TW202227117A - 牡丹花蕊複合微晶囊體組合物、其製作方法及其抗藍光、保護修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制色素沉著之用途 - Google Patents

Abstract

本發明有關一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物，其包含：形成一具保護、防護功效之殼狀結構的載體；及鑲嵌於該殼狀結構或為其包覆的牡丹花蕊萃取物。本發明之組合物藉由該殼狀結構之載體將牡丹花蕊萃取物包覆，以防止牡丹花蕊萃取物變質或受汙染，而提供穩定功效。此外，本發明之組合物的功效包含：抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制色素沉著。

Description

牡丹花蕊複合微晶囊體組合物、其製作方法及其抗藍光、保護修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制色素沉著之用途

本發明關於一種微晶囊體組合物，且特別攸關一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物。此外，本發明尚有關上述組合物的製作方法與其用於抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制黑色素瘤細胞中色素沉著機制基因之表現的用途。

牡丹花一度被譽為「植物黃金」，其中，牡丹花蕊是牡丹花的組成部分，為牡丹生長最集中的部位，因此是牡丹精華之精華，營養極其豐富，其富含胺基酸、活性多醣、黃酮化合物等成分，能夠滋陰補陽，此外，牡丹花蕊含有大量維生素B3，為所有植物性食品中含量最高者。其功效包含：使氣血充沛、面色紅潤、精神飽滿、減輕生理疼痛、降低血壓、改善貧血以及美容養顏等等。

本發明之一目的在於提供一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物，係包括：一載體，其形成為一殼狀結構；以及一牡丹花蕊萃取物，其鑲嵌於該殼狀結構或為該殼狀結構包覆。

更佳者，該載體之成分包含磷脂醯膽鹼。

更佳者，該磷脂醯膽鹼佔該載體所含成分之比例大於50重量%。

更佳者，該載體之成分更包含磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂酸、卵磷脂、氫化卵磷脂以及D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。

本發明之另一目的在於提供一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物的製備方法，其方法包含：將該牡丹花蕊萃取物與該載體混合，使該載體分散形成一膠體複合物。

更佳者，其方法更包含：一震盪步驟，利用高功率超音波震盪器震盪該膠體複合物。

更佳者，該震盪步驟之溫度條件為35°C ~55°C。

更佳者，該震盪步驟之持續時間至少持續30分鐘。

本發明之再一目的在於提供一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物的用途，係用於製備抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制黑色素瘤細胞中色素沉著機制基因之表現之組合物。

更佳者，該組合物用於以一有效劑量之該牡丹花蕊萃取物投予至一個體的皮膚細胞以達抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制黑色素瘤細胞中色素沉著機制基因之表現。

為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：

本發明提供一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物，係包括：一載體，為形成為一殼狀結構；以及一牡丹花蕊萃取物，為鑲嵌於該殼狀結構或為該殼狀結構包覆。於一較佳實施例中，該牡丹花蕊萃取物種類包含：牡丹花蕊水萃萃取物或牡丹花蕊乙醇萃萃取物，但不以此為限。於另一較佳實施例中，該牡丹花蕊萃取物可用於製備具抗發炎、促進粒線體再生、促進膠原蛋白生成、保護細胞或修護細胞功能的組合物，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該粒線體包含動物細胞之粒線體、植物細胞之粒線體、真菌細胞之粒線體或原生生物細胞之粒線體，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該膠原蛋白種類包含第一型膠原蛋白(Type I Collagen)、第二型膠原蛋白(Type II Collagen)、第三型膠原蛋白(Type III Collagen)、第四型膠原蛋白(Type IV Collagen)或第五型膠原蛋白(Type V Collagen)，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該細胞種類包含皮膚細胞、皮膚纖維母細胞、上皮細胞、神經細胞、紅細胞、白細胞、血小板、吞噬細胞（噬中性粒細胞、噬鹼性粒細胞、噬酸性粒細胞）、B淋巴細胞、效應B細胞、記憶B細胞、T淋巴細胞、記憶T細胞、效應T細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、成骨細胞、神經膠質細胞、肝細胞、腎細胞、腺細胞或內分泌細胞（甲狀腺細胞、胸腺細胞、胰島B細胞、胰島細胞），但不以此為限。

更佳者，該載體之原料包含：磷脂醯膽鹼。於另一較佳實施例中，該磷脂醯膽鹼佔總載體原料之重量百分比大於50重量%。於又一較佳實施例中，該磷脂醯膽鹼佔總載體原料之重量百分比為60重量%~80重量%。於又一較佳實施例中，該磷脂醯膽鹼佔總載體原料之重量百分比為70重量%。於又一較佳實施例中，該載體原料更包含磷脂醯乙醇胺(phosphatidyl ethanol amine, PE)、磷脂醯肌醇(phosphatidyl inositol, PI)、磷脂酸(phosphatidic acid, PA)、卵磷脂(egg phosphatidylcholine，EPC)、氫化卵磷脂(hydoegenated lecithin)或D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)，但不以此為限。

此外，本發明之另一實施方式提出一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物的製備方法，詳如下文所述：

首先，，使牡丹花蕊萃取物與載體原料混合，使載體原料分散形成一膠體複合物。具體而言，將載體原料溶解於一溶劑中，利用旋轉減壓濃縮儀去除溶劑以形成脂質薄膜，之後加入牡丹花蕊萃取物至脂質薄膜使脂質分散成膠體複合物。

於一較佳實施例中，該牡丹花蕊萃取物之製備方法有兩種實施態樣，於第一實施態樣中，該牡丹花蕊萃取物之製備方法包含：一浸泡步驟，以水或乙醇溶液將牡丹花蕊覆蓋浸泡；以及一萃取步驟，於低溫下以總能量500~800 w的超音波能量連續快速振盪萃取該浸泡有牡丹花蕊的水或乙醇溶液。於第一實施態樣之一較佳實施例中，該低溫之溫度條件為-4°C~25°C。於另一較佳實施例中，該連續快速震盪之時間累積60~120分鐘。於又一較佳實施例中，該連續快速震盪之過程為：每震盪5分鐘休息2分鐘，直到震盪累積時間為60~120分鐘。於又一較佳實施例中，在浸泡步驟中，於以水將牡丹花蕊覆蓋浸泡下，牡丹花蕊與水之重量比例為1：7~1：11，其溫度條件為4°C~50°C，其浸泡時間為72~120小時；於以乙醇溶液將牡丹花蕊覆蓋浸泡下，牡丹花蕊與乙醇溶液之重量比例為1：7~1：11，其溫度條件為4°C~50°C，其浸泡時間為72~120小時。於又一較佳實施例中，該牡丹花蕊與水之重量比例為1：9。於又一較佳實施例中，該水可為純水、結晶水、超純水、地下水、天然水、生物水、礦泉水或去離子水，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該牡丹花蕊與乙醇溶液之重量比例為1：9。於又一較佳實施例中，該乙醇溶液含有50重量%~75重量%的乙醇。於第二實施態樣中，該牡丹花蕊萃取物之製備方法包含：一冷凍步驟，以急速(-195.79°C)冷凍、固化牡丹花蕊；一研磨步驟，以冷凍研磨器研磨牡丹花蕊，將牡丹花蕊磨成粉末；一浸泡步驟，以水或乙醇溶液將牡丹花蕊粉末覆蓋浸泡；以及一萃取步驟，於低溫下以總能量500~800 w的超音波能量連續快速振盪萃取該浸泡有牡丹花蕊粉末的水或乙醇溶液。於第二實施態樣之一較佳實施例中，該低溫之溫度條件為-4°C~25°C。於另一較佳實施例中，該連續快速震盪之時間累積60~120分鐘。於又一較佳實施例中，該連續快速震盪之過程為：每震盪5分鐘休息2分鐘，直到震盪累積時間為60~120分鐘。於又一較佳實施例中，在浸泡步驟中，於以水將牡丹花蕊粉末覆蓋浸泡下，牡丹花蕊粉末與水之重量比例為1：7~1：11，其溫度條件為4°C~50°C，其浸泡時間為72~120小時；於以乙醇溶液將牡丹花蕊粉末覆蓋浸泡下，牡丹花蕊與乙醇溶液之重量比例為1：7~1：11，其溫度條件為4°C~50°C，其浸泡時間為72~120小時。於又一較佳實施例中，該牡丹花蕊粉末與水之重量比例為1：9。於又一較佳實施例中，該水可為純水、結晶水、超純水、地下水、天然水、生物水、礦泉水或去離子水，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該牡丹花蕊粉末與乙醇溶液之重量比例為1：9。於又一較佳實施例中，該乙醇溶液含有50重量%~75重量%的乙醇。除此之外，以上二種實施態樣所述之牡丹花蕊萃取物之製備方法更包含： 一離心步驟，於低溫(-20°C)下對該快速振盪萃取後的水或乙醇溶液以15,000 g進行高速離心10分鐘，以去除底部沉澱物並收集上清液。於另一較佳實施例中，該牡丹花蕊萃取物之製備方法更包含：一過濾步驟，將該上清液以微孔濾膜孔徑為0.22~0.45 μm之多微孔結構濾膜，並利用真空篩檢器過濾，以獲得澄清過濾液。於又一較佳實施例中，該牡丹花蕊萃取物之製備方法更包含：一乾燥步驟，利用減壓濃縮機及真空冷凍乾燥機將該澄清過濾液凍乾。

於另一較佳實施例中，該溶劑為 乙醇。於又一較佳實施例中，該載體原料包含磷脂醯膽鹼。於又一較佳實施例中，該磷脂醯膽鹼佔總載體原料之重量百分比大於50重量%。於又一較佳實施例中，該磷脂醯膽鹼佔總載體原料之重量百分比為60重量%~80重量%。於又一較佳實施例中，該磷脂醯膽鹼佔總載體原料之重量百分比為70重量%。於又一較佳實施例中，該載體原料更包含磷脂醯乙醇胺(phosphatidyl ethanol amine, PE)、磷脂醯肌醇(phosphatidyl inositol, PI)、磷脂酸(phosphatidic acid, PA)、卵磷脂(egg phosphatidylcholine，EPC)、氫化卵磷脂(hydoegenated lecithin)或D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)。於又一較佳實施例中，磷脂酸膽鹼是建構神經細胞膜的重要成分，在身體生長發育階段非常重要；磷脂酸膽鹼經酵素分解後，會產生膽鹼，與人體內的乙醯基化合，產生的乙醯膽鹼是重要的神經傳導物質，有益神經細胞活動；磷脂酸膽鹼可修復受損的細胞膜，也有助乙醯膽鹼合成，使腦部變得更靈活，提升記憶力。於又一較佳實施例中，磷脂醯乙醇胺之功效包含：提升專注力、減緩過動症、減輕壓力、預防老人癡呆與認知功能下降或增加記憶力與學習能力，但不以此為限。於又一較佳實施例中，卵磷脂之主要組成成分包含：膽鹼、脂肪酸、甘油、糖脂、磷酸、三酸甘油脂和磷脂質；其功效包含：活化新陳代謝、避免細胞過早老化、幫助腦部發育、調節神經組織、提高記憶力、舒緩情緒、促進油脂與脂溶性維他命的消化與吸收、降低血脂或幫助肝臟代謝，但不以此為限。於又一較佳實施例中，磷脂質是所有動植物細胞膜的關鍵結構和功能成分，包括：磷脂醯絲氨酸、磷脂醯膽鹼、磷脂醯肌醇。

再來，利用高功率超音波震盪器震盪膠體複合物，以獲得一牡丹花蕊複合微晶囊體組合物。於另一較佳實施例中，該高功率為總能量20~100 w的超音波能量。於又一較佳實施例中，震盪時間為30~60分鐘，震盪溫度為30℃~60℃。於又一較佳實施例中，震盪時間為30~40分鐘，震盪溫度為30℃~60℃。於又一較佳實施例中，震盪時間為40~50分鐘，震盪溫度為30℃~60℃。於又一較佳實施例中，震盪時間為40~60分鐘，震盪溫度為30℃~60℃。於又一較佳實施例中，震盪時間為50~60分鐘，震盪溫度為30℃~60℃。於又一較佳實施例中，震盪時間為30分鐘，震盪溫度為45℃。

更佳者，依據上述方法所製成之牡丹花蕊微晶囊體組合物，其載體具有保護、防護之功效，可防止包覆其內之牡丹花蕊萃取物變質或受汙染。於一較佳實施例中，由於其載體為脂溶性，更加容易被皮膚所吸收，因此其大大提升人體皮膚對包覆於載體內之牡丹花蕊萃取物的吸收效果。

此外，本發明之又一實施方式提出一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物的用途，詳如下文所述：

本發明提出之牡丹花蕊複合微晶囊體組合物可用於製備具抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化或抑制色素沉著機制基因之表現之功效的組合物，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該組合物可為醫藥品、保養品、化妝品、保健食品或護膚用品之原料，但不以此為限。於又一較佳實施例中，該組合物用於以一有效劑量之該牡丹花蕊萃取物投予至一個體的皮膚細胞以達抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制色素沉著機制基因之表現。

為瞭解本發明之技術特徵、運用技術手段及所預期達成之功效，茲將本發明萃取物之相關實施例加以說明，其敘述如下：

實施例1：「牡丹花蕊生長點組織萃取物之萃取方法」

萃取方法一：「以純水浸泡牡丹花蕊組織」

新鮮花蕊採取後，將牡丹花蕊組織以急速−195.79°C (77 K)液態氮冷凍固化，並以冷凍研磨器研磨牡丹花蕊組織，將牡丹花蕊組織磨成粉末；提取重量比為9：1的純水以及牡丹花蕊組織粉末，並將牡丹花蕊組織粉末浸泡於純水中，於溫度條件4°C~50°C的情況下浸泡72~120小時；將浸泡完成的牡丹花蕊組織粉末以及純水之混合物，於溫度條件-4°C~25°C的情況下，以總能量500~800 w的超音波能量連續快速振盪萃取，其中，以每震動5分鐘休息2分鐘的方式連續震盪，直到總震盪時間達60~120分鐘；於溫度條件-20°C下以15,000 g高速離心10分鐘以去除底部沉澱物並收集上清液；將該上清液以孔徑0.22-0.45 μM之多微孔結構濾膜後，利用真空篩檢器之程式過濾，以獲得一澄清過濾液；利用減壓濃縮機及真空冷凍乾燥機將該澄清過濾液凍乾，獲得牡丹花蕊生長點組織萃取物(PSB)。

萃取方法二：「以酒精溶液浸泡牡丹花蕊組織」

新鮮花蕊採取後，將牡丹花蕊組織以急速−195.79°C (77 K)液態氮冷凍固化，並以冷凍研磨器研磨牡丹花蕊組織，將牡丹花蕊組織磨成粉末；提取重量比為9：1的酒精溶液(含50重量%~75重量%乙醇)以及牡丹花蕊組織粉末，並將牡丹花蕊組織粉末浸泡於酒精溶液(含50重量%~75重量%乙醇)中，於溫度條件4°C~50°C的情況下浸泡72~120小時；將浸泡完成的牡丹花蕊組織粉末以及酒精溶液(含50重量%~75重量%乙醇)之混合物，於溫度條件-4°C~25°C的情況下，以總能量500~800 w的超音波能量連續快速振盪萃取，其中，以每震動5分鐘休息2分鐘的方式連續震盪，直到總震盪時間達60~120分鐘；於溫度條件-20°C下以15,000 g高速離心10分鐘以去除底部沉澱物並收集上清液；將該上清液以孔徑0.22-0.45 μM之多微孔結構濾膜後，利用真空篩檢器之程式過濾，以獲得一澄清過濾液；利用減壓濃縮機及真空冷凍乾燥機將該澄清過濾液凍乾，獲得牡丹花蕊生長點組織萃取物(PSB)。

實施例2：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之製備」

於球型玻璃燒瓶中將載體原料：磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholine, PC)、磷脂醯乙醇胺(phosphatidyl ethanol amine, PE)、磷脂醯肌醇(phosphatidyl inositol, PI)、磷脂酸(phosphatidic acid, PA)、卵磷脂(egg phosphatidylcholine，EPC)、氫化卵磷脂(hydoegenated lecithin)以及D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS)混合溶解於一乙醇中，其中，磷脂醯膽鹼為載體之主要成分，其佔載體成分總重之70重量%；利用旋轉減壓濃縮儀除去該乙醇，在球型玻璃燒瓶壁形成脂質薄膜，再加入牡丹花蕊萃取物(PSB)溶液與脂質薄膜混合進行交互作用，使脂質分散在溶液中並形成膠體複合物；將膠體複合物利用高功率超音波震盪器以總能量20~100 w的超音波能量進行震盪，其中設定溫度條件為45°C，持續時間為30分鐘，形成包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)；該PSBL之濃度為0.1~5 mM，以增強活性成分之安定性及經皮穿透的能力。於另一較佳實施例中，磷脂酸膽鹼是建構神經細胞膜的重要成分，在身體生長發育階段非常重要；磷脂酸膽鹼經酵素分解後，會產生膽鹼，與人體內的乙醯基化合，產生的乙醯膽鹼是重要的神經傳導物質，有益神經細胞活動；磷脂酸膽鹼可修復受損的細胞膜，也有助乙醯膽鹼合成，使腦部變得更靈活，提升記憶力。

實施例3：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之型態 」

以穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscope, TEM)觀察膠體分散液中粒子的結構型態，樣品的前處理是利用微脂粒分散液滴附於支撐膜上(formvar film)的鍍碳銅網上，並靜置兩分鐘使樣品粒子能夠嵌於銅網上，再利用拭淨紙擦拭吸去多餘樣品，再利用醋酸雙氧鈾(0.5 wt%)滴於銅網上進行樣品染色，並靜置兩分鐘利用拭淨紙擦拭吸去多餘染劑，並存放於乾燥箱12小時，再利用穿透式電子顯微鏡分析其形態結構。藉由穿透式電子顯微鏡分析，結果如圖1所示，包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)形成平均粒徑為50~250 nm的奈米級膠體複合物。

實施例4：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之粒徑與界面電位元分析試驗 」

使用動態光散射及界面電位元分析儀(Dynamic Light Scattering, DLS) 量測PSBL之粒徑及界面電位元，其中，該界面電位元分析儀之型號為Brookhaven 90Plus Particle Size Analyzer，購自Brookhaven Inc.，U.S.A。量測結果如表1所示：包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之平均粒徑(average particle size, AP.S.)為170.7 nm；分佈係數(polydispersity index, Pd.I)為0.24；平均界面電位(average zeta potential, A.Z.P.)為-5.46 mV；牡丹花蕊萃取物(PSB)與微囊(L)結合後之PSB濃度與未結合前之PSB濃度比例為94.39%，結合比例(combined percentage, C.P.)為94.39%。 表1

組成物	平均粒徑(nm)	分布係數	平均界面電位(mV)	結合比例(%)
PSBL	170.70±11.39	0.24±0.01	-5.46±3.24	94.39±4.11

實施例5：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)活性成分含量分析試驗」

利用高效能液相層析儀(High performance liquid chromatography, HPLC)進行PSB活性組成之定量及定性分析量測，幫浦型號為 L-7100，自動注射器型號為 L-7200，紫外光偵測器(UV-vis)型號為 L-4200，皆購自Hitachi，Japan；管柱型號為 Microsorb-MV 100-5 C18(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm particle size)，購自Getech, Taiwan。PSB水溶液與PSBL複合物活性濃度隨時間變化關係如圖2所示。結果顯示奈米級膠體複合物PSBL可以有效改善PSB在水中的活性穩定性；PSBL可改善PSB活性的儲存穩定性。

實施例6：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之安全性評估試驗 」

進行包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之安全性評估，細胞存活度試驗。 將人類皮膚角質株化細胞株(HaCaT cells)迅速移至37°C水浴箱內使其在40~60秒內急速解凍，隨即將細胞冷凍保存液(含10% DMSO的細胞培養液)加入細胞培養液，再將細胞打散並移置25 cm ²細胞培養瓶，於37°C、5% CO ₂細胞培養箱中生長，平均每隔2天更換一次培養液。 將人類皮膚角質株化細胞和人類皮膚纖維母細胞(HaCaT and Hs68 cells) (1.5×10 ⁵cell/mL)培養在96-well盤，並在37°C及5% CO ₂培養箱中培養至少24小時。評估包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)對皮膚細胞是否會影響到細胞存活度：加入牡丹花蕊生長點組織萃取物(PSB)以及於指定的時間作用，達反應時間，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，加入10 μL的MTT (3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反應，於37°C、5% CO ₂反應4小時後移除培養液，加入100 μL的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570 nm下測定吸光值(BioTek, Synergy ^TM2, USA)。 試驗結果：將人類皮膚角質株化細胞和人類皮膚纖維母細胞(HaCaT and Hs68 cells)分別作用包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL) 24小時後，細胞存活度分別為102.5%和101.6%。

實施例7：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之皮膚膜層防護試驗(抗藍光試驗)」

將人類皮膚角質株化細胞(HaCaT cells) (1.5×10 ⁵cell/mL)培養在96-well盤，並在37°C及5% CO ₂培養箱中培養至少24小時。評估包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)對皮膚細胞是否具皮膚膜層防護功能。以藍光照射細胞3小時，之後加入包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)以及於指定的時間作用，達反應時間，移除舊的培養液，以PBS清洗一次，並換上新的培養液，加入10 μL的MTT (3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)溶液反應，於37°C、5% CO ₂反應4小時後移除培養液，加入100 μL的DMSO溶解formazan沉澱物，最後於波長570 nm下測定吸光值(BioTek, Synergy ^TM2, USA)。 試驗結果：人類皮膚角質株化細胞於作用組(控制組)之細胞存活度為100.0%；經藍光照射後之細胞存活度為62.5%；以包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)作用後之細胞存活度提升至95.6%，顯示包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)具抗藍光之防護皮膚膜層功能。 表2

樣品/試驗	皮膚膜層防護-抗藍光試驗
藍光	-	+	+
包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)	-	-	+
細胞存活度 (%)	100.0±0.5	62.5±2.1	95.6±1.3

實施例8：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之光健康功能」 評估包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)是否可降低UVB光產物環丁烷嘧啶二聚體(cyclobutane pyrimidine dimmer, CPD)之表現，保護及修護受損的皮膚細胞，進而達到皮膚光健康功能。將人類皮膚角質株化細胞(HaCaT cells) (1.5×10 ⁵cell/mL)培養在24-well盤中24小時後，加入樣品培養4小時，抽乾上清液，進行UVB (50 mJ/cm ²)照射，再加入含有樣品之無血清培養液於培養箱中反應4小時，達反應時間後，移除上清液，PBS清洗，加入500 μL 4% formalin，放置室溫10分鐘進行固定。接著移除formalin，以PBS清洗兩次，加入500 μL 0.5% triton-X100在冰上反應5分鐘後移除，以PBS清洗兩次。加入1 mL 2 M HCL室溫下作用30分鐘，使細胞內DNA變性，再以PBS清洗五次。之後加入1 mL 20% FBS在37˚C下30分鐘進行隔絕(blocking)，以防非特異性蛋白結合，達時間後，再以PBS清洗五次。加入70 μL CPD (1:100)於37˚C下均勻搖晃作用30分鐘，再以PBS清洗五次。最後加入等量PBS，於Excitation：530 nm, Emission：630 nm以酵素免疫分析儀測其吸光值。之後加入70 μL比例1：250的Hoechst 33342 staining solution (10 μg/mL)繼續搖晃5分鐘，立即以PBS清洗5次，利用螢光顯微鏡觀察螢光表現。 試驗結果如圖3所示：CPD為一種光化產物，利用可被螢光偵測之特性進行試驗。經過UVB照射後細胞受到傷害而碎裂並產生光化產物堆積，CPD誘發為138.7%。皮膚細胞經包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)作用再經UVB照射後，僅有些許光化產物產生，CPD誘發為102.2%。結果顯示包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)具有保護及修護受損的皮膚細胞，進而達到皮膚光健康之功能。 表3

樣品/試驗	光健康功能-降低UVB光產物CPD之表現試驗
UVB	-	+	+
包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)	-	-	+
CPD含量 (%)	100.0±1.8	138.7±2.9	102.2±3.1

實施例9：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之抗敏評估試驗 」

過敏是一種機體的變態反應，為過敏源的一種不正常反應，當過敏源接觸到過敏體質的人群才會 發生過敏，過敏源有化學物質、紫外線、花粉、粉塵、異體蛋白等幾百種。在過敏反應的發生過程中，過敏介質起著直接的作用，過敏源是過敏病症發生的外因，而免疫能力低下，大量自由基對肥大細胞和嗜鹼粒細胞的氧化破壞是過敏病症發生的內因。人體內有兩類細胞即肥大細胞和嗜鹼粒細胞，它們廣泛分佈於鼻黏膜、支氣管黏膜、腸胃黏膜以及皮膚下層結締組織中的微血管周圍和內臟器官的包膜中。這兩類細胞中含有組胺、白三烯、5-羥色胺、激汰等過敏介質。 使用肥大細胞株(RBL-2H3 cells)作為評估包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之抗過敏效能。肥大細胞經由IgE抗體或是鈣離子載體刺激下，可經由去顆粒現象而釋放大量的β-葡萄糖醛酸酶(β-hexosaminidase)，可藉由所釋放的量來判斷待測牡丹萃取物(PSE)是否具備有抑制過敏反應的潛力。將肥大細胞(2×10 ⁴cells/well)培養於96-well盤中，以包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)處理24小時，接著加入anti-DNP IgE Ab (1 μg/mL)後培養6-12小時以致敏肥大細胞。洗滌掉上清液後，加入DNP-BSA (100 ng/mL)後培養1小時以活化肥大細胞。收集上清液後冷凍保存。於96-well盤中加入等體積的上清液與p-NAG受質(1 μM)，37°C培養1小時後測量405 nm吸光值(BioTek, Synergy ^TM2, USA)。 試驗結果：利用卡西霉素A23187 (1 µM)進行誘導過敏反應，β-hexosaminidase釋放率為62.3%，經包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)作用肥大細胞後，β-hexosaminidase活性為49.6%，顯示包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)具抑制β-hexosaminidase活性，具抗過敏效能。 表4

樣品/試驗	抗敏評估試驗
卡西霉素A23187(1 µM)	-	+	+
包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)	-	-	+
β-hexosaminidase活性(%)	0.0±2.6	62.3±4.8	49.6±3.9

實施例10：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之促進細胞能量生成試驗 」

細胞內三磷酸腺苷ATP (adenosine triphosphate)含量測定。ATP是體內最豐富的能量載體分子。它可以利用食物分子中的化學能，將其釋放出來，為細胞內的工作提供燃料。評估包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)是否會誘發細胞能量ATP之生成，以ApoSENSORTM Cell viability assay kit定量ATP之誘發量。 將人類皮膚角質株化細胞(1.5×10 ⁵cell/mL)培養在96-well盤中，並在37˚C、5% CO ₂培養箱中生長24小時以上，再加入包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)反應24小時後，移除上清液，以PBS清洗，加入100 μL Nuclear releasing reagent反應5分鐘，再加入10 μL ATP monitoring enzyme以冷光儀進行測定ATP含量 (BioTek, Synergy ^TM2, USA)。 試驗結果：未經處理之人類皮膚角質株化細胞ATP含量控制組為100%，經包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)作用後，使細胞內ATP含量提升至108.7%。試驗結果顯示細胞受到包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)的刺激，可增加細胞內ATP含量8.7%，其顯示包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)具促進細胞能量ATP生成效能。 表5

樣品/試驗	細胞能量ATP生成試驗
包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)	-	+
ATP活性(%)	100.0±1.3	108.7±2.6

實施例11：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)調控抗老化蛋白Lamin A之表現 」

核纖層蛋白Lamin A基因變異可損壞DNA修復功能，而令基因組變得不穩定，導致早老症。抗衰老啟動機制發現Lamin A蛋白質能刺激長壽基因SIRT1，使細胞自我保護、自我更新及延緩衰老。評估包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)調控抗老化蛋白Lamin A之表現，進而延緩細胞衰老。 人類皮膚角質株化細胞(HaCaT細胞)(1.5×10 ⁵cell/mL)培養於直徑10 cm的培養皿(dish)，在37°C及5% CO ₂培養箱中培養至少24小時，加入包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)，置入培養箱作用24小時。當達反應時間，利用RIPA buffer進行蛋白質萃取，之後進行SDS-PAGE電泳直到目標蛋白分離。加入0.5%脫脂牛奶2分鐘後，再加入1級抗體反應10分鐘，以0.1% 磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBST)沖洗3次，再加入2級抗體反應10分鐘，再以0.1% PBST沖洗3次。最後加入ECL冷光感應試劑，置入冷光照相系統拍照並使用image J定量分析蛋白質表現。 試驗結果如圖4所示：人類皮膚角質株化細胞(HaCaT細胞)經包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)作用後，分析細胞內Lamin A蛋白質表現量。细胞骨架蛋白β-actin作為定量控制組。結果顯示，與控制組(Lamin A表現為1.0)相比，細胞經包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)作用後Lamin A表現增加至3.8，顯示包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)可活化Lamin A蛋白質，推測其具抗老化效果。

實施例12：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)調控抑制色素沉著機制基因Tyrosinase之表現；調控抑制老化基因mTOR之表現；調控促進端粒酶基因TOP1之表現」

利用即時定量qPCR進行試驗。分析包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)調控黑生素生成機制中酪胺酸酶(Tyrosinase)基因之表現情形；調控抑制老化基因(mTOR)之表現情形；調控促進端粒酶基因(TOP1)之表現情形。酪胺酸酶(Tyrosinase)是一種氧化酶，是調控黑色素生成的限速酶。這種酶參與黑色素合成，藉由調控、抑制Tyrosinase的活化，可抑制黑色素生成以及色素沉著。 mTOR是一種絲胺酸─蘇胺酸蛋白激酶，是造成老化和癌化的重要因子，其會促進細胞吸收熱量、關閉自噬機制進而阻止細胞更新，因此近年來有針對抑制mTOR表現相關研究指出，透過抑制老化細胞中mTOR的表現可使得細胞具有新生的潛力。 端粒作用是保持真核生物染色體的完整性和控制細胞分裂週期，在細胞進行分裂後，端粒會穩定複製分裂後的DNA，確保遺傳序列的完整性，但細胞每分裂一次，端粒就會縮短，當端粒被消耗殆盡的時候，細胞即啟動凋亡，因此端粒被視為老化的最佳標記。而端粒酶可以補充端粒，延長細胞分裂的次數，減緩老化的速度。TOP1為端粒保護蛋白，促進其表現可增進對端粒體的保護作用。分別將黑色素瘤細胞株(B16 cells)和人類皮膚角質株化細胞(HaCaT cells)(1.5×10 ⁵cell/mL)以1×10 ⁵cell /mL之密度接種於6 well盤中，培養24小時。將包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)混合無血清培養液作用72小時後，萃取黑色素瘤細胞株之RNA；包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)混合無血清培養液作用24小時後，萃取人類皮膚角質株化細胞之RNA。 各別收集上清液至15 mL離心管，以Trypsin取下細胞，並以PBS收集細胞並離心移除上清液。加入1 mL REzolTMC&T於室溫下均勻混合5分鐘溶解細胞。加入200 μL chloroform均勻混合15秒。 置4°C反應5分鐘純化分離Total RNA。 進行離心12000 rpm於4°C下10分鐘。將離心管中最上層透明層取入浸泡過DEPC-H ₂O並滅菌之1.5 mL之微量離心管中。 加入等量體積的異丙醇(isopropanol)混合均勻，於4°C下靜置5分鐘以沉澱RNA；以12000 rpm，於4°C下離心10分鐘；去除上清液；加入200 μL 75%的冰酒精清洗RNA；以12000 rpm，於4°C下離心10分鐘；完全去除上清液，並於無菌操作檯中倒置陰乾，使離心管中的水氣完全揮發；加入100 μL 0.1% DEPC-H ₂O分散RNA，並儲存於-80°C冰箱；定量RNA：取2 μL RNA於198 μL 0.1% DEPC-H ₂O中，混合均勻取100 μL於微量石英管中，以分光光度計於OD260 nm以及OD280 nm測量吸光值(BioTek, Synergy ^TM2, USA)。反轉錄(reverse transcription, RT)：加入0.1% DEPC-H ₂O調整為2 mg RNA之濃度，將體積補足12.5 μL，加入1 μL Oligo dT primer混合均勻後，於70 μL作用2分鐘後，迅速置於冰上，再加入4 μL 5× MMLV-RT buffer solution、1 μL 10 mM Each dNTP、0.5 μL RNase inhibitor和1 μL MMLV RTase，於42°C作用1小時，再於94°C作用5分鐘後，再加入冰的ddH ₂O將體積補足至100 μL，即完成cDNA之製備並存放於-80°C冰箱。以螢光偵測系統(prism 7700定序偵測系統)與Qiagen’s Quantitect SYBR Green RT-PCR套組，依照製造商提供之流程完成第一步之qRT-PCR。引子序列與產生arrayed cDNAs相同。基因擴增條件依序下列：於50°C反轉錄作用30分鐘，接續以95°C作用15分鐘完成PCR起始激活步驟。Melting溫度為95°C下15秒，而annealing/extension於60°C作用1分鐘，一共40個循環。最後確認擴增產物大小以cycle threshold (CT) (ΔΔCT)方法判讀數據，比較控制組與實驗室之CT值，以β-actin基因作為定量分析。計算基因表現之倍數改變。取10 μL cDNA至微量離心管中，加入5 μL 10×reaction buffer、2 μL的25 mM MgCl ₂、0.8 μL 10 mM dNTP及各1 μL之50 μM upstream and downstream primer、Taq DNA polymerase (5 unit/μL)，最後加入去離子水使總體積達50 μL，置於自動溫度循環機(MyGo Pro real-time PCR)進行PCR反應。 試驗結果如圖5所示：進行基因分析試驗，包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)會調控抑制黑色素瘤細胞中之色素沉著機制基因Tyrosinase之表現；調控抑制人類皮膚角質株化細胞中老化基因mTOR之表現，調控促進端粒酶基因TOP1之表現。 惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例，但不能以此限定本創作實施之範圍；故，凡依本創作申請專利範圍及說明書內容所做之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本創作專利涵蓋之範圍內。

無

以下「牡丹花蕊萃取物」簡稱為「PSB」，「包覆型牡丹花蕊微囊」簡稱為「PSBL」； 圖1為一照片圖，其表示：「包覆型牡丹花蕊微囊之平均粒徑」； 圖2為一曲線圖，其表示：「PSBL與PSB在水中的活性穩定性」； 圖3為一照片圖，其表示：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)之光健康功能 」； 圖4為一照片圖，其表示：「包覆型牡丹花蕊微囊(PSBL)調控抗老化蛋白Lamin A之表現情形」； 圖5為一長條圖，其表示：「經PSBL作用後Tyrosinase、Mtor、TOP1之基因表現情形」。

Claims (10)

1. 一種牡丹花蕊複合微晶囊體組合物，係包括：一載體，其形成為一殼狀結構；以及一牡丹花蕊萃取物，其鑲嵌於該殼狀結構或為該殼狀結構包覆。
2. 如請求項1所述之組合物，其中該載體之成分包含磷脂醯膽鹼。
3. 如請求項2所述之組合物，其中該磷脂醯膽鹼佔該載體所含成分之比例大於50重量%。
4. 如請求項2所述之組合物，其中該載體之成分更包含磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇、磷脂酸、卵磷脂、氫化卵磷脂以及D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
5. 一種如請求項1所述組合物的製備方法，其方法包含：將該牡丹花蕊萃取物與該載體混合，使該載體分散形成一膠體複合物。
6. 如請求項5所述之方法，其方法更包含：一震盪步驟，利用高功率超音波震盪器震盪該膠體複合物。
7. 如請求項6所述之方法，其中，該震盪步驟之溫度條件為35°C ~55°C。
8. 如請求項7所述之方法，其中，該震盪步驟之持續時間至少持續30分鐘。
9. 一種如請求項1所述組合物的用途，係用於製備抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制色素沉著機制基因之表現之組合物。
10. 如請求項9所述之用途，其中該組合物用於以一有效劑量之該牡丹花蕊萃取物投予至一個體的皮膚細胞以達抗藍光、保護細胞、修護細胞、抗過敏、促進細胞能量生成、抗老化、抑制色素沉著機制基因之表現。

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