JP6190105B2 - 皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法 - Google Patents
皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6190105B2 JP6190105B2 JP2012249509A JP2012249509A JP6190105B2 JP 6190105 B2 JP6190105 B2 JP 6190105B2 JP 2012249509 A JP2012249509 A JP 2012249509A JP 2012249509 A JP2012249509 A JP 2012249509A JP 6190105 B2 JP6190105 B2 JP 6190105B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- expression level
- gene
- related gene
- epidermal keratinocytes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 33
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 21
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 title description 23
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 123
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 120
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 117
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 109
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 87
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 50
- 108090000320 Hyaluronan Synthases Proteins 0.000 claims description 48
- 102000003918 Hyaluronan Synthases Human genes 0.000 claims description 45
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 claims description 40
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 35
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 34
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 32
- 101001054921 Homo sapiens Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 Proteins 0.000 claims description 23
- 102100026849 Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 Human genes 0.000 claims description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 19
- 101000962526 Homo sapiens Hyaluronidase-2 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100039285 Hyaluronidase-2 Human genes 0.000 claims description 17
- 101000962530 Homo sapiens Hyaluronidase-1 Proteins 0.000 claims description 16
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 14
- 102100039283 Hyaluronidase-1 Human genes 0.000 claims description 14
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 12
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 10
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 claims description 10
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims 3
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 28
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 15
- 244000294611 Punica granatum Species 0.000 description 13
- 235000014360 Punica granatum Nutrition 0.000 description 13
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 11
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 10
- 235000017276 Salvia Nutrition 0.000 description 9
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 9
- 240000007164 Salvia officinalis Species 0.000 description 8
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 5
- 241000218158 Clematis Species 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- -1 antiseptics Substances 0.000 description 4
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000546188 Hypericum Species 0.000 description 3
- 235000017309 Hypericum perforatum Nutrition 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000183666 Nepsera aquatica Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 3
- 229940008099 dimethicone Drugs 0.000 description 3
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 3
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 3
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241001072909 Salvia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000036620 skin dryness Effects 0.000 description 2
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 2
- 230000037393 skin firmness Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N titanium oxide Inorganic materials [Ti]=O OGIDPMRJRNCKJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WAYINTBTZWQNSN-UHFFFAOYSA-N 11-methyldodecyl 3,5,5-trimethylhexanoate Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCOC(=O)CC(C)CC(C)(C)C WAYINTBTZWQNSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 2-octyldodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(CO)CCCCCCCC LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 101150017002 CD44 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- XMSXQFUHVRWGNA-UHFFFAOYSA-N Decamethylcyclopentasiloxane Chemical compound C[Si]1(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O1 XMSXQFUHVRWGNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000013558 Developmental Bone disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 239000004129 EU approved improving agent Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000166124 Eucalyptus globulus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- MPDGHEJMBKOTSU-YKLVYJNSSA-N Glycyrrhetinic acid Natural products C([C@H]1C2=CC(=O)[C@H]34)[C@@](C)(C(O)=O)CC[C@]1(C)CC[C@@]2(C)[C@]4(C)CC[C@@H]1[C@]3(C)CC[C@H](O)C1(C)C MPDGHEJMBKOTSU-YKLVYJNSSA-N 0.000 description 1
- MPDGHEJMBKOTSU-UHFFFAOYSA-N Glycyrrhetinsaeure Natural products C12C(=O)C=C3C4CC(C)(C(O)=O)CCC4(C)CCC3(C)C1(C)CCC1C2(C)CCC(O)C1(C)C MPDGHEJMBKOTSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150085382 HAS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150089672 HAS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150056481 HYAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150001550 HYAL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027313 Has2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001041128 Homo sapiens Hyaluronidase-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001041120 Homo sapiens Hyaluronidase-4 Proteins 0.000 description 1
- 102100021082 Hyaluronidase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100021081 Hyaluronidase-4 Human genes 0.000 description 1
- 241000207923 Lamiaceae Species 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 1
- 239000009724 Salvia extract Substances 0.000 description 1
- 235000002912 Salvia officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 206010072610 Skeletal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006750 UV protection Effects 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- BTFJIXJJCSYFAL-UHFFFAOYSA-N arachidyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO BTFJIXJJCSYFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M carbocyanin DBTC Chemical compound [Br-].C1=CC=CC2=C([N+](=C(C=C(C)C=C3N(C4=C5C=CC=CC5=CC=C4S3)CC)S3)CC)C3=CC=C21 MPBRYMWMMKKRGC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 229940085262 cetyl dimethicone Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960003720 enoxolone Drugs 0.000 description 1
- 239000010696 ester oil Substances 0.000 description 1
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 229940091554 lauryl peg-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940088608 peg-9 polydimethylsiloxyethyl dimethicone Drugs 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940109529 pomegranate extract Drugs 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000011410 subtraction method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000000475 sunscreen effect Effects 0.000 description 1
- 239000000516 sunscreening agent Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法に関する。具体的には、ヒアルロン酸合成関連遺伝子、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子、ヒアルロン酸分解関連遺伝子を指標とした皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法とその方法を用いて選択された皮膚バリア機能改善剤に関する。
ヒアルロン酸は皮膚の角質層や真皮に存在するムコ多糖で、皮膚の保湿や弾力性に寄与することが知られている。ヒアルロン酸の半減期は約1日と短く、皮膚内においては常に合成と分解が繰り返されて、皮膚の保湿や弾力性を維持している。
一方、加齢に伴い皮膚の弾力性やハリの低下、皮膚の乾燥や肌荒れといった変化が生じることは良く知られている。その変化の原因の一つとして皮膚におけるヒアルロン酸量の低下が考えられ、皮膚におけるヒアルロン酸については、加齢により減少することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
またヒアルロン酸分子量については、紫外線の照射により低分子化すること（非特許文献３）、角層、表皮層、真皮層で比較すると角層＜表皮層＜真皮層の順で小さいことが報告されていた（非特許文献４）。
そこで、これらの現象を解決するために、従来は専らヒアルロン酸量を増加あるいは維持することを目的とするヒアルロン酸生成促進剤やヒアルロン酸分解抑制剤が提案されていた。
一方、ヒアルロン酸の分解促進剤に関しては、動脈硬化、心筋梗塞、骨形成異常、乾癬、悪性腫瘍の症状悪化に密接に関連すると考えられるヒアルロン酸合成の異常亢進への対処としてヒアルロン酸分解促進剤を適用する試みがわずかに報告されている（特許文献１、２）。
しかしながら、加齢に伴う皮膚の弾力性やハリの低下、皮膚の乾燥や肌荒れといった皮膚の変化を予防・改善することを目的としてヒアルロン酸の分解促進を試みる例は全く報告されていなかった。
しかしながら、加齢に伴う皮膚の弾力性やハリの低下、皮膚の乾燥や肌荒れといった皮膚の変化を予防・改善することを目的としてヒアルロン酸の分解促進を試みる例は全く報告されていなかった。
つまり、従来は、単にヒアルロン酸の合成を促進する、或いは分解を抑制する、或いは、異常に産生されたヒアルロン酸を分解するというように、専らヒアルロン酸の量に着目し、その量を増やす、或いは減るのを抑える、増えすぎるのを抑えると言った提案に過ぎず、ヒアルロン酸の合成関連遺伝子とレセプター関連遺伝子と分解関連遺伝子に着目し、これらを指標としたスクリーニング方法は開示されていなかった。
Meyer LJ et al. Journal of Investigative Dermatology 102: 385-389,1994.
Longas MO.Carbohydrate Research 159: 127-136, 1987.
高山健一郎. 化学と生物 26: 308-315, 1988.
井上ら. 生化学 77: 1152-1164, 2005.
本発明者らは、上記背景技術に鑑み、表皮内のヒアルロン酸代謝と表皮の外部環境からの防御機能との関連について研究を進めたところ、表皮内のヒアルロン酸の量ではなく、むしろヒアルロン酸の分子量と角層水分量および水分蒸散量との間に何らかの関係があることを発見した。
そして、さらに研究を進めたところ、加齢および紫外線による表皮ケラチノサイトにおけるヒアルロン酸合成関連遺伝子（以下、単に合成関連遺伝子と言う場合がある）のみならず、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（以下、単にレセプター関連遺伝子と言う場合がある）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（以下、単に分解関連遺伝子と言う場合がある）が、皮膚バリア機能の改善に関連していることを突き止めた。
そして、さらに研究を進めたところ、加齢および紫外線による表皮ケラチノサイトにおけるヒアルロン酸合成関連遺伝子（以下、単に合成関連遺伝子と言う場合がある）のみならず、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（以下、単にレセプター関連遺伝子と言う場合がある）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（以下、単に分解関連遺伝子と言う場合がある）が、皮膚バリア機能の改善に関連していることを突き止めた。
具体的には、ヒアルロン酸合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子の発現低下、或いは上昇度低下が、表皮内に低分子ヒアルロン酸の蓄積を招き、低分子化したヒアルロン酸が表皮細胞の分化を抑制することにより、未成熟な角層を生成し、結果として皮膚バリア機能の低下に引き続く角層水分量の低下を生じさせるという悪循環を生じさせていることが判明した。
これらのことにより、表皮内に低分子化したヒアルロン酸の蓄積を抑制することが出来れば、皮膚バリア機能を改善させることが出来ると考えられる。
本願発明は、紫外線及び加齢により低下した皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法を提供することを課題とし、加えてより効果の高い皮膚バリア機能改善剤を提供することを課題とする。
本発明は、若齢のヒト及び高齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトを用い、紫外線照射により培養表皮ケラチノサイトに発現するヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量とヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量とヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量を指標とし、高齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子と若齢のヒトのドナーから得られた培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子の発現量を比較することで、皮膚バリア機能改善剤をスクリーニングする方法である。
更に具体的には、下記ステップにより測定した遺伝子の発現量を指標とする、皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法である。
（１）紫外線を照射した若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃｙｄ）を測定するステップ
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定するステップ
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定するステップ
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定するステップ
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定するステップ
（６）前記（１）〜（５）の各ステップで得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択するステップ
（１）紫外線を照射した若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃｙｄ）を測定するステップ
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定するステップ
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定するステップ
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定するステップ
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定するステップ
（６）前記（１）〜（５）の各ステップで得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択するステップ
更には、
Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓかつ、Ｃｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／Ｂａｒかつ、Ｃｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ≧（Ｃｙｄ／Ｂｙｄ＋Ｃａｄ／Ｂａｄ）／２となる被験物質を有効成分として選択することを特徴とする請求項１の皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法である。
Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓかつ、Ｃｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／Ｂａｒかつ、Ｃｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ≧（Ｃｙｄ／Ｂｙｄ＋Ｃａｄ／Ｂａｄ）／２となる被験物質を有効成分として選択することを特徴とする請求項１の皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法である。
また、上記スクリーニング方法により選別された皮膚バリア機能改善剤及びそれを配合した皮膚外用剤を提供する。
本発明によれば、ヒアルロン酸合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子を指標にし、各遺伝子発現が特定の関係を示す被験物質を選別することにより、動物実験や人での試験を行わずとも、簡易的に皮膚バリア機能を高める被験物質を選別することが可能になる。
また、これまでにない新たな着想に基づく皮膚バリア機能改善剤及び皮膚外用剤が提供される。
また、これまでにない新たな着想に基づく皮膚バリア機能改善剤及び皮膚外用剤が提供される。
本願発明のスクリーニング方法は、低分子化したヒアルロン酸の蓄積を防止するために、単にヒアルロン酸の分解を促進して、ヒアルロン酸の合成を促進させる被験物質を選択するものではない。 単にヒアルロン酸量を増加させることは、かえって病的な状態になる場合があるからである。
本願発明のスクリーニング方法においては、加齢及び紫外線によりダメージを受けた皮膚を想定し、ヒアルロン酸の合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子の発現量を、若齢のヒトの皮膚における各遺伝子発現の状態に近づけさせる被験物質を選択する方法である。
本願発明のスクリーニング方法においては、加齢及び紫外線によりダメージを受けた皮膚を想定し、ヒアルロン酸の合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子の発現量を、若齢のヒトの皮膚における各遺伝子発現の状態に近づけさせる被験物質を選択する方法である。
具体的には、以下の方法による。
（１）紫外線を照射した若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃｙｄ）を測定する。
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定する。
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定する。
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定する。
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定する。
（６）前記（１）〜（５）で得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択する。
（１）紫外線を照射した若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃｙｄ）を測定する。
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂｙｄ）を測定する。
（３）紫外線を照射した高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｃａｄ）を測定する。
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｂａｄ）を測定する。
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子の発現量（Ｔａｄ）を測定する。
（６）前記（１）〜（５）で得られた遺伝子の発現量において、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなる被験物質を有効成分として選択する。
本発明で用いるヒアルロン酸合成関連遺伝子はＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３である。ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３それぞれの発現量を測定し、これらの内、少なくとも１種以上の遺伝子の発現量がＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていればよい。
具体的には、例えばヒアルロン酸合成関連遺伝子中、指標をＨＡＳ１とした際に、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていれば良いという意味である。この関係が、ＨＡＳ２を指標とした場合、ＨＡＳ３を指標にした際にも、それぞれ同様の関係であれば更に良い。 つまり、本関係を確認する場合には、遺伝子の種類は固定した上で判断する。
尚、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３それぞれの発現量の内、少なくとも１種以上の遺伝子の発現量が前記関係を満たしていれば良く、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３のいずれかの指標において、遺伝子の発現量がＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていないものがあっても差し支えない。
具体的には、例えばヒアルロン酸合成関連遺伝子中、指標をＨＡＳ１とした際に、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていれば良いという意味である。この関係が、ＨＡＳ２を指標とした場合、ＨＡＳ３を指標にした際にも、それぞれ同様の関係であれば更に良い。 つまり、本関係を確認する場合には、遺伝子の種類は固定した上で判断する。
尚、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３それぞれの発現量の内、少なくとも１種以上の遺伝子の発現量が前記関係を満たしていれば良く、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３のいずれかの指標において、遺伝子の発現量がＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／Ｂａｓとなっていないものがあっても差し支えない。
ＨＡＳはヒアルロン酸合成酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子で、脊椎動物のＨＡＳファミリーにはＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３の３種類がある。表皮細胞のヒアルロン酸合成では ＨＡＳ３ が主に働いていることが報告されているが（Sayo T et al.
Journal of Investigative Dermatology 118: 43-48, 2002. ）、ノックアウトマウスを用いた研究からＨＡＳ１とＨＡＳ３のノックアウトマウスでは目立った表現型が見られず、ＨＡＳは互いに機能を補完し合っている可能性も示唆されている。
Journal of Investigative Dermatology 118: 43-48, 2002. ）、ノックアウトマウスを用いた研究からＨＡＳ１とＨＡＳ３のノックアウトマウスでは目立った表現型が見られず、ＨＡＳは互いに機能を補完し合っている可能性も示唆されている。
本発明で用いるヒアルロン酸レセプター関連遺伝子はＣＤ４４である。
ＣＤ４４は、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス−細胞間のシグナリング、レセプターを介するヒアルロン酸の取り込み／分解や細胞遊走などを含む様々な細胞機能に関与するＣＤ４４
Ａｎｔｉｇｅｎをコードする遺伝子である。
Ａｎｔｉｇｅｎをコードする遺伝子である。
本発明で用いるヒアルロン酸分解関連遺伝子は、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２である。ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２それぞれの発現量を測定し、これらの内、少なくとも一方の遺伝子の発現量がＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなっていればよい。具体的には、例えばヒアルロン酸分解関連遺伝子中、指標をＨＹＡL１とした際に、Ｃｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなっていれば良いという意味である。この関係が、ＨＹＡＬ２を指標とした場合にも、同様の関係であれば更に良い。
つまり、本関係を確認する場合には、遺伝子の種類は固定した上で判断する。
尚、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２それぞれの発現量の内、少なくとも一方の遺伝子の発現量が前記関係を満たしていれば良く、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２のいずれか一方の指標において、遺伝子の発現量がＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄなっていないものがあっても差し支えない。
つまり、本関係を確認する場合には、遺伝子の種類は固定した上で判断する。
尚、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２それぞれの発現量の内、少なくとも一方の遺伝子の発現量が前記関係を満たしていれば良く、ＨＹＡL１、ＨＹＡＬ２のいずれか一方の指標において、遺伝子の発現量がＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄなっていないものがあっても差し支えない。
ＨＹＡＬはヒアルロン酸分解酵素（Ｈｙａｌｕｒｏｎｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子で、ＨＹＡＬファミリーにはＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４の４つの遺伝子が知られている（http://omim.org/entry/607071）が、現在のところ、ヒト体細胞で発現し、ＨＹＡＬとして主に機能しているのはＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２の２種類と考えられており（井上ら. 生化学 77: 1152-1164, 2005.）、ＨＹＡＬ２が細胞膜上で高分子ヒアルロン酸を約２０ｋＤａの分子量にまで限定分解した後、ＨＹＡＬ１がリソソームにおいてＨＡを４糖にまで分解する。ＨＹＡＬ２が細胞膜上で高分子ヒアルロン酸を分解する際には、ヒアルロン酸、ＣＤ４４と複合体（ＨＡ−ＣＤ４４−ＨＹＡＬ２複合体）を形成して反応が進行する。ＨＡ−ＣＤ４４−ＨＹＡＬ２複合体は脂質ラフトの１種でカベオレ（Ｃａｖｅｏｌａｅ）と呼ばれる形質膜が陥入した所に豊富に存在し、ヒアルロン酸はここで約５０個の二糖単位に相当する２０ｋＤａの大きさの限定生成物に分解される（Stern R. ほ乳類ヒアルロニダーゼ-Update-. グライコフォーラム/今日のヒアルロン酸科学-15, 2004.）。
本願発明の皮膚バリア機能改善剤は、前記スクリーニング方法により選択される。
本発明におけるヒアルロン酸合成関連遺伝子、レセプター関連遺伝子、分解関連遺伝子（以下、総称して代謝関連遺伝子と言う場合がある。）の発現量は、回収した細胞からまずＴｏｔａｌ
ＲＮＡを抽出し、このＴｏｔａｌ ＲＮＡ中におけるヒアルロン酸代謝関連遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定する。
ＲＮＡを抽出し、このＴｏｔａｌ ＲＮＡ中におけるヒアルロン酸代謝関連遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現量を測定する。
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、たとえば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski P et
al. Anal. Biochem, 162, 156-159, 1987.）等を採用することができる。例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ
ＭＩＮＩ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）などが使用でき、抽出された全RNAは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。
al. Anal. Biochem, 162, 156-159, 1987.）等を採用することができる。例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ
ＭＩＮＩ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）などが使用でき、抽出された全RNAは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。
各遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。
本発明に用いる高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトは、健常な５０歳以上のヒトをドナーとするものが望ましく、継代数が５以下のものが望ましい。３０〜４０歳代のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトではヒアルロン酸代謝関連遺伝子の紫外線による明確な低下が認められず、また、継代数が６以上では被験物質による紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下の抑制が明確でなくなる。例えば、市販品であるＥｐｉｄｅｒｃｅｌｌ
Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（クラボウ社）やＨＥＫ（東洋紡社）を使用することができ、培養に用いる好適な培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。
Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（クラボウ社）やＨＥＫ（東洋紡社）を使用することができ、培養に用いる好適な培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。
本発明に用いる若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトは、健常な１０〜２０歳代のヒトをドナーとするものが望ましく、継代数が５以下のものが望ましい。９歳以下のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトではヒアルロン酸代謝関連遺伝子の紫外線による変動に被験者間のバラツキがあり、また、継代数が６以上では被験物質による紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下の抑制が明確でなくなる。例えば、市販品であるＥｐｉｄｅｒｃｅｌｌ
Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（クラボウ社）やＨＥＫ（東洋紡社）を使用することができ、培養に用いる好適な培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。
Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ（クラボウ社）やＨＥＫ（東洋紡社）を使用することができ、培養に用いる好適な培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。
本発明に用いる紫外線を照射した培養表皮ケラチノサイトは、上記の培養表皮ケラチノサイトに紫外線を照射することにより得られる。この際に使用する光源としては、例えば、ＴＯＲＥＸ
ＦＬ２０Ｓ・Ｅ−３０／ＤＭＲ（ＴＯＳＨＩＢＡ社）が好適に使用でき、紫外線照射量は１５〜２５ｍＪ／ｃｍ２が望ましい。１５ｍＪ／ｃｍ２より少ないと紫外線による影響が明確に観察できず、２５ｍＪ／ｃｍ２より多いと培養表皮ケラチノサイトの生存率が著しく低下し、遺伝子発現量の変化が正しく観察できない。
ＦＬ２０Ｓ・Ｅ−３０／ＤＭＲ（ＴＯＳＨＩＢＡ社）が好適に使用でき、紫外線照射量は１５〜２５ｍＪ／ｃｍ２が望ましい。１５ｍＪ／ｃｍ２より少ないと紫外線による影響が明確に観察できず、２５ｍＪ／ｃｍ２より多いと培養表皮ケラチノサイトの生存率が著しく低下し、遺伝子発現量の変化が正しく観察できない。
本願発明のスクリーニング方法より選別された皮膚バリア機能改善効果が期待できる成分は、サルビア抽出物及びザクロ抽出物である。
前記サルビアは、シソ科サルビア属のサルビア（Ｓａｌｖｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）で、部位は特に限定されないが、例えば、葉が好適に使用できる。
前記ザクロは、ミソハギ科ザクロ属のザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）で、部位は特に限定されないが、例えば、果皮および／または花が好適に使用できる。
これらの植物抽出物の調製は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることが出来る。就中、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。
本発明に用いることのできる植物抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものであれば重量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、常温抽出の場合には、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。
以上のような条件で得られる上記各抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることが出来る。
本発明の皮膚外用剤における植物抽出物の配合量は、蒸発乾燥分に換算して０．００００１〜２０．０重量％が好ましく、特に０．０１〜１０．０重量％の範囲が最適である。
また、本発明のスクリーニング方法で選別される被験物質は、植物抽出物に限定されない。本願発明のスクリーニング方法で選別されたものであればよく、植物抽出物以外に、菌類、動物等の抽出物は勿論、化合物であっても差し支えない。
本発明の皮膚外用剤は皮膚に適用される組成物を意味する。例えば、化粧水、乳液、クリーム、オイル、化粧下地、ファンデーション等の化粧品や医薬部外品、分散液、軟膏、クリーム、外用液等の外用医薬品等の皮膚外用剤として適用可能な組成物のことを言う。液体、クリーム状、粉末状、固体状等の皮膚外用剤の形態も問わない。
皮膚外用剤は、公知である従来の皮膚外用剤と同様な基剤成分が用いられ、常法により製造される。本発明の皮膚外用剤は、本発明の効果を阻害しない範囲内で、皮膚外用剤に通常用いられている他の成分を配合することができる。例えば、油脂、ロウ類、炭化水素油、エステル油、高級アルコール、シリコーン油、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、保湿剤、界面活性剤、水溶性高分子、増粘剤、粉体、皮膚保護剤、美白剤、シワ改善剤、老化防止剤、植物抽出物、防腐剤、消炎剤、pH調整剤、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤などが挙げられる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
＜実験例１＞角層状態および角層ヒアルロン酸状態の評価
試験に同意を得た２０歳代の男性５名および５０歳代の男性５名にて下記項目について評価した。露光部皮膚としては顔面、非露光部皮膚としては上腕内側部を測定部位とし、測定部位を洗顔料で洗浄後、２０±１℃、湿度５０±２％の環境下で１０分間順化した後測定を行った。
試験に同意を得た２０歳代の男性５名および５０歳代の男性５名にて下記項目について評価した。露光部皮膚としては顔面、非露光部皮膚としては上腕内側部を測定部位とし、測定部位を洗顔料で洗浄後、２０±１℃、湿度５０±２％の環境下で１０分間順化した後測定を行った。
１．角層状態の評価
１−１．角層水分量の測定
露光部皮膚および非露光部皮膚の角層水分量を角層水分量測定装置（Corneometer CM825,
Courage+Khazaka）にて測定した。各部位５点を測定し、平均値を各被験者の当該部位における角層水分量値とした。
１−１．角層水分量の測定
露光部皮膚および非露光部皮膚の角層水分量を角層水分量測定装置（Corneometer CM825,
Courage+Khazaka）にて測定した。各部位５点を測定し、平均値を各被験者の当該部位における角層水分量値とした。
１−２．経表皮水分蒸散量の測定
露光部皮膚および非露光部皮膚の経表皮水分蒸散量を経表皮水分蒸散量測定装置（Tewameter TM210, Courage+Khazaka）にて測定した。各部位１点を測定し、１分間を超えて測定値が安定した時間帯の測定値を平均した値を各被験者の当該部位における経表皮水分蒸散量値とした。
露光部皮膚および非露光部皮膚の経表皮水分蒸散量を経表皮水分蒸散量測定装置（Tewameter TM210, Courage+Khazaka）にて測定した。各部位１点を測定し、１分間を超えて測定値が安定した時間帯の測定値を平均した値を各被験者の当該部位における経表皮水分蒸散量値とした。
２．角層ヒアルロン酸状態の評価
２−１．角層ヒアルロン酸の採取
露光部皮膚および非露光部皮膚の３．６×４ｃｍの範囲の角層を５回のテープストリッピングにより採取し、テープを１５ｍＬチューブに入れて０．５Ｎ
ＮａＯＨ水溶液 ３ｍＬを添加し、一晩室温下で静置した。その後１Ｎ ＨＣｌ水溶液１．５ｍＬを添加して中和し、緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５．０ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ７．８）４．５ｍＬを加えて１０分間煮沸した。次いでプロテアーゼ
６ｍｇを添加して５０℃にて２４時間インキュベートし、その後再度プロテアーゼ ６ｍｇを添加した。さらに５０℃にて２４時間インキュベートした後、トリクロロ酢酸１ｍＬを加え、４℃で１時間静置後、遠心分離（３５００ｒｐｍ，１５分）してタンパクを沈殿させた。次に上清を採取して蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。得られた乾燥物に蒸留水
１ｍＬを添加して溶解し、５００μＬずつ分注して再度凍結乾燥した。
２−１．角層ヒアルロン酸の採取
露光部皮膚および非露光部皮膚の３．６×４ｃｍの範囲の角層を５回のテープストリッピングにより採取し、テープを１５ｍＬチューブに入れて０．５Ｎ
ＮａＯＨ水溶液 ３ｍＬを添加し、一晩室温下で静置した。その後１Ｎ ＨＣｌ水溶液１．５ｍＬを添加して中和し、緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５．０ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ７．８）４．５ｍＬを加えて１０分間煮沸した。次いでプロテアーゼ
６ｍｇを添加して５０℃にて２４時間インキュベートし、その後再度プロテアーゼ ６ｍｇを添加した。さらに５０℃にて２４時間インキュベートした後、トリクロロ酢酸１ｍＬを加え、４℃で１時間静置後、遠心分離（３５００ｒｐｍ，１５分）してタンパクを沈殿させた。次に上清を採取して蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。得られた乾燥物に蒸留水
１ｍＬを添加して溶解し、５００μＬずつ分注して再度凍結乾燥した。
２−２．角層ヒアルロン酸量の測定
２−１で調製された凍結乾燥物中に含まれるヒアルロン酸量を市販のＥＬＩＳＡ
Ｋｉｔ（QnE
Hyaluronic Acid(HA)ELISA Assay, Biotech Trading Partners)を使用し、Ｋｉｔの指示通りに測定した。
２−１で調製された凍結乾燥物中に含まれるヒアルロン酸量を市販のＥＬＩＳＡ
Ｋｉｔ（QnE
Hyaluronic Acid(HA)ELISA Assay, Biotech Trading Partners)を使用し、Ｋｉｔの指示通りに測定した。
２−３．角層ヒアルロン酸分子量の測定
２−１で調製された凍結乾燥物に蒸留水 １０μＬとＬｏａｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ（２Ｍスクロース，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．３） １０μＬを添加した。これを試料として４％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルを作製し、ＴＢＥバッファー中４００Ｖで１２分間電気泳動を行い、ゲルを０．００５％
Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ ５０％エタノール溶液（Sigma社）を用いて一晩染色後、１０％エタノール水溶液中で脱色し、電気泳動像をスキャナーで取り込んだ。各試料のゲル上での移動距離を基に分子量を５段階に分類し（分子量の小さい方から１，２，３，４，５）、分子量スコアとした。具体的には、ヒアルロン酸の電気泳動は、タンパク質とは異なりテーリングをするので、陽極方向のテーリング最先端部（到達点側）の位置をスコアリングしている。つまり、本分子量スコアが上がるということは、低分子化したヒアルロン酸の蓄積がなくなり、正常分子量のヒアルロン酸が合成されていることが示される。
２−１で調製された凍結乾燥物に蒸留水 １０μＬとＬｏａｄｉｎｇ
Ｂｕｆｆｅｒ（２Ｍスクロース，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｏｒａｔｅ，１ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．３） １０μＬを添加した。これを試料として４％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルを作製し、ＴＢＥバッファー中４００Ｖで１２分間電気泳動を行い、ゲルを０．００５％
Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ ５０％エタノール溶液（Sigma社）を用いて一晩染色後、１０％エタノール水溶液中で脱色し、電気泳動像をスキャナーで取り込んだ。各試料のゲル上での移動距離を基に分子量を５段階に分類し（分子量の小さい方から１，２，３，４，５）、分子量スコアとした。具体的には、ヒアルロン酸の電気泳動は、タンパク質とは異なりテーリングをするので、陽極方向のテーリング最先端部（到達点側）の位置をスコアリングしている。つまり、本分子量スコアが上がるということは、低分子化したヒアルロン酸の蓄積がなくなり、正常分子量のヒアルロン酸が合成されていることが示される。
図１〜４に示した実験の結果より、加齢したヒトの露光部皮膚の角層より抽出されたヒアルロン酸は非露光部皮膚のものよりも分子量が小さく、また、若齢ヒトの同部位ものと比較しても分子量が小さかった。一方、ヒアルロン酸量も若齢ヒトの同部位との比較では少ないが、年代に関わらず露光部皮膚のヒアルロン酸量の方が多いということ、この際加齢したヒトの露光部皮膚では非露光部皮膚と比較して角層水分量が低く、経表皮水分蒸散量が高いという結果が得られた。すなわち、露光部皮膚と非露光部皮膚では露光部皮膚の角層ヒアルロン酸量が多いにも関わらず、角層水分量が低く、経表皮水分蒸散量が高い。この結果から、角層水分量と皮膚バリア機能の向上には、ヒアルロン酸の量よりもむしろ分子量が重要であることが示された。また、露光部皮膚と非露光部皮膚の経表皮水分蒸散量は年代に関わらず露光部皮膚の経表皮水分蒸散量が高いが、角層水分量については若齢のヒトでは部位による差が小さいのに対して、加齢したヒトの露光部皮膚では非露光部皮膚に比較して著しく小さく、加齢したヒト皮膚における低分子ヒアルロン酸の蓄積が継続的な皮膚バリア機能の低下を招き、角層水分量を低下させている可能性が示唆された。
＜実験例２＞培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸代謝関連遺伝子発現量に対する紫外線の影響
１９歳および５７歳健常ヒト由来ケラチノサイト（ＨＥＫ， 東洋紡社）をそれぞれ７．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（Cell Applications）に分散し、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔを除いてＰＢＳに置換し、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した。その後ＰＢＳを取り除いて新しいＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに置換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートした。次に、市販のＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出Ｋｉｔ（RNeasy Mini Kit,QIAGEN)を使用し、Ｋｉｔの指示通りにＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡは、市販の逆転写Ｋｉｔ（PrimeScript RT
Reagent Kit (Perfect Real Time), TaKaRa)を用い、GeneAmp PCR System
2700 (Applied Biosystems)にてＫｉｔの指示通りに逆転写した。ヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量は、市販のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ試薬（Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)を用い、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)にてＫｉｔの指示通りに測定した。この際に使用したプライマー配列は下記の通りである。
１９歳および５７歳健常ヒト由来ケラチノサイト（ＨＥＫ， 東洋紡社）をそれぞれ７．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（Cell Applications）に分散し、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔを除いてＰＢＳに置換し、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した。その後ＰＢＳを取り除いて新しいＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに置換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートした。次に、市販のＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出Ｋｉｔ（RNeasy Mini Kit,QIAGEN)を使用し、Ｋｉｔの指示通りにＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡは、市販の逆転写Ｋｉｔ（PrimeScript RT
Reagent Kit (Perfect Real Time), TaKaRa)を用い、GeneAmp PCR System
2700 (Applied Biosystems)にてＫｉｔの指示通りに逆転写した。ヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量は、市販のＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ試薬（Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)を用い、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)にてＫｉｔの指示通りに測定した。この際に使用したプライマー配列は下記の通りである。
（１）ＧＡＰＤＨ
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’
（２）ＨＡＳ１
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＡＴＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣ−３’
（３）ＨＡＳ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＡＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ−３’
（４）ＨＡＳ３
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴ−３’
（５）ＣＤ４４
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣ−３’
（６）ＨＹＡＬ１
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＴＣ−３’
（７）ＨＹＡＬ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴＣＴＴＣＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＡ−３’
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’
（２）ＨＡＳ１
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＡＴＡＴＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＴＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣ−３’
（３）ＨＡＳ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＧＡＴＡＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：５‘−ＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧ−３’
（４）ＨＡＳ３
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＧＴＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴ−３’
（５）ＣＤ４４
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＣＴＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＴ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＣ−３’
（６）ＨＹＡＬ１
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡＧＴＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＴＣ−３’
（７）ＨＹＡＬ２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴＣＴＴＣＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ： ５‘−ＣＧＣＡＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＴＧＧＴＡ−３’
図５〜１０に示すように、紫外線を照射した高齢ヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトにおいて、ヒアルロン酸代謝関連遺伝子のうち、ヒアルロン酸合成関連遺伝子であるＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子であるＣＤ４４、ヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２のそれぞれの発現量が低下あるいは若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトと比較して発現量の上昇度が低下していることが示された。この結果から、加齢および紫外線による表皮ケラチノサイトにおけるヒアルロン酸合成関連遺伝子のみならず、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子およびヒアルロン酸分解関連遺伝子を含むヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下が低分子ヒアルロン酸の蓄積を招いている可能性が示唆された。
＜実験例３＞加齢および紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下を抑制する物質のスクリーニング
１．被験物質の調製
オトギリソウ地上部、サルビア葉、ザクロ果皮、ザクロ花、アルテア葉、クレマティス葉、トウキンセンカ花を用いて、次の製造方法に従い、各植物抽出物（粉末）を得た。
１．被験物質の調製
オトギリソウ地上部、サルビア葉、ザクロ果皮、ザクロ花、アルテア葉、クレマティス葉、トウキンセンカ花を用いて、次の製造方法に従い、各植物抽出物（粉末）を得た。
乾燥したオトギリソウ地上部、サルビア葉、ザクロ果皮、ザクロ花、アルテア葉、クレマティス葉トウキンセンカ花に、１０倍の重量の５０％エタノール水溶液を加えて室温で1週間静置し、各植物の５０％エタノール抽出液を得た。次に、得られた抽出液をフィルター(ADVANTEC
Cellulose acetate, 0.45μm, 47mm)を用いて吸引ろ過後、エバポレーターにてエタノールを留去し、凍結乾燥することによって各植物抽出物（粉末）を得た。
Cellulose acetate, 0.45μm, 47mm)を用いて吸引ろ過後、エバポレーターにてエタノールを留去し、凍結乾燥することによって各植物抽出物（粉末）を得た。
２．培養表皮ケラチノサイトに対する被験物質の適用
５７歳健常ヒト由来ケラチノサイト（ＨＥＫ， 東洋紡社）を７．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに分散し、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、被験物質を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。その後Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔを除いてＰＢＳに置換し、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した後、ＰＢＳを取り除いて新しいＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに置換し、再度被験物質を添加して３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートした。その後Ｔｏｔａｌ
ＲＮＡを調製して＜実験例２＞と同様の方法でヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量を測定した。
尚、本実験では、紫外線照射の前後に被験物質の添加を行ったが、紫外線照射前のみ被験物質の添加を行っても良いし、紫外線照射後にのみ被験物質を添加して実験を行っても、遺伝子の発現量と皮膚バリア機能改善作用との関係は同様の傾向を示すので、被験物質に合わせて、適宜調整することが可能である。
５７歳健常ヒト由来ケラチノサイト（ＨＥＫ， 東洋紡社）を７．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに分散し、２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに５００μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした後、被験物質を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。その後Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔを除いてＰＢＳに置換し、ＵＶＢ ２０ｍＪ／ｃｍ２を照射した後、ＰＢＳを取り除いて新しいＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔに置換し、再度被験物質を添加して３７℃、５％ＣＯ２下で６時間インキュベートした。その後Ｔｏｔａｌ
ＲＮＡを調製して＜実験例２＞と同様の方法でヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量を測定した。
尚、本実験では、紫外線照射の前後に被験物質の添加を行ったが、紫外線照射前のみ被験物質の添加を行っても良いし、紫外線照射後にのみ被験物質を添加して実験を行っても、遺伝子の発現量と皮膚バリア機能改善作用との関係は同様の傾向を示すので、被験物質に合わせて、適宜調整することが可能である。
表１に示したように、サルビア葉から得られた抽出物でヒアルロン酸合成関連遺伝子であるＨＡＳ１およびＨＡＳ３、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子であるＣＤ４４、ヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２、ザクロ果皮および花から得られた各抽出物でヒアルロン酸合成関連遺伝子であるＨＡＳ１およびＨＡＳ２およびＨＡＳ３、ヒアルロン酸レセプター関連遺伝子であるＣＤ４４、ヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２についてＣｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄとなり、本発明の皮膚バリア機能改善剤の有効成分として選択された。さらに、サルビア葉から得られた抽出物ではヒアルロン酸分解関連遺伝子であるＨＹＡＬ２についてＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ≧（Ｃｙｄ／Ｂｙｄ＋Ｃａｄ／Ｂａｄ）／２になっており、特に有効な有効成分として選択された。一方、オトギリソウ地上部、アルテア葉、クレマティス葉、トウキンセンカ花から得られた抽出物では、Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ≧Ｃａｓ／ＢａｓかつＣｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／ＢａｒかつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄが満たされておらず、本発明の皮膚バリア機能改善剤の有効成分として選択されなかった。
＜実験例４＞実使用試験
サルビア葉抽出物、ザクロ花抽出物、あるいはクレマティス葉抽出物を用いて「表２」の処方により皮膚外用剤を調製し、試験に同意を得た５０代男性５名を１群とし、第１群に実施例１と比較例２、第２群に実施例２と比較例２、第３群に比較例１と比較例２のテストサンプルを半顔に１日２回塗布してもらい、使用開始前、使用開始４週間後に＜実験例１＞と同様の方法で角層水分量、経表皮水分蒸散量、ヒアルロン酸分子量の測定を行った。試験結果は各測定日の比較例２使用部位の測定により得られた値を１００％として表した。試験結果を図１１〜１４に示す。
サルビア葉抽出物、ザクロ花抽出物、あるいはクレマティス葉抽出物を用いて「表２」の処方により皮膚外用剤を調製し、試験に同意を得た５０代男性５名を１群とし、第１群に実施例１と比較例２、第２群に実施例２と比較例２、第３群に比較例１と比較例２のテストサンプルを半顔に１日２回塗布してもらい、使用開始前、使用開始４週間後に＜実験例１＞と同様の方法で角層水分量、経表皮水分蒸散量、ヒアルロン酸分子量の測定を行った。試験結果は各測定日の比較例２使用部位の測定により得られた値を１００％として表した。試験結果を図１１〜１４に示す。
図１１〜１４に示したように、本発明のスクリーニング法により選択された加齢および紫外線によるヒアルロン酸代謝関連遺伝子の発現量低下あるいは上昇度低下を抑制する成分を含有する皮膚バリア機能改善剤であるサルビア葉抽出物を配合した実施例１あるいはザクロ花抽出物を配合した実施例２では角層ヒアルロン酸量には大きな変化が認められなかったが、角層ヒアルロン酸分子量スコアの上昇と経表皮水分蒸散量の低下、角層水分量の向上が認められた。一方、本発明のスクリーニング法において良好な成績を与えなかったクレマティス葉抽出物では、各測定項目において明確な変化は見られなかった。
以下、本発明に係る紫外線防御用皮膚外用剤の処方例を示す。なお、含有量は重量％である。尚、製法は常法による。
処方例１：クリーム
サルビア葉抽出物 ０．０２
ステアリルアルコール ６．００
ステアリン酸 ２．００
ワセリン ４．００
スクワラン ９．００
オクチルドデカノール １０．００
１，３−ブチレングリコール ６．００
グリセリン ４．００
ＰＯＥ（２０）セチルアルコールエーテル ３．００
モノステアリン酸グリセリン ２．００
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
サルビア葉抽出物 ０．０２
ステアリルアルコール ６．００
ステアリン酸 ２．００
ワセリン ４．００
スクワラン ９．００
オクチルドデカノール １０．００
１，３−ブチレングリコール ６．００
グリセリン ４．００
ＰＯＥ（２０）セチルアルコールエーテル ３．００
モノステアリン酸グリセリン ２．００
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
処方例２：ファンデーション
ザクロ葉抽出物 ０．０１
サルビア葉抽出物 ０．０１
タルク ５.００
セリサイト ８.００
酸化チタン ５.００
色顔料 適量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル ３.００
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １.５０
イソノナン酸イソトリデシル １０.００
１，３−ブチレングリコール ５.００
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
ザクロ葉抽出物 ０．０１
サルビア葉抽出物 ０．０１
タルク ５.００
セリサイト ８.００
酸化チタン ５.００
色顔料 適量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル ３.００
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 １.５０
イソノナン酸イソトリデシル １０.００
１，３−ブチレングリコール ５.００
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
処方例３：サンスクリーン
ザクロ花抽出物 ０．０１
サルビア葉抽出物 ０．０１
酸化チタン １０.００
酸化亜鉛 １０.００
PEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン １.５０
ラウリルPEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン １.５０
シクロペンタシロキサン ２０.００
ジメチコン １０.００
（ジメチコン／ビニルジメチコン）クロスポリマー
０.５０
セチルジメチコン ０.２５
グリチルレチン酸エステル ０.０５
メチルグルセス−２０ １.００
１，３−ブチレングリコール １０.００
塩化ナトリウム 適量
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
ザクロ花抽出物 ０．０１
サルビア葉抽出物 ０．０１
酸化チタン １０.００
酸化亜鉛 １０.００
PEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン １.５０
ラウリルPEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン １.５０
シクロペンタシロキサン ２０.００
ジメチコン １０.００
（ジメチコン／ビニルジメチコン）クロスポリマー
０.５０
セチルジメチコン ０.２５
グリチルレチン酸エステル ０.０５
メチルグルセス−２０ １.００
１，３−ブチレングリコール １０.００
塩化ナトリウム 適量
酸化防止剤 適量
防腐剤 適量
精製水 残部
合計 １００．０
Claims (2)
- 培養表皮ケラチノサイトについて、培養表皮ケラチノサイトに発現する遺伝子の発現量を比較することで、皮膚水分バリア機能改善剤をスクリーニングする方法であって、
（１）紫外線を照射した健常な１０〜２０歳代（以下若齢）のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子（ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３から選ばれる１種以上）の発現量（Ｃｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（ＣＤ４４）の発現量（Ｃｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２から選ばれる１種以上）の発現量（Ｃｙｄ）を測定するステップ
（２）紫外線を照射しない若齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子（ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３から選ばれる１種以上）の発現量（Ｂｙｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（ＣＤ４４）の発現量（Ｂｙｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２から選ばれる１種以上）の発現量（Ｂｙｄ）を測定するステップ
（３）紫外線を照射した健常な５０歳以上（以下高齢）のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子（ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３から選ばれる１種以上）の発現量（Ｃａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（ＣＤ４４）の発現量（Ｃａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２から選ばれる１種以上）の発現量（Ｃａｄ）を測定するステップ
（４）紫外線を照射しない高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子（ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３から選ばれる１種以上）の発現量（Ｂａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（ＣＤ４４）の発現量（Ｂａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２から選ばれる１種以上）の発現量（Ｂａｄ）を測定するステップ
（５）紫外線照射前又は、紫外線照射後又は、紫外線照射の前後に被験物質を加えた状態の高齢のヒトをドナーとする培養表皮ケラチノサイトのヒアルロン酸合成関連遺伝子（ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３から選ばれる１種以上）の発現量（Ｔａｓ）およびヒアルロン酸レセプター関連遺伝子（ＣＤ４４）の発現量（Ｔａｒ）およびヒアルロン酸分解関連遺伝子（ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２から選ばれる１種以上）の発現量（Ｔａｄ）を測定するステップ
（６）前記（１）〜（５）の各ステップで得られた遺伝子の発現量において、
（Ｃｙｓ／Ｂｙｓ≧Ｔａｓ／Ｂａｓ＞Ｃａｓ／ＢａｓまたはＣｙｓ／Ｂｙｓ＞Ｔａｓ／Ｂａｓ＞Ｃａｓ／Ｂａｓ）、
かつ（Ｃｙｒ／Ｂｙｒ≧Ｔａｒ/Ｂａｒ＞Ｃａｒ／ＢａｒまたはＣｙｒ／Ｂｙｒ＞Ｔａｒ/Ｂａｒ≧Ｃａｒ／Ｂａｒ）、
かつＣｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞Ｃａｄ／Ｂａｄ
となる被験物質を有効成分として選択することを特徴とする皮膚水分バリア機能改善剤のスクリーニング方法。 - Ｃｙｄ／Ｂｙｄ≧Ｔａｄ／Ｂａｄ＞（Ｃｙｄ／Ｂｙｄ＋Ｃａｄ／Ｂａｄ）／２となる被験物質を有効成分として選択することを特徴とする請求項１の皮膚水分バリア機能改善剤のスクリーニング方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012249509A JP6190105B2 (ja) | 2012-11-13 | 2012-11-13 | 皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012249509A JP6190105B2 (ja) | 2012-11-13 | 2012-11-13 | 皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014097000A JP2014097000A (ja) | 2014-05-29 |
| JP6190105B2 true JP6190105B2 (ja) | 2017-08-30 |
Family
ID=50939627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012249509A Active JP6190105B2 (ja) | 2012-11-13 | 2012-11-13 | 皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6190105B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014162748A (ja) * | 2013-02-25 | 2014-09-08 | Kagawa Univ | 皮膚の光老化抑制剤 |
| EP3124620B1 (en) * | 2015-07-27 | 2018-08-08 | Chanel Parfums Beauté | Activators of uc.291 for use for improving skin barrier function and/or for preventing and/or attenuating skin ageing and/or for hydrating skin |
| CN107095828B (zh) * | 2017-07-03 | 2020-08-11 | 四川省中医药科学院 | 一种具有皮肤屏障修复功能的日化用品组合物及其制备方法和用途 |
| JPWO2021182283A1 (ja) * | 2020-03-10 | 2021-09-16 | ||
| JP7370909B2 (ja) * | 2020-03-17 | 2023-10-30 | 日清食品ホールディングス株式会社 | ヒアルロン酸の調製方法及びヒアルロン酸の検出方法、並びにこれらのキット |
| JP7395637B2 (ja) * | 2022-03-28 | 2023-12-11 | 株式会社ナリス化粧品 | ヒアルロニダーゼ阻害剤 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4768238B2 (ja) * | 2004-07-01 | 2011-09-07 | 丸善製薬株式会社 | プロフィラグリンｍＲＮＡ発現促進剤 |
| EP1901817A2 (en) * | 2005-07-08 | 2008-03-26 | The Procter and Gamble Company | Personal care compositions and methods for the beautification of mammalian skin and hair |
-
2012
- 2012-11-13 JP JP2012249509A patent/JP6190105B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014097000A (ja) | 2014-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6190105B2 (ja) | 皮膚バリア機能改善剤のスクリーニング方法 | |
| JP5085321B2 (ja) | 皮膚外用剤 | |
| JP5108025B2 (ja) | ラン科植物から得られる抽出物およびその製造方法、ならびにラン科植物から得られる抽出物を含有する皮膚外用剤 | |
| KR101967615B1 (ko) | 피부 외용제 | |
| JP5683134B2 (ja) | 皮膚外用剤 | |
| US20120195923A1 (en) | Use of skin care compositions comprising laminariacea extract for treatment of skin aging signs | |
| WO2014182917A1 (en) | Formulations and methods for improving skin conditions | |
| CN110946784A (zh) | 一种具有提升皮肤屏障功能、加强皮肤健康的护肤组合物 | |
| CN113116755A (zh) | 一种促渗透的护肤组合物及其制备方法和应用 | |
| US20130183257A1 (en) | Compositions and methods for improving skin appearance | |
| EP2092934A1 (en) | Ceramide synthesis accelerators, cosmetic preparation, skin preparation for external use, method of preventing aging, and method of diminishing wrinkle | |
| EP2986983B1 (fr) | Utilisation de biomarqueurs de la barrière pour l'évaluation de l'efficacité d'actifs | |
| JP4869751B2 (ja) | サンバーンセル形成抑制剤及びｄｎａ損傷修復促進剤 | |
| EP2941254B1 (en) | Agent for sedating response to external stimulation in skin and method for sedating that response technical field | |
| JP7212410B2 (ja) | ガラクトオリゴ糖、又はガラクトオリゴ糖及びコラーゲントリペプチドを含む免疫機能改善及び皮膚状態改善用の機能性食品組成物及び化粧料組成物 | |
| JP7033160B2 (ja) | ビタミンｄ様作用剤 | |
| CN108542803B (zh) | 一种防晒剂及其制备工艺 | |
| EP2935199B1 (en) | Esters of glycyrrhetinic acid, preparation and cosmetic applications thereof | |
| JP3235922B2 (ja) | 化粧料 | |
| JP6246474B2 (ja) | 多糖体，皮膚バリア機能改善剤及び皮膚保湿剤 | |
| JP2006241095A (ja) | フィラグリン合成促進剤および紫外線傷害緩和剤 | |
| JP5918168B2 (ja) | β−グルコセレブロシダーゼ活性増強剤 | |
| JP5455248B2 (ja) | 保湿作用を有する皮膚外用剤 | |
| CZ13908U1 (cs) | Kosmetický přípravek s vysokomolekulární antioxidační složkou | |
| WO2022045261A1 (ja) | Ｃｄ３９遺伝子の発現低下の抑制剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150917 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160628 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160826 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170302 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170801 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170804 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6190105 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |