TW202200185A - 用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物、用以抑制第４型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，及具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法 - Google Patents

用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物、用以抑制第４型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，及具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法 Download PDF

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Abstract

本發明之目的為提供可抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之方法，及具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法。 本發明係關於一種經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，該組成物包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。

Description

用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物、用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，及具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法
本發明係關於用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物及用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物。此外，本發明係關於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法及抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之方法。本發明又關於具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法等。
將皮膚加以大致區分，從表面起係由表皮、真皮共2層所構成。表皮從深層起係由基底層、有棘層、顆粒層、角質層共4層所構成，基底層係經由基底膜而與真皮進行接合。基底膜係由第4型膠原蛋白、第7型膠原蛋白等成分所構成，有使表皮的基底層與真皮進行結合等功用，但隨著年齡增長，其功能降低。
就皮膚而言，有防止異物從外部侵入至生物體，或者藉由防止體內之水分從皮膚中過量地蒸發而維持皮膚的水分之屏障功能。若皮膚屏障功能因年齡增長等原因而降低，則會成為乾燥肌等的原因。在專利文獻1中，已記載包含線狀阿司巴拉妥(Aspalathus linearis)的萃取物等之皮膚屏障功能改善劑。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特開2009-256244號公報
[發明所欲解決之課題]
本發明之目的為提供可抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物。本發明之又一目的為提供用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物。此外，本發明之目的為提供抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之方法，及抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之方法。再者，本發明之目的為提供具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法。 [解決課題之手段]
本發明者為了解決上述課題而進行研究之結果，發現藉由在皮膚細胞中抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，便可抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能。本發明者係基於該種見解進一步進行研究，遂完成本發明。
雖然並不限定於此，但本發明包含以下用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物、用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物等。 [1]一種經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，該組成物包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。 [2]如上述[1]所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為薔薇，耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，山茶科山茶屬植物為茶樹，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷。 [3]如上述[1]或[2]所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為包含選自由飛燕草素(delphinidin)型花青苷(anthocyanin)、玫瑰花青苷(rosacyanin)化合物及玫瑰飛燕草素苷(rosadelphin)化合物所組成之群組之1種以上化合物之薔薇花瓣，山茶科山茶屬植物為茶樹的葉，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草的花，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷全草。 [4]一種用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其包含金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物作為有效成分。 [5]如上述[4]所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅，車前科車前屬植物為大車前草。 [6]如上述[4]或[5]所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅的葉，車前科車前屬植物為大車前草種子。 [7]如上述[4]~[6]中任一項所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其係經由抑制基底膜功能的降低或改善該功能而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。 [8]如上述[7]所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，抑制基底膜功能的降低或改善該功能係經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現。 [9]一種用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其包含基底膜功能的降低抑制或改善劑作為有效成分。 [10]如上述[9]所記載之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，基底膜功能的降低抑制或改善劑係經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制基底膜功能的降低或改善基底膜功能。 [11]一種用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。 [12]如上述[11]所記載之用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為薔薇，耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，山茶科山茶屬植物為茶樹，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草，車前科車前屬植物為大車前草，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷。 [13]如上述[11]或[12]所記載之用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為包含選自由飛燕草素型花青苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飛燕草素苷化合物所組成之群組之1種以上化合物之薔薇花瓣，山茶科山茶屬植物為茶樹的葉，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅的葉，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草的花，車前科車前屬植物為大車前草種子，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷全草。 [14]如上述[1]~[13]中任一項所記載之組成物，其係皮膚外用劑。 [15]如上述[1]~[14]中任一項所記載之組成物，其係化妝料。 [16]一種選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物的使用，其係用於藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。 [17]一種金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物的使用，其係用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。 [18]一種選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物的使用，其係用於抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善前述表現。 [19]一種藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物。 [20]一種抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物。 [21]一種抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善前述表現之方法，其係投予選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物。 [22]一種具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法，其包含將人類表皮角化細胞於活體外(in vitro)以包含被驗物質之培養基或不含上述被驗物質之對照培養基進行培養之步驟，以及將以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞及以對照培養基進行培養而得之對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量進行比較之步驟，在以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量多於上述對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量之情況，選擇上述被驗物質作為具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質。 [發明效果]
藉由本發明，可提供可抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物。此外，根據本發明，可提供用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物。此外，根據本發明，可提供抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之方法，及抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之方法。根據本發明，可提供具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法。
本發明之第一態樣為一種用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。亦將本發明之第一態樣的用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物稱為本發明之第一態樣的組成物。 上述萃取物具有抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之作用。抑制第4型膠原蛋白之表現的降低包含抑止第4型膠原蛋白之表現降低的進展、維持第4型膠原蛋白之表現、減輕(緩和)第4型膠原蛋白之表現降低的程度等。改善第4型膠原蛋白之表現包含使第4型膠原蛋白之表現恢復等。恢復包含至少部分地恢復。就第4型膠原蛋白之表現而言，包含編碼出第4型膠原蛋白之基因之表現及以第4型膠原蛋白的蛋白質水平計之表現，可為此等中之任一者或兩者。第4型膠原蛋白較佳為人類的第4型膠原蛋白，更佳為人類第4型膠原蛋白α1鏈。人類第4型膠原蛋白α1鏈為第4型膠原蛋白A1(COL4A1)基因所編碼出之蛋白質。在一態樣中，本發明之用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物可藉由抑制人類第4型膠原蛋白α1鏈之表現的降低或改善該表現，而使用於抑制人類中之第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現。
第4型膠原蛋白之表現會因紫外線等外在因素或年齡增長等內在因素而降低(表現量減少)。 如後述實施例所示，若在表皮角化細胞中抑制第4型膠原蛋白之表現降低或改善表現，則皮膚的經上皮電阻值(TEER)的降低會受到抑制或改善。此表示皮膚屏障功能的降低受到抑制或皮膚屏障功能受到改善。藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之詳細的機制並不確定，但經推定為由於第4型膠原蛋白為基底膜的成分，故藉由抑制或改善第4型膠原蛋白之表現的降低，基底膜之功能的降低便受到抑制或該功能便受到改善，皮膚的恆定性受到維持之結果，皮膚屏障功能的降低便受到抑制或該功能便受到改善。從而，期待可藉由抑制基底膜功能的降低或改善該功能而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。由於上述植物或酵母的萃取物具有優異的抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之作用，故可使用於抑制基底膜功能的降低或改善該功能。 從抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之效果之觀點而言，在本發明之第一態樣的組成物中，上述萃取物較佳為選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物以及薔薇科蚊子草屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上。
所謂皮膚屏障功能，係指防止異物從外部侵入至生物體，或者藉由防止體內之水分從皮膚中過量地蒸發而維持皮膚的水分之皮膚的屏障功能。抑制皮膚屏障功能的降低包含抑止皮膚屏障功能的降低的進展、維持皮膚屏障功能、減輕(緩和)皮膚屏障功能的降低的程度等。改善皮膚屏障功能包含使皮膚屏障功能恢復等。皮膚屏障功能的降低亦可為年齡增長所引發之皮膚屏障功能的降低、紫外線暴露所引發之皮膚屏障功能的降低等。
如上述，藉由抑制基底膜功能的降低或改善該功能，便能夠抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能。 本發明之第二態樣為一種用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其包含基底膜功能的降低抑制或改善劑作為有效成分。以下，亦將本發明之第二態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物稱為本發明之第二態樣的組成物。
作為基底膜之功能，已知連接表皮與真皮之機械性支撐，或表皮與真皮之間之物質交換的選擇性過濾器等功能。抑制第4型膠原蛋白等基底膜成分之表現的降低或改善該表現係有效於抑制基底膜功能的降低或改善該功能。 基底膜功能的降低抑制或改善劑只要是具有抑制基底膜功能的降低或改善該功能之作用，例如抑制基底膜的構成成分之表現的降低或改善該表現之作用者即可，並無特別限定。基底膜功能的降低抑制或改善劑較佳係經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制基底膜功能的降低或改善基底膜功能。就基底膜功能的降低抑制或改善劑而言，可使用例如具有抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之作用之上述植物或酵母的萃取物。在一態樣中，作為基底膜功能的降低抑制或改善劑，可使用選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物。 上述萃取物之中，作為基底膜功能的降低抑制或改善劑，較佳為選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物以及薔薇科蚊子草屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上。
本發明之第三態樣為一種經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，該組成物包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。以下，亦將本發明之第三態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物稱為本發明之第三態樣的組成物。 在本發明之第三態樣的組成物中，上述萃取物較佳為選自由葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物以及薔薇科蚊子草屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上。
本發明之第四態樣為一種用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其包含金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物作為有效成分。以下，亦將本發明之第四態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物稱為本發明之第四態樣的組成物。本發明之第四態樣的組成物較佳係包含金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物作為有效成分。
本發明之第三態樣的組成物及第四態樣的組成物中所使用之上述萃取物具有抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之作用。藉此，便能夠抑制基底膜功能的降低或改善該功能。在一態樣中，本發明之第三態樣及第四態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物可經由抑制基底膜功能的降低或改善該功能，而使用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。此外，本發明之第四態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物可經由透過抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現來抑制基底膜功能的降低或改善該功能，而使用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。在一態樣中，本發明之第四態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物可藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而使用於抑制或改善皮膚屏障功能的降低。
以下，亦將本發明之第一態樣的用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物、第二態樣、第三態樣及第四態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物總稱為本發明之組成物。在本發明之組成物中，亦可組合2種以上上述萃取物而使用作為有效成分。
在本發明中，薔薇科薔薇屬(Rosaceae Rosa)植物為以雜種薔薇(Rosa hybrida)(學名)為代表之薔薇科薔薇屬的薔薇。 作為薔薇科薔薇屬植物，較佳為包含選自由飛燕草素型花青苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飛燕草素苷化合物所組成之群組之1種以上化合物之薔薇，更佳為在花瓣中包含選自由飛燕草素型花青苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飛燕草素苷化合物所組成之群組之1種以上化合物之薔薇。該等之中，較佳為在花瓣中包含飛燕草素型花青苷之薔薇。
飛燕草素型花青苷為在呈現紫色或藍色之花瓣中大量包含之色素。作為飛燕草素型花青苷，可列舉飛燕草素、錦葵素(malvidin)、矮牽牛素(petunidin)或該等經醣、醯基等修飾而得之化合物。作為包含飛燕草素型花青苷之薔薇，可列舉呈現藍系或淡紫色系色調之薔薇，例如Suntory blue rose Applause(註冊商標)等品種的薔薇。可藉由例如日本專利5697040號公報等所記載之方法，以HPLC確認在薔薇中包含飛燕草素型花青苷。
玫瑰花青苷化合物為選自由玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2及玫瑰花青苷B所組成之群組之1種以上化合物。包含玫瑰花青苷化合物之薔薇只要是包含1種以上上述化合物之薔薇即可，較佳為包含玫瑰花青苷A1、玫瑰飛燕草素苷A2及玫瑰飛燕草素苷B之薔薇。玫瑰花青苷A1為在下述通式(I)中，R1 為氫原子之化合物，玫瑰花青苷A2為在下述通式(II)中，R2 為氫原子之化合物，玫瑰花青苷B為在下述通式(III)中，R3 為氫原子之化合物。
Figure 02_image001
(上述式中，葡萄糖之1位的羥基之配位(波線)顯示出α體與β體之互變異構性。R1 表示氫原子或羥基)。
Figure 02_image003
(上述式中，R2 表示氫原子或羥基)。
Figure 02_image005
(上述式中，R3 表示氫原子或羥基)。
作為包含玫瑰花青苷化合物之薔薇，可列舉呈現藍系或淡紫色系色調之薔薇，例如紫夫人(Madame Violet)、紫雨(Purple Rain)、薰衣草(Lavande)、曼哈頓藍(Manhattan Blue)、尚蒂伊蕾絲(Chantilly Lace)、藍月(Blue Moon)、黃昏(Tasogare)、戴高樂(Charles de Gaulle)、紫羅蘭多莉(Violet Dolly)、藍絲帶(Blue Ribbon)、青空(Aozora)、X女士(Lady X)、藍寶石(Blue Bajou)、純銀(Sterling silver)等品種的薔薇。此等薔薇係在花瓣中包含玫瑰花青苷化合物，因而較佳。
玫瑰飛燕草素苷化合物為選自由玫瑰飛燕草素苷A1、玫瑰飛燕草素苷A2及玫瑰飛燕草素苷B所組成之群組之1種以上化合物。包含玫瑰飛燕草素苷化合物之薔薇只要是包含1種以上上述化合物之薔薇即可，較佳為包含玫瑰飛燕草素苷A1、玫瑰飛燕草素苷A2及玫瑰飛燕草素苷B之薔薇。玫瑰飛燕草素苷A1為在上述通式(I)中，R1 為羥基之化合物，玫瑰飛燕草素苷A2為在上述通式(II)中，R2 為羥基之化合物，玫瑰飛燕草素苷B為在上述通式(III)中，R3 為羥基之化合物。
上述玫瑰飛燕草素苷化合物不存在於野生種的薔薇中，其係在以基因重組等手法導入編碼出類黃酮3’,5’-羥化酵素之基因(以下，亦稱為類黃酮3’,5’-羥化酵素基因)而得之薔薇，或以基因重組薔薇作為親本所獲得之具有類黃酮3’,5’-羥化酵素基因之薔薇中，屬於藍色色素之飛燕草素被合成出，於其上鍵結沒食子酸酯或鐵馬寧(tellimagrandin)類所生成之化合物。
作為包含上述玫瑰飛燕草素苷化合物之薔薇，可使用以基因重組等手法導入類黃酮3’,5’-羥化酵素基因而得之薔薇，及以此種基因重組薔薇作為親本所獲得之具有類黃酮3’,5’-羥化酵素基因之薔薇。作為此種薔薇，可使用例如Suntory blue rose Applause(註冊商標)等品種的薔薇。已知在Suntory blue rose Applause(註冊商標)的花瓣中，包含玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2及玫瑰花青苷B以及玫瑰飛燕草素苷A1、玫瑰飛燕草素苷A2及玫瑰飛燕草素苷B(例如WO2010/110382)。Suntory blue rose Applause(註冊商標)可由Suntory Flowers股份有限公司(日本國，東京都)取得。具有類黃酮3’,5’-羥化酵素基因之薔薇亦可藉由WO2010/110382等所記載之方法予以製作。作為類黃酮3’,5’-羥化酵素基因，可列舉WO2004/020637所記載之源自植物之基因，較佳為例如源自菫菜屬三色菫(菫菜屬黑色三色菫(Viola spp. cv Black Pansy)等)之類黃酮3’,5’-羥化酵素基因等。具有類黃酮3’,5’-羥化酵素基因之薔薇係在花瓣中包含玫瑰飛燕草素苷化合物，因而較佳。另外，本說明書中所記載之學術文獻及專利文獻全部皆併入本說明書中作為參照。
可藉由例如WO2010/110382、WO2015/ 178385等所記載之方法，以HPLC-TOF-MS確認在薔薇中包含玫瑰花青苷化合物及/或玫瑰飛燕草素苷化合物。
葡萄種子及果皮為葡萄科葡萄屬(Vitaceae Vitis)植物的葡萄(學名Vitis spp.)的種子及果皮。葡萄的品種並無特別限定，可列舉例如卡本內蘇維翁(Cabernet Sauvignon)、康科德(Concord)、梅洛(Merlot)、麝香貝利A(Muscat Bailey A)等黑葡萄；夏多內(Chardonnay)、甲州等白葡萄等。該等之中，較佳為夏多內或黑葡萄，更佳為黑葡萄，再佳為卡本內蘇維翁、梅洛等。葡萄種子及/或果皮的萃取物中之葡萄可為1種，亦可為2種以上。葡萄種子及/或果皮的萃取物較佳為葡萄種子及果皮的萃取物。
作為耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母，較佳為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物較佳為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的萃取物。
作為山茶科山茶屬(Theaceae Camellia)植物，較佳為茶樹(學名Camellia sinensis)。 作為金縷梅科金縷梅屬(Hamamelidaceae Hamamelis)植物，較佳為北美金縷梅(學名Hamamelis virginiana)。 作為薔薇科蚊子草屬(Rosaceae Filipendula)植物，較佳為旋果蚊子草(學名Filipendula ulmaria)。
作為車前科車前屬(Plantaginaceae Plantago)植物，較佳為大車前草(學名Plantago major)。 作為唇形科薄荷屬(Lamiaceae Mentha)植物，較佳為辣薄荷(學名Mentha x piperita)。
就植物萃取物的調製而言，可使用上述植物的任意部位，例如根、根莖、莖、葉、枝、樹皮、花、種子(包含種皮、胚芽、胚乳、胚軸、子葉等)、果實(包含果肉、果皮)或此等中之複數種組合。可藉由將此植物的任意部位以溶媒進行萃取而製造植物萃取物。 作為用於製作植物萃取物之較佳部位，可列舉例如以下部位。作為本發明中之植物萃取物，較佳為植物的下述部位的萃取物。 薔薇科薔薇屬植物較佳為花，特定而言，花瓣。葡萄係使用種子及/或果皮，較佳係使用種子及果皮。山茶科山茶屬植物、金縷梅科金縷梅屬植物較佳為葉。薔薇科蚊子草屬植物較佳為花。車前科車前屬植物較佳為種子。唇形科薄荷屬植物較佳為全草。 上述植物的部位可依原樣付諸於萃取步驟，亦可在加以粉碎、切斷或乾燥後付諸於萃取步驟。在本發明中，植物萃取物可為將上述植物依原樣進行萃取而得之萃取物，亦可為萃取自將該植物進行粉碎、切斷或乾燥而得之物之萃取物。較佳為來自將上述植物進行粉碎、切斷或乾燥而得之物之萃取物。
用於獲得植物萃取物之植物的萃取方法並無特別限定，可藉由植物成分的萃取中所使用之通常的萃取方法獲得。萃取方法可適宜設定，萃取條件亦無特別限定。例如，較佳係藉由將上述植物於常溫或加溫下以溶媒(萃取溶媒)進行萃取而獲得植物萃取物。在植物萃取物的調製中，屬於原料之上述植物可依原樣付諸於萃取步驟，亦可在加以粉碎、切斷或乾燥後付諸於萃取步驟。
用於調製植物萃取物之萃取溶媒可適宜選擇，可使用植物成分的萃取中通常所使用者。作為萃取溶媒，可列舉例如水；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等碳數1~5的一元醇；乙二醇、丙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2,3-丁二醇等碳數2~5的多元醇；丙酮、甲基乙基酮等酮；醋酸甲酯、醋酸乙酯等酯；四氫呋喃、二乙基醚等鏈狀及環狀醚；聚乙二醇等聚醚；角鯊烷等。此等可單獨使用，亦可使用將2種以上進行組合而得之混合溶媒(混合液)。作為碳數1~5的一元醇，較佳為碳數1~4者，更佳為碳數2~4者，再佳為乙醇。作為碳數2~5的多元醇，較佳為碳數2~4的二元或三元醇，更佳為二元醇，再佳為1,3-丁二醇。該等之中，作為萃取溶媒，較佳為水、碳數1~5的一元醇、碳數2~5的多元醇、此等中之2種以上之混合溶媒，更佳為水、碳數2~4的一元醇或其水溶液、碳數2~4的二元醇或其水溶液，再佳為水、乙醇、乙醇水溶液、1,3-丁二醇、1,3-丁二醇水溶液，特佳為水、乙醇水溶液或1,3-丁二醇水溶液。在一態樣中，乙醇水溶液及1,3-丁二醇水溶液較佳係乙醇或1,3-丁二醇濃度為10~98體積%，更佳係30~90體積%，再佳係30~70體積%。作為本發明中之植物萃取物，可適合地使用上述溶媒萃取物。
萃取時亦可添加酸或鹼，調整萃取溶媒的pH值。在萃取後，較佳係從萃取液中去除植物殘渣(萃取後之植物體或其部分)。從萃取液中去除植物殘渣之方法並無特別限定，可列舉過濾、離心分離等公知的分離手段。
作為植物的萃取方法之一例，可使用例如以下方法。將植物依原樣或使其進行乾燥，加以細碎，加入以重量計0.1~30倍量的萃取溶媒，在常壓下，於室溫，較佳係萃取10分鐘~15日，更佳係30分鐘~10日，再佳係1小時~7日，或者於萃取溶媒的沸點附近，較佳係萃取10分鐘~1日(更佳係10分鐘~2小時)左右之後再進行過濾而獲得濾液。萃取時，可加以靜置，亦可適宜施行攪拌。此外，可將所獲得之濾液(植物萃取液)依原樣作為植物萃取物，亦可視需要進行稀釋、濃縮或乾燥等。
在本發明中，可將藉由萃取所獲得之植物萃取液依原樣用作植物萃取物。此外，在無損本發明之效果之前提下，亦可藉由公知的方法進行稀釋、濃縮或乾燥而製成稀釋液、濃縮物或粉末，亦可調製成糊狀而使用。作為乾燥方法，可列舉例如凍結乾燥、噴霧乾燥等。再者，針對上述植物萃取液、其濃縮物或乾燥粉末等，在無損本發明之效果之範圍中，亦可視需要進一步施行脫臭、脫色等精製。此種精製方法只要任意選擇通常的手段來施行即可。 本發明中之植物萃取物包含以如上述之萃取方法所獲得之各種溶媒萃取液、其稀釋液、其濃縮物或其乾燥粉末、此等之精製物。此外，萃取物亦可以與萃取溶媒不同的溶媒進行稀釋或溶解而使用。 此外，上述植物萃取物已市售，亦可使用市售品。
耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物較佳為耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的菌體或菌體培養物的萃取物。作為菌體或菌體培養物的萃取物，可列舉對菌體或包含菌體之菌體培養物(較佳為菌體培養液)施行自體消化處理或酵素分解處理等菌體破碎處理而在培養液中等溶出酵母菌體內容物而得之物(菌體破碎物)；從經施行菌體破碎處理之菌體或菌體培養物(菌體破碎物)中去除菌體殘渣而得之物。較佳為將菌體或包含菌體之菌體培養物(較佳為菌體培養液)進行自體消化處理而得之物。亦可視需要對菌體破碎物或從其中去除菌體殘渣而得之物施行加熱處理等殺菌處理等。上述酵母的萃取物可為經施行此種殺菌處理等者。耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物的形態並無特別限定，可列舉例如糊狀、懸浮狀、提取物狀、液狀、粉末狀等。
在一態樣中，作為薔薇科薔薇屬植物的萃取物，較佳為薔薇(較佳為花瓣)的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。 作為葡萄種子及/或果皮的萃取物，較佳為葡萄種子及/或果皮的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。 作為山茶科山茶屬植物的萃取物，較佳為茶樹(較佳為葉)的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。 作為金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物，較佳為北美金縷梅(較佳為葉)的1,3-丁二醇萃取物或1,3-丁二醇水溶液萃取物。 作為薔薇科蚊子草屬植物的萃取物，較佳為旋果蚊子草(較佳為花)的1,3-丁二醇萃取物或1,3-丁二醇水溶液萃取物。作為車前科車前屬植物的萃取物，較佳為大車前草(較佳為種子)的乙醇萃取物或乙醇水溶液萃取物。 作為唇形科薄荷屬植物的萃取物，較佳為辣薄荷(較佳為全草)的乙醇萃取物、乙醇水溶液萃取物或熱水萃取物。
本發明之組成物的形態並無特別限定，可為粉末狀、顆粒狀、糊狀、固形狀等，亦可為液狀，可適宜選擇。在本發明之組成物中，在無損本發明之效果之前提下，除了上述萃取物以外，尚可摻合其他成分。作為其他成分，可列舉例如可使用於後述之化妝料、飲食品、醫藥品、準醫藥品等中之成分。 本發明之用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物、用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，作為一例，可以劑的形態提供，但並不限定於本形態。亦可將該劑依原樣作為組成物，或以包含該劑之組成物之形式提供。在一態樣中，本發明之組成物亦可稱為第4型膠原蛋白之表現的降低抑制或改善劑、皮膚屏障功能的降低抑制或改善劑。
本發明之第一態樣的用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物係使用於抑制對象的第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，較佳係抑制對象的皮膚中之第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現。本發明之第二態樣、第三態樣及第四態樣的用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物係使用於抑制對象的皮膚屏障功能的降低或改善該功能。 本發明之組成物可使用於預防或改善起因於例如皮膚屏障功能的降低、基底膜之功能降低或第4型膠原蛋白之表現降低之不良情形。作為此種不良情形，可列舉例如肌膚乾燥、搔癢、乾枯、敏感肌、肌膚粗糙等。在一態樣中，本發明之組成物可藉由抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能，或者抑制皮膚中之第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，而使用於預防或改善肌膚乾燥、搔癢、乾枯、敏感肌、肌膚粗糙等。預防不良情形包含防止發病、延遲發病、降低發病率等。改善不良情形包含緩解症狀、使症狀好轉、抑制症狀的進展等。
本發明之組成物可使用於化妝料、飲食品、醫藥品、準醫藥品等各式各樣的用途中。本發明之組成物可其本身為用於抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，或者用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之化妝料、飲食品、醫藥品或準醫藥品等，或者，亦可為摻合至該化妝料、飲食品、醫藥品或準醫藥品等中而使用之素材或製劑等。
本發明之組成物係適合地使用作為例如皮膚外用劑。皮膚外用劑包含化妝料、醫藥品、準醫藥品，較佳為化妝料。 本發明之組成物亦可使用作為皮膚外用劑以外之醫藥品或準醫藥品。 在另一實施態樣中，亦較佳係將本發明之組成物製成飲食品。以下針對將本發明之組成物製成化妝料、醫藥品、準醫藥品等皮膚外用劑、飲食品等之情況進行說明。
在將本發明之組成物等製成皮膚外用劑之情況，劑型等並無特別限定，可製成例如溶液、乳液、乳霜、凝膠、粉末、氣溶膠、噴霧、膠囊及薄片等任意形態。皮膚外用劑較佳為化妝料。化妝料的製品形態亦無特別限定，可列舉例如洗顏料、卸妝品、化妝水、美容液、面膜、乳液、乳霜、防曬品等肌膚保養化妝料；粉底、妝前修飾品、口紅、眼影、眼線品、睫毛膏、眉筆、腮紅、指甲油等彩妝化妝料；洗髮精、潤絲精、整髮料、染髮料、生髮劑等毛髮化妝料；肥皂、沐浴乳等洗淨料；入浴劑等。
在上述化妝料中，在無損本發明之效果之範圍中，可適宜含有化妝料中可容許的載體、添加劑等成分，例如水、醇類、油劑、界面活性劑、增黏劑、金屬皂、凝膠化劑、粉體、螯合劑、水溶性高分子、皮膜形成劑、樹脂、包接化合物、抗菌劑、消臭劑、鹽類、pH調整劑、紫外線吸收劑、上述以外之源自動植物/微生物之萃取物、角質溶解劑、酵素、激素類、其他維生素類、保濕劑、殺菌劑、抗炎症劑、香料等中之1或2種以上。化妝料可藉由一般的製造法予以製造。例如，可藉由將使用於有效成分中之上述萃取物及1或2種以上可使用於上述化妝料中之成分進行混合後，加工成所期望的形態而獲得。
在將皮膚外用劑製成醫藥品或準醫藥品之情況，在無損本發明之效果之範圍中，亦可使用醫藥品或準醫藥品中可容許的載體、添加劑等成分。作為該種成分，可列舉例如賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、抗氧化劑、著色劑等中之1或2種以上，此等可視需要使用。
本發明之組成物亦可製成上述之皮膚外用劑以外之醫藥品、準醫藥品。此種醫藥品或準醫藥品可經口投予，亦可非經口投予。醫藥品或準醫藥品可製成經口投予製劑(內服劑)或非經口投予製劑的形態。作為經口投予製劑的劑型，可列舉液劑、錠劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、糖衣錠、膠囊劑、懸浮液、乳劑、嚼錠劑等。作為非經口投予製劑的劑型，可列舉注射劑、輸液劑等。在此種醫藥品或準醫藥品中，亦可使用醫藥品或準醫藥品中可容許的載體、添加劑等成分。作為該種成分，可列舉例如賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、抗氧化劑、著色劑、矯味劑等中之1或2種以上，此等可視需要使用。醫藥品、準醫藥品可藉由一般的製造法予以製造。例如，可藉由將使用於有效成分中之上述萃取物及1或2種以上可在醫藥品或準醫藥品中使用之成分進行混合後，加工成所期望的形態而獲得。
在將本發明之組成物製成飲食品之情況，飲食品並無特別限定，可列舉例如一般的飲食品、健康食品、功能性標示食品、特定保健用食品等。飲食品的形態亦無特別限定。上述健康食品、功能性標示食品、特定保健用食品亦可製成例如液劑、錠劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、糖衣錠、膠囊劑、懸浮液、乳劑、嚼錠劑、流質食物等各種製劑形態。
在上述飲食品中，在無損本發明之效果之範圍中，亦可摻合飲食品中可容許的成分，例如其他飲食品材料、可摻合至飲食品中之添加劑等。此種飲食品可藉由一般的製造法予以製造。例如，在飲食品的製造中，只要將在本發明中使用於有效成分中之上述萃取物摻合至飲食品材料等中即可。
在本發明之組成物為皮膚外用劑、皮膚外用劑以外之醫藥品或準醫藥品、飲食品等中之任何形態之情況，使用於有效成分中之上述萃取物的含量在該組成物中係例如就該萃取物的乾燥物換算之重量而言，較佳為0.0000001~100重量%，更佳為0.000001~100重量%，再佳為0.00001~10重量%。上述含量在包含2種以上萃取物之情況，係其合計的含量。
本發明之組成物的使用量並無特別限定，只要是可獲得抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之效果、抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之效果之量(有效量)即可，可依照對象者的狀態、體重、性別、年齡或其他因素而適宜設定。本發明之組成物的使用量，若為化妝料等皮膚外用劑，係例如成人(60kg)每1人每1日，就使用於有效成分中之上述萃取物(乾燥物換算)而言，較佳為例如0.01~500mg。經口投予醫藥品或準醫藥品之情況之投予量係例如成人(60kg)每1人每1日，就上述萃取物(乾燥物換算)而言，較佳為例如0.01~500mg。若為飲食品，其攝取量係例如成人(60kg)每1人每1日，就上述萃取物(乾燥物換算)而言，較佳為例如0.01~500mg。可單次或分成複數次攝取或投予上述量的萃取物。上述萃取物的量在使用2種以上萃取物之情況，係其合計量。將包含上述萃取物之皮膚外用劑應用於皮膚之時機，攝取或投予飲食品、醫藥品或準醫藥品之時機等並無特別限定。
作為本發明之組成物的應用對象(亦可稱為投予對象)，並無特別限定，可應用於人類或非人類哺乳動物等，較佳為人類。作為應用對象，可列舉例如希望或需要抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之對象、希望或需要抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之對象等。作為此種對象，可列舉例如確實感受到肌膚乾燥、搔癢、乾枯、敏感肌、肌膚粗糙之人。本發明之組成物可因應其形態、劑型等，以本身公知的多種方法進行攝取或投予。在一態樣中，本發明之組成物較佳係應用於皮膚。
使用於本發明之組成物的有效成分中之上述萃取物可使用於抑制對象的第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現。上述萃取物可使用於抑制對象的皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能，較佳係藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而使用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。
本發明亦包含以下使用及方法。 一種選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物的使用，其係用於藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。 一種藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物。
一種金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物的使用，其係用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。 一種抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物。
一種選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物的使用，其係用於抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現。 一種抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之方法，其係投予上述1種以上萃取物。
上述萃取物較佳係投予(應用)至皮膚，可使用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能，使用於抑制皮膚中之第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，或使用於抑制基底膜功能的降低或改善該功能。在一態樣中，上述萃取物可使用於預防或改善起因於皮膚屏障功能的降低、基底膜之功能降低或第4型膠原蛋白之表現降低之不良情形。上述萃取物可藉由例如抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能，或者抑制皮膚中之第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，而使用於預防或改善肌膚乾燥、搔癢、乾枯、敏感肌、肌膚粗糙等。
在上述使用及方法中，上述萃取物、投予此等之對象、萃取物的投予量及此等之較佳態樣等係與上述之本發明之組成物中者相同。上述萃取物可依原樣使用，亦可與其他成分組合使用。亦可使用本發明之組成物。上述萃取物可以上述之皮膚外用劑、飲食品等形態使用。 上述使用可為治療性使用，亦可為非治療性使用。上述方法可為治療性方法，亦可為非治療性方法。所謂非治療性，係不包含醫療行為，即人類的手術、治療或診斷之概念。
本發明之另一態樣亦為一種上述萃取物的使用，其係用於製造用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物；一種上述萃取物的使用，其係用於製造用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物。萃取物及此等之較佳態樣等係與上述之本發明之組成物中者相同。 本發明之又另一態樣亦為一種基底膜功能的降低抑制或改善劑的使用，其係用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能；一種抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予基底膜功能的降低抑制或改善劑。 基底膜功能的降低抑制或改善劑及其較佳態樣係與上述相同。
本發明亦包含具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法。針對本發明之篩選方法進行說明。 本發明之具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法包含將人類表皮角化細胞於活體外以包含被驗物質之培養基或不含上述被驗物質之對照培養基進行培養之步驟，以及將以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞及以對照培養基進行培養而得之對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量進行比較之步驟，在以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量多於上述對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量之情況，選擇上述被驗物質作為具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質。
在本發明之篩選方法中，係將人類表皮角化細胞於活體外以包含被驗物質之培養基或不含上述被驗物質之對照培養基進行培養。人類表皮角化細胞已市售，可使用市售品。 被驗物質並無特別限定，可列舉例如植物萃取液、細胞萃取液、細胞培養上清液、發酵生產物、蛋白質、胜肽、維生素類、合成化合物等。此等可為既知物質，亦可為新穎物質。
將人類表皮角化細胞於活體外以包含被驗物質之培養基或不含上述被驗物質之對照培養基進行培養之步驟亦被稱為培養步驟。將以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞(亦稱為被驗皮膚細胞)及以對照培養基進行培養而得之對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量進行比較之步驟亦被稱為第4型膠原蛋白表現量比較步驟。
在培養步驟中，培養人類表皮角化細胞之條件並無特別限定，只要採用公知的條件即可。包含被驗物質之培養基可藉由將被驗物質混合於培養基中而予以調製。培養基可使用人類表皮角化細胞的培養中所使用者，亦可使用市售品。作為培養基之一例，可列舉HuMedia-KB2培養基(Kurabo公司製)、DMEM培養基等。在培養基中，亦可添加胰島素、人類EGF、氫化可體松(hydrocortisone)、血清、抗菌劑等。培養時間並無特別限定，只要依培養條件等適宜設定即可。就對照培養基而言，除了不含有被驗物質以外，只要使用與含有被驗物質之培養基相同的培養基即可。例如，只要在包含被驗物質之培養基或對照培養基中，將人類表皮角化細胞較佳係培養1~72小時，更佳係3~48小時即可。 在培養步驟中，亦可施行紫外線照射、氧化壓力負荷等壓力負荷。例如，若在紫外線照射、氧化壓力負荷等壓力負荷條件下施行培養，則可藉由抑制該壓力所引發之皮膚屏障功能的降低或改善壓力下之皮膚屏障功能而篩選出有效的成分。
在培養步驟之後，施行第4型膠原蛋白表現量比較步驟。在上述培養後，將以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞及以對照培養基進行培養而得之對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量進行比較。在以包含上述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量多於上述對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量之情況，選擇上述被驗物質作為具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質。
第4型膠原蛋白表現量可藉由測定編碼出第4型膠原蛋白之mRNA量或第4型膠原蛋白的蛋白質量而施行。mRNA或蛋白質量的測定可藉由公知的方法施行。 編碼出第4型膠原蛋白之mRNA量能夠藉由定量PCR、北方墨點法(Northern blotting)、微陣列、使用螢光探針之實時成像等予以測定。第4型膠原蛋白的蛋白質量能夠藉由免疫化學試驗、質量分析等予以測定。作為免疫化學試驗，可列舉Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)、西方墨點法(Western blotting)等。在蛋白質量的測定中，亦可使用市售的ELISA套組(MyBioSource公司製)等。人類的第4型膠原蛋白的鹼基序列或胺基酸序列(ORF)屬公知，鹼基序列(mRNA)係以Accession No. AH002741之形式，登錄於公共資料庫Genbank。只要是熟習該項技術者，即可輕易地施行用於測定編碼出第4型膠原蛋白之mRNA量之引子的設計或合成、DNA的增幅等。
如上述，能夠藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現，而抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能。因此，在被驗皮膚細胞中之第4型膠原蛋白的表現量多於對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量之情況，可將該被驗物質判定為具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質。根據上述篩選方法，可施行具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質的篩選。 [實施例]
以下，藉由實施例進一步詳細說明本發明，但並不因此限定本發明之範圍。
＜調製例1＞ 調製源自植物之萃取物。用於萃取之植物及其部位係如下。 (1)薔薇(Rosa hybrida，品種「Suntory blue rose Applause」(註冊商標)，Suntory Flowers(股))：花瓣 (2)葡萄(Vitis spp.)(卡本內蘇維翁)：種子及果皮 (3)茶樹(Camellia sinensis)：葉 (4)北美金縷梅(Hamamelis virginiana)：葉 (5)旋果蚊子草(Filipendula ulmaria)：花 (6)大車前草(Plantago major)：種子 (7)辣薄荷(Mentha x piperita)：全草 上述薔薇(品種「Suntory blue rose Applause」)為在花瓣中包含飛燕草素型花青苷、玫瑰花青苷A1、玫瑰花青苷A2及玫瑰花青苷B以及玫瑰飛燕草素苷A1、玫瑰飛燕草素苷A2及玫瑰飛燕草素苷B之藍系薔薇。
將上述(1)~(7)之植物的破碎物浸於溶媒中，進行萃取。更詳細而言，針對上述(1)、(2)、(3)、(6)、(7)，將植物的破碎物浸於重量的10倍量的30~90vol%乙醇水溶液中，於室溫下，1日施加1次攪拌操作並萃取10分鐘~7日，而獲得萃取液。針對上述(4)、(5)，使用1,3-丁二醇水溶液來代替乙醇水溶液，以上述方法進行萃取。
藉由過濾從所獲得之萃取液中去除植物殘渣，獲得濾液作為植物萃取液。 將所獲得之植物萃取液以蒸發器進行濃縮後，藉由進行凍結乾燥而以粉末之形式獲得各植物的萃取物。將該粉末狀的植物萃取物(薔薇花瓣萃取物、葡萄種子及果皮萃取物、茶樹葉萃取物、北美金縷梅葉萃取物、旋果蚊子草花萃取物、大車前草種子萃取物、辣薄荷萃取物)作為萃取物樣品並用於後述評估。
＜調製例2＞ 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)萃取物係藉由將解脂耶氏酵母進行培養，使其進行自體消化後，施行加熱殺菌除菌操作，而獲得粉末狀的解脂耶氏酵母萃取物。 在後述實施例中，就解脂耶氏酵母萃取物而言，係使用上述粉末作為萃取物樣品。
＜實施例1＞在炎症刺激時，第4型膠原蛋白的過量表現對皮膚屏障所帶來之影響 製作將COL4A1(RefSeq ID：NM_001845.6)組入CMV啟動子的下游而得之質體(以下，COL4A1質體)。依照建議實驗指南，將COL4A1質體，Lipofectamine 3000 Reagent(Thermo Fisher Scientific公司製)使用Opti-MEM(註冊商標)I Reduced Serum Media(Thermo Fisher Scientific公司製)(以下，Opti-MEM)進行稀釋，製作質體濃度不同的2種溶液(以下，Opti-MEM溶液)(質體濃度：5μg/mL或20μg/mL)。另外，作為對照，亦製作添加Opti-MEM來代替質體而得之溶液。
使用HuMedia-KG2(以下，建議培養基)(Kurabo公司製)，將正常人類成人表皮角化細胞(Kurabo公司製)以3×104 個細胞/200μL/孔的濃度接種於24孔用Cell Culture Inserts(Millipore公司製)後，迅速地添加10μL的上述任一種Opti-MEM溶液。另外，在24孔盤(AGC Techno Glass(股)製)內添加900μL的建議培養基。繼而，在30分鐘後，僅對一部分群組，以終濃度成為100μM之方式添加過氧化氫水(Nacalai Tesque(股)製)(H2 O2 處理)。在接種4小時後，更換成建議培養基。在接種24小時後，更換成藉由添加CaCl2 而將培養基中Ca2+ 濃度提高至1.41mM而得之建議培養基(以下，非典型建議培養基)。每隔2~3日使用非典型建議培養基施行培養基更換。
在接種96小時後、120小時後、144小時後，使用Millicell ERS-2(Merck公司製)評估經上皮電阻值(TEER(Ω･cm2 ))。此外，在接種144小時後，使用isogen(Nippon Gene(股)製)將細胞進行溶解後，萃取出mRNA。然後，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit及RNase Inhibitor合成cDNA，使用TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(皆Thermo Fisher Scientific公司製)、引子施行定量PCR，評估人類第4型膠原蛋白A1(COL4A1)的表現量。另外，就內因性對照而言，係使用Eukaryotic 18S rRNA。
就用於測定COL4A1表現量之引子(COL4A1)、用於定量內因性對照之引子(Eukaryotic 18S rRNA)而言，係分別使用#Hs00266237_m1，#Hs99999901_s1(皆Thermo Fisher Scientific公司製)。
將結果示於表1及表2。將未添加質體且未經H2 O2 處理組(H2 O2 (-)，質體(-))的COL4A1表現量設為1時之COL4A1的基因表現量示於表1。在表1及2中，H2 O2 (+)為經施行H2 O2 處理之組。質體(-)表示未添加COL4A1質體，質體(+)表示添加COL4A1質體。＊表示有顯著差異(p＜0.05)(Dunnett’s test(vs未添加質體且經H2 O2 處理組))。隨著H2 O2 刺激，可見到COL4A1表現量的降低，但藉由導入COL4A1質體，對H2 O2 刺激組而言，可確認到顯著且用量依存性地抑制表現的降低或改善該表現(＊：p＜0.05)。
Figure 02_image007
將接種144小時後之TEER之值示於表2。＊表示有顯著差異(p＜0.05)(Dunnett’s test(vs未添加質體且經H2 O2 處理組))。隨著H2 O2 刺激，可見到TEER的顯著降低，但藉由導入COL4A1質體，對H2 O2 刺激組而言，可確認到用量依存性的且在高用量組中顯著的TEER改善作用(＊：p＜0.05)。
Figure 02_image009
＜實施例2~9＞萃取物樣品之抑制第4型膠原蛋白基因表現的降低或改善該表現之作用的評估 使用建議培養基，將正常人類成人表皮角化細胞(Kurabo公司製)以5×104 個細胞/mL/孔的濃度接種於12孔盤(AGC Techno Glass公司製)，培養48小時。更換成包含萃取物樣品之建議培養基並開始進行樣品處理後，在樣品處理開始起30分鐘後，以終濃度成為100μM之方式添加過氧化氫水(Nacalai Tesque(股)製)。在過氧化氫水處理開始起3小時後，更換成不含萃取物樣品之建議培養基。在樣品處理開始時起48小時後，使用RLT Buffer(含有1%2-巰基乙醇)將細胞進行溶解及回收後，使用RNeasy Mini Kit及RNase-Free DNase Set(皆Qiagen公司製)萃取出mRNA。然後，藉由與實施例1相同的方法，施行cDNA合成、定量PCR，評估COL4A1的表現量。
針對對照，除了經以終濃度成為0.1%之方式添加二甲基亞碸(DMSO)來代替萃取物樣品而得之建議培養基處理以外，以與上述相同的方法培養細胞，添加過氧化氫水，評估COL4A1的表現量。
實施例2~9中所使用之萃取物樣品為調製例1及2中所調製而得之薔薇花瓣萃取物、葡萄種子及果皮萃取物、茶樹葉萃取物、北美金縷梅葉萃取物、旋果蚊子草花萃取物、大車前草種子萃取物、解脂耶氏酵母萃取物或辣薄荷萃取物。萃取物樣品係溶解於超純水或DMSO中並添加至培養基中。培養基中之萃取物樣品的濃度係設為5~20μg/mL。另外，在溶解於超純水中之情況，係另行添加DMSO，使所有包含萃取物樣品之建議培養基皆DMSO終濃度成為0.1%。
將實施例2~9之結果(N=3~4之平均值)示於表3。表3所示之結果為將對照的COL4A1的表現量設為100%之情況之經萃取物樣品處理之細胞中之COL4A1的表現量之相對值(%)。＊表示相對於對照而言有顯著差異(p＜0.05)(Student’s t-test)。另外，在萃取物樣品(被驗物質)的濃度為5~20μg/mL之範圍中，將COL4A1之表現最高的情況之結果示於表3。針對薔薇花瓣萃取物、葡萄種子及果皮萃取物、茶樹葉萃取物、北美金縷梅葉萃取物、旋果蚊子草花萃取物、大車前草種子萃取物、解脂耶氏酵母萃取物、辣薄荷萃取物，相對於對照而言可確認到抑制COL4A1之表現的降低或改善該表現之顯著的效果(＊：p＜0.05)。
Figure 02_image011
＜實施例10~15＞萃取物樣品之抑制皮膚屏障功能降低或改善該功能之作用的評估 使用包含萃取物樣品之建議培養基，將正常人類成人表皮角化細胞以3×104 個細胞/200μL/孔的濃度接種於Millicell Cell Culture Inserts。在接種起30分鐘後，以終濃度成為100μM之方式添加過氧化氫水。在接種起4小時後，更換成不含萃取物樣品之建議培養基。在接種起24小時後，更換成非典型建議培養基。然後，藉由與實施例1相同的方法，評估經上皮電阻值(TEER)。
針對對照，除了使用以終濃度成為0.1%之方式添加DMSO而得之建議培養基來代替包含萃取物樣品之建議培養基以外，以與上述相同的方法培養細胞，添加過氧化氫水，評估經上皮電阻值。
實施例10~15中所使用之萃取物樣品為調製例1及2中所調製而得之表4所示之萃取物。萃取物樣品係溶解於超純水或DMSO中並添加至培養基中。培養基中之萃取物樣品的濃度係設為5~20μg/mL。另外，在溶解於超純水中之情況，係另行添加DMSO，使所有包含萃取物樣品之建議培養基皆DMSO終濃度成為0.1%。
將結果(N=4~6之平均值)示於表4。表4所示之結果為將對照的TEER設為100%之情況之經萃取物樣品處理之細胞中之TEER之相對值(%)。另外，在萃取物樣品(被驗物質)的濃度為5~20μg/mL，及測定時間為接種後96~144小時之範圍中，將TEER之值最高的情況之結果示於表4。在6種萃取物中可確認到抑制或改善TEER的降低之高效果，再者，針對葡萄種子及果皮萃取物、茶樹葉萃取物、北美金縷梅葉萃取物、旋果蚊子草花萃取物、解脂耶氏酵母萃取物，相對於對照而言可確認到顯著的變化(＊：p＜0.05)(Student’s t-test)。
Figure 02_image013
已得知上述植物的萃取物及解脂耶氏酵母的萃取物具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用。

Claims (22)

  1. 一種經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，該組成物包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。
  2. 如請求項1之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為薔薇，耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，山茶科山茶屬植物為茶樹，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷。
  3. 如請求項1或2之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為包含選自由飛燕草素(delphinidin)型花青苷(anthocyanin)、玫瑰花青苷(rosacyanin)化合物及玫瑰飛燕草素苷(rosadelphin)化合物所組成之群組之1種以上化合物之薔薇花瓣，山茶科山茶屬植物為茶樹的葉，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草的花，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷全草。
  4. 一種用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其包含金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物作為有效成分。
  5. 如請求項4之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅，車前科車前屬植物為大車前草。
  6. 如請求項4或5之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅的葉，車前科車前屬植物為大車前草種子。
  7. 如請求項4至6中任一項之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其係經由抑制基底膜功能的降低或改善該功能而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。
  8. 如請求項7之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，抑制基底膜功能的降低或改善該功能係經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現。
  9. 一種用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其包含基底膜功能的降低抑制或改善劑作為有效成分。
  10. 如請求項9之用以抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之組成物，其中，基底膜功能的降低抑制或改善劑係經由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制基底膜功能的降低或改善基底膜功能。
  11. 一種用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其包含選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物作為有效成分。
  12. 如請求項11之用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為薔薇，耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，山茶科山茶屬植物為茶樹，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草，車前科車前屬植物為大車前草，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷。
  13. 如請求項11或12之用以抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現之組成物，其中，薔薇科薔薇屬植物為包含選自由飛燕草素型花青苷、玫瑰花青苷化合物及玫瑰飛燕草素苷化合物所組成之群組之1種以上化合物之薔薇花瓣，山茶科山茶屬植物為茶樹的葉，金縷梅科金縷梅屬植物為北美金縷梅的葉，薔薇科蚊子草屬植物為旋果蚊子草的花，車前科車前屬植物為大車前草種子，唇形科薄荷屬植物為辣薄荷全草。
  14. 如請求項1至13中任一項之組成物，其係皮膚外用劑。
  15. 如請求項1至14中任一項之組成物，其係化妝料。
  16. 一種選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物的使用，其係用於藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。
  17. 一種金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物的使用，其係用於抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能。
  18. 一種選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物的使用，其係用於抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善前述表現。
  19. 一種藉由抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善該表現而抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物。
  20. 一種抑制皮膚屏障功能的降低或改善皮膚屏障功能之方法，其係投予金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物及/或車前科車前屬植物的萃取物。
  21. 一種抑制第4型膠原蛋白之表現的降低或改善前述表現之方法，其係投予選自由薔薇科薔薇屬植物的萃取物、葡萄種子及/或果皮的萃取物、耶氏酵母(Yarrowia)屬酵母的萃取物、山茶科山茶屬植物的萃取物、金縷梅科金縷梅屬植物的萃取物、薔薇科蚊子草屬植物的萃取物、車前科車前屬植物的萃取物以及唇形科薄荷屬植物的萃取物所組成之群組之1種以上萃取物。
  22. 一種具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質之篩選方法，其包含 將人類表皮角化細胞於活體外(in vitro)以包含被驗物質之培養基或不含前述被驗物質之對照培養基進行培養之步驟，以及 將以包含前述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞及以對照培養基進行培養而得之對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量進行比較之步驟， 在以包含前述被驗物質之培養基進行培養而得之皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量多於前述對照皮膚細胞中之第4型膠原蛋白表現量之情況，選擇前述被驗物質作為具有抑制皮膚屏障功能的降低或改善該功能之作用的物質。
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