TW202220670A - 肌肉的分解抑制劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種能夠抑制肌肉分解的新穎技術。作為解決手段，是一種肌肉的分解抑制劑，其含有甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。

Description

肌肉的分解抑制劑
本發明關於肌肉的分解抑制，尤其關於抑制藉由表現Atrogin-1所引發之肌肉分解。
作為人體等中的肌肉分解，已習知例如年齡增加所造成的肌肉分解。具體而言，已知伴隨年齡增加的肌肉量的減少會從30歲左右開始，並且若超過60歲，肌肉減少率會變高。肌肉量的減少不僅會使生活品質(QOL)降低、和使由於跌倒造成的骨折、住院、臥病在床等的風險增加，也與急性疾病和外科手術後的預後惡化風險有關。作為與肌肉量的減少有關的疾病，可列舉例如：肌少症(Sarcopenia)。骨骼肌量及肌力降低至一定程度以上會被診斷為肌少症，並且實際上在60歲～69歲的年齡層被診斷為肌少症者約為10%，75歲以上的後期高齡者則為35%。
這樣由於年齡增加所造成的肌肉量的減少，認為主要原因在於肌肉分解的促進。 若具體地說明，肌肉量是藉由合成與分解的平衡所形成，其中，肌肉的合成會因運動和營養攝取而被促進。另一方面，肌肉分解則會因老化、不活動(臥床休息、失用性固定等)、營養不足、疾病等而被促進。
已知老化、不活動(臥床休息、失用性固定等)、營養不足、疾病等會增加體內所產生的發炎性細胞激素(例如，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及糖皮質素等的量，而該等細胞激素和賀爾蒙會促進肌肉分解。
認為高齡者大多會由於老化等而處於該等細胞激素和賀爾蒙的分泌過多的狀態，結果會促進肌肉分解。
在此處，作為能夠抑制高齡者的QOL的降低的技術，已提案有專利文獻1所揭示的技術。專利文獻1關於一種身體活動促進劑，其可支持肌肉量及活動量增加，並且是以一種乳酸菌即加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)作為有效成分。然而，雖然可藉由攝取專利文獻1所揭示的身體活動促進劑來使肌肉量增加，但是卻無法抑制肌肉分解。
另一方面，作為有關肌肉分解的技術，發明人至今也揭示了專利文獻2、專利文獻3。 [先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：日本特開2013-47192號公報。 專利文獻2：日本特開2016-216408號公報。 專利文獻3：日本特開2018-083761號公報。
[發明所欲解決的問題] 本發明的目的在於提供一種能夠抑制肌肉分解的新穎技術。 [解決問題的技術手段]
針對預防並改善肌肉的減少，藉由運動和營養攝取來促進肌肉的合成已受到關注，但是藉由從內部環境改善仍在進行的肌肉分解的原因，能夠有效率地預防並改善肌肉的減少。 已知肌肉分解會藉由蛋白質分解酶而發生，特別是泛素-蛋白酶體系統會加速肌肉分解。又，已知2個有關該系統的肌肉專一性(muscle-specific)泛素連接酶基因[MAFbx(muscle atrophy F-box)/Atrogin-1與MuRF1(muscle ring finger 1)]。 已知該等肌肉專一性泛素連接酶基因的表現會受到發炎性細胞激素、TNF-α、糖皮質素等而增加，其結果肌肉會被分解。因此，該等基因的表現是肌肉分解的指標之一。 發明人致力於研究的結果，發現藉由攝取甘油磷酸(glycerol phosphate)、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物可抑制Atrogin-1的表現，進而完成本發明。
本發明的主旨如下。 [1] 一種肌肉的分解抑制劑，其含有甘油磷酸(glycerol phosphate)、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。 [2] 如[1]所述之肌肉的分解抑制劑，其中，前述甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的重複單元的數量為1～110。 [3] 一種肌肉分解抑制用飲食品，其含有甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。 [4] 如[3]所述之肌肉分解抑制用飲食品，其中，前述甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的重複單元的數量為1～110。 [5] 一種抑制肌肉分解的方法，其包含攝取甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的步驟(但是該方法中可不包括對於人體的醫療行為)。 [6] 如[5]所述之抑制肌肉分解的方法，其中，前述甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的重複單元的數量為1～110。 [7] 一種甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物，其用以預防或治療與肌肉量的減少有關的疾病。 再者，甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物是以其原本的形態存在於[1]～[7]中。 [發明的效果]
根據本發明，能夠提供一種能夠抑制肌肉分解的新穎技術。
以下，詳述本發明的一實施形態。 本實施形態有關一種肌肉的分解抑制劑(以下，有時亦僅稱為分解抑制劑)，其含有甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。
甘油磷酸及其聚合物，例如能夠以具有如以下結構之化合物來表示，在以下的結構式中，當重複單元(monomer unit，單體單元)為1時，相當於單體即甘油磷酸。又，甘油磷酸及其聚合物，可以是鈉鹽、鋰鹽、鎂鹽等鹽。 本實施形態中的甘油磷酸、甘油磷酸鹽及該等的聚合物所具有的重複單元的數量並無特別限定，從進一步抑制肌肉分解的觀點來看較佳是1～110。
再者，甘油磷酸、甘油磷酸鹽及該等的聚合物所具有的重複單元中的甘油的部分羥基，可以被丙胺酸等胺基酸和葡萄糖等糖取代。 又，如同上述，甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物是以其原本的形態存在於本實施形態的分解抑制劑中。作為甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物，能夠例示合成而成者、經過處理並分離而得者等，該處理是從乳酸菌等細胞和如後述的脂壁酸(lipoteichoic acid)這樣分子量較大的化合物進行萃取和分解等。
Figure 02_image001
式中，n為1以上的整數。
本實施形態中，甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物例如能夠從乳酸菌等來獲得，除此之外，也能夠使用市售品。 本實施形態中，當要從乳酸菌等獲得甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物時，能夠藉由習知的方法來獲得，例如根據專利文獻3，從乳酸菌萃取脂壁酸，並且進一步將脂壁酸分解。具體而言，首先將已粉碎的菌體懸浮於水等溶液中，藉由離心來回收上清液。繼而，將使用丁醇或苯酚而從上清液獲得的萃取物進行精製，來獲得脂壁酸(以下，亦稱為LTA)，使用酸等對該脂壁酸實行分解處理，而獲得甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。
本實施形態的分解抑制劑只要能夠獲得本發明的效果，可包含甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物以外的其他成分。本實施形態的分解抑制劑的態樣並無特別限定，能夠製造並作成醫藥品、準醫藥品或飲食品等。 當作成醫藥品、準醫藥品或飲食品時，使用甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物作為有效成分，並且能夠與賦形劑、黏合劑、穩定劑、崩散劑、潤滑劑、矯味劑、懸浮劑、包覆劑、其他任意成分適當地混合並依照一般方法來進行製劑化。作為劑形，能夠是錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑、糖漿劑等，並且期望將該等劑形進行經口性的投予。 又，雖然並未特別限定，當製造為作為飲食品的態樣時，除了一般的飲食品之外，可以是特定保健用食品等特別用途食品或機能性標示食品、營養機能食品等。作為飲食品的具體例，能夠列舉例如：營養輔助食品(營養補充品，supplement)；軟性飲料，其是碳酸飲料、茶飲料、咖啡飲料、果汁飲料、運動飲料等；乳製品，其是牛乳、加工乳、乳酸菌飲料、乳飲料、發酵乳、優格、乳酪、調製乳粉、幼兒用乳粉等食品、授乳婦人用乳粉等食品等；點心麵包類，其是果凍、糖果、美乃滋等蛋加工品、麵包、餅乾(biscuit)、脆餅乾(cracker)、披薩薄餅(pizza crust)、白脫餅(butter cake)、冰淇淋、軟糖、口香糖等；流動食品、病患用食品等。 又，本實施形態的分解抑制劑，例如也可作成用於家畜用途的飼料，其例如將甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物作為飼料原料來進行調配。
本實施形態的分解抑制劑的每日攝取量並無特別限定，例如當在成人的情況下，只要以能夠攝取0.1～10g且較佳是0.5～5g的本實施形態中的甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的方式來調整調配量等即可。本實施形態的肌肉的分解抑制劑中的甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的含有比例也沒有特別限定，只要配合製造的容易性和較佳的一日投予量等來適當調節即可。
以上，根據本實施形態能夠提供一種能夠抑制肌肉分解的新穎技術。 例如，使患者等對象攝取足以預防或治療所需的量的甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。具體而言，本實施形態中的攝取甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的態樣並無特別限定，例如能夠以醫藥品、準醫藥品、食品等態樣來進行攝取，該等態樣包含甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。其結果，能夠抑制對象體內的肌肉分解。具體而言，能夠抑制與肌肉分解有關的肌肉專一性泛素連接酶基因Atrogin-1的表現。 因此，雖然會有個人差異，但是仍能夠期待例如下述效果：抑制藉由年齡增加等所導致的肌肉分解而抑制肌肉量的減少。因而，甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物能夠用於用以預防或治療肌少症等與肌肉量的減少有關的疾病。又，本實施形態中的甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物例如能夠從乳酸菌株等獲得，而能夠較為價廉地進行大量供給，並且安全性極高。 [實施例]
以下，藉由實施例進一步詳細地說明本發明，但是本發明不限於此。 [樣品等的調製、試驗條件] (1)試驗菌株及培養條件。 表1中記載供以試驗的乳酸菌菌株。乳酸菌在Lactobacilli MRS Broth(乳酸桿菌篩選培養基)中培養一晚。將經培養的細菌細胞以200×g且20℃的條件離心分離10分鐘，利用滅菌水洗滌，並在90℃中加熱30分鐘使細胞失活，然後進行冷凍乾燥。
[表1]
Figure 02_image002
(2)胜肽多醣體(Peptide Glycan，以下亦稱為PG)的調製 將菌體(Lactobacillus gasseri JCM 1131T，乾燥重量6.4g)懸浮於80ml滅菌水中，使用濕式微粒化裝置Star Burst Mini(杉野機械股份有限公司)進行破碎。冷卻至室溫後，將破碎菌體懸浮液以4200×g且4℃的條件離心分離50分鐘。將所獲得的沉澱物利用滅菌水洗滌數次，然後進行冷凍乾燥。將冷凍乾燥後的沉澱物利用10%(v/v)三氯乙酸(TCA)在100℃中處理20分鐘後，利用三氯甲烷及滅菌水洗滌數次，在20℃中以5900×g的條件離心分離20分鐘來去除TCA。利用乙醇及二乙基醚進行連續洗滌後，將沉澱物進行冷凍乾燥，來作為PG使用。
(3)脂壁酸的調製 在(2)所獲得的破碎菌體懸浮液的上清液中以水添加等量的1-丁醇。在室溫中將混合物攪拌30分鐘，在20℃中以5900×g的條件離心分離20分鐘。回收下半部的水層，進行冷凍乾燥，然後溶解在100mM乙酸鈉緩衝液(pH4.7)中的15%(v/v)1-丙醇中。使該溶液通過0.45μm的過濾器後，注入Octyl Sepharose 4 Fast Flow管柱(奇異醫療(GE Healthcare)公司)。利用100mM乙酸鈉緩衝液(pH4.7)中的15、25、35及45%(v/v)1-丙醇階段性地進行溶出。LTA是利用包含25及35%(v/v)1-丙醇之乙酸鈉緩衝液所溶出。將經溶出的LTA部分(fraction)進行濃縮，並利用滅菌水進行透析並實行冷凍乾燥。 對於表1所示的其他4種菌株亦實行相同的操作，並分別從不同菌株取得LTA。
(4)甘油磷酸鹽及甘油磷酸聚合物的調製 從源自各別的5種菌株的LTA調製甘油磷酸聚合物(以下，亦稱為Poly-GroP)。LTA的甘油磷酸聚合物的磷酸二酯鍵的裂解，是藉由添加98%(v/v)乙酸並在100℃中處理3小時來實行。藉由離心蒸發去除乙酸後，利用三氯甲烷/甲醇/水(1:1:0.9，v/v)將生成物進行分層。將有機層使用來作為醣脂質錨定部分(glycolipid anchor fraction)，並將水層使用來作為甘油磷酸聚合物部分(Poly-GroP fraction)。 sn-甘油-1-磷酸鈉是從西格瑪奧瑞奇公司(Sigma-Aldrich Corp.)購入。
(5)點漬法(dot blotting) 預先利用甲醇潤濕聚偏二氟乙烯膜(奇異醫療公司)，並浸漬於磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)中。將樣品點印(spotting)於濕潤膜上。利用包含0.1%(v/v)聚山梨酯20之PBS中的5%(w/v)脫脂乳在室溫中將經印漬的膜進行阻斷(blocking)60分鐘。將經阻斷的膜浸漬於小鼠抗LTA單株抗體55(Hycult Biotech公司)的1:500稀釋液中，在室溫中培育60分鐘，繼而利用山葵過氧化酶標記山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體(Cell Signaling Technology, Inc.)的1:1000稀釋液使膜在室溫中反應60分鐘。專一性結合使用化學冷光西方墨點偵測試劑(ECL Prime Western Blotting Detection Reagent，奇異醫療公司)來進行偵測。
(6)細胞試驗(針對Atrogin-1的表現抑制的試驗) 使用小鼠橫紋肌細胞C2C12細胞(KAC Co., Ltd.)。以成為2.0×10 4個/ml的方式將C2C12細胞懸浮於含10%胎牛血清、1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-Streptomaycin)且含有高葡萄糖之杜氏改良英格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，Sigma-Aldrich Corp.)，並在12孔盤中各添加1ml後，在37℃且5%CO 2的條件下，每隔2～3天更換培養基並培養至90%滿盤(confluent)為止。 繼而，更換為含2%小牛血清、1%青黴素-鏈黴素且含有低葡萄糖之杜氏改良培養基，每隔2～3天更換培養基並培養6天，使C2C12細胞分化。之後，添加含1%青黴素-鏈黴素(Penicillin-Streptomaycin)且含有高葡萄糖之杜氏改良培養基。在該培養基中添加檢體，並以已知會使骨骼肌中的Atrogin-1的表現提升的地塞米松(DEX)成為1μM方式添加至培養基中。再者，參考試驗例1、參考試驗例3、試驗例1及試驗例2中則以成為100μg/ml的濃度的方式添加檢體。參考試驗例2中則以成為100μg/ml或1000μg/ml的濃度的方式添加檢體。 之後，使用RNeasy Plus Mini(Qiagen公司)來回收細胞的RNA。RNA以成為100ng/ml的方式使用滅菌蒸餾水稀釋，並使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems公司)來作成cDNA。進一步使用QuantStudio3 (Applied Biosystems公司)實行GAPDH及Atrogin-1的表現量測定，來求出Atrogin-1/GAPDH的值。針對測定使用Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems公司)。又，作為引子，Atrogin-1的表現使用Atrogin-1F即5'-ATCCCAGCACACGACAACAC-3'及Atrogin-1R即5'-CGGCAACTGCATCTCTTC-3'，GAPDH的表現使用GAPDH F即5'-ATGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3'及GAPDH R即5'-TGCCTGCTTCACCACCTTC-3'。並以N=6實施測定。
(7)統計分析 數據分析是使用鐘形曲線(BellCurve，SSRI)，並基於Dunnett檢定來實行。P＜0.1或P＜0.05的值在統計上被認為顯著。
[試驗結果] 參考試驗例1：熱致死菌體(以下，亦稱為HK)對於Atrogin-1的表現抑制的確認 將結果顯示於第1圖。供以試驗的5種菌株都抑制了藉由DEX所促進的Atrogin-1的表現。
參考試驗例2：熱致死菌體及源自各別菌體的LTA、PG對於Atrogin-1的表現抑制的確認 將結果顯示於第2圖。藉由Lactobacillus gasseri JCM 1131T的熱致死菌體、源自該熱致死菌體的LTA可抑制藉由DEX所促進的Atrogin-1的表現。
參考試驗例3：LTA對於Atrogin-1的表現抑制的確認 將結果顯示於第3圖。從供以試驗的5種菌株萃取出的LTA都抑制了藉由DEX所促進的Atrogin-1的表現。
試驗例1：LTA分解物對於Atrogin-1的表現抑制的確認 將結果顯示於第4圖。 LTA分解物之中，甘油磷酸聚合物顯著地抑制了藉由DEX所促進的Atrogin-1的表現(第4圖A)。 又，試驗菌株的甘油磷酸聚合物中的共同成分即sn-甘油-1-磷酸酯(sn-glycerol-1-phosphate)也顯著地抑制了Atrogin-1的表現(第4圖B)。
試驗例2：經減少甘油磷酸聚合物量的菌體對於Atrogin-1的表現抑制的確認 除了使用不添加MnSO 44H 2O之Lactobacilli MRS Broth以外，以與(1)相同的條件實行Lactobacillus gasseri JCM 1131T的培養及處理，來獲得甘油磷酸聚合物量已減少的熱致死菌體。甘油磷酸聚合物量減少的確認是藉由點漬法來實行(第5圖A)。 將所獲得的熱致死菌體供以確認Atrogin-1的表現抑制的細胞試驗時，發現一般的菌體可抑制藉由DEX所促進的Atrogin-1的表現，另一方面經減少甘油磷酸聚合物量的菌體卻無法抑制Atrogin-1的表現(第5圖B)。
無
第1圖是顯示熱致死菌體(heat-killed baterium)對於Atrogin-1的表現抑制的試驗結果的圖。誤差槓顯示SD(標準差，n=6)。 第2圖是顯示熱致死菌體(Lactobacillus gasseri JCM 1131T)、LTA、PG對於Atrogin-1的表現抑制的試驗結果的圖。誤差槓顯示SD(n=6)。 第3圖是顯示LTA對於Atrogin-1的表現抑制的試驗結果的圖。誤差槓顯示SD(n=6)。 第4圖是顯示LTA分解物及甘油磷酸鹽對於Atrogin-1的表現抑制的試驗結果的圖。誤差槓顯示SD(n=6)。 第5圖是經減少甘油磷酸聚合物量的菌體對於Atrogin-1的表現抑制的試驗結果的圖。第5圖B中誤差槓顯示SD(n＝6)。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (6)

  1. 一種肌肉的分解抑制劑，其含有甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。
  2. 如請求項1所述之肌肉的分解抑制劑，其中，前述甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的重複單元的數量為1～110。
  3. 一種肌肉分解抑制用飲食品，其含有甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物。
  4. 如請求項3所述之肌肉分解抑制用飲食品，其中，前述甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的重複單元的數量為1～110。
  5. 一種抑制肌肉分解的方法，其包含攝取甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的步驟。
  6. 如請求項5所述之抑制肌肉分解的方法，其中，前述甘油磷酸、甘油磷酸鹽及/或該等的聚合物的重複單元的數量為1～110。
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