TW202146434A - 免疫控制法、免疫控制用核酸組成物及其用途 - Google Patents

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山野友義
的場一��
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Abstract

本發明係提供可製作可使抗原特異性T細胞充分地活性化等之細胞外囊泡之多核苷酸。 本發明係提供包含由下列(a)～(e)所構成之群所選出之至少1個序列之多核苷酸： (a)編碼包含抗原呈現MHC分子，且可將該抗原呈現MHC分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(A)之序列； (b)編碼包含至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(B)之序列； (c)編碼包含T細胞共刺激分子，且可將該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(C)之序列； (d)編碼包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(D)之序列；及 (e)編碼包含抗原呈現MHC分子，與至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及T細胞共刺激分子，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素與該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(E)之序列。

Description

免疫控制法、免疫控制用核酸組成物及其用途
本發明係關於免疫控制法、免疫控制用核酸組成物及其用途。
藉由生物進行之癌細胞等的排除，或對於自體抗原、過敏性物質等之應答之調節等的免疫反應，已知係以抗原特異性T細胞(例如，細胞毒殺型T細胞、輔助T細胞等)為中心進行作用。抗原特異性T細胞係以T細胞受體識別樹狀細胞或巨噬細胞等之抗原呈現細胞之細胞表面之MHC分子與源自癌、過敏性物質等之抗原之結合複合體來進行活性化、增殖、分化等。進行活性化等後之抗原特異性T細胞係調節對於呈現抗原之癌細胞等進行特異性的傷害之情況，或對於自體抗原、過敏性物質等之應答。因此，使抗原特異性T細胞活性化、增殖、分化等，在免疫反應中被認為是尤其重要的事。
作為使抗原特異性T細胞活性化等之方法，不僅只有已實用化之在T細胞中表現嵌合抗原受體之方法，還有其他的方法亦正被開發當中。例如，專利文獻1係揭示表現上包含MHC分子與T細胞共刺激分子之奈米粒子使抗原特異性T細胞增殖之情況。此外，非專利文獻1係揭示透過PTGFRN而於膜上表現IL-12之胞外體係使腫瘤抗原特異性之CD8陽性T細胞增殖。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2016-520518號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Katherine Kirwin, et al., “Exosome Surface Display of IL-12 Results in Tumor-Retained Pharmacology with Superior Potency and Limited Systemic Exposure Compared to Recombinant IL-12”, 令和1年(2019年)11月6日, 34th Annual Meeting of the Society for Immuno-therapy of Cancer [非專利文獻2]Journal of Extracellular Vesicles (2018); 7: 1535750
[發明所欲解決之課題]
本發明人等，作為可使抗原特異性T細胞活性化等之新的方法，係嘗試使用於膜中包含MHC分子與T細胞共刺激分子之細胞外囊泡。然而，使用此細胞外囊泡嘗試進行抗原特異性T細胞之活性化等之後，係初次發現無法使抗原特異性T細胞充分地活性化等。
因此，本發明之目的在於提供一種新穎的免疫控制法、免疫控制用核酸組成物及其用途。 [用於解決課題之手段]
鑒於上述課題而重複進行積極檢討之後，本發明者係意外地發現，藉由使用可製作於膜中包含MHC分子及T細胞刺激性細胞激素之細胞外囊泡之多核苷酸，可使抗原特異性T細胞充分地活性化等，進而完成本發明。
因此，本發明係包含下述內容： [0] 一種細胞外囊泡，其係於膜外呈現抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素。 [1] 一種抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)包含抗原呈現MHC分子之可於膜外呈現該抗原之蛋白質；及 (B)包含第1T細胞刺激性細胞激素或其次單元之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質。 [2] 如[1]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)可於膜外呈現該抗原之融合蛋白質或蛋白質複合體，其係包含：抗原呈現MHC分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域；及 (B)其係包含：第1T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域、可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。 [3] 如[1]或[2]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)可於膜外呈現該抗原之融合蛋白質或蛋白質複合體，其係包含：抗原呈現MHC分子，及四跨膜蛋白(Tetraspanin)或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域；及 (B)融合蛋白質，其係包含第1T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及四跨膜蛋白之部分序列之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其中，該四跨膜蛋白之部分序列係至少具有2個膜貫通結構域，且該第1T細胞刺激性細胞激素係配置於該2個膜貫通結構域之間，或 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含第1T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及MFG-E8或其結構域。 [4] 如[1]～[3]中之任一項所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子(spacer)序列、 (A-3)單鏈MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列，或 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、β2 微球蛋白、第II型MHCα鏈，或第II型MHCβ鏈 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含β2 微球蛋白、第I型MHCα鏈、第II型MHCβ鏈，或第II型MHCα鏈之胺基酸序列；以及 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係，其係包含自N末端側起由 (B-1)自N末端側起、包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)可存在之間隔子序列、 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，以及 (B-5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列，或 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，及 (B-5)MFG-E8 構成之胺基酸序列。 [5] 如[4]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其係於膜中包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈第I型MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 [6] 如[4]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其係於膜中包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其係 包含自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)包含第II型MHCα鏈之胺基酸序列之蛋白質。 [7] 如[1]～[6]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，第1T細胞刺激性細胞激素為IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-12之次單元或TGF-β。 [8] 如[1]～[7]中之任一項所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (C)包含T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質。 [9] 如[1]～[8]中之任一項所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (C)包含T細胞共刺激分子，及，可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。 [10] 如[1]～[9]中之任一項所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (C)包含T細胞共刺激分子，及，四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。 [11] 如[1]～[10]中之任一項所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (C-1)T細胞共刺激分子、 (C-2)可存在之間隔子序列，及 (C-3)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 [12] 如[1]～[11]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，細胞外囊泡為胞外體。 [13] 一種多核苷酸，其係編碼以下之任一者： (i)如[2]～[6]中之任一項所定義之(A)之融合蛋白質或者蛋白質複合體； (ii)如[2]～[4]中之任一項所定義之(B)之融合蛋白質；或 (iii)如[9]～[11]中之任一項所定義之(C)之融合蛋白質。 [14] 一種載體，其係包含由[13]記載之多核苷酸所選出之至少1種多核苷酸而成。 [15] 一種經轉形之細胞，其係藉由包含以下： (i)編碼如[2]～[6]中之任一項所定義之(A)之融合蛋白質或者蛋白質複合體之多核苷酸；及 (ii)編碼如[2]～[4]中之任一項所定義之(B)之融合蛋白質之多核苷酸，以及可選擇性地包含 (iii)編碼如[9]～[11]中之任一項所定義之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之單一載體或2種以上載體之組合進行轉形。 [16] 一種培養上清液，其係培養[15]記載之細胞所獲得。 [17] 一種抗原呈現細胞外囊泡，其係由[16]記載之培養上清液所獲得。 [18] 一種用於製造如[1]～[12]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡之方法，其中，包含將培養[15]記載之細胞所獲得之培養上清液回收之步驟。 [19] 一種醫藥組成物，其係包含如[1]～[12]及[17]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，或如[16]記載之培養上清液。 [20] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防感染症之[1]～[12]及[17]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，或[16]記載之培養上清液。 [21] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防癌之如[5]及[7]～[12]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡。 [22] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防自體免疫疾病之[6]～[12]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡。 [23] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防過敏性疾患之如[6]～[12]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡。 [24] 一種使相對於特異性的抗原之T細胞活性化及/或增殖之方法，其中包含使[1]～[12]及[17]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡與T細胞於in vitro或ex vivo中接觸之步驟。
[25] 如[1]～[11]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，(A)所界定之蛋白質或蛋白質複合體與(B)所界定之蛋白質或蛋白質複合體係融合。 [26] 如[8]～[11]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，(A)所界定之蛋白質或蛋白質複合體與(C)所界定之蛋白質或蛋白質複合體係融合。 [27] 如[8]～[11]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，(B)所界定之蛋白質或蛋白質複合體與(C)所界定之蛋白質或蛋白質複合體係融合。 [28] 如[8]～[11]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，(A)所界定之蛋白質或蛋白質複合體與(B)所界定之蛋白質或蛋白質複合體與(C)所界定之蛋白質或蛋白質複合體係融合。 [29] 如[25]～[27]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，細胞外囊泡為胞外體。
[30] 如[21]記載之醫藥組成物，其係包含免疫檢查點抑制劑。 [31] 如[30]記載之醫藥組成物，其中，前述免疫檢查點抑制劑係存在於前述抗原呈現細胞外囊泡之膜上。 [32] 如[30]或[31]記載之醫藥組成物，其中，前述免疫檢查點抑制劑係選自由抗PD-1抗體或其活性碎片；抗CTLA-4抗體或其活性碎片；及PD-L1抗體或其活性碎片所成之群。
[1A] 一種抗原呈現細胞外囊泡，其膜係包含以下成分： (D)可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元。 [2A] 如[1A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中， 前述融合蛋白質係包含前述抗原呈現MHC分子，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域。 [3A] 如[2A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中， 前述可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質為四跨膜蛋白或MFG-E8、抗原呈現細胞外囊泡。 [4A] 如[3A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中， 前述融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽。 [5A] 如[3A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中， 前述融合蛋白質係包含自N末端側起編碼 (D-1)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)MHC分子限制性抗原胜肽 之胺基酸序列。 [6A] 如[4A]或[5A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述融合胜肽係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (2)可存在之間隔子序列、 (3)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (4)可存在之間隔子序列，以及 (5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列。 [7A] 如[4A]或[5A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述融合胜肽係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (2)可存在之間隔子序列，及 (3)MFG-E8。 [8A] 如[4A]或[5A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第I型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子係包含第I型MHCα鏈之細胞外領域。 [9A] 如[4A]或[5A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第II型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子係包含第II型MHCα鏈之細胞外結構域及/或第II型MHCβ鏈之細胞外結構域。
[10A] 如[1A]～[9A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，進一步於該膜中包含(C)包含至少1種T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質。 [11A] 如[10A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述可與T細胞相互作用之蛋白質係包含前述至少1種T細胞共刺激分子，及，可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。 [12A] 如[11A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述可與T細胞相互作用之蛋白質係包含前述至少1種T細胞共刺激分子，及，四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。 [13A] 如[12A]所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述可與T細胞相互作用之蛋白質係包含 (C)自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (C-1)前述至少1種T細胞共刺激分子、 (C-2)可存在之間隔子序列，及 (C-3)四跨膜蛋白。 [14A] 如[10A]～[13A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述(A)融合蛋白質與前述(C)可與T細胞相互作用之蛋白質係融合。 [15A] 如[1A]～[14A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，細胞外囊泡為胞外體。
[1B] 一種醫藥組成物，其係包含如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡與藥理學上容許之擔體。
[1C] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防癌之如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡；此處，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2C] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防自體免疫疾病之如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡；此處，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3C] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防過敏性疾患之[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡；此處，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4C] 如[1C]記載之醫藥組成物，其係包含免疫檢查點抑制劑。 [5C] 如[4C]記載之醫藥組成物，其中，前述免疫檢查點抑制劑係存在於前述抗原呈現細胞外囊泡之膜上。 [6C] 如[4C]或[5C]記載之醫藥組成物，其中，前述免疫檢查點抑制劑係選自由抗PD-1抗體或其活性碎片；抗CTLA-4抗體或其活性碎片；及PD-L1抗體或其活性碎片所成之群。 [7C] 一種用於處置或預防感染症之醫藥組成物，其係包含如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡及藥理學上容許之擔體；此處，較佳為前述抗原胜肽係源自引起前述感染症之感染病原體。
[1D] 如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其係用於癌之處置或預防中之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2D] 如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其係用於自體免疫疾病之處置或預防中之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3D] 如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其係用於過敏性疾患之處置或預防中之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4D] 如[1D]記載之用途之抗原呈現細胞外囊泡，其係與免疫檢查點抑制劑共同使用。 [5D] 如[4D]記載之用途之抗原呈現細胞外囊泡，前述免疫檢查點抑制劑係存在於前述抗原呈現細胞外囊泡之膜上。 [6D] 如[4D]或[5D]記載之用途之抗原呈現細胞外囊泡，其中，前述免疫檢查點抑制劑係選自由抗PD-1抗體或其活性碎片；抗CTLA-4抗體或其活性碎片；及PD-L1抗體或其活性碎片所成之群。 [7D] 如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡，其係用於感染症之處置或預防中之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係源自引起前述感染症之感染病原體。
[1E] 一種如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡之用於處置或預防癌之醫藥之製造之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2E] 一種如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡之用於自體免疫疾病之處置或預防之醫藥之製造之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3E] 一種如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡之用於過敏性疾患之處置或預防之醫藥之製造之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4E] 如[1E]記載之用途，其中，前述醫藥係與免疫檢查點抑制劑共同使用。 [5E] 如[4E]記載之用途，其中，前述免疫檢查點抑制劑係存在於前述抗原呈現細胞外囊泡之膜上。 [6E] 如[4E]或[5E]記載之用途，其中，前述免疫檢查點抑制劑係選自由抗PD-1抗體或其活性碎片；抗CTLA-4抗體或其活性碎片；及PD-L1抗體或其活性碎片所成之群。 [7E] 一種如[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡之用途，其係用於處置或預防感染症之醫藥之製造中；此處，前述抗原胜肽較佳係源自引起前述感染症之感染病原體。
[1F] 一種於對象中處置或預防癌之方法，其係藉由將有效量之[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡投予至對象，使對象內之辨識癌抗原之T細胞活性化及/或增殖，並使該活性化及/或增殖後之T細胞攻擊癌細胞，藉此處置或預防癌；此處，前述該活性化及/或增殖後之T細胞較佳為CD8陽性之細胞毒殺型T細胞，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2F] 一種於對象中處置或預防自體免疫疾病之方法，其係藉由將有效量之[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡投予至對象，使對象內之辨識自體抗原之T細胞活性化及/或增殖，於對象內進行對於前述自體抗原之免疫反應之減敏作用，藉此處置或預防自體免疫疾病之方法；此處，前述該活性化及/或增殖後之T細胞較佳為CD4陽性之調節性T細胞(Treg)，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3F] 一種於對象中處置或預防過敏性疾患之方法，其係藉由將有效量之[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡投予至對象，使對象內之辨識過敏原之T細胞活性化及/或增殖，於對象內進行對於前述自體抗原之免疫反應之減敏作用，藉此處置或預防自體免疫疾病之方法；此處，前述該活性化及/或增殖後之T細胞較佳為CD4陽性之調節性T細胞(Treg)，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4F] 如[1F]記載之方法，前述抗原呈現細胞外囊泡係與免疫檢查點抑制劑同時被投予。 [5F] 如[4F]記載之方法，其中，前述免疫檢查點抑制劑係存在於前述抗原呈現細胞外囊泡之膜上。 [6F] 如[4F]或[5F]記載之方法，其中，前述免疫檢查點抑制劑係選自由抗PD-1抗體或其活性碎片；抗CTLA-4抗體或其活性碎片；及PD-L1抗體或其活性碎片所成之群。 [7F] 一種處置或預防感染症之方法，其係於對象中處置或預防感染症之方法，其中包含將有效量之[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡投予至對象， 1)使發炎性細胞激素分泌，並使對象之自然免疫活性化，及/或 2)使前述對象具有對於引起前述感染症之感染病原體之獲得免疫，並排除在體內之引起前述感染症之感染病原體之步驟，及/或抑制其之增殖之步驟。
[1G] 一種使相對於特異性的抗原之T細胞活性化及/或增殖之方法，其中，包含使[1A]～[15A]中之任一項記載之抗原呈現細胞外囊泡與T細胞於in vitro或ex vivo中接觸之步驟。
[1H] 一種多核苷酸，其係編碼 (i)如[1A]～[9A]中之任一項所定義之(D)之融合蛋白質或者蛋白質複合體； (ii)如[10A]～[13A]中之任一項所定義之(C)之可與T細胞相互作用之蛋白質；或 (iii)如[14A]記載之(D)之融合蛋白質及(C)之可與T細胞相互作用之蛋白質之融合蛋白質。 [2H] 一種載體，其係包含[1G]記載之核酸。
[1I] 一種多核苷酸，其係包含由 (a)編碼包含抗原呈現MHC分子，且可將該抗原呈現MHC分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(A)之序列； (b)編碼包含至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(B)之序列； (c)編碼包含T細胞共刺激分子，且可將該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(C)之序列； (d)編碼包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(D)之序列；及 (e)編碼包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元及T細胞共刺激分子，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素與該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(E)之序列 所成之群所選出之至少1個序列。 [2I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含抗原呈現MHC分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。 [3I]如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。 [4I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含抗原呈現MHC分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。 [5I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及四跨膜蛋白之部分序列，且該四跨膜蛋白之部分序列係至少具有2個膜貫通結構域，該至少1個T細胞刺激性細胞激素係配置於該2個膜貫通結構域之間。 [6I]如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及MFG-E8或其結構域。 [7I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含： 自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 [8I]如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、β2 微球蛋白、第II型MHCα鏈，或第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 [9I]如[8I]所記載之多核苷酸，其係進一步包含β2 微球蛋白、第I型MHCα鏈、第II型MHCβ鏈，或第II型MHCα鏈之胺基酸序列。 [10I]如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (B-1)自N末端側起包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)可存在之間隔子序列、 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，以及 (B-5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列。 [11I]如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，及 (B-5)MFG-E8 構成之胺基酸序列。 [12I]如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈第I型MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 [13I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 [14I] 如[13I]所記載之多核苷酸，其係進一步包含(A-6)第II型MHCα鏈之胺基酸序列。 [15I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述T細胞刺激性細胞激素為IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-12之次單元或TGF-β。 [16I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(C)所規定之融合蛋白質係包含 T細胞共刺激分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。 [17I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(C)所規定之融合蛋白質係包含 T細胞共刺激分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。 [18I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(C)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (C-1)T細胞共刺激分子、 (C-2)可存在之間隔子序列，及 (C-3)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
[19I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(D)所規定之融合蛋白質係包含 前述抗原呈現MHC分子，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可局部存在於細胞外囊泡之膜中之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域。 [20I] 如[19I]所記載之多核苷酸，其中，前述可局部存在於細胞外囊泡之膜中之膜蛋白質或可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質為四跨膜蛋白或MFG-E8。 [21I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(D)所規定之融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽。 [22I] 如[1I]所記載之多核苷酸，其中，前述(D)所規定之融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)MHC分子限制性抗原胜肽。 [23I] 如[21I]或[22I]所記載之多核苷酸，其中，前述包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (2)可存在之間隔子序列、 (3)前述至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (4)可存在之間隔子序列，以及 (5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列。 [24I] 如[21I]或[22I]所記載之多核苷酸前述前述包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (2)可存在之間隔子序列，及 (3)MFG-E8。 [25I] 如[21I]或[22I]所記載之多核苷酸，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第I型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子係包含第I型MHCα鏈之細胞外領域。 [26I] 如[21I]或[22I]所記載之多核苷酸，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第II型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子係包含第II型MHCα鏈之細胞外結構域及/或第II型MHCβ鏈之細胞外結構域。
[1J] 如[1I]所記載之多肽，其中，包含前述(a)所規定之序列及前述(b)所規定之序列。 [2J] 如[1J]所記載之多核苷酸，其係進一步包含前述(c)所規定之序列。 [3J] 如[1I]所記載之多肽，其係包含前述(d)所規定之序列。 [4J] 如[3J]所記載之多肽，其係進一步包含前述(c)所規定之序列。 [5J] 如[1I]所記載之多肽，其係包含前述(e)所規定之序列。 [6J]一種載體，其係包含[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸。
[1K] 一種醫藥組成物，其係包含[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體，及藥理學上可容許之擔體。
[1L] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防癌之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體。 [2L] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防自體免疫疾病之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體；此處，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3L] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防過敏性疾患之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體；此處，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4L] 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防感染症之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體，及藥理學上可容許之擔體；此處，前述抗原胜肽較佳係源自引起感染症之感染病原體。
[1M] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體，其係用於癌之處置或預防之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2M] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體，其係用於自體免疫疾病之處置或預防之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3M] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體，其係用於過敏性疾患之處置或預防之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4M] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體，其係用於感染症之處置或預防之用途；此處，前述抗原胜肽較佳係源自引起前述感染症之感染病原體。
[1N] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體之用途，其係用於處置或預防癌之醫藥之製造中；此處，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2N] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體之用途，其係用於處置或預防自體免疫疾病之醫藥之製造中；此處，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3N] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體之用途，其係用於處置或預防過敏性疾患之醫藥之製造中；此處，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4N] 如[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體之用途，其係用於處置或預防感染症之醫藥之製造中；此處，前述抗原胜肽較佳係源自引起前述感染症之感染病原體。
[1O] 一種於對象中處置或預防癌之方法，其係藉由將有效量之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體投予至對象，使對象內識別癌抗原之T細胞活性化及/或增殖，並使該活性化及/或增殖後之T細胞攻擊癌細胞，來處置或預防癌之方法；此處，前述該活性化及/或增殖後之T細胞較佳為CD8陽性之細胞毒殺性T細胞，前述抗原胜肽較佳係包含癌抗原胜肽。 [2O] 一種於對象中處置或預防自體免疫疾病之方法，其係藉由將有效量之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體投予至對象，使對象內之識別自體抗原之T細胞活性化及/或增殖，而於對象內進行對於前述自體抗原之免疫反應之減敏作用，來處置或預防自體免疫疾病之方法；此處，前述該活性化及/或增殖後之T細胞較佳係CD4陽性之控制性T細胞(Treg)，前述抗原胜肽較佳係包含自體抗原胜肽。 [3O] 一種於對象中處置或預防過敏性疾患之方法，其中，藉由將有效量之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體投予至對象，使對象內之識別過敏原之T細胞活性化及/或增殖，而於對象內進行對於前述自體抗原之免疫反應之減敏作用，來處置或預防自體免疫疾病之方法；此處，前述該活性化及/或增殖後之T細胞較佳係CD4陽性之控制性T細胞(Treg)，前述抗原胜肽較佳係包含過敏原。 [4O] 一種處置或預防感染症之方法，其係於對象中處置或預防感染症之方法，其中包含藉由將有效量之[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體投予至對象， 1)使發炎性細胞激素分泌，並使對象之自然免疫活性化，及/或 2)使前述對象具有對於引起前述感染症之感染病原體之獲得免疫，並排除在體內之引起前述感染症之感染病原體之步驟，及/或抑制其之增殖之步驟。
[1P] 一種使相對於特異性的抗原之T細胞活性化及/或增殖之方法，其中，包含使[1I]～[5J]中之任1項所記載之多核苷酸或[6J]所記載之載體以in vitro或ex vivo導入細胞中，生成抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡，並使所生成之抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡與T細胞於in vitro或ex vivo中接觸之步驟。 [發明之效果]
依據本發明，係藉由使用用於製作於膜中包含MHC分子及T細胞刺激性細胞激素之細胞(抗原呈現細胞)及細胞外囊泡(抗原呈現細胞外囊泡)之多核苷酸，而可使抗原特異性T細胞充分地活性化等。
定義 細胞外囊泡
本說明書中所使用之所謂「細胞外囊泡」，若為由細胞分泌出之小胞，則未受到特別限定，然而，例如可舉出Exosomes(胞外體)、Microvesicles(MV；微囊泡)、Apoptotic Bodies(凋亡小體)等。
本說明書中所使用之所謂「胞外體」，係意指源自胞吞途徑(endocytosis pathway)之約20～約500nm (較佳為約20～約200nm、更佳為約25～約150nm、再更佳為約30～約100nm)之小胞。作為胞外體之構成成分，例如，可舉出蛋白質、核酸(mRNA、miRNA、非編碼RNA (non-coding RNA))等。胞外體係可具有掌管細胞間通訊之機能。作為胞外體之標記分子，例如，可舉出Alix、Tsg101、四跨膜蛋白、flotillin、磷脂絲胺酸等。
本說明書中所使用之所謂「微囊泡」，係意指源自於細胞質膜，約50～約1000nm之小胞。作為微囊泡之構成成分，例如，可舉出蛋白質、核酸(mRNA、miRNA、非編碼RNA等)等。微囊泡係可具有掌管細胞間通訊之機能等。作為微囊泡之標記分子，例如，可舉出整聯蛋白、選滯蛋白、CD40、CD154等。
本說明書中所使用之所謂「凋亡小體」，係意指源自於細胞質膜，約500～約2000nm之小胞。作為凋亡小體之構成成分，例如，可舉出經碎片化之核、胞器(organelle)等。凋亡小體係可具有誘導吞噬作用(Phagocytosis)之機能等。作為凋亡小體之標記分子，例如，可舉出Annexin V、磷脂絲胺酸等。
本說明書中所使用之所謂「抗原呈現細胞外囊泡」，係意指於該膜外呈現抗原之細胞外囊泡。
主要組織相容基因複合體分子
本說明書中所使用之「主要組織相容基因複合體(Major Histocompatibility Complex，以下亦稱為「MHC」。)分子」，若為包含抗原結合間隙，且可與呈現於T細胞、T細胞前軀體等之抗原結合者，並未受到特別限定。作為MHC分子，例如，可舉出第I型MHC分子、第II型MHC分子等。MHC分子可源自任意的動物種類。例如，人類中可舉出人類白血球型抗原(HLA)，小鼠中可舉出H2類。
相當於第I型MHC分子之HLA，係被分類為例如，HLA-A、HLA-B、HLA-Cw、HLA-F、HLA-G等的亞型。針對此等亞型，已知有多型(等位基因)。作為HLA-A之多型，例如，可舉出HLA-A1、HLA-A0201、HLA-A24等，作為HLA-B之多型，例如，可舉出HLA-B7、HLA-B40、HLA-B4403等，作為HLA-Cw之多型，例如，可舉出HLA-Cw0301、HLA-Cw0401、HLA-Cw0602等。
相當於第II型MHC分子之HLA，係被分類為例如，HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等的亞型。
本說明書中所記載之MHC分子在可發揮其機能之範圍內，亦可為與其野生型之胺基酸序列(例如，第I型MHC分子之情況：例如，序列編號：9等的第I型MHCα鏈、序列編號：7等的β2 微球蛋白、序列編號：65等的單鏈第I型MHC分子等；第II型MHC分子之情況：例如，序列編號：71等的第II型MHCα鏈、序列編號：37等的第II型MHCβ鏈、單鏈第II型MHC分子等)之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之MHC分子在可發揮其機能之範圍內，亦可為對於其野生型之胺基酸序列刪除(Deletion)、插入(insertion)、附加及/或取代1個或複數個之胺基酸等之MHC分子。
本說明書中所使用之所謂「抗原呈現MHC分子」，若為呈現抗原之MHC分子則未受到特別限定，例如，可舉出抗原呈現第I型MHC分子、抗原呈現第II型MHC分子等。作為「抗原呈現第I型MHC分子」，例如，可舉出抗原與第I型MHCα鏈或其細胞外結構域與β2 微球蛋白之複合體；抗原與單鏈第I型MHC分子之複合體；抗原及單鏈第I型MHC分子所結合之融合蛋白質；抗原，與第I型MHCα鏈之細胞外結構域與其他蛋白質或其結構域或者其片段等之融合蛋白質(例如，第I型MHCα鏈之細胞外結構域與抗體之Fc部分之融合蛋白質；第I型MHCα鏈之細胞外結構域與其他膜蛋白質之膜貫通結構域之融合蛋白質等)之複合體；等。作為「抗原呈現第II型MHC分子」，例如，可舉出抗原與第II型MHCα鏈或其細胞外結構域與第II型MHCβ鏈或其細胞外結構域之複合體；抗原與單鏈第II型MHC分子之複合體；抗原及第II型MHCβ鏈所結合之融合蛋白質，與第II型MHCα鏈之複合體；抗原，與第II型MHCα鏈之細胞外結構域與其他蛋白質或其結構域或者其片段等之融合蛋白質(例如，第II型MHCα鏈之細胞外結構域與抗體之Fc部分之融合蛋白質；第II型MHCα鏈之細胞外結構域與其他膜蛋白質之膜貫通結構域之融合蛋白質等)，與第II型MHCβ鏈之細胞外結構域與其他蛋白質或其結構域或者其片段等之融合蛋白質(例如，第II型MHCβ鏈之細胞外結構域與抗體之Fc部分之融合蛋白質；第II型MHCβ鏈之細胞外結構域與包含其他膜蛋白質之膜貫通結構域之胺基酸序列之融合蛋白質等)之複合體等。
本說明書中所使用之所謂「單鏈MHC分子」、「單鏈第I型MHC分子」或「單鏈第II型MHC分子」，係意指MHC分子(或第I型MHC分子或者第II型MHC分子)之α鏈或者其細胞外結構域，與β鏈或者其細胞外結構域或β2 微球蛋白，依據需要透過間隔子序列等連結後之融合蛋白質。作為「單鏈第I型MHC分子」，例如，可舉出第I型MHCα鏈與β2 微球蛋白依據需要透過間隔子序列連結後之融合蛋白質等。作為「單鏈第II型MHC分子」，例如，可舉出第II型MHCα鏈與第II型MHCβ鏈依據需要透過間隔子序列連結後之融合蛋白質等。
本說明書中所使用之所謂「包含抗原呈現MHC分子之可於膜外呈現該抗原(或者抗原胜肽)之蛋白質(或者融合蛋白質、蛋白質複合體等)」，係意指至少包含抗原呈現MHC分子，且藉由於膜外呈現抗原(或者抗原胜肽)，而可於T細胞等呈現抗原之蛋白質(或者融合蛋白質、蛋白質複合體等)。「包含抗原呈現MHC分子之可於膜外呈現抗原(或者抗原胜肽)之蛋白質(或者融合蛋白質、蛋白質複合體等)」亦可為以使其於細胞外囊泡之膜表現之方式，使用質體等，以融合蛋白質、蛋白質複合體等的形態表現者。或者，「包含抗原呈現MHC分子之可於膜外呈現抗原(或者抗原胜肽)之蛋白質(或者融合蛋白質、蛋白質複合體等)」係使用可溶性之抗原呈現MHC分子(雖非受到此等所限定者，然而例如，專利文獻1中所記載之包含第I型MHCα鏈及免疫球蛋白重鏈之融合蛋白質等；日本特開2007-161719號公報中所記載之可溶性之第I型MHC分子等)之情況中，亦可為將可溶性之抗原呈現MHC分子及細胞外囊泡依據需要透過脂質連結子、胜肽連結子等，使其結合於細胞外囊泡之膜者(例如，亦可參考日本特開2018-104341號公報等記載之方法)。或者，亦可為將於可溶性之抗原呈現MHC分子之N末端側或C末端側附加有所期望之標籤(例如，His標籤(His-Tag)、FLAG標籤(FLAG-Tag)、PNE標籤(PNE-Tag)(序列編號：79：NYHLENEVARLKKL)等)者(該標籤係例如，亦可與其他的構成要素共同作為融合蛋白質表現，亦可依據需要透過連結子等使其結合於另外準備之可溶性之抗原呈現MHC分子)，與包含相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等之蛋白質(例如，依據需要透過連結子等結合於細胞外囊泡之膜上之，相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等自身；於可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或其膜貫通結構域之N末端側或C末端側結合有針對該標籤之奈米抗體之融合蛋白質等)之細胞外囊泡，以所期望之條件混合後者(例如，亦可參考Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064等記載之使用PNE標籤與相對於該標籤之抗體等之方法)。
抗原
本說明書中所使用之所謂「抗原」，若為可具有抗原性者則未受到特別限制，係不僅包含胜肽抗原，亦包含磷脂質、複合式碳水化合物等的非胜肽抗原(例如，黴菌酸、脂阿拉伯甘露糖等的細菌性膜構成要素等)。
本說明書中所使用之「抗原胜肽」若為可成為抗原之胜肽則未受到特別限制，可為源自天然者，亦可為源自合成者，亦可為市售者。抗原胜肽雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出WT-1、α-胎兒蛋白、MAGE-1、MAGE-3、胎盤鹼性磷酸酶Sialyl-Lewis X、CA-125、CA-19、TAG-72、上皮糖蛋白質2、5T4、α胎兒蛋白受體、M2A、酪胺酸酶、Ras、p53、Her-2/neu、EGF-R、雌激素受體、黃體素受體、myc、BCR-ABL、HPV型16、黑色素轉鐵蛋白、MUC1、CD10、CD19、CD20、CD37、CD45R、IL-2受體α鏈、T細胞受體、前列腺酸性磷酸酶、GP100、MelanA/Mart-1、gp75/棕色、BAGE、S-100、細胞角蛋白、CYFRA21-1、Ep-CAM等的腫瘤關聯抗原胜肽；胰島素、麩胺酸脫羧酶、ICA512/IA-2蛋白質酪胺酸磷酸酶、ICA12、ICA69、前胰島素原、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、GM1-2、玻璃黏連蛋白、β晶體蛋白、鈣網伴護蛋白、血清轉鐵蛋白、角蛋白、丙酮酸羧化酶、C1、絨毛蛋白2、核體、核糖核蛋白質、髓磷脂寡突膠質細胞糖蛋白質、髓磷脂關聯糖蛋白質、髓磷脂/寡突膠質細胞鹼性蛋白質、寡突膠質細胞特異性蛋白質、髓磷脂鹼性蛋白質、蛋白脂脫輔基蛋白質等的自體抗原胜肽；原生動物(例如，瘧原蟲、利什曼種、錐蟲種)、細菌(例如，革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陰性細菌、厭氧性菌)、真菌(例如，麴菌、芽生菌、念珠菌、球黴菌、隱球菌、組織胞漿菌、副球黴菌、孢子絲菌)、病毒(例如，腺病毒、單純皰疹病毒、乳頭狀瘤病毒、呼吸道融合病毒、痘病毒、HIV、流行性感冒病毒、SARS-CoV或SARS-CoV2那樣的冠狀病毒)、細胞內寄生體(例如，披衣菌科、黴漿菌科、無膽黴漿菌科、立克次體科)、源自蠕蟲(例如，線蟲、吸蟲、絛蟲)等的感染病原體之抗原胜肽；普利昂蛋白等的其他的抗原胜肽等。 抗原胜肽亦可包含引起過敏症狀之過敏原。作為過敏原，除了源自上述原生動物、細菌、真菌、細胞內寄生體及蠕蟲之胜肽以外，係可例示出源自外來性的胜肽，例如，室內粉塵、蟎、動物(例如貓、狗等的伴生動物)，及源自花粉(例如，杉木或日本扁柏)之胜肽等。更詳細而言，係例示出Cryj1等的杉木花粉所包含之蛋白質。或者，引起過敏症狀之過敏原，可為源自食物者。作為引起對於食物之過敏症狀之過敏原，係例示出源自雞蛋、牛乳、小麥、蕎麥、螃蟹、蝦子及落花生之胜肽等。
本說明書中所使用之所謂「MHC分子限制性抗原胜肽」，係意指可於in vitro、in vivo及/或ex vivo等結合於MHC分子之抗原胜肽。「MHC分子限制性抗原胜肽」之胺基酸殘基數通常為約7～約30。作為「MHC分子限制性抗原胜肽」，可舉出例如，第I型MHC分子限制性抗原胜肽、第II型MHC分子限制性抗原胜肽等。
本說明書中所使用之所謂「第I型MHC分子限制性抗原胜肽」，係意指可於in vitro、in vivo及/或ex vivo等結合於第I型MHC分子之抗原胜肽。第I型MHC分子限制性抗原胜肽若被呈現於細胞外囊泡之膜外，則例如，該抗原胜肽係受到前軀體T細胞等之識別，而可誘導細胞毒殺型T細胞等。「第I型MHC分子限制性抗原胜肽」之胺基酸殘基數通常為約7～約30，較佳為約7～約25，更佳為約7～約20，再更佳為約7～約15，又再更佳為約7～約12。
本說明書中所使用之所謂「第II型MHC分子限制性抗原胜肽」，係意指於in vitro、in vivo及/或ex vivo等，可結合於第II型MHC分子之抗原胜肽。第II型MHC分子限制性抗原胜肽若被呈現於細胞外囊泡之膜外，則例如，該抗原胜肽係受到前軀體T細胞等之識別，而可誘導輔助T細胞等。「第II型MHC分子限制性抗原胜肽」之胺基酸殘基數通常為約7～約30，較佳為約10～約25，更佳為約12～約24。
作為「MHC分子限制性抗原胜肽」、「第I型MHC分子限制性抗原胜肽」，或「第II型MHC分子限制性抗原胜肽」，若為可結合於MHC分子、第I型MHC分子或第II型MHC分子之抗原胜肽，則並未受到特別限制。
T細胞刺激性細胞激素
本說明書中所使用之所謂「T細胞刺激性細胞激素」，若為可透過於T細胞之膜上表現之受體等來刺激T細胞(例如，活性化、抑制等)之細胞激素，則並未受到特別限定。作為T細胞刺激性細胞激素，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TGF-β、IFN-α、IFN-γ等。此等之中，可形成相同或者不同的次單元之多聚物者(例如，IL-12、TGF-β等)在具有機能的前提下(亦即，在可具有所期望之藥理活性之範圍內)，依據情況亦可為透過胜肽連結子等連結之連續之胺基酸序列者。
本說明書中所記載之T細胞刺激性細胞激素可源自任意的動物種類。例如，可舉出源自小鼠、大鼠等的齧齒類；兔子等的兔形目；豬、牛、山羊、馬、羊等的有蹄類；狗、貓等的食肉目；人類、新世界猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等的靈長類等的哺乳動物等的動物者。本說明書中所記載之T細胞刺激性細胞激素較佳為源自齧齒類或哺乳類動物者，更佳為源自小鼠或人類者。
本說明書中所記載之T細胞刺激性細胞激素在可發揮其機能之範圍內，亦可為與其野生型之胺基酸序列(例如，IL-2之情況中，例如序列編號：25等；IL-4之情況中，例如序列編號：53等)之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之T細胞刺激性細胞激素在可發揮其機能之範圍內，亦可於其野生型之胺基酸序列將1個或複數個之胺基酸進行刪除、插入、附加及/或取代等。
本說明書中所使用之所謂「包含(第1、第2)T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該(第1、第2)T細胞刺激性細胞激素之蛋白質」，係意指至少包含T細胞刺激性細胞激素，且可於細胞外囊泡之膜外呈現該T細胞刺激性細胞激素之蛋白質。「包含(第1、第2)T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該(第1、第2)T細胞刺激性細胞激素之蛋白質」亦可為以使其於細胞外囊泡之膜表現之方式，使用質體等，作為包含T細胞刺激性細胞激素及包含膜蛋白質或其膜貫通結構域之片段等之融合蛋白質使其表現者。或者，「包含(第1、第2)T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該(第1、第2)T細胞刺激性細胞激素之蛋白質」係使用可溶性之T細胞刺激性細胞激素(雖非受到此等所限定者，然而例如，T細胞刺激性細胞激素本身；T細胞刺激性細胞激素與抗體之Fc部分之融合蛋白質；T細胞刺激性細胞激素，與識別該T細胞刺激性細胞激素之抗體，或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等之複合體等)之情況中，亦可為將可溶性之T細胞刺激性細胞激素及細胞外囊泡依據需要透過脂質連結子、胜肽連結子等，結合於細胞外囊泡之膜者(例如，亦可參考日本特開2018-104341號公報等記載之方法)。或者，與可溶性之T細胞刺激性細胞激素之N末端側或C末端側附加有所期望之標籤者(例如，His標籤、FLAG標籤、PNE標籤)(該標籤係例如，可與其他的構成要素共同作為融合蛋白質表現，亦可依據需要透過連結子等使其結合於另外準備之可溶性之T細胞刺激性細胞激素)，與包含相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等之蛋白質(例如，依據需要透過連結子等結合於細胞外囊泡之膜上之，相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等自身；於可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或其膜貫通結構域之N末端側或C末端側結合有針對該標籤之奈米抗體之融合蛋白質等)之細胞外囊泡以所期望之條件混合者亦可(例如，亦可參考Raj D, et al., Gut., 2019 Jun; 68(6): 1052-1064等記載之使用PNE標籤與相對於該標籤之抗體等之方法)。此外，在以次單元之多聚物形成之T細胞刺激性細胞激素之情況中，其次單元中之一個若為可呈現於細胞外囊泡之膜外之蛋白質，則剩下之次單元不必要為可呈現於膜外之態樣。其次單元中之一個若為可呈現於細胞外囊泡之膜外之蛋白質，則藉由添加其他的次單元或使其共表現，機能性T細胞刺激性細胞激素可構築於細胞外囊泡之膜外。
T細胞共刺激分子
本說明書中所使用之所謂「T細胞共刺激分子」，係意指藉由與CD28、CD134等存在於T細胞之膜上之分子進行相互作用，而有助於T細胞之活性化等之分子。作為T細胞共刺激分子，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出CD80、CD86等的分子，或此等之細胞外結構域或者其機能性片段；抗CD28抗體、抗CD134抗體等的抗體，或此等之抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等；此等與其他蛋白質之膜貫通結構域或者抗體之Fc部分等之融合蛋白質(或者複合體、締合體(association))等。
本說明書中所記載之T細胞共刺激分子可源自任意的動物種類。例如，可舉出源自小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等的齧齒類；兔子等的兔形目；豬、牛、山羊、馬、羊等的有蹄類；狗、貓等的食肉目；人類、新世界猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等的靈長類等的哺乳動物等的動物者。本說明書中所記載之T細胞共刺激分子較佳為源自齧齒類或哺乳類動物者，更佳為源自小鼠或人類者。
本說明書中所記載之T細胞共刺激分子在可發揮上述機能之範圍內，亦可為與其野生型之胺基酸序列(例如，CD80之情況中，例如序列編號：67等)之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之T細胞共刺激分子在可發揮其機能之範圍內，亦可於其野生型之胺基酸序列將1個或複數個之胺基酸進行刪除、插入、附加及/或取代等。
本說明書中所使用之所謂「包含T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質」，係意指至少包含T細胞共刺激分子，且可與存在於T細胞之膜上之分子相互作用之蛋白質。亦即，意指至少T細胞共刺激分子中存在之可與T細胞相互作用之部分係位於細胞外囊泡之膜外。「包含T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質」亦可為以使其於細胞外囊泡之膜表現之方式，使用質體等使其表現者。或者，在「包含T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質」係使用可溶性之T細胞共刺激分子(雖非受到此等所限定者，然而例如，CD80之細胞外結構域與抗體之Fc部分之融合蛋白質；抗CD28抗體，或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等)之情況中，亦可為將可溶性之T細胞共刺激分子及細胞外囊泡依據需要透過脂質連結子、間隔子序列等結合於細胞外囊泡之膜者(例如，亦可參考日本特開2018-104341號公報等記載之方法)。或者，將於可溶性之T細胞共刺激分子之N末端側或C末端側附加有所期望之標籤者(例如，His標籤、FLAG標籤、PNE標籤)(該標籤係例如，可與其他的構成要素共同作為融合蛋白質表現，亦可依據需要透過連結子等使其結合至另外準備之可溶性之T細胞共刺激分子)，與包含相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等之蛋白質(例如，依據需要透過連結子等結合於細胞外囊泡之膜上之，相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等自身；於可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或其膜貫通結構域之N末端側或C末端側結合有針對該標籤之奈米抗體之融合蛋白質等)之細胞外囊泡以所期望之條件混合者亦可(例如，亦可參考Raj D, et al., Gut., 2019 Jun;68(6):1052-1064等記載之使用PNE標籤與相對於該標籤之抗體等之方法)。
作為本說明書中所使用之「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」，在可於細胞外囊泡之膜上表現之範圍內，可選擇任意的膜蛋白質或其膜貫通結構域。「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或其膜貫通結構域」較佳係已知可表現於細胞外囊泡(例如，胞外體等)之膜蛋白質(例如，四跨膜蛋白、CD58、ICAM-1、PTGFRN(例如，參照非專利文獻1、國際公開第2019/183578號等)等)，或此等之膜貫通結構域等。
作為本說明書中所使用之「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」，在可結合於細胞外囊泡之膜之範圍內，可選擇任意的蛋白質或其結構域。「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」較佳係已知可結合於細胞外囊泡(例如，胞外體等)之膜者(例如，MFG-E8，或其結構域(例如，Alain Delcayre, et al., Blood Cells, Molecules, and Diseases 35 (2005) 158–168記載之MFG-E8之C1、C2結構域))等。
本說明書中所記載之「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」可源自任意的動物種類。例如，可舉出源自小鼠、大鼠等的齧齒類；兔子等的兔形目；豬、牛、山羊、馬、羊等的有蹄類；狗、貓等的食肉目；人類、新世界猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等的靈長類等的哺乳動物等的動物者。本說明書中所記載之「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」較佳為源自齧齒類或哺乳類動物者，更佳為源自小鼠或人類者。
根據非專利文獻2，哺乳動物之細胞外囊泡之標記可藉由以下的方式進行分類。 作為可作為細胞外囊泡之標記蛋白質使用之膜蛋白質或GPI錨定蛋白質，可舉出 1)組織非特異性者 四跨膜蛋白(CD63，CD9，CD81，CD82)，其他的複數膜貫通型之膜蛋白質(CD47或異3聚體G蛋白質(GNA：Guanine nucleotide-binding proteins)等) 第I型MHC(HLA-A/B/C，H2-K/D/Q)， 整聯蛋白(ITGA/ITGB)、轉鐵蛋白受體(TFR2)； LAMP1/2； 硫酸肝素蛋白多醣(包含多配體聚糖(SDC))； 胞外基質金屬蛋白酶誘導物質(EMMPRIN)(亦稱為BSG或CD147)； ADAM10； 屬於GPI錨定型之5’核苷酸酶之CD73(NT5E)， 屬於GPI錨定型之補體結合蛋白質之CD55及CD59； 音速刺蝟蛋白質(SHH) 2)細胞/組織特異性者 數個四跨膜蛋白：TSPAN8(上皮細胞特異性)、CD37及CD53(白血球特異性)； PECAM1(內皮細胞特異性)； ERBB2(乳癌特異性)； EPCAM(上皮性特異性)； CD90(THY1)(間葉系幹細胞特異性)； CD45(PTPRC)(免疫細胞特異性)、CD41(ITGA2B)或CD42a(GP9)(血小板特異性)； 血型糖蛋白A(GYPA)(紅血球特異性)； CD14(單核球特異性)，第II型MHC(HLA-DR/DP/DQ，H2-A)； CD3(T細胞特異性)； 乙醯膽鹼酶/AChE-S(神經細胞特異性)、AChE-E(紅血球特異性)； 類澱粉蛋白βA4/APP(神經細胞特異性)； 等。 因此，雖不限定於此等，然而屬於細胞外囊泡之標記之蛋白質亦可作為本發明中之「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質」使用。
本說明書中所使用之所謂「四跨膜蛋白」，係意指屬於四跨膜蛋白家族之蛋白質(雖非受到此等所限定者，然而例如，CD9、CD53、CD63、CD81、CD82、CD151等)。四跨膜蛋白由於通常自N末端側起具有膜貫通結構域1(以下，亦稱為「TM1」。)、小型細胞外環狀結構(以下，亦稱為「SEL」。)、膜貫通結構域2(以下，亦稱為「TM2」。)、小型細胞內環狀結構(以下，亦稱為「SIL」。)、膜貫通結構域3(以下，亦稱為「TM3」。)、大型細胞外環狀結構(以下，亦稱為「LEL」。)，及膜貫通結構域4(以下，亦稱為「TM4」。)，故為4次膜貫通型，且N末端側及C末端側之兩者係存在於細胞質側。例如，四跨膜蛋白為小鼠CD63(胺基酸序列1～238：序列編號：27)之情況中，通常在胺基酸序列之約1～約110中，包含TM1、SEL、TM2、SIL及TM3，胺基酸序列之約111～約200中，包含LEL，胺基酸序列之約201～約238中，可包含TM4。
本說明書中所記載之「四跨膜蛋白」中之各結構域(例如，TM1、SEL、SIL、LTL等)可為源自同一四跨膜蛋白者，亦可全部或一部分源自不同的四跨膜蛋白。
本說明書中所記載之四跨膜蛋白在可於細胞外囊泡之膜上表現之範圍內，亦可為與其野生型之胺基酸序列(例如，全長之CD9之情況中，例如序列編號：21等；全長之CD63之情況中，例如序列編號：27等；全長之CD81之情況中，例如序列編號：15等)之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之四跨膜蛋白在可於細胞外囊泡之膜上表現之範圍內，亦可於其野生型之胺基酸序列將1個或複數個之胺基酸進行刪除、插入、附加及/或取代等。
本說明書中所記載之四跨膜蛋白之部分序列(例如，各結構域；包含TM1、SEL、TM2、SIL及TM3之部分序列(例如，CD63之情況中，序列編號：57等；CD81之情況中，序列編號：61等)；包含TM4之部分序列(例如，CD63之情況中，序列編號：59等；CD81之情況中，序列編號：63等))亦可為與其野生型之胺基酸序列之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之四跨膜蛋白之部分序列亦可於其野生型之胺基酸序列將1個或複數個之胺基酸進行刪除、插入、附加及/或取代等。
本說明書中所記載之MFG-E8在可結合於細胞外囊泡之膜之範圍內，亦可為與其野生型之胺基酸序列(例如，序列編號：49等)之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之MFG-E8在可結合於細胞外囊泡之膜之範圍內，亦可於其野生型之胺基酸序列將1個或複數個之胺基酸進行刪除、插入、附加及/或取代等。
本說明書中所記載之CD58、PTGFRN等在可於細胞外囊泡之膜上表現之範圍內，或可結合於細胞外囊泡之膜之範圍內，亦可為與其野生型之胺基酸序列之胺基酸序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。或者，本說明書中所記載之CD58、PTGFRN等在可於細胞外囊泡之膜上表現之範圍內，或可結合於細胞外囊泡之膜之範圍內，亦可於其野生型之胺基酸序列將1個或複數個之胺基酸進行刪除、插入、附加及/或取代等。
間隔子序列
本說明書中所使用之所謂「間隔子序列」，係意指存在於2個以上之蛋白質或其部分序列或者結構域等之間之至少具有1個胺基酸殘基之任意的序列。間隔子序列係例如，可於連結2個以上之蛋白質或其部分序列或者結構域等時使用。間隔子序列係包含胜肽連結子。作為間隔子序列之胺基酸殘基之長度，通常為1～約50，較佳為約2～約28，更佳為約4～約25。作為間隔子序列，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出(GGGXS)n Gm (式中，X係每次出現皆獨立為A或G，n為1～8，m為0～3)(例如，序列編號：5、11、29、39等)；(GGGS)n Gm (式中，n為1～10，m為0～3)；Ta Sb (GGX)n Gm (式中，X係每次出現皆獨立為S或T，n為1～8，m為0～3，a為0或1，b為0或1) (例如，序列編號：77等)；等。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡
本發明之一實施態樣中，係提供一種細胞外囊泡，其係於膜外呈現抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素(圖2J(1)係例示出其模型)。 所述細胞外囊泡可藉由於膜中包含以下之(A)及(B)所界定之蛋白質，而將抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素呈現於膜外，亦可藉由於膜中包含(D)所界定之蛋白質，而於膜外呈現抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素。 或者，亦可隨後使抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素附著於分離後之細胞外囊泡之膜表面。使其附著之方法係無特別限定，然而亦可藉由將磷脂質各自結合於抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素，並將新脂質部分併入細胞外囊泡之膜中，使抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素附著於膜表面。細胞外囊泡中磷脂絲胺酸係存在於表面。因此，於與磷脂絲胺酸結合之MFG-E8上，各自合成精製欲使其呈現之抗原呈現MHC分子或T細胞刺激性細胞激素融合之蛋白質，並藉由將該融合蛋白質與細胞外囊泡混合，可製作於膜表面呈現抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素之細胞外囊泡。此外，於預先表現胜肽抗原決定部位(PNE)奈米抗體之細胞外囊泡中，後續添加附加PNEtag之抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素，使其呈現於細胞外囊泡之膜表面亦可。於表現鏈親和素之細胞外囊泡中添加生物素化後之抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素，使其呈現於細胞外囊泡之膜表面亦可。
本發明之一實施態樣中，亦可為將複數種類(2、3、4、5種)之抗原呈現MHC分子及複數種類(2、3、4、5種)之T細胞刺激性細胞激素(為了識別各個T細胞刺激性細胞激素，以下，亦稱為第一T細胞刺激性細胞激素、第二T細胞刺激性細胞激素、其以上T細胞刺激性細胞激素等)呈現於膜外之細胞外囊泡。或者亦可為將1種類之抗原呈現MHC分子與複數種類之細胞刺激性細胞激素呈現於膜外之細胞外囊泡(圖2J(3)係例示出將1種類之抗原呈現MHC分子與2種類之T細胞刺激性細胞激素呈現於膜外之細胞外囊泡之模型)。
本發明之一實施態樣中，係提供一種抗原呈現細胞外囊泡，其中，其膜係包含以下成分： (A)包含抗原呈現MHC分子之可於膜外呈現該抗原之蛋白質；及 (B)包含第1T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質。
構成要件(A) 上述(A)之「包含抗原呈現MHC分子之可於膜外呈現該抗原之蛋白質」若為可將抗原呈現於細胞外囊泡之膜外之蛋白質，則除了抗原呈現MHC分子以外，亦可包含其他蛋白質或其結構域等。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為可於膜外呈現該抗原之融合蛋白質或蛋白質複合體，其係包含：抗原呈現MHC分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為可於膜外呈現該抗原之融合蛋白質或蛋白質複合體，其係包含：抗原呈現MHC分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列，或 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、β2 微球蛋白、第II型MHCα鏈，或第II型MHCβ鏈 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其中包含β2 微球蛋白、第I型MHCα鏈、第II型MHCβ鏈，或第II型MHCα鏈之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，自N末端側起，包含由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈第I型MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。 此外，本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈第II型MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)β2 微球蛋白、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含第I型MHCα鏈之胺基酸序列。 此外，本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含β2 微球蛋白之胺基酸序列。 此外，本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含第II型MHCα鏈之胺基酸序列。 此外，本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第II型MHCα鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含第II型MHCβ鏈之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(A-3)為「單鏈第I型MHC分子」之情況中，「單鏈第I型MHC分子」係自N末端側起，由β2 微球蛋白(例如，序列編號：7等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)、可存在之間隔子序列(存在之情況中，係例如為序列編號：5、11、29、39、77等)，及第I型MHCα鏈(例如，序列編號：9等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)構成。本發明之一實施態樣中，上述(A-3)為「單鏈第I型MHC分子」之情況中，「單鏈第I型MHC分子」為序列編號：65，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。
本發明之一實施態樣中，上述(A-3)為「單鏈第II型MHC分子」之情況中，「單鏈第II型MHC分子」係自N末端側起，由第II型MHCβ鏈、可存在之間隔子序列，及第II型MHCα鏈構成。
本發明之一實施態樣中，上述(A-3)及/或(A-6)為「β2 微球蛋白」之情況中，「β2 微球蛋白」為序列編號：7，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。
本發明之一實施態樣中，上述(A-3)及/或(A-6)為「第I型MHCα鏈」之情況中，「第I型MHCα鏈」為序列編號：9，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。
本發明之一實施態樣中，上述(A-3)及/或(A-6)為「第II型MHCβ鏈」之情況中，「第II型MHCβ鏈」為序列編號：37，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。
本發明之一實施態樣中，上述(A-3)及/或(A-6)為「第II型MHCα鏈」之情況中，「第II型MHCα鏈」為序列編號：71，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。
在上述各實施態樣中之(A-2)及(A-4)之「可存在之間隔子序列」存在之情況中，係可獨立地選擇。(A-2)存在之情況中，係例如可為序列編號：5、11、29、39、77等的間隔子序列。(A-4)存在之情況中，係例如可為序列編號：5、11、29、39、77等的間隔子序列。
本發明之一實施態樣中，上述各實施態樣中之(A-5)之四跨膜蛋白係選自由CD9、CD63及CD81所構成之群。本發明之一實施態樣中，上述各實施態樣中之(A-5)之四跨膜蛋白為CD81(較佳為序列編號：15等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，自N末端側起為由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(A)為 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈。
構成要件(B) 上述(B)之「包含第1T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質」若為可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質，則除了第1T細胞刺激性細胞激素以外，亦可包含其他蛋白質或者其結構域等。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其中包含：第1T細胞刺激性細胞激素，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為 (B)融合蛋白質，其係包含第1T細胞刺激性細胞激素及四跨膜蛋白之部分序列之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其中，該四跨膜蛋白之部分序列係至少具有2個膜貫通結構域，且該第1T細胞刺激性細胞激素係配置於該2個膜貫通結構域之間，或 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含：第1T細胞刺激性細胞激素，及MFG-E8或其結構域。
本說明書中所使用之所謂「四跨膜蛋白之部分序列係至少具有2個膜貫通結構域，且該第1T細胞刺激性細胞激素係配置於該2個膜貫通結構域之間」，係例如可舉出在四跨膜蛋白之部分序列至少包含四跨膜蛋白之TM1及TM2，且該第1T細胞刺激性細胞激素配置於TM1與TM2之間之情況，四跨膜蛋白之部分序列至少包含四跨膜蛋白之TM3及TM4，且該第1T細胞刺激性細胞激素係配置於TM3與TM4之間之情況等。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-1)自N末端側起、包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)可存在之間隔子序列、 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，以及 (B-5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列，或 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，及 (B-5)MFG-E8 構成之胺基酸序列。
如同國際公開第2016/139354號中所揭示之內容，係報導四跨膜蛋白係即使其大型細胞外環狀結構(LEL)之全體或部分以相異之胺基酸序列取代，仍可於膜上表現。因此，(B-3)之第1T細胞刺激性細胞激素亦可透過可存在之間隔子序列取代四跨膜蛋白之LEL並插入，亦可插入四跨膜蛋白之LEL中或其部分序列中之任意的位置中。
(B-1)之「包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列」通常係不包含四跨膜蛋白之膜貫通結構域4。(B-1)之「包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列」亦可包含大型細胞外環狀結構或其部分序列。(B-1)中之膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之各結構域可各自為源自其他四跨膜蛋白之序列，亦可全部為來自相同四跨膜蛋白之序列。(B-1)中之膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之各結構域較佳係全部為來自相同四跨膜蛋白之序列。
本發明之一實施態樣中，(B-1)中之包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列全部皆為源自CD9、源自CD63或源自CD81之部分序列。本發明之一實施態樣中，(B-1)之包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列全部皆為源自CD63或CD81之部分序列(較佳為序列編號：57或序列編號：61等，或者與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
(B-5)之「包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列」通常係不包含四跨膜蛋白之膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3。(B-5)之「包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列」亦可包含大型細胞外環狀結構或其部分序列。(B-5)中之膜貫通結構域4，可源自與(B-1)不同之四跨膜蛋白之序列，亦可源自與(B-1)相同之四跨膜蛋白序列。(B-5)中之膜貫通結構域4，較佳係與(B-1)源自同樣四跨膜蛋白之序列。本發明之一實施態樣中，(B-5)中之包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列係源自CD9、源自CD63或源自CD81之部分序列。本發明之一實施態樣中，(B-5)之包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列係源自CD63或CD81之部分序列(較佳為序列編號：59或序列編號：63等，或者與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
本發明之一實施態樣中，(B-1)之「包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列」為源自CD63之部分序列(較佳為序列編號：57等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)，且(B-5)之「包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列」為源自CD63之部分序列(較佳為序列編號：59等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。本發明之一實施態樣中，(B-1)之「包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列」為源自CD81之部分序列(較佳為序列編號：61等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)，且(B-5)之「包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列」為源自CD81之部分序列(較佳為序列編號：63等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
上述(B)之融合蛋白質為包含四跨膜蛋白之部分序列之融合蛋白質，且上述(A)及後述之依情況存在之(C)之中的1個以上包含包含四跨膜蛋白之胺基酸序列之融合蛋白質之情況，上述(B)之融合蛋白質係可與上述(A)及/或後述之依情況存在之(C)之融合蛋白質為分別之融合蛋白質，亦可構成上述(A)及/或後述之依情況存在之(C)之融合蛋白質之一部份。所謂上述(B)之融合蛋白質「構成上述(A)及/或後述之依情況存在之(C)之融合蛋白質之一部份」係例如，可舉出(A-5)之四跨膜蛋白構成(B)之融合蛋白質之情況，及/或後述之依情況存在之(C-3)之四跨膜蛋白構成(B)之融合蛋白質之情況等。
上述(B-5)之「MFG-E8」較佳為序列編號：49等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者。
本發明之一實施態樣中，上述各實施態樣之(B-3)中之第1T細胞刺激性細胞激素為IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β。本發明之一實施態樣中，上述各實施態樣之(B-3)中之第1T細胞刺激性細胞激素為IL-2(較佳為序列編號：25，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)、IL-4(較佳為序列編號：53，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)，或TGF-β(較佳為序列編號：73，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
在上述各實施態樣之(B-2)及(B-4)之「可存在之間隔子序列」存在之情況中，係可獨立地選擇。(B-2)存在之情況中，係例如可為序列編號：5、11、29、39、77等的間隔子序列。(B-4)存在之情況中，係例如可為序列編號：5、11、29、39、77等的間隔子序列。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-1)序列編號：57(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：25(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，以及 (B-5)序列編號：59(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為序列編號：31(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-1)序列編號：61(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：53(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-4之第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，以及 (B-5)序列編號：63(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為序列編號：55(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-3)序列編號：73(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)屬於TGF-β之第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：49(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之MFG-E8 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(B)為序列編號：75(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。
第2(或其以上)T細胞刺激性細胞激素 本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡除了第1T細胞刺激性細胞激素以外，亦可進一步包含第2(或其以上)T細胞刺激性細胞激素。因此，本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡係進一步包含第2T細胞刺激性細胞激素。尤其，可呈現抗原之MHC分子為可抗原呈現之第II型MHC分子之情況中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡較佳係包含第2T細胞刺激細胞激素。
第2(或其以上)T細胞刺激性細胞激素，例如，亦可被插入上述(B)中(例如，亦可於(B-3)之「第1T細胞刺激性細胞激素」之N末端側及/或C末端側，依據需要透過間隔子序列等，連結第2(或其以上)T細胞刺激性細胞激素)。或者，第2(或其以上)T細胞刺激性細胞激素亦可藉由具有與本說明書中所記載之構成要件(B)同樣的構成，而作為與本說明書中所記載之構成要件(B)之蛋白質(或融合蛋白質)不同之蛋白質(或融合蛋白質)，與第1T細胞刺激性細胞激素同樣地包含於本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之膜中。
本發明之一實施態樣中，第2T細胞刺激性細胞激素為IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β。本發明之一實施態樣中，第2T細胞刺激性細胞激素為TGF-β(較佳為序列編號：73，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
本發明之一實施態樣中，第1T細胞刺激性細胞激素為IL-2或IL-4(較佳為序列編號：25或序列編號：53，或者與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)，且第2T細胞刺激性細胞激素為TGF-β(較佳為序列編號：73，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)可於膜外呈現該抗原之融合蛋白質或蛋白質複合體，其係包含：抗原呈現MHC分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域；及 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含第1T細胞刺激性細胞激素，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)可於膜外呈現該抗原之融合蛋白質或蛋白質複合體，其係包含：抗原呈現MHC分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域；及 (B)融合蛋白質，其係包含第1T細胞刺激性細胞激素及四跨膜蛋白之部分序列之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其中，該四跨膜蛋白之部分序列係至少具有2個膜貫通結構域，且該第1T細胞刺激性細胞激素係配置於該2個膜貫通結構域之間，或 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含：第1T細胞刺激性細胞激素，及MFG-E8或其結構域。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列，或 (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、β2 微球蛋白、第II型MHCα鏈，或第II型MHCβ鏈 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含β2 微球蛋白、第I型MHCα鏈、第II型MHCβ鏈，或第II型MHCα鏈之胺基酸序列 ；以及 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-1)自N末端側起包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)可存在之間隔子序列、 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，以及 (B-5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列，或 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，及 (B-5)MFG-E8 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈第I型MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中，包含 包含自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)蛋白質，其係包含第II型MHCα鏈之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，係提供一種第1T細胞刺激性細胞激素為IL-2、IL-4、IL-6、IL-12或TGF-β之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。
本發明之一實施態樣為本說明書中所記載之細胞外囊泡，其係進一步將T細胞共刺激分子呈現於其膜外(圖2J(2)係例示出其模型)。 所述細胞外囊泡亦可藉由於膜中包含以下之(C)所界定之蛋白質，使T細胞共刺激分子呈現於膜外。 或者，亦在後續於分離後之細胞外囊泡上，使T細胞共刺激分子附著於其膜表面。使其附著之方法係無特別限定，然而亦可藉由使各個磷脂質結合於T細胞共刺激分子，並將新脂質部分併入細胞外囊泡之膜中，使抗原呈現MHC分子及T細胞刺激性細胞激素附著於膜表面。 本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (C)包含T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質。
構成要件(C) 上述(C)之「包含T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質」若為該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質，則除了T細胞共刺激分子以外，亦可包含其他蛋白質或其結構域等。
本發明之一實施態樣中，上述(C)係包含T細胞共刺激分子，及，可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，上述(C)係包含T細胞共刺激分子，及，四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，上述(C)為 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (C-1)T細胞共刺激分子、 (C-2)可存在之間隔子序列，及 (C-3)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，(C-1)之T細胞共刺激分子為CD80或CD86。本發明之一實施態樣中，(C-1)中之T細胞共刺激分子較佳為CD80(較佳為序列編號：67等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
上述(C-2)之「可存在之間隔子序列」存在之情況中，係例如可為序列編號：5、11、29、39、77等的間隔子序列。
本發明之一實施態樣中，(C-3)之四跨膜蛋白係選自由CD9、CD63及CD81所構成之群。本發明之一實施態樣中，(C-3)中之四跨膜蛋白為CD9(較佳為序列編號：21等，或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)。
本發明之一實施態樣中，上述(C)為 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (C-1)序列編號：67(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：21(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，上述(C)為序列編號：69(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列；以及 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (B-1)序列編號：57(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：25(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：59(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列；以及 (B)序列編號：31(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，自N末端側起為由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列； (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-1)序列編號：57(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：25(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：59(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列；以及 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (C-1)序列編號：67(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：21(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，自N末端側起為由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列； (B)序列編號：31(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質；以及 (C)序列編號：69(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其係由：自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈 所構成； (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-1)序列編號：57(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：25(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：59(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列；以及 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (C-1)序列編號：67(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：21(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其係由 自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈 構成之蛋白質複合體； (B)序列編號：31(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質；及 (C)序列編號：69(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其中， 自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈 構成； (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-1)序列編號：57(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：25(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：59(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列； (B’)可於膜外呈現該第2T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-3)序列編號：73(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於TGF-β之第2T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：49(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之MFG-E8 構成之胺基酸序列；以及 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (C-1)序列編號：67(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：21(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其係由 自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈 所構成； (B)序列編號：31(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質； (B’)序列編號：75(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第2T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質；以及 (C)序列編號：69(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其係由 自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈 所構成； (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (B-1)序列編號：61(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：53(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-4之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：63(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列；以及 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係自N末端側起為由 (C-1)序列編號：67(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：21(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，其中該膜係包含以下成分： (A)蛋白質複合體，其係可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體，其係由 自N末端側起為由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之胺基酸序列之融合蛋白質，及 (A-6)序列編號：71(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCα鏈 所構成； (B)序列編號：55(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質；及 (C)序列編號：69(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，關於上述(A)、(B)及(C)，其中(A)與(B)融合成為1分子亦可，(B)與(C)融合成為1分子亦可，(A)、(B)及(C)融合成為1分子亦可。所述融合分子係可以(A)、(B)及(C)之間包含或不包含間隔子序列之形式轉譯為1個蛋白質分子，(A)、(B)及(C)之蛋白質藉由化學性地交聯(例如半胱胺酸殘基間之二硫鍵)來融合成為1個分子亦可。 或者，上述(A)、(B)及(C)亦可藉由共有該蛋白質用於局部存在於細胞外囊泡之要素，亦即，藉由共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」之部分，進行機能地融合亦可。 例如本發明之一實施態樣中，亦可包含融合蛋白質(D)，其中 (A)與(B)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，且包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)至少1種T細胞刺激性細胞激素；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 亦可包含融合蛋白質(F)，其中 (A)與(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，且包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)T細胞共刺激分子；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 亦可包含融合蛋白質(G)，其中 (B)與(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)至少1種T細胞刺激性細胞激素； (2)T細胞共刺激分子；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 或者 亦可包含融合蛋白質(E)，其中 (A)～(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)至少1種T細胞刺激性細胞激素； (3)T細胞共刺激分子；及 (4)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」。
本發明之一實施態樣中，亦可使用構成要件(B)之「包含第1T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質」取代構成要件(A)之「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質」，而為包含具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)之抗原呈現細胞外囊泡細胞。
所述具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)亦可為 (D)包含抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。 前述融合蛋白質亦可包含前述抗原呈現MHC分子，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素，及可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域。
具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)中，前述可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質亦可為四跨膜蛋白或MFG-E8。 前述融合蛋白質亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (D-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列、 (D-5)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素之融合胜肽。 前述融合蛋白質亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (D-1)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素之融合胜肽 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)MHC分子限制性抗原胜肽。 此處，前述融合胜肽亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (1)包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (2)可存在之間隔子序列、 (3)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素、 (4)可存在之間隔子序列，以及 (5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列。 前述融合胜肽亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (1)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素、 (2)可存在之間隔子序列，及 (3)MFG-E8。
本發明之一實施態樣中，MHC分子限制性抗原胜肽為第I型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子亦可包含第I型MHCα鏈之細胞外領域，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第II型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子亦可包含第II型MHCα鏈之細胞外結構域及/或第II型MHCβ鏈之細胞外結構域。
在包含具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)之態樣中； 亦可進一步於該膜中包含(C)包含至少1種T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質； 前述可與T細胞相互作用之蛋白質亦可包含前述至少1種T細胞共刺激分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域； 前述可與T細胞相互作用之蛋白質亦可包含前述至少1種T細胞共刺激分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。
本發明之一實施態樣中，細胞外囊泡為胞外體。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡亦可於其膜內或膜中包含或結合可能對於治療上有益之物質(例如，低分子化合物、核酸等)。使該物質封入細胞外囊泡之膜內之方法雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出將該物質與本說明書中所記載之細胞外囊泡於適宜的溶媒中混合之方法等。 本發明之一實施態樣中，抗原呈現細胞外囊泡亦可包含任意的蛋白製劑。作為蛋白製劑係無特別限定，然而可為紅血球生成素等的自然中亦存在之蛋白質，亦可為如同免疫球蛋白-CTLA4融合蛋白那樣自然中不存在之合成蛋白質，亦可為單株抗體或其活性碎片。此等之蛋白製劑，亦可局部存在抗原呈現細胞外囊泡之表面，作為可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者與該膜結合結構域之融合蛋白質。所述抗原呈現細胞外囊泡係可藉由將用於表現融合蛋白質之載體轉染至產生抗原呈現細胞外囊泡之細胞中來製作。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之各融合蛋白質或蛋白質複合體或者蛋白製劑亦可包含1個或複數個可檢測之標識。例如，融合蛋白質或蛋白質複合體或者蛋白製劑亦可藉由以往的方法藉由特定的報導(reporter)分子、螢光團、放射性材料，或酵素(例如，過氧化酶、磷酸酶)等被標識。此等係例如，亦可作為融合蛋白質或蛋白質複合體或者蛋白製劑之構成要素連結於該融合蛋白質或蛋白質複合體或者蛋白製劑之N末端側或C末端側。
多核苷酸
本發明之一實施態樣中，係提供編碼本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之(A)及(B)，以及依據情況存在之(C)中之各融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸。本發明之一實施態樣中，係提供編碼本說明書中所定義之(A)～(G)中之各融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸。
本發明之一實施態樣，係提供一種多核苷酸序列，其係包含由 (a)編碼包含抗原呈現MHC分子，且可將該抗原呈現MHC分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(A)之序列； (b)編碼包含至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(B)之序列； (c)編碼包含T細胞共刺激分子，且可將該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(C)之序列； (d)編碼包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素提示於膜外之融合蛋白質(D)之序列；及 (e)編碼包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元及T細胞共刺激分子，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素與該T細胞共刺激分子提示於膜外之融合蛋白質(E)之序列； 所成之群所選出之至少1個序列。 上述序列(a)～(e)係包含本案說明書中所具體記載之序列及相同性高之序列(較佳為90%以上、更佳為95%以上、再更佳為99%以上之相同性)，然而並未特別限定。若為具有同等機能者，則可為同種同源物(藉由基因重複而產生之基因序列)或異種同源物(不同生物中所存在之具有相同機能之基因群)，經序列資訊之改變(添加(addition)、刪除(deletion)、取代(substitution)等)之序列亦包含在內。
本說明書中所使用之「多核苷酸」係意指單股或雙股DNA分子或RNA分子等。多核苷酸係包含基因體DNA、cDNA、hnRNA、mRNA等，及此等之所有天然地存在或人工化修飾後之衍生物等。多核苷酸可為鏈狀亦可為環狀。
編碼上述(A)～(G)中之各融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸，係本發明技術領域中具有通常知識者參考上述融合蛋白質或蛋白質複合體之胺基酸序列可適宜地決定者。此外，(A)～(G)中之各融合蛋白質或蛋白質複合體之胺基酸序列係可參考各融合蛋白質或蛋白質複合體中之各構成要素(例如，若為(A)之情況，(A-1)～(A-5)，及依據情況之(A-6))之胺基酸序列適宜地決定。決定多核苷酸時所使用之密碼子之種類係可任意選擇。例如，亦可考慮使用包含該多核苷酸之載體使其轉形之細胞之密碼子之頻率等來決定多核苷酸。
上述(A)～(G)中編碼各融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸之N末端側，亦可依據需要附加編碼訊息胜肽(訊息序列)之多核苷酸。
訊息胜肽之胺基酸序列係可使用任意者，例如，亦可考慮欲使其表現之融合蛋白質之胺基酸序列等來決定。作為編碼訊息胜肽之多核苷酸，例如，可舉出編碼β2 微球蛋白之訊息胜肽(例如，序列編號：1)之多核苷酸(例如，序列編號：2)、編碼第I型MHCα鏈之訊息胜肽之多核苷酸、編碼第II型MHCα鏈之訊息胜肽之多核苷酸、編碼第II型MHCβ鏈之訊息胜肽(例如，序列編號：33)之多核苷酸(例如，序列編號：34)等。
上述(A)～(G)中之各融合蛋白質或蛋白質複合體之各構成要素(例如，若為(A)之情況，(A-1)～(A-5)，及存在之情況下之(A-6))，及訊息胜肽等之胺基酸序列，以及編碼此等之多核苷酸之情報，例如，亦可檢索習知的文獻或NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等的資料庫後適宜地取得。此外，四跨膜蛋白之部分序列(例如，(C-1)、(C-5)中之部分序列)中之胺基酸序列及編碼其之多核苷酸，亦可參考國際公開第2016/139354號。
本發明之一實施態樣中，係一種多核苷酸，其係編碼下列之任一者之多核苷酸： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其中，包含自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列，或者， (A)融合蛋白質，其係構成可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體之融合蛋白質，其中包含 自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、β2 微球蛋白、第II型MHCα鏈，或第II型MHCβ鏈 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列； (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-1)自N末端側起包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)可存在之間隔子序列、 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，以及 (B-5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列，或者 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係包含自N末端側起由 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，及 (B-5)MFG-E8 構成之胺基酸序列；或 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，包含自N末端側起由 (C-1)T細胞共刺激分子、 (C-2)可存在之間隔子序列，及 (C-3)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，係提供編碼下述任一蛋白質之多核苷酸： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列，或者 (A)融合蛋白質，其係構成可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體之融合蛋白質， 其係自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之胺基酸序列； (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (B-1)序列編號：57(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：25(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：59(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列、 (B)可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (B-1)序列編號：61(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：29之間隔子序列、 (B-3)序列編號：53(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-4之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：63(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列，或者 (B’)可於膜外呈現該第2(或第1)T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (B-3)序列編號：73(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於TGF-β之第2T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：29之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：49(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之MFG-E8 構成之胺基酸序列；或 (C)T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (C-1)序列編號：67(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：21(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
本發明之一實施態樣中，係提供一種多核苷酸，其係編碼下列任一之蛋白質： (A)融合蛋白質，其係可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質，其係自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：5之間隔子序列、 (A-3)序列編號：65(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列，或者 (A)融合蛋白質，其係構成可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體之融合蛋白質， 其係自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)序列編號：39之間隔子序列、 (A-3)序列編號：37(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：15(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之胺基酸序列； (B)序列編號：31、75或者55(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之可於膜外呈現該第1(或第2)T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質；或 (C)序列編號：23(或與其胺基酸序列之一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質。
本發明之一實施態樣中，係提供下述之多核苷酸： (A)編碼可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (A-1)編碼第I型MHC分子限制性抗原胜肽之多核苷酸、 (A-2)序列編號：6之間隔子序列、 (A-3)序列編號：66(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：16(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之序列，或者 (A)編碼構成可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (A-1)編碼第II型MHC分子限制性抗原胜肽之多核苷酸、 (A-2)序列編號：40之間隔子序列、 (A-3)序列編號：38(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：16(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白、 構成之序列； (B)編碼可於膜外呈現第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (B-1)序列編號：58(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：30之間隔子序列、 (B-3)序列編號：26(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-2之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：30之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：60(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列 構成之序列、 (B)編碼可於膜外呈現第1T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (B-1)序列編號：62(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)序列編號：30之間隔子序列、 (B-3)序列編號：54(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於IL-4之第1T細胞刺激性細胞激素 (B-4)序列編號：30之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：64(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白之部分序列； 構成之序列，或者 (B’)編碼可於膜外呈現第2(或第1)T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (B-3)序列編號：74(或與其序列一致性80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於TGF-β之第2(或第1)T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)序列編號：30之間隔子序列，及 (B-5)序列編號：50(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之MFG-E8 構成之序列；或 (C)編碼該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (C-1)序列編號：68(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之屬於CD80之T細胞共刺激分子，及 (C-3)序列編號：22(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之序列。
本發明之一實施態樣中，係提供下述之多核苷酸： (A)編碼可於膜外呈現抗原胜肽之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (A-1)編碼第I型MHC分子限制性抗原胜肽之多核苷酸、 (A-2)序列編號：6之間隔子序列、 (A-3)序列編號：66(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之單鏈第I型MHC分子，及 (A-5)序列編號：16(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之序列，或者 (A)編碼構成可於膜外呈現抗原胜肽之蛋白質複合體之融合蛋白質之多核苷酸，其係由 (A-1)編碼第II型MHC分子限制性抗原胜肽之多核苷酸、 (A-2)序列編號：40之間隔子序列、 (A-3)序列編號：38(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之第II型MHCβ鏈，及 (A-5)序列編號：16(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之四跨膜蛋白 構成之序列； (B)序列編號：32、76或者56(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之編碼可於膜外呈現該第1(或第2)T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸；或 (C)序列編號：24(或與其序列一致性為80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，再更佳為98%以上，又再更佳為99%以上者)之編碼該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之融合蛋白質之多核苷酸。
作為本發明之一實施態樣，係提供一種多核苷酸，其中， 前述(D)所規定之融合蛋白質係包含前述抗原呈現MHC分子，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可局部存在於細胞外囊泡之膜中之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域。 前述可局部存在於細胞外囊泡之膜中之膜蛋白質或可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質可為四跨膜蛋白或MFG-E8。
作為本發明之一實施態樣，係一種多核苷酸，其中， 前述(D)所規定之融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽(此處各構成要素(D-1)～(D-5)係包含本說明書所記載之態樣)； 或者 提供一種多核苷酸，其中， 前述(D)所規定之融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)MHC分子限制性抗原胜肽 (此處各構成要素(D-1)～(D-5)係包含本說明書所記載之態樣)。 此態樣中，前述包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽亦可包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (2)可存在之間隔子序列、 (3)前述至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (4)可存在之間隔子序列，以及 (5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列； 或者 前述前述包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽亦可包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (2)可存在之間隔子序列，及 (3)MFG-E8。 此處，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第I型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子亦可包含第I型MHCα鏈之細胞外領域；前述MHC分子限制性抗原胜肽為第II型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子亦可包含第II型MHCα鏈之細胞外結構域及/或第II型MHCβ鏈之細胞外結構域。
本發明之一實施態樣中，係提供一種多核苷酸，其中，包含前述(a)所規定之序列及前述(b)所規定之序列。 亦可進一步包含前述(c)所規定之序列。
本發明之一實施態樣中，係提供一種多核苷酸，其係包含前述(d)所規定之序列。 作為所述序列，係例示出編碼序列編號：135之胺基酸序列之序列編號：136之核酸序列。 所述態樣中，亦可包含前述(c)所規定之序列。
本發明之一實施態樣中，係提供一種多核苷酸，其係包含前述(e)所規定之序列。
本發明之一實施態樣中，關於上述(A)、(B)及(C)，其中(A)與(B)融合，而為編碼成為1分子之融合蛋白質之多核苷酸亦可，(B)與(C)融合，而為編碼成為1分子之融合蛋白質之多核苷酸亦可，(A)、(B)及(C)融合，而為編碼成為1分子之融合蛋白質之多核苷酸亦可。所述多核苷酸亦可編碼(A)、(B)及(C)之間包含或不包含間隔子序列之形式之1個融合蛋白質。 或者，本發明之一實施態樣中之多核苷酸亦可編碼上述(A)、(B)及(C)藉由共有該蛋白質為用於局部存在於細胞外囊泡之要素，亦即，共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」之部分而機能性地融合之融合蛋白質。 例如本發明之一實施態樣中， 亦可包含編碼融合蛋白質(D)之多核苷酸，其中 (A)與(B)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)至少1種T細胞刺激性細胞激素；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 亦可包含編碼融合蛋白質(F)之多核苷酸，其中 (A)與(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)T細胞共刺激分子；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 亦可包含編碼融合蛋白質(G)之多核苷酸，其中 (B)與(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)至少1種T細胞刺激性細胞激素； (2)T細胞共刺激分子；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 或者 亦可包含編碼融合蛋白質(E)之多核苷酸，其中 (A)～(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)至少1種T細胞刺激性細胞激素； (2)T細胞共刺激分子；及 (4)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」。
本發明之一實施態樣亦可為編碼下述融合蛋白質之多核苷酸，該融合蛋白質係使用構成要件(B)之包含第1T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質取代構成要件(A)之可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質，且具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)，且其係包含抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。
所述具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)亦可為包含抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。 前述融合蛋白質亦可包含前述抗原呈現MHC分子，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素，及可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域。
具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)中，前述可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質亦可為四跨膜蛋白或MFG-E8。 前述融合蛋白質亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (D-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列、 (D-5)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素之融合胜肽。 前述融合蛋白質亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (D-1)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素之融合胜肽 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)MHC分子限制性抗原胜肽。 此處，前述融合胜肽亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (1)包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (2)可存在之間隔子序列、 (3)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素、 (4)可存在之間隔子序列，以及 (5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列。 前述融合胜肽亦可自N末端側起依序包含編碼下列蛋白質之胺基酸序列： (1)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素、 (2)可存在之間隔子序列，及 (3)MFG-E8。
本發明之一實施態樣中，MHC分子限制性抗原胜肽為第I型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子亦可包含第I型MHCα鏈之細胞外領域，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第II型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子亦可包含第II型MHCα鏈之細胞外結構域及/或第II型MHCβ鏈之細胞外結構域。
在包含具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質(D)之態樣中； 亦可進一步於該膜中包含(C)包含至少1種T細胞共刺激分子，且該T細胞共刺激分子與T細胞可相互作用之蛋白質； 前述可與T細胞相互作用之蛋白質亦可包含前述至少1種T細胞共刺激分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域； 前述可與T細胞相互作用之蛋白質亦可包含前述至少1種T細胞共刺激分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。
載體、套組
本發明之一實施態樣中，係提供一種載體，其係包含由本說明書中所記載之多核苷酸所選出之至少1種多核苷酸而成。
本說明書中所使用之所謂「載體」，係意指任意的載體(雖非受到此等所限定者，然而例如，包含質體載體、黏質體載體、噬菌體等的噬菌體載體、腺病毒載體、棒狀病毒載體等的病毒載體、人工染色體載體等)。載體係包含表現載體、選殖載體等。表現載體中，亦可包含一般而言所期望之編碼序列，及於宿主生物(例如，植物、昆蟲、動物等)或體外之發現系統中以可作動的方式連結之編碼序列之表現所必要之適當的多核苷酸。選殖載體亦可使用於操作所期望之多核苷酸碎片及/或使其增幅。選殖載體亦可刪除所期望之多核苷酸碎片之表現所必要之機能性序列。
本發明之一實施態樣中，本說明書中所記載之多核苷酸在此等可以可作動的方式插入之範圍內，可全部插入同一個載體內，亦可將2個以上之多核苷酸插入個別之載體中。本發明之一實施態樣中，係提供將包含由本說明書中所記載之多核苷酸所選出之至少1種多核苷酸而成之2種以上之載體組合而成之套組。
轉形細胞
本發明之一實施態樣，係提供一種經轉形之細胞，其係藉由包含以下： (i)編碼如本說明書中所記載之(A)之融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸、 (ii)編碼本說明書中所記載之(B)之融合蛋白質之多核苷酸，或 (iii)編碼本說明書中所記載之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之載體進行轉形。
本發明之一實施態樣，係提供一種經轉形之細胞，其係藉由包含以下： (i)編碼本說明書中所記載之(A)之融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸，及 (ii)編碼本說明書中所記載之(B)之融合蛋白質之多核苷酸，以及，依據情況包含之 (iii)編碼本說明書中所記載之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之單一載體或2種以上載體之組合進行轉形。
本發明之一實施態樣之細胞中，針對上述(A)、(B)及(C)，亦可以下述載體進行轉形：包含編碼(A)與(B)融合成為1分子之融合蛋白質之多核苷酸之載體、包含編碼(B)與(C)融合成為1分子之融合蛋白質之多核苷酸之載體，或者包含編碼(A)、(B)及(C)融合成為1分子之融合蛋白質之多核苷酸之載體。所述多核苷酸亦可編碼(A)、(B)及(C)之間包含或不包含間隔子序列之形式之1個融合蛋白質。 或者，亦可編碼上述(A)、(B)及(C)藉由共有該蛋白質用於局部存在於細胞外囊泡之要素，亦即，「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」之部分而機能地融合之融合蛋白質。 例如本發明之一實施態樣中，亦可以以下載體進行轉形： 包含編碼融合蛋白質(D)之多核苷酸之載體，其中 (A)與(B)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)至少1種T細胞刺激性細胞激素；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 包含編碼融合蛋白質(F)之多核苷酸之載體，其中 (A)與(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)T細胞共刺激分子；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 包含編碼融合蛋白質(G)之多核苷酸之載體，其中 (B)與(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)至少1種T細胞刺激性細胞激素； (2)T細胞共刺激分子；及 (3)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」； 或者 包含編碼融合蛋白質(E)之多核苷酸之載體，其中 (A)～(C)以共有「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」部分的形式融合，其中包含 (1)抗原呈現MHC分子； (2)至少1種T細胞刺激性細胞激素； (3)T細胞共刺激分子；及 (4)「可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者其膜貫通結構域」或「可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域」。
或者，本發明之一實施態樣，係提供一種經轉形之細胞，其係藉由包含編碼下述之融合蛋白質之多核苷酸之載體進行轉形： (iv)使用構成要件(B)之包含第1T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該第1T細胞刺激性細胞激素之蛋白質取代構成要件(A)之可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質，且具備構成要件(A)及構成要件(B)之機能之融合蛋白質， 且其係包含本說明書中所記載之(D)之抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質。
所謂「藉由單一載體或2種以上載體之組合進行轉形」，係意指例如，細胞係可藉由上述(i)～(iv)之多核苷酸全部插入同一個載體內者進行轉形，亦可藉由此等中之2個以上插入個別之載體後之2種以上載體之組合進行轉形。
作為「單一載體或2種以上載體之組合」，在(A)為融合蛋白質之情況中，例如，可舉出下列內容： ・包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體； ・包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸、編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體； ・包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合；或 ・包含編碼(A)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合。
或者，作為「單一載體或2種以上載體之組合」，在(A)為蛋白質複合體之情況中，例如，可舉出下列內容： ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸、編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸、編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸、編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸、編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸、編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸、編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸、編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合； ・包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸，及編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合；或 ・包含編碼包含由(A-1)～(A-5)所構成之胺基酸序列之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼包含(A-6)之蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(B)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體，與包含編碼(C)之融合蛋白質之多核苷酸而成之載體之組合。
被轉形之細胞若為在被轉形後可獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡者，則未受到特別限制，可為初代培養細胞，亦可為繼代細胞，亦可為已建立之細胞，此等可為正常細胞，亦可為包含癌化或腫瘤化細胞之病變細胞。此外，被轉形之細胞之由來並未受到特別限定，然而例如，可舉出源自小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等的齧齒類、兔子等的兔形目、豬、牛、山羊、馬、羊等的有蹄類、狗、貓等的食肉目、人類、新世界猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等的靈長類等的哺乳動物等的動物之細胞；源自植物之細胞；源自昆蟲之細胞等。作為被轉形之細胞，較佳為源自動物之細胞。作為源自動物之細胞，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出人類胚腎臓細胞(包含HEK293T細胞等)、人類FL細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、COS-7、Vero、小鼠L細胞、大鼠GH3等。
使細胞轉形之方法，若為可於細胞中導入目的之多核苷酸之方法則未受到特別限定。例如，亦可為電穿孔法、顯微注射法、磷酸鈣法、陽離子性脂質法、使用微脂體之方法、使用聚乙烯亞胺等的非微脂體性之物質之方法、病毒感染法等。
被轉形之細胞可為暫時性地表現(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)及/或(G)之融合蛋白質或蛋白質複合體之轉形細胞，亦可為安定地表現其之轉形細胞(安定細胞株)。
被轉形之細胞之培養條件並未受到特別限定。例如，被轉形之細胞為源自動物之細胞之情況，例如，細胞培養等一般被使用之培養基(例如，RPMI1640培養基、Eagle之MEM培養基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(DMEM培養基)、Ham F12培養基，或此等之任意的組合等)，或使用在其中添加胎牛血清、抗生物質、胺基酸等的其他的成分後之培養基等，例如，亦可在約1～約10%(較佳為約2～約5%)CO2 之存在下，以約30～約40℃(較佳為約37℃)以所期望之時間(例如，約0.5小時～約240小時(較佳為約5～約120小時、更佳為約12～約72小時))進行培養(例如，靜置下或振盪下)。
培養被轉形之細胞所獲得之培養上清液中，係可包含本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。為此，以獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡為目的培養轉形細胞時，依據需要，亦可使用去除胞外體等的細胞外囊泡之培養基(例如，去除胞外體後之包含約1～約5%胎牛血清之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基等)。
培養上清液
本發明之一實施態樣中，係提供一種培養本說明書中所記載之被轉形之細胞所獲得之培養上清液。
本說明書中所記載之培養上清液中所包含之抗原呈現細胞外囊泡係可藉由例如，該培養上清液進行精製(例如，離心分離、層析等)、濃縮、分離等來進行回收。
本發明之一實施態樣中，係提供一種由本說明書中所記載之培養上清液所獲得之抗原呈現細胞外囊泡。
用於製造本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之方法
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡雖非受到此等所限定者，然而亦可例如，藉由本發明技術領域中具有通常知識者所習知之基因重組技術等的手段(例如，藉由以下記載之方法，或者藉由實施例記載之方法，或藉由類似於此等之方法)來獲得。 可藉由通常之基因重組技術獲得各自編碼上述(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之蛋白質之多核苷酸，並將此等以可作動的方式插入同一或個別之載體。將各自編碼(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之蛋白質之多核苷酸中之2種以上插入同一載體中之情況，其各自亦可以可作動的方式連結與同一或別個之啟動子連結。所獲得之單一或2個以上之載體同時或依序地轉形至細胞中，可獲得轉形細胞(可為暫時性地表現此等融合蛋白質之轉形細胞，亦可為安定地表現之轉形細胞(安定株))。可將所獲得之轉形細胞於所期望之條件下培養，獲得培養上清液，並將所獲得之培養上清液依據需要藉由精製(例如，使用離心分離、抗體(例如，識別細胞外囊泡之膜中所包含之蛋白質等之抗體)、層析、流式細胞儀等之精製)、濃縮(例如，限外濾過等)、乾燥等，藉此獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。
或者，作為上述(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之蛋白質，使用可溶性者之情況中，例如，亦可藉由以下之方法獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。 上述(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)作為可溶性之蛋白質，係可使用藉由通常之基因重組技術所獲得者，或市售者。接著，由所期望之細胞，例如，藉由習知之方法或者藉由本說明書中所記載之方法，或藉由類似於此等之方法，獲得細胞外囊泡。接著，將所獲得之細胞外囊泡與上述可溶性之蛋白質之1種以上，於所期望之溶媒中，以所期望之條件下使其反應(例如，亦可參考日本特開2018-104341號公報等記載之方法)。一邊在使細胞外囊泡之膜中包含(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之可溶性之蛋白質為止進行實施，一邊適宜地變更條件，藉此可獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。
或者，作為上述(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之蛋白質，使用可溶性者之情況中，例如，亦可藉由以下之方法獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。 藉由通常之基因重組技術來獲得於上述(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之可溶性之蛋白質之N末端側或C末端側附加有所期望之標籤(例如，可舉出His標籤、FLAG標籤、序列編號：79之PNE標籤等，此等可全部都為相同標籤，亦可全部皆為不同種類之標籤)者。接著，由所期望之細胞，例如，藉由習知之方法或者藉由本說明書中所記載之方法，或藉由類似於此等之方法，獲得細胞外囊泡，於其上使相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體、例如，序列編號：83之抗PNE標籤奈米抗體)等，依據需要透過胜肽連結子等使其結合；或者，藉由通常之基因重組技術，獲得編碼可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或於該膜貫通結構域之N末端側或C末端側融合有相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等之融合蛋白質(例如，序列編號：89之抗PNE標籤奈米抗體(序列編號：83)及CD8a(序列編號：85)及CD81(序列編號：15)之融合蛋白質等)之多核苷酸(例如，序列編號：88、90等)，使用將其以可作用的方式插入載體者，藉由轉形至細胞中之步驟，獲得轉形細胞(可為暫時性地表現融合蛋白質之轉形細胞，亦可為安定地表現其之轉形細胞(安定株))，並培養所獲得之轉形細胞等，藉由上述方法等回收細胞外囊泡。亦可將附加有標籤之可溶性之(A)及(B)，以及依據情況之(C)之蛋白質，與於膜中包含包含相對於該標籤之抗體或其抗原結合性片段(例如，scFv、Fab或者奈米抗體)等之蛋白質之細胞外囊泡，藉由所期望之條件進行混合，獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。
或者，亦可組合編碼上述(A)～(G)之融合蛋白質之多核苷酸使用並進行轉形，並由所獲得之轉形細胞或獲得說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。
或者，亦可藉由組合上述方法中之2種以上之方法，來獲得本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡亦可藉由例如，流式細胞儀、ELISA、西方墨點法等的手法，確認膜中包含(A)及(B)(或者以(D)取代(A)及(B))，以及依據情況之(C)之蛋白質。
本發明之一實施態樣中，係提供一種用於製造本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之方法，其係包含將培養本說明書中所記載之被轉形之細胞所獲得之培養上清液回收之步驟。
本發明之一實施態樣中，係提供一種方法，其係用於製造本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之方法，其中包含使包含 (i)編碼本說明書中所記載之(A)之融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸，及 (ii)編碼本說明書中所記載之(B)之融合蛋白質之多核苷酸，以及，依據情況包含 (iii)編碼本說明書中所記載之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之單一載體或2種以上載體之組合同時或依序地(較佳為同時)轉型於細胞中之步驟，及 回收培養所獲得之轉形細胞所獲得之培養上清液之步驟。 或者，本發明之一實施態樣中，係提供一種方法，其係用於製造本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之方法，其中包含使包含 (iv)編碼包含本說明書中所記載之(D)之抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸，及 依據情況之 (iii)編碼本說明書中所記載之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之單一載體或2種以上載體之組合同時或依序地(較佳為同時)轉型於細胞中之步驟，及 回收培養所獲得之轉形細胞所獲得之培養上清液之步驟。 或者，本發明之一實施態樣中，係提供一種方法，其係用於製造本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡之方法，其中包含使包含 (v)編碼包含本說明書中所記載之(E)之抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素及T細胞共刺激分子，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸 而成之載體，轉形至細胞中之步驟，及 回收培養所獲得之轉形細胞所獲得之培養上清液之步驟。
本發明之一實施態樣中，係提供由本說明書中所記載之培養上清液所獲得而成之抗原呈現細胞外囊泡。
本發明之一實施態樣中，係提供一種抗原呈現細胞外囊泡，其係藉由包含以下步驟之方法所獲得：將包含 (i)編碼本說明書中所記載之(A)之融合蛋白質或蛋白質複合體之多核苷酸，及 (ii)編碼本說明書中所記載之(B)之融合蛋白質之多核苷酸，以及，依據情況包含 (iii)編碼本說明書中所記載之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之單一載體或2種以上載體之組合同時或依序地(較佳為同時)轉型於細胞中之步驟，及 回收培養所獲得之轉形細胞所獲得之培養上清液之步驟。 或者，本發明之一實施態樣中，係提供一種抗原呈現細胞外囊泡，其係藉由包含以下之步驟之方法所獲得：將包含 (iv)編碼包含本說明書中所記載之(D)之抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸，及 依據情況 (iii)編碼本說明書中所記載之(C)之融合蛋白質之多核苷酸 而成之單一載體或2種以上載體之組合同時或依序地(較佳為同時)轉型於細胞中之步驟，及 回收培養所獲得之轉形細胞所獲得之培養上清液之步驟。 或者，本發明之一實施態樣中，係提供一種抗原呈現細胞外囊泡，其係藉由包含以下步驟之方法所獲得： 將(v)編碼包含本說明書中所記載之(E)之抗原呈現MHC分子及至少1種T細胞刺激性細胞激素及T細胞共刺激分子，且可於膜外呈現該抗原及該T細胞刺激性細胞激素之融合蛋白質之多核苷酸轉形至細胞中之步驟，及 回收培養所獲得之轉形細胞所獲得之培養上清液之步驟。
組成物、用途
本發明之一實施態樣中，係提供本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或包含轉形細胞及/或其之培養上清液之組成物(例如，醫藥組成物)。本發明之一實施態樣中，係提供一種本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡，或包含本說明書中所記載之培養上清液之醫藥組成物。
本說明書中所記載之組成物(例如，醫藥組成物)雖非受到此等所限定者，然而例如，可包含賦形劑、潤滑劑、結合劑、崩解劑、pH調整劑、溶劑、溶解補助劑、懸浮化劑、等滲壓劑、緩衝劑、舒緩劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑、界面活性劑等的添加劑。本發明技術領域中具有通常知識者係可依據目的適宜地選擇此等添加劑之種類、其使用量等。作為醫藥組成物使用之情況中，此等之添加劑較佳為藥理學上可容許之擔體。此外，本說明書中所記載之組成物中包含多核苷酸之情況中，雖非必須，然而較佳係包含適於核酸之DD(藥物輸送)之擔體，作為此等之擔體可舉出脂質奈米粒子(LNP)及聚合物(例如PEI)。
本說明書中所記載之組成物(例如，醫藥組成物)係可與上述添加劑共同藉由自身習知之方法，例如，進行錠劑、被覆錠劑、口腔崩散錠、嚼錠劑、丸劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、液劑(例如，包含糖漿劑、注射劑、洗劑等)、懸浮劑、乳劑、膠狀劑、貼附劑、軟膏劑、乳膏劑、吸入劑、栓劑等之製劑化。此等可為口服劑，亦可為非口服劑。經製劑化者，依據其目的，亦可更進一步包含有益的其他的成分(例如，治療上有益的其他的成分)。
屬於本發明之一實施態樣之組成物係如同試驗例所示，可增強對於特定抗原之獲得免疫(細胞性免疫及/或體液性免疫)，若使用源自感染病原體(病原菌或病毒等)之胜肽作為抗原，則可作為用於處置或預防因感染病原體所引起之感染症之醫藥組成物使用。 此外，屬於本發明之一實施態樣之組成物係如同試驗例所示，係藉由使發炎性細胞激素之誘導可進行，並使自然免疫活性化(包含動員、活性化嗜中性球、單核球、巨噬細胞等，使病原菌等被吞噬)，而可排除感染病原體，並可作為用於處置或預防因感染病原體所引起之感染症之醫藥組成物使用。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡(較佳為於膜中包含第I型MHC限制性抗原胜肽及第I型MHC分子之抗原呈現細胞外囊泡)、其多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)用於處置或預防癌係為有用。
因此，本發明之一實施態樣中，係提供用於處置或預防癌之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)。如同試驗例所示，屬於本發明之一實施態樣之抗原呈現細胞外囊泡等係可使所使用之抗原特異性之細胞毒殺型T細胞進行增殖・活性化，若使用腫瘤關聯抗原胜肽作為所使用之抗原，藉由使增殖・活性化後之細胞毒殺型T細胞識別並攻擊癌細胞，可殺死癌細胞。
本發明之其他實施態樣中，係提供一種用於製造用於處置或預防癌之醫藥之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)之用途。
本發明之其他實施態樣係提供一種用於處置或預防癌之方法，其係包含於需要其之受試個體中投予有效量之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物之步驟。
作為癌，可包含任一固態性腫瘤及血液癌，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出小細胞肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、胰臟癌、前列腺癌、骨髓癌、腎臓癌(包含腎細胞癌等)、副甲狀腺癌、腎上腺腫瘤、尿管癌、肝癌、膽管癌、子宮頸癌、卵巢癌(例如，其組織型為漿液性腺癌、黏液性腺癌、透明細胞腺癌等)、睪丸癌、膀胱癌、外陰部癌、陰莖癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、頭蓋咽頭癌、咽頭癌、舌癌、皮膚癌、默克麥克氏細胞癌(Merkel Cell Carcinoma)、黑色素瘤(惡性黑色素瘤等)、上皮癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、兒童癌症、原發不明癌、纖維肉瘤、黏膜肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、伊文氏肉瘤、精母細胞瘤、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)、腦腫瘤、神經膠腫、膠質母細胞瘤、星狀細胞瘤、骨髓芽腫、腦膜瘤、神經芽細胞瘤、髓芽腫、視網膜母細胞瘤、脊椎腫瘤、惡性淋巴腫瘤(例如，非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤等)、慢性或急性淋巴球性白血病、成人T細胞白血病等。
本發明之一實施態樣中，為了處置或預防癌症，可併用免疫檢查點抑制劑。可將免疫檢查點抑制劑同時或依序投予至患者，亦可包含於本發明之醫藥品中。 作為免疫檢查點抑制劑，係可例示出PD-1抑制劑(例如、Nivolumab、Pembrolizumab等的抗PD-1抗體)、CTLA-4抑制劑(例如Ipilimumab等的抗CTLA-4抗體)、PD-L1抑制劑(例如Durvalumab、Atezolizumab、Avelumab等的抗PD-L1抗體)等，然而並不限定於此。免疫檢查點抑制劑為抗體或其活性碎片之情況中，亦可使該抗體或其活性碎片結合於可局部存在於細胞外囊泡之膜上之膜蛋白質或者可結合於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域，而存在於本發明之細胞外囊泡之膜上。 所述免疫檢查點抑制劑之併用，係增強對於癌細胞之細胞毒殺性。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡(較佳為膜上包含第II型MHC限制性抗原胜肽及第II型MHC分子之抗原呈現細胞外囊泡)、其多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物用於處置或預防自體免疫疾病係可能有用。如同試驗例之例子所示，屬於本發明之一實施態樣之抗原呈現細胞外囊泡係可增殖・活性化所使用之抗原特異性之調節性T細胞(Treg)，若使用自體抗原胜肽作為所使用之抗原，則係引起經增殖・活性化之Treg對於自體抗原之免疫耐受，並可處置或預防自體免疫疾病。
因此，本發明之一實施態樣中，係提供用於處置或預防自體免疫疾病之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)。
本發明之其他實施態樣中係提供一種用於製造用於處置或預防自體免疫疾病之醫藥之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)之用途。
本發明之其他實施態樣中係提供一種用於處置或預防自體免疫疾病之方法，其係包含於需要其之受試個體中投予有效量之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物之步驟。
作為自體免疫疾病，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出氣喘、乾癬、全身性紅斑狼瘡、格林巴利症候群、修格連氏(sjogren's)症候群、多發性硬化症、重症肌無力症、惡性貧血、巴塞杜氏(Basedow)病、橋本氏甲狀腺炎、第I型糖尿病、克隆氏症、發炎性腸疾患、類風濕性關節炎等。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡(較佳為膜上包含第II型MHC限制性抗原胜肽及第II型MHC分子之抗原呈現細胞外囊泡)、其多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)用於處置或預防過敏性疾患係可能有用。如同試驗例所示，屬於本發明之一實施態樣之抗原呈現細胞外囊泡等係可增殖・活性化所使用之抗原特異性之調節性T細胞(Treg)，若使用過敏原做為所使用之抗原，係引起經增殖・活性化之Treg對於過敏原之免疫耐受，而可處置或預防過敏疾病。
因此，本發明之一實施態樣中，係提供用於處置或預防過敏性疾病之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)。
本發明之其他實施態樣中，係提供用於製造用於處置或預防過敏性疾病之醫藥之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物(例如，醫藥組成物)之用途。
本發明之其他實施態樣係提供一種方法，其係用於處置或預防過敏性疾病之方法，其中，係包含於需要其之受試個體中投予有效量之本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物之步驟。
作為過敏性疾病，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、過敏性氣喘、過敏性結膜炎、過敏性胃腸炎、食物過敏、藥物過敏、蕁麻疹等。
成為處置或預防上述各種疾病之對象之受試個體，雖非受到此等所限定者，然而例如，可舉出小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠等的齧齒類；兔子等的兔形目；豬、牛、山羊、馬、羊等的有蹄類；狗、貓等的食肉目；人類、新世界猴、恆河獼猴、食蟹獼猴、狨猿、紅毛猩猩、黑猩猩等的靈長類；等的哺乳動物等的動物，或者植物，較佳為動物，更佳為齧齒類或靈長類，再更佳為小鼠或人類。
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡、多核苷酸及/或包含其之載體，以及/或轉形細胞及/或其之培養上清液，或者包含此等之組成物或將其製劑化後之物之投予量係可考慮投予之受試個體之性別、年齡、體重、健康狀態、病狀之程度或者飲食；投予時間；投予方法；與其他的藥物之組合；其他的因素來適宜地決定。
用於使相對於特異性的抗原之T細胞活性化、增殖及/或分化等之方法
本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡係可藉由於in vitro、ex vivo，及/或in vivo與T細胞(雖非受到此等所限定者，然而例如，由末梢血、脾臓等所獲得之T細胞或T細胞集團)接觸，使相對於特異性的抗原之T細胞進行活性化、增殖、分化等。
本發明之一實施態樣中，係提供一種包含使本說明書中所記載之抗原呈現細胞外囊泡與T細胞於in vitro或ex vivo接觸之步驟之用於使相對於特異性的抗原之T細胞活性化、增殖及/或分化之方法。
本發明之一實施態樣中，係提供藉由前述方法所獲得之T細胞。
為了處置及/或預防疾病(例如，癌、自體免疫疾病、過敏性疾病等)，亦可將藉由上述方法獲得之T細胞投予至受試個體。 [實施例]
以下，係利用實施例進一步詳細地說明本發明，然而本發明之範圍係不受此等實施例之任何限制者。
質體之調製1 使用pCAG-puro載體，製作用於使可於膜外呈現抗原之第I型MHC分子於細胞外囊泡之膜上表現之載體。 藉由經確立之選殖技術，製作由編碼β2 微球蛋白之訊息胜肽(胺基酸1～20；序列編號：1)之多核苷酸(序列編號：2)、編碼屬於模型抗原胜肽之OVA胜肽(序列編號：3)之多核苷酸(序列編號：4)、胜肽連結子(胺基酸序列：序列編號：5、多核苷酸：序列編號：6)、編碼去除訊息胜肽後之β2 微球蛋白之全長序列(胺基酸21～119；序列編號：7)之多核苷酸(序列編號：8)、編碼胜肽連結子(序列編號：11)之多核苷酸(序列編號：12)，及編碼去除訊息胜肽後之第I型MHCα鏈之全長序列(胺基酸22～369；序列編號：9)之多核苷酸(序列編號：10)所構成之單鏈三聚體(sc-Trimer)(胺基酸序列：序列編號：13；多核苷酸：序列編號：14)。接著，將連結sc-Trimer與編碼屬於四跨膜蛋白之CD81之全長序列(胺基酸1～236；序列編號：15)之多核苷酸(序列編號：16)後之多核苷酸(序列編號：18；對應之胺基酸序列：序列編號：17)插入pCAG-puro載體中(圖1A、1B：以下，稱為sc-Trimer-CD81)。 藉由同樣的方法，為了使屬於T細胞共刺激分子中之一種之CD80表現於細胞外囊泡之膜上，係將連結編碼CD80之全長序列(胺基酸1～306；序列編號：19)之多核苷酸(序列編號：20)與編碼屬於四跨膜蛋白之CD9之全長之全長序列(胺基酸1～306；序列編號：21)之多核苷酸(序列編號：22)後之多核苷酸(序列編號：24；對應之胺基酸序列：序列編號：23)插入pCAG-puro或pMX載體中(圖1C、1D：以下，稱為CD80-CD9)。 藉由同樣的方法，為了使屬於T細胞刺激性細胞激素中之一種之IL-2表現於細胞外囊泡之膜上，將編碼去除IL-2之訊息胜肽後之全長序列(胺基酸21～169；序列編號：25)之多核苷酸(序列編號：26)插入屬於四跨膜蛋白之小鼠CD63(胺基酸1～238：序列編號：27；多核苷酸：序列編號：28)之大型細胞外環狀結構中所具有之胺基酸170C與171I之間(亦即，於編碼序列編號：57之CD63之部分序列之多核苷酸(序列編號：58)，與編碼序列編號：59之CD63之部分序列之多核苷酸(序列編號：60)之間，插入IL-2之序列)。此外，IL-2之N末端側及C末端側係各自附加編碼胜肽連結子(胺基酸序列GGGGS：序列編號：29)之多核苷酸(序列編號：30)。將此多核苷酸(序列編號：32；對應之胺基酸序列：序列編號：31)插入pCAG-puro載體中(圖1E、1F：以下，CD63-IL-2)。
質體之調製2： 使用pCAG-puro載體，製作用於使可於膜外呈現抗原之第II型MHC分子於細胞外囊泡之膜上表現之載體。 藉由經確立之選殖技術，將編碼第II型MHCβ鏈之訊息胜肽(胺基酸1～27；序列編號：33)之多核苷酸(序列編號：34)、編碼屬於模型抗原胜肽之OVA胜肽(序列編號：35)之多核苷酸(序列編號：36)及編碼去除訊息胜肽後之第II型MHCβ鏈之全長序列(胺基酸28～265；序列編號：37)之多核苷酸(序列編號：38)以編碼胜肽連結子(序列編號：39)之多核苷酸(序列編號：40)連接，製作單鏈二聚物(sc-Dimer)(胺基酸序列：序列編號：41；多核苷酸：序列編號：42)。接著，將連結sc-Dimer與編碼屬於四跨膜蛋白之CD81之全長序列(胺基酸1～236；序列編號：15)之多核苷酸(序列編號：16)之多核苷酸(序列編號：44；對應之胺基酸序列：序列編號：43)插入pCAG-puro載體中(圖1G、1H：以下，稱為sc-Dimer-CD81)。 將編碼屬於第II型MHC分子之構成要素之第II型MHCα鏈之全長序列(胺基酸1～256；序列編號：45)之多核苷酸(序列編號：46)插入其他的pCAG-puro載體中(圖1I：以下，稱為第II型MHCα鏈)。 藉由同樣的方法，為了使屬於T細胞刺激性細胞激素中之一種之TGF-β1表現於細胞外囊泡之膜上，係使編碼LAP結構域之第33、223、225個之3個C變更為S後之TGF-β1之全長序列(胺基酸1～390；序列編號：47)之多核苷酸(序列編號：48)，與編碼去除第89個之D變更為E後之MFG-E8之訊息胜肽之全長序列(胺基酸23～463；序列編號：49)之多核苷酸(序列編號：50)透過編碼胜肽連結子(序列編號：29)之多核苷酸(序列編號：30)連結。將此多核苷酸(序列編號：52；對應之胺基酸序列：序列編號：51)插入pCAG-puro載體中(圖1J、1K：以下，稱為TGF-β-MFG-E8)。 藉由同樣的方法，為了使屬於T細胞刺激性細胞激素中之一種之IL-4表現於細胞外囊泡之膜上，係將編碼去除IL-4之訊息胜肽後之全長序列(胺基酸21～140；序列編號：53)之多核苷酸(序列編號：54)插入屬於四跨膜蛋白之小鼠CD81(胺基酸1～236：序列編號：15；多核苷酸：序列編號：16)之大型細胞外環狀結構中所具有之胺基酸177S與178G之間(亦即，於編碼序列編號：61之CD81之部分序列之多核苷酸(序列編號：62)，與編碼序列編號：63之CD81之部分序列之多核苷酸(序列編號：64)之間插入IL-4之序列)。此外，各自於IL-4之N末端側及C末端側附加編碼胜肽連結子(胺基酸序列GGGGS；序列編號：29)之多核苷酸(序列編號：30)。將此多核苷酸(序列編號：56；對應之胺基酸序列：序列編號：55)插入pCAG-puro載體中(圖1L、1M：以下，稱為CD81-IL-4)。
質體之調製3： sc-Dimer-CD81-IL-12p40 將編碼於上述sc-Dimer中，使CD81與屬於T細胞刺激性細胞激素之IL-12之次單元之IL-12p40融合之蛋白質(序列編號：91)之多核苷酸(序列編號：92)插入pCAG-puro載體中，製作表現融合蛋白質之載體。 IL-12p35 將編碼屬於IL-12之另一個次單元之IL-12p35(序列編號：97)之多核苷酸(序列編號：98)插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現IL-12p35之載體。
CD81-IL-6 為了使屬於T細胞刺激性細胞激素中之一種之IL-6表現於細胞外囊泡之膜上，係將編碼去除IL-6之訊息胜肽後之全長序列(序列編號：99)之多核苷酸(序列編號：100)導入編碼屬於四跨膜蛋白之CD81之細胞外環狀結構之多核苷酸中，並將編碼CD81-IL-6融合蛋白質(序列編號：101)之多核苷酸(序列編號：102)插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。
hCD80-hCD9 為了使屬於T細胞共刺激分子中之一種之人類CD80表現於細胞外囊泡之膜上，係將編碼人類CD80及屬於四跨膜蛋白之人類CD9之融合蛋白質(序列編號：107)之多核苷酸(序列編號：108)插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。 sc-Trimer-CD81-IL-2 為了使屬於T細胞刺激性細胞激素中之一種之IL-2表現於細胞外囊泡之膜上，與上述CD81-IL-4同樣地，製作編碼CD81-IL2之融合胜肽之多核苷酸，結合該多核苷酸序列與編碼sc-Trimer-之核苷酸，製作編碼sc-Trimer-CD81-IL-2(序列編號：135)之多核苷酸(序列編號：136)，並插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。
hsc-Trimer-hCD81 上述sc-Trimer-CD81使用人類之基因序列(使用HLA-A2402作為MHC-I之序列)，製作編碼hsc-Trimer-hCD81(序列編號：131)之多核苷酸(序列編號：132)，並插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。 SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81 將SARS-CoV-2胜肽(胺基酸序列：序列編號：141；多核苷酸序列：序列編號：142))作為抗原，並使用HLA-A0201作為MHC分子，製作編碼抗原呈現MHC分子(SARS-CoV2sc-Trimer；胺基酸序列：序列編號：147)之多核苷酸(序列編號：148)，並進一步使其與編碼hCD81之多核苷酸結合，製作編碼SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81(序列編號：149)之多核苷酸(序列編號：150)。將所作製之多核苷酸插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。 hCD63-hIL-2 使用人類基因序列製作上述CD63-IL-2。製作編碼hCD63-hIL-2(序列編號：115)之多核苷酸(序列編號：116)，並插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。
CD63-Akaluc 作為陰性對照，係使CD63與Akaluc螢光素酶融合，製作用於使AlkaLuc融合蛋白質(序列編號：139)局部存在於細胞外囊泡之多核苷酸(序列編號：140)，插入pCAG-puro或pMX載體中，製作表現融合蛋白質之載體。
實施例中所使用之各序列係示於以下之表1～13。此外，各序列中之底線部分係表示訊息胜肽。
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去除胞外體之胎牛血清之調製 將10mL之經不活化處理(inactivation)之FBS與2mL之50% Poly(ethylene glycol)10,000溶液(Sigma-Aldrich公司製、#81280)於4℃、攪拌2小時後，以1500×g、4℃、30分鐘之離心條件使胞外體沉澱，並藉由回收上清液，獲得去除胞外體之胎牛血清。
[實施例1]於膜中包含第I型MHC分子及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，質體(各自編碼sc-Trimer-CD81，及CD63-IL-2之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，並將兩者同時轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例1之抗原呈現細胞外囊泡使用(圖2A)。細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[實施例2]於膜中包含第I型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞中，依據製造業者之指示，將上述調製之質體(各自編碼sc-Trimer-CD81、CD80-CD9，及CD63-IL-2之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，將3個同時進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例2之抗原呈現細胞外囊泡使用(圖2B)。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[實施例3]於膜中包含第II型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡1 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，將上述調製之質體(各自編碼sc-Dimer-CD81、第II型MHCα鏈、CD80-CD9，及CD63-IL-2之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，將4個同時地進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例3之抗原呈現細胞外囊泡使用(圖2C)。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[實施例4]於膜中包含第II型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡2 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，質體(各自編碼sc-Dimer-CD81、第II型MHCα鏈、CD80-CD9、TGF-β-MFGE8，及CD63-IL-2之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，將5個同時地進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例4之抗原呈現細胞外囊泡使用(圖2D)。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[實施例5]於膜中包含第II型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡3 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，將上述調製之質體(各自編碼sc-Dimer-CD81、第II型MHCα鏈、CD80-CD9，及CD81-IL-4之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，將4個同時地進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例5之抗原呈現細胞外囊泡使用(圖2E)。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[參考例1]控制組之細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞進行培養基交換，24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。交換為去除胞外體後之該培養基之48小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為參考例1之細胞外囊泡使用。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[參考例2]膜中包含第I型MHC分子之細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，質體(編碼sc-Trimer-CD81之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為參考例2之細胞外囊泡使用。細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[參考例3]膜中包含T細胞共刺激分子之細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，質體(編碼CD80-CD9之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為參考例3之細胞外囊泡使用。細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。 [參考例4]於膜中包含T細胞刺激性細胞激素之細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，質體(編碼CD63-IL-2之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司)，進行轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為參考例4之細胞外囊泡使用。細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
[參考例5]膜中包含第I型MHC分子及T細胞共刺激分子之細胞外囊泡 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，質體(各自編碼sc-Trimer-CD81，及CD80-CD9之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，並將兩者同時轉染。轉染之3小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為參考例5之細胞外囊泡使用。細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
試驗例1-1：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例2之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・APC複合(conjugated)抗小鼠H-2KbOVA複合體抗體(25-D1.16 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) ・Brilliant Violet421複合抗小鼠IL-2抗體(JES6-5H4 Biolegend公司製) 結果示於圖3A。
[結果] 根據試驗例1-1之結果，可知實施例2之抗原呈現細胞外囊泡於其膜包含呈現OVA抗原之第I型MHC分子、CD80，及IL-2(圖3A)。
試驗例1-2：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例3之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII (BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・APC複合抗小鼠IL-2抗體(JES6-5H4 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) ・APC-Cy7複合抗小鼠I-A/I-E抗體(M5/114.15.2 Biolegend公司製) 結果示於圖3B。
[結果] 根據試驗例1-2之結果，可知實施例3之抗原呈現細胞外囊泡係於其膜上包含呈現OVA抗原之第II型MHC分子、CD80，及IL-2(圖3B)。
試驗例1-3：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例4之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII (BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・APC複合抗小鼠IL-2抗體(JES6-5H4 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) ・APC-Cy7複合抗小鼠I-A/I-E抗體(M5/114.15.2 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠LAP(TGF-β1)抗體(TW7-16B4 Biolegend公司製) 結果示於圖3C。
[結果] 根據試驗例1-3之結果，可知實施例4之抗原呈現細胞外囊泡係於其膜上包含呈現OVA抗原之第II型MHC分子、CD80、IL-2，及TGF-β1(圖3C)。
試驗例1-4：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例5之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII (BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・Alexa Fluor 488複合抗小鼠IL-4抗體(11B11 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) ・APC-Cy7複合抗小鼠I-A/I-E抗體(M5/114.15.2 Biolegend公司製) 結果示於圖3D。
[結果] 根據試驗例1-4之結果，可知實施例5之抗原呈現細胞外囊泡係於其膜上包含呈現OVA抗原之第II型MHC分子、CD80，及IL-4(圖3D)。
試驗例2：在in vitro中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD8陽性T細胞(OT-1 T細胞)之活性化實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD8陽性T細胞活性化等，係於in vitro中實施以下之試驗。 將由屬於OVA反應性TCR基因轉殖小鼠之OT-1小鼠摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，添加實施例1或2之抗原呈現細胞外囊泡(最終濃度3μg/mL)，或者參考例2～4之3種類之細胞外囊泡之混合物(3種類之細胞外囊泡之各別之最終濃度為3μg/mL)或參考例1、2或5之細胞外囊泡(最終濃度3μg/mL)，以96孔圓底盤培養3天後，進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，OT-1 T細胞中之屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度係以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)進行檢測。 ・APC複合抗小鼠CD8抗體(53-6.7 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) 結果示於圖4。
[結果] 根據試驗例2之結果，實施例1、2之抗原呈現細胞外囊泡與參考例2～4之3種之細胞外囊泡之混合物，或參考例1、2、5之細胞外囊泡相比，係顯著地使抗原特異性CD8陽性T細胞分化及/或增殖(圖4)。
試驗例3：在in vivo中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD8陽性T細胞(OT-1 T細胞)之活性化實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD8陽性T細胞活性化等，係在in vivo中實施以下之試驗。 自屬於OVA反應性TCR基因轉殖小鼠之OT-1小鼠將淋巴結摘出，並與試驗例2同樣地調製淋巴球懸浮液。自CD45.1同基因型小鼠亦同樣地將淋巴結摘出，並調製淋巴球懸浮液。將各自之淋巴球懸浮液以1：1之比例混合，並使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet進行染色。將懸浮於PBS之1×107 個經CellTrace Violet染色後之混合淋巴球懸浮液，由CD45.1/CD45.2同基因型小鼠之尾靜脈移入。隔日，將實施例2之抗原呈現細胞外囊泡或者參考例1之細胞外囊泡 50μg，或1.5μg之IL-2(Biolegend公司製)與50μg之抗小鼠IL-2抗體(S4B6-1 Bio X Cell公司製)之混合物(IL-2/抗IL-2抗體複合體)由CD45.1/CD45.2同基因型小鼠之尾靜脈移入。細胞移入4日後，由接受者(recipient)小鼠將淋巴結摘出，調製淋巴球懸浮液，並進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，移入後之OT-1 T細胞及野生型CD8T細胞中之屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度係以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)進行檢測。 ・PE-Cy7複合抗小鼠CD8抗體(53-6.7 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) ・FITC複合抗小鼠CD45.1抗體(A20 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠CD45.2抗體(104 Biolegend公司製) 結果示於圖5。
[結果] 根據試驗例3之結果，實施例2之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，在in vivo中，其他的CD8陽性T細胞(抗原非特異性之CD8陽性T細胞)係幾乎進行不活性化等，可知係顯著地使抗原特異性CD8陽性T細胞分化及/或增殖(圖5)。此外，實施例2之抗原呈現細胞外囊泡與IL-2/抗IL-2抗體複合體相比較，由於幾乎不使其他的CD8陽性T細胞(抗原非特異性之CD8陽性T細胞)進行活性化，故被認為發生細胞激素風暴(cytokine storm)等的嚴重的副作用的可能性低(圖5)。
試驗例4：在in vitro中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)之活性化實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD4陽性T細胞活性化等，係於in vitro中實施以下之試驗。 將自屬於OVA反應性CD4TCR基因轉殖小鼠之OT-2小鼠摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，以使最終濃度成為10μg/mL的方式添加實施例3之抗原呈現細胞外囊泡或參考例1之細胞外囊泡，以96孔圓底盤培養4天。4天後將細胞回收，並進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測屬於OT-2 T細胞中之細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度。 ・PE-Cy7複合抗小鼠CD4抗體(RM4-5 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) 結果示於圖6。
[結果] 根據試驗例4之結果，實施例3之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，係顯著地使抗原特異性CD4T細胞分化及/或增殖(圖6)。
試驗例5：在in vitro中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)之分化誘導為調節性T細胞之實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否將抗原特異性CD4陽性T細胞誘導為調節性T細胞(Treg)，係於in vitro中實施以下之試驗。 將自屬於OVA反應性CD4TCR基因轉殖小鼠之OT-2小鼠摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，以使最終濃度成為10μg/mL的方式添加實施例4之抗原呈現細胞外囊泡或參考例1之細胞外囊泡，以96孔圓底盤培養4天。4天後將細胞回收，並進行細胞外免疫染色。染色所使用之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。細胞外染色後，使用True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (Biolegend公司製)及抗小鼠FOXP3抗體，根據製造業者之指示進行細胞內免疫染色。細胞內染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測OT-2 T細胞上之屬於調節性T細胞之標記之CD25分子及FOXP3分子之表現。 ・PE複合抗小鼠CD25抗體(PC61 Biolegend公司製) ・PE-Cy7複合抗小鼠CD4抗體(RM4-5 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) ・Alexa Fluor 488複合抗小鼠FOXP3抗體(MF-14 Biolegend公司製) 結果示於圖7。
[結果] 根據試驗例5之結果，可知實施例4之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，係使抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為調節性T細胞(較佳為表現Foxp3之調節性T細胞)(圖7)。
試驗例6：在in vitro中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)之分化誘導為Th2T細胞之實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否將抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為Th2T細胞，係於in vitro中實施以下之試驗。 將自屬於OVA反應性CD4TCR基因轉殖小鼠之OT-2小鼠摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，以使最終濃度成為10μg/mL的方式添加實施例3或者5之抗原呈現細胞外囊泡或參考例1之細胞外囊泡，以96孔圓底盤培養4天。4天後將細胞回收，並進行細胞外免疫染色。染色所使用之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。細胞外染色後，使用True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (Biolegend公司製)及抗GATA3抗體，根據製造業者之指示進行細胞內免疫染色。細胞內染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測屬於OT-2 T細胞之細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度與屬於Th2T細胞之標記之GATA3之表現。 ・PE複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) ・PE-Cy7複合抗小鼠CD4抗體(RM4-5 Biolegend公司製) ・APC複合抗GATA3抗體(16E10A23 Biolegend公司製) 結果示於圖8。
[結果] 根據試驗例6之結果，可知實施例3、5之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，在in vitro中，係使抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為Th2細胞(圖8)。Th2細胞係分泌IL-4或IL-5等之細胞激素，係使辨識相同抗原之初級(naive)B細胞分化活性化，並促進抗原特異性IgE產生之誘導(亦即體液性免疫之活性化)。
[實施例6]於膜中包含第II型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡4 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，將上述調製之質體(各自編碼sc-Dimer-CD81-IL-12p40、第II型MHCα鏈、CD80-CD9，及IL-12p35之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，將4個同時地進行轉染。於轉染之3-12小時後交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例6之抗原呈現細胞外囊泡使用。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行測定。
試驗例1-5：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例6之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII (BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・Alexa Fluor 488複合抗小鼠I-A/I-E抗體(M5/114.15.2 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠IL-12抗體(C15.6 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) 結果示於圖3E。
[結果] 根據試驗例1-5之結果，可知實施例6之抗原呈現細胞外囊泡係於其膜上包含呈現OVA抗原之第II型MHC分子、CD80，及機能性IL-12(圖3E)
[實施例7]於膜中包含第II型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡5 將HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，於上述調製之質體(各自編碼sc-Dimer-CD81、第II型MHCα鏈、CD80-CD9、CD81-IL-6及TGF-β-MFGE8之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，將5個同時地進行轉染。於轉染之3-12小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例7之抗原呈現細胞外囊泡使用。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。
試驗例1-6：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例7之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII (BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・FITC複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠IL-6抗體(MP5-20F3 Biolegend公司製) ・APC-Cy7複合抗小鼠I-A/I-E抗體(M5/114.15.2 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠LAP(TGF-β1)抗體(TW7-16B4 Biolegend公司製) 結果示於圖3F。
[結果] 根據試驗例1-6之結果，可知實施例7之抗原呈現細胞外囊泡係於其膜上包含呈現OVA抗原之第II型MHC分子、CD80、IL-6，及TGFb(圖3F)
[實施例8]安定地表現第I型MHC分子、T細胞共刺激分子，及T細胞刺激性細胞激素之細胞株之建立與抗原呈現細胞外囊泡之調製 將PLAT-A細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，將編碼CD80-CD9或sc-Trimer-CD81-IL-2之pMX載體使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)各自進行轉染。於轉染之12小時後交換培養基，轉染之60小時後，回收上清液，以300g離心分離5分鐘。將回收之上清液作為病毒粒子使用。將HEK293細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞中，於將經上述調製之CD80-CD9納入之病毒粒子中，將DOTAP轉染試藥(Roche)依據製造業者之指示添加，並添加至HEK293細胞中。添加了病毒粒子之細胞係以2500rpm進行3小時之離心感染。感染24小時後，交亂培養基並於1週間後，將CD80陽性細胞以FACSMelody(BD Biosciences公司製)進行分選。將分選後之CD80陽性細胞進行1週之培養後，播種至培養皿，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。約50%匯合之細胞中，於將經上述調製之sc-Trimer-CD81-IL-2納入之病毒粒子中，將DOTAP轉染試藥依據製造業者之指示添加，並添加至CD80陽性HEK293細胞中。添加了病毒粒子之細胞係以2500rpm進行3小時之離心感染。感染24小時後，交亂培養基並於1週間後，將CD80陽性、MHCI陽性細胞以FACSMelody(BD Biosciences公司製)進行分選。將經分選之細胞作為穩定表現細胞使用。將穩定表現細胞播種至培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。將約50%匯合之細胞之上清液以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。培養基交換72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例8之抗原呈現細胞外囊泡使用。
試驗例1-7：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例8之抗原呈現細胞外囊泡，藉由PS Capture(商標)胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・PE複合抗小鼠H-2KbOVA複合體抗體(25-D1.16 Biolegend公司製) ・FITC複合抗小鼠CD80抗體(16-10A1 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠IL-2抗體(JES6-5H4 Biolegend公司製) 結果示於圖3G。
[結果] 根據試驗例1-7之結果，可知實施例8之抗原呈現細胞外囊泡於其膜包含呈現OVA抗原之第I型MHC分子、CD80，及IL-2(圖3G)。
[實施例9]於膜中包含第I型HLA分子、人類T細胞共刺激分子，及人類T細胞刺激性細胞激素之抗原呈現細胞外囊泡 將B2m缺損之HEK293T細胞播種於細胞培養皿中，並於添加有2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基中進行培養。於約50%匯合之細胞，依據製造業者之指示，將上述調製之質體(各自編碼HLAsc-Trimer-人類CD81、人類CD80-人類CD9及人類CD63-IL2之pCAG載體)使用Polyethylenimine“Max”(Polysciences公司製)，並將兩者同時轉染。於轉染之3-12小時後，交換培養基，轉染之24小時後，以添加去除胞外體後之2%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基進行培養基交換。轉染之72小時後，回收上清液，將該上清液通過0.22μm過濾器後，以300g離心分離5分鐘。回收上清液，將該上清液以2,000g進行20分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以10,000g進行30分鐘之離心分離。回收上清液，將該上清液以100,000g進行2小時離心分離後，將上清液去除，並將團粒以PBS進行洗淨。於團粒中添加PBS，並以100,000g進行2小時之離心分離後，將上清液去除，使團粒懸浮於100μL之PBS後，將其作為實施例9之人類化抗原呈現細胞外囊泡使用。抗原呈現細胞外囊泡之濃度係使用BCA蛋白分析套組(Thermo Fisher Scientific公司製)，並依據製造業者之指示進行測定。 藉由使用SARS-CoV2sc-Trimer-hCD81取代hsc-Trimer-hCD81，可製作將SARS-CoV2胜肽作為抗原呈現之抗原呈現MHC分子，及將hCD80，及hIL-2於其表面呈現之人類化抗原呈現細胞外囊泡。
試驗例1-8：細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質之流式細胞儀解析 將實施例9之抗原呈現細胞外囊泡藉由PS Capture(商標) 胞外體流式細胞儀套組(富士軟片和光純藥股份公司製)，依據製造業者之指示進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測各融合蛋白質之表現。 ・APC複合抗人類IL-2抗體(MQ1-17H12 Biolegend公司製) ・PE複合抗人類CD80抗體(2D10 Biolegend公司製) ・APC複合抗人類β2m抗體(2M2 Biolegend公司製) 結果示於圖3H。
[結果] 根據試驗例1-8之結果，可之實施例9之抗原呈現細胞外囊泡於其膜包含呈現WT1抗原之第I型MHC分子、hCD80，及hIL-2(圖3H)。
試驗例7：在in vitro中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)之分化誘導為Th1T細胞之實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否將抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為Th1T細胞，係於in vitro中實施以下之試驗。 將自屬於OVA反應性CD4TCR基因轉殖小鼠之OT-2小鼠摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，以使最終濃度成為10μg/mL的方式添加實施例3或者6之抗原呈現細胞外囊泡或參考例1之細胞外囊泡，以96孔圓底盤培養4天。4天後將細胞回收，並進行細胞外免疫染色。染色所使用之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。細胞外染色後，使用True-Nuclear Transcription Factor Buffer Set (Biolegend公司製)及抗T-bet抗體，根據製造業者之指示進行細胞內免疫染色。細胞內染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測屬於OT-2 T細胞之細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度與屬於Th1T細胞之標記之T-bet之表現。 ・PerCP/Cy5.5複合抗小鼠TCRVa2抗體(B20.1 Biolegend公司製) ・APC-Cy7複合抗小鼠CD4抗體(RM4-5 Biolegend公司製) ・PE複合抗T-bet抗體(4B10 Biolegend公司製) 結果示於圖9。
[結果] 根據試驗例7之結果，實施例6之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，在in vitro中，係將抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為Th1細胞(圖9)。Th1細胞係產生IFN-γ或IL-2等，促進進行感染病原體細胞、病毒之細胞、癌細胞等的破壞之巨噬細胞或細胞毒殺型T細胞之活性化(亦即細胞性免疫之活性化)。
試驗例8：在in vitro中，藉由抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)之分化誘導為Th17T細胞之實驗 為了調查抗原呈現細胞外囊泡是否將抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為Th17T細胞，係於in vitro中實施以下之試驗。 將自OVA反應性CD4TCR基因轉殖小鼠與RORrt-GFP小鼠交配後之所產生之小鼠所摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，以使最終濃度成為10μg/mL的方式添加實施例7之抗原呈現小胞或者參考例1之細胞外囊泡，以96孔圓底盤培養4天。4天後將細胞回收，並進行細胞外免疫染色。染色所使用之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。細胞內染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測屬於OT-2 T細胞之細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度與屬於Th17T細胞之標記之RORrt之表現。 ・APC複合抗小鼠TCRVa2抗體(B20.1 Biolegend公司製) ・PE-Cy7複合抗小鼠CD4抗體(RM4-5 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) 結果示於圖10。
[結果] 根據試驗例8之結果，可知實施例7之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，在in vitro中，係將抗原特異性CD4陽性T細胞分化誘導為Th17細胞(圖10)。Th17細胞係與Th1或Th2細胞不同，為發炎性細胞激素，係產生IL-17、IL-21、IL-22、TNF-α等，而誘導炎症，且促進嗜中性球或單核球之動員、增殖，並有助於防禦真菌(包含念珠菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等病原性真菌)之感染。
試驗例9：在in vitro中，藉由由安定細胞株精製之抗原呈現細胞外囊泡進行之OVA特異性CD8陽性T細胞(OT-1 T細胞)之活性化實驗 為了調查由安定細胞株精製之抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD8陽性T細胞活性化等，係於in vitro中實施以下之試驗。 將由屬於OVA反應性TCR基因轉殖小鼠之OT-1小鼠摘出之淋巴結於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。細胞懸浮液係使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific公司製)，依據製造業者之指示進行染色。使染色後之2×105 個淋巴結細胞懸浮於添加有10%胎牛血清、50μM 2-巰基乙醇及青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養基 200μL中，以使最終濃度成為9μg/mL的方式添加實施例1或者8之抗原呈現細胞外囊泡或參考例1之細胞外囊泡，以96孔圓底盤培養4天。以96孔圓底盤培養3天後，進行免疫染色。使用於染色之抗體係如同下述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)檢測屬於OT-1 T細胞中之細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度。 ・APC複合抗小鼠CD8抗體(53-6.7 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) 結果示於圖11。
[結果] 根據試驗例9之結果，實施例1及實施例8之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，係顯著地使抗原特異性CD8陽性T細胞增殖(圖11)。此係表示不僅是以sc-Trimer-CD81為例子之構成要件(A)及以CD81-IL-2為例子之構成要件(B)作為分別之蛋白質存在之細胞外囊泡，即使為存在以sc-Trimer-CD81-IL-2為例子之具備兩者之機能之融合蛋白質之細胞外囊泡，亦於T細胞產生同等的效果。
試驗例10：藉由抗原呈現細胞外囊泡所進行之抗腫瘤效果之評估實驗 為了調查由安定細胞株精製之抗原呈現細胞外囊泡是否具有抗腫瘤效果，於CD45.1/CD45.2同基因型小鼠之皮下攝取表現OVA之B16黑色素瘤細胞1×105 個，3日後移入1×105 個OT-1T細胞。OT-1T細胞移入後，於1天、4天、7天後將實施例8之抗原呈現細胞外囊泡或者參考例1之細胞外囊泡50μg由接受者小鼠之尾靜脈移入，並觀察B16黑色素瘤細胞之大小。
[結果] 根據試驗例10之結果，實施例8之抗原呈現細胞外囊泡與參考例1之細胞外囊泡相比，係顯著地抑制B16黑色素瘤細胞之增殖(圖12)。此係表示不僅是以sc-Trimer-CD81為例子之構成要件(A)及以CD81-IL-2為例子之構成要件(B)作為分別之蛋白質存在之細胞外囊泡，即使為存在以sc-Trimer-CD81-IL-2為例子之具備兩者之機能之融合蛋白質之細胞外囊泡，亦產生同等的醫藥效果。
[實施例10]表現sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質之mRNA之調製 將編碼sc-Trimer-CD81-IL-2之pET-15b載體使用EagI進行直線化後之產物使用FastGene Gel/PCR Extraction Kit(Nippon Genetics Co.,Ltd.)進行精製，並使用T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT公司)，依據製造業者之指示，進行in vitro轉錄及加蓋化、附加polyA。將所合成之mRNA作為產出實施例10之抗原呈現細胞及抗原呈現細胞外囊泡之RNA使用(圖1N)。
參考例6 表現CD63-AkaLuc融合蛋白質膜之mRNA之調製 將編碼CD63-AkaLuc之pET-15b載體使用EcoRI直線化後之產物使用FastGene Gel/PCR Extraction Kit(Nippon Genetics Co.,Ltd.)進行精製，並使用T7 mScript Standard mRNA Production System(CELLSCRIPT公司)，依據製造業者之指示進行in vitro轉錄及加蓋化、附加polyA。所合成之mRNA做為參考例6之控制組RNA使用(圖1O)。
試驗例11：於in vivo中，藉由表現sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質之mRNA進行之OVA特異性CD8陽性T細胞(OT-1 T細胞)之活性化實驗 為了調查表現sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質之mRNA是否使抗原特異性CD8陽性T細胞活性化等，而於in vivo中實施以下的試驗。 自屬於OVA反應性TCR基因轉殖小鼠之OT-1小鼠將淋巴結摘出，於100μm過濾器上進行粉碎，獲得淋巴結細胞懸浮液。自CD45.1同基因型小鼠亦同樣地將淋巴結摘出，並調製淋巴球懸浮液。將各自之淋巴球懸浮液以1：1之比例混合，並使用屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet進行染色。將懸浮於PBS中之1×107 個經CellTrace Violet染色後之混合淋巴球懸浮液，由CD45.1/CD45.2同基因型小鼠之尾靜脈移入。隔日，將實施例10或者參考例6之mRNA10μg依據製造業者之指示，與invivo-jetRNA轉染試藥(Polyplus公司)混合，並由CD45.1/CD45.2同基因型小鼠之尾靜脈移入。細胞移入4日後，由接受者小鼠將脾臓摘出，並調製淋巴球懸浮液，並進行免疫染色。染色所使用之抗體係如同以下所述(染色時間：15分、溫度：4℃)。染色後，移入後之OT-1 T細胞及野生型CD8T細胞中之屬於細胞增殖化驗試藥之CellTrace Violet之發光強度係以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)進行檢測。 ・PE-Cy7複合抗小鼠CD8抗體(53-6.7 Biolegend公司製) ・PE複合抗小鼠TCR Vb5.1，5.2抗體(MR9-4 Biolegend公司製) ・FITC複合抗小鼠CD45.1抗體(A20 Biolegend公司製) ・APC複合抗小鼠CD45.2抗體(104 Biolegend公司製) 結果示於圖13。 [結果] 根據試驗例11之結果，實施例10之mRNA與參考例6之mRNA相比，在in vivo中，係幾乎不使其他的CD8陽性T細胞(抗原非特異性之CD8陽性T細胞)活性化等，可使抗原特異性CD8陽性T細胞顯著地分化及/或增殖(圖13)。雖不深究其原理，然而係解釋為本發明中所述之多核苷酸被導入CD45.1/CD45.2同基因小鼠體內之任意的細胞中，該細胞之膜表面及/或由該細胞分泌出之細胞外囊泡之膜表面係表現sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質，抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡係生成，使該生成之抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡與OT-1 T細胞接觸，OVA反應性CD8T細胞係增殖。此係表示，即使係用於製作抗原呈現細胞外囊泡之多核苷酸在in vivo亦可獲得與上述試驗例1～10中所示之抗原呈現細胞外囊泡之T細胞活性化之效果同等之效果。
試驗例12：藉由表現sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質之mRNA所進行之內在性OVA反應性T細胞之活性化實驗 將實施例10或者參考例6之mRNA10μg依據製造業者之指示，與invivo-jetRNA轉染試藥(Polyplus公司)混合，並由C57BL/6小鼠之尾靜脈移入。移入4日後，由接受者小鼠將脾臓摘出，並調製淋巴球懸浮液，將OVA反應性T細胞依據製造業者之指示，以四聚物進行免疫染色。染色所使用之抗體係如同以下所述。染色後，將四聚物陽性細胞以流式細胞儀FACSCantoII(BD Biosciences公司製)進行檢測。 ・APC複合H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP公司) ・PE複合H-2Kb OVA Tetramer(TETRAMER SHOP公司) ・Brilliant Violet421複合抗小鼠CD8抗體(53-6.7 Biolegend公司製)
[結果] 根據試驗例12之結果，實施例10之mRNA與參考例6之mRNA相比，顯著地使內在性地存在之OVA反應性CD8T細胞增殖(圖14)。雖不深究其原理，然而係解釋為本發明中所述之多核苷酸導入C57BL/6小鼠體內之任意的細胞中，於該細胞之膜表面及/或由該細胞分泌出之細胞外囊泡之膜表面上係表現sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質，抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡係生成，使該生成之抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡與內在性之T細胞接觸後，OVA反應性CD8T細胞係增殖。此係表示即使為用於製作抗原呈現細胞外囊泡之多核苷酸在in vivo中，亦可獲得與上述試驗例1～10中所示之抗原呈現細胞外囊泡之作為醫藥之效果為同等之效果。
以上，如同實施例所示，本說明書中所記載之抗原呈現細胞及用於製作抗原呈現細胞外囊泡之多核苷酸係可使抗原特異性T細胞(例如，抗原特異性CD8陽性T細胞、抗原特異性CD4陽性細胞等)滿足地進行活性化、增殖及/或分化等。
以下係記載序列表所包含之序列之概要。
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[圖1A]係顯示抗原胜肽-單鏈第I型MHC分子(sc-Trimer)-CD81融合蛋白質之模型圖。 [圖1B]係顯示抗原胜肽-單鏈第I型MHC分子(sc-Trimer)-CD81融合蛋白質之胺基酸序列。 [圖1C]係顯示CD80-CD9融合蛋白質之模型圖。 [圖1D]係顯示CD80-CD9融合蛋白質之胺基酸序列。 [圖1E]係顯示CD63-IL-2融合蛋白質之模型圖。 [圖1F]係顯示CD63-IL-2融合蛋白質之胺基酸序列。 [圖1G]係顯示抗原胜肽-第II型MHCβ鏈(sc-Dimer)-CD81融合蛋白質之模型圖。 [圖1H]係顯示抗原胜肽-第II型MHCβ鏈(sc-Dimer)-CD81融合蛋白質之胺基酸序列。 [圖1I]係顯示第II型MHCα鏈之胺基酸序列。 [圖1J]係顯示TGF-β-MFG-E8融合蛋白質之模型圖。 [圖1K]係顯示TGF-β-MFG-E8融合蛋白質之胺基酸序列。 [圖1L]係顯示CD81-IL-4融合蛋白質之模型圖。 [圖1M]係顯示CD81-IL-4融合蛋白質之胺基酸序列。 [圖1N]係顯示sc-Trimer-CD81-IL-2融合蛋白質之核酸序列。 [圖1O]係顯示CD81-IL-4融合蛋白質之核酸序列。 [圖2A]係顯示實施例1之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2B]係顯示實施例2之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2C]係顯示實施例3之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2D]係顯示實施例4之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2E]係顯示實施例5之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2F]係顯示實施例6之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2G]係顯示實施例7之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2H]係顯示實施例8之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2I]係顯示實施例9之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖2J]係例示出其他的實施態樣之抗原呈現細胞外囊泡之模型圖。 [圖3A]係顯示試驗例1-1中，實施例2之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3B]係顯示試驗例1-2中，實施例3之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3C]係顯示試驗例1-3中，實施例4之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3D]係顯示試驗例1-4中，實施例5之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3E]係顯示試驗例1-5中，實施例6之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3F]係顯示試驗例1-6中，實施例7之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3G]係顯示試驗例1-7中，實施例8之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖3H]係顯示試驗例1-8中，實施例9之抗原呈現細胞外囊泡之膜中所包含之融合蛋白質以流式細胞儀解析後之結果。 [圖4]係顯示試驗例2中，以in vitro進行實施例1、2之抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD8陽性T細胞(OT-1 T細胞)活性化等之評估後之結果。 [圖5]係顯示試驗例3中，以in vivo進行實施例2之抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD8陽性T細胞(OT-1)活性化等之評估後之結果。 [圖6]係顯示試驗例4中，以in vitro進行實施例3之抗原呈現細胞外囊泡是否使抗原特異性CD4陽性T細胞活性化等之評估後之結果。 [圖7]係顯示試驗例5中，以in vitro進行實施例4之抗原呈現細胞外囊泡是否誘導抗原特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)分化為調節性T細胞之評估後之結果。 [圖8]係顯示試驗例6中，以in vitro進行實施例3、5之抗原呈現細胞外囊泡是否誘導抗原特異性CD4陽性T細胞(OT-2 T細胞)分化為Th2T細胞之評估後之結果。 [圖9]係顯示試驗例7中，以in vitro進行實施例6之抗原呈現細胞外囊泡是否誘導抗原特異性CD4陽性T細胞分化為Th1細胞之評估後之結果。 [圖10]係顯示試驗例8中，以in vitro進行實施例7之抗原呈現細胞外囊泡是否誘導抗原特異性CD4陽性T細胞分化為Th17細胞之評估後之結果。 [圖11]係顯示試驗例9中，實施例1及實施例8之抗原呈現細胞外囊泡係顯著地使抗原特異性CD8陽性T細胞增殖。 [圖12]係顯示試驗例10中，實施例8之抗原呈現細胞外囊泡係顯著地抑制B16黑色素瘤細胞之增殖。 [圖13]係顯示試驗例11中，以in vivo進行實施例10之mRNA是否使抗原特異性CD8陽性T細胞(OT-1)活性化等之評估後之結果。 [圖14]係顯示試驗例12中，以in vivo進行實施例10之mRNA是否使內在性抗原特異性CD8陽性T細胞活性化等之評估後之結果。
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Claims (38)

  1. 一種多核苷酸，其係包含由 (a)編碼包含抗原呈現MHC分子，且可將該抗原呈現MHC分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(A)之序列； (b)編碼包含至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(B)之序列； (c)編碼包含T細胞共刺激分子，且可將該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(C)之序列； (d)編碼包含抗原呈現MHC分子，及至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(D)之序列；及 (e)編碼包含抗原呈現MHC分子，與至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及T細胞共刺激分子，且可將該抗原與該T細胞刺激性細胞激素與該T細胞共刺激分子提示於細胞外囊泡之膜外之融合蛋白質(E)之序列； 所成之群所選出之至少1個序列。
  2. 如請求項1所記載之多核苷酸，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含抗原呈現MHC分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。
  3. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。
  4. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係(A)包含抗原呈現MHC分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。
  5. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係(B)包含至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及四跨膜蛋白之部分序列，且該四跨膜蛋白之部分序列係至少具有2個膜貫通結構域，該至少1個T細胞刺激性細胞激素係配置於該2個膜貫通結構域之間。
  6. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含(B)至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及MFG-E8或其結構域。
  7. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含： 自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
  8. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (A-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第I型MHCα鏈、β2 微球蛋白、第II型MHCα鏈，或第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
  9. 如請求項8所記載之多核苷酸，其係進一步包含β2 微球蛋白、第I型MHCα鏈、第II型MHCβ鏈，或第II型MHCα鏈之胺基酸序列。
  10. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (B-1)自N末端側起包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (B-2)可存在之間隔子序列、 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，以及 (B-5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列 構成之胺基酸序列。
  11. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(B)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (B-3)第1T細胞刺激性細胞激素、 (B-4)可存在之間隔子序列，及 (B-5)MFG-E8 構成之胺基酸序列。
  12. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (A-1)第I型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)單鏈第I型MHC分子、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
  13. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(A)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (A-1)第II型MHC分子限制性抗原胜肽、 (A-2)可存在之間隔子序列、 (A-3)第II型MHCβ鏈、 (A-4)可存在之間隔子序列，及 (A-5)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
  14. 如請求項13所記載之多核苷酸，其係進一步包含(A-6)第II型MHCα鏈之胺基酸序列。
  15. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述T細胞刺激性細胞激素為IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-12之次單元或TGF-β。
  16. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(C)所規定之融合蛋白質係包含 (C)T細胞共刺激分子，及可表現於細胞外囊泡之膜之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其結構域。
  17. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(C)所規定之融合蛋白質係包含 (C)T細胞共刺激分子，及四跨膜蛋白或者其膜貫通結構域或MFG-E8或者其結構域。
  18. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(C)所規定之融合蛋白質係包含 自N末端側起由 (C-1)T細胞共刺激分子、 (C-2)可存在之間隔子序列，及 (C-3)四跨膜蛋白 構成之胺基酸序列。
  19. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(D)所規定之融合蛋白質係包含 前述抗原呈現MHC分子，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元，及可局部存在於細胞外囊泡之膜中之膜蛋白質或者可鍵結於其膜貫通結構域或細胞外囊泡之膜之蛋白質或者其膜結合結構域。
  20. 如請求項19所記載之多核苷酸，其中，前述可局部存在於細胞外囊泡之膜中之膜蛋白質或可結合於細胞外囊泡之膜之蛋白質為四跨膜蛋白或MFG-E8。
  21. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(D)所規定之融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)MHC分子限制性抗原胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽。
  22. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，前述(D)所規定之融合蛋白質係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (D-1)包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽、 (D-2)可存在之間隔子序列、 (D-3)單鏈MHC分子、 (D-4)可存在之間隔子序列，及 (D-5)MHC分子限制性抗原胜肽。
  23. 如請求項21或22所記載之多核苷酸，其中，前述包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)包含膜貫通結構域1、小型細胞外環狀結構、膜貫通結構域2、小型細胞內環狀結構及膜貫通結構域3之四跨膜蛋白之部分序列、 (2)可存在之間隔子序列、 (3)前述至少1個T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (4)可存在之間隔子序列，以及 (5)包含膜貫通結構域4之四跨膜蛋白之部分序列。
  24. 如請求項21或22所記載之多核苷酸，其中，前述前述包含四跨膜蛋白或其膜貫通結構域或者MFG-E8或其膜貫通結構域，及前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元之融合胜肽係包含自N末端側起依序編碼下列成分之胺基酸序列： (1)前述至少1種T細胞刺激性細胞激素或其次單元、 (2)可存在之間隔子序列，及 (3)MFG-E8。
  25. 如請求項21或22所記載之多核苷酸，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第I型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子係包含第I型MHCα鏈之細胞外領域。
  26. 如請求項21或22所記載之多核苷酸，其中，前述MHC分子限制性抗原胜肽為第II型MHC分子限制性抗原胜肽，前述單鏈MHC分子係包含第II型MHCα鏈之細胞外結構域及/或第II型MHCβ鏈之細胞外結構域。
  27. 如請求項1所記載之多核苷酸，其中，包含前述(a)所規定之序列及前述(b)所規定之序列。
  28. 如請求項1所記載之多核苷酸，其係進一步包含前述(c)所規定之序列。
  29. 如請求項1所記載之多核苷酸，其係包含前述(d)所規定之序列。
  30. 如請求項29所記載之多核苷酸，其係進一步包含前述(c)所規定之序列。
  31. 如請求項1所記載之多核苷酸，其係包含前述(e)所規定之序列。
  32. 一種載體，其係包含請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸。
  33. 一種醫藥組成物，其係包含請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸或請求項32所記載之載體，及藥理學上可容許之擔體。
  34. 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防感染症之請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸或請求項32所記載之載體，及藥理學上可容許之擔體。
  35. 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防癌之請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸或請求項32所記載之載體。
  36. 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防自體免疫疾病之請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸或請求項32所記載之載體。
  37. 一種醫藥組成物，其係包含用於處置或預防過敏性疾患之請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸或請求項32所記載之載體。
  38. 一種使相對於特異性的抗原之T細胞活性化及/或增殖之方法，其中，包含將請求項1～31中之任1項所記載之多核苷酸或請求項32所記載之載體以in vitro或ex vivo導入細胞中，生成抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡，並使所生成之抗原呈現細胞及/或抗原呈現細胞外囊泡與T細胞於in vitro或ex vivo中接觸之步驟。
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