TW202227487A - 與ｖｅｇｆ—ａ及ａｎｇ２結合之抗體及其使用方法 - Google Patents

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俊 沙賓 因霍夫
克里斯多夫 烏莫
珍妮娜 史伯克
喬治 莫嫩肯
羅倫 貝克曼
舍貝斯俊 芬
麥可 莫賀傑
芭芭拉 偉瑟
古多 哈特曼
克里斯汀 蕭茲
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Abstract

本發明涉及抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體，例如以雙特異性 Fab 片段之形式，及使用該等抗體之方法。

Description

與　VEGF-A　及　ANG2　結合之抗體及其使用方法
本發明涉及抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體及其使用方法。
先前已經報告了與 VEGF 和 ANG2 結合的雙特異性抗體，並提出將其用於治療眼部血管疾病 (例如年齡相關性黃斑退化)。Faricimab (INN) 是一種全長 IgG1 抗體，其包含與 VEGF 特異性結合的 Fab 結合臂及與 ANG2 特異性結合的第二 Fab 結合臂，是目前正在臨床 III 期研究中評估其治療 DME 及 nAMD 的效果的最先進的雙特異性治療劑 (Sharma, A.，Kumar, N.，Kuppermann, B.D. 等人，Eye 34，802–804 (2020))。
過去幾年，已經提出靶向 VEGF 和 ANG2 的其他聯合治療來治療眼部血管疾病 (例如 WO2016/122996 A1、WO2018/037000A1、WO2019/200006A2、US 2020/0102381 A1)。
包含在一對可變重鏈域 (VH) 及可變輕鏈域 (VL) 中的兩個互補位的多特異性抗體已描述於以下文獻中：WO2008/027236；WO2010/108127；Bostrom, J. 等人，Science 323 (2009) 1610-1614；及 WO2012/163520。
WO2012/163520 揭示了包含在一對 VH 及 VL 域中的兩個互補位的雙特異性抗體 (「DutaFab」)。WO2012/163520 之雙特異性抗體的每個互補位包含來自重鏈及輕鏈 CDR 的胺基酸，其中重鏈 CDR-H1 及 CDR-H3 以及輕鏈 CDR-L2 帶來第一互補位，且輕鏈 CDR-L1 及 CDR-L3 以及重鏈 CDR-H2 帶來第二互補位。從不同 Fab 文庫獨立分離出包含單個互補位的單特異性抗體，該等抗體在第一互補位或第二互補位方面是多樣化的。對該等單特異性抗體之胺基酸序列進行鑑定並合併為雙互補位 VH 及 VL 對。WO2012/163520 中揭示了一種與 VEGF 及 IL-6 特異性結合的例示性 Fab 片段。
然而，需要改善的與 VEGF 和 ANG2 結合的治療性抗體，例如藉由改善與標準護理相比的療效及改善作用持續時間並繼而降低玻璃體內注射頻率以使患者的投予負擔減小來實現。
本發明涉及雙特異性抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體及其使用方法。
在一個態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中 VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 ANG2 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中可變輕鏈域及可變重鏈域對同時與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中抗體與人類 VEGF-A 上的相同抗原決定位及人類 ANG2 上的相同抗原決定位結合，因為該抗體包含 SEQ ID NO:19 之可變重鏈域及 SEQ ID NO:20 之可變輕鏈域。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如靜態光散射 (SLS) 所測量 (在一個實施例中，如「材料及一般方法」部分的「熱穩定性」章節中所述之 SLS 所測量) 之 70℃ 或更高的聚集起始溫度。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如靜態光散射 (SLS) 所測量 (在一個實施例中，如「材料及一般方法」部分的「熱穩定性」章節中所述之 SLS 所測量) 之超過 80℃ 的解構溫度。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99，該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。在一個實施例中，抗體包含：VEGF-A 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66 及 D95，及 VL 域中之如下胺基酸殘基：I2、Y3、Y27、W27a、E32、R92、Y93、H94 及 P95；及 ANG2 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、R94、V96、F98 及 F99，及 VL 域中之如下胺基酸殘基：E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57 及 Y91。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、R66 及 R94；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、L46、F49 及 E57，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含：(a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，其中胺基酸取代位於 SEQ ID NO:19 之位置 1、2、4 至 25、28、35d 至 54、59、60、67 至 93、97、101 至 113 中的一者或多者；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，其中胺基酸取代位於 SEQ ID NO:20 之位置 1、4 至 26、27b 至 27d、33 至 45、47、48、51、52、58 至 90、96 至 107，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL 域 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 SEQ ID NO: 19 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 20 之 VL 序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:25 之輕鏈胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；其中該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；且其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 或更高的聚集起始溫度。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；其中該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；且其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 或更高的聚集起始溫度。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；其中該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；且該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；其中該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；且其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。
本發明之一個實施例涉及與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體片段。本發明之一個實施例涉及與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之雙特異性抗體片段。在一個實施例中，抗體片段選自 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab') 2或由其衍生的單鏈抗體。本發明之一個實施例涉及與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之 Fab 片段。本發明之一個實施例涉及與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之 Fv 片段。
本發明之一個實施例涉及與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之全長 IgG 抗體。
在一個態樣中，本發明提供一種分離之核酸，該分離之核酸編碼本發明之抗體。
在一個態樣中，本發明提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含本發明之核酸。在一個實施例中，宿主細胞為 CHO 細胞。在一個實施例中，宿主細胞為大腸桿菌細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種表現載體，該表現載體包含本發明之核酸。
在一個態樣中，本發明提供一種生產與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體之方法，該方法包含培養本發明之宿主細胞，從而生產該抗體。
在一個態樣中，本發明提供由本發明之方法所生產的抗體。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥調配物，該醫藥調配物包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明提供一種預填裝注射器，該預填裝注射器包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明提供一種眼部植入物，該眼部植入物包含本發明之抗體及醫藥上可接受之載劑。在一個實施例中，本發明包含端口輸送裝置，該端口輸送裝置包含本發明之抗體。
在本發明之一個態樣中，抗體或醫藥調配物藉由端口輸送裝置投予。
在一個態樣中，本發明提供本發明之抗體，該抗體用為藥物，在一個實施例中，用於治療血管疾病。
在一個態樣中，本發明提供本發明之抗體或本發明之醫藥組成物在製造藥物中之用途，在一個實施例中，該藥物用於治療血管疾病。
在一個態樣中，本發明提供一種治療患有血管疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投予有效量之本發明之抗體或本發明之醫藥組成物。
在一個態樣中，本發明提供一種抑制個體中之血管生成的方法，該方法包含向個體投予有效量之本發明之抗體或本發明之醫藥組成物以抑制血管生成。
根據本發明，提供一種治療性抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體，該抗體能夠獨立地結合其標靶抗原，即使其以抗體 Fab 片段的形式提供亦如此。本發明之抗體適合治療眼部血管疾病。本發明之抗體提供了若干支持其治療應用的有價值的性質，例如與兩個標靶的高親和力 (支持低有效劑量) 及有利於延長持續時間的高穩定性。與非抗體方法相比，本發明之抗體往往更容易接受，因為它具有高度人源性且不含人工域及連接子。此外，本發明之抗體有利於以具有適合眼部應用之黏度的高濃度液體調配物提供。由於能夠以高濃度提供，因此用本發明之抗體進行治療對患者而言更容易接受，因為在一次治療中可應用更高劑量之治療劑，從而允許採用更長的治療週期。此外，當用為雙特異性 Fab 片段進行治療時，本發明之抗體與雙特異性全長 IgG 抗體相比，允許每劑提供更多的結合位點。
1. 定義
除非本文另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。本揭露之方法及技術通常按照本領域所熟知之習用方法來進行。通常，與本文所述之生物化學、酵素學、分子與細胞生物學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學和雜交相關之命名法及技術為本領域熟知且常用的那些。
除非本文另外定義，否則術語「包含」應包括術語「由...組成」。
如本文所用之與具體值 (例如，溫度、濃度、時間等) 關聯使用的術語「約」應指代該術語「約」所指代之具體值的 +/- 1% 之變更。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原-結合活性即可。
「經分離之」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在一些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如 SDS-PAGE、等電聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 方法測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
如本文所用的術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的受試者抗體係相同的且/或結合相同抗原決定位，但不包括，例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定位) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構或具有包含本文所定義之 Fc 區域的重鏈之抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。在某些實施例中，抗體屬於 IgG1 同型。在某些實施例中，抗體屬於具有 P329G、L234A 及 L235A 突變的 IgG1 同型，以減少 Fc 區效應子功能。在其他實施例中，抗體屬於 IgG2 同型。在某些實施例中，抗體屬於鉸鏈區中具有 S228P 突變的 IgG4 同型，以改善 IgG4 抗體之穩定性。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
本文中的術語「Fc 域」或「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。於一個實施例中，人類 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。除非本文另有說明，否則 Fc 區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合之抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR) (參見例如：Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007))。在本發明之抗體中，一對 VH 域及 VL 域，亦即同源 VH/VL 對，與其兩個標靶特異性結合：VEGF-A 及 ANG2。
「DutaFab」為如 WO2012/163520 所揭示之雙特異性抗體。在 DutaFab 中，一對 VH 域及 VL 域與兩個不同的抗原決定位特異性結合，其中一個互補位包含來自 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，且另一個互補位包含來自 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。DutaFab 包含同源 VH/VL 對中之兩個不重疊的互補位，並可同時與兩個不同的抗原決定位結合。DutaFab 及藉由篩選包含單特異性 Fab 片段的文庫生成 DutaFab 的方法揭示於 WO2012/163520 中。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義具體而言排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列來源於可變域序列的亞組。通常，序列之亞群為如 Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第 1-3 卷中之亞群。在一個實施例中，對於 VL，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 κ I。在一個實施例中，對於 VH，亞組是如 Kabat 等人在上述文獻中所述之亞組 III。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab’)2、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子 (例如，scFv) 及抗體片段形成的多特異性抗體。
「互補位」或「抗原結合位點」在本文中可互換使用，是指抗體的一部分，其識別並結合抗原。互補位由來自抗體重鏈及輕鏈可變域的多個單獨的胺基酸殘基形成，該等胺基酸殘基在 Fv 區之三級結構中排列為在空間上接近。本發明之抗體包含在一個同源 VH/VL 對中的兩個互補位。
如本文所用，「VEGF-A 互補位」是與 VEGF-A 結合的互補位或抗原結合位點。本發明之抗體的 VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基。
如本文所用，「ANG2 互補位」是與 ANG2 結合的互補位或抗原結合位點。本發明之抗體的 ANG2 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「血管內皮生長因子」或「VEGF」是指來自任何脊椎動物來源之任何天然 VEGF，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 VEGF 以及在細胞處理中得到的任何形式的 VEGF。該術語亦涵蓋天然生成之 VEGF 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類 VEGF 之胺基酸序列如 SEQ ID NO:26 所示。
術語「抗 VEGF-A 抗體」及「與 VEGF-A 結合之抗體」是指能夠以足夠親和力結合 VEGF-A，從而使得該抗體可用作靶向 VEGF-A 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗 VEGF-A 抗體與無關、非 VEGF-A 蛋白結合之程度低於該抗體與 VEGF-A 之結合的約 10%，其藉由例如表面電漿子共振 (SPR) 所量測。在某些實施例中，與 VEGF-A 結合之抗體的解離常數 (K D) ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.01 nM。當抗體的 K D為 1µM 或更小時，稱該抗體與 VEGF-A「特異性結合」。
除非另有說明，否則如本文所使用之術語「血管生成素-2」或「ANG2」是指來自任何脊椎動物來源之任何天然 ANG2，該脊椎動物包括哺乳動物，諸如靈長類動物 (例如，人類) 及囓齒類動物 (例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 ANG2 以及在細胞處理中得到的任何形式的 ANG2。該術語亦涵蓋天然生成之 ANG2 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類 ANG2 之胺基酸序列如 SEQ ID NO:27 所示。
術語「抗 ANG2 抗體」及「與抗 ANG2 結合之抗體」是指能夠以足夠親和力結合抗 ANG2，從而使得該抗體可用作靶向抗 ANG2 之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗抗 ANG2 抗體與無關、非抗 ANG2 蛋白結合之程度低於該抗體與抗 ANG2 結合的約 10%，其藉由例如表面電漿子共振 (SPR) 所量測。在某些實施例中，與 ANG2 結合之抗體的解離常數 (K D) ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.03 nM。當抗體的 K D為 1μM 或更小時，稱該抗體與抗 ANG2「特異性結合」。
本發明之抗體「同時與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合」意指 (a) 與人類 ANG2 結合的本發明之抗體 Fab 片段 (亦) 與人類 VEGF-A 特異性結合，及 (b) 與人類 VEGF-A 結合的本發明之抗體 Fab 片段 (亦) 與人類 ANG2 特異性結合。可用本領域已知的方法評估同時結合，例如藉由如本文所述之表面電漿子共振來評估。
如本文所用，術語「互補決定區」或「CDR」是指在序列中高度可變且含有抗原接觸殘基的抗體可變域的各個區域。通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 域中 (CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3)，三個在 VL 域中 (CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3)。除非另有說明，否則可變域中之 CDR 殘基及其他殘基 (例如，FR 殘基) 在本文中根據 Kabat 編號系統進行編號 (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。
如本文所用之「骨架」或「FR」是指 CDR 殘基之外的可變域胺基酸殘基。可變域之骨架通常由四個骨架域組成：  FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 胺基酸序列通常以如下順序出現在 (a) VH 域中：FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4；並以如下順序出現在 (b) VL 域中：FR1—CDR-L1—FR2—CDR-L2—FR3—CDR-L3—FR4。
根據 Kabat 編號系統，如本文所用，骨架及 CDR 區位於可變域之如下區域：
   FR1 CDR-1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
VH 1-30 31-35b* 36-49 50-65 66-94 95-102 103-113
VL 1-23 24-34 35-49 50-56 57-88 89-97 98-107
* 在 CDR-H1 中，在位置 35b 和 36 之間可能存在額外胺基酸，本文稱為位置「35c」、「35d」及「35e」，如 圖 2 及圖 3所示
根據本文所指的 Kabat 編號系統編號的胺基酸位置在 圖 2 及圖 3中所示與本發明之抗體之胺基酸序列保持一致。對胺基酸序列中特定位置上之胺基酸之引用在本文中藉由說明相應之胺基酸及胺基酸位置是本領域所熟知的，例如，「E2」是指位於相應的抗域之胺基酸序列之 Kabat 位置 2 的麩胺酸殘基。
「親和力」係指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力 (binding affinity)」係指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (K D) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。本文描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。
術語「抗原決定位」表示抗體與之結合的抗原上的位點，無論是蛋白性的還是非蛋白性的。抗原決定位可由連續的胺基酸延伸形成 (線性抗原決定位) 或包含非連續的胺基酸 (構象抗原決定位)，例如，由於抗原的折疊，即藉由蛋白抗原的三級折疊而在空間上接近。線性抗原決定位通常在蛋白抗原暴露於變性劑後仍被抗體結合，而構形抗原決定位通常在變性劑處理後被破壞。在獨特空間構形中，抗原決定位包含至少 3 個、至少 4 個、至少 5 個、至少 6 個、至少 7 個或 8 至 10 個胺基酸。
篩選與特定抗原決定位結合的抗體 (即與相同抗原決定位結合者) 可使用本技術領域的常規方法進行，例如像是但不限於丙胺酸掃描、胜肽印漬 (參見 Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463)、胜肽裂解分析、抗原決定位切除、抗原決定位萃取、抗原的化學修飾 (參見 Prot. Sci. 9 (2000) 487-496) 及交叉阻斷 (參見「Antibodies」，Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY))。
基於抗原結構的抗體剖析 (ASAP)，亦稱為修飾輔助剖析 (MAP)，允許根據從眾多化學或酶修飾的抗原表面的各抗體結合剖析，將特異性結合 VEGF-A 或 ANG2  的眾多單株抗體進行分箱 (bin) (參見例如 US 2004/0101920)。各分箱中的抗體都與相同抗原決定位結合，這個抗原決定位可能是獨特的抗原決定位，與另一分箱所代表的抗原決定位明顯不同或部分重疊。
另外，競爭性結合可用來易於確定抗體是否與 VEGF-A 或 ANG2 之相同抗原決定位結合，或與本發明之抗體競爭性結合。例如，與參考抗體「結合至 VEGF-A 及 ANG2 上相同抗原決定位的抗體」是指，在相應的競爭測定中，分別阻斷參考抗體與其抗原結合 50% 或更多的抗體，反之，參考抗體在相應的競爭測定中阻斷該抗體與其抗原結合 50% 或更多。又例如，為了確定抗體是否與參考抗體結合在相同抗原決定位，讓參考抗體在飽和條件下與 VEGF-A 或 ANG2 結合。在去除過量的參考抗體後，評估有關抗體與 VEGF-A 或 ANG2 結合的能力。如果在參考抗體飽和結合後，有關抗體與能夠與 VEGF-A 或 ANG2 結合，則可以斷定該抗體與參考抗體結合至不同的抗原決定位。但是，如果在參考抗體飽和結合後，有關抗體不能與 VEGF-A 或 ANG2 結合，則該抗體可能與參考抗體結合至相同的抗原決定位。為了確認該抗體是否與相同的抗原決定位結合，或者只是由於立體原因而阻礙了結合，可以使用常規實驗 (例如，使用 ELISA、RIA、表面電漿子共振、流式細胞分析技術或本技術中可獲得的任何其他定量或定性的抗體結合檢定進行胜肽突變和結合分析)。此檢定應分兩次設置進行，即以兩種抗體為飽和抗體。如果在兩種設置中，僅第一 (飽和) 抗體能夠與 VEGF-A 或 ANG2 結合，則可以斷定有關抗體與參考抗體競爭結合至 VEGF-A 或 ANG2。
在一些實施例中，如果一個抗體的 1 倍、5 倍、10 倍、20 倍或 100 倍的過量抑制另一抗體的結合至少 50%、至少 75%、至少 90% 或甚至 99% 或更多 (藉由競爭性結合檢定測量)，則認為兩個抗體與相同或重疊的抗原決定位結合 (參見例如 Junghans 等人，Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502)。
在一些實施例中，如果抗原中基本上所有的胺基酸突變減少或消除一個抗體的結合，也減少或消除另一抗體的結合，則認為兩個抗體與相同抗原決定位結合。如果只有減少或消除一個抗體結合的胺基酸突變的次集合減少或消除另一抗體的結合，則認為兩種抗體具有「重疊抗原決定位」。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮出於比對目的將任何保留取代作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR) 軟體或 FASTA 程式包實現。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何算法。可替代地，可使用序列比較計算機程式 ALIGN-2 生成同一性百分比值。ALIGN-2 序列比較計算機程式由建南德克公司開發，並且其源代碼已與用戶文檔一起歸檔在位於美國華盛頓特區 20559 的美國著作權局，其已經注冊 (美國版權註冊號 TXU510087) 並在 WO 2000/005319 中有所描述。
除非另有說明，否則出於本文之目的，使用 FASTA 套裝 36.3.8c 版或更高版本的 ggsearch 程式與 BLOSUM50 比較矩陣來生成胺基酸序列同一性 % 值。FASTA 程式包由以下作者開發：W. R. Pearson 及 D. J. Lipman (1988)，Improved Tools for Biological Sequence Analysis，PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996)，Effective protein sequence comparison，Meth. Enzymol. 266:227-258；及 Pearson 等人(1997)，Genomics 46:24-36，並可從以下網址公開存取：www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 或 www.  ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta。可替代地，可使用透過 fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi 存取的公用伺服器，使用 ggsearch (global protein:protein) 程式和預設選項 (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) 比較序列，以確保執行全局而不是局部比對。胺基酸同一性百分比提供於輸出比對標題中。
「免疫結合物」是與一個或多個異源分子複合之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言訊息 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有义股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生醣、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦包括適於在活體外及/或活體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的 DNA 及 RNA 分子。該等 DNA (例如 cDNA) 或 RNA (例如 mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之安定性及/或所編碼之分子的表現，使得 mRNA 可被注射入受試者體內以生成抗體 (參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，線上發表于 2017 年 6 月 12 日，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗體的分離核酸」是指編碼抗體重鏈及輕鏈 (或其片段) 之一種或多種核酸分子，包括在單個載體或單獨載體中的該等核酸分子，且該等核酸分子存在於宿主細胞中的一個或複數個位置。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送與其連接之另一種核酸。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接的核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源性核酸的細胞，其包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉化子」和「轉化細胞」，其包括原代轉化細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。
術語「醫藥組成物」或「醫藥調配物」係指以下製劑，其形式為允許其中所含之活性成分的生物活性有效，並且不含對組成物將投予之受試者具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥組成物或調配物中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
藥劑例如醫藥組成物的「治療有效量」係指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。
「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，受試者或個體為人類。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、緩解或改善預後。於一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。
如本文中所使用之術語「眼部疾病」包括與病理性血管生成及/或萎縮相關的任何眼部疾病。眼部疾病之特徵可以為經改變或不受調控之新血管增生及/或侵入眼部組織諸如視網膜或角膜之結構內。眼部疾病之特徵可以為視網膜組織 (光受器及下方視網膜色素上皮細胞 (RPE) 及脈絡膜毛細管) 之萎縮。非限制性眼部疾病包括例如 AMD (例如，濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD、及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑部病變、黃斑部水腫、DME (例如，局部性、非中心性 DME 和瀰漫性、涉及中心的 DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR) (例如，增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)、其他與缺血相關的視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (例如中心 (CRVO) 和分支 (BRVO) 形式)、CNV (例如近視 CNV)、視網膜新血管形成、與視網膜新血管形成相關的疾病、視網膜血管新生、與視網膜/脈絡膜血管新生相關的疾病、中心性漿液視網膜病變 (CSR)、病理性近視、逢希伯-林道病、眼部組織胞漿菌病、FEVR、柯氏症、諾里氏病，與骨質疏鬆-假性神經膠質瘤症候群 (OPPG) 相關的視網膜異常、結膜下出血、紅腫、眼血管新生疾病、血管新生性青光眼、色素性視網膜炎 (RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤增生、黃斑部毛細血管擴張、虹膜血管新生、眼內血管新生、視網膜病變、黃斑部囊樣水腫 (CME)、管脈炎、視乳頭水腫、視網膜炎，包括但不限於 CMV 視網膜炎、眼黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、結膜炎 (例如，感染性結膜炎和非感染性 (例如，過敏性) 結膜炎)、萊伯先天性黑蒙症 (亦稱為萊伯氏先天性黑蒙症或 LCA)、眼色素層炎 (包括感染性和非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎 (例如多灶性脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、眼外傷、修格倫氏病及其他眼科疾病，其中，該疾病或疾病與血管新生、血管滲漏、及/或視網膜水腫或視網膜萎縮有關。另外示例性眼部疾病包括視網膜劈裂症 (視網膜神經感測層之不正常剝離)、與皮膚發紅相關之疾病 (瞼角之新血管形成) 以及由纖維小管或纖維組織之不正常增殖造成之疾病 (包括全部形式之增殖性玻璃體視網膜病變)。與角膜新血管形成相關之示例性疾病包括但不限於，流行性角膜結膜炎、維生素 A 缺乏症、隱形眼鏡過度磨損、過敏性角膜炎、上邊緣性角膜炎、角膜病乾燥性角膜炎 (terygium keratitis sicca)、Sjögren 氏症候群、痤瘡、phylectenulosis、梅毒、分枝桿菌感染、脂質退化、化學品燒傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹病毒感染、帶狀皰疹病毒感染、原蟲感染、卡波西肉瘤、蠶蝕性角膜潰瘍、Terrien 氏邊際退化、邊際性角質退化、類風濕性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、Wegener 類肉瘤病、鞏膜炎、Stevens-Johnson 氏症候群、類天皰瘡放射狀角膜切開術及角膜圖像排斥反應 (corneal graph rejection).與脈絡膜新血管形成及視網膜血管系缺陷 (包括增加之血管滲漏、動脈瘤及毛細血管滴落) 相關的示例性疾病包括但不限於，糖尿病性視網膜病變、黃斑退化、鐮狀細胞貧血、肉瘤、梅毒、彈性纖維假黃瘤、Paget 氏病、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞性疾病、慢性眼色素層炎/玻璃體炎、分支桿菌感染、Lyme 氏病、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病變、視網膜水腫 (包括黃斑水腫)、Eales 病、貝塞特氏病、視網膜炎或脈絡膜炎造成之感染、預設性眼部組織胞漿菌病、Best 氏病 (卵黃狀黃斑退化)、近視、視盤小凹 (optic pits)、睫狀體扁平部炎、視網膜脫落 (例如，慢性視網膜脫落)、血液高度黏稠症、弓蟲症、創傷及雷射後併發症。與視網膜組織 (光受器及下方 RPE) 相關之示例性疾病包括但不限於，萎縮性或非滲出性 AMD (例如，地圖狀萎縮或晚期乾性 AMD)、黃斑萎縮 (例如，與新血管形成相關之萎縮及/或地圖狀萎縮)、糖尿病性視網膜病變、斯特格氏病、Skorsby 眼底萎縮症、視網膜劈裂症及色素性視網膜炎。
術語「藥品說明書」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、給藥途徑、聯合治療、禁忌症及/或警告等資訊。 2. 具體實施方式
在一個態樣中，本發明部分地基於提供用於治療應用之雙特異性抗體。在某些態樣中，提供了與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體。本發明之抗體用於例如診斷或治療血管疾病 (例如眼部血管疾病)。 A. 與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體
在一個態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體。在一個態樣中，提供了與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之經分離之抗體。在一個態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體。
在某些態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含在 VL 域及 VH 域之一個同源對內的 VEGF-A 互補位 (亦即，與 VEGF-A 結合至抗原結合位點) 及 ANG2 互補位 (亦即，與 ANG2 結合至抗原結合位點)，其中 •       VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR‑L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 ANG2 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基；及/或 •       可變輕鏈域及可變重鏈域對同時與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合；及/或 •       抗體與具有 SEQ ID NO:19 之可變重鏈域及 SEQ ID NO:20 之可變輕鏈域之抗體結合至人類 VEGF-A 上的相同抗原決定位及人類 ANG2 上的相同抗原決定位；及/或 •       該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2；及/或 •       該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 或更高的聚集起始溫度；及/或 •       該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度；及/或 •       包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99，該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。在一個實施例中，抗體包含：VEGF-A 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66 及 D95，及 VL 域中之如下胺基酸殘基：I2、Y3、Y27、W27a、E32、R92、Y93、H94 及 P95；及 ANG2 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、R94、V96、F98 及 F99，及 VL 域中之如下胺基酸殘基：E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57 及 Y91。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列，其中該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列，其中該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列，其中 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、R66 及 R94；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、L46、F49 及 E57，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一性的胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，其中胺基酸取代位於 SEQ ID NO:19 之位置 1、2、4 至 25、28、35d 至 54、59、60、67 至 93、97、101 至 113 中的一者或多者；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，其中胺基酸取代位於 SEQ ID NO:20 之位置 1、4 至 26、27b 至 27d、33 至 45、47、48、51、52、58 至 90、96 至 107，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL 域 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有 1 至 15 個、1 至 10 個或 1 至 5 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 VH 域。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性的 VH 序列包含相對於參考序列的取代 (例如保留取代)、插入或缺失，但是與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體包含保留與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之能力的序列。在某些態樣中，在 SEQ ID NO:19 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在特定態樣中，VH 包含：(a) CDR-H1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:3；(b) CDR-H2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:21；及 (c) CDR-H3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:14。
在一個態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 VL 域。在某些態樣中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 之同一性的 VL 序列包含相對於參考序列的取代 (例如保留取代)、插入或缺失，但是與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體包含保留與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之能力的序列。在某些態樣中，在 SEQ ID NO:20 中，共有 1 至 10 個胺基酸被取代、插入及/或缺失。在某些方面，取代、插入或缺失發生在 CDR 以外的區域 (即，在 FR 中)。在特定態樣中，VL 包含：(d) CDR-L1，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:22；(e) CDR-L2，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:23；及 (f) CDR-L3，其包含胺基酸序列 SEQ ID NO:8。
在另一態樣中，提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含上文提供的任一態樣的 VH 序列及上文提供的任一態樣的 VL 序列。在一個態樣中，抗體包含分別為 SEQ ID NO:19 和 SEQ ID NO:20 之 VH 和 VL 序列，其包括那些序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:25 之輕鏈胺基酸序列。
在另一態樣中，提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 SEQ ID NO:17 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:18 之輕鏈胺基酸序列。
在本發明之又一態樣中，根據上述態樣中之任一者的與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體為單株抗體。在一個態樣中，與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體為抗體片段，例如 Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或 F(ab’) 2片段。在另一態樣中，抗體為全長抗體。
在又一態樣中，根據上述態樣中之任一者的與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體可單獨或組合結合如以下 1-5 部分所述之任意特徵： 1. 抗體親和性
在某些實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.01 nM 的解離常數 (K D) 與 VEGF-A 結合。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與 VEGF-A 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 VEGFA-121 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 VEGFA-165 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。
在某些實施例中，與 ANG2 結合之抗體的解離常數 (K D) ≤ 1 nM、≤ 0.1 nM 或 ≤ 0.03 nM。在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體以 ≤ 10 pM 的解離常數 (K D) 與人類 ANG2 結合，在一較佳的實施例中，該解離常數 ≤ 5 pM。
在一個態樣中，K D使用 BIACORE ®表面電漿子共振測定法測得。
在另一態樣中，K D使用 KinExA 測定法測得。在一個實施例中，K D使用 KinExA 測定法在下文「材料與一般方法」部分中所述之用於檢測 VEGF-A 結合之 K D或用於檢測 ANG2 結合之 K D之條件下測得。
例如 ，抗體與 VEGF-A 結合的 K D在使用來自 Sapidyne Instruments (Boise, ID) 的 KinExA 3200 儀器的測定中測量，其中 PMMA 珠粒根據 KinExA 手冊方案 (吸附塗層，Sapidyne) 使用於 1 ml PBS (pH 7.4) 中之 30 µg 抗 VEGF-抗體 MAB293 (R&D) 以抗原塗布。KinExA 平衡測定於室溫下使用含 0.01 % BSA 及 0.01 % Tween20 的 PBS pH 7.4 作為運行緩衝劑進行，其中樣品及珠粒在 LowCross 緩衝劑 (Candor Bioscience) 中製備。所用流速為 0.25 ml/min。用被測抗體滴定恆定量之的 VEGFA-121-His (50 pM，在第二個實驗中為 500 pM)，並使平衡後之混合物透過 KinExA 系統中之抗 VEGF 抗體 (Mab293) 偶合珠粒的管柱，對於 50 pM 恆定 VEGF，採用 750 µl 的體積；對於 500pM 恆定 VEGF，採用 125 µl 的體積。結合之 VEGFA-121 的檢測使用濃度為 250 ng/ml 的第二生物素化抗 VEGF 抗體 (BAF293)，然後注入樣品緩衝劑中之 250 ng/ml 鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物。使用 KinExA 軟體 (4.0.11 版) 內包含的單點同質結合模型，用「標準分析」方法對資料進行非線性回歸分析，獲得 K D。軟體藉由將資料點擬合至理論 K D曲線來計算 K D並確定 95% 信賴區間。95% 信賴區間以 K D低和 K D高給出。
例如 ，抗體與 ANG2 結合的 K D在使用來自 Sapidyne Instruments (Boise, ID) 的 KinExA 3200 儀器的測定中測量，其中 PMMA 珠粒根據 KinExA 手冊方案 (吸附塗層，Sapidyne) 使用於 1 ml PBS (pH 7.4) 中之 20 µg 抗 Ang2 抗體 MAB098 (R&D) 以抗原塗布。KinExA 平衡測定於室溫下使用含 0.01 % BSA 及 0.01 % Tween20 的 PBS pH 7.4 作為運行緩衝劑進行，其中樣品及珠粒在 LowCross 緩衝劑 (Candor Bioscience) 中製備。所用流速為 0.25 ml/min。用被測抗體滴定恆定量之 Ang2-RBD-muFc (50 pM，在第二個實驗中為 500 pM)，並使平衡後之混合物透過 KinExA 系統中之抗 Ang2 抗體 (MAB098) 偶合珠粒的管柱，對於 50 pM 恆定 Ang2，採用 750 µl 的體積；對於 500pM 恆定 Ang2，採用 188 µl 的體積。結合之 Ang2 的檢測使用濃度為 250 ng/ml 的第二生物素化抗 Ang2 抗體 (BAM0981)，然後在樣品緩衝劑中注射 250 ng/ml 鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物。使用 KinExA 軟體 (4.0.11 版) 內包含的單點同質結合模型，用「標準分析」方法對資料進行非線性回歸分析，獲得 K D。軟體藉由將資料點擬合至理論 K D曲線來計算 K D並確定 95% 信賴區間。95% 信賴區間以 K D低和 K D高給出。 2. 抗體片段
在某些方面，本文提供之抗體為抗體片段。
在一個方面，抗體片段為 Fab、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’) 2片段，特別是 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域 (分別為 VH 和 VL) 及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈 (包含 VL 域和 CL 域) 及重鏈片段 (包含 VH 域和 CH1 域) 之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合抗原決定位殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab') 2片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利。
抗體片段可藉由各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌、CHO) 之重組產生。
在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體為 Fab 片段。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 VH 域包含人類 VH3 骨架。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 VL 域包含人類 Vkappa1 骨架。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 CL 域為 κ 同型。
在一個實施例中，本文所提供之抗體之 CH1 域為人類 IgG1 同型。
在一較佳的實施例中，本文所提供之抗體為包含 κ 同型的 CL 域及人類 IgG1 同型的 CH1 域的 Fab 片段。 3. 熱穩定性
本文所提供之抗體表現出優異的熱穩定性。在某些實施例中，本文所提供之抗體之 Fab 片段具有 70℃ 或更高的聚集起始溫度。在某些實施例中，本文所提供之抗體之 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 4. 多特異性抗體
在某些態樣中，本文所提供之抗體為多特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同抗原決定位或同一抗原上之不同抗原決定位) 具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。
具有三種或更多種結合特異性之多特異性抗體包含本文所提供之抗體，其可提供為不對稱形式，包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即藉由交換 VH/VL 域 (參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447)、CH1/CL 域 (參見例如 WO 2009/080253) 或完整的 Fab 臂 (參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS，108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20) 實現。用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中已知的並且包括在本文中 (參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106)。 5. 抗體變異體
在某些方面，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能希望改變抗體的結合親和力及/或其他生物學特性。可通過將適當的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或通過肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。
在某些方面，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代誘變的目標位點包括 CDR 和 FR。保留取代列於下表之「較佳取代」標題下。表 1 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。可將胺基酸取代引入目標抗體中，並篩選具有所需活性之產物，例如，保留/改善的抗原結合特徵、降低的免疫原性或改善的 ADCC 或 CDC。 表
原始 殘基 示例性 取代 優選 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保留取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型之取代變異體涉及取代親代抗體 (例如，人源化或人抗體) 之一個或多個 CDR 殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體將相對於親代抗體在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留親代抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和性成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和性成熟技術，例如本文所述的那些。簡言之，一個或多個 CDR 殘基發生突變，並且變異抗體在噬菌體上展示並篩選出特定的生物活性 (例如，結合親和力)。
在某些方面，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中實施基本上不降低結合親和力的保留式修改 (例如，本文所提供之保留取代)。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989) ( Science，244:1081-1085) 所述，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 arg、asp、his、lys 和 glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體，其長度為從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶 (例如，對於 ADEPT (針對抗體之酶前藥治療)) 或提高抗體血清半衰期之多肽。 a) 醣基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體發生醣基化之程度。抗體中添加或缺失醣基化位點可透過改變胺基酸序列以使得產生或去除一個或多個醣基化位點而方便地實現。
當抗體包含 Fc 區域時，可改變與其相連的寡醣。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，其通常藉由 N‑鍵連接至 Fc 區之 CH2 域之 Asn297。參見例如 Wright 等人 TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在雙天線型寡醣結構之「莖」中連接至 GlcNAc 的岩藻醣。在一些實施例中，可對本發明之抗體中的寡醣進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個態樣中，提供了具有非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體，即缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻醣的寡醣結構。此等非岩藻醣基化寡醣 (也稱為「去岩藻醣基化」寡醣) 特定而言在雙天線型寡醣結構的莖中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻醣殘基的 N-連接寡醣。在一個態樣中，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區域中具有增加比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體變異體。例如，非岩藻醣基化寡醣的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100% (即不存在岩藻醣基化寡醣)。非岩藻醣基化寡醣之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡醣相對於連接至 Asn 297 (例如復合物、雜合和高甘露糖結構) 的所有寡醣的總和之 (平均) 量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區域位置 297 附近之天冬醯胺殘基 (Fc 區域殘基的 EU 編號)；但是，Asn297 也可以位於位置 297 上游或下游大約 ±3 個胺基酸處，即由於抗體之微小序列變化而介於位置 294 和 300 之間。此等在 Fc 區域中具有增加的比例的非岩藻醣基化寡醣的抗體可具有改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應功能，特定而言改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠產生具有減少的岩藻醣基化抗體之細胞系的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之 Lec13 CHO 細胞 (Ripka 等人， Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中)；和敲除細胞系，諸如敲除 α-1,6-岩藻醣基轉移酶基因 FUT8 的 CHO 細胞 (參見例如 Yamane-Ohnuki 等人， Biotech. Bioeng.87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人， Biotechnol. Bioeng，94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107)；或 GDP-岩藻醣合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞 (參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一個實施例中，抗體變異體被提供有二等分之寡醣，例如，其中連接至抗體之 Fc 區域的雙天線型寡醣被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上文所述之減少的岩藻醣基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如：Umana 等人，Nat Biotechnol 17，176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
還提供了在寡醣上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。該等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。 b. Fc 區域變異體
在某些方面，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區域變異體。Fc 區域變異體可包含人 Fc 區域序列 (例如，人 IgG 1、IgG 2、IgG 3或 IgG 4Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些態樣中，本發明考慮了一種具有一部分但非全部效應子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選抗體：其中抗體 活體內半衰期很重要，但某些效應子功能 (例如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 及抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)) 是不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合 (因此可能缺乏 ADCC 活性)，但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 之原代細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞則表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 ( Annu. Rev. Immunol.9:457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估目標分子之 ADCC 活性的 活體外測定方法之非限制性實例描述於美國專利第 5,500,362 號中 (參見例如 Hellstrom, I. 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA83:7059-7063 (1986))；及 Hellstrom, I 等人， Proc. Nat’l Acad. Sci. USA82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見 Bruggemann, M. 等人， J. Exp.Med.166:1351-1361 (1987))。可替代地，可采用非放射性分析方法 (參見例如：用於流式細胞分析技術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)；及 CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等分析的有用的效應細胞包括周邊血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在 活體內評估所關注分子的 ADCC 活性，例如在動物模型中，例如揭示於 Clynes 等人 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998) 中。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人， J. Immunol. Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S. 等人， Blood101:1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. 和 M.J. Glennie， Blood103:2738-2743 (2004))。FcRn 結合和活體內清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行 (參見例如 Petkova, S.B. 等人， Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)。
效應子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國專利號 6,737,056)。此等 Fc 變異體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 變異體，包括所謂的「DANA」 Fc 變異體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸取代 (美國專利號 7,332,581)。
其中描述了某些與 FcR 的結合能力得到改善或減弱的抗體變異體。(參見例如美國專利第 6,737,056 號；WO 2004/056312；及 Shields 等人， J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001)。)
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區域的位置 298、333 及/或 334 (殘基的 EU 編號) 處之取代。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區域的位置 234 和 235 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在一個方面，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。在某些方面，抗體變異體進一步包含 Fc 區域中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人 IgG 1Fc 區域。在一個方面，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 P329G (LALA-PG)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。參見例如 WO 2012/130831。在另一方面，取代為 Fc 區域中的 L234A、L235A 和 D265A (LALA-DA)，其來源於人 IgG 1Fc 區域。
在一些態樣中，在 Fc 區中進行修改，得到修改 (亦即改善或減少) 之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如美國專利第 6,194,551 號、WO 99/51642 及 Idusogie 等人 J. Immunol.164: 4178-4184 (2000) 中所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn) (其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，見 Guyer 等人 J. Immunol.117:587 (1976) 和 Kim 等人 J. Immunol.24:249 (1994)) 之結合的抗體描述於 US2005/0014934 (Hinton 等人) 中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區域，其改善了 Fc 區域與 FcRn 之結合。此等 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區域殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區殘基 434 之取代 (參見例如：美國專利第 7,371,826 號；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem.281 (2006) 23514-23524)。
藉由定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區殘基 (參見例如，Dall’Acqua, W.F. 等人J. Immunol 169 (2002) 5171-5180)。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435 (EU 指數編號) 參與相互作用 (Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542)。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要 (Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819)。對人 Fc-人 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要 (Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604)。在 Yeung, Y.A. 等人(J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報告並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變異體。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 253、及/或 310、及/或 435 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些方面，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 253、310 和 435 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區域中之 I253A、H310A 和 H435A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。參見例如 Grevys, A., 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 310、及/或 433、及/或 436 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些方面，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 310、433 和 436 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區域中之 H310A、H433A 和 Y436A，其來源於人 IgG1 Fc 區域。(參見例如 WO 2014/177460 Al。)
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區域，這些取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區域之位置 252、及/或 254、及/或 256 (殘基的 EU 編號) 處之取代。在某些方面，抗體變異體包含 Fc 區域，該 Fc 區域具有在位置 252、254 和 256 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區域中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人 IgG 1Fc 區域。另參見 Duncan & Winter, Nature322:738-40 (1988)；美國專利第 5,648,260 號；美國專利第 5,624,821 號；及 WO 94/29351 涉及 Fc 區變異體的其他實例。
如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個優選方面，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有方面中之一方面，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號)。在本文所報告的所有方面中之一方面，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，胺基酸位置的 EU 指數編號)。
c. 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些方面，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMAB TM抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接基-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所屬的方法產生。 6. 免疫複合體
本發明亦提供了包含如本文所述之抗體的免疫結合物，該等免疫結合物結合 (化學鍵合) 至一種或多種治療劑；在一個實施例中，例如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素 (例如，來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酵素活性毒素或其片段) 或放射性同位素。
在一個實施例中，本發明提供了免疫結合物，該等免疫結合物包含結合至聚合物的本文所提供之抗體。本文所使用之術語「聚合物」包括化學聚合物及蛋白質聚合物。在一個實施例中，免疫結合物包含結合至延伸重組多肽 (XTEN) 的本文所提供之抗體。「延伸重組多肽」是本領域已知的且例如揭示於 US20190083577 中。在一個實施例中，免疫結合物包含 XTEN，該 XTEN (a) 包含選自 GGSPAGSCTSP、GASASCAPSTG、TAEAAGCGTAEAA 和 GPEPTCPAPSG 的序列。(b) 長度為 36 至 3000 個 L-胺基酸殘基，及/或 (c) 其中甘胺酸 (G)、丙胺酸 (A)、絲胺酸 (S)、蘇胺酸 (T)、麩胺酸鹽 (E) 及脯胺酸 (P) 殘基之總和佔 XTEN 總胺基酸殘基的 90% 以上。 B. 重組方法和組成物
可使用重組方法和組成物來生產抗體，例如 US 4,816,567 中所述。對於這些方法，提供了一個或多個編碼抗體的經分離之核酸。
在一個態樣中，提供編碼本發明之抗體的經分離之核酸。
在一個態樣中，提供了一種製備與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體的方法，其中該方法包括在適合於抗體表現的條件下培養包含如上所提供之編碼抗體的核酸的宿主細胞，並視情況從宿主細胞 (或宿主細胞培養基) 中回收抗體。
在重組生產與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體時，將例如上述之編碼抗體之核酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等核酸可通過常規方法 (例如，使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並序列化，或通過重組方法或化學合成進行生產。
適用於選殖或表現編碼抗體之載體的宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可能在細菌中產生，特別是在無需醣基化和 Fc 效應功能的情況下。有關抗體片段和多肽在細菌中之表現，參見例如 US 5,648,237、US 5,789,199 及 US 5,840,523。(另見 Charlton, K.A.，在：Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. (主編)，Humana Press，Totowa，NJ (2003) 第 245-254 頁，其中描述了抗體片段在大腸桿菌中之表現。)在表現後，抗體可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。在一個實施例中，宿主細胞為大腸桿菌細胞。
脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞係。可用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人胚胎腎系 (如 Graham, F.L. 等人，J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather, J.P.，Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人肺細胞 (W138)；人肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather, J.P. 等人，Annals N.Y.Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 DHFR- CHO 細胞 (Urlaub, G. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)；及骨髓瘤細胞系，例如 Y0、NS0 和 Sp2/0。有關某些適用於抗體生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki, P. 和 Wu, A.M.，Methods in Molecular Biology，第 248 卷，Lo, B.K.C. 主編，Humana Press，Totowa，NJ (2004)，第 255-268 頁。
在一個方面，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。在一個較佳的實施例中，宿主細胞為 CHO 細胞。在 CHO 細胞中生產本發明之抗體可改善抗體之可注射性。 C. 醫藥組成物
在又一方面，提供了包含本文所提供之任何抗體的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個方面，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體和醫藥上可接受之載劑。在另一方面，醫藥組成物包含本文所提供之任何抗體及至少一種另外治療劑 (如下文所述)。
藉由混合具有所需純度的與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體與一種或多種視情況的醫藥上可接受之載劑，來製備如本文所述抗體的呈凍乾組成物或水溶液形式的醫藥組成物 ( Remington's Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol, A. 主編，1980 年)。醫藥上可接受之載劑在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒，其包括但不限於：緩衝劑，例如組胺酸、磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯化物；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。本文中例示性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白 (sHASEGP)，例如，人類可溶性 PH-20 透明質酸酶醣蛋白，諸如 rHuPH20 (HYLENEX ®，Halozyme, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及使用方法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號2005/0260186 及 2006/0104968 中。在一個方面，sHASEGP 與一種或多種另外的糖胺聚醣酶諸如軟骨素酶結合在一起。
例示性凍乾抗體組成物如美國專利第 6,267,958 號所述。水溶性抗體組成物包括美國專利號 6,171,586 和 WO 2006/044908 中所述的那些，後者所述之組成物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本文所述之醫藥組成物還可包含適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。該等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。
活性成分可以誘捕在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。該等技術公開於 Remington's Pharmaceutical Sciences(第 16 版，Osol, A. 主編，1980 年)。
可製備用於緩釋之醫藥組成物。緩釋製劑的適宜的實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。
用於 活體內投予之醫藥組成物通常為無菌的。無菌性可易於例如藉由無菌濾膜過濾來實現。 D. 治療方法及投予途徑
本文所提供之與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體中之任一者皆可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用為藥物。在另外的態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用於治療血管疾病。在某些態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用於治療方法中。在某些態樣中，,本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用於治療患有血管疾病之個體的方法中，該方法包含向個體投予有效量之人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體。在一個此等方面，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外治療劑) 投予該個體。在另外的態樣中，本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用於抑制血管生成。在某些態樣中，,本發明提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用於抑制血管生成的方法中，該方法包含向個體投予有效量之與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體以抑制血管生成。根據上述任一方面的「個體」較佳地為人。
在另外的態樣中，提供一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其用於治療眼部疾病。在一個實施例中，眼部疾病選自 AMD (在一個實施例中為濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD 及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑部病變、黃斑部水腫、DME (在一個實施例中為局部性、非中心性 DME 和瀰漫性、涉及中心的 DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR) (在一個實施例中為增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)、其他與缺血相關的視網膜病變、ROP、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (在一個實施例中為中心 (CRVO) 和分支 (BRVO) 形式)、CNV (在一個實施例中為近視 CNV)、視網膜新血管形成、與視網膜新血管形成相關的疾病、視網膜血管新生、與視網膜/脈絡膜血管新生相關的疾病、中心性漿液視網膜病變 (CSR)、病理性近視、逢希伯-林道病、眼部組織胞漿菌病、FEVR、柯氏症、諾里氏病，與骨質疏鬆-假性神經膠質瘤症候群 (OPPG) 相關的視網膜異常、結膜下出血、紅腫、眼血管新生疾病、血管新生性青光眼、色素性視網膜炎 (RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤增生、黃斑部毛細血管擴張、虹膜血管新生、眼內血管新生、視網膜病變、黃斑部囊樣水腫 (CME)、管脈炎、視乳頭水腫、視網膜炎，包括但不限於 CMV 視網膜炎、眼黑色素瘤、視網膜母細胞瘤、結膜炎 (在一個實施例中為感染性結膜炎和非感染性 (例如，過敏性) 結膜炎)、萊伯先天性黑蒙症 (亦稱為萊伯氏先天性黑蒙症或 LCA)、眼色素層炎 (包括感染性和非感染性眼色素層炎)、脈絡膜炎 (在一個實施例中為多灶性脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、眼外傷、修格倫氏病及其他眼科疾病，其中，該疾病或疾病與血管新生、血管滲漏、及/或視網膜水腫或視網膜萎縮有關。在一個實施例中，眼部疾病選自 AMD (在一個實施例中，為濕性 AMD、乾性 AMD、中期 AMD、晚期 AMD 及地圖狀萎縮 (GA))、黃斑部病變、黃斑部水腫、DME (在一個實施例中，為局部性、非中心性 DME 和瀰漫性、涉及中心的 DME)、視網膜病變、糖尿病性視網膜病變 (DR) (在一個實施例中，為增生性 DR (PDR)、非增生性 DR (NPDR) 及高海拔 DR)。
在又一態樣中，本發明提供與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體在製造或製備藥物中之用途。在一個態樣中，藥物用於治療血管疾病。在又一態樣中，藥物用於治療血管疾病的方法中，該方法包含向患有血管疾病之個體投予有效量之藥物。在一個此等方面，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (例如，如下文所述) 投予個體。
在一個態樣中，藥物用於治療眼部疾病。在又一態樣中，藥物用於治療眼部疾病的方法中，該方法包含向患有眼部疾病的個體投予有效量之藥物。在一個此等方面，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (例如，如下文所述) 投予個體。
在又一態樣中，本發明提供一種治療血管疾病的方法。在一個態樣中，該方法包含向患有該等血管疾病的個體投予有效量之與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體。在一個此等方面，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。
在又一態樣中，本發明提供一種治療眼部疾病的方法。在一個態樣中，該方法包含向患有該等眼部疾病的個體投予有效量之與人類 VEGF‑A 及人類 ANG2 結合之抗體。在一個此等方面，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。
根據上述任一方面的「個體」可以是人。
在又一態樣中，本發明提供包含本文所提供之任意與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體的醫藥組成物，其例如用於以上任何治療方法。在一個態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任意與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之任意與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體及至少一種其他治療劑 (例如，如下文所述)。
本發明之抗體可藉由玻璃體內投予 (例如，玻璃體內注射) 或使用端口輸送裝置來投予。在一個實施例中，在端口輸送裝置再裝滿之前，本發明之抗體使用端口輸送裝置於六個月或更長時間內投予；在一個實施例中，於 8 個月或更長時間內投予；在一個實施例中，於 9 個月或更長時間內投予；在一個實施例中，於 12 個月或更長時間內投予。在一個實施例中，本發明之抗體使用端口輸送裝置來投予，其中抗體以 150 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置；在一個實施例中，以 200 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置。
本發明之抗體可單獨投予或用於聯合治療。例如，聯合治療包括投予本發明之抗體並投予至少一種另外治療劑 (例如，一種、兩種、三種、四種、五種或六種另外治療劑)。
在根據 (或如應用於) 上述任何實施例之某些實施例中，該眼部病症為選自由以下所組成之群組的眼內新血管疾病：增殖性視網膜病變、脈絡膜新血管形成 (CNV)、年齡相關性黃斑退化 (AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫,、病理性近視、逢希伯-林道病、眼睛組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞 (RVO) (包括 CRVO 及 BRVO)、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病變 (ROP)。
在一些情況下，本文所提供之與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體可與至少一種其他治療劑組合投予以治療眼部病症，例如本文所述之眼部病症 (例如，AMD (例如，濕性 AMD)、DME、DR、RVO 或 GA)。
任何合適的 AMD 治療劑皆可作為其他治療劑與本文所提供之與人類 VEGF 及人類 ANG2 結合之抗體組合投予以用於治療眼部病症 (例如 AMD、DME、DR、RVO 或 GA)，包括但不限於 VEGF 拮抗劑，例如抗 VEGF 抗體 (例如 LUCENTIS® (蘭尼單抗)、RTH-258 (原 ESBA-1008，即抗 VEGF 單鏈抗體片段；Novartis) 或雙特異性抗 VEGF 抗體 (例如抗 VEGF/抗血管生成素 2 雙特異性抗體，諸如 Faricimab；Roche))、可溶性 VEGF 受體融合蛋白 (例如，EYLEA® (阿柏西普))、抗 VEGF DARPin® (例如 abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan) 或抗 VEGF 適體 (例如MACUGEN® (哌加他尼鈉))；源自血小板之生長因子 (PDGF) 拮抗劑，例如，抗 PDGF 抗體，抗 PDGFR 抗體 (例如，REGN2176-3)、抗 PDGF-BB peg 化適體 (例如 FOVISTA®；Ophthotech/Novartis)、可溶性 PDGFR 受體融合蛋白或雙重 PDGF/VEGF 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，DE-120 (Santen) 或 X-82 (TyrogeneX)) 或雙特異性抗 PDGF/抗 VEGF 抗體))；與光動力治療合用之 VISUDYNE® (維替泊芬)；抗氧化劑；補體系統拮抗劑，例如，補體因子 C5 拮抗劑 (例如，小分子抑制劑 (例如，ARC-1905；Opthotech) 或抗 C5 抗體 (例如，LFG-316；Novartis)、備解素拮抗劑 (例如，抗備解素抗體，例如，CLG-561；Alcon) 或補體因子 D 拮抗劑 (例如，抗補體因子 D 抗體，例如，蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)；Roche))；C3 阻斷肽 (例如，APL-2,，Appellis)；視覺週期休試劑 (例如，依米司他鹽酸鹽 (emixustat hydrochloride))；角鯊胺 (例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；維生素及礦物質補充劑 (例如，彼等揭示於 Age-Related Eye Disease Study 1 (AREDS1；鋅及/或抗氧化劑) 及 Study 2 (AREDS2；鋅、抗氧化劑、葉黃素、玉米黃素及/或 ω-3 脂肪酸))；基於細胞之治療，例如，NT-501 (Renexus)；PH-05206388 (Pfizer)、huCNS-SC 細胞移植 (StemCells)、CNTO-2476 (臍帶幹細胞系；Janssen)、OpRegen (RPE 細胞之懸浮液；Cell Cure Neurosciences) 或 MA09-hRPE 細胞移植 (Ocata Therapeutics)；組織因子拮抗劑 (例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-腎上腺素性受體促效劑 (例如，酒石酸溴莫尼定 (brimonidine tartrate)；Allergan)；肽疫苗 (例如，S-646240；Shionogi)；類澱粉蛋白 β 拮抗劑 (例如，抗 β 類澱粉蛋白單株抗體，例如，GSK-933776)；S1P 拮抗劑 (例如，抗 S1P 抗體，例如，iSONEP™；Lpath Inc)；ROBO4 拮抗劑 (例如，抗 ROBO4 抗體，例如，DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表現內皮抑素及血管抑素之慢病毒載體 (例如，RetinoStat) 及其組合。於一些情況下，AMD 治療劑 (包括前述任意 AMD 治療劑) 可共同調配。例如，抗 PDGFR 抗體 REGN2176-3 可與阿柏西普 (EYLEA®) 共同調配。在一些情況下，該等共調配物可與本發明之與人類 VEGF 及人類 ANG2 結合之抗體聯合投予。於一些情況下，該眼部病症為 AMD (例如，濕性 AMD)。
任何合適的 DME 及/或 DR 治療劑皆可本發明之與人類 VEGF 及人類 ANG2 結合之抗體聯合投予，以用於治療眼部病症 (例如，AMD、DME、DR、RVO 或 GA)，包括但不限於 VEGF 拮抗劑 (例如，LUCENTIS® 或 EYLEA®)、皮質類固醇 (例如，皮質類固醇植入物 (例如，OZURDEX® (地塞米松玻璃體內植入物) 或 ILUVIEN® (丙酮氟洛皮質醇玻璃體內植入物)) 或經調配用於藉由玻璃體內注射投予之皮質類固醇 (例如，丙酮特安皮質醇)) 或其組合。於一些情況下，該眼部病症為 DME 及/或 DR。
如本文所提供之與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體可與治療或外科方法聯合投予以用於治療眼部病症 (例如，DME、DR、AMD、RVO 或 GA)，該治療或外科方法包括，例如，雷射光凝 (例如，全視網膜光凝 (PRP))、隱結雷射作用、黃斑裂孔手術、黃斑轉位手術、可植入袖珍望遠鏡、PHI-運動血管造影 (亦稱為微雷射治療及分支血管治療 (feeder vessel treatment))、光子束治療、微刺激治療、視網膜脫落及玻璃體手術、鞏膜屈曲 (scleral buckle)、黃斑下手術、經瞳孔熱療、光系統 I 治療、RNA 干擾 (RNAi) 之使用、體外流變過程 (亦稱為膜差濾及流變治療)、微晶片植入、幹細胞治療、基因替換治療、核糖核酸酵素基因治療 (包括用於缺氧反應元件之基因治療，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；以及 PDEF 基因治療，GenVec)、光受器/視網膜細胞移植 (包括可移植視網膜上皮細胞，Diacrin, Inc.；視網膜細胞移植物，例如，Astellas Pharma US, Inc., ReNeuron, CHA Biotech)、針灸術及其組合。
上文述及之該等聯合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，本發明之與人類 VEGF 及人類 ANG2 結合之抗體之投予可在投予其他一種或多種治療劑之前、同時及/或之後發生。在一個實施例中，本發明之與人類 VEGF 及人類 ANG2 結合之抗體之投予及其他治療劑之投予彼此在約一個、兩個、三個、四個或五個月內或者在約一週、兩週或三週內或者在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。
本發明之抗體 (及任何其他治療劑) 可透過任何合適的方式給藥，包括腸胃外、肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內給藥。腸胃道外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。給藥可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫給藥還是長期給藥。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次給藥、快速注射給藥和脈衝輸注。
本發明之抗體將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥和施用。此背景中考慮的因素包括待治療的特定疾病、待治療的特定哺乳動物、個別患者的臨床狀況、疾病的原因、遞送藥劑的部位、施用方法、施用日程及醫療從業者已知的其他因素。該抗體並非必須、但可以視情況與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。該等其他藥物的有效量視醫藥組成物中存在之抗體的量、疾病或治療的類型以及上文討論的其他因素而定。這些藥物通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。
對於疾病的預防或治療，本發明之抗體的適當劑量 (單獨使用或與一種或多種其他其他治療劑組合使用) 將取決於待治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重度和病程、為了預防或是治療的目的施用該抗體、之前的治療、患者的臨床病史和對該抗體的反應及主治醫師的判斷。在一次或一系列的治療中適宜地對患者投予抗體。根據疾病的類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.1mg/kg – -10mg/kg) 的抗體可為例如透過一次或多次分開的施用或透過連續輸注來對患者施用的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複給藥，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者施用約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇施用，例如每週或每三週施用 (例如，使得患者接受約兩種至約二十種或例如約六種劑量的抗體)。可以施用初始較高的負荷劑量，然後施用一種或多種較低的劑量。藉由習用技術和測定很容易監測此治療的進展。 E. 製成品
本發明的另一方面提供包含能夠有效治療、預防及/或診斷上述疾病材料的製成品。製成品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品仿單。合適的容器包括例如小瓶、注射器等。容器可由各種材料諸如玻璃或塑料形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防和/或診斷疾病的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之抗體。標籤或包裝說明書指示該組成物用於治療所選擇的疾病。
此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之抗體；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的包裝說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。 F. 裝置
本發明之抗體可使用眼部植入物投予眼部，在一個實施例中，使用端口輸送裝置投予。
端口輸送裝置為可植入、可再裝滿的裝置，其可以在幾個月的時間內 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 或更多個月) 釋放治療劑 (例如本發明之抗體)。可使用的例示性端口輸送裝置包括來自 ForSight Labs, LLC 和/或 ForSight VISION4 的那些，例如以下國際專利申請公開號WO 2010/088548、WO2015/085234、WO 2013/116061、WO 2012/019176、WO 2013/040247 及 WO 2012/019047 中所述的那些，該等國際專利申請全文以引用方式併入本文。
例如，本發明提供端口輸送裝置，其包括含有本文所述之任何抗體的儲器。端口輸送裝置可進一步包括近端區域、耦合至近端區域並與儲器流體連通的管狀主體以及一個或多個出口，該等一個或多個出口與儲器流體連通並且經組態以將組成物釋放到眼部。管狀主體的外徑可組態為透過眼部約 0.5 mm 或更小的切口或開口插入。裝置長度可為約 1 mm 至約 15 mm (例如，長約 1 mm、約 2 mm、約 4 mm、約 5 mm、約 6 mm、約 7 mm、約 9 mm、約 11 mm、約 13 mm 或約 15 mm)。儲器可具有任何合適的容積。在一些情況下，儲器可具有約 1 µl 至約 100 µl (例如，約 1 µl、約 5 µl、約 10 µl、約 20 µl、約 50 µl、約 75 µl 或約 100 µl) 的容積。裝置或其組成部件可由任何合適的材料 (例如聚醯亞胺) 製成。
在一些情況下，端口輸送裝置包括儲器，該儲器含有本文所述之任何抗體及一種或多種其他化合物。
在一些情況下，端口輸送裝置包括本文所述之任何抗體或抗體結合物及其他 VEGF 拮抗劑。 3. 本發明之具體實施例
下文中列述本發明之具體實施例。 1.      一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中 VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 ANG2 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基。 2.      一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中可變輕鏈域及可變重鏈域對同時與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合。 3.      一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中抗體與人類 VEGF-A 上的相同抗原決定位及人類 ANG2 上的相同抗原決定位結合，因為該抗體包含 SEQ ID NO:19 之可變重鏈域及 SEQ ID NO:20 之可變輕鏈域。 4.      一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含在一個可變輕鏈域 (VL 域) 及可變重鏈域 (VH 域) 同源對內的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位，其中 •       VEGF-A 互補位包含來自抗體之 CDR-H2、CDR-L1 及 CDR-L3 的胺基酸殘基，其中 ANG2 互補位包含來自抗體之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 的胺基酸殘基；及/或 •       可變輕鏈域及可變重鏈域對同時與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合；及/或 •       抗體與具有 SEQ ID NO:19 之可變重鏈域及 SEQ ID NO:20 之可變輕鏈域之抗體結合至人類 VEGF-A 上的相同抗原決定位及人類 ANG2 上的相同抗原決定位；及/或 •       該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2；及/或 •       該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度；及/或 •       該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度；及/或 •       包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 5.      如前述實施例中一者之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列。 6.      一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列。 7.      如前述實施例中一者之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 8.      一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中該 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 9.      如前述實施例中一者之抗體，其包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99，該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 10.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中抗體包含胺基酸殘基，該等胺基酸殘基包含於具有 SEQ ID NO:19 之 VH 域及 SEQ ID NO:20 之 VL 域的抗體的 VEGF-A 互補位及 ANG2 互補位中。 11.  如實施例 9 或 10 之抗體，其包含 -          VEGF-A 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66 及 D95；及 VL 域中之如下胺基酸殘基：I2、Y3、Y27、W27a、E32、R92、Y93、H94 及 P95；及 -          ANG2 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、R94、V96、F98 及 F99；及 VL 域中之如下胺基酸殘基：E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57 及 Y91。 12.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99，該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 13.  如實施例 12 之抗體，其包含 -          VEGF-A 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66 及 D95；及 VL 域中之如下胺基酸殘基：I2、Y3、Y27、W27a、E32、R92、Y93、H94 及 P95；及 -          ANG2 互補位，其包含 VH 域中之如下胺基酸殘基：H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、R94、V96、F98 及 F99；及 VL 域中之如下胺基酸殘基：E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57 及 Y91。 14.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。 15.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 16.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。 17.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、R66 及 R94；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、L46、F49 及 E57，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 18.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。 19.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。 20.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列，其中胺基酸取代位於 SEQ ID NO:19 之位置 1、2、4 至 25、28、35d 至 54、59、60、67 至 93、97、101 至 113 中的一者或多者；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列，其中胺基酸取代位於 SEQ ID NO:20 之位置 1、4 至 26、27b 至 27d、33 至 45、47、48、51、52、58 至 90、96 至 107，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。 21.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；及 VL 域 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。 22.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列。 23.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 SEQ ID NO: 19 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 20 之 VL 序列。 24.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其包含 SEQ ID NO: 19 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 20 之 VL 序列。 25.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:25 之輕鏈胺基酸序列。 26.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其包含 SEQ ID NO:24 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:25 之輕鏈胺基酸序列。 27.  如前述實施例中任一者之抗體，其包含 SEQ ID NO:17 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:18 之輕鏈胺基酸序列。 28.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其包含 SEQ ID NO:17 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO:18 之輕鏈胺基酸序列。 29.  如前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。 30.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121。 31.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體,，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。 32.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。 33.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其包含一對 VH 域及 VL 域：(i) VH 域，其包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (ii) VL 域，其包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。 34.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。 35.  如前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 36.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 37.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 38.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 39.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其包含一對 VH 域及 VL 域：(i) VH 域，其包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (ii) VL 域，其包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 40.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；其中該抗體之抗體 Fab 片段具有 70℃ 及更高的聚集起始溫度。 41.  如前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 42.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 43.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 44.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 45.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其包含一對 VH 域及 VL 域：(i) VH 域，其包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (ii) VL 域，其包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 46.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；其中該抗體之抗體 Fab 片段具有如動態光散射所測量之超過 80℃ 的解構溫度。 47. 如前述實施例中任一者之抗體，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 48.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 49.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體,，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 50.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 51.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其包含一對 VH 域及 VL 域：(i) VH 域，其包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (ii) VL 域，其包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 52.  一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 特異性結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO:21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列；該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO:22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO:23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；且該抗體包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO:19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO:20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。 53.  如前述實施例中任一項之抗體，其為單株抗體。 54.  如前述實施例中任一者之抗體，其為與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體片段。 55.  如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為雙特異性抗體。 56.  如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為 Fab 片段。 57.  如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為雙特異性抗體片段。 58.  如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體為多特異性抗體。 59.  如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體與人類 VEGF-A 特異性結合。 60.  如前述實施例中任一者之抗體，其中抗體與人類 ANG2 特異性結合。 61.  一種經分離之核酸，其編碼如實施例第 1 項至第 58 項中任一項所述之抗體。 62.  一種經分離之宿主細胞，其包含如實施例 59 之核酸。 63.  一種表現載體，其包含如實施例 61 之核酸。 64.  一種生產與人類 VEGF-A 及人類 ANG2　結合之抗體之方法，其包含培養如實施例 60 之宿主細胞，從而生產該抗體。 65.  如實施例第 64 項所述之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。 66.  如實施例 64 或 65 之方法，其中宿主細胞為大腸桿菌細胞。 67.  如實施例 64 或 65 之方法，其中宿主細胞為 CHO 細胞。 68.  一種抗體，其藉由如實施例 64 或 65 之方法來生產。 69.  一種醫藥調配物，其包含如實施例 1 至 60 中任一者之抗體及醫藥上可接受之載劑。 70.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體，其用為藥物。 71.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體，其用於治療血管疾病。 72.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體，其用於治療眼部血管疾病。 73.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 65 之醫藥組成物在製造藥物中之用途。 74.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 65 之醫藥組成物在製造用於抑制血管生成之藥物中之用途。 75.  一種治療患有血管疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物。 76.  一種治療患有眼部血管疾病之個體的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物。 77.  一種抑制個體中之血管生成的方法，該方法包含向該個體投予有效量之如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物以抑制血管生成。 78.  一種端口輸送裝置，其包含如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物。 79.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物藉由端口輸送裝置進行眼部投予。 80.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物藉由如實施例 79 之端口輸送裝置進行眼部投予，其中在端口輸送裝置再裝滿之前，於六個月或更長時間內投予，在一個實施例中，於 8 個月或更長時間內投予，在一個實施例中，於 9 個月或更長時間內投予。 81.  如實施例 1 至 60 中任一者之抗體或如實施例 69 之醫藥調配物用為藥物，其藉由使用端口輸送裝置投予抗體或醫藥調配物，其中抗體以 150 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置，在一個實施例中，以 200 mg/ml 或更高的濃度應用於端口輸送裝置。 胺基酸序列說明
SEQ ID NO: 1 P1AA8906 之 VH 域 DFQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASYEFEYDDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGGSTYYNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGFFDMWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 2 P1AA8906 之 VL 域 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSNYLAWYQQKPGKAPKLLIFDARWLVHGVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIK
SEQ ID NO: 3 P1AA8906、P1AA0902 及 P1AD9820 之 H-CDR1 DDMS
SEQ ID NO: 4 P1AA8906 之 H-CDR2 SISPKGGSTYYNTKFIG
SEQ ID NO: 5 P1AA8906 之 H-CDR3 DVGFFDM
SEQ ID NO: 6 P1AA8906 之 L-CDR1 HGSYWLSNYLA
SEQ ID NO: 7 P1AA8906 之 L-CDR2 DARWLVH
SEQ ID NO: 8 P1AA8906、P1AA0902 及 P1AD9820 之 L-CDR3 QQYRYHPYT
SEQ ID NO: 9 P1AA8906 Fab 片段之重鏈 DFQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASYEFEYDDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGGSTYYNTKFIGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGFFDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
SEQ ID NO: 10 P1AA8906 Fab 片段之輕鏈 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLSNYLAWYQQKPGKAPKLLIFDARWLVHGVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 11 P1AA0902 之 VH 域 DDHLVESGGGLVKPGGSLRLSCATADFFEYDDMSWVRQAPGKGLEWVGSISGRGDHKYLNTKFIGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGFFDWWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 12 P1AA0902 之 VL 域 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIFDGDFKVFDVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIK
SEQ ID NO: 13 P1AA0902 之 H-CDR2 SISGRGDHKYLNTKFIG
SEQ ID NO: 14 P1AA0902 及 P1AD9820 之 H-CDR3 DVGFFDW
SEQ ID NO: 15 P1AA0902 之 L-CDR1 HGSYWLNSELA
SEQ ID NO: 16 P1AA0902 之 L-CDR2 DGDFKVF
SEQ ID NO: 17 P1AA0902 Fab 片段之重鏈 DDHLVESGGGLVKPGGSLRLSCATADFFEYDDMSWVRQAPGKGLEWVGSISGRGDHKYLNTKFIGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGFFDWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
SEQ ID NO: 18 P1AA0902 Fab 片段之輕鏈 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSELAWYQQKPGKAPKLLIFDGDFKVFDVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 19 P1AD9820 之 VH 域 SEHLVESGGGLVKPGGSLRLSCATADFFEYDDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGFFDWWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 20 P1AD9820 之 VL 域 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSEVAWYQQKPGKAPKLLIFDGDFKVYEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIK
SEQ ID NO: 21 P1AD9820 之 H-CDR2 SISPKGDHKYLNTKFIG
SEQ ID NO: 22 P1AD9820 之 L-CDR1 HGSYWLNSEVA
SEQ ID NO: 23 P1AD9820 之 L-CDR2 DGDFKVY
SEQ ID NO: 24 P1AD9820 Fab 片段之重鏈 SEHLVESGGGLVKPGGSLRLSCATADFFEYDDMSWVRQAPGKGLEWVGSISPKGDHKYLNTKFIGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVGFFDWWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT
SEQ ID NO: 25 P1AD9820 Fab 片段之輕鏈 AIYMHQEPSSLSASVGDRVTITCHGSYWLNSEVAWYQQKPGKAPKLLIFDGDFKVYEVPSRFSGSGSHEDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYRYHPYTFGHGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 26 人類 VEGF MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
SEQ ID NO: 27 人 ANG2 MWQIVFFTLSCDLVLAAAYNNFRKSMDSIGKKQYQVQHGSCSYTFLLPEMDNCRSSSSPYVSNAVQRDAPLEYDDSVQRLQVLENIMENNTQWLMKLENYIQDNMKKEMVEIQQNAVQNQTAVMIEIGTNLLNQTAEQTRKLTDVEAQVLNQTTRLELQLLEHSLSTNKLEKQILDQTSEINKLQDKNSFLEKKVLAMEDKHIIQLQSIKEEKDQLQVLVSKQNSIIEELEKKIVTATVNNSVLQKQQHDLMETVNNLLTMMSTSNSAKDPTVAKEEQISFRDCAEVFKSGHTTNGIYTLTFPNSTEEIKAYCDMEAGGGGWTIIQRREDGSVDFQRTWKEYKVGFGNPSGEYWLGNEFVSQLTNQQRYVLKIHLKDWEGNEAYSLYEHFYLSSEELNYRIHLKGLTGTAGKISSISQPGNDFSTKDGDNDKCICKCSQMLTGGWWFDACGPSNLNGMYYPQRQNTNKFNGIKWYYWKGSGYSLKATTMMIRPADF
SEQ ID NO: 28 人 VEGFA-121 MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKCDKPRR
SEQ ID NO: 29 Nesvacumab LC IVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYDNSQTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 30 Nesvacumab HC AVQLVASGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDIHWVRQATGKGLEWVSAIGPAGDTYYPGSVKGRFTISRENAKNSLYLQMNSLRAGDTAVYYCARGLITFGGLIAPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK   
實例
提供以下實例以幫助理解本發明，但本發明之真實範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。 材料與一般方法 人類 VEGF-A121 親和力 Kinexa ：• 儀器 及方法：
使用來自 Sapidyne Instruments (Boise, ID) 的 KinExA 3200 儀器，其配備自動進樣器。聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 珠粒購自 Sapidyne，抗 VEGF 抗體購自 R&D Systems (Mab293, BAF293)。鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物購自 Thermo Fisher scientific (S21374)。PBS (磷酸鹽緩衝生理食鹽水)、BSA (牛血清白蛋白組分 V)、VEGFA-121 (SEQ ID NO:28) 在內部 (Roche) 製備。 • 抗原塗布珠粒的製備
PMMA 珠粒根據 KinExA 手冊方案 (吸附塗層，Sapidyne) 進行塗布。首先，向每小瓶 (200 mg) 用於吸附塗層的珠粒中加入於 1 ml PBS (pH 7.4) 中之 30 µg 抗 VEGF-抗體 MAB293 (R&D)。於室溫下旋轉 2 小時後，除去上清液，並用 1 ml 封閉液 (10 mg/ml BSA 緩衝劑) 注滿，然後振搖 1 小時。 • KinExA 平衡測定
所有 KinExA 實驗均於室溫 (RT) 下進行，使用含 0.01% BSA 及 0.01% Tween20 (BioRad, #161-0781) 的 PBS pH 7.4 作為運行緩衝劑。在 LowCross 緩衝劑 (Candor Bioscience) 中製備樣品和珠粒，以減少在之前測量中觀察到的非特異性結合。所用流速為 0.25 ml/min。藉由從 4 nM 開始的兩倍系列稀釋 (濃度範圍 1.95 pM – 4000 pM)，用被測抗體滴定恆定量之 VEGFA-121-His (50 pM，在第二個實驗中為 500 pM)。將抗原-抗體複合物於室溫下培育至少 8 小時以使其達到平衡。然後使平衡後之混合物透過 KinExA 系統中之抗 VEGF 抗體 (Mab293) 偶合珠粒的管柱， (對於 50 pM 恆定 VEGF，的體積為 750 µl；對於 500 pM 恆定 VEGF，體積為 125 µl)，以使未結合之 VEGFA-121 被珠粒捕獲而不干擾溶液之平衡狀態。結合之 VEGFA-121 的檢測使用濃度為 250 ng/ml 的第二生物素化抗 VEGF 抗體 (BAF293)，然後注入樣品緩衝劑中之 250 ng/ml 鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物。在所有平衡實驗中，每個樣品皆重複測量兩次。使用 KinExA 軟體 (4.0.11 版) 內包含的單點同質結合模型，用「標準分析」方法對資料進行非線性回歸分析，獲得 K D。軟體藉由將資料點擬合至理論 K D曲線來計算 K D並確定 95% 信賴區間。95% 信賴區間以 K D低和 K D高給出。
在最終 K D確定中，用不同之恆定 VEGFA-121 濃度，測量兩次 n 曲線測定。n 曲線分析可用於在同一軸上分析多個標準 K D實驗，以獲得更準確的 K D測定結果。 人類 ANG2 親和力 Kinexa ：• 儀器及材料
使用來自 Sapidyne Instruments (Boise, ID) 的 KinExA 3200 儀器，其配備自動進樣器。聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 珠粒購自 Sapidyne，抗 Ang2 抗體購自 R&D Systems (MAB098, BAM0981)。鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物購自 Thermo Fisher scientific (S21374)。PBS (磷酸鹽緩衝生理食鹽水)、BSA (牛血清白蛋白組分 V)、Ang2 (SEQ ID NO:27) 在內部 (Roche) 製備。 • 抗原塗布珠粒的製備
PMMA 珠粒根據 KinExA 手冊方案 (吸附塗層，Sapidyne) 進行塗布。首先，向每小瓶 (200 mg) 用於吸附塗層的珠粒中加入於 1 ml PBS (pH 7.4) 中之 20 µg 抗 Ang2-抗體 MAB098 (R&D)。於室溫下旋轉 2 小時後，除去上清液，並用 1 ml 封閉液 (10 mg/ml BSA 緩衝劑) 注滿，然後振搖 1 小時。 • KinExA 平衡測定
所有 KinExA 實驗均於室溫 (RT) 下進行，使用含 0.01% BSA 及 0.01% Tween20 (BioRad, #161-0781) 的 PBS pH 7.4 作為運行緩衝劑。在 LowCross 緩衝劑 (Candor Bioscience) 中製備樣品和珠粒，以減少在之前測量中觀察到的非特異性結合。所用流速為 0.25 ml/min。藉由從 4 nM 開始兩倍系列稀釋 (濃度範圍 1.95 pM – 4000 pM)，用被測抗體滴定恆定量之 Ang2-RBD-muFc (50 pM，在第二個實驗中為 500 pM)。將抗原-抗體複合物於室溫下培育至少 8 小時以使其達到平衡。然後使平衡後之混合物透過 KinExA 系統中之抗 Ang2 抗體 (MAB098) 偶合珠粒的管柱 (對於 50 pM 恆定 Ang2，體積為 750 µl；對於 500 pM 恆定 Ang2，體積為 188 µl)，以使未結合之 Ang2 被珠粒捕獲而不干擾溶液之平衡狀態。結合之 Ang2 的檢測使用濃度為 250 ng/ml 的第二生物素化抗 Ang2 抗體 (BAM0981)，然後注入樣品緩衝劑中之 250 ng/ml 鏈黴親和素 Alexa Fluor™ 647 結合物。在所有平衡實驗中，每個樣品皆重複測量兩次。使用 KinExA 軟體 (4.0.11 版) 內包含的單點同質結合模型，用「標準分析」方法對資料進行非線性回歸分析，獲得 K D。軟體藉由將資料點擬合至理論 K D曲線來計算 K D並確定 95% 信賴區間。95% 信賴區間以 K D低和 K D高給出。
在最終 K D確定中，用不同之恆定 Ang2 濃度，測量兩次 n 曲線測定。n 曲線分析可用於在同一軸上分析多個標準 K D實驗，以獲得更準確的 K D測定結果。 藉由表面電漿子共振 (SPR) 所評估的人類 VEGF-A 結合動力學：
抗 His 捕獲抗體 (GE Healthcare 28995056) 使用標準胺偶合化學固定在 Series S Sensor Chip C1 (GE Healthcare BR100535) 上，得到約 600 個共振單位 (RU) 之表面密度。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液。將人類 VEGF-A121-His 捕獲到表面，所得配體密度分別為約 10 RU 及 20 RU。將被測抗體之一系列稀釋液 (3.7 – 300 nM，稀釋比 1:3) 各自以 30 µl/min 之流速連續注射 60 秒，以監測 3600 秒的解離 (單循環動力學)。藉由在 60 秒內以 5 µl/min 的流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 1.5 來再生表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自不含經捕獲之人類 VEGF-A121 的對照流動池獲得之反應，校正本體折射率差。採用 Biacore 評估軟體內的 1:1 Langmuir 結合模型進行曲線擬合。 在交叉反應性測試中藉由表面電漿子共振 (SPR) 評估 VEGF-A 結合動力學：
抗 His 捕獲抗體 (GE Healthcare 28995056) 使用標準胺偶合化學固定在 Series S Sensor Chip C1 (GE Healthcare BR100535) 上，得到約 600 個共振單位 (RU) 之表面密度。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液。將來自指定物種的 VEGF-A121-His 捕獲到表面，所得配體密度分別為約 10 RU 及 20 RU。將被測抗體之一系列稀釋液 (3.7 – 300 nM，稀釋比 1:3) 各自以 30 µl/min 之流速連續注射 60 秒，以監測 3600 秒的解離 (單循環動力學)。藉由在 60 秒內以 5 µl/min 的流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 1.5 來再生表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自不含經捕獲之 VEGF-A121 的對照流動池獲得之反應，校正本體折射率差。採用 Biacore 評估軟體內的 1:1 Langmuir 結合模型進行曲線擬合。 藉由表面電漿子共振 (SPR) 所評估的人類 ANG2 結合動力學：
抗 Fab 捕獲抗體 (GE Healthcare 28958325) 使用標準胺偶合化學固定在 Series S Sensor Chip C1 (GE Healthcare BR100535) 上，得到約 800 個共振單位 (RU) 之表面密度。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝劑，測量溫度為 25℃。藉由在 60 秒內以 5 µl/min 的流速注入 50 nM 溶液來捕獲被測抗體。藉由在 180 秒內以 30 µl/min 的流速 (0.07 nM - 50 nM，稀釋比 1:3) 注入溶液中不同濃度之人類 Ang2-RBD 來測量結合。監測解離相最多 900 秒，並藉由將流速為 30 µl/min 之樣品溶液切換為運行緩衝劑來觸發解離相。藉由在 60 秒內以 30 µl/min 的流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 2.1 來再生表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自不含被測抗體的參考流動池獲得之反應，校正本體折射率差。採用 Biacore 評估軟體內的 1:1 Langmuir 結合模型進行曲線擬合。 在反應性測試中藉由表面電漿子共振 (SPR) 評估 ANG2 結合動力學：
抗 Fab 捕獲抗體 (GE Healthcare 28958325) 使用標準胺偶合化學固定在 Series S Sensor Chip C1 (GE Healthcare BR100535) 上，得到約 800 個共振單位 (RU) 之表面密度。使用 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝劑，測量溫度為 25℃。藉由在 60 秒內以 5 µl/min 的流速注入 50 nM 溶液來捕獲被測抗體。藉由在 180 秒內以 30 µl/min 的流速 (0.07 nM - 50 nM，稀釋比 1:3) 注入溶液中來自指定物種的不同濃度之 Ang2-RBD 來測量結合。監測解離相最多 600 秒，並藉由將流速為 30 µl/min 之樣品溶液切換為運行緩衝劑來觸發解離相。藉由在 60 秒內以 30 µl/min 的流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 2.1 來再生表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自不含經捕獲之抗體的參考流動池獲得之反應，校正本體折射率差。採用 Biacore 評估軟體內的 1:1 Langmuir 結合模型進行曲線擬合。 用表面電漿子共振 (SPR) 評估與標靶抗原之獨立結合
藉由使用由 GE Healthcare 提供的胺偶合套組，在 pH 5.0 下將大約 5000 個共振單位 (RU) 的捕獲系統 (抗 Fab 捕獲抗體 (GE Healthcare 28958325)) 偶合至 CM5 晶片 (GE Healthcare BR100530)。樣品及系統緩衝劑為 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20)。將流動池之溫度設定為 25℃，並將樣品塊之溫度設定為 12℃。捕獲前，將流動池用運行緩衝劑灌注三次。
藉由在 60 秒內以 5 µl/min 的流速注入 6.5 µg/ml 溶液來捕獲雙特異性 Fab。藉由確定每種配體的活性結合能力來分析每種配體與雙特異性 Fab 之獨立結合，其中各抗體依次或同時添加 (流速 10 µl/min)： 1)     在 60 秒內注入濃度為 1 µg/ml 的人類 VEGFA-121 (鑑定抗原之單一結合)。 2)     在 60 秒內注入濃度為 5 µg/ml 的人類 Ang2 (鑑定抗原之單一結合)。 3)     在 60 秒內注入濃度為 1 µg/ml 的人類 VEGFA-121，然後在 60 秒內額外注入濃度為 5 µg/ml 的人類 Ang2 (鑑定在 VEGFA-121 存在下 Ang2 之結合)。 4)     在 60 秒內注入濃度為 5µg/ml 的人類 VEGFA-121，然後在 60 秒內額外注入濃度為 1µg/ml 的人類 Ang2 (鑑定在 Ang2 存在下 VAGFA-121 之結合)。 5)     在 60 秒內共同注入濃度為 1 µg/ml 的人類 VEGFA-121 及濃度為 5 µg/ml 的人類 Ang2 (同時鑑定 VEGFA-121 及 Ang2 之結合)。
藉由在 60 秒內以 30 µl/min 的流速注入 10 mM 甘胺酸 pH 2.1 來再生表面。藉由扣除空白注射且藉由扣除自不含經捕獲之雙特異性 Fab 的參考流動池獲得之反應，校正本體折射率差。如果方法 3、4 及 5 所得最終訊息等於方法 1 及方法 2 之單個最終訊息之總和，則雙特異性抗體能夠相互獨立地結合兩個抗原。 熱穩定性：
在 20 mM 組胺酸/組胺酸氯化物、140 mM NaCl (pH 6.0) 中製備濃度為 1 mg/mL 的雙特異性抗體 Fab 片段樣品，並將其轉移至 10 µL 微量比色皿陣列。使用 UNcle 儀器 (Unchained Labs)，記錄 266 nm 激發後之靜態光散射以及螢光資料，同時樣品以 0.1℃/min 的速率從 30℃ 加熱至 90℃。樣品重複測量三次。
藉由 UNcle 分析軟體完成對起始溫度的評估。聚集起始溫度定義為散射光強度開始增加的溫度。藉由螢光訊息之重心均值 (BCM) 隨溫度之變化來監測蛋白質之變性。解構溫度定義為 BCM (nm) vs. 溫度曲線之反曲點。 物化穩定性：
在 20 mM His/HisCl、140 mM NaCl (pH 6.0) 中配製抗體樣品，並分成三份：一份分別重新加入 PBS 緩衝劑中，兩份保留原始調配物。將 PBS 等分試樣及一份 His/HisCl 等分試樣於 40℃ (His/NaCl) 或 37℃ (PBS) 下以 1 mg/ml 培育 2 週 (2w)，將 PBS 樣品進一步培育總共 4 週 (4w)。將第三個對照等分試樣儲存於 -80℃ 下。培育結束後，分析樣品之相對活性濃度 (Biacore；將每種結合物之兩個應力等分試樣之活性濃度標準化至未受應力之 4℃ 等分試樣)、聚集 (SEC) 及片段化 (毛細管電泳或 SDS-PAGE、CE-SDS) 並與未經處理之對照進行比較。 在功能穩定性測試中藉由 SPR 評估人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合動力學
VEGFA-121 (內部)、蛋白質 A (Pierce/Thermo Scientific 21181) 及抗人類 Fab 捕獲抗體 (GE Healthcare 28958325) 使用標準胺偶合化學固定在 Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare 29104988) 上，得到表面密度為 3000 個共振單位 (RU) 的 hVEGFA-121 及蛋白質 A 以及 12000 個共振單位 (RU) 的抗人類 Fab 捕獲抗體。使用 HBS-N (10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.4, GE Healthcare) 作為運行及稀釋緩衝劑。在以下濃度測量中，使用 HBS-P (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 界面活性劑 P20；GE Healthcare) 作為樣品及運行緩衝劑。將流動池之溫度設定為 25℃，並將樣品塊之溫度設定為 12℃。在濃度測量之前，將流動池用運行緩衝劑灌注兩次。首先，藉由在 120 秒內以 10 µl/min 的流速注入 10 µg/ml 溶液來捕獲人類 Ang2-RBD-hFc 二聚體。將被測抗體在 60 秒內以 5 µl/min 的流速注入溶液中，濃度為 1 µg/ml。監測解離相最多 30 秒，並藉由將樣品溶液切換為運行緩衝劑來觸發解離相。
用 10 mM 甘胺酸 pH 2.0 溶液在 30 µl/min 的流速下洗滌 30 秒，使 hVEGFA-121 表面再生。用 10 mM 甘胺酸 pH 1.5 溶液在 30 µl/min 的流速下洗滌 30 秒，使蛋白質 A 表面再生。最後，用 10 mM 甘胺酸 pH 2.1 溶液在 30 µl/min 的流速洗滌 60 秒，使抗人類 Fab 抗體表面再生。
藉由扣除由空白表面所獲得之反應，以校正本體折射率差。在評估時，採用結合反應。
藉由將每個溫度應力樣品與相應的非應力樣品進行比較，計算相對活性濃度。
Figure 02_image001
為使抗原之結合訊息標準化，將 hVEGF-A121 結合及 Ang2 結合標準化為抗體樣品之抗 Fab 結合：
Figure 02_image003
實例 1 ： 雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之生成
藉由獨立篩選與 VEGF-A 及 ANG2 結合之單特異性抗體，隨後藉由如前所述的方法 (例如在 WO2012/163520 中) 將胺基酸序列併入形成與 VEGF-A 及 ANG2 結合之 Fab 片段的雙互補位 HC/LC 對，生成雙特異性抗 VEGF-A/抗 ANG2 Fab 片段。
利用兩個不同的合成 Fab 片段之噬菌體展示文庫，其中在第一噬菌體展示文庫中，Fab 片段之 CDR-H1、CDR-H3 及 CDR-L2 區的殘基多樣化，其中在第二個噬菌體展示文庫中，Fab 片段之 CDR-L1、CDR-L3 及 CDR-H2 區內的殘基多樣化。在每個文庫中，其他三個 CDR 區作為不變之仿真序列保持非多樣化。在兩個文庫中，Fab 片段之 CH1 域通過連接子與截短之基因 III 蛋白融合，以促進噬菌體展示。
藉由噬菌體文庫淘選，第一個文庫富集抗人類 ANG2 之結合物 (binder)，第二個文庫富集抗人類 VEGF-A 之結合物。淘選後，針對兩個富集的噬菌粒載體池生成質體小量製備物。將小量製備物用限制酶消化以切除編碼截短的基因-III 蛋白之區域，並藉由連接重新環化以分別獲得編碼富含 ANG2 結合物或 VEGF-A 結合物的可溶性 Fab 片段的表現載體池。將這些載體池轉化到 TG1 大腸桿菌細胞中，挑取並培養單個菌落，以便在微量滴定板中可溶性表現單個 Fab 選殖株。使用標準 ELISA 方法篩選包含可溶性 Fab 片段的上清液與 ANG2 或 VEGF-A 之結合，並對產生特異性結合物的 TG1 選殖株進行 DNA 質體製備及定序，以分別獲得與 ANG2 或 VEGF-A 特異性結合的 VH 及 VL 序列對。
一對雙特異性抗 VEGF-A/抗 ANG2 VH 及 VL 序列用電腦模擬設計如下：(1) 將 ANG2 特異性 Fab 之 VH 序列中之無關 VH 殘基 52b 至 65 替換為 VEGF-A 特異性 Fab 之選定 VH 殘基 52b 至 65，由此將可能作為 VEGF-A 特異性互補位之一部分的 CDR-H2 殘基替換到 ANG2 結合物重鏈中；及 (2) 將 VEGF-A 特異性 Fab 之 VL 序列中之無關 VL 殘基 49 至 57 替換為 ANG2 特異性 Fab 之 VL 殘基 49 至 57，由此將可能作為 ANG2 特異性互補位之一部分的 CDR-L2 殘基替換到 VEGF-A 結合物輕鏈中。 實例 2 ： 雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段 P1AA8906 之表現
合成所設計的雙特異性抗 VEGF-A/抗 ANG2 VH 及 VL 序列，並將其選殖到具有編碼 CH1 及 Cκ 域的基因序列的框內的大腸桿菌表現載體中。將載體轉化到 TG1 大腸桿菌細胞中，並培養單個菌落以可溶性表現雙特異性抗體 Fab 片段。藉由親和層析從 TG1 培養上清液中純化雙特異性抗體，驗證了與 ANG2 及 VEGF-A 之特異性結合。
選擇雙特異性抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體「P1AA8906」，其特徵在於包含 SEQ ID NO:9 之重鏈及 SEQ ID NO:10 之輕鏈。
為進一步分析，藉由標準重組方法將本發明之抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體轉化到 CHO 細胞中並由 CHO 表現。 實例 3 ： 雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段 P1AA8906 之表徵
如上文「材料與一般方法」部分所述，藉由 SPR 及 KinExA 評估雙特異性抗體 P1AA8906 之 結合親和力。 表 1: 人類 VEGFA-121 結合：
KinExA SPR
K D K D高 K D低 信賴區間 ka [1/Ms] kd [1/s] t1/2 [min] K D[pM]
10.86 pM 47.94 pM ＜39.23 fM 95% 1.66E+06 (4.53E-06)* 2551 (3)*
* 超出 Biacore® 規格
KinExA 分析在以下條件下進行：VEGF-A-121 濃度：100 pM / 1000 pM (CBP)，P1AA8906 4 nM – 0 pM (稀釋比 1:2，12 倍)，於室溫下預培育約 8 小時。 表 2: 人類 ANG2 結合：
KinExA SPR
K D K D高 K D低 信賴區間 ka [1/Ms] kd [1/s] t1/2 [min] K D[pM]
7.18 nM 12.67 nM ＜3.45 nM 95% 7.03E+06 3.20E-02 0.4 4554
KinExA 分析在以下條件下進行：VEGF-A-121 濃度：100 pM / 1000 pM (CBP)，P1AA8906 4 nM – 0 pM (稀釋比 1:2，12 倍)，於室溫下預培育約 8 小時。
如上文「材料與一般方法」部分所述，評估雙特異性抗體 P1AA8906 之 熱穩定性。 表 3: 熱穩定性
Tagg (℃) Tm (℃) DLS
73.7 85.7
如上文「材料與一般方法」部分所述，評估雙特異性抗體 P1AA8906 之 物化穩定性。 表 4: 物化穩定性 (SEC)
   T0 (His/NaCl) 2w 40℃ (His/NaCl) T0 (PBS) 2w 37℃ (PBS) 4w 37℃ (PBS)
單體 [%] 97.2 96.9 97.5 95.3 92.6
HMW [%] 2.8 3.1 2.5 4.7 7.4
表 5: 物化穩定性 (CE-SDS)
   T0 (His/NaCl) 2w 40℃ (His/NaCl) T0 (PBS) 2w 37℃ (PBS) 4w 37℃ (PBS)
單體 [%] 98.5 97.9 95.6 94.8 93.0
HMW [%] 1.5 2.1 4.4 5.2 7.0
實例 4 ： 雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段 P1AA8906 之改善
如上所示，P1AA8906 在表現出對 VEGF-A 之高熱穩定性及有利的親和力的同時，表現出在奈米莫耳範圍內的對 ANG2 的親和力以及形成在應力下增加的高分子量雜質的趨勢。對於需要將治療劑注入眼內的眼部血管疾病的治療，需要提供對標靶抗原具有高親和力及非常高濃度的治療劑，以提高治療效果之持久性並最大程度減少患者的不便。因此，為達到預期目的，需要提高親和力並改善物化穩定性。
因此，為實現臨床應用，需要進一步改善抗體，例如關於 ANG2 結合 (特別是藉由改善解離率) 並降低對應力的敏感性。藉由在 VH 及 VL 域中引入不同的胺基酸取代進行多輪熟化。在成熟過程中，根據在產率、親和力、同時抗原結合、親水性、穩定性、黏度及其他參數等方面所需的特性，篩選並選擇來源於抗體 P1AA8906 的候選抗體。
從多種經測試之候選抗體分子中選擇改善之候選抗體 P1AA0902。從該分子開始，再次藉由在 VH 及 VL 域中引入不同的胺基酸取代，進行更多輪優化。候選物選擇基於其所需的特性，特別是改善 ANG2 結合並確保高濃度下之可注射性，同時保持其他有利特性，例如 VEGF-A 親和力、同時抗原結合及熱穩定性。
從多種經測試之候選抗體分子中選擇進一步改善之候選抗體 P1AD9820。 表 6: 雙特異性 Fab 片段 P1AA8906 、 P1AA0902 、 P1AD9820 之胺基酸序 ( 編號是指如本文所用之 SEQ ID NO)
VH VL 重鏈 輕鏈
P1AA8906 1 2 9 10
P1AA0902 11 12 17 18
P1AD9820 19 20 24 25
圖 2 及圖 3示出生成的雙特異性片段的可變重鏈域及可變輕鏈域的對齊方式。VH 及 VL 域內的胺基酸位置的編號是根據 Kabat 編號系統。為簡單起見，附圖中包含編號，進一步示出骨架及 CDR 胺基酸位置。
候選抗體之表現如實例 2 所述。 實例 5 ： 經改善之抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之抗原結合動力學
如上所述，使用指定的 Fab 片段 (胺基酸序列如 表 4所示) 評估候選抗體與 與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 的結合動力學。為比較本發明之抗體與現有技術分子 Faricimab (INN，先前亦稱為 RG7716)、抗 VEGF 結合物阿柏西普 (Aflibercept) (INN) 及 Brolucizumab (INN) 和抗 ANG2 結合物 Nesvacumab (INN) 的抗原結合動力學，上述現有技術抗體藉由重組表現其各自 INN 中揭示的相同胺基酸序列來製備。參考分子在本文中亦稱為「類似物」，以強調它們是內部製劑。 表 7: 人類 VEGFA-121 結合 (KinExA)
K D K D高 K D低 信賴區間
P1AA8906 10.86 pM 47.94 pM ＜39.23 fM 95%
P1AA0902 11.41pM 32.81pM 295.81fM 95%
P1AD9820 3.85pM 11.22pM 175.67fM 95%
表 8: 人類 VEGFA-121 結合 (SPR)
ka [1/Ms] kd [1/s] t1/2 [min] K D[pM]
P1AA8906 1.66E+06 (4.53E-06)* 2551 (3)*
P1AA0902 7.37E+05 (8.27E-06)* 1396 (11)*
P1AD9820 7.27E+05 (5.82E+06)* 1986 (8)*
* 超出 Biacore® 規格 表 9: 人類 VEGF-A 結合 ( 如 KinExA 所測量之 K D)
分子 VEGFA-121 VEGFA-165
P1AD9820 約 4 pM 約 2 pM
Faricimab (RG7716) 169 pM 224 pM
阿柏西普類似物 0.2 pM 0.1 pM
Brolucizumab 類似物 2 pM  1 pM
表 10: 人類 ANG2 結合 (KinExA)
K D K D高 K D低 信賴區間
P1AA8906 7.18 nM 12.67 nM ＜3.45 nM 95%
P1AA0902 2.75pM 14.23pM 9.92fM 95%
P1AD9820 1.72pM 6.55pM 6.22fM 95%
表 11: 人類 ANG2 結合 (SPR)
ka [1/Ms] kd [1/s] t1/2 [min] K D[pM]
P1AA8906 7.03E+06 3.20E-02 0.4 4554
P1AA0902 5.51E+06 1.06E-04 109 19
P1AD9820 7.43E+06 5.78E-05 200 8
表 12: 人類 ANG2 結合 ( 如 KinExA 所測量之 K D)
分子 VEGFA-121
P1AD9820 約 2 pM
Faricimab (RG7716) 7 nM
Nesvacumab 類似物 10 pM
如上文「材料與一般方法」部分所述，藉由 SPR 分析候選抗體與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 之 獨立結合。 表 13: 與人類 VEGFA-121 及人類 ANG2 之獨立結合
分子    注射 1 注射 2 訊息 [%]
P1AA8906 1) VEGFA-121 HBS-P 50
2) Ang2-RBD HBS-P 50
3) VEGFA-121 Ang2-RBD 82
4) Ang2-RBD VEGFA-121 91
5) 混合物 (VEGF + Ang2) HBS-P 100
P1AA0902 1) VEGFA-121 HBS-P 50
2) Ang2-RBD HBS-P 50
3) VEGFA-121 Ang2-RBD 85
4) Ang2-RBD VEGFA-121 90
5) 混合物 (VEGF + Ang2) HBS-P 102
P1AD9820 1) VEGFA-121 HBS-P 50
2) Ang2-RBD HBS-P 50
3) VEGFA-121 Ang2-RBD 85
4) Ang2-RBD VEGFA-121 92
5) 混合物 (VEGF + Ang2) HBS-P 104
如上文「材料與一般方法」部分所述，評估與來自其他物種的 VEGF-A 及 ANG2 之 交叉反應性。 表 14: P1AD9820 Fab 片段與來自其他物種的 VEGF‑A 之交叉反應性之評估
ka [1/Ms] kd [1/s] t1/2 [min] K D* [pM]
人 VEGF-A-121 4.86E+05 2.21E-05 523 45.5
小鼠 VEGF-A-121 4.97E+05 1.83E-04 63 368.1
兔 VEGF-A-121 結合極低
豬 VEGF-A-121 1.79E+05 4.99E-04 23 2790
*K D取決於測定設置。所示 K D對於上述交叉反應性測試的設置有效。 表 15: P1AD9820 Fab 片段與來自其他物種的 ANG2 之交叉反應性之評估
ka [1/Ms] kd [1/s] t1/2 [min] K D* [pM]
人 ANG2 1.02E+07 2.64E-05 437 3
小鼠 ANG2 8.11E+06 7.43E-04 16 92
兔 ANG2 9.91E+06 5.33E-05 217 5
豬 ANG2 7.82E+06 1.05E-04 110 13
食蟹獼猴 ANG2 9.98E+06 1.56E-05 741 2
*K D取決於測定設置。所示 K D對於上述交叉反應性測試的設置有效。 實例 6 ： 經改善之抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之熱穩定性
如上文「材料與一般方法」部分所述並採用與實例 3 相同的條件，評估所示雙特異性抗體之熱穩定性。 表 16: 熱穩定性
Tagg (℃) Tm (℃)
P1AA8906 73.7 85.7
P1AA0902 70.2 83.5
P1AD9820 71.6 81.3
Faricimab (RG7716) 64.7 63.6
實例 7 ： 經改善之雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之生物物理特性 ( 穩定性 )
如上文「材料與一般方法」部分所述並採用與實例 3 相同的條件，評估所示雙特異性抗體之物化穩定性。 表 17: 物化穩定性 (SEC)
   T0 (His/NaCl) 2w 40℃ (His/NaCl) 4w 40℃ (His/NaCl) T0 (PBS) 2w 37℃ (PBS) 4w 37℃ (PBS)
P1AA8906
單體 [%] 97.2 96.9    97.5 95.3 92.6
HMW [%] 2.8 3.1    2.5 4.7 7.4
P1AA0902
單體 [%] 98.80 99.64 99.44 98.80 99.02 98.35
HMW [%] 0.20 0.36 0.56 0.20 0.98 1.65
P1AD9820
單體 [%] 99.00 98.17    99.00 97.43 96.90
HMW [%] 1.00 1.83    1.00 2.57 3.10
實例 8 ： 經改善之雙特異性抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之生物物理特性 ( 藉由動態光散射 (DLS) 評估黏度 )
如前文所述的 P1AA0902 和 P1AD9820 Fab 片段藉由標準方法在大腸桿菌細胞中表現。
用前文所述的乳膠-珠粒 DLS 方法測量黏度 (He F 等人；Anal Biochem. 2010 Apr 1;399(1):141-3)。具體而言，按照以下方案使用指定材料進行評估。 黏度評估： 儀器及材料 •       Wyatt DLS 酶標儀，配備 Greiner Bio-One 微孔板 •       3000 系列 Nanosphere™ 尺寸標準品 (Thermofisher 型錄號碼 3300A) •       Tween 20 (Roche，型錄號碼11332465001) 及矽油 (例如 Alfa Aesar 型錄號碼A12728) •       用於濃度測定的紫外光度計 (例如 Nanodrop 8000)。 樣品製備
將抗體樣品重新緩衝並用 20 mM His/HCl (pH 6.0) (緩衝劑) 及 0.02% Tween 20 (最終濃度) 稀釋。添加固體濃度為 0.03% 的珠粒。製備至少四種不同的濃度，在可能的情況下，最高濃度為約 200 mg/mL。需要兩個空白樣品作為無抗體對照：一個空白樣品包含重懸於水中的 Nanosphere 珠粒，另一個空白樣品包含重懸於緩衝劑中的 Nanosphere 珠粒。將樣品轉移至微孔板中，每孔皆覆蓋矽油。 用 Wyatt DLS 酶標儀進行測量
所有樣品及空白皆於 15℃ 至 35℃ 的不同溫度下 (步長為 5℃) 進行分析。採集時間為 30 秒，每個樣品及溫度的採集次數為 40 次。
資料分析
在軟體 (Microsoft Dynamics 7.0 或更高版本) 模板概覽中顯示了以 nm 為單位的原始資料 Dapp (表觀半徑)。黏度計算公式為 (ηreal = Dapp * ηH2O / Dreal)。Dreal 為空白樣品中實測珠粒尺寸，其等於珠粒尺寸 (300 nm)。計算出的黏度顯示於 Excel 曲線中。使用 Mooney 曲線擬合 (在 Excel 中)，可外推給定濃度下之黏度。此處計算出黏度超過 20 cP 時的最大蛋白質濃度。
在 20℃ 下達到 20 cP 的黏度的指定抗體的最大濃度如下所示。結果亦顯示於 圖 10中。 表 18: 藉由 DLS 珠粒方法所測得之黏度。顯示了指定抗體於 20℃ 下達到 20 cP 時的最大可行濃度。抗體 Fab 片段在大腸桿菌中表現
抗體    濃度 [mg/ml]
P1AA0902 Fab 166.3
P1AD9820 Fab 195
結果表明，本發明之抗體可以高濃度配製，其包含低於可注射性之可接受黏度限值的黏度。雖然兩種被測抗體皆可高度濃縮，但在 P1AD9820 抗體中之效應更突出。
因此，本發明之抗體非常適合眼部應用，因為它們允許以有限之注射體積提供高莫耳劑量，與高效力相結合，可產生高耐久性，從而降低給藥頻率，這對於減少患者方面的不便是所需的。
在另一組實驗中，如上所述，分析根據標準重組方法在 CHO 細胞中產生的 P1AD9820 之黏度。
在 20℃ 下達到 20 cP 的黏度的指定抗體的最大濃度如下所示。結果亦顯示於 圖 10中。 表 19: 藉由 DLS 珠粒方法所測得之黏度。顯示了指定抗體於 20℃ 下達到 20 cP 時的最大可行濃度。抗體 Fab 片段在大腸桿菌中表現
抗體    濃度 [mg/ml]
P1AD9820 大腸桿菌 195
P1AD9820 CHO 223
實例 9 ： 經改善之抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之功能穩定性
如上文「材料與一般方法」部分 (物化穩定性) 所述，P1AD9820 Fab 片段在不同應力條件下進行處理。如上所述，分析所得應力抗體樣品之抗原結合 (「材料與一般方法」部分：在功能穩定性測試中藉由 SPR 評估人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合動力學)。 表 20: P1AD9820 之應力樣品之抗原結合 (SPR)
應力條件 相對活性濃度 [%] VEGFA-121 相對活性濃度 [%] Ang2
初始 100 100
2w，於 40° 下，pH 6.0 99 100
2w，於 37° 下，PBS 100 101
4w，於 37° 下，PBS 100 102
實例 10 ： 經改善之抗 VEGF-A/ 抗 ANG2 Fab 片段之功能表徵
在細胞測定中評估 ANG2 及 VEGF-A 對候選抗體之抑制：
ANG2 抑制：pTie2 測定
將候選抗體及選定的參考分子 (Nesvacumab 類似物，根據 SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 藉由重組表現進行內部製備) 在 MEM α-培養基中以 250 nM 至 0.14 nM 範圍內的 11 個濃度預培育。將 40 µl 三倍濃縮的抗 Ang2 抗體與 40 µl 三倍濃縮的 Ang-2 (c=3,9 µg/ml) 混合，並在細胞培養箱中培育 30 分鐘。然後，於室溫下在 10 分鐘內以 40000 個細胞/孔的密度添加 40 µl/孔的懸浮於 FreeStyle 培養基 (不經選擇) 中之 Hek293_HOMSA-Tie2-Clone22_B11 細胞。然後藉由添加包含蛋白酶抑制劑的低溫裂解緩衝劑終止 Ang2 磷酸化。然後於室溫下在振搖的同時，結合 maxisorp 板的抗 Tie2 抗體將來自細胞裂解物的 Tie2 固定 90 分鐘。在 PBS (0.05% Tween 20) 中洗滌步驟後，於室溫下在 1 小時內添加對磷酸化 Tie2 具有特異性的生物素化抗體，使其最終濃度為 3 µg/ml。在三個洗滌步驟之後，添加 HRP 偶合的鏈黴親和素，使其最終濃度為 100 mU/ml，其於室溫下在 30 分鐘內轉化 POD，並在用 1 M H2SO2 終止後，使用 Tecan Sunrise 酶標儀在 405/690 nm 下進行最終比色終點評估。結果如下文及圖 8 所示。 表 21: ANG2 抑制 (IC50 ，細胞測定 )
IC50 [nM], n=3
P1AA0902 7
P1AD9820 10
Nesvacumab Mab 6
VEGF-A 抑制：報告基因測定 (RGA)
在該測定中，將 37,5 µl 四倍濃縮的被測抗體或參考分子與四倍濃縮的 37,5 µl VEGF-A121 (R&D, c=100µg/ml) 於室溫下預培育 15 分鐘。然後將混合物以 40000 個細胞/孔的密度添加至 75 µl/孔的 Hek_NFAT_KDR_Luc 細胞中，並在細胞培養箱中培育 5 小時。最後，向每個孔中添加 100 µl BioGlo 試劑後，使用 Infinite Pro 酶標儀 (Tecan) 評估發光。結果如下文及圖 7 所示。 表 22: VEGF-A 抑制 (IC50 ，細胞測定 )
IC50 [nM], n=4
P1AA0902 1.09
P1AD9820 1.07
蘭尼單抗 (INN) 1.10
實例 11 ： hVEGF-A121 及 hVEGF-A165 阻斷活性 (VEGF 基線測定 )
將 Maxisorp 96 孔板 (ThermoScientific #442404) 用 50 µL/孔的含 hVEGFR-1-Fc 的 200 mM NaHCO 3(pH 9.4) 以 1 µg/mL 之最終濃度於室溫下塗布 1 小時。在 280 µL PBST-1% BSA 中將指定的候選 Fab 片段稀釋至濃度 409.6 nM。對於 2 倍連續稀釋，將 140 µL 稀釋後之 Fab 樣品與 140 µL PBST-1% BSA 混合，並藉由溫和移液混合 7 次。將該 2 倍稀釋步驟重複 9 次。將圓底 96 孔板預填充 50 µL/孔的含 2 nM VEGF-A121 或 2 nM VEGF-A165 的 PBST-1% BSA。將 50 µL Fab 稀釋液添加至 VEGF 平板中，混合 6 次並培育 1.5 小時。隨後，將 maxisorp 板用 PBST 洗滌 2 次，然後添加 200 µL 2% MPBST，並於室溫下培育 45 分鐘。然後，將板用 PBST 洗滌兩次。將 50 µl Fab-VEGF 預混物轉移至 Maxisorp 板，並於室溫下培育 1.5 小時。然後，將板用 PBST 洗滌兩次，添加 50 µL 抗 VEGF-bio 抗體 (在 PBST 中按 1:2000 稀釋) 及 SA-HRP (在 PBST 中按 1:2000 稀釋)，並於室溫下培育 30 分鐘。將板用 PBST 洗滌 6 次，添加 50 µL TMB 受質溶液並於室溫下培育 30 分鐘。最後，添加 50 µL 1 N 硫酸終止反應，並讀取 450 nm 下的吸光度。結果示於 圖 5 及圖 6中。 實例 12 ： ANG2 相對於 ANG1 的選擇性結合
Ang-2 相對於 Ang-1 的選擇性可能是眼部安全的關鍵屬性之一：在細胞測定中評估 ANG1 對 P1AD9820 Fab 的抑制作用。
ANG-1 是飢餓條件下生長的 HUVEC 生存力的輕微誘導劑。因此，可使用 ANG-1 中和抗體來抑制生存力。抗體 RO5314196 (原 LC-08 – Thomas M，Kienast Y，Scheuer W 等人，A novel angiopoietin-2 selective fully human antibody with potent anti-tumoral and anti-angiogenic efficacy and superior side effect profile compared to Pan-Angiopoietin-1/-2 inhibitors.PLoS One.2013;8(2):e54923. doi:10.1371/journal.pone.0054923) 藉由中和 ANG-1 抑制 HUVEC 生存力，並用作測定的陽性對照。使用塗有來自 Gibco 的 AF (接附因子) (型錄號碼 S-006-100) 的來自 Corning 的細胞培養瓶 T162 (型錄號碼 3151) 來維持 HUVEC 直至第 5 代。在生存力測定中，將 HUVEC 用 Accutase® 分離，然後用 PBS-/- 進行洗滌。然後，將包含 0.5% FBS 的 EBM-2 中的細胞以 10.000 個細胞/孔的細胞密度接種到塗布有纖網蛋白的 96 孔板上，每孔 100 µl。將細胞於 37℃ 及 5% CO2 下培育過夜。第二天，將 P1AD9820 或 Ang-1 結合陽性對照 RO5314196 在 EBM/0.5% FBS 中稀釋至 10 倍工作濃度。起始濃度為 1000 µg/ml，然後採用 3 倍 8 點稀釋系列，最終濃度為 457.2 µg/ml。將 ANG‑1 設定為 20 倍工作濃度，對應於 2400 ng/ml。接下來，依次將 10 µl 預稀釋 10 倍的 P1AD9820 及 5 µl 稀釋 20 倍的 ANG‑1 溶液添加到細胞中，每個板中一式四份。在每個實驗日，每種條件在重複的平板中進行。將細胞於 37℃、5% CO2 下培育 72 小時。分析時，向每個孔中添加 11 µl alamarBlue®，隨後在細胞培養箱中培育 4 小時。相對於 600 nm 之參考波長，在 570 nm 下量測吸光度。
對於每個實驗，使用兩個測定板重複條件，且每種條件重複四次。從實驗孔的結果中扣除未經刺激之細胞的背景訊息並計算每種條件下的平均訊息。根據經 ANG‑1 (120 ng/ml) 刺激且未經額外處理的細胞計算 100% 反應水平，且來自經抗體處理的孔的訊息表示為 100% 反應的抑制百分比。對於 P1AD9820 及 RO5314196，每種抗體處理的抑制百分比在 n=4 個獨立實驗中進行量測，並計算平均值及平均值的標準誤差。使用 ExcelXLfit 軟體 (IDBS)，由每種抗體濃度的平均資料計算 IC 50值。使用相對於基礎和最大抑制活性計算的 5 參數邏輯模型 (A+((B-A)/(1+((C/x)^D))))，藉由非線性回歸分析擬合濃度-反應曲線。
細胞測定未檢測到 P1AD9820 所介導之 ANG1 抑制。 實例 13 ： P1AD9820 Fab 片段之結構分析
藉由 X 射線晶體學對 P1AD9820 Fab 進行結構分析，如下所述：
三元複合物血管生成素 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820 的複合物形成及純化。為形成複合物，將 P1AD9820 Fab 與人類 VEGF-A121 (Peprotech) 以 1.1:1 的莫耳比混合。於 4℃ 下培育 45 分鐘後，於 4℃ 下在額外的 60 分鐘添加與 P1AD9820 莫耳比為 1.25:1 的血管生成素 2-RBD。所得三元復合物於 37℃ 下進一步用 PNGaseF(NEB) 去醣基化 13 小時，最後藉由過凝膠過濾層析法在 Superdex200 (16/600) 柱上進行純化。合併含有三元復合物的餾分並濃縮至 3.55 mg/ml。
三元血管生成素 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820 之結晶。初始結晶試驗於 21℃ 下以 14.5 mg/ml 的蛋白質濃度在坐滴蒸汽擴散裝置中進行。在 35% MPD、0.1 M Na/K 磷酸鹽 (pH 6.2) 中，於 1 天內出現晶體。板狀晶體在一周內生長至最終尺寸 100 × 80 × 30 µm。直接從篩選板上收穫晶體，未採用任何進一步優化步驟。
資料採集及結構測定。 為採集資料，晶體於 100 K 下在不含任何其他冷凍保護劑的情況下在沉澱劑溶液中快速冷卻。使用 PILATUS 6M 檢測器以 Swiss 光源 (Villigen, Switzerland) 的光束線 X10SA 在 1.0000 Å 波長下採集衍射資料。資料經 XDS (Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)) 處理並用 SADABS (BRUKER) 縮放。晶體屬於空間群 C2，晶胞軸 a=165.74 Å，b= 90.27 Å，c= 127.89 Å，　=112.05°，衍射解析度為 2.08Å。結構使用 PHASER 藉由分子置換來確定 (McCoy, A.J，Grosse-Kunstleve, R.W.，Adams, P.D.，Storoni, L.C., 及 Read, R.J .J. Appl. Cryst. 40，658-674 (2007))，其中使用 Ang2-VEGF-Fab 三元復合物的相關內部結構之座標作為搜索模型。隨後使用 CCP4 套件中的程式 (Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994) 及 Buster (Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O.(2011).Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd) 精化資料。借由 COOT，使用差異電子密度手動重建蛋白質 (Emsley, P.，Lohkamp, B.，Scott, W.G. 及 Cowtan, K. Acta Cryst D66，486-501 (2010))。兩種結構之資料採集及精化統計總結於 表 23中。所有圖形演示都使用 PYMOL (DeLano Scientific, Palo Alto, CA, 2002) 得到。 表 23: 資料採集及精化統計
資料採集
波長 (Å) 1.0
解析度 1(Å) 77.83 - 2.08 (2.18 - 2.08)
空間群 C2
單位晶胞 (Å, °) 165.74 90.27 127.89, 90.00 112.05 90.00
特有反射 104942 (13712)
多重性 3.83 (3.68)
完備性 (%) 0.99 (0.99)
平均 I/　(I) 7.22 (0.78)
Wilson B 因子 44.64
R-meas 0.069 (0.780)
CC1/2 0.999 (0.768)
精化
解析度 1(Å) 77.83 - 2.08 (2.13 - 2.08)
精化中使用的反射 104910 (7712)
自由 R 所用的反射 5243 (357)
R-work 3 0.218 (0.272)
R-free 4 0.265 (0.303)
原子數 12200
蛋白質殘基 1466
RMS 鍵 (Å) 0.010
RMS 角 (°) 1.13
Ramachandran 偏好 (%) 95.8
Ramachandran 異常值 (%) 0.35
Rotamer 異常值 (%) 4.07
Clashscore 3.53
平均 B 因子 (Å 2) 68.29
  蛋白質 66.34
  溶劑 59.07
1括號中的值指的是最高解析度的筐 (bin)。 2R merge=
Figure 02_image005
，其中 I 為強度。 3R work=
Figure 02_image007
，其中 F o為觀測值，且 F c為計算得出的結構因子幅度。 4R free基於精化過程中省略的總資料的 5% 計算得出。
根據三元復合物血管生成素 2-RBD-VEGF-A121-P1AD9820 之晶體結構中鑑定出與相應抗原 VEGF-A 和 ANG2 接觸的胺基酸殘基。VH 及 VL 域內的互補位胺基酸殘基位置示意圖見 圖 2 及圖 3。
鑑定出的有助於抗原結合的胺基酸殘基見 表 24(對於可變重鏈域胺基酸殘基) 及 表 25(對於可變輕鏈域胺基酸殘基)。胺基酸位置的編號是根據 Kabat 編號系統 (在 圖 2 及圖 3中使用相同的編號)。參與抗原結合的胺基酸位置藉由它們在 VH 或 VL 域中的 Kabat 位置來鑑定 (參見 圖 2 及圖 3中的編號)。 表 24:藉由 P1AD9820 之晶體結構分析鑑定出的參與抗原結合的可變重鏈胺基酸殘基
VH VEGF-A ANG2
FR1 - H3, D26, F27, E29, Y30
H-CDR1 D35c D35b
FR2 - -
H-CDR2 D55, H56, K57, Y58, T61, K62, F63, I64, G65 -
FR3 R66 R94
H-CDR3 D95 V96, F98, F99
FR4 - -
表 25:藉由 P1AD9820 之晶體結構分析鑑定出的參與抗原結合的可變輕鏈胺基酸殘基
VL VEGF-A ANG2
FR1 I2；Y3 -
L-CDR1 Y27, W27a, E32 E32,
FR2 - L46；F49
L-CDR2 - D50, F53, K54, V55, Y56
FR3 - E57
L-CDR3 R92, Y93, H94, P95 Y91
FR4 - -
圖 1 ：本發明之抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體之 Fab 片段之示意圖。所示為同源 VH/VL 對的俯視圖，其中包括 CDR 胺基酸之排列 (上圖)。VH 域以灰色顯示，VL 域以白色顯示。此外，還顯示了 CDR 區的空間排列。突出顯示了本發明之抗體的互補位區域 (下圖)，其中 VEGF-A 互補位排列在 H-CDR2、L-CDR1 及 L-CDR2 之區域，ANG2 互補位排列在 H-CDR1、H-CDR3 及 L-CDR2 之區域。 圖 2 ：本發明之例示性抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體之 VH 域之胺基酸序列。顯示了胺基酸位置的 Kabat 編號，以及 CDR 及 FR 區。突出顯示了產生 VEGF-A 互補位的胺基酸位置，以及如實例 13 中鑑定出之 ANG2 互補位。 圖 3 ：本發明之例示性抗 VEGF-A/抗 ANG2 抗體之 VL 域之胺基酸序列。顯示了胺基酸位置的 Kabat 編號，以及 CDR 及 FR 區。突出顯示了產生 VEGF-A 互補位的胺基酸位置，以及如實例 13 中鑑定出之 ANG2 互補位。 圖 4 ：根據實例 5，通過 SPR 評估雙特異性抗體 P1AD9820 與 VEGF-A 及 ANG2 之獨立的抗原結合。 圖 5 ：如實例 11 中所檢測之所示抗體之 VEGF-A121 及 VEGF-A165 阻斷活性。 圖 6 ：如實例 11 中所檢測之所示本發明之抗體及現有技術抗體類似物之 VEGF-A121 及 VEGF-A165 阻斷活性。 圖 7 ：報告基因測定 (RGA) 用於分析所示之本發明之抗體及現有技術抗體類似物對於 VEGF-A 的抑制作用，如實例 10 中所檢測。 圖 8 ：pTie2 測定用於分析 ANG2 對所示之本發明之抗體及現有技術抗體類似物的抑制作用 ，如實例 10 中所檢測。 圖 9 ：P1AD9820 所介導之 ANG1 抑制如實例 12 中所檢測。 圖 10 ：用乳膠-珠粒 DLS 方法所測量之大腸桿菌中所產生之 P1AA0902 (左上圖) 和 P1AD9820 (右上圖) Fab 片段及 CHO 中所產生之 P1AD9820 (中圖) 的黏度，如實例 8 中所檢測。 
<![CDATA[<110>  瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)]]>
          <![CDATA[<120>  與 VEGF-A 及 ANG2 結合之抗體及其使用方法]]>
          <![CDATA[<130>  P36370]]>
          <![CDATA[<150>  EP20194610.0]]>
          <![CDATA[<151>  2020-09-04]]>
          <![CDATA[<150>  EP20209591.5]]>
          <![CDATA[<151>  2020-11-24]]>
          <![CDATA[<160>  30    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5 版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 之 VH 域]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Asp Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Glu Phe Glu Tyr Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 之 VL 域]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Asp Ala Arg Trp Leu Val His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906、P1AA0902 及 P1AD9820 之 H-CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Asp Asp Met Ser 
          1               
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 之 H-CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 之 H-CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Asp Val Gly Phe Phe Asp Met 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 之 L-CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 之 L-CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Asp Ala Arg Trp Leu Val His 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906、P1AA0902 及 P1AD9820 之 L-CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  223]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 Fab 片段之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Asp Phe Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Glu Phe Glu Tyr Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Pro Lys Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Thr Lys Phe Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 
              210                 215                 220             
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA8906 Fab 片段之輕鏈]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Asp Ala Arg Trp Leu Val His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 之 VH 域]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Asp Asp His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 之 VL 域]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 之 H-CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 及 P1AD9820 之 H-CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 之 L-CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 之 L-CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  223]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AA0902 Fab 片段之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Asp Asp His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Gly Arg Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Lys Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 
              210                 215                 220             
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          Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
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          Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Phe Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
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                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
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          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  19]]>
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          <![CDATA[<400>  19]]>
          Ser Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
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          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Tyr His Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AD9820 之 H-CDR2 ]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  22]]>
          His Gly Ser Tyr Trp Leu Asn Ser Glu Val Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AD9820 之 L-CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  223]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  P1AD9820 Fab 片段之重鏈]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Ser Glu His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ala Asp Phe Phe Glu Tyr Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 
                  35                  40                  45              
          Ser Ile Ser Pro Lys Gly Asp His Lys Tyr Leu Asn Thr Lys Phe Ile 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
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          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Val Gly Phe Phe Asp Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 
              210                 215                 220             
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  25]]>
          Ala Ile Tyr Met His Gln Glu Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
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          Phe Asp Gly Asp Phe Lys Val Tyr Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser His Glu Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
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                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 
                  35                  40                  45              
          Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 
              50                  55                  60                  
          Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 
                  115                 120                 125             
          Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Lys Ser Val 
              130                 135                 140                 
          Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ser Trp Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Cys Cys Leu Met Pro Trp 
                          165                 170                 175     
          Ser Leu Pro Gly Pro His Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys 
                      180                 185                 190         
          His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn 
                  195                 200                 205             
          Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr 
              210                 215                 220                 
          Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  496]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 
                      20                  25                  30          
          Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 
                  35                  40                  45              
          Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 
              50                  55                  60                  
          Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 
                          85                  90                  95      
          Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 
                      100                 105                 110         
          Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 
              130                 135                 140                 
          Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 
                          165                 170                 175     
          Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 
                      180                 185                 190         
          Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 
                  195                 200                 205             
          Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 
              210                 215                 220                 
          Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 
                          245                 250                 255     
          Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 
                      260                 265                 270         
          Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 
                  275                 280                 285             
          Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 
              290                 295                 300                 
          Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 
                          325                 330                 335     
          Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 
                      340                 345                 350         
          Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg 
                  355                 360                 365             
          Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 
              370                 375                 380                 
          Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 
          385                 390                 395                 400 
          Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 
                          405                 410                 415     
          Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 
                      420                 425                 430         
          Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 
              450                 455                 460                 
          Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 
                          485                 490                 495     
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  147]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 
                  35                  40                  45              
          Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 
              50                  55                  60                  
          Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 
                  115                 120                 125             
          Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Lys Cys Asp Lys 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Arg 
          145         
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Nesvacumab Mab LC]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Gln Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 
              130                 135                 140                 
          Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Nesvacumab Mab HC]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Ala Val Gln Leu Val Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Gly Pro Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Phe Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
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Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026

Claims (16)

  1. 一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，該 VL 域包含 (d) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(e) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，及 (f) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列。
  2. 一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其中該抗體包含 VH 域及 VL 域，該 VH 域包含 (a) CDR-H1，其包含 SEQ ID NO: 3 之胺基酸序列，(b) CDR-H2，其包含 SEQ ID NO: 21 之胺基酸序列，及 (c) CDR-H3，其包含 SEQ ID NO: 14 之胺基酸序列，(d) 人類重鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29 及 Y30 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 R66 及 R94 之 FR3；該 VL 域包含 (e) CDR-L1，其包含 SEQ ID NO: 22 之胺基酸序列，(f) CDR-L2，其包含 SEQ ID NO: 23 之胺基酸序列，(g) CDR-L3，其包含 SEQ ID NO: 8 之胺基酸序列，及 (h) 人類輕鏈骨架，其具有 (i) 包含胺基酸殘基 I2 及 Y3 之 FR1，(ii) 包含胺基酸殘基 L46 及 F49 之 FR2，(iii) 包含胺基酸殘基 E57 之 FR3，其中該 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
  3. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含與 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中該 VH 域包含胺基酸殘基 H3、D26、F27、E29、Y30、D35b、D35c、D55、H56、K57、Y58、T61、K62、F63、I64、G65、R66、R94、D95、V96、F98 及 F99；及 (b) VL 域，其包含與 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列具有至少 90% 序列同一性的胺基酸序列，其中該 VL 域包含胺基酸殘基 I2、Y3、Y27、W27a、E32、L46、F49、D50、F53、K54、V55、Y56、E57、Y91、R92、Y93、H94 及 P95，其中該 VH 及 VL 域的編號是根據 Kabat 編號系統。
  5. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含 (a) VH 域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO: 19 之胺基酸序列；及 (b) 可變輕鏈域，其包含具有多達 15 個胺基酸取代之 SEQ ID NO: 20 之胺基酸序列。
  6. 一種與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體，其包含 SEQ ID NO: 19 之 VH 序列及 SEQ ID NO: 20 之 VL 序列。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體之抗體 Fab 片段 (i) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 VEGF-A121，及 (ii) 以如 KinExA 所測量之小於 50 pM 之 K D結合人類 ANG2。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體，其中包含 180 mg/ml 之該抗體 Fab 片段的 20 mM His/HisHCl、pH 6.0 溶液在 20℃ 具有小於 20 cP 的黏度，如實例 8 中所述以乳膠-珠粒 DLS 方法藉由動態光散射所檢測。
  9. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為 Fab 片段。
  10. 一種分離之核酸，其編碼如請求項 1 至 9 中任一項之抗體。
  11. 一種宿主細胞，其包含如請求項 10 之核酸。
  12. 一種生產與人類 VEGF-A 及人類 ANG2 結合之抗體之方法，其包含培養如請求項 11 之宿主細胞，從而生產該抗體。
  13. 如請求項 12 之方法，其中該宿主細胞為 CHO 細胞。
  14. 一種醫藥調配物，其包含如請求項 1 至 9 中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  15. 一種端口輸送裝置，其包含如請求項 1 至 9 中任一項之抗體。
  16. 如請求項 1 至 9 中任一項之抗體，其用為藥物。
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