TWI414529B - Extraction of Polysaccharides and Preparation of Frozen Crystal - Google Patents
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Description
本發明為一種多醣體萃取及凍晶微脂粒製備技術,將植物或天然有機體利用破壁技術及水浴萃取、酒精沈析進行多醣體成份萃取,利用微脂粒包覆萃取物,再添加10%蔗糖作為抗凍劑,利用冷凍乾燥技術製備微脂粒凍晶,找出多醣體凍晶微脂粒之功能性及有功能性之最佳化條件。
天然保養品是指其成份來源來自動植物或是天然的有機體,早期會從動物身上的締結組織、雞冠、胎盤中萃取出玻璃醛酸物質來當保養品的成份,但近年來因環保議題及狂牛病或禽流感等問題,基於安全考量,越來越多人尋找植物性或是菇菌類中可以用來當保濕或美白的物質,皮膚保濕是保養中最重要的一環,因為皮膚的老化源自於皮膚水份的流失,若皮膚的水份流失,則皮膚會黯淡無光,沒有活力或是產生皺紋,目前已知多醣體的成份可以增加皮膚保濕,減少皮膚老化,所以具有保濕效果的非動物性多醣體是化妝品注目的焦點。菇蕈類含有大量的多醣體,也被廣泛的萃取其中的多醣體,進行醫療或抗癌的功效。但是在化妝保養品方面,僅有少數被使用,因此廉價的菇蕈類保養品是化妝品的開發是一個大方向。
黑木耳(A. polytricha)在植物分類學上是屬於真菌界,擔子菌門,有隔擔子菌亞綱,木耳目,木耳科,木耳屬其中的一種品種。目前台灣人工栽種的品種為黑木耳(A. polytricha)和毛木耳(A. auricula)。
因黑木耳與毛木耳均為膠質菌之成員,膠質菌主要特徵是菇體軟骨質具有彈性,在潮濕時呈現膠質狀,所以又有另一個名稱「果凍菌類」,黑木耳的生命力強,只要濕度夠,就能在中低海拔野外發現它,可以生長在腐木或是活的樹幹上,全株菇體的大小約2~12 cm,外形呈耳狀或淺圓盤形,色澤為棕褐色或深褐色,子實體光滑略有皺褶,黑木耳的子實體中沒有髓層,茸毛層的茸毛較短。黑木耳與毛木耳因外形特徵相似,人們常常混為一談,目前台灣市面上大都以黑木耳概稱此類的膠質菌,但經研究者向農林試驗所詢問台灣裁培之品系【農試收字第000259號】,得知目前台灣栽培均為毛木耳,毛木耳又分兩個品系,分別為「黑耳仔」及「紅耳仔」。「黑耳仔」以鮮食為主,適宜炒食;「紅耳仔」新鮮子實體形狀較「黑耳仔」扁平,顏色較黑且不帶紅色,背面毛狀較明顯,常用來做成乾貨。
毛木耳內含有大量多醣成份,具有獨特的物性和觸感,它的營養價值非常高,除了大量的醣類之外,纖維素的含量也很高,其中所含之蛋白質含量遠遠超過米麵。尚有維生素B2、鈣等營養素。木耳含有十七種以上胺基酸,其中有六種是人體必須的胺基酸。毛木耳是一種具有多方面功能的菇菌類,內部含有大量的具有醫學功能之多醣體,若能將此多醣體應用在保養品上,必可增加毛木耳的產品價值。
基於環保意識的抬頭,目前越來越多的研究開始聚焦在多醣體應用在化妝品上,各種來源的多醣體慢慢被開發出來。菇類含有的脂質少、醣質多,目前已有許多的研究顯示內含多醣體的醫學保健和保養效果。早在1986年就有日本的專利提出銀耳多醣體可以保存皮膚的水份,增加皮膚的光澤度及改善皮膚皺紋(Konishi. et al. 1986)。楊淑慧(2006)萃取銀耳多醣體應用於保濕產品,研究發現這類保養品可降低皮膚水份之流失,若長期使用還有淡化斑點的功效。楊淑惠等人(2007)更進一步實驗證實銀耳多醣體的保濕效果,並且研發較高萃取率的方法,適合用來量產此類產品。另外較少見的樟芝菌絲多醣體在抗老化也具有不錯的效果(鄭懿芳,2005)。香菇多醣體亦被證實具有抗氧化及保濕效果(任清,2008)。真菌類的粉末例如白木耳、黑木耳、紅麴菌對皮膚老化具有抑制效果(謝詠筌,2007)。由上面研究可知真菌內含的多醣體對皮膚具有良好的保養效果。另外海藻內部的多醣體也被廣泛使用,以重緣葉馬尾藻多醣加入化粧品原料中,發現此產品對於皮膚具有抗老化的功效,有此可知緣葉馬尾藻多醣可作為抗老化化粧品的有效成份(賴宜甄,2006)。有研究指出若在化妝品中加入由蘆薈所萃取出的多醣體,可以增加皮膚角質層的含水量(Dal’ Belo et al. 2006)。由發酵納豆中所萃耳出的納豆多醣體可以有效的減少皮膚水份的散失,並且增加角質層的含水量(Lu,2003)。而秋葵中的多醣體也被證實可以增加皮膚的保濕性及增加皮膚之彈性(吳勝豐,2007;吳政樺,2010)。由上可知,非動物性的多醣體具有皮膚保養的功能,適當的開發可取代具有爭議性的動物多醣體原料,增加天然化妝品產品的市場。
微脂粒包覆技術,近幾年廣泛運用於化妝品的製作,隨著化妝保養品市場的蓬勃發展,化妝保養品行業不斷推層出新,更積極研發出新的化妝品材料。此包覆技術能使化妝品成份分子細微化及增加其滲透性,應用於皮膚的作用時,能與角質細胞內的成份相容,再將化妝品的成分帶進皮膚的底層,且可防止易被氧化的保養成分遭受破壞。
微脂粒是1965年英國學者Alec Bangham發現的。微脂粒(Liposome)的構造為一層或多層的脂雙層中空球體,目前的技術能做出20~100奈米的粒徑,有自行密合的特性,在脂雙層的夾層中,可包覆疏水性物質,內層的水相區中,則可包覆親水性物質,可同時運送水溶性和油溶性物質,水溶性物質之溶液可包在球心,油溶性物質可夾在球皮膜層內(好像三夾板)。因此微脂粒可當做水溶性及油溶性藥物之載體。
微脂粒的成份為天然的磷脂質所構成,其中以磷脂質中的磷脂醯膽鹼(Phosphatidyl choline,PC)被廣泛應用於製備微脂粒,磷脂質(phosphatidyl choline,PC)是生物體的細胞膜主要組成之一,其具有親水極性基與疏水非極性基之脂肪酸鏈,因此在乳化製備過程中是一個良好的穩定劑,其外層脂質膜類似保護屏障使核心物質與外界隔離,來增加物質穩定性,以達到遮蓋、保護、儲存和控制物質的釋放、降低毒性及減少副作用等目的;亦可控制所包覆蕊質的滲透性、釋放活性、快速溶解或延緩釋放時間及增加其有效性等。
微脂粒的粒徑分佈在100 nm至2000 nm之間,其中脂質的成份,濃度及製備方法都會影響到微脂粒的型態,依微脂粒的大小及脂質層數來區分,可分為以下三個型態:
1. MLV(Multilamellar Vesicle)(多層微脂粒):其結構為一顆微脂粒內包有數個同心球,有如洋蔥。此結構因含多層的脂雙層,有利於脂溶性物質的包覆,而內部脂雙層的物質因外層的阻礙,所以物質釋放速度較慢,可以增加微脂粒對細胞的作用時間。
2. LUV(Large Unilamellar Vesicle)(單層大微脂粒):它是由單層的脂雙層形成的大微脂粒,因內部親水端形成的包覆空間大,可以有效的包覆親水性物質。
3. SUV(Small Unilamellar Vesicle)(單層小微脂粒):由單層脂雙層形成的小型微脂粒,因比LUV小,可包覆的水溶性物質相對較少。也因其粒徑很小,可以穿透皮膚或是血管壁。其製備方法超音波法及乾燥水合法。
以微脂粒作為傳輸載體技術,近年來除了醫藥製劑將微脂粒普遍應用在生物體內進行比例居多,其他應用領域也甚為廣泛,如羊毛、絲織物之染色加工、食品科技、動物飼料、民生工業、美容保養品…等。隨著生物科技時代的來臨,如何使化妝品長效附著及大幅提升化妝品的效能,與如何使化妝品成份分子細微化、增加滲透性,更成為各國化妝品產業全力投入研發的主要方向。以奈米技術為主要訴求的生技公司皆高功效與高安全性產品為主要重點發展。
微脂粒保養品為有效的皮膚保養劑型,因皮膚基本上是不透水的,對於油脂類的保養品無法有效的吸收,而水溶性的物質因分子大,不易滲透,只有少數物質可通使角質軟化,並滲透過角質層細胞膜,進入角質層細胞,然後通過表皮其他層。可以通過毛囊、皮脂腺及汗腺吸收的物質則更少數。微脂粒大小約為皮膚細胞的1/300,可以有效的穿透皮膚角質層並進入至真皮層,主要是利用微脂粒中所含的水份及皮膜之閉塞作用而達到保濕效果,而且微脂粒的成份磷脂質也可和皮膚的角質蛋白結合,進而被皮膚所吸收,而增加皮膚的保濕效果,還可以修補細胞。微脂粒將原來化妝品加入的水溶性機能成份,藉由脂雙層的內層包覆,再利用微脂粒與細胞的相容性,使得滲透至皮膚內層,進入到內層後,產生溫度變化及體內的酵素作用,慢慢的改變微脂粒的結構,而被包覆的活性物質得以慢慢釋放出來,在此緩釋作用中,活性物質的濃度可以維持一致。微脂粒對皮膚的滲透特性如下:
1. 形成生物膜,可以進入到皮膚深層。
2. 可以讓活性成分通過表皮間隙而送達真皮層之後,再慢慢將活性物質釋放出來。
3. SUV微脂粒可以經由毛囊汗腺到達皮膚的真皮層。
微脂粒化妝品有效的將活性物質送到皮膚深層,以達到保養效果,微脂粒的包覆作用可防止容易被氧化的保養成分(例如維他命C、E)遭到破壞,並且把活性成分包覆其中,以提高功效或穩定度,而這些裝有活性成分的微球顆粒小於毛細孔或細胞的間隙,可以輕易的通過表皮層間的間隙、毛囊或汗腺到達真皮層,並且將所携帶的活性成分緩緩的釋放出來,使得活性成分能長時間發揮作用。透過微脂粒的傳送載體,可以將抗氧化成分、美白成分、保濕成分、生化成分、胎盤素等等活膚成分,確實送達細胞內部,發揮最極限的功效。而運用微脂粒來傳送活性物質的好處:
1. 緩釋作用,即活性物質濃度在釋放歷程較一致。
2. 有效的傳送活性物質到皮膚內。
3. 增加活性物質被吸收的效果。
4. 增加活性物質的穿皮滲透性。
5. 可與次要基質分開傳送。
6. 粒子半生期長,屬於長效型。
7. 保持活性物質的穩定性,增加產品的保存期限。
但隨著生化科技對於奈米材料的需求增加,微脂粒不穩定等問題隨之而起。影響微脂粒聚集、融合以及包埋物質的滲漏等三項因素,如脂質之組成、外在環境、粒徑大小、pH值以及雙層結構之物理狀態的差異,皆會影響微脂粒的物理穩定性。其中以聚集、融合會造成微脂粒平均粒徑大小及分佈的改變,而滲透作用則會導致包覆物質的減少。而化學穩定性在微脂粒製備及保存過程中發生氧化或水解的自然反應而影響微脂粒之穩定性。
為因應大眾急於追求細緻膚質,而眾多保濕商品中該如何創造出具長效保濕使皮膚增加彈力,且安全無過敏的保濕產品,尋找天然物質與提高微脂粒的穩定性,是現階段化妝品市場的另一尋求及急於開發的產品。
有鑑於此,為解決上述問題,本發明提供一種多醣體萃取及凍晶微脂粒製備技術,本發明以毛木耳利用專利研磨技術進行破壁後以水浴萃取、酒精沈析進行多醣體成份萃取,以薄膜/高壓均質乳化法製備多醣體微脂粒,添加10%蔗糖作為抗凍劑,利用冷凍乾燥技術製備微脂粒凍晶並進行有效性、功能性及安全性評估,並找出多醣體凍晶微脂粒安定性之最佳化條件。
本發明以磷脂質作為載體,製備微脂粒(Liposome)包覆萃取物(多醣體),利用微脂粒穿透細胞吸收較容易特性,包覆多醣體能增加皮膚保濕、提升保濕功效與彈力之有效性。本發明以凍晶微脂粒型態配方添加抗凍劑,藉由抗凍劑的添加,使凍晶微脂粒產品之安定性與安全性更為提升。
本發明製備之多醣體凍晶微脂粒較一般市售產品的保濕效果更佳、且由天然植物中萃取之保濕材料,藉由冷凍乾燥技術及抗凍劑的添加,可使多醣體凍晶微脂粒安定性與配方安全性提升。
本發明除了探討不同毛木耳多醣體特性之外,再將不同之多醣體加入抗凍劑後以微脂粒包覆,進行凍晶之製備,最後以不同條件製得之毛木耳凍晶進行皮膚的測試。
另一方面,本發明凍晶微脂粒之安定性及最佳化條件將可提供產業界做為製備奈米材料的參考指標,本發明製備多醣體凍晶微脂粒之保濕產品將可為保濕產品市場及奈米材料帶來新穎性及進步性。
有關本發明的特徵與實作,茲以最佳實施例詳細說明如下:
毛木耳多醣體分離及製備以水浴浸提法搭配酒精沈析,來分離毛木耳中不同特性之多醣體。
先將乾木耳研磨成微米等級之粉末,稱重,加入99.5%之無水酒精去除色素,去除色素之濕木耳加入20倍之純水,浸泡還原,浸泡液減壓濃縮,進行乾燥,得到冷水可溶之多醣體A。濕木耳以恆溫水槽攝氏90度水浴萃取3小時,利用抽氣過濾,得到之濾液,進行減壓濃縮至少量,加入4倍體積之酒精,過濾懸浮物,進行冷凍乾燥,得多醣體B。濾液經減壓濃縮,冷凍乾燥得到多醣體C。
所得到之多醣體A為冷水可溶之多醣體,多醣體B為熱水可溶、酒精不溶之多醣體,多醣體C為熱水可溶、酒精可溶之多醣體,經乾後所得到之粗萃取率,結果如表1所示,其中以多醣體A之萃取率最高。
多醣粗萃取率=(WA~C/W2)×100%
WA~E:多醣體乾燥物重
W2:黑木耳乾重
毛木耳總醣的測定是採用的酚-硫酸法,以葡萄糖標準液0 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、200 mg/L,分別取1mL,加入0.5 mL 5%苯酚溶液,在各混合液中慢慢加入2.5 mL的濃硫酸,混合均勻後靜置30分鐘。以分光光度計測量葡萄糖標準液在490 nm吸光值的關係,所得到之檢量線,結果如圖1所示。
將萃取出的多醣體A、B、C配製成0.01%的多醣體溶液,編號為AP、BP、CP,各取1mL的多醣體溶液加入5%的酚,再沖入2.5mL的硫酸,混合後靜置30分鐘,以分光光度計測量490 nm的吸光值,將吸光值代入檢量線公式中,求得各多醣體的總醣含量,結果如表2所示。
使用薄膜水合法製備毛木耳多醣體微脂粒,實驗步驟如下:
a.取0.02 g的市售PC溶於99%的乙醇10 mL中,使用震盪器震盪使其完全溶解。
b.將溶解後的乙醇脂質放入茄形瓶中,利用減壓迴旋濃縮機去除乙醇溶劑,使其在茄型瓶內壁形成一層半透明的脂質薄膜。
c.配製0.01%黑木耳多醣體溶液,配方如表3所示,取0.01 g黑木耳萃取物溶於100 mL純水中,使用震盪器震盪使其完全溶解。
d.將多醣體溶液加入乙醇脂質茄形瓶內,使用震盪器震盪使其完全溶解,即可得到多層微脂粒(MLVs)。
e.將MLVs溶液以超音波細胞粉碎機在功率21W下震盪10分鐘,即可完成單層小微脂粒的製備。
因毛木耳多醣體為分子量較大之物質,進行微脂粒製備時,採用之多醣體與脂質的比例、超音波粉碎機及高壓均質乳化機採用之條件都可能影響微脂粒之包覆率。
a. 先將離心管(Ultra-0.5),以電子天平稱得空離心管之重量,得到數值備用(W1
)。
b. 取0.4 mL之多醣體微脂粒,注入過濾離心管內。
c. 以高速離心機離心,離心條件為4℃,轉速6000轉,離心2小時。
d. 離心完成後,取出過濾離心管,過濾離心管內為包覆物,離心管內為未包覆液。
a. 取未包覆液,連同離心管再次稱重,得到數值備用(W2
)。
b. 將未包覆液加入超純水稀釋10倍。
c. 取1 mL未包覆稀釋液加入0.5 mL 5%苯酚溶液,在混合液中慢慢加入2.5 mL的濃硫酸,將其混合均勻後靜置30分鐘。以分光光度計測量葡萄糖標準液在490 nm吸光值,代入檢量線公式,求得毛木耳未包覆PC前之總醣濃度(C1
)。
a. 先將空離心管稱重,得到數值備用(w3
)。
b. 將含有微脂粒之過濾離心管倒蓋於步驟1之空離心管。
c. 以高速離心機進行離心,離心條件為4℃,轉速6000轉,離心30分鐘。
d. 將含上層微脂粒之離心管稱重,得到數值備用(W4
)。
e. 將步驟4之微脂粒,以乙醇:微脂粒=10:1的比例,將微脂粒溶解在乙醇中。
f. 取1 mL已包覆稀釋液加入0.5 mL 5%苯酚溶液,在混合液中慢慢加入2.5 mL的濃硫酸,將其混合均勻後靜置30分鐘。以分光光度計測量葡萄糖標準液在490 nm吸光值,代入檢量線公式,求得毛木耳多醣體之被包覆之總醣濃度(C2
)。
利用高壓均質乳化法所測得之毛木耳多醣體之未包覆率及包覆率並進而得知各種多醣體之總還原率,結果如表4所示,其中以CL之包覆率最高為54.2%,AL之包覆率最低,只有39.4%。而未包覆率則是以BL之未包覆率較高,而CL之未包覆率最低。
配製0.01%之多醣體A、多醣體B及多醣體C溶液,以PC:多醣體為2:1的比例,製作毛木耳微脂粒,得到之多層微脂粒分別在超音波粉碎機功率21W及27W下震盪10分鐘,製得單層微脂粒,透過粒徑分析儀分析得到之微脂粒粒徑大小如表4-3,並以Student’s t-test檢定不同功率製備之微脂粒粒徑是否有顯著差異。結果如表5所示,發現在不同功率條件下AL之粒徑呈現極端顯著差異(P<0.001),CL粒徑呈現顯著差異(P<0.05),而BL之粒徑差異未達顯著。其中在功率21W條件下製得之微脂粒粒徑在96至119 nm之間,以AL粒徑最小為96 nm,CL之粒徑最大為119 nm。在功率27W條件下製得之微脂粒粒徑在111至133nm之間,BL及CL粒徑約在111 nm,AL粒徑較大為133 nm。
配製0.01%之多醣體A、多醣體B及多醣體C溶液,以PC:多醣體為2:1的比例,製作毛木耳微脂粒,得到之多層微脂粒以高壓均質機800 Bar十次循環進行單層微脂粒製備,製得之微脂粒以粒徑分析儀進行粒徑測量,結果如表6、圖2。AL的粒徑呈現極端顯著差異(P<0.001),BL的粒徑呈現極顯著差異(P<0.01),CL之粒徑呈現顯著差異(P<0.05)。以此條件製得之微脂粒粒徑在119 nm至182 nm之間,其中以多醣體B(BL2)之粒徑最小,而多醣體A(AL2)之粒徑最大。
綜合表5與6的結果得到不同製備方法微脂粒之粒徑,結果如圖2。以超音波粉碎法來製備微脂粒時,27W的功率所得到的粒徑均比21W的粒徑大,可見得高功率的條件對微脂粒的形成可能造成粒徑增大的影響。故本實驗之超音波粉碎法之條件以21W,10分鐘。而高壓均質乳化法中600Bar的壓力使BL的粒徑比800Bar時還要大,有可能是較低的壓力無法將多層微脂粒有效的擠壓成較小的單層微脂粒,故本發明採用之高壓均質乳化法條件為800Bar,十次迴圈。
微脂粒在儲存期間會隨著時間增加或是貯存環境之溫度而產生不穩定的變化,可能產生聚集、融合,或是包覆物外漏等現象,可能造成微脂粒之粒徑產生改變。
利用超音波粉碎法21W製備完成之微脂粒溶液分別儲存在常溫及4℃環境下,在28天的儲存期間內,分別於1、7、14、21、28天,在5個時間點取樣觀察受測樣品之粒徑大小,各樣品所測得之平均粒徑結果如表7、圖3,將測得之粒徑值以Excel 2007進行單因子變異數分析(ANOVA),並以LSD檢定其顯著性。由結果發現毛木耳多醣體A、多醣體B及多醣體C貯存在4℃之條件下4週後,AL-1除了在第7天微脂粒之粒徑未達顯著差異之外,其他BL-1、CL-1粒徑呈現顯著差異(P<0.001),而且隨著時間越久,顯著性越高。其中AL-1及CL-1的粒徑逐漸變小,顯示多醣體之包覆物可能產生滲露的情況。而BL-1之粒徑忽大忽小,呈不穩定的變化。
利用超音波粉碎法21W製備完成之微脂粒溶液貯存在25℃條件之下,AL-2、BL-2、CL-2在第7天時均產生結塊的現象,而粒徑已達顯著差異。其中AL-2及BL-2之粒徑變化無規律性,忽大忽小,CL-2之粒徑逐漸變大。
由此以上結果可知毛木耳微脂粒貯存在低溫的條件下,可以降低微脂粒粒徑之變化。
製備流程:
a.取1.2g的市售PC溶於99%的乙醇50 mL中,震盪使其完全溶解。
b.將溶解後的乙醇脂質放入茄形瓶中,利用減壓迴旋濃縮機去取0.6 g毛木耳萃取物溶於300mL純水中,使用震盪器震盪使其完全溶解。
c.將多醣體溶液加入乙醇脂質茄形瓶內,使用震盪器震盪使其完全溶解,即可得到多層微脂粒(MLVs)。
d.將高壓均質乳化機壓力調到600 Bar,取含有多層毛木耳微脂粒溶液,以十次回圈,即完成大量之毛木耳微脂粒之製備。
e. 將不同特性之毛木耳微脂粒配方(如表8所示)不加入或加入10%的蔗糖當作抗凍劑,以冷凍乾燥機進行凍晶的製備,凍晶條件為降溫1分鐘至-30℃,-30℃維持10小時,升溫1分鐘至-20℃,-20℃維持10小時,升溫1分鐘至-10℃,-10℃維持26小時,,升溫12小時至25℃,維持16小時。
利用高壓均質乳化法800Bar,十次迴圈所製得之不同特性之毛木耳微脂粒配方不加入或加入10%的蔗糖當作抗凍劑,以冷凍乾燥機進行凍晶的製備,製備完成之凍晶分別存放在4℃、25℃、45℃的環境中,第1天、第1週、第2週、第3週、第4週、第8週分別取出加入5 ml超純水還原,以粒徑分析儀測量粒徑大小,其粒徑大小如結果如表9、表10、表11所示。
貯存在4℃環境之下之凍晶,其中未加抗凍劑配方之樣品AC1、BC1及CC1,除了BC1之粒徑在第7天未達顯著標準外,其餘時間點之粒徑均達高度顯著差異(P<0.001),有加抗凍劑配方之樣品AC2、BC2及CC2,除了CC2之粒徑在第1週及第三週未達顯著標準外,其餘時間點之粒徑均達高度顯著差異(P<0.001)。
貯存在25℃環境之下之凍晶,其中未加抗凍劑配方之樣品AC1、BC1及CC1,三樣品在12週內各個時間點之粒徑均達高度顯著差異(P<0.001);有加抗凍劑配方之樣品AC2、BC2及CC2,三樣品之粒徑在第1週均未達顯著標準外,其餘時間點之粒徑均達顯著差異(P<0.01)。
貯存在45℃環境之下之凍晶,其中未加抗凍劑配方之樣品AC1、BC1及CC1,三樣品在12週內各個時間點之粒徑均達高度顯著差異(P<0.001),而且樣品出現結塊現象,PDI值均高於0.5;有加抗凍劑配方之樣品AC2、BC2及CC2,除AC2及BC2之粒徑在第3週均未達顯著標準外,其餘時間點之粒徑均達高度顯著差異(P<0.001)。
為評估含毛木耳多醣體之微脂粒,是否會造成人體皮膚的過敏與不適,因此徵求10位受測者,年齡在18-45歲,皮膚健康且無過敏病史,進行人體貼布(Finn chambers on scanpor貼布)測試。測試前先以肥皂清洗受測部位,在分別將取0.5 mL不同抗凍配方之微脂粒溶液滴於貼布內,並貼於上臂內側,待受測48小時後移除,觀察受測者的皮膚變化持續120小時,根據表12皮膚反應評價的評分法判斷是否有產生皮膚刺激感或過敏現象,並記錄其結果。若無表12所列之反應,則評分為0。
取樣品編號P1到編號P11之不同配方成份(如表13所示)及形態之毛木耳多醣體為受測樣品,採用Finn chambers on scapor貼布進行人體皮膚過敏測試。
10位年齡為18歲至45歲皮膚健康、無過敏病史的受試者,在清洗亁淨的手臂內側,接受48小時的貼布測試,撕下貼布後持續觀察72小時,依據皮膚反應評分表評分後,結果如表14所示,所有受測樣品之皮膚反應評分均為0,顯示此9組樣品配方均不會產生皮膚過敏之現象,亦不會造成皮膚紅腫等情形。顯示9組毛木耳多醣體配方對皮膚而言是安全無虞的。
徵求8位受測者,年齡在18-40歲,皮膚健康且無過敏病史,接受測試前24小時,手臂內側皮膚不塗抹任何保養品或藥品,於受測環境中待30分鐘後,以皮膚測試儀(CK Cologne Germay,Corneometer CM825PC)之探計測量手臂內側11個位置皮膚之含水量,每個位置探取10個數值,去除誤差值大之數值,取5個數值存檔為標準值。測試樣品如表13所示,含兩組對照組及9組實驗組。以1 mL的測試樣品浸濕2×2 cm之化妝棉,貼於手臂內測1分鐘,撕下化妝棉,在10分、20分、30、60分、90分120分、150分、180分鐘測量皮膚之含水量數值。表皮水分以儀器的arbitrary unit(a.u.)度量值計算,數值愈高水分含量愈高。
測試期間,受測者不從事激烈動作,受測者的試驗環境溫度及濕度維持一定,實驗環境條件為冷氣調節室溫25℃,並備有一盆補充空氣濕度之水。
皮膚含水量變化率(%)=(實驗時刻含水量-標準值)/標準值
以皮膚測試儀之探計測量手臂塗抺上測試樣品後,在0分、10分、20分、30、60分、90分120分、150分、180分鐘測量皮膚之含水量,以表皮之高頻電傳導a.u.值代表皮膚含水量,數值愈高代表皮膚水分含量愈高。測試數值轉換成含皮膚含水量變化率,其結果如表15所示。本實驗以正常皮膚為測試部位,採用兩組的對照組,一組為未塗抺任何產品,另一組則是塗抺凍晶使用之溶劑,由超純水機(Millipore,Synergy)所製造之超純水。實驗樣品9組為多醣體溶液、微脂粒溶液及凍晶還原溶液。
試驗結果發現未塗抺任何產品(P1)之皮膚,角質層水合量剛開始會有減少的情況,變化率在-10.5%至2.9%,但皮膚內部存在的天然保溼因子會適當的作用,因此角質層含水量會有增減的狀況,但以180分鐘後,整體的角質層含水量會減少,整體的角質層含水量變化率在-10.5%至7.1%之間。若是塗抹超純水於正常皮膚(P2),塗抺後30分鐘內皮膚角質層的含水量是增加的,含水量變化率在-1.2%至8.2%。但90分鐘後,含水量隨時間慢慢降低的,整體而言,塗抺超純水於正常皮膚180分鐘,角質層含水量變化率在-8.6%至8.3%之間。
塗抺多醣體溶液於正常皮膚,與對照組P1進行Student’s t-test檢定,P3、在10分鐘、20分鐘、30分鐘、90分鐘時,角質層之含水量變化率均達顯著(P<0.05),在180分鐘時更達高度顯著(P<0.001);與對照組P2進行Student’s t-test檢定,在P3分別在30、90、150分鐘時,角質層含水量變化率達顯著差異(P<0.05),在180分鐘時,更達高度顯著差異(P<0.001),角質層含水量變化率在17.5%至-1.5%之間。P4與對照組P1相比較,在10分、30分、60分、120分鐘時,角質層之含水量變化率均達顯著(P<0.05),在180分鐘時更達高度顯著(P<0.001);與對照組P2相比較,P4在60分鐘後,角質層含水量變化率達顯著差異(P<0.05)(90分鐘除外),在180分鐘時達高度顯著差異(P<0.001),角質層含水量變化率在16.8%至-7.6%之間。P5與對照組P1相比較,在10分分鐘時,角質層之含水量變化率達高度顯著(P<0.001),在在20分、60分120分時,角質層含水量變化率達顯著差異(P<0.05),在180分鐘時更達高度顯著(P<0.001);與對照組P2相比較,P5在20分、150分鐘後,角質層含水量變化率達顯著差異(P<0.05),在180分鐘時達高度顯著差異(P<0.001),角質層含水量變化率在15.4%至-4.4%之間。
塗抺多醣體微脂粒於正常皮膚時,P6與對照組P1相比較,角質層含水量變化率除了在90分鐘時未達顯著標準外,其餘時間均達顯著差異,在180分鐘時,更達高度顯著差異(P<0.001)。與對照組P2相比較時,任何時間點均達顯著差異,其中在20分及180分鐘時更高度顯著(P<0.001),角質層含水量變化率在17.3%至-1.7%之間。P7與對照組P1相比較,角質層含水量變化率除了在90分鐘時未達顯著標準外,其餘時間均達顯著差異,在10分、20分、180分鐘時,更達高度顯著差異(P<0.001)。與對照組P2相比較時,除10分、90分未達顯著標準外,其餘時間點均達顯著差異,其中在180分鐘時更達高度顯著(P<0.001),角質層含水量變化率在17.1%至-4.9%之間。P8與對照組P1相比較,角質層含水量變化率在10分及120分150分時達顯著差異(P<0.01),在180分鐘時即達高度顯著差異(P<0.001)。與對照組P2相比較時,在10分及120分、150分時達顯著差異,在180分鐘時達高度顯著(P<0.001),角質層含水量變化率在15.3%至-5.5%之間。
塗抺微脂粒凍晶還原後之溶液於正常皮膚,P9與對照組P1相比較,角質層含水量變化率除了在90分鐘時未達顯著標準外,其餘時間均達顯著差異,在10分及180分鐘時,更達高度顯著差異(P<0.001)。與對照組P2相比較時,除20分、30分未達顯著差異外,其餘時間點均達顯著差異(P<0.05),其中在180分鐘時更達高度顯著(P<0.001),角質層含水量變化率在15.7%至-2.1%之間。P10與對照組P1相比較,角質層含水量變化率在10分、20分、30分鐘時均達顯著差異,在10分、20分、180分鐘時,更達高度顯著差異(P<0.001)。與對照組P2相比較時,在10分20分、90分、180分時均達顯著差異(P<0.05),其中在180分鐘時更達高度顯著(P<0.001),角質層含水量變化率在22.3%至-5.6%之間。P11與對照組P1相比較,角質層含水量變化率在10分、20分、30分、150分、180分時達顯著差異(P<0.05),在10分、20分及180分鐘時更達高度顯著差異(P<0.001)。與對照組P2相比較時,在10分及、20分、30分、150分達顯著差異(P<0.05),在10分、180分鐘時達高度顯著(P<0.001),角質層含水量變化率在28.9%至-5.4%之間。
從皮膚保濕測試中發現塗抺毛木耳多醣體及微脂粒及凍晶還原液對皮膚的角質層含水量均有正向的改善,以塗抺180分鐘後的效果而言,除了多醣體B之外,多醣體A及多醣體C的改善效果以凍晶形態優於微脂粒形態,更優於多醣體形態。但是皮膚含水量容易受到許多因素干擾,以至於所得到之變化率範圍相當大,因素測試者本身肌膚的代謝情形,例如排汗及天然保濕因子運作情形及外在環境,例如空氣的相對濕度及測試者本身從事的活動或是探測位置的誤差等。
雖然已說明且描述了本發明之實施例,但是熟悉此項技術者可作各種修改及改良。並不意欲將本發明限制於如所說明之特殊形式,且所有不背離本發明之精神及範圍的修改都屬於如隨附之申請專利範圍中所界定之範圍內。
綜觀上述,本發明以其整體之組合與特徵而言,既未曾見諸於同類產品中,申請前亦未公開,誠已符合專利法之法定要件,依法提出發明專利之申請。
圖1葡萄糖標準液之檢量線;
圖2不同製備方法微脂粒之粒徑;
圖3微脂粒溶液分別儲存在常溫(25℃)及4℃環境下,在28天的儲存期間內,分別於1、7、14、21、28天,5個時間取樣觀察受測樣品之粒徑變化圖。
Claims (10)
- 一種多醣體萃取技術,其係以一研磨技術進行破壁後,提供一萃取方法搭配一溶劑作為萃取配方進行多醣體成份萃取。
- 如申請專利範圍第1項所述之多醣體萃取技術,其中該多醣體係萃取毛木耳所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之多醣體萃取技術,其中利用該研磨技術將毛木耳研磨至4微米所組成之群組中釋出。
- 如申請專利範圍第1項所述之多醣體萃取技術,其中該萃取方法係為水浴萃取,水浴溫度為攝氏90度、時間3小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之多醣體萃取技術,其中該溶劑係為純水及乙醇搭配不同比例所組成之群組。
- 一種多醣體凍晶微脂粒之製備技術,其至少包含下列步驟:提供一磷脂質作為載體,製備微脂粒;將該一微脂粒包覆多醣體萃取物形成多醣體微脂粒;以及由冷凍乾燥技術及添加抗凍劑來提高多醣體微脂粒安定性與安全性。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備技術,其中該微脂粒粒徑為101nm,係以薄膜/高壓均質乳化法進行製備。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備技術,其中該抗凍劑係選自10%蔗糖。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備技術,其中該多醣體凍晶微脂粒對皮膚不產生過敏現象。
- 如申請專利範圍第6項所述之製備技術,其中該多醣體凍晶微脂粒具有提高皮膚角質層含水量。
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