米、約10微米、約5微米或約1微米中之一或多個之孔徑。

該固相反應介質的厚度可以影響LAMP反應的總反應時間、通過該固相反應介質的流速、使用比色指示劑時的顏色對比、比色結果的均勻性、該固相反應介質中試劑的濃度等。

在一個態樣中，該固相反應介質可包含222級層析紙，其提供相對於1級層析紙的均勻性增加的均勻性，因為222級層析紙比1級層析紙厚。因此，與1級層析紙相比，222級層析紙可以將試劑濃縮在更小的表面積內。在一個態樣中，該層析紙可為222級，具有約5mm×約5mm的表面積以提供所需的表面積對厚度比。在一個例子中，1級層析紙可具有長20 mm及寬5 mm之橫截面尺寸及0.18 mm之厚度以提供約555之表面積對厚度比。在另一個例子中，222級層析紙可具有長5 mm及寬5 mm之橫截面尺寸及0.83 mm之厚度以提供約30之表面積對厚度比。因此，此例子說明了，與表面積對厚度比為約555 (如，1級層析紙)相比，表面積對厚度比約30 (如，222級層析紙)可以提供增加的均勻性。

除了本文揭示的材料外，該固相反應介質可包含紙或玻璃纖維中的一或多種。在一個例子中，該紙可包含α纖維素、β纖維素、γ纖維素等或其等之組合中的一或多種。在另一個例子中，該玻璃纖維可包含A-玻璃、E-玻璃、S-玻璃、R-玻璃、C-玻璃、T-玻璃、D-玻璃、M-玻璃、ECR玻璃等或其等之組合中之一或多種。

在一些例子中，該反應總成可包含一黏合劑。例如，該黏合劑可用於將該固相反應介質的各個片段彼此黏合。在一個例子中，該反應總成可進一步包含實質上不含鎂干擾劑、吸濕劑或其等之組合之黏合劑。該黏合劑可實質上不含鎂干擾劑，以避免鎂與DNA聚合酶之間的干擾，及避免在使用基於鎂的指示劑時使讀取LAMP結果複雜化。

在一些例子中，該反應總成還可包括一展開層。該展開層可促進生物樣品在該固相反應介質的不同區段中均勻展開。在另一個例子中，該展開層可具有比該固相反應介質低的親水性。具有比該固相反應介質低的親水性展開層，可促進生物樣品的均勻展開，因為生物樣品會從親水性較低的展開層朝更親水的固相反應介質擴散。

該試劑混合物相對於該固相反應介質的配置會影響LAMP反應。在一個實施例中，製造如本文所述的LAMP反應總成的方法可包含結合該實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與該固相反應介質，使得該試劑混合物與該固相反應介質保持接觸。在一個例子中，可使該試劑混合物與該固相反應介質保持直接接觸。在另一個例子中，可使該試劑混合物與該固相反應介質保持間接接觸。當該試劑混合物保持與該固相反應介質間接接觸時，中介材料(例如抗氧化劑)可增強該LAMP反應。

在某些情況下，該固相反應介質的顏色可能會受到不是由LAMP反應產生之試劑的影響。例如，揮發性劑，例如硫酸銨，其可形成硫酸根離子，然後反應形成硫酸。當使用基於pH的指示劑來讀取LAMP反應的結果時，這些非LAMP反應可能會妨礙結果的正確讀取，或可能會使結果的解讀更加複雜。

在一個態樣中，該方法可包含使用不變色添加劑來控制變色。該不變色添加劑可包含糖、緩衝劑、阻斷劑等或其等之組合。在一個例子中，該糖可包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣等或其等之組合。在另一個例子中，該阻斷劑可包含牛血清白蛋白、酪蛋白等，或其等之組合。

該糖可以防止非LAMP試劑pH變化的影響。該緩衝劑可防止由LAMP反應以外的因素引起的pH變化的影響，從而防止對LAMP反應或LAMP反應結果的干擾。該阻斷劑可以通過阻斷各種酶如RNase或DNase對待分析核酸(如，來自病毒的RNA或來自病原的DNA)的作用，來防止LAMP反應以外的因素的影響。

在另一個實施例中，如圖1所示，進行LAMP分析的方法100可包含提供如本揭示中所述的LAMP反應總成，如方塊110所示。該方法可進一步包含將一生物樣品施加到該反應總成，如方塊120所示。該方法可進一步包含將該總成加熱至足以引發LAMP反應的溫度，如方塊130所示。該方法可進一步包括將溫度維持足以完成該LAMP反應的時間，如方塊140所示。

在一個態樣中，該生物樣品可為唾液、黏液、血液、尿液、糞便、汗液、呼出氣冷凝物或其等之組合中的一或多種。在另一個態樣中，該生物樣品可為唾液。在另一個態樣中，該方法可進一步包含檢測一病毒病原。在另一個態樣中，該LAMP分析可為反轉錄LAMP (RT-LAMP)。

在另一個態樣中，足以引發LAMP反應的溫度可在約50℃至約60℃之溫度範圍內。在另一個態樣中，足以引發LAMP反應的溫度可在約60℃至約70℃之溫度範圍內。在另一個例子中，該恆溫溫度可為相差小於5℃之範圍內的溫度。在另一個態樣中，可以將溫度維持在足以完成該LAMP反應的溫度超過以下一個或多個：15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘、105分鐘或120分鐘。在另一個態樣中，可以將溫度維持在足以完成該LAMP反應的溫度少於以下一個或多個：15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘、105分鐘或120分鐘。

LAMP反應總成可以根據提高其均勻性、保質期或儲存夀命以及測試有效性製造。在一個態樣中，可使用以下一或多種來製造該LAMP反應總成：切割(將捲分割成更薄的捲)、單片化(由截斷機、旋轉模鍛或雷射切割成單件)、試劑塗佈(試劑浸漬、噴塗或分配並乾燥)、卡片層壓(將塑料背櫬加至捲軸上)等，或其等之組合。在一個例子中，可使用以下一或多種來製造該LAMP反應總成：將捲分割成更薄的捲；由截斷機或旋轉模鍛切割成單件；使用試劑浸漬進行試劑塗佈、使用加至捲軸上的塑料背襯之卡片層壓等，或其等之組合。 固相介質上基於pH的LAMP分析之材料

當存在吸濕劑及鎂干擾劑時，在固相反應介質上進行LAMP反應可能很困難。但是，還有其他因素會干擾LAMP反應結果的輸出及解讀。當涉及基於pH的指示劑時，試劑混合物應實質上不含干擾性試劑。在一些例子中，該干擾性試劑可包括氧化劑及pH干擾劑。

在一個實施例中，一種用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統可包含一實質上非反應性固相反應介質及一非干擾性試劑混合物。在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可實質上不含氧化劑及pH干擾劑。在一個態樣中，該非干擾性試劑混合物可包含一或多種目標引子、DNA聚合酶、再溶解劑或其等之組合。

該氧化劑會干擾LAMP反應。因此，該實質上非反應性固相反應介質中不應包含氧化劑。在一個態樣中，氧化劑可包括，但不限於，以下之一或多種：O ₂、O ₃、H ₂O ₂、F ₂、Cl ₂、鹵素、HNO ₃、硝酸鹽、H ₂SO ₄、H ₂S ₂O ₈、H ₂SO ₅、次氯酸鹽、亞氯酸鹽、氯酸鹽、過氯酸鹽、鉻化合物、過錳酸鹽、過硼酸鈉、一氧化二氮、NO ₂、N ₂O ₄、KNO ₃、NaBiO ₃、鈰化合物、二氧化鉛等，或其等之組合。

在某些情況下，僅僅避開氧化劑可能不足以促進LAMP反應。在這種情況下，可包括額外的試劑來防止不希望的氧化。在一個態樣中，該非反應性固相反應介質可包括以下之一或多種：氧吸收劑、乾燥劑等或其等之組合，以防止該非反應性固相反應介質氧化。在另一個態樣中，為了防止包含纖維素之非反應性固相反應介質的氧化，可以通過對纖維素進行熱循環來預處理纖維素以使氧化位點飽和。在另一個例子中，可以添加抗氧化劑來防止氧化。在另一個態樣中，染料指示劑(如，酚紅)可具有抗氧化作用。在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可含少於以下之一或多個的氧化劑：1.0重量%、0.5重量%、0.1重量%或0.01重量%。

除氧化劑外，pH干擾劑會妨礙對LAMP反應結果的正確解讀或進一步使LAMP反應的信號輸出複雜化。在一個態樣中，pH干擾劑可包括，但不限於，以下之一或多種：揮發性劑、影響pH的試劑、含鎂試劑或其等之組合。

當包括影響pH的試劑時，所產生的pH變化會使LAMP反應之基於pH的結果之分析複雜化。在某些情況下，可以補償影響pH值的試劑，且可調節該分析以容許適當的測試解讀。然而，在其他情況下，影響pH的試劑可能會使基於pH的結果的解讀變得不明確。

在一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可實質上不含影響pH的試劑。在一個態樣中，該影響pH的試劑可包括會干擾pH敏感性信號之酸、鹼或其等之組合。在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可含少於以下之一或多個之影響pH的試劑：1.0重量%、0.5重量%、0.1重量%或0.01w重量%。

當揮發性劑包含在該非反應性固相反應介質中時，該揮發性組分可能會揮發並留下會干擾pH敏感性輸出信號的組分或留下會進一步反應以干擾pH敏感性輸出信號之組分。在一個例子中，碳酸銨可形成會揮發的銨離子及會反應形成碳酸的碳酸根離子。碳酸可能在沒有來自LAMP反應之陽性結果(如，存在目標病原及LAMP誘導的擴增)之情況下，通過降低pH而干擾pH敏感性輸出信號。因此，在一個實例中，該非反應性固相介質可實質上不含如本文所定義的揮發性劑。

當含鎂試劑包含在該非反應性固相反應介質中時，該含鎂試劑在沒有嚴密監測時會干擾DNA聚合酶的操作。因此，在一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可實質上不含如本文另外揭示的鎂試劑。

該實質上非反應性固相介質可由各種材料組成。在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、親水性PTFE等，或其等之組合。在另一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可為如本文所揭示之親水性、吸收性、惰性及多孔性的。

該非反應性固相介質的緩衝能力可能會影響LAMP反應。例如，強緩衝劑會防礙從LAMP反應中檢測到的pH值變化。然而，弱緩衝劑會在即使沒有LAMP誘導的擴增之情況下導致pH大幅波動。在一個態樣中，該實質上非反應性固相反應介質可具有從約0.01mM至約5mM的緩衝能力。在一個例子中，可以每25μl樣品體積約500個拷貝數的檢測極限於生物庫唾液中摻入熱去活性病毒。然而，生物庫唾液的緩衝能力及pH可能與新鮮收集的唾液不同。因此，可以根據生物庫唾液與新鮮收集唾液之間的緩衝能力差異及pH值差異來調節新鮮收集唾液的檢測極限(LOD)。

在一些例子中，可在沒有專門儀器的情況下，由技術人員解讀來自該非反應性固相反應介質的pH敏感性輸出信號。但是，比色讀取器可提供更高水平的精準度及準確度。例如，在一個例子中，當與pH敏感性染料組合時，該實質上非反應性固相反應介質在測試範圍內可具有一最大吸收波長(λ _max)。在一例子中，當該pH敏感性染料為酚紅時，λ _max可在約443nm至約570nm的測試範圍內。因此，當該pH敏感性染料為酚紅且最大吸收波長在檢測範圍內時，技術人員可以使用比色讀取器檢測陽性或陰性結果。

在一些態樣中，該系統可進一步包含除該非反應性固相反應介質之外的組分。在一個態樣中，該系統可進一步包含黏合劑、展開層、隔件、塑料載體或其等之組合。在一個態樣中，該黏合劑、展開層、隔件及塑料載體中的每一個可實質上不含如本文所揭示的氧化劑及pH干擾劑。

在另一個實施例中，如圖2所示，一種使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中之色度輸出信號的準確度最大化的方法200可包含：提供使非LAMP反應產生的變色最小化之固相反應介質，如方塊210，及在該固相反應介質上進行該LAMP分析，如方塊220所示。

在一個態樣中，該方法可進一步包含控制由非LAMP反應產生的質子引起的非LAMP產生的變色。在另一個態樣中，該方法可進一步包含使用一不變色添加劑來控制非LAMP反應產生的變色。

不變色添加劑可防止由於非LAMP擴增導致的比色應答發生不希望的變化。在一個態樣中，該不變色添加劑可包含糖、緩衝劑、阻斷劑等，或其等之組合。

在一個例子中，該糖可包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣等或其等之組合中之一或多種。在一個態樣中，當在該固相介質上使用時，該糖的濃度可從約0.01mM至約1M。在另一個例子中，當在該固相介質上使用時，該糖的濃度可從約10mM至約500mM。在又一個例子中，當在該固相介質上使用時，該糖的濃度可從約200mM至約400mM。

在另一個例子中，該緩衝劑可包括磷酸鹽緩衝液(PBS)、Dulbecco氏PBS、Alsever氏溶液、Tris緩衝液(TBS)、水、HEPES、BICINE、平衡鹽溶液(BSS)，如Hank氏BSS、Earle氏BSS、Grey氏BSS、Puck氏BSS、Simm氏BSS、Tyrode氏BSS、BSS Plus、Ringer氏乳酸溶液、生理食鹽水(即0.9%食鹽水)、1/2生理食鹽水等等或其等之組合。在一個態樣中，當用在固相介質上時，該緩衝劑的濃度可從約10μM至約20mM。在另一個例子中，當用在固相介質上時，該緩衝劑的濃度可從約100μM至約10mM。在又另一個例子中，當用在固相介質上時，該緩衝劑的濃度可從約100μM至約500μM。

在另一個例子中，該阻斷劑可包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合中之一或多種。在一個態樣中，當用在固相介質上時，該阻斷劑的濃度可從約0.01重量%至約5重量%。在另一個例子中，當用在固相介質上時，該阻斷劑的濃度可從約0.01重量%至約1重量%。在又另一個例子中，當用在固相介質上時，該阻斷劑的濃度可從約0.02重量%至約0.06重量%。

在另一個實施例中，一種使環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的檢測位準(LOD)最大化的方法，可包含提供使非LAMP反應產物最小化的反應環境及試劑。在一些例子中，該反應環境可實質上不含氧化劑、pH干擾劑、吸濕劑、鎂干擾劑等或其等之組合中之一或多種。

在另一個實施例中，一種用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統，可包含一固相反應介質與一LAMP試劑的組合，其當儲存在25℃下時，可維持該固相反應介質的色彩在該固相介質之初始色調的10%以內。在一個態樣中，該固相介質與該LAMP試劑的組合在儲存超過以下一或多個時可維持色彩：30天、90天、365天、2年、3年或5年。在另一個態樣中，該固相介質與該LAMP試劑的組合在儲存於約40%與90%之間的相對濕度下時可維持色彩。

在另一個實施例中，一種用於製造色度LAMP系統的方法，可包含結合該非干擾性試劑混合物與一實質上非反應性固相反應介質，使得該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質保持接觸。

在一個例子中，可使該非干擾性試劑混合物與該固相反應介質保持直接接觸。在另一個實例中，可使該非干擾性試劑混合物與該固相反應介質保持間接接觸。當該非干擾性試劑混合物保持與該固相反應介質間接接觸時，中介材料(如，抗氧化劑)可增強該LAMP反應。

在一個態樣中，該方法可包含：製備含有該非干擾性試劑混合物的溶液，以及將該試劑混合物塗佈至該實質上非反應性固相反應介質上。在另一個態樣中，該塗佈可包含將溶液滴落、噴霧、浸漬、浸泡或霧化到該實質上非反應性固相反應介質上。

在某些情況下，該製造過程會影響LAMP分析系統的儲存夀命穩定性或均勻性。在一個例子中，可使用捲對捲(R2R)方法將該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質結合。 在固相介質上使用LAMP對選定的目標進行多重檢測以測試病原

在固相介質上使用LAMP來檢測病原時，有多種方法可以多重檢測LAMP。首先，可藉由在相同固相介質上包含多個對照組來多重檢測該方法。例如，可使用陽性對照組來驗證測試有效性。例如，該LAMP反應可測試唾液樣品中的唾液DNA或RNA生物標記，以驗證該LAMP反應是否按預期發揮作用。在另一個例子中，可使用陰性對照組來驗證測試有效性。例如，該LAMP反應可檢測不含病原的唾液樣品。

第二種多重檢測LAMP的方法，是在相同固相介質上包括靶向多種不同病原的引子。例如，可以藉由在相同固相介質上測試病毒病原及細菌病原來驗證測試的有效性，以進一步表徵生物樣品。

多重檢測LAMP的第三種方法，是使用不同的目標引子測試相同的病原。在一個例子中，該固相介質的第一區段可以使用一引子組測試病毒病原的第一蛋白；該固相介質的第二區段可以使用第二引子組測試該病毒病原的第二蛋白；以及該固相介質的第三區段可以使用第三引子組測試該病毒病原的第三蛋白。每個引子可靶向該病毒病原基因組的不同區域，以排除偽陰性及偽陽性。

LAMP可藉由在固相LAMP反應介質上包括各種組份進行多重檢測。在一個實施例中，如圖3a所示，用於進行LAMP分析的固相反應介質300a可包含基板302、配置在基板302上的黏合層304、配置在黏合層304上的反應層306，其包括測試點或反應位置或片段305a、305b、305c及隔件307a、307b、307c，及配置在反應層306上之展開層308。在一個態樣中，測試點305a、305b及305c可包含或以其他方式保持包括一或多種目標引子、DNA聚合酶、再溶解劑等的試劑。在一個態樣中，該試劑可形成足以進行LAMP反應的組成物。

空間不連續的反應層306可容許多個對照組或多種病原的多重檢測。例如，測試點305a可為陽性對照組(如，測試已知的唾液DNA或RNA生物標記)，測試點305b可為陰性對照組(如，不包括用於LAMP反應的所有試劑之比色結果測試)，及測試點或反應片段305c可測試目標病原。

空間上不連續的測試點或反應位置305a、305b及305c也可容許對多種病原進行多重檢測。例如，測試點305a可測試流感，測試點305b可測試細菌感染及測試點305c可測試真菌感染。

反應位置或片段305a-305c的尺寸可能影響多重檢測潛力。在一個態樣中，反應片段305a-305c可具有從約0.05mm到約2mm的厚度。在另一個態樣中，反應片段305a-305c可具有從約4mm至約12mm的寬度及從約4mm至約25mm的長度。在一個例子中，反應位置305a-305c可為空間不連續的。在另一個例子中，反應片段305a-305c可具有從約30至約600的表面積對厚度比。

在一個例子中，固相反應介質300a可配置成可接收一生物流體，其可橫向流過展開層308且可垂直向下遷移到反應層306的測試點305a-305c中。測試點305a-305c可包含用於發生RT-LAMP或LAMP反應的所有組份。在一個例子中，測試點305a-305c可包含再溶解劑(如，界面活性劑)、酵素(如，DNA聚合酶、反轉錄酶、DNase抑制劑或RNase抑制劑)、穩定劑(如，阻斷劑，如BSA或酪蛋白)、比色指示劑(如，鎂比色指示劑、pH比色指示劑或DNA嵌入比色指示劑)及緩衝劑(例如，20mM Tris)。

固相反應介質300a可配置成可接收一試劑，其可加速反應、增加靈敏度或其等之組合。在一個例子中，BSA可加速反應並增加靈敏度。然而，包含BSA也會引入可能影響結果可讀性的pH變化。因此，在一些例子中，該穩定劑可為酪蛋白、聚山梨醇酯20等，或其等之組合。

反應片段或點(如，測試點) 305a-305c可包含本文所揭示的任何合適的材料。在一個例子中，反應片段305a-305c可包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、親水性PTFE等或其等之組合中的一或多種。在一個態樣中，反應片段或點305a-305c的孔徑可從約1至約100微米。反應片段或點305a-305c在外觀上可為光潔及光滑的。

在另一個態樣中，反應片段305a-305c可在讀取區域中提供均勻的最終顏色，用於準確及精準的信號輸出或檢測。在一個例子中，生物樣品可垂直向下緩慢遷移到反應片段305a-305c中。反應片段305a-305c的最終顏色強度可由使用者通過光學觀察及與顏色圖表或刻度比較，或使用手持式LED儀測量為百分比反射率單位並使用對實驗室參考儀器校準的曲線集轉換為每反應RNA或DNA個拷貝數，或為獲得RGB值或像素計數的光學影像，其可根據實驗室參考儀器校準。RNA或DNA的濃度可以通過選定時間的最終顏色強度或動力學速率測定來確定。

在另一個態樣中，固相LAMP反應介質300a可進一步包含反應片段305a-c。在一個例子中，至少一個區段可實質上不含試劑(如，305a可實質上不含試劑)。在另一個態樣中，反應片段305a-c可由至少三個不連續的黏合層304區段界定。三個反應片段305a、305b及305c可指定用於測試一個病原、多個對照組之相同病原，或有或無特定陽性或陰性對照組之不同的病原。簡言之，反應片段305a-c可被指定及組配用於在幾乎任何陣列中進行測試，以便提供任何期望的參數或步驟準則，其產生具有高度準確信賴度的特定結果的特定測試。此外，反應層306可配置有多種數目及位置排列的測試點305a-c。例如，反應層中可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或任何其他合理數目的測試點。此外，這樣的測試點或反應片段可在反應層306內以直線、併排或幾乎任何其他期望的空間佈置方式佈置。

在一個態樣中，如圖3b所示，固相LAMP反應介質300b可包含偶合在黏合層304與展開層或分佈層308之間的反應片段305a及305b。在一個態樣中，至少一個反應片段(如，305a或305b)可為實質上不含試劑的對照區段或點。在另一個態樣中，反應片段(如，305a或305b)中之至少一個可配置用以測試目標病原(如，將包含或以其他方式支持用於選定的LAMP反應的試劑)。

在又另一個態樣中，如圖3c所示，固相LAMP反應介質300c可包含反應層306，及偶合在黏合層304與展開層308之間的反應片段或點305a、305b、305c、305d。每個反應片段可用隔件(如，307a、307b、307c、307d、307e)與相鄰的反應片段或點隔開。

在又另一個態樣中，如圖3d所示，固相LAMP反應介質300d可包含基板302、黏合劑304、具有反應片段或點305a、305b及305c，不包括展開層之反應層306。在此例子中，樣品可分別或同時沈積在反應層305a、305b、305c的每個區段上。此外，在此實施例中，相鄰反應片段之間不存在隔件。然而，在一些實施例中，可包含隔件而不存在展開層308。

在又另一個態樣中，如圖3e所示，固相LAMP反應介質300e可包含基板302、黏合劑304及具有反應片段或測試點305a及305b的反應層306，不包括展開層或任何隔件。同樣，在另一個實施例中仍然可包含隔件而不包括展開層308。在此例子中，樣品可分別及/或共同地沈積在反應層305a及305b的每個區段上。

在又另一個態樣中，如圖3f所示，可用於LAMP分析的固相反應介質300f可包括基板302、黏合劑304、具有反應片段305a、305b、305c及305d，不包括展開層且不具任何隔件的反應層306。同樣，應該理解，如果需要，可在相鄰反應片段之間包括隔件，但不包括展開層。在此例子中，樣品可以分別及/或共同地沈積在反應層305a、305b、305c、305d的每個區段上。

還應當理解，在其他實施例(未示出)中，可以存在展開層308，具有偶合在該展開層與黏合劑304之間的測試點或反應片段，但不包括任何隔件。簡言之，為提供最準確的結果，或適應任何製造需要或獲得某些其他利益，可根據要執行的具體測試選擇固相反應介質的組份，以適應測試的需要。

在另一個態樣中，基板302可為光學透明材料。在另一個態樣中，基板302可為光學透明的塑料載體。在另一個態樣中，黏合層304可實質上不含揮發性劑。在另一個態樣中，黏合層304可實質上不含會干擾LAMP反應的試劑。在另一個態樣中，黏合層304可連續或不連續地配置在基板上。

該黏合層可包含各種材料。在一個例子中，反應層306可包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、親水性PTFE等或其等之組合中的一或多種。在一個例子中，黏合層304可包含不會影響反應層中的反應片段或測試點的顏色變化的惰性黏合劑。在一個例子中，反應層306可實質上不含螯合劑、鎂、過度緩衝能力、影響pH的試劑或其等之組合。在另一個例子中，可最小化黏合劑的數量以防止黏合層304與反應片段305a-c之間的干擾。

該展開層可配置成可增強生物樣品在反應片段305a-305c上的分佈及均勻性。在另一個態樣中，展開層308可將唾液樣品分佈在反應層306的表面上或計量穿過該反應層的唾液樣品。展開層308可以在展開層308與反應層306之間的界面處提供均勻或實質上均勻濃度的唾液樣品。展開層308可為網狀材料、具有相同孔隙率的各向同性多孔材料、或具有孔隙率梯度的各向異性層等或其等之組合中的一或多種。在一個態樣中，各向異性層可具有約1至約100微米範圍內的孔徑。在一個態樣中，展開層308可親水到足以吸收及展開樣品的程度。在另一個態樣中，展開層308的親水性可低於下面的反應層306，以容許樣品被抽離展開層308並進入反應層306。

當提供均質的生物樣品時，展開層308的精準滲透性可用於將生物樣品均勻地分佈在反應層305a-c的表面上。在一個態樣中，展開層308的表面可與反應層305a-c直接接觸，用於通過生物樣品的橫向遷移而達成生物樣品的均勻垂直轉移。在另一個態樣中，展開層308可包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、聚酯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)等或其等之組合中的一或多種。在一個例子中，展開層308可為光學透明的。在一個態樣中，可對該材料進行化學處理以增強生物樣品在多個反應片段305a-305c上的分佈。

反應片段或測試點305a-305c之間的足夠間隔可最小化或排除各反應片段間交叉污染的可能性。例如，當兩個區段之間的間隔容許試劑從305a流到305b時，反應片段305a可能會污染相鄰的片段，如305b。在另一個態樣中，該固相LAMP反應介質300a可進一步包含隔件307a、307b、307c及307d，其等可在反應片段305a-c之間強加約1.0mm-約3.0mm (如，2.5mm)的最小空間。

在一些實施例中，隔件307a-307d可具有大於或等於反應片段或測試點305a-305d的高度，以便在其等之間產生物理屏障(如，當樣品分別施加到每個測試點時)。在一個例子中，該隔件高度可測定為基板302與隔件頂表面之間距離的測量值。同樣地，該反應片段高度可測定為基板302與反應片段頂表面之間距離的測量值。在一些態樣中，該隔件可具有比該反應片段的高度高出0至50%的高度。

在其他實施例中，隔件307a-307d可具有小於或等於反應片段或測試點305a-305d的高度，以便在其等之間產生物理屏障(如，當樣品分別施加到每個測試點時)。同樣地，該反應片段高度可測定為基板302與反應片段頂表面之間距離的測量值。在一些方面，該隔件可具有比該反應片段的高度低0至50%的高度。

在一個例子中，隔件307a-d可包括，但不限於，聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、聚苯乙烯、聚酯、親水性聚四氟乙烯(PTFE)等或其等之組合中的一或多種。在另一例子中，隔件307a-d可包括，但不限於，玻璃纖維、尼龍、纖維素等或其等之組合。在另一例子中，隔件307a-d可包含疏水性材料(如，聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、聚苯乙烯、聚酯、親水聚四氟乙烯(PTFE)等)，但不包括親水性材料(玻璃纖維、尼龍、纖維素等)。在一個態樣中，隔件307a-d可定向在與反應片段305a-c相同的平面上且可定向在其等之間。

在另一個例子中，如圖3a所示，固相LAMP反應介質可包括由黏合層304接合的展開層308及反應層306。在一個例子中，隔件307a-307d的材料類型可增強或以其他方式正面地影響展開程度。例如，聚苯乙烯隔件可產生比其他材料類型更高程度的展開。犧牲使用者的簡便，沒有展開層308的固相反應介質可簡化製造。在這種情況下，使用者可將唾液樣品單獨施加到每個測試點305a-c。然而，會排斥或最小程度吸收樣品的材料(如聚苯乙烯)的隔件，可幫助該展開層，提供均勻的展開結果。此外，當沒有使用展開層308時，此類材料的隔件亦有助於將樣品展開。

參考圖4，顯示一種測試病毒病原存在的方法400，可包含提供來自一受試者之一唾液樣品，如方塊410所示，及將該樣品分配到一測試環境中，其具有一固相反應介質與一LAMP試劑混合物和一pH敏感性染料之組合，如方塊 420所示。

在一個態樣中，該方法可包含使揮發性劑、吸濕劑及非pH敏感劑(能夠使該固相介質變色)的數量最小化。在另一個態樣中，該方法可包含提供足以促進LAMP反應之數量的一或多種目標引子、DNA聚合酶及再溶解劑。在另一個態樣中，該方法可包含提供足以促進RT-LAMP反應之數量的反轉錄酶。在另一個態樣中，該方法可包含提供足以檢測該病毒病原之數量的一或多種目標引子。在另一個例子中，該方法可包含在將該樣品分配到該測試環境後不到一小時內產生一測試結果。

在又另一個實施例中，如圖5所示，一種確認唾液樣品是否適合用固相LAMP反應進行測試的方法500，可包含提供具有至少一個測試位置或點之一固相反應介質，該至少一個測試位置或點包括一LAMP試劑與一pH敏感性染料之組合。在另一個態樣中，該方法可進一步包含提供具有至少一個陰性對照位置之一固相反應介質，該陰性對照位置包括一pH敏感性染料，但不包括LAMP試劑，如方塊510所示。在另一個態樣中，該方法可進一步包含將該唾液樣品施加到該固相反應介質中，如方塊520所示。在另一個態樣中，該方法可進一步包含確認該陰性對照位置上的pH敏感性染料的活化，如方塊530所示。

在一個例子中，該pH敏感性染料可為酚紅、酚酞、石蕊紅質、溴瑞香草酚藍、萘酚酞、甲酚紅或其等之組合中的至少一種。在另一個例子中，該LAMP試劑可實質上不含揮發性劑、影響pH的試劑、含鎂試劑或其等之組合。在另一個態樣中，該LAMP試劑可包含非干擾性LAMP試劑，包括DNA聚合酶、反轉錄酶、針對目標區域的引子或其等之組合。

在另一個態樣中，該方法可進一步包含提供由至少兩個不連續的黏合層區段界定之測試位置或點。在另一個例子中，該方法可進一步包含提供由至少三個不連續的黏合層區段界定之測試位置或點。

在又另一個實施例中，如圖6所示，一種使固相LAMP反應的陽性測試結果的準確度最大化的方法600，可包含提供一固相反應介質，其具有至少三個測試位置或點，各包括一共同的pH敏感性染料及一LAMP試劑的組合，如方塊610所示。在一個態樣中，各位置可包括來自一目標病原的不同引子序列。在另一個態樣中，該方法可包含引發LAMP反應，如方塊620所示。在另一個態樣中，該方法可包含當該等測試位置或點中之至少二個活化pH敏感性染料並經歷從第一顏色到第二顏色的變化時，確認陽性測試結果，如方塊630所示。在另一個態樣中，該方法可進一步包含提供足以促進RT-LAMP反應之數量的反轉錄酶。

在一個例子中，該pH敏感性染料可為酚紅、酚酞、石蕊紅質、溴瑞香草酚藍、萘酚酞、甲酚紅或其等之組合中的至少一種。在另一個態樣中，該LAMP試劑可實質上不含揮發性劑、影響pH的試劑、含鎂試劑或其等之組合。

在另一個態樣中，該目標病原可包含病毒病原、細菌病原、真菌病原或原生動物病原。在一個態樣中，該目標病原可包含一病毒病原。在另一個態樣中，該病毒病原可包含dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、正股ssRNA病毒、反股ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或ds-DNA-RT病毒。在另一個態樣中，各引子序列可配對來自包含H1N1、H2N2、H3N2、H1N1pdm09或SARS-CoV-2的病毒目標的序列。

在另一個態樣中，待檢測的特定目標核苷酸序列可為對應於人類生物標記的目標核苷酸。任何具有對應於待檢測疾病之人類生物標記之目標核苷酸之疾病，均可檢測。各種可檢測的疾病類型包括下列之一或多種：乳癌、胰臟癌、結直腸癌、卵巢癌、胃腸道癌、子宮頸癌、肺癌、膀胱癌、多種上皮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、胃癌等等或其等之組合。例如，可藉由檢測對應於以下一或多種之目標核苷酸來檢測各種疾病類型之生物標記：α胎兒蛋白、CA15-3及CA27-29、CA19-9、C!-125、降鈣素、鈣網膜蛋白、癌胚抗原、CD34、CD99MIC 2、CD117、染色顆粒素、染色體3、7、17及9p21、細胞角蛋白、cesmin、上皮膜抗原、第八凝血因子、CD31 FL1、膠質原纖維酸性蛋白、巨囊性病液體蛋白、hPG80、HMB-45、人絨毛膜促性腺激素、免疫球蛋白、抑制素、角蛋白、淋巴細胞標記、MART-1、Myo D1、肌肉特異性肌動蛋白、神經絲、神經元特異烯醇酶、胎盤鹼性磷酸酶、前列腺特異性抗原、PTPRC、S100蛋白、平滑肌肌動蛋白、突觸素、胸苷激酶、甲狀腺球蛋白、甲狀腺轉錄因子-1、腫瘤M2-PK、波形蛋白(vimentin)等等或其等之組合。

在一個例子中，該陽性對照組可包括一合成DNA目標作為該測試區段之一，以確認該DNA樣版是穩定的。在另一個態樣中，該陰性對照組可包括：(a)沒有引子之酵素試劑，或(b)具有靶向不同病毒的引子之酵素試劑。

在另一個例子中，可以使用3個測試區段來增強對不同病毒株(如，SARS-CoV-2)的覆蓋率。可為每個引子選擇檢測時間及極限。在一個例子中，使用第一引子，可實現97%的病毒(如，SARS-CoV-2)覆蓋率。在另一個例子中，與第一個引子相比，包括2個更慢及更不敏感的額外引子可能不會增強病毒的覆蓋率。在另一個例子中，多個測試區段可用於實現不同病毒病原(如，SARS-CoV-2、H1N1、H2N2、H3N2、H1N1pdm09等)的覆蓋率。 固相介質LAMP測試過程及方法

在固相介質上的LAMP測試可以多種方式增強。首先，可監測測試環境，防止可能影響測試過程的變化。其次，生物樣品檢測裝置的儲存條件會影響生物樣品檢測裝置的有效性。當嚴格監測這些條件時，與液體基LAMP測試相比，該生物樣品測試裝置可具有增強的操作性。

可使用與測試環境相關的各種方法。在一個實施例中，如圖7所示，一種測試目標核苷酸序列的存在的方法可包含：提供一生物樣品，如方塊710所示，及將該樣品分配到具有一固相反應介質與一環介導恆溫擴增(LAMP)試劑混合物和一pH敏感性染料之組合的測試環境中，如方塊720所示。在一個態樣中，該方法可包含提供足以促進RT-LAMP反應之數量的反轉錄酶。

生物樣品的類型會影響測試環境。例如，唾液樣品可能具有緩衝能力，可能降低測試輸出的對比度。在一個例子中，該生物樣品可為下列中之至少一種：唾液、黏液、血液、尿液、汗液、呼出氣冷凝物或糞便。在另一個例子中，該方法可進一步包含使用下列中之一或多種收集生物樣品：唾液收集裝置、鼻拭子、血液收集裝置、尿液收集裝置、汗液收集裝置、呼出氣收集裝置或糞便收集裝置。

可控制測試環境以提供一致的測試輸出。在一個態樣中，該測試環境可實質上不含揮發性劑、影響pH的試劑、乾燥劑或其等之組合。這些試劑中的每一種都可能因引入變量(其可能會通過額外的分析得到補償)而降低測試結果的一致性。

另一個可以監測的測試環境變量是當使用生物測試裝置加熱生物樣品時溫度升高的速率。在一個態樣中，該方法可包含以每秒約0.1℃/的速率升高測試環境溫度。在一個例子中，測試環境溫度可以每秒約0.1℃至每秒約0.2℃的速率升高。在一個例子中，該反轉錄酶可在約55℃被活化，而DNA聚合酶可在約65℃被活化。因此，高於每秒約0.2℃的升溫速率會干擾LAMP反應中反轉錄酶及DNA聚合酶的協調作用。在一個例子中，可提高升溫速率直到該測試環境溫度在約60℃到約67℃的範圍內。在一些例子中，當該測試環境增加到約55℃ (即，可活化反轉錄酶的溫度)時，以約0.1℃的升溫速率從55℃到約65℃，生物樣品測試裝置可能提供無效的結果。因此，升溫速率不僅應在約55℃至約65℃的測試環境溫度範圍內進行監測，且亦應在將生物樣品加熱至約55℃時進行監測。

測試環境的變異也可能影響生物樣品測試裝置的結果。在一個態樣中，該方法可包含在該測試環境中提供變異小於1℃的加熱均勻性。測試盒周圍溫度的空間變異不應大於約0.5℃，以避免干擾LAMP反應。

在另一個態樣中，該方法可包含從約15分鐘至約30分鐘之唾液樣品測試時間。在另一個態樣中，該方法可包含從約30分鐘至約45分鐘之唾液樣品測試時間。在另一個態樣中，該方法可包含從約45分鐘至約60分鐘之唾液樣品測試時間。在另一個態樣中，該方法可包含從約60分鐘至約90分鐘之唾液樣品測試時間。在另一個態樣中，該方法可包含從約20分鐘至約30分鐘之鼻咽樣品測試時間。在另一個態樣中，該方法可包含從約30分鐘至約40分鐘之鼻咽樣品測試時間。

在另一個態樣中，該方法可進一步包含提供一固相反應介質，其包含玻璃纖維、尼龍、纖維素、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素、親水性PTFE等或其等之組合。在另一個態樣中，該固相反應介質可包含本文另外揭示的材料。

在一個態樣中，該目標核苷酸序列可來自病毒病原、細菌病原、真菌病原或原生動物病原中的至少一種。在一個態樣中，該目標核苷酸序列可來自一病毒病原。在另一個態樣中，該病毒病原可來自由下列所構成之群組：冠狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、小核糖核酸病毒科、腺病毒科及細小病毒科。在另一個態樣中，該病毒病原可選自於由下列所構成之群組：嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(SARS-CoV-1)、嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)、中東呼吸症候群(MERS)、流行性感冒及H1N1。在一個態樣中，該目標核苷酸序列可來自嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)病原。

該生物樣品檢測裝置的檢測準確度可能會受到測試前儲存時間長短及儲存條件(如，儲存溫度、濕度等)的影響。在一個實施例中，一種生物樣品測試裝置可包含一基板，其接合一固相反應介質與一脫水環介導恆溫擴增(LAMP)試劑混合物和一脫水pH敏感性染料之組合。在一個態樣中，該裝置在一選定的溫度(如，約25℃之室溫)下儲存6個月後，可提供至少約95%、96%、97%、98%或99%的測試準確度。在一個態樣中，該裝置在一選定的溫度下儲存12個月後，可提供至少約95%、96%、97%、98%或99%的測試準確度。在另一個態樣中，該裝置在一選定的溫度下儲存2年後，可提供至少約95%、96%、97%、98%或99%的測試準確度。在另一個態樣中，該裝置在一選定的溫度下儲存3年後，可提供至少約95%、96%、97%、98%或99%的測試準確度。在另一個態樣中，該選定的溫度可為在約-20與約37℃之間範圍內的任何溫度。

該生物樣品測試系統可包含一外殼。在又另一個實施例中，該生物樣品測試系統可包含：一基板，其接合一固相反應介質與一脫水環介導恆溫擴增(LAMP)試劑混合物和一脫水pH敏感性染料之組合，該外殼可操作以接收一生物樣品。在一個態樣中，該生物樣品測試系統可進一步包括一加熱器，配置成可將該容器恆溫加熱到一內部溫度，該內部溫度足以引發及維持該LAMP試劑混合物與一生物樣品之間的LAMP反應持續一段用於通過該pH敏感性染料產生測試結果的時間。

在一個態樣中，該基板可包含一光學透明材料。在另一個態樣中，該基板可以通過一黏合劑接合該固相反應介質。在另一個態樣中，該黏合劑可為實質上光學透明的。在另一個態樣中，該基板可包含一外殼的一部分。在另一個態樣中，該生物樣品測試系統可進一步包含一黏合層，其配置在該基板上；一反應層，其配置在該黏合層上；及一展開層，其配置在該反應層上。在另一個態樣中，該生物樣品測試系統可進一步包含一隔件層，其與該反應層定向在相同平面上。在另一個態樣中，該生物樣品測試系統可進一步包含靠著該基板配置之一外殼。在一個例子中，該外殼可進一步靠著該展開層配置。在另一個例子中，該外殼可實質上圍住該基板、黏合層、反應層及展開層。

在一個例子中，生物測試系統的操作，如圖8所示，可包括：(a)使用海綿收集唾液，(b)將該海綿插入一收集管中，(c)用水稀釋該收集管，將該唾液樣品稀釋低至5%以穩定該唾液之pH及降低緩衝能力，(d)使用一移液管將該唾液樣品轉移到測試盒中之測試條上，藉由將該唾液樣品施加到單一位置，以便毛細管及網狀層可將該唾液樣品展開到該反應層之個別片段；(e)將蓋子放在該測試盒上並將蓋子鎖定到位；(f)通過檢驗該反應層的片段驗證該唾液樣品的pH在一測試範圍內；(g)將該測試盒插入一加熱器中，及(h)驗證該測試盒在該加熱器內的正確位置；(i)啟動該加熱器；(j)測試完成約30分鐘後讀取結果；(k)判定該結果是否有效，及(l)判定該結果是陽性還是陰性。

操作(a)可透過海綿收集裝置或被動流口水裝置收集唾液來進行。當使用海綿收集裝置時，可將海綿插入收集管中，將唾液釋放到收集管中(操作(b))。收集管可用水稀釋，以降低唾液的緩衝能力，降低唾液的黏度，並提高樣品的均勻性(操作(c))。要轉移到測試條上時，可將唾液樣品單獨施加在測試條的每個區段上，或可施加在測試條的中心，再由展開層將樣品展開到測試條的整個測試區域(操作(d))。可將測試條蓋起來以避免測試環境的污染(操作e)。唾液樣品的pH可透過各種方法測試，如比色儀器、螢光讀取器等方式進行測試，或者通過與使用中的pH指示劑的pH色表進行簡單比較(操作((f))。可將測試盒放入加熱器中並啟動(操作(g)、(h)及(i))記錄時間，以便測量總反應時間及達到陽性或陰性結果的時間。可在30分鐘後讀取結果(操作(j))，或可在結果顯示陽性結果時立即讀取結果。出現陽性結果的速率可能與病原的濃度相關。根據陽性對照組、陰性對照組、其他病原結果或其等之組合，可判定結果是有效的(操作(k))。當使用基於pH的指示劑時，通過將結果的顏色與基於pH的指示劑的顏色比較圖進行比較，可以判定結果是陽性還是陰性。也可以通過測量所吸收的顏色之波長來判定結果是陽性還是陰性。

在另一個揭示的實施例中，一種生物測試套組可包含唾液收集裝置、收集管、測試盒、移液管、加熱器、色表或其等之組合中的一個或多個，如圖8a及8b所示。唾液收集裝置可為海綿收集裝置或被動流口水裝置。

在一個例子中，如圖8a中之操作1所示，使用者可使用一或多個操作收集唾液，包括：(a)從生物測試套組的袋中取出Pure-Sal ^TM，(b)將Pure-Sal ^TM的海綿放入嘴巴收集唾液，直到指示劑改變顏色或提供其他顯示唾液收集過程結束的指示，(c)將收集管固定到壓縮管中，(d)將海綿取樣器插入壓縮管中，(e)壓縮海綿將收集的唾液(不含一些降解唾液酵素)擠入壓縮管中，(f)將管關起來，及(g)通過倒置多次(如，1至10次)混合管。

在將唾液收集在管中並充分混合之後，使用者可以準備測試盒，如圖8a中的操作2所示。使用者可(i)從鋁箔袋中取出測試盒，(ii)從測試盒中取下護套，及(c)將測試盒放在水平表面上。使用者還可轉移樣品，如圖8a中之操作3所示，使用稀釋的唾液(如，用水稀釋)將移液管填充至黑線，並轉移到樣品孔中。使用者也可將測試盒封起來，如圖8a中的操作4所示，將護套放在測試盒上，使得扣件對齊並卡扣在一起。使用者還可加熱測試盒，如圖8a中的操作5所示，將測試盒放入輔助加熱器中，關閉蓋子並啟動輔助加熱器，這可通過LED指示何時完成反應。

反應完成後，如圖8a的操作6所示，使用者可從加熱器中取出測試盒並將測試盒與色表進行比較，同時亦確保色表及測試盒之間的方向是正確的。如圖8b進一步所示，參考病毒病原SARS-CoV-2的色表，可包含2列3行的6個正方形。第一行(-ve)可指示陰性結果，第二行(+ve)可指示陽性結果，第三行(無效測試)可指示無效結果。

例如，第一行可指示陰性結果，因為頂列正方形與底列正方形都近似紅橘色，此可發生在當在各正方形中未發生核苷酸之LAMP反應擴增時。第二行可指示陽性結果，因為頂列正方形近似紅橘色，此可發生在當核苷酸之LAMP反應擴增未發生時，但底部正方形近似橘黃色，此可發生在當核苷酸之LAMP反應擴增發生時，表明存在病毒病原。第三行可表示無效結果，因為頂列正方形近似橘黃色，此可發生在當核苷酸之LAMP反應擴增發生時，但底部正方形近似橘黃色，此可發生在當核苷酸之LAMP反應擴增發生時。但是對於第三行，顏色從紅橘色變成橘黃色的原因可能是不確定的，因為陰性對照組(如，頂列)也發生了顏色變化。

因此，使用者可將色表與測試盒中的測試進行比較，以確定測試結果。圖8b中所示的色表是一個例子。色表可包括額外的列或行，用以容納針對額外對照組、額外病原或針對相同病原的不同引子的任意數量的測試。此外，該測試可以由受試者自己進行，或可以由受過培訓的技術人員、護理助理、護士、醫師助理、醫生或任何其他有資格進行測試及解讀結果的人進行。 範例

提供以下範例以促進對本發明的某些實施例更清楚的理解，且絕不意味著對其之限制。 紙質LAMP 反應的材料總成範例 1 – 紙質LAMP總成

在紙質LAMP總成方面，篩選了幾種材料設計出便攜小巧的總成。在展開層之篩選方面，將二個紙條(一條有引子，一條無引子)放在一起，並加載50μL濃度為0.2 ng/μL的RNA使二個紙條均飽和。由於以下幾個原因，材料可能不會對紙張的pH產生實質性的影響：(a)紙張太酸而不會在培育前改變顏色，或者 (b)紙張太鹼，這會阻止反應產生任何顏色變化。進一步使用其他設備組件測試防止兩個紙條之間相互影響的材料。

紙質LAMP總成的尺寸為約24 x 54 mm。紙質LAMP總成包含：(i)讀取層，(ii) 2個反應條，及(iii)展開層。讀取層包含一透明的3毫米Melinex ^®背襯，用於支撐。將Melinex ^®背襯附接到2個反應條上，各反應條由與雙面黏合劑(ArClean® 90178)接觸的5 mm x 20 mm層析紙(如，Whatman® Grade 1層析紙)形成。二個測試條由2.5 x 20 mm 10毫米的聚苯乙烯隔件隔開，以防止兩個測試條之間的相互影響。展開層包括聚酯碸網(Saaticare® PES 105/52)。將樣品加載在展開層上。圖9顯示總成的一個例子。 範例 2 – 材料篩選

紙質材料的選擇基於五個標準：(a)在基板上乾燥時配方的穩定性，(b)以樣品再水化時顏色變化的強度，(c)樣品在整個紙質基板中均勻芯吸的能力(d)材料在整個反應過程中保持惰性的能力，及(e)紙質材料在擴增時表現出顏色變化的能力。測試Whatman® 1級層析紙並用於優化。當將二個測試條組裝在一起時，觀察到流體分佈不均勻，因為LAMP反應使用了大面積的1級色譜。選擇比1級層析紙厚的層析紙(如，Ahlstron 222級層析紙)允許測試條的表面積約為5 mm x 6 mm，同時還攜帶與1級層析紙相同數量的樣品及試劑，其允許在再水化過程中更均勻地展開。 範例 3 – 材料篩選 – 1級及222級層析紙

在一個例子中，如圖10所示，這些影像示出可生成的顏色對比例子。在一個例子中，使用1級層析紙。在另一個例子中，使用222級層析紙。在這二種情況下，RT-LAMP試劑都經過乾燥，並用25μL的5%唾液及95%的水進行再水化。陽性樣品含有摻入每反應10k個拷貝數的熱去活性SARS-CoV-2，陰性樣品為5%唾液(不含病毒)及95%水。影像是在65℃下培育90分鐘的時間點拍攝的。

如圖10所示，1級紙的陰性結果與1級紙的陽性結果之間的顏色對比，不如222級紙的陰性結果與222級紙的陽性結果之間的顏色對比明顯。因此，較厚的紙張產生增強的顏色對比度。 範例 4 – 紙總成步驟準則

紙總成步驟準則可包括：(1)將聚對苯二甲酸乙二酯(PET)切割成尺寸為80 mm x 7 mm的矩形，每個裝置創造2個； (2)將層析紙剪成尺寸為33mm x 5mm的矩形，每個裝置創造1個；(3)剪出一大片雙面膠帶，及將PET矩形貼在上面，使每個PET矩形之間有2cm的距離；(4)剪掉所有的方形，讓四周都有多餘的膠帶；(5)將上面有PET的膠帶撕掉，在PET的反面貼上層析紙，在膠帶外面留出約1cm；(6)使用靠近裝置內部的單點將25μl樣品加在層析紙上；(7)貼上其它PET條以蓋住樣品(即，有膠帶的一面應接觸樣品，而PET應在外面)；(8)折疊任何黏在PET膠帶上的膠帶以進一步密封；(9)在15ml管底部加入1 ml溶劑；(10)將組裝好的紙裝置放入管中，使伸出的層析紙在溶劑中；(11)關閉管子；及(12)在65℃下培育1小時。 基於pH的紙質LAMP分析之材料 範例5 – 檢測極限(LoD)

LoD研究使用靶向SARS-CoV-2之各種不同區域的引子組，以及在25μL的反應體積中，以2.5、5、10、20個拷貝數/μL的濃度將熱去活性SARS-CoV-2進行2倍系列稀釋。使用在水中基於液體的比色測定法，估計的LoD為約20個拷貝數/μL，4/4次重複顯示顏色從紅色變為黃色，因此確認發生了擴增。 範例6 – 檢測極限(LoD)

基於液體的LAMP反應的LOD可為每μL樣品體積約20個病毒拷貝數的濃度。對於固相反應介質(如，層析紙)，各反應區域可容納約25μL的樣品體積。 範例 7 – LoD的確效

在確定唾液中的LoD約為20個拷貝數/μL後，製造以下具有相關濃度的樣品：(1) 20個拷貝數/μL (1x LoD – 10個樣品)，(2) 40個拷貝數/μL (2x LoD – 10個樣品，(3) 100個拷貝數/μL (2個樣品)，(4) 1000個拷貝數/μL (2個樣品)，(5) 10,000個拷貝數/μL (2個樣品)，(6) 100,000個拷貝數/μL (2個樣品)及 (7) 1,000,000個拷貝數/μL (2個樣品)。陰性樣品是混合唾液的等分試樣(30等分試樣)。亦使用影像處理確認結果。 範例8 – LoD、靈敏度及特異性

在水中對熱去活性SARS-CoV-2進行多次連續稀釋(範圍為約100個拷貝數/反應 - 10 ⁵個拷貝數/反應)。這些系列稀釋液用作液體反應的樣版，為潛在的引子組候選物建立基線LoD。在白色qPCR盤(如，Thermo Scientific® AB-0800W)上對各病毒濃度一式三份進行反應，並在標準75L生物培養箱(如，Fisherbrand® Isotemp Microbiological Indicator, 15-103- 0513)中加熱至65℃，歷時60分鐘。通過在桌面掃描儀(Epson® Perfection V800 Photo Color)上掃描該盤記錄該反應混合物在不同時間點的顏色。引子組的LoD由在所有三個重複中導致強烈顏色變化的最低病毒濃度確定。將任何能夠以10 ³個拷貝數/反應或更低提供擴增的候選物，之後以相同的病毒稀釋程序(如，2倍稀釋)處理，並摻入混合的健康唾液中以檢查基質干擾。然後在紙質裝置上進行唾液LoD研究，以檢查引子在紙質基板上的相容性。

如圖11所示，右側的反應是在液體中進行的，使用摻入水中的熱去活性SARS-CoV-2，及比色混合物與螢光染料的組合，反應體積為25μL。黑線表示以吸光度比(OD ₄₃₀/OD ₅₆₀)測量的顏色變化，淺藍色線表示以10 ³為單位的螢光強度測量的螢光變化。與內建顏色/螢光讀取器一起使用時，檢測時間可能會更快。

對於約1000個拷貝數/反應的病毒濃度，吸光度比及螢光活性在約17分鐘後達到峰值。對於約500個拷貝數/反應的病毒濃度，吸光度比及螢光活性在約18分鐘後達到峰值。對於約250個拷貝數/反應的病毒濃度，吸光度比及螢光活性在約19分鐘後達到峰值。對於約125個拷貝數/反應的病毒濃度，吸光度比及螢光活性在約18分鐘後達到峰值。對於約62.5個拷貝數/反應的病毒濃度，吸光度比及螢光活性在約17分鐘後達到峰值。對於約31.25個拷貝數/反應的病毒濃度，吸光度比及螢光活性在約22分鐘後達到峰值。對於無樣版對照組，吸光度比及螢光活性如預期的未出現峰值。

使用30個不同LoD倍數(1x、2x、4x、40x及400x，分別重複10、10、4、3及3次)之人為陽性樣品及30個無樣版對照組(NTC)陰性唾液樣品，測定靈敏度及特異性。使用ImageJ擷取每個反應區的平均綠色通道強度，確定比色應答強度。通過改變陽性反應及陰性反應之間的閾值截止值並計算每個閾值的靈敏度及特異性來生成接受者操作特徵(ROC)曲線。靈敏度計算為真陽性與總陽性數(包括偽陽性)的比率。特異性計算為真陰性與總陰性(包括偽陰性)的比率。 使用紙 LAMP多重選定目標以測試病毒病原 範例9 – 紙條格式

圖12示出紙條格式。黑線表示SAATICARE Hyphyl®聚酯PES 105/52，厚度為0.063mm，長度為50mm。紅線表示Tekra Clear MELINEX® 454聚酯PET，厚度為0.0762，長度為50 mm。綠線表示Adhesives Research ARclean® 90178 (AS-144)，厚度為0.038 mm，長度為50 mm。橘色塊表示Tekra Double White Opaque High Impact Polystyrene Litho Grade，厚度為0.508 mm、長度為2.5 mm。藍色塊表示Ahistrom-Munksjö Cellulose Grade 222，厚度為0.83 mm，長度為 5 mm。在此範例中，紙條具有5個隔件(橘色)及4個反應層區段(藍色)，以及展開層(黑色)、黏合層(綠色)及基板(紅色)。 範例10 – RT-LAMP過程

如圖13所示，固相LAMP反應介質可包括：6mm x 50mm透明的3mm Melinex® 454及Arclean® 90178；包含5mm Ahlstrom 222試劑材料的反應層(包括4個粉紅色的不連續反應層區段)；包含2.5 mm 20密耳聚苯乙烯的隔件(包括5個不連續隔件)、包含Saaticare® PES 105/52 hyphyl的展開層及包含由14 mm Melinex、Arclean® 90178及3M 9962製成的毛細管的基板。

如圖14所示，藉由在每個反應區段或測試區域之間具有足夠的空間，可以避免反應區之間的交叉污染。在此範例中，橘色的四個反應區段沒有交叉污染，因為5個隔件沒有顏色變化。 範例11-A – 紙的對比度

在另一個例子中，如圖15所示，222級層析紙可提供比1級層析紙大的對比度。222紙的陽性結果(左側)顯示，與右上的陽性結果(橘色)及右下的陰性結果(深橘色)相比，左上的陽性結果(黃橘色)與左下的陰性結果(深橘色)之間的對比更大。每個紙條都用約500μM的緩衝液進行測試，pH範圍從陰性測試的8.0到陽性測試的7.5。 範例11-B – 酚紅濃度對紙的影響

為了在不抑制反應本身的情況下區分陰性結果與陽性結果之間的差異，在1級及222級層析紙上測試酚紅濃度。對於這二種層析紙，每次反應250μM的酚紅顯示出一致的結果。較低的染料濃度在培育60分鐘後顯示出相對較淡且蒼白的顏色，而對於較高濃度的酚紅紙墊，使用較長的培育時間以區分陽性及陰性。 範例 11-C – 初始pH及乾燥對使用酚紅的紙上比色RT-LAMP應答的影響

圖15B示出在RT-LAMP反應混合物的不同起始pH下結合乾燥時的RT-LAMP。在本範例中，pH7.6是RT-LAMP反應混合物之未經調節的pH。濕配置表示在添加20μL的LAMP反應主混合液後立即添加5μL之合成RNA (N基因，0.2 ng/μL，“+”)或水(“-”)。乾燥配置表示在施加20μL LAMP主混合液後，將紙條置於室溫下乾燥30分鐘，然後用25μL合成RNA ('+')或水('-')再水化。LAMP反應包含12.5μL NEB 2x比色主混合液、2.5μL引子混合物及5μL酚紅，配製在無核酸酶水中(1 mM)。用KOH調節所產生的混合物之pH。使用1級層析紙。在設定為65℃的培養箱中加熱120鐘，並在反應過程中的45、60、90 及120分鐘的時間點用平板掃描儀掃描。 範例12 – 測試條格式

如圖16所示，測試條格式具有樣品施加側及讀取側(圖的右上方)。當存在展開層時，樣品可加至樣品施加側的一個位置上。在其他例子中，在沒有展開層的情況下，樣品可加至反應層的各區段(橘色)上方的樣品施加層。可在不需專用儀器，或可使用比色檢測器或螢光檢測器之情況下讀取讀取側。

如圖16進一步所示，測試條格式還具有4個測試反應區域、一個吸收/展開層及透明的單面黏合劑，其將符合形狀並接觸吸收層。 範例13 – 測試條組裝過程

圖17示出測試條組裝過程，包括切割，其中以較寬的寬度塗佈反應層並且切割至5mm，然後放置在捲軸上進行層壓。該過程還包括將反應層層壓至透明單面黏合劑上之第一層壓製程。該過程還包括在第一層壓製程之後直接在線執行的第二層壓製程，其中將展開層層壓到反應層及黏合層上。該測試條組裝過程可包含包括下列之材料：塗有pH試劑的聚碸材料、單面黏合劑及1級層析紙。 範例14 – RT-LAMP過程

在65℃下加熱唾液及試劑混合物，在一鍋混合物中提取、反轉錄及擴增唾液中SARS-CoV-2病毒的RNA。用於LAMP的四個引子組包括：一組靶向SARS-CoV-2 RdRp基因，一組靶向SARS-CoV-2包膜基因(E)，一組靶向SARS-CoV-2 ORF1ab區域及最後一組靶向人RNaseP (RP)基因，其等作為機上對照組。每個引子組由6個單獨的引子組成，靶向病毒或人類RNA的特定區域，這些區域在使用反轉錄酶及鏈置換聚合酶恆溫培育期間會被反轉錄及擴增。 範例15 – 陽性對照組

陽性對照組反應包括在測試裝置機上，作為與病毒RNA的三個測試條一起運行的測試區域之一。陽性對照組同時用作陽性樣版對照組及提取對照組。如果測試條的對照區域出現紅到黃的顏色變化，這表明病毒RNA，如果它存在於檢體中，已經成功地從病毒中提取出來，並且測試中的試劑都按預期進行產生放大信號。如果沒有發生顏色變化，則該測試應視為無效並重複進行。

陽性對照組檢測人類RNase P，一種人類臨床檢體中普遍存在的標記且為許多RT-PCR套組中的標準對照物。此標記的擴增表明在此測試條件下已經成功地發生了人體細胞的溶解，並且還可以推斷出病毒裂解。

對照組的科學依據如下。與基於RT-PCR的分析法不同，我們的分析法不使用化學方式提取病毒RNA；而是熱處理就足夠了。RT-PCR中的聚合酶對生物樣品基質中的反應抑制物敏感。因此，這些測試通常具有RNA提取及純化操作。相反地，LAMP分析法中使用的Bst 2.0聚合酶酵素在生物基質中非常穩定，因此不使用提取及純化。儀器達到65℃之溫度即足以裂解病毒顆粒、暴露病毒RNA並支持穩健的擴增。 範例16 – 陰性對照組

使用帶有空白測試溶液代替唾液檢體的測試裝置進行陰性、無樣版對照測試。空白測試溶液是不含任何RNA或DNA樣版之無菌pH緩衝溶液。如果在此測試中觀察到顏色變化，則表明可能存在偽陽性，因此自上次對照組運行以來獲得的任何陽性結果均無效。因此，給使用者的說明，會要使用者端在收到使用此類代表性測試套組的測試套組後，進行此陰性對照組。此確認也可在定義的時間間隔內重複。

在陰性對照組中出現偽陽性的最可能原因是來自連續測試之擴增 DNA產物的留存效應。陰性對照組測試是包括對具有嚴格密封公差的測試盒的製造控制以及操作員對加熱器裝置進行常規消毒擦拭清潔之一系列控制措施中的最後一項，用以防止因留存污染而出現偽陽性。 範例17 – 內部對照組

該測試總成採用了一種為使用唾液作為測試基質設計的獨特對照。每個測試條都包括pH指示染料作為內部對照，可驗證唾液檢體的初始pH是否在預期範圍內。如果施加樣品時(加熱之前)在全部四個測試條上均觀察到顏色從紅色變為黃色，則使用者應斷定檢體無效並且不繼續測試。取樣前吃、喝或使用口腔衛生產品等外部因素均會影響檢體的初始pH。在pH指示劑失效的情況下，如果操作者確定此等中之一個因素影響了檢體，則可以在5分鐘後重新測試，讓患者的唾液pH值恢復到正常狀態。其他外部因素(如，某些疾病)也會系統地影響唾液pH，在這種情況下，需要使用替代測試方法。 範例18 – 結果確認

紙LAMP測試是一種定性測試。該測試是基於顏色的目測結果，其可由操作者藉助顏色判讀表來讀取。陽性反應結果產生黃色。在解讀患者的結果之前，應檢查所有測試對照組。如果對照組無效，則該測試無效且不能解讀患者的結果。

由於這是一種恆溫RNA擴增，所以在有LoD實驗所定義的位準之目標SARS CoV-2 RNA存在的情況下，將產生表明檢測呈陽性的結果。在某些情況下，Orf1ab、E基因或RdRp基因之3個目標基因引子區域中的2個陽性結果，可確認陽性測試的判讀。可將測試條的顏色與提供的顏色判讀表進行比較，以確定陽性結果。測試條的RNaseP區域應變為黃色表示有效測試。如果該區域沒有變成黃色，則該測試無效，應重新進行。

可靠且合法的測試條的第一個指標是確認4個測試條區域在施加唾液後，加熱該測試條之前不會變黃。如果發生這種情況，則可能是由於最近的食物或液體攝入而使得唾液的pH超出可接受的範圍。患者應用水漱口，等待至少5分鐘，然後重新採取唾液樣品。

一旦在加熱器裝置中完成測試反應，機上對照組在RNaseP區域應顯示出陽性黃色變化。一旦確認這一點，則應根據提供的顏色判讀表檢查每個條區域的顏色變化。每個條區域分成陽性(如，黃色變化)或陰性(如，粉紅色)。在一個例子中，當2個測試區域為陽性時，表明SARS CoV-2確診。 範例 19 –  偽陽性的來源

如果在檢測過程中未採取適當措施解決偽陽性，則RT-LAMP分析中經常會出現偽陽性。這些偽陽性的來源可能源於先前的RT-LAMP反應形成的DNA氣溶膠，其會在環境中長時間停留並污染未來的實驗。這些氣溶膠可能會在反應製備過程中污染個別的試劑，或者在反應混合物的運送、處理、加載樣品或培育時污染該反應混合物。除了會降低RT-LAMP相關測試的準確度外，氣溶膠還會給使用特定濃度樣版的實驗(如，LoD研究)增加雜訊。為了解決這些各種的污染點，所有與RT-LAMP相關的程序都可分為幾個待於不同位置進行的階段(即，反應準備、運送、加載/密封、擴增培育及凝膠電泳)。藉由在操作程序中空間上分離操作，可最大限度地減少在反應密封之前引入氣溶膠的可能性或若發生偽陽性，排除錯誤。 範例20 – 盤、蓋、密封劑及管的篩選

鑑於RT-LAMP容易受到污染而產生偽陽性，因此對qPCR 96孔盤、密封方法及PCR管進行了廣泛的篩選。首先我們篩選Thermo Scientific® 96 孔全側緣PCR盤，透明(ThermoScientific® AB-0800)及白色(AB-0800W)二種，及FrameStar ® 96孔全側緣光學底盤(Brooks Life Sciences® 4TI-0970)。透明盤主要用於幫助比色分析的掃描。在這些透明盤中，根據平均偽陽性數，白底Thermo Scientific® 96孔全側緣PCR盤具有最佳的性能。

圖22A顯示針對orf1ab.II的檢測極限(LoD)之比色RT-LAMP掃描影像。掃描標題是對應於用於運行比色LoD之不同盤類型的目錄號。黃色孔表示發生成功的LAMP反應，而紅色/橘色孔分別表示無或低位準擴增。在20μL反應混合物中摻入5μL於水中在標記濃度下的熱去活性病毒稀釋液。反應主混合液由12.5μL的NEB比色2x主混合液、2.5μL的引子混合物及5μL的水組成。在設定為65℃的培養箱中加熱60分鐘後拍攝終點影像。每個引子組對每個病毒濃度進行三次重複。

對於密封方法，我們研究了以下產品：MicroAmp® Optical 8連管蓋條(Thermo Fisher® 43-230-32)、Thermo Scientific VersiCap Mat Cap Strip (Thermo Fisher® AB1820)、Thermo Scientific Adhesive Plate Seals (Thermo Fisher® AB-0558)及MicroAmp Optical Adhesive Seal (Thermo Fisher ® 43-119-71)。在該等蓋子中，於觀察偽陽性率時，VersiCap Mat Cap Strip密封效果最好；然而，在比色掃描方面，由於蓋子不是完全透明的，因此很難獲得反應過程的準確影像。因此，測試了黏合劑密封，其等彼此比較之後性能相當。此外，當在盤上同時均勻地施加壓力時，基於偽陽性率，黏合劑密封的性能優於VersiCaps。

圖22B顯示針對orf1ab.II之檢測極限(LoD)的比色RT-LAMP掃描影像。掃描標題是對應於用於運行比色LoD之不同蓋子類型的目錄號。黃色孔表示發生成功的LAMP反應，而紅色/橘色孔分別表示無或低位準擴增。在20μL反應混合物中摻入5μL在水中的熱去活性病毒稀釋液，以產生最終標記濃度(陽性反應)或無核酸酶水(陰性)。反應主混合液包括12.5μL的NEB比色2x主混合液、2.5μL引子混合物及5μL的水。在65℃下培育該盤60分鐘後拍攝終點影像。每個引子組對每個病毒濃度進行三次重複。

在成像期間作為盤的替代品，我們研究了以下PCR管產品：MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip帶有光學蓋(Thermo Fisher ® A30588)及MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip  (Thermo Fisher® 4316567)，使用與那些用於密封盤相同的蓋子。在偽陽性率方面，帶有光學蓋的管表現最好。

完全組裝的4重測試條可包括展開網、黏合劑及透明 Melinexbacker。測試條還可包括在水中濃度為0.2ng/μL的DNA樣版，其對應於約10 ⁸個拷貝數/μL。樣品體積可為100μL。N基因引子可以在引子及無引子的交替條件下使用。黏合劑可能具有抑制顏色應答的緩衝作用，因此配方應進行補償。 紙LAMP 測試過程及方法範例 21-A – 紙LAMP測試過程

紙LAMP測試是為訓練有素的健康照護專業人員的簡單定點照護使用而設計。整個測試過程在圖18中描述。患者在健康照護專業人員的指導下收集唾液樣品。將唾液樣品收集到一個專門的收集容器中，該容器不含任何添加劑，因此患者在收集過程中使用是安全的。唾液體積大約100μL，患者很容易收集到。包含上述特定RNA檢測區域的測試條完全包含在塑料條盒中。收集唾液樣品後，患者將收集容器交給操作員。然後操作員將唾液樣品施加到測試條上的指示位置處，並關閉測試盒外殼。然後將帶有含樣品的條帶的測試盒放置在加熱器裝置中，該裝置是設定用於將測試盒牢固地固定在適當的位置，以實現所需的加熱到65℃。紙LAMP分析在恆溫溫度下於測試條上進行。在LAMP反應期間，唾液樣品中的核酸被識別出來，在65℃溫度下，核酸擴增導致的pH變化會導致條上的顏色變化。

加熱器裝置是設計用於在測試條上提供均勻加熱。加熱裝置可具有(紅-黃-綠)有色LED燈，以根據培育時間向使用者顯示加熱進度，並在測試結束時提醒操作員。當測試進行時，加熱器裝置可包含一個特徵件，如，磁性或機械鎖以確保測試不被中斷。測試反應可在65℃恆溫溫度下進行約15至30分鐘。在分析結束時，可從加熱器中取出其中包含測試條的測試載體並目測讀取。 範例21-B – 紙LAMP測試過程

圖18B示出用於SARS-CoV-2的紙質比色分子測試的製造及使用。 SARS-CoV-2紙質比色分子測試的製作包括：(1a)創建一主混合液，(1b)將該混合物轉移到墊上，(1c)進行品質檢查，及(1d)空氣乾燥測試裝置。SARS-CoV-2紙質比色分子測試的使用包括：(2a)樣品收集，(2b)重新懸浮在水中，(2c)將樣品添加到墊上，(2d)在65℃下培育約60分鐘，及(2e)解讀結果。 範例21-C – 紙LAMP測試過程

分析的工作流程示於圖19A中：收集唾液，將樣品轉移到紙質裝置，在65℃下培育及讀取結果；一個典型的結果示於圖19D中。圖19C提供我們的紙裝置結構的示意圖。該紙裝置包括幾個222級纖維素反應墊，由20密耳的聚苯乙烯隔件隔開，以防止反應區之間的交叉污染。這些組件透過雙面黏合劑連接到用於結構支撐的透明背襯上。在製造過程中，將進行RT-LAMP的試劑乾燥到反應墊上。當使用者將樣品添加到反應區時，這些試劑會再水化。

圖19示出紙質裝置的示意圖及比色表徵分析。圖19A提供裝置使用的工作流程的示意圖。對照區表示無引子對照組。圖19B提供使用在5%唾液中指定濃度下的熱去活性嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)之紙上比色LoD。陰性重複是使用無核酸酶水代替熱去活性SARS-CoV-2的RT-LAMP反應。數據取自圖21A。

圖19C提供紙裝置的示意性佈局。圖19D提供陰性及陽性運行的典型比色結果。對照組是不包括LAMP引子的RT-LAMP反應。陽性反應具有800個拷貝數/μL摻入5%唾液中。圖19E提供從B格的比色結果得出的可能結果的顏色梯度。圖19F提供用於根據調查應答計算紙裝置的分析靈敏度及特異性的觀察匯總表。

該分析的每個操作(圖19A)是設計用於降低複雜性並減輕定點照護環境中的使用者錯誤。樣品收集操作使用海綿基收集裝置，該裝置容許患者自行收集，從收集的唾液中去除微粒，及最大限度地減少患者與患者之間的結果差異。轉移操作包括將25μL稀釋的唾液放置在該裝置上的兩個反應區中的每一個上。對於培育操作，將裝有樣品的紙裝置密封在可重新密封的塑料袋中，然後置於設定在65℃的培養器中60分鐘。最後，在讀取操作方面，使用者將對照及反應區的顏色與圖19C中的顏色帶進行比較，以判定結果是否有效及是否存在感興趣的病原。

該平台包括三個主要組件：對該分析加諸特異性的引子組、包含二個反應區(一個對照區及一個反應區)的紙裝置，及用於將紙裝置加熱到反應溫度的加熱源。引子組決定該分析目標的病原是什麼。因此，可以通過重新設計引子組來重新配置平台以靶向不同的病原，同時保持裝置及配方的所有其他方面相同。此外，該紙質裝置可配置為容納多個反應區，從而容許同時檢測多個目標。

唾液中SARS-CoV-2的直接檢測之顯示，係通過可以使用肉眼讀取的不同比色應答(圖19)。這種格式適用於捲對捲製造，預計成本約為$10/測試。該測試的檢測極限(LoD)為200個拷貝數/μL唾液。當使用人為樣品(新鮮收集的唾液中摻入熱去活性SARS-CoV-2)測定，以目測評估時，分析靈敏度(陽性預測值)為76%，特異性(陰性預測值)為100%及準確度約為91% (圖19F)。由於對於對照墊顏色感知的主觀性，在80個呈現無效的裝置中，受測者錯誤地辨識了20個，導致錯誤無效率為25%。當使用影像處理對顏色變化進行量化時，靈敏度增加至97%，準確度為98% (圖19C)。

該裝置(圖19C)具有6 mm x 20 mm的尺寸並且包括：讀取層、二個反應條及用於防止交叉污染的隔件。讀取區包括用於支持的光學透明3密耳MELINEX (Tekra MELINEX® 454聚酯(PET))背襯。使用雙面黏合劑(Adhesives Research無酸ARclean® 90178)將其連接到二個5mm x 6mm層析紙(Ahlstrom-Munksjö Grade 222)的反應條上。此等條由2.5 x 6 mm 20密耳聚苯乙烯隔件(Tekra Double White Opaque High Impact Polystyrene (HIPS) Litho Grade)隔開。再水化時加入25μL樣品以使該等條飽和。

通過在一系列pH範圍內對222級層析紙上酚紅的RGB值進行平均來創建一個顏色帶。使用這些平均RGB值創建一線性梯度，並在該顏色帶上註釋從ROC曲線確定的最佳閾值(圖19C)。

將樣品加載到紙質裝置上後，將該裝置放入1" x 1"可重新密封的塑料袋中，以防止RT-LAMP反應過程中的污染。然後將裝有該紙裝置的塑料袋放入65℃培養箱中60分鐘。將袋子取出，用平板掃描儀掃描(圖19D)，並與通過在已知pH從6-9的緩衝液中對222級墊上酚紅應答的RGB值(圖21B)進行平均而創建的色表(圖19E)進行比較。色表中的閾值對應於從ROC分析中確定的閾值(圖19B)。

在確定唾液中LoD為200個拷貝數/μL後(圖19B)，創建1x、2x、4x、40x及400x LoD的人為樣品。30份新鮮收集的唾液用作陰性樣品(圖21A)。使用影像處理對結果進行量化(圖19A及圖21C)。使用雙尾t檢定發現陰性與陽性比色反應墊的綠色通道強度之間的差異是顯著的(p ＜ 0.001)。

使用影像分析的特異性是100%，靈敏度是97%，準確度是98% (圖20C)。圖20示出紙上比色應答的數位分析。圖20A顯示紙上RT-LAMP的30個陽性及30個陰性結果的綠色通道強度的盒形圖。圖20B顯示紙上RT-LAMP的30個陽性及30個陰性結果的接受者操作(ROC)曲線。圖20C顯示基於影像分析之觀察的匯總表。

根據Purdue University IRB協議#IRB-2021-375，從參與研究的參與者收集比色感知調查(圖23A及23B)。給參與者帶有閾值註釋的色帶(圖19E)。給參與者多個紙裝置掃描，並要求將對照組(左側反應區)分類為有效或無效，及將SARS-CoV-2反應(右側反應區)分類為陽性或陰性。將歸類為無效的觀察結果從分析法性能分析中捨棄，錯誤識別的無效分析的比例報告為錯誤無效率。

四名參與者被要求使用色帶(圖19)，對圖21A所示的10個陽性及10個陰性反應進行分類為有效或無效(根據左側對照區)，及SARS-CoV-2陽性或陰性(根據右側反應區)。參與者認為無效的觀察結果捨棄。在40個真陽性觀察結果(使用影像分析全部為有效)中，參與者錯誤地將19個分類為無效。這與40個真陰性觀察結果(使用影像分析其中36個為有效)其中1觀察被錯誤地歸類為無效，形成對比。因此，我們的裝置計算出的特異性及靈敏度在考慮比色解讀時分別為100%及76%，準確度為91% (圖19F)及錯誤無效率為25%。 範例22 –  樣品穩定性

從唾液收集到測試條施用的標準時間係2小時內。容許從樣品收集到進行測試至多24小時的樣品穩定性，可基於在0-2小時、8-12小時及20-24小時的重複測試樣品(如，15個陽性及15個陰性)。那麼在收集中心或診所環境中以快速方式從患者身上收集的樣品，可以在數小時後進行測試。也可評估在一個站點收集(如，在門診或在得來速收集區域，隨後將唾液樣品運送到第二位置)。 範例23 – 製造

浸塗及在高溫下乾燥似乎不會對LAMP反應產生負面影響。這對製造通量及可擴展性具有正向意義。該測試條的設計使其可以在現有的紙張加工設備上大規模製造，無需大量的工具成本。該設計足夠簡單，可以滿足從原型製作到全面生產的快速簡單路徑的目標，從而滿足新興市場的需求。 範例 24 – 紙質裝置的設計

紙被廣泛用於pH指示劑及尿液試紙，主要是由於成本低廉、技術複雜性低以及使用捲對捲製造易於生產。在本文所揭示的裝置方面，評估了幾種類型的紙及選擇的層析紙的使用(圖21D-21F)。層析紙可用於紙質生物感測器，因為與其他紙相比，它具有更高的芯吸能力。許多紙質裝置使用1級層析紙；但是，由於1級層析紙的面積很大(5 mm x 20 mm)，因此溶液在紙上的分佈不均勻。因此，選擇不同類型的層析紙，222級(0.83毫米)，其比1級(0.18mm)厚約4.6倍。由於其厚度增加，相同體積的液體可以加載到因裝置尺寸減少(5 mm x 6 mm)而小70%的反應區域，從而實現均勻分佈。

為了降低裝置的複雜性，RT-LAMP反應的組分(沒有樣版)在紙上乾燥。乾燥可在不會影響診斷性能之情況下實現裝置的穩定分佈及易於操作；使用者只需添加樣品即可再水化試劑。試劑在紙上乾燥後，隨著時間的推移，在沒有任何樣版存在之情況下，紙的顏色會從紅色變為黃色，顯示紙的pH降低。通過一系列捨一實驗，確定硫酸銨是造成此變化的原因(圖21G)。這種顏色變化可能是由於加熱引起的纖維素氧化及硫酸銨的氧化本質或因從RT-LAMP混合物中脫出的氨氣而導致試劑酸化。為了防止在沒有擴增的情況下發生顏色變化，用甜菜鹼取代硫酸銨及增加酚紅的濃度(其作為抗氧化劑) (圖21H)。

甜菜鹼在LAMP反應中的有效性各不相同；然而，甜菜鹼可減少氧化損害，因此被包括在內。海藻糖及BSA都被添加到紙上配方中(圖21H)。

在該裝置方面，使用了二個反應區；一個靶向SARS-CoV-2及一個提供無引子對照組以確定我們的試劑在紙上的穩定性(不應與任何樣品反應)。最終裝置的示意圖示於圖19C中，從有及無熱去活性SARS-CoV-2摻入5%反應濃度之唾液中的裝置而來的結果，顯示在圖19D中。如圖19B所示，紙上分析的LoD (250個拷貝數/反應)與比色RT-LAMP配方在溶液中觀察到的LoD相當(圖21I)。

在該裝置的構造方面，Melinex®背襯用於提供結構支撐。使用雙面黏合劑，在不改變pH之情況下將兩個反應墊連接到背襯上。可以任意增加反應區的數量，以便在不改變裝置設計的情況下進行多重檢測。在反應墊之間加上20密耳的聚苯乙烯隔件，以提供物理屏障，防止從一個反應區漏到相鄰反應區，因此排除試劑及樣品添加過程的交叉污染。在某些情況下，可利蠟印產生的疏水屏障將反應區隔開，防止樣品橫過；然而，為了實現捲對捲製造，排除蠟的使用，並使用隔件。 範例25 – 人為樣品的確效

為了評估我們的紙上分析法之分析靈敏度及特異性，使用熱去活性SARS-CoV-2以orf7ab.I之LoD的倍數產生人為樣品，在紙上運行RT-LAMP分析。總共使用30個陽性樣品及30個相應的陰性樣品，這是美國緊急使用授權(EUA)的最低數量。為了確定區分陽性反應及陰性反應的比色閾值，通過計算在不同綠色通道強度閾值下的靈敏度及特異性來構建ROC曲線(圖20)。在該閾值處，該分析法具有以下分析指標：97%的靈敏度、100%的特異性及98%的準確度(圖20A及圖20B)。發現陽性組及陰性組之間的差異具顯著差異(p＜ 0.001)。紙條是手工切割的，紙張尺寸的微小差異會導致比色應答的差異。因此，大規模製造及質量控制可進一步增强二組(陽性與陰性)之間的一致性。此靈敏度與使用RNA提取物的分析法相當(靈敏度~95%)，且比其針對粗樣品常見的靈敏度顯著下降(約80%)的報告好。 範例26 – 紙質裝置的比色判讀

為了觀察顏色感知對我們裝置性能的影響，對四名參與者進行調查，並要求他們判讀裝置的結果。提供每位參與者一個色帶，於60分鐘後掃描該裝置(圖23A及23B)，並要求根據該色帶上標記的閾值，將結果分類為有效或無效(使用對照墊)及陽性或陰性。當於分析中引入使用者的判讀時，裝置的靈敏度及準確度分別下降到76%及91% (圖19F)。此低靈敏度源於受測者根據對照墊將許多陽性反應識別為無效，導致25%的錯誤無效率，這可能歸因於反應過程中對照墊被擴增子污染。此外，使用者對同時存在黃色及紅色區域之墊的判讀可能會引入不明確，從而導致偽陽性率或錯誤無效率增加。最近的研究結果表明，此不明確是由於第三個中間顏色簇(及陽性/陰性簇)，此在比色分析法中沒有得到充分解決。由於無效結果從進一步分析中被捨棄，所以此提高的錯誤無效率可能會人為地影響該裝置的特異性及準確度指標。 範例27 – 單一反應物的排除對乾燥後紙的初始顏色的影響

圖21G顯示將20μL RT-LAMP主混合液，其含有KCl (50 mM)、MgSO ₄(8 mM)、等莫耳dNTP混合物(每種dNTP 1.4 mM)、WarmStart BST 2.0 (0.32 U/μL)、WarmStart RTx (0.3 U/μL)、酚紅(0.25 mM)、dUTP (0.14 mM)、Antarctic UDG (0.0004 U/μL)、Tween 20 (1% v/v)、(NH ₄) ₂SO ₄(10 mM)及海藻糖(10% w/v)的基礎配方，以及5μL無核酸酶水加入1級層析紙上，並在PCR製備通風櫥內乾燥10分鐘。如所示，將反應物排除在基礎配方之外，以確定乾燥後觀察到的顏色變化的原因。本研究不包括RT-LAMP引子及樣版。 範例28 – 不同pH值下的酚紅顏色校正

圖21B顯示在經過20mM Tris緩衝的紙上，250μM酚紅於不同pH值下的校正。使用HCl或KOH調節pH值。將222級層析紙(5 mm x 6 mm)的影像裁剪成矩形，以便在多個測試條之間輕鬆比較顏色。 範例29 – 最終裝置在不同濃度的熱去活性SARS-Cov-2下的確效

圖21A顯示使用orf7ab.I引子組及比色RT-LAMP主混合液的最終配方之RT-LAMP。每個裝置上的左側反應區是無引子對照組，其中所有的orf7ab.I引子均用水代替並且不包括在主混合液中。右側反應區在陽性反應的情況下包含以指定濃度摻入處理過的唾液中之熱去活性病毒，或在陰性反應的情況下含有處理過的唾液。所有處理過的唾液的最終反應濃度為5%。主混合液由KCl (50 mM)、MgSO ₄(8 mM)、等莫耳dNTP混合物(每種dNTP 1.4 mM)、WarmStart BST 2.0 (0.32 U/μL)、WarmStart RTx (0.3 U/μL)、酚紅(0.25 mM)、dUTP (0.14 mM)、Antarctic UDG (0.0004 U/μL)、Tween 20 (1% v/v)、甜菜鹼(20 mM)、BSA (40 mg/mL)及海藻糖(10% w/v)組成。使用222級層析紙。 範例30 – 不同樣版濃度下RT-LAMP比色應答的綠色通道顏色強度

圖21C顯示不同濃度的紙墊之比色應答的散點圖。綠色強度閾值用參考線121顯示。 範例31 – 加熱方法對RT-LAMP比色應答的影響

圖22C顯示在不同的加熱設備中以65℃培育60分鐘後，對25μL反應之LAMP檢測極限(LoD)的比色掃描。用於這些反應的引子組是orf1ab.II。在20μL反應混合物中摻入5μL在水中的熱去活性病毒稀釋液，產生最終標示濃度(陽性反應)或無核酸酶水(陰性)。反應主混合液包括12.5μL的NEB Colorimetric 2x 主混合液、2.5μL引子混合物及5μL的水。 範例32 – 升溫速率對RT-LAMP比色應答的影響

圖22D顯示25μL反應在qTower (96孔盤)及熱循環儀(PCR管)上以不同的升溫速率在65℃下培育60分鐘後的比色掃描。使用的引子組是orf1ab.II。20μL反應混合物中摻入5μL熱去活性病毒稀釋液，產生最終標示濃度(陽性反應)或無核酸酶水(陰性)。反應主混合液包括12.5μL的NEB Colorimetric 2x主混合液、2.5μL的引子混合物及5μL的水。 範例33 – 海藻糖及Tween 20對RT-LAMP比色應答的影響

圖21H顯示包含給定濃度的海藻糖或Tween 20的比色RT-LAMP結果。使用orf1ab.II引子組。將20μL含有KCl (50 mM)、MgSO ₄(8 mM)、等莫耳dNTP混合物(每種dNTP 1.4 mM)、WarmStart BST 2.0 (0.32 U/μL)、WarmStart RTx (0.3 U/μL)、酚紅(0.25 mM)、dUTP (0.14 mM)、Antarctic UDG (0.0004 U/μL)、Tween 20 (1% v/v，若有指示的話)、甜菜鹼(20 mM)、BSA (40 mg /mL)及海藻糖(10% w/v，若有指示的話)之基礎配方之RT-LAMP主混合液，添加到1級層析紙(5 mm x 20 mm)上，並容許在PCR製備通風櫥內乾燥60分鐘。將25μL在25%處理過的唾液(陽性反應)或無核酸酶水(陰性反應)中最終濃度為每反應1x10 ⁵個拷貝數之熱去活性SARS-CoV-2，添加到乾燥的反應墊上。將該墊在設定為65℃的培養箱中加熱60分鐘，然後使用平板掃描儀進行掃描。

包含硫酸銨會導致RT-LAMP試劑乾燥後，不存在樣版時，顏色從紅色變為黃色。增加酚紅濃度及用甜菜鹼取代硫酸銨可防止此顏色變化(圖21G)。此外，海藻糖及牛血清白蛋白(BSA)的添加增加了反應速率並改善了LoD (圖21H )。 範例34 – 總結

一種可使用環介導恆溫擴增(LAMP)，通過產生人眼可見的比色應答來檢測複雜樣品中感興趣的病原核酸的紙質裝置。該裝置無需預處理即可檢測到人類唾液中的SARS-CoV-2，證明該裝置在新興突發公共衛生事件中的實用性。由此產生的裝置能夠在60分鐘內檢測到病毒，且使用影像分析具有97%的分析靈敏度及100%的特異性，檢測極限為200個基因組拷貝數/μL患者唾液。該裝置包括可配置數量的反應區，該反應區由222級層析紙構成，以20密耳聚苯乙烯隔件隔開，通過ARclean®雙面黏合劑連接到Melinex®背襯上。由此產生的裝置可通過改變LAMP引子組來檢測多個目標及各種病原。

該平台具有以下特性：i)其使用唾液，ii)其具有最少的操作員培訓，iii)其可以使用捲對捲方法製造以實現數百萬次測試，iv)在分析靈敏度及特異性方面，其表現與RT-qPCR分析法相似，v)其提供肉眼可見的比色應答，vi)其適合定點照護使用，vii)其在不到60分鐘內提供結果，以及viii)其估計成本~ $10/測試。

由於該測試的簡單性及可擴展性，其可用於各種環境，可能包括家庭診斷。通過在溶液中篩選引子組，該平台可以很容易地重新配置以針對不同的病原。通過在裝置中添加額外的反應位置可實現多重檢測。該平台的可重構性本質，使其可用於在未來的突發公共衛生事件中檢測新興的病原。 示例性實施例

在一個實施例中，提供一種環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成，其可包含一實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與一固相反應介質的組合。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的一個例子中，該固相介質可實質上不含鎂干擾劑。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該鎂干擾劑可包括含鎂化合物及會干擾鎂的螯合劑。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該固相介質可為親水性、吸收性及多孔性的。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該固相介質可為纖維素基介質。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該纖維素基介質可具有約30與約600之間的表面積對厚度比。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該纖維素基介質可具有小於約100微米的孔徑。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該固相介質可包含紙。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該固相介質可包含玻璃纖維。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該固相介質可包含尼龍、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素或親水性聚四氟乙烯(PTFE)，或其等之組合。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該LAMP反應介質可進一步包含實質上不含鎂干擾劑及吸濕劑之一黏合劑。

在環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成的另一個例子中，該LAMP反應介質可進一步包括一展開層，其具有比該固相反應介質低的親水性。

在一個例子中，提供一種製造如本文所述的LAMP反應總成的方法，該方法包括結合該實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與該固相反應介質，使得該試劑混合物與該固相反應介質保持接觸。

在一個例子中，製造如本文所述的LAMP反應總成的方法可進一步包括使用一不變色添加劑來控制變色。

在製造如本文所述的LAMP反應總成的方法之另一個例子中，該不變色添加劑可包含糖、緩衝劑、阻斷劑或其等之組合。

在製造如本文所述的LAMP反應總成的方法之另一個例子中，該不變色添加劑可包含糖，該糖包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣或其等之組合。

在製造如本文所述的LAMP反應總成的方法之另一個例子中，該不變色添加劑可包含一阻斷劑，其包含牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合。

在另一個例子中，提供一種進行LAMP分析的方法，其包括或包括提供如本文所述的LAMP反應總成；將一生物樣品施加於該反應總成；將該總成加熱到足以引發LAMP反應的溫度；及維持該溫度歷時一段足以完成該LAMP反應的時間。

在進行LAMP分析的方法之一個例子中，該生物樣品可為唾液、黏液、血液、尿液、糞便、汗液、呼出氣冷凝物或其等之組合中的一或多種。

在進行LAMP分析的方法之另一個例子中，該生物樣品可為唾液。

在進行LAMP分析的方法之另一個例子中，該方法可進一步包含檢測一病毒病原。

在進行LAMP分析的方法之另一個例子中，該LAMP分析可為反轉錄LAMP (RT-LAMP)。

在一個實施例中，提供一種用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統，其包括或包含一實質上非反應性固相反應介質；及一非干擾性試劑混合物。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可具有從約0.01 mM至約5 mM的緩衝能力。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之另一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可具有λ _max範圍從約443nm至約570nm。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之另一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可包含纖維素或玻璃纖維。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之另一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可為親水性、吸收性及多孔性的。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之另一個例子中，該實質上非反應性固相反應介質可實質上不含氧化劑及pH干擾劑。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之另一個例子中，該系統可進一步包含一黏合劑；一展開層；一隔件；及一塑料載體，其中該黏合劑、展開層、隔件及塑料載體中的每一個實質上不含氧化劑及pH干擾劑。

在用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統之另一個例子中，該非干擾性試劑混合物可進一步包含一或多種目標引子、一DNA聚合酶及一再溶解劑。

在另一個例子中，提供一種使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法，其可包含：提供使非 LAMP反應產生的變色最小化之一固相反應介質；及在該固相反應介質上進行該LAMP分析。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之一個例子中，該方法可進一步包含控制由非LAMP反應產生的質子引起的非LAMP產生的變色。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，該方法可進一步包含使用一不變色添加劑來控制非LAMP反應產生的變色。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，該不變色添加劑可包含糖、緩衝劑、阻斷劑或其等之組合。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，該不變色添加劑可包含糖，該糖可包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣或其等之組合。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，該不變色添加劑可包含一阻斷劑，該阻斷劑包含牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，使環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的檢測位準(LOD)最大化的方法可包含提供使非LAMP反應產物最小化的反應環境及試劑。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統可包含一固相反應介質與一LAMP試劑的組合，其當儲存在25℃下時，維持該固相反應介質的色彩在該固相介質之初始色調的10%以內。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之一個例子中，該組合在儲存超過以下一或多個時可維持色彩：30天、90天、365天、2年或5年。

在使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法之另一個例子中，該組合在儲存於25℃，約40%與90%之間的相對濕度下時可維持色彩。

在另一個例子中，提供一種用於製造如本文所述的色度LAMP系統的方法，其可包含結合該非干擾性試劑混合物與一實質上非反應性固相反應介質，使得該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質保持接觸。

在用於製造如本文所述的色度LAMP系統的方法之一個例子中，該製造過程可包含：製備一含有該非干擾性試劑混合物之溶液；及將該試劑混合物塗佈在該實質上非反應性固相反應介質上。

在用於製造如本文所述的色度LAMP系統的方法之另一個例子中，該塗佈可包含將該溶液滴落、噴霧、浸漬、浸泡或霧化到該實質上非反應性固相反應介質上。

在用於製造如本文所述的色度LAMP系統的方法之另一個例子中，該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質可使用捲對捲(R2R)方法結合。

應當理解，上述方法僅用於說明本發明的一些實施例。在不脫離本發明的精神及範圍的情況下，本領域技術人員可以設計出許多修改及替代排列，並且所附發明申請專利範圍旨在覆蓋這些修改及排列。因此，雖然上面已經結合目前認為是本發明的最實用及優選的實施例對本發明進行了具體及詳細的描述，但是對於本領域的普通技術人員來說很明顯，可在不背離本文中所述的原則及概念下的製造變化。

100、200、400、500、600、700:方法 110、120、130、140:方塊 210、220:方塊 410、420:方塊 510、520、530:方塊 610、620、630:方塊 710、720:方塊 300a、300b、300c、300d、300e、300f:固相反應介質 302:基板 304:黏合層 306:反應層 305a、305b、305c、305d:測試點、反應位置、反應區段 307a、307b、307c、307d、307e:隔件 308:展開層、分佈層 121:參考線

參考下面的詳細描述，結合以例示方式一起說明本揭示之特徵之附圖，本揭示的特徵和優點將變得顯而易見，其中：

圖1描述依照示例性實施例之進行LAMP分析的方法；

圖2描述依照示例性實施例之在固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中使色度輸出信號的準確度最大化的方法；

圖3a說明依照示例性實施例之具有三個測試區段的固相LAMP反應介質；

圖3b說明依照示例性實施例之具有二個測試區段的固相LAMP反應介質；

圖3c說明依照示例性實施例之具有四個測試區段的固相LAMP反應介質；

圖3d說明依照示例性實施例之具有三個測試區段且沒有展開層的固相LAMP反應介質；

圖3e說明依照示例性實施例之具有二個測試區段且沒有展開層的固相LAMP反應介質；

圖3f說明依照示例性實施例之具有四個測試區段且沒有展開層的固相LAMP反應介質；

圖4描述依照示例性實施例之測試病毒病原的存在的方法；

圖5描述依照示例性實施例之確認唾液樣品是否適合用固相LAMP反應進行測試的方法；

圖6描述依照示例性實施例之使來自固相LAMP反應的陽性測試結果的準確度最大化的方法；

圖7描述依照示例性實施例之測試目標核苷酸序列的存在的方法；

圖8a描述依照示例性實施例之生物測試套組的操作；

圖8b說明依照示例性實施例之生物測試套組的色表；

圖9說明依照示例性實施例之紙質LAMP總成；

圖10描述依照示例性實施例之1級及222級層析紙的材料篩選；

圖11依照示例性實施例顯示使用摻入水中的熱去活性SARS-CoV-2在液體中的反應；

圖12說明依照示例性實施例之紙條格式；

圖13說明依照示例性實施例之固相LAMP反應介質；

圖14說明依照示例性實施例之固相LAMP反應介質；

圖15A說明依照示例性實施例之1級層析紙與222級層析紙之間的比較；

圖15B說明依照示例性實施例之在RT-LAMP反應混合物的不同起始pH下結合乾燥時的RT-LAMP；

圖16說明依照示例性實施例之測試條格式；

圖17說明依照示例性實施例之測試條組裝過程；及

圖18A說明依照示例性實施例之生物測試系統的操作。

圖18B說明依照示例性實施例之生物測試系統的操作；

圖19A-19F說明依照示例性實施例之紙質裝置的示意圖及比色表徵分析；

圖20A-20C說明依照示例性實施例之紙上比色應答的數位分析；

圖21A說明依照示例性實施例之在不同濃度的熱去活性SARS-CoV-2下對裝置的確效；

圖21B說明依照示例性實施例之在各種pH值下的酚紅顏色校正；

圖21C說明依照示例性實施例之在不同樣版濃度下RT-LAMP比色應答的綠色通道顏色強度；

圖21D說明依照示例性實施例之使用EBT作為比色報告劑之層析紙上的LAMP；

圖21E說明依照示例性實施例之在使用EBT作為指示劑之各種紙上的LAMP之比色應答；

圖21F說明依照示例性實施例之在使用EBT作為比色指示劑的biodyne A兩性紙上的LAMP檢測；

圖21G說明依照示例性實施例之消除單一反應物對乾燥後紙的初始顏色的影響；

圖21H說明依照示例性實施例之海藻糖及Tween 20對RT-LAMP比色應答的影響；

圖21I說明依照示例性實施例之唾液處理對比色應答的影響；

圖22A說明依照示例性實施例之盤對RT-LAMP比色應答的影響；

圖22B說明依照示例性實施例之上蓋對RT-LAMP比色應答的影響；

圖22C說明依照示例性實施例之加熱方法對RT-LAMP比色應答的影響；

圖22D說明依照示例性實施例之升溫速率對RT-LAMP比色應答的影響；及

圖23A及23B說明依照示例性實施例之比色感知調查。

現在將參考圖示的示例性實施例，並且將使用特定語言來描述相同的實施例。然而，應當理解，並不意在限制本技術的範疇。

(無)

Claims (44)

1. 一種環介導恆溫擴增(LAMP)反應總成，其包含： 一實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與一固相反應介質的組合。
2. 如請求項1的LAMP反應總成，其中該固相介質實質上不含鎂干擾劑。
3. 如請求項2的LAMP反應總成，其中該等鎂干擾劑包括含鎂化合物及會干擾鎂的螯合劑。
4. 如請求項1的LAMP反應總成，其中該固相介質是親水性、吸收性及多孔性。
5. 如請求項1的LAMP反應總成，其中該固相介質是纖維素基介質。
6. 如請求項5的LAMP反應總成，其中該纖維素基介質具有約30至約600之間的表面積對厚度比。
7. 如請求項5的LAMP反應總成，其中該纖維素基介質具有小於約100微米的孔徑。
8. 如請求項1的LAMP反應總成，其中該固相介質包含紙。
9. 如請求項1的LAMP反應總成，其中該固相介質包含玻璃纖維。
10. 如請求項1的LAMP反應總成，其中該固相介質包含尼龍、聚碸、聚醚碸、醋酸纖維素、硝化纖維素或親水性聚四氟乙烯(PTFE)或其等之組合。
11. 如請求項1的LAMP反應總成，其進一步包含實質上不含鎂干擾劑及吸濕劑之一黏合劑。
12. 如請求項1的LAMP反應總成，其進一步包含一展開層，其具有比該固相反應介質低的親水性。
13. 一種製造如請求項1所述之LAMP反應總成的方法，其包含： 結合該實質上不含吸濕劑的LAMP試劑混合物與該固相反應介質，使得該試劑混合物與該固相反應介質保持接觸。
14. 如請求項13的方法，其進一步包含： 使用一不變色添加劑來控制變色。
15. 如請求項14的方法，其中該不變色添加劑包含一糖、一緩衝劑、一阻斷劑或其等之組合。
16. 如請求項14的方法，其中該不變色添加劑包含一糖，該糖包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣或其等之組合。
17. 如請求項14的組合物，其中該不變色添加劑包含一阻斷劑，該阻斷劑包含牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合。
18. 一種執行LAMP分析的方法，其包含： 提供如請求項1所述之LAMP反應總成； 將一生物樣品施加到該反應總成； 將該總成加熱到一足以引發LAMP反應的溫度；及 維持該溫度歷時一段足以完成該LAMP反應的時間。
19. 如請求項18的方法，其中該生物樣品是唾液、黏液、血液、尿液、糞便、汗液、呼出氣冷凝物或其等之組合中的一或多種。
20. 如請求項18的方法，其中該生物樣品是唾液。
21. 如請求項18的方法，其進一步包含： 檢測一病毒病原。
22. 如請求項18的方法，其中該LAMP分析是反轉錄LAMP (RT-LAMP)。
23. 一種用於色度環介導恆溫擴增(chromatic LAMP)分析的系統，其包含： 一實質上非反應性固相反應介質；及 一非干擾性試劑混合物。
24. 如請求項23的系統，其中該實質上非反應性固相反應介質具有從約0.01 mM至約5 mM的緩衝能力。
25. 如請求項23的系統，其中該實質上非反應性固相反應介質具有λ _max範圍從約443 nm至約570 nm。
26. 如請求項23的系統，其中該實質上非反應性固相反應介質包含纖維素或玻璃纖維。
27. 如請求項23的系統，其中該實質上非反應性固相反應介質是親水性、吸收性及多孔性。
28. 如請求項23的系統，其中該實質上非反應性固相反應介質實質上不含氧化劑及pH干擾劑。
29. 如請求項23的系統，其進一步包含： 一黏合劑； 一展開層； 一隔件；及 一塑料載體， 其中該黏合劑、展開層、隔件及塑料載體中的每一個實質上不含氧化劑及pH干擾劑。
30. 如請求項23的系統，其中該非干擾性試劑混合物進一步包含： 一或多種目標引子、一DNA聚合酶及一再溶解劑。
31. 一種使固相pH依賴性環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的色度輸出信號的準確度最大化的方法，其包含： 提供使非LAMP反應產生的變色最小化之一固相反應介質；及 在該固相反應介質上進行該LAMP分析。
32. 如請求項31的方法，其進一步包含： 控制由非LAMP反應產生的質子引起的非LAMP產生的變色。
33. 如請求項31的方法，其進一步包含： 使用一不變色添加劑來控制非LAMP反應產生的變色。
34. 如請求項33的方法，其中該不變色添加劑包含一糖、一緩衝劑、一阻斷劑或其等之組合。
35. 如請求項33的方法，其中該不變色添加劑包括一糖，該糖包含海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚醣或其等之組合。
36. 如請求項33的組合物，其中該不變色添加劑包含一阻斷劑，該阻斷劑包含牛血清白蛋白、酪蛋白或其等之組合。
37. 一種使環介導恆溫擴增(LAMP)分析中的檢測位準(LOD)最大化的方法，其包含： 提供使非LAMP反應產物最小化的反應環境及試劑。
38. 一種用於色度環介導恆溫擴增(LAMP)分析的系統，其包含： 一固相反應介質與LAMP試劑的組合，其當儲存在25℃下時，維持該固相反應介質的色彩在該固相介質之初始色調的10%以內。
39. 如請求項38的系統，其中該組合在儲存超過以下一或多個時維持色彩：30天、90天、365天、2年或5年。
40. 如請求項38的系統，其中該組合當儲存於25℃、約40%與90%之間的相對濕度下時維持色彩。
41. 一種用於製造如請求項1所述之色度LAMP系統的方法，其包含： 結合該非干擾性試劑混合物與一實質上非反應性固相反應介質，使得該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質保持接觸。
42. 如請求項42的方法，其中該製造過程包含： 製備一含有該非干擾性試劑混合物之溶液；及 將該試劑混合物塗佈在該實質上非反應性固相反應介質上。
43. 如請求項42的方法，其中該塗佈包含將該溶液滴落、噴霧、浸漬、浸泡或霧化到該實質上非反應性固相反應介質上。
44. 如請求項42的方法，其中該非干擾性試劑混合物與該實質上非反應性固相反應介質使用捲對捲(R2R)方法結合。

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