TW202142260A - 核酸複合體及包含其之醫藥組合物 - Google Patents

核酸複合體及包含其之醫藥組合物 Download PDF

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田村智彦
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Abstract

本發明揭示一種下述式（I）所表示之核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽[X為CH2 或O；Y為含有甘露糖或GalNac之糖配體；n表示1至8之整數；Z為含有寡核苷酸之基]。

Description

核酸複合體及包含其之醫藥組合物
本發明係關於一種核酸複合體及包含該核酸複合體之醫藥組合物等。
作為核酸醫藥，已知有反義核酸、誘餌核酸、核糖核酸酶、適體、siRNA（small interfering RNA，小干擾RNA）、miRNA（microRNA，微小RNA）、信使RNA（mRNA）等。其中，作用於mRNA之核酸醫藥因其可控制細胞內之所有基因之通用性高，而期待將其臨床應用於目前難以治療之疾病中。即，核酸醫藥有望成為繼低分子、抗體醫藥之後的下一代醫藥。然而，作為核酸醫藥的問題點，可列舉：因核酸醫藥之相對較大之尺寸、磷酸骨架之負電荷引起之顯著較低之細胞膜通透性、血中核酸酶引起之siRNA分解等導致難以向核酸醫藥之作用點即細胞內傳遞（非專利文獻1）。
針對該問題點，採用使傳遞手段適應核酸醫藥而解決之方法。作為傳遞手段之一，報告有靶配體與核酸之核酸複合體（複合核酸）。作為靶配體，可列舉與在細胞表面表現之受體結合之形態。例如，作為相對於在肝實質細胞中高度表現之去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）之配體，報告有多種利用N-乙醯基-D-半乳胺糖（GalNAc）等之核酸複合體（專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3、非專利文獻2）。進而，作為對在巨噬細胞或樹狀細胞等免疫細胞中高度表現之甘露糖受體（CD206）傳遞之藥物載體，報告有甘露糖偶聯物及經甘露糖基化之核酸複合體（專利文獻4）。又，報告有將膽固醇及脂肪酸等脂溶性化合物修飾於核酸醫藥，提高與血漿中之脂蛋白等之親和性，藉此實現向表現相對應之脂蛋白受體（LDL（low density lipoprotein，低密度脂蛋白）受體、HDL（high density lipoprotein，高密度脂蛋白）受體、清道夫受體SRB1）之細胞之傳遞（非專利文獻3）。 現有技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2009/073809號 專利文獻2：國際公開第2014/179620號 專利文獻3：國際公開第2016/100401號 專利文獻4：國際公開第2018/004004號 非專利文獻
非專利文獻1：Nature Reviews Drug Discovery. 8, 129-138 (2009). 非專利文獻2：J. Am. Chem. Soc. 2014,136, 16958-16961. 非專利文獻3：Nucleic Acids Research, 2019, Vol.47, No.3,1082-1096.
[發明所欲解決之問題]
迄今為止提出多種靶配體、以及包含配體之核酸複合體，但現狀下尚未發現可充分滿足與受體之特異結合性之改善、核酸醫藥之細胞內吸收之增強者。 [解決問題之技術手段]
本發明人等為了解決上述課題而進行了銳意研究，結果發現細胞選擇性地吸收之核酸複合體。即，本發明係關於下述之[1]至[27]。 [1] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（I）表示： [化1]
Figure 02_image005
[X為CH2 或O； Y為含有甘露糖或GalNac之糖配體； n表示1至8之整數； Z為含有寡核苷酸之基]。 [2] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（II）表示： [化2]
Figure 02_image007
[Y為含有甘露糖或GalNac之糖配體； Z為含有寡核苷酸之基]。 [3] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（III）表示： [化3]
Figure 02_image009
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [4] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（IV）表示： [化4]
Figure 02_image011
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [5] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（V）表示： [化5]
Figure 02_image013
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [6] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（VI）表示： [化6]
Figure 02_image015
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [7] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（VII）表示： [化7]
Figure 02_image017
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [8] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（VIII）表示： [化8]
Figure 02_image019
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [9] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（IX）表示： [化9]
Figure 02_image021
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [10] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（X）表示： [化10]
Figure 02_image023
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [11] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XI）表示： [化11]
Figure 02_image025
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [12] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XII）表示： [化12]
Figure 02_image027
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [13] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XIII）表示： [化13]
Figure 02_image029
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [14] 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XIV）表示： [化14]
Figure 02_image031
[Z為含有寡核苷酸之基]。 [15] 如上述[1]至[14]中任一項所記載之核酸複合體，其中寡核苷酸為單鏈。 [16] 如上述[15]之核酸複合體，其中寡核苷酸經由3’末端而結合。 [17] 如上述[15]之核酸複合體，其中寡核苷酸經由5’末端而結合。 [18] 如上述[1]至[14]中任一項所記載之核酸複合體，其中寡核苷酸為雙鏈。 [19] 如上述[18]之核酸複合體，其中寡核苷酸經由一條鏈之3’末端而結合。 [20] 如上述[18]之核酸複合體，其中寡核苷酸經由一條鏈之5’末端而結合。 [21] 一種醫藥組合物，其包含如上述[1]至[20]中任一項所記載之核酸複合體。 [22] 如上述[21]所記載之醫藥組合物，其中對細胞中之靶基因之表現進行調節。 [23] 如上述[22]所記載之醫藥組合物，其中細胞為樹狀細胞、巨噬細胞或肝實質細胞。 [24] 如上述[1]至[20]中任一項所記載之核酸複合體，其係用於對細胞中之靶基因之表現進行調節之方法。 [25] 如上述[24]所記載之核酸複合體，其中細胞為樹狀細胞、巨噬細胞或肝實質細胞。 [26] 一種調節對象細胞中之靶基因之表現之方法，其包括將如上述[1]至[20]中任一項所記載之核酸複合體或上述[21]之醫藥組合物投予至對象。 [27] 如上述[26]所記載之方法，其中細胞為樹狀細胞、巨噬細胞或肝實質細胞。 [發明之效果]
如下述藥理試驗中所示，本發明之核酸複合體被選擇性地吸收至甘露糖受體或ASGPR表現之細胞。藉由將包含本發明之核酸複合體之醫藥組合物投予至哺乳動物（包括人類），而有可治癒各種關聯疾病之可能性。
以下，對本發明之內容進行詳細說明。
關於本說明書中之化合物，存在為了方便起見其結構式表示某種異構物之情況，但不限定於為了方便之式之記載，還包括化合物之結構上產生之所有幾何異構物、光學異構物、旋轉異構物、立體異構物、互變異構物等異構物以及異構物混合物，並且任一異構物均可為以任意比率包含各異構物之混合物。因此，例如本說明書中之化合物可能存在光學異構物及外消旋體，於本說明書中不限定於任一者，可為外消旋體，亦可為各光學活性體之任一者，亦可為以任意比率包含各光學活性體之混合物。
又，本說明書中之化合物亦有存在多晶型之情況，但同樣不限定於任一者，可為任一晶型之單一物，亦可為混合物，又，本說明書中之化合物亦包括非晶體，並且本說明書中之化合物包含無水物與溶劑合物（尤其是水合物）。
本說明書中之化合物亦包含化合物之經同位素標記之化合物。經同位素標記之化合物除了1個或其以上之原子經具有與自然界通常發現之原子質量或質量數不同之原子質量或質量數之原子取代以外，與化合物相同。可摻入本說明書中之化合物的同位素例如為氫、碳、氮、氧、氟、磷、硫、碘、及氯之同位素，包括2 H、3 H、11 C、14 C、15 N、18 O、18 F及35 S等。
本說明書中之所謂「藥劑學上容許之鹽」只要為與化合物形成鹽者，則無特別限定，具體而言，例如可列舉：酸加成鹽、金屬鹽、銨鹽、有機胺加成鹽、胺基酸加成鹽等鹽。
作為酸加成鹽之較佳例，例如可列舉：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；或乙酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、硬脂酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽等有機酸鹽。 作為金屬鹽之較佳例，例如可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等鹼土金屬鹽；鋁鹽、鋅鹽等。 作為銨鹽之較佳例，例如可列舉：銨、四甲基銨等之鹽。 作為有機胺加成鹽之較佳例，例如可列舉：嗎啉、哌啶等之加成鹽。 作為胺基酸加成鹽之較佳例，例如可列舉：離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、天冬胺酸、麩胺酸等之加成鹽。
於以游離體獲得本說明書中之化合物之情形時，可依照常規方法轉換為化合物可形成之鹽或該等之水合物之狀態。
於以鹽或水合物之形式獲得本說明書中之化合物之情形時，可依照常規方法轉換為游離體。
又，關於本說明書中之化合物而獲得之各種異構物（例如幾何異構物、光學異構物、旋轉異構物、立體異構物、互變異構物等）可藉由使用通常之分離方法，例如再結晶、非鏡像異構物鹽法、酶分割法、各種層析法（例如薄層層析法、管柱層析法、氣相層析法、高效液相層析法等）進行純化而單離。
本發明之醫藥組合物可藉由將藥劑學上容許之添加物與核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽混合而製造。本發明之醫藥組合物例如可依照日本藥典第十七修訂版之製劑總則中所記載之方法等已知之方法而製造。
本發明之醫藥組合物可根據其劑型而適當地投予至患者。
本發明之核酸複合體之投予量依症狀之程度、年齡、性別、體重、投予形態或鹽之種類、疾病之具體之種類等而異，通常於成人之情形時，以換算為寡核苷酸之投予量計，經口投予時每天將約30 μg~10 g、較佳為100 μg~1 g，注射投予時每天將約1 μg~1 g、較佳為100 μg~300 mg分別1次投予或分為數次投予。
本發明之核酸複合體為糖配體經由連接子與寡核苷酸結合而成之核酸複合體，糖配體含有O、N、或C結合、較佳為O結合甘露糖或GalNac。即，本發明之核酸複合體具有（糖配體）-（連接子）-（寡核苷酸）之結構。
於一實施方式中，核酸複合體含有2個以上糖、較佳為3個或4個糖。於一實施方式中，核酸複合體含有至少3個甘露糖或至少3個GalNac，該等核酸複合體可分別以巨噬細胞或肝實質細胞為靶而傳遞。
＜關於糖配體＞ 甘露糖受體於CD206高度表現之細胞、例如巨噬細胞或樹狀細胞等特定之細胞中高度表現。甘露糖偶聯物及經甘露糖基化之藥物載體對CD206表現出較高之結合親和性，並已成功地用於將藥物分子、例如寡核苷酸傳遞到巨噬細胞或樹狀細胞等細胞中。
ASGPR於肝實質細胞等特定之細胞中高度表現。GalNac偶聯物及經GalNac化之藥物載體對ASGPR表現出較高之結合親和性，並已成功地用於將藥物分子、例如寡核苷酸傳遞到肝實質細胞等細胞中。
糖配體意指源自可與在靶細胞中表現之受體結合之糖類之基，作為本發明之核酸複合體中較佳之糖配體之態樣之一，可例示以下結構。波形線意指與連接子之結合鍵。 [化15]
Figure 02_image033
[化16]
Figure 02_image035
＜關於寡核苷酸＞ 作為本發明之核酸複合體中之寡核苷酸，可使用已知用作核酸醫藥之寡核苷酸。於本說明書中，核酸醫藥意指以反義核酸、誘餌核酸、核糖核酸酶、siRNA、miRNA、antimiRNA及mRNA等形式使用之核苷酸。
又，寡核苷酸亦可為單鏈或雙鏈之寡核苷酸。
本發明之核酸複合體中之連接子與寡核苷酸可於寡核苷酸等之核苷酸結合，例如於寡核苷酸之3’末端或5’末端結合。於寡核苷酸為雙鏈之情形時，連接子較佳為與構成雙鏈核酸之正義股之3’末端或5’末端結合，但不限定於該結合。
核酸複合體中之寡核苷酸所結合之連接子之數量不限於1個，亦可為2個以上。
於若干實施方式中，例如為了提高穩定性，可於突出端包含特定之鹼基，或者於單鏈突出端（例如，5’突出端或3’突出端、或該兩者）包含修飾核苷酸或核苷酸代用物。
構成本發明之核酸複合體之寡核苷酸只要於導入哺乳動物細胞之情形時具有控制靶基因之表現之能力，則可為任意形狀，可適宜地使用單鏈之寡核苷酸或雙鏈之寡核苷酸。
作為寡核苷酸，只要為核苷酸或具有與核苷酸同等功能之分子之聚合物，則可為任意分子，例如可列舉：作為脫氧核糖核苷酸之聚合物之DNA、作為核糖核苷酸之聚合物之RNA、作為DNA與RNA之聚合物之嵌合核酸。又，於DNA、RNA及嵌合核酸中，亦可為至少一個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸等核苷酸被具有與核苷酸同等功能之分子取代而成之核苷酸聚合物。再者，RNA中之尿嘧啶（U）於DNA中可單義地改稱為胸腺嘧啶（T）。
作為具有與核苷酸同等功能之分子，例如可列舉對核苷酸施加修飾而成之核苷酸衍生物等，例如為了與DNA或RNA相比而提高或穩定核酸酶耐性，提高與互補鏈核酸之親和性，提高細胞通透性，或使其可視化，可適當使用對脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸施加修飾而成之分子等。
作為核苷酸衍生物，例如可列舉糖部修飾核苷酸、磷酸二酯鍵修飾核苷酸、鹼基修飾核苷酸等糖部、磷酸二酯鍵及鹼基之至少一者被修飾之核苷酸等。
作為糖部修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之糖之化學結構之一部分或全部，以任意取代基修飾或取代而成者、或以任意原子取代而成者，則可為任意者，可較佳地使用2’-修飾核苷酸。
作為2’-修飾核苷酸，例如可列舉核糖之2’-OH基被選自由OR、R、R’OR、SH、SR、NH2 、NHR、NR2 、N3 、CN、F、Cl、Br及I所組成之群（R為烷基或芳基，較佳為碳數1~6之烷基，R’為伸烷基，較佳為碳數1~6之伸烷基）的取代基取代之2’-修飾核苷酸，作為2’-修飾，較佳可列舉以F、甲氧基及乙氧基進行之取代。又，亦可為藉由亞甲基橋接核糖之2’位之氧原子與4’位之碳的2’-修飾核苷酸、即鎖核酸。
作為磷酸二酯鍵修飾核苷酸，只要為對於核苷酸之磷酸二酯鍵之化學結構之一部分或全部，以任意取代基修飾或取代而成者、或以任意原子取代而成者，則可為任意者，例如可列舉：磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵被二硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵被膦酸烷基酯鍵取代之核苷酸、磷酸二酯鍵被胺基磷酸酯鍵取代之核苷酸等，較佳可列舉磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代之核苷酸。
寡核苷酸亦包含其分子中之一部分或全部原子被質量數不同之原子（同位素）取代而成者。
於一態樣中，本發明之核酸複合體中之寡核苷酸對細胞中之靶基因之表現進行調節。
於一態樣中，本發明之核酸複合體中之寡核苷酸經由連接子與配體（亦稱為連接子配體）結合。
＜關於連接子＞ 作為本發明中之「連接子」，可使用可用作核酸複合體之任意連接子。
作為連接子結構之例示，例如可採用國際公開第2009/073809號、國際公開第2013/075035號、國際公開第2015/105083號所揭示之結構。
於一實施方式中，連接子包含至少1個可切斷之結合基。
所謂可切斷之結合基係於細胞外十分穩定，但若進入靶細胞內則被切斷而釋放出與連接子結合之部分的基。
例如，基於磷酸之可切斷之結合基可被將磷酸基分解或水解之藥劑所切斷。於細胞內切斷磷酸基之例為磷酸酶等酶。基於磷酸之結合基之較佳之實施方式為-O-P(O)(OH)-O-或O-P(S)(OH)-O-。
作為連接子之實施方式，為下述結構之任一者，X、Y分別獨立存在，X表示CH2 或O，Y表示糖配體，Z表示含有寡核苷酸之基，n表示1至8之整數。 [化17]
Figure 02_image037
實施例
本發明之核酸複合體例如可藉由以下之製造例所記載之方法而製造，又，該化合物之效果可藉由以下之試驗例所記載之方法進行確認。但該等為例示者，本發明於任意情形時均不限制於以下具體例，又，可於不脫離本發明之範圍之範圍內變化。本發明中之實施例可使用業者已知之合成化學技術進行製造。
又，本說明書所使用之縮寫係業者所周知之慣用之縮寫。本說明書中使用以下縮寫。 Cbz：苄氧羰基 CTC：2-氯三苯甲基氯 DCE：1,2-二氯乙烷 DCM：二氯甲烷 DIPEA：N,N-二異丙基乙基胺 DMF：N,N-二甲基甲醯胺 DMSO：二甲基亞碸 EDCI：1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽 EtOAc：乙酸乙酯 ESI：電灑游離 Fmoc：9-茀基甲氧基羰基 HBTU：1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽 HOBT：1-羥基苯并三唑 IMS：工業用改質醇 MALDI-TOF-MS：基質輔助雷射脫附游離-飛行時間型質譜儀 MeOH：甲醇 MTBE：甲基第三丁基醚 NaOMe：甲醇鈉 TFA：三氟乙酸1 H-NMR：質子核磁共振譜分析 MS：質譜分析 HPLC：高效液相層析法
以下之實施例及製造例中之「室溫」通常表示約10°C至約35°C。%只要無特別說明，則表示重量或體積百分比。
質子核磁共振譜之化學位移以相對於四甲基矽烷之δ單位（ppm）記錄，偶合常數以赫茲（Hz）記錄。模式為s：單峰、d：雙峰、t：三重峰、q：四重峰、quin：五重峰、m：多重峰、br：寬峰、br.s：寬單峰。
關於矽膠管柱層析法，矽膠使用Merck公司製造之Silica Gel60（70-230目、或230-400目ASTM）、Fuji Silysia Chemical公司製造之PSQ60B，或者使用預裝柱（管柱：YAMAZEN公司製造之Hi-FlashTM Column（Silicagel）、或Biotage公司製造之BiotageTM SNAP Ultra Silica Cartridge）。
化合物之命名除了通常所使用之試劑以外，使用以「E- Notebook」第12或13版（PerkinElmer公司）或「MarvinSketch」第16版（ChemAxon公司）所示者。
以下述製造例為參考，可藉由業者所公知之方法進行製造。
化合物6之合成流程 [化18]
Figure 02_image039
化合物2之合成 [化19]
Figure 02_image041
於乙酸肼（5.19 g，56.4 mmol）中添加DMF（200 mL），於55°C攪拌後，將反應混合物冷卻為15°C，添加1-O,2-O,3-O,4-O,6-O-五乙醯基-β-D-甘露糖（化合物1）（20.0 g，51.2 mmol），於15°C攪拌16小時。將反應混合物添加至水中，利用EtOAc進行萃取。利用飽和食鹽水洗淨合併之有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥，過濾後，於減壓下進行濃縮而獲得化合物2（14.3 g）。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) : 1.97-2.00 (m, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 4.11-4.15 (m, 1H), 4.16-4.32 (m, 3H), 5.14-5.34 (m, 3H), 5.37-5.45 (m, 1H)。
化合物3之合成 [化20]
Figure 02_image043
於DCM（50 mL）中添加化合物2（5.00 g，14.4 mmol）、2,2,2-三氯乙腈（20.7 g，143 mmol）及Cs2 CO3 （5.14 g，15.8 mmol），於25°C攪拌2小時。對反應混合物進行過濾，將濾液於減壓下進行濃縮。藉由矽膠管柱層析法（50 : 1-20 : 1 石油醚/EtOAc）純化殘渣而獲得化合物3（2.70 g）。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) : 2.01 (s, 3H), 2.04 (s, 2H), 2.08 (d, J = 6.8Hz, 6H), 2.20 (s, 3H), 4.15-4.22 (m, 2H), 4.24-4.32 (m, 1H), 5.37-5.42 (m, 2H), 5.46-5.49 (m, 1H), 6.28 (d, J = 1.8Hz, 1H), 8.79 (s, 1H)。
化合物4之合成 [化21]
Figure 02_image045
將化合物3（14.0 g，28.4 mmol）、6-(Cbz-胺基)-1-己醇（8.57 g，34.1 mmol）及分子篩4A（10.0 g）添加至DCM（140 mL）中，於0°C攪拌30分鐘。繼而，於-65°C將三甲基矽烷基三氟甲磺酸酯（6.32 g，28.4 mmol）滴加至反應混合物中，將反應混合物於25°C攪拌16小時。利用DCM稀釋反應混合物，過濾後，利用飽和碳酸氫鈉水溶液、水及食鹽水洗淨濾液，利用無水硫酸鈉加以乾燥，過濾後，於減壓下進行濃縮。藉由矽膠管柱層析法（50 : 1-20 : 1 石油醚/EtOAc）純化殘渣而獲得化合物4（7.50 g）。
化合物5之合成 [化22]
Figure 02_image047
將化合物4（7.50 g，12.9 mmol）溶解於MeOH（300 mL）中，添加NaOMe（2.79 g，51.6 mmol），於室溫下反應3小時。將反應混合物之一部分濃縮，注入冷水中，添加乙酸直至pH = 5為止，藉由矽膠管柱層析法（50 : 1-20 : 1 DCM/MeOH）純化所獲得之粗產物而獲得化合物5（3.90 g）。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) : 1.26-1.63 (m, 8H), 3.14 (d, J = 6.3Hz, 2H), 3.34 (d, J = 8.8Hz, 1H), 3.54-3.74(m, 2H), 3.80-4.01 (m, 4H), 4.78 (s, 1H), 5.01-5.12 (m, 2H), 5.16-5.47 (m, 6H), 7.28-7.41 (m, 5H)。
化合物6之合成 [化23]
Figure 02_image049
於乾燥10%鈀-碳（0.40 g）中添加MeOH（40 mL）、化合物5（3.90 g，9.43 mmol），於25°C、氫氣壓力下（50 psi）攪拌3小時。對反應混合物進行過濾，於減壓下進行濃縮而獲得化合物6（1.50 g）。1 H-NMR (400 MHz, MeOD) δ (ppm) : 1.38-1.49 (m, 4H), 1.61 (dquin, J = 13.3, 6.9, 6.9, 6.9, 6.9Hz, 4H), 2.73-2.88 (m, 2H), 3.31 (dt, J = 3.3, 1.6Hz, 1H), 3.43 (dt, J = 9.7, 6.1Hz, 1H), 3.48-3.89 (m, 8H)。
化合物8之合成 [化24]
Figure 02_image051
於6-疊氮基己酸（化合物7）（50.2 mg，319 μmol）及化合物6（268 mg，959 μmol）之DMF（3 mL）溶液中添加HOBt（129 mg，959 μmol）、DIPEA（248 mg，1.92 mmol）及EDCI（183 mg，959 μmol），於25°C攪拌3小時。藉由製備型HPLC（TFA條件）純化反應混合物而獲得化合物8（20.1 mg）。1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 1.24-1.54 (m, 14H) 2.04 (t, J = 7.40Hz, 2H) 3.00 (q, J = 6.53Hz, 2H) 3.23-3.40 (m, 12H) 3.55-3.66 (m, 2H) 4.57 (s, 1H) 7.75 (br s, 1H)
化合物11之合成流程 [化25]
Figure 02_image053
化合物10之合成 [化26]
Figure 02_image055
於包含CTC樹脂（0.50 g，0.50 mmol，1.00 mmol/g）與N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-麩胺酸5-第三丁酯（化合物9）（212 mg，0.50 mmol）之混合物中添加DCM（30 mL）及DIPEA（258 mg，2.00 mmol），將反應混合物攪拌2小時。於反應混合物中添加MeOH（0.2 mL），並攪拌30分鐘。於反應混合物中添加6-疊氮基己酸（化合物7）（118 mg，0.75 mmol）、DIPEA（258 mg，2.00 mmol）、HBTU（270 mg，712 umol）及DMF（3 mL），於25°C攪拌1小時。於反應混合物中添加90%TFA/10%DCM，並攪拌2小時。對反應混合物進行過濾，於減壓下濃縮濾液而獲得化合物10（110 mg）。
化合物11之合成 [化27]
Figure 02_image057
於化合物10（50.0 mg，174 μmol）及化合物6（292 mg，1.05 mmol）之DMF（3 mL）溶液中添加HOBt（141 mg，1.05 mmol）、DIPEA（270 mg，2.10 mmol）及EDCI（200 mg，1.05 mmol）。將反應混合物於25°C攪拌16小時。藉由製備型HPLC（TFA條件）進行純化而獲得化合物11（18.1 mg）。1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) : 1.16-1.56 (m, 24H), 1.62-1.73 (m, 1H), 1.76-1.87 (m, 1H), 2.00-2.07 (m, 2H), 2.09-2.15 (m, 2H), 2.95-3.07 (m, 4H), 3.22-3.41 (m, 18H), 3.65 (br s, 6H), 4.10-4.19 (m, 1H), 4.57 (d, J = 1.00Hz, 2H), 7.74-7.93 (m, 3H)。
化合物12之合成 [化28]
Figure 02_image059
於CTC樹脂（1.00 g，1.00 mmol，1.00 mmol/g）及N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-麩胺酸5-第三丁酯（化合物9）（511 mg，1.20 mmol）中添加DCM（20 mL）、DIPEA（516 mg，4.00 mmol），對反應混合物通入氮氣（N2 ）並攪拌2小時。於反應混合物中添加MeOH（1 mL），並攪拌30分鐘。將20%哌啶之DMF（30 mL）溶液添加至反應混合物中，並攪拌30分鐘，利用DMF洗淨樹脂，添加N-Fmoc-麩胺酸1-第三丁酯（851 mg，2.00 mmol）、HBTU（720 mg，1.90 mmol）及DIPEA（516 mg，4.00 mmol）之DMF（5 mL）溶液，於25°C攪拌1小時。添加20%哌啶之DMF（30 mL）溶液，攪拌30分鐘，並利用DMF洗淨樹脂。繼而，添加6-疊氮基己酸（化合物7）（0.30 g，1.91 mmol）、HBTU（720 mg，1.90 mmol）及DIPEA（516 mg，4.00 mmol）之DMF（5 mL）溶液，於25°C攪拌1小時，利用DMF洗淨樹脂，並利用MeOH進行洗淨，於減壓下使其乾燥。於所獲得之殘渣（0.60 g）中添加50%TFA/50%DCM，攪拌2小時，於減壓下濃縮反應混合物而獲得化合物12（240 mg）。
化合物13之合成 [化29]
Figure 02_image061
化合物13之合成係依照化合物12之合成方法，使用疊氮-PEG8-酸（Azido-PEG8-acid）（CAS No.1214319-92-2）代替6-疊氮基己酸，藉此獲得化合物13(350 mg)。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) : 2.01 (s, 2H), 2.18 (s, 2H), 2.32-2.63 (m, 6H), 3.40 (t, J = 5.0Hz, 2H), 3.54-3.71 (m, 32H), 4.49 (s, 2H), 7.67-8.03 (m, 2H)。
化合物14之合成 [化30]
Figure 02_image063
於化合物12（0.20 g，481 μmol）及化合物7（1.08 g，3.85 mmol）之DMF（0.5 mL）溶液中添加DIPEA（996 mg，7.70 mmol）、HOBt（520 mg，3.85 mmol）及EDCI（738 mg，3.85 mmol）。將反應混合物於25°C攪拌16小時，藉由製備型HPLC（TFA條件）進行純化而獲得化合物14（103 mg）。1 H-NMR (400 MHz, MeOD) δ (ppm) : 1.26-1.72 (m, 32H), 1.82-1.97 (m, 2H), 2.03-2.13 (m, 2H), 2.22-2.41 (m, 6H), 3.14-3.24 (m, 6H), 3.37-3.47 (m, 3H), 3.49-3.55 (m, 3H), 3.60 (t, J = 9.5Hz, 3H), 3.65-3.86 (m, 15H), 4.22-4.42 (m, 2H), 4.73 (s, 3H)。
化合物15之合成 [化31]
Figure 02_image065
於化合物13（0.20 g，275 μmol）及化合物7（616 mg，2.20 mmol）之DMF（0.5 mL）溶液中添加DIPEA（570 mg，4.41 mmol）、HOBT（298 mg，2.20 mmol）及EDCI（423 mg，2.20 mmol），將反應混合物於25°C攪拌16小時。藉由製備型HPLC（TFA條件）純化反應混合物而獲得化合物15（127 mg）。1 H-NMR (400 MHz, MeOD) δ (ppm) : 1.23-1.68 (m, 24H), 1.78-1.95 (m, 2H), 2.04-2.19 (m, 2H), 2.23-2.31 (m, 2H), 2.33-2.42 (m, 2H), 2.48-2.60 (m, 2H), 3.10-3.26 (m, 6H), 3.35-3.46 (m, 5H), 3.48-3.56 (m, 3H), 3.57-3.84 (m, 50H), 4.23-4.41 (m, 2H), 4.73 (s, 3H)。
化合物17之合成流程 [化32]
Figure 02_image067
化合物16之合成 [化33]
Figure 02_image069
於CTC樹脂（0.50 mmol，0.50 g，1.00 mmol/g）及N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-麩胺酸5-第三丁酯（化合物9）（212 mg，0.50 mmol）中添加DCM（30 mL）及DIPEA（258 mg，2.00 mmol）。將反應混合物攪拌2小時後，添加MeOH（0.2 mL），並攪拌30分鐘。於反應混合物中添加HBTU（360 mg，950 μmol）及DIPEA（258 mg，2.00 mmol）之DMF（3 mL）溶液及N-Fmoc-麩胺酸1-第三丁酯（425 mg，1.00 mmol），於25°C攪拌1小時後，添加N-Fmoc-麩胺酸1-第三丁酯（425 mg，1.00 mmol）、HBTU（360 mg，950 μmol）及DIPEA（258 mg，2.00 mmol）之DMF（3 mL）溶液，於25°C在1小時內添加。繼而，添加6-疊氮基己酸（化合物7）（118 mg，750 μmol）、HBTU（360 mg，950 μmol）、DIPEA（258 mg，2.00 mmol）並攪拌1小時。添加90%TFA/10%DCM，於室溫下攪拌2小時。對反應混合物進行過濾，於減壓下進行濃縮而獲得化合物16（200 mg）。
化合物17之合成 [化34]
Figure 02_image071
於化合物16（50.0 mg，91.8 μmol）及化合物7（256 mg，918 μmol）之DMF（3 mL）溶液中添加HOBt（124 mg，918 μmol）、DIPEA（237 mg，1.84 mmol）及EDCI（176 mg，918 μmol），將反應混合物於25°C攪拌16小時。藉由製備型HPLC（TFA條件）純化反應混合物而獲得化合物17（18.2 mg）。1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) : 1.19-1.56 (m, 40H), 1.66 (br s, 3H), 1.83 (br s, 3H), 2.00-2.15 (m, 7H), 2.94-3.05 (m, 8H), 3.29 (br d, J = 5.02Hz, 24H), 3.52-3.71 (m, 24H), 4.13 (br s, 3H), 4.57 (s, 4H), 7.74-7.99 (m, 7H)。
化合物21及22之合成流程 [化35]
Figure 02_image073
化合物19之合成 [化36]
Figure 02_image075
於半乳胺糖五乙酸酯化合物18（12.0 g，30.8 mmol）、6-(Cbz-胺基)-1-己醇（10.3 g，41.1 mmol）及ZnCl2 （5.60 g，41.1 mmol）（於使用前在110°C減壓乾燥1小時）之混合物中添加DCE（120 mL），將反應混合物於70°C攪拌3小時。利用EtOAc及碳酸氫鈉水溶液稀釋反應混合物，將混合物攪拌10分鐘，進行矽藻土（註冊商標）過濾，並利用EtOAc洗淨。利用水及食鹽水洗淨濾液。利用EtOAc萃取水層，利用硫酸鈉乾燥有機層，過濾後，於減壓下進行濃縮，藉由矽膠管柱層析法（2 : 1 石油醚/EtOAc）純化所獲得之殘渣而獲得化合物19（14.0 g）。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ (ppm) : 1.35 (d, J = 3.8Hz, 4H), 1.45-1.66 (m, 4H), 1.77 (s, 2H), 1.94 (s, 3H),2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 3.20 (qq, J = 13.4, 6.8Hz, 2H), 3.48 (dt, J = 9.6, 6.5Hz, 1H), 3.79-4.03 (m, 3H), 4.08-4.19 (m, 2H), 4.65 (d, J = 8.3Hz, 1H), 4.90 (s, 1H), 5.04-5.17 (m, 2H), 5.26 (dd, J = 11.2, 3.1Hz, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.34 (d, J = 2.8Hz, 1H), 5.94 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.28-7.42 (m, 5H)。
化合物20之合成 [化37]
Figure 02_image077
於化合物19（7.50 g，12.9 mmol）中添加MeOH（300 mL）及NaOMe（2.79 g，51.7 mmol），於室溫下攪拌3小時。將反應混合物之一部分濃縮，注入冷水中，添加乙酸直至pH = 5為止。繼而，藉由矽膠管柱層析法（50 : 0-50 : 1 DCM/MeOH）純化所獲得之粗產物而獲得化合物20（4.00 g）。1 H-NMR (400 MHz, MeOD) δ (ppm) : 1.19-1.35 (m, 4H), 1.40-1.56 (m, 4H), 1.93 (s, 2H), 3.06 (t, J = 7.0Hz, 2H), 3.27 (dt, J = 3.3, 1.6Hz, 1H), 3.31 (s, 1H), 3.37-3.49 (m, 2H), 3.55 (dd, J = 10.8, 3.3Hz, 1H), 3.65-3.76 (m, 2H), 3.78-3.94 (m, 3H), 4.31 (d, J = 8.5Hz, 1H), 5.02 (s, 2H), 7.17-7.44 (m, 5H)。
化合物21之合成 [化38]
Figure 02_image079
於氬氣環境下向乾燥10%鈀-碳（240 mg）中添加MeOH（25 mL）及化合物20（2.40 g，5.28 mmol），於氫氣壓力下（50 psi）在25°C攪拌3小時。對反應混合物進行過濾，於減壓下濃縮濾液而獲得化合物21（0.66 g）。1 H-NMR (400 MHz, MeOD) δ (ppm) : 1.30-1.44 (m, 4H), 1.52-1.66 (m, 4H), 1.98 (s, 3H), 2.76-2.90 (m, 2H), 3.31 (dt, J = 3.3, 1.6Hz, 2H), 3.44-3.51 (m, 2H), 3.58 (dd, J = 10.8, 3.3Hz, 1H), 3.73-3.78 (m, 2H), 3.82-3.95 (m, 3H), 4.34 (d, J = 8.5Hz, 1H)。
化合物22之合成 [化39]
Figure 02_image081
於化合物19（202 mg，0.35 mmol）中添加乙醇（6 mL）、10%鈀-碳（50%含水品）（42 mg），於氫氣環境下在室溫下攪拌3小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾反應混合物，利用乙醇洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物22（159 mg）。1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 0.64 (br s, 1H) 1.27 (br s, 5H) 1.33-1.52 (m, 4H) 1.67 (br s, 1H) 1.80 (s, 3H) 2.61 (br t, J = 6.88Hz, 2H) 3.40-3.60 (m, 5H) 3.58-3.77 (m, 4H) 4.23 (br d, J = 8.25Hz, 1H) 4.31-4.97 (m, 5H) 7.53-7.71 (m, 1H); MS (ESI+): m/z 321 [M＋H]+。
化合物23之合成 [化40]
Figure 02_image083
於化合物12（602 mg，1.88 mmol）及化合物21（601 mg，1.88 mmol）之DMF（0.5 mL）溶液中添加DIPEA（485 mg，3.76 mmol）、HOBt（254 mg，1.88 mmol）及EDCI（360 mg，1.88 mmol），將反應混合物於25°C攪拌16小時。藉由製備型HPLC（TFA條件）純化殘渣而獲得化合物23（104 mg）。1 H-NMR (400 MHz, MeOD) δ (ppm) : 1.29-1.70 (m, 32H), 1.82-2.01 (m, 11H), 2.08 (s, 2H), 2.22-2.38 (m, 8H),3.18 (d, J = 6.3Hz, 6H), 3.42-3.52 (m, 6H), 3.60 (d, J = 10.5Hz, 3H), 3.71-3.95 (m, 14H), 4.28 (s, 1H), 4.36 (d, J = 8.3Hz, 3H)。
化合物24之合成 [化41]
Figure 02_image085
以與化合物23之合成同樣之方式，使用化合物16代替化合物12，藉此獲得化合物24。1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 1.15-1.59 (m, 44H) 1.68 (br d, J = 9.90Hz, 3H) 1.79 (s, 12H) 1.82-1.92 (m, 5H) 1.97-2.22 (m, 9H) 3.02 (br d, J = 5.50Hz, 10H) 3.32-3.58 (m, 19H) 3.61-3.72 (m, 13H) 4.06-4.27 (m, 8H) 4.43 (br s, 4H) 4.46-4.59 (m, 9H) 7.59 (br d, J = 8.80Hz, 4H) 7.74 (br s, 1H) 7.83 (br s, 3H) 7.89 (br s, 3H); MS (ESI+): m/z 1754 [M＋H]+。
化合物28之合成流程 [化42]
Figure 02_image087
化合物25之合成 [化43]
Figure 02_image089
於包含CTC樹脂（1.33 mmol/g，0.375 g，0.50 mmol）與化合物9（212 mg，0.50 mmol）之混合物中添加DCM（30 mL），並滴加DIPEA（0.35 mL，2.00 mmol），將反應液攪拌2小時。於反應液中添加MeOH（0.2 mL，4.94 mmol），並攪拌35分鐘。於反應液中添加20%哌啶之DMF（15 mL）溶液並攪拌30分鐘。對反應混合物進行過濾，利用DMF洗淨所獲得之固體。繼而添加N-Fmoc-D-麩胺酸1-第三丁酯（213 mg，0.499 mmol）及N-Fmoc-L-麩胺酸1-第三丁酯（213 mg，0.499 mmol）、HBTU（360 mg，0.949 mmol）、DMF（3 mL）及DIPEA（0.35 mL，2.00 mmol），對反應混合物通入氮氣並攪拌1小時。添加20%哌啶之DMF（15 mL）溶液，並攪拌30分鐘。然後利用DMF洗淨樹脂。繼而添加N-Fmoc-D-麩胺酸1-第三丁酯（213 mg，0.499 mmol），N-Fmoc-L-麩胺酸1-第三丁酯（213 mg，0.499 mmol）、HBTU（360 mg，0.949 mmol）及DMF（3 mL），緩慢滴加DIPEA（0.35 mL，2.00 mmol）。對反應混合物通入氮氣並攪拌80分鐘。然後，利用DMF洗淨樹脂，並利用MeOH進行洗淨，於減壓下使其乾燥。於所獲得之殘渣中添加50%TFA/50%DCM，攪拌2小時並過濾後，於減壓下濃縮濾液而獲得化合物25（307.3 mg）。 MS(ESI) M/Z: 610[M＋H]+ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) : 1.77 (m, 5H), 1.94 (m, 3H), 2.12-2.23 (m, 6H), 2.26 (m, 2H), 2.38 (br t, J = 7.34Hz, 2H), 4.13-4.21 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 7.30-7.40 (m, 5H), 8.05-8.15 (m, 3H)。
化合物26之合成 [化44]
Figure 02_image091
於化合物22（154 mg，0.344 mmol）與化合物25（21.0 mg，0.034 mmol）之DMF（2 mL）溶液中添加HOBt（52.8 mg，0.344 mmol）、DIPEA（0.12 mL，0.689 mmol）及EDCI（66.0 mg，0.344 mmol）。將反應混合物於室溫下攪拌18小時，添加水及EtOAc、少量甲醇進行萃取，利用硫酸鈉乾燥有機層。過濾後於減壓下進行濃縮。藉由製備型HPLC純化殘渣而獲得化合物26（16.7 mg）。 MS(ESI) M/Z: 1162[M＋2H]+ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) : 1.23 (br s, 16H), 1.31-1.41 (m, 8H), 1.41-1.48 (m, 8H), 1.60-1.73 (m, 4H), 1.77 (s, 12H), 1.78-1.87 (m, 4H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.01-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 12H), 2.11-2.21 (m, 6H), 2.33-2.37 (m, 2H), 2.95-3.07 (m, 8H), 3.37-3.43 (m, 4H), 3.65-3.72 (m, 4H), 3.82-3.90 (m, 4H), 3.98-4.05 (m, 12H), 4.09-4.20 (m, 3H), 4.48 (d, J = 8.44Hz, 4H), 4.97 (dd, J = 11.19, 3.12Hz, 4H), 5.08 (s, 2H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 4H), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.80 (m, 8H), 7.86-7.95 (m, 3H)。
化合物27之合成 [化45]
Figure 02_image093
於化合物26（19.0 mg，8.18 μmol）之乙醇（3 mL）溶液中添加10%鈀-碳（50%含水品）（5.3 mg）。將反應混合物於氫氣環境下在室溫下攪拌3小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾反應混合物，利用乙醇洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物27（19.6 mg）。1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) : 1.24 (br s, 22H), 1.30-1.40 (m, 8H), 1.45 (br s, 8H), 1.61-1.74 (m, 4H), 1.77 (s, 12H), 1.80-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.01-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.25 (m, 4H), 2.93-3.06 (m, 8H), 3.36-3.46 (m, 4H), 3.64-3.72 (m, 4H), 3.82-3.91 (m, 4H), 3.98-4.20 (m, 16H), 4.50 (br d, J = 8.07Hz, 4H), 4.94-5.02 (m, 4H), 5.21 (d, J = 2.93Hz, 4H) 7.73-8.03 (m, 11H)。
化合物28之合成 [化46]
Figure 02_image095
於氮氣環境下向化合物27（17.4 mg，7.79 μmol）之DMF（2 mL）溶液中添加三乙胺（8.7 μL，62 μmol）及三氟乙酸五氟苯酯（5.4 μL，31 μmol），將反應混合物於室溫下攪拌1.5小時。於反應液中添加水，利用EtOAc進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉、硫酸氫鈉、飽和食鹽水洗淨有機層。於減壓下濃縮後，利用戊烷濕磨殘渣，濾取並於40度在減壓下加以乾燥而獲得化合物28（11.72 mg）。 MS(ESI) M/Z: 1200[M＋2H]＋ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ (ppm) : 1.24 (br s, 20H), 1.31-1.40 (m, 8H), 1.41-1.49 (m, 8H), 1.61-1.72 (m, 2H), 1.77 (s, 12H), 1.79-1.86 (m, 2H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.01-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.31 (m, 2H), 2.80 (br t, J = 7.34Hz, 2H), 2.95-3.08 (m, 8H), 3.37-3.43 (m, 4H), 3.65-3.72 (m, 4H), 3.82-3.90 (m, 4H), 3.97-4.06 (m, 12H), 4.10-4.22 (m, 3H), 4.48 (d, J = 8.44Hz, 4H), 4.97 (dd, J = 11.00, 2.93Hz, 4H), 5.21 (d, J = 2.93Hz, 4H), 7.70-7.86 (m, 8H), 7.86-8.01 (m, 3H)。
實施例1~7：核酸複合體1~7之合成 SEQ-1及SEQ-2係委託JEEN DESIGN公司合成。於SEQ-2（1.3 μmol）中添加四硼酸鈉緩衝液（sodium tetraborate buffer）（pH值為8.5，最終濃度40 mM），並添加溶解於DMSO中之DBCO-NHS酯（Dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester，二苯并環辛炔-N-羥基丁二醯亞胺酯）（CAS No.1353016-71-3，60 μmol），於室溫下攪拌15分鐘。於反應液中添加水後，利用PD-10管柱（GE Healthcare公司）進行凝膠過濾純化。進而利用Amicon Ultra 3K（Millipore公司）進行純化、濃縮，藉此獲得粗產物（SEQ-3）。於粗產物（40 nmol）中添加乙酸三乙基銨（triethylammonium acetate）（pH值為7.0，最終濃度50 mM），並分別添加溶解於水中之化合物8、11、14、15、17、23、24（400 nmol），於室溫下攪拌15分鐘。利用PD-10管柱（GE Healthcare公司）對反應液進行凝膠過濾純化。進而利用Amicon Ultra 3K（Millipore公司）進行純化、濃縮，藉此獲得核酸複合體、即對應於化合物8、11、14、15、17、23、24之核酸複合體1~7。
[化47]
Figure 02_image097
核酸複合體1 [化48]
Figure 02_image099
核酸複合體2 [化49]
Figure 02_image101
核酸複合體3 [化50]
Figure 02_image103
核酸複合體4 [化51]
Figure 02_image105
核酸複合體5 [化52]
Figure 02_image107
核酸複合體6 [化53]
Figure 02_image109
核酸複合體7 [化54]
Figure 02_image111
實施例8：核酸複合體8之合成 於SEQ-2（26.6 nmol）中添加四硼酸鈉緩衝液（pH值為8.5）及溶解於DMSO中之化合物28（120 nmol），於室溫下進行攪拌。於反應液中添加水後，利用Amicon Ultra 3K（Millipore公司）進行純化。於所獲得之粗產物中添加5倍量之28%氨水，於室溫下靜置3小時。於反應液中添加水後，利用Amicon Ultra 3K（Millipore公司）進行純化。進而藉由逆相HPLC進行純化，藉此獲得核酸複合體8。
核酸複合體8 [化55]
Figure 02_image113
核酸序列之說明 本實施例所使用之核酸之序列中(5’-3’)為A(F)^G(M)^G(F)A(M)C(F)U(M)G(F)G(M)U(F)C(M)U(F)U(F)U(M)C(F)U(M)A(F)U(M)A(F)U(M)^C(F)^U(M)，大寫字母表示RNA，（M）表示2’-O-甲基修飾RNA，（F）表示2’-氟RNA，^表示硫代磷酸酯鍵。又，於各寡核苷酸之5’末端結合有作為螢光色素之花青色素Cy3（激發波長555 nm，螢光波長570 nm）。對SEQ-1、2及本實施例中所合成之核酸複合體進行利用MALDI-TOF-MS之分子量測定，將其結果示於表1。
[表1]
化合物 理論分子量 實測值 m/z [M－H]-
SEQ-1 7346.1 7345.5
SEQ-2 7525.3 7526.4
核酸複合體1 8231.1 8227.8
核酸複合體2 8621.5 8620.1
核酸複合體3 9011.9 9009.4
核酸複合體4 9322.3 9321.1
核酸複合體5 9402.4 9397.6
核酸複合體6 9135.1 9131.1
核酸複合體7 9236.2 9235.5
核酸複合體8 9566.6 9566.0
＜試驗例1＞ 核酸複合體對人CD206表現Lenti-X 293T細胞之活體外吸收活性評估 對於實施例中所合成之核酸複合體，分別藉由以下方法導入人CD206表現Lenti-X 293T細胞（Clontech公司），對吸收進行評估。將人CD206表現Lenti-X 293T細胞（Clontech公司）以成為2×104 個/100 μL/孔之方式接種至96孔PDL（Poly-D-Lysine，聚離胺酸）塗層板（Corning公司），於37°C之5%CO2 培養箱內培養2天。以最終濃度成為100 nmol/L之方式，添加SEQ-1或所合成之核酸複合體，於37°C之5%CO2 培養箱內培養2小時。添加包含10 μg/mL Hoechst（Life Technologies公司）之4%多聚甲醛/PBS（Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝鹽水）（Wako），於常溫下將細胞固定30分鐘，利用PBS洗淨4次。利用IN Cell Analyzer 2200（GE Healthcare公司）進行螢光成像解析，利用核數修正孔內之Cy3螢光強度，算出每個細胞之平均Cy3螢光強度。此時，將添加有未經糖配體修飾之核酸SEQ-1之孔的螢光強度設為1，以相對值之形式算出添加有各核酸複合體之孔之螢光強度。
將結果示於表2。根據該結果可知，與不含糖配體之SEQ-1相比，含有GalNac之核酸複合體6未被有效率地吸收至CD206表現之細胞中，另一方面，含有甘露糖之核酸複合體1至5被有效率地吸收至CD206表現之細胞中。
[表2]
檢體編號 SEQ-1 核酸複合體
1 2 3 4 5 6
配體 - 甘露糖 甘露糖 甘露糖 甘露糖 甘露糖 GalNac
結合價 - 1 2 3 3 4 3
螢光強度之相對值 （SEQ-1 = 1.0) 1 7.5 12.6 13.8 15 14.5 1.1
＜試驗例2＞ 核酸複合體對人ASGR1表現Lenti-X293T細胞之活體外吸收活性評估 對於實施例中所合成之核酸複合體，分別藉由以下方法導入至人ASGR1表現Lenti-X293T細胞（Clontech公司）中，對吸收活性進行評估。將人ASGR1表現Lenti-X293T細胞（Clontech公司）以成為2×104 個/100 μL/孔之方式接種至96孔PDL塗層板（Corning公司），於37°C之5%CO2 培養箱內培養1天或2天。以最終濃度成為100 nmol/L之方式，添加SEQ-1或所合成之核酸複合體，於37°C之5%CO2 培養箱內培養2小時。其後之螢光成像解析係藉由與試驗例1同樣之方法實施。
將結果示於表3。根據該結果可知，與不含糖配體之SEQ-1相比，含有甘露糖之核酸複合體1至5未被有效率地吸收至ASGR1表現之細胞中，另一方面，含有GalNac之核酸複合體6至8被有效率地吸收至ASGR1表現之細胞中。
[表3]
檢體編號 SEQ-1 核酸複合體
1 2 3 4 5 6 7 8
配體 - 甘露糖 甘露糖 甘露糖 甘露糖 甘露糖 GalNac GalNAc GalNAc
結合價 - 1 2 3 3 4 3 4 4
螢光強度之相對值 (SEQ-1 = 1.0) 1 2.1 1.4 1.3 0.9 1.1 44.9 64.5 53.3
＜試驗例3＞ 小鼠肝實質細胞及庫弗氏細胞（Kupffer cell）中之核酸複合體之吸收評估（活體內評估） 分別以1 mg/kg對BALB/c小鼠（n = 3）皮下投予SEQ-1、核酸複合體3及6。投予4小時後，對肝臟進行灌流，利用流式細胞儀將肝實質細胞及庫弗氏細胞分離，對螢光強度進行測定。此時，將投予了SEQ-1之組之螢光強度設為1，以相對值之形式算出各核酸複合體投予組之螢光強度。 將結果示於表4。根據該結果可知，與不含糖配體之SEQ-1相比，含有甘露糖之核酸複合體3被高效地吸收至報告為CD206陽性之小鼠庫弗氏細胞中，含有GalNac之核酸複合體6被高效地吸收至報告為ASGR1陽性之小鼠肝實質細胞中。
[表4]
檢體編號 SEQ-1 核酸複合體
3 6
配體 - 甘露糖 GalNac
結合價 - 3 3
肝實質細胞 1 1.6 5.3
庫弗氏細胞 1 2.2 0.7
化合物37之合成流程 [化56]
Figure 02_image115
化合物30之合成 [化57]
Figure 02_image117
於50°C加熱乙酸肼（1.29 g，14.06 mmol）與DMF（50 mL）之混合物。繼而，將其於15°C之水浴中冷卻，添加α-D-甘露糖五乙酸酯（4.99 g，12.8 mmol）。將所獲得之溶液於15°C-19°C之水浴中攪拌16小時。於混合物中添加水與EtOAc進行萃取，利用EtOAc進一步萃取水層。利用飽和食鹽水洗淨合併之有機層，利用無水硫酸鈉加以乾燥並過濾，於減壓下進行濃縮。藉由使用Biotage Isolera（100 g KP-Sil，20-100%EtOAc/環己烷）之管柱層析法純化殘渣而以α及β非鏡像異構物之9 : 1混合物之形式獲得化合物30（4.19 g）。 α異構物1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm: 2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.16 (s, 3H), 3.00 (d, J = 4.03Hz, 1H), 4.15 (br d, J = 10.64Hz, 1H), 4.22-4.28 (m, 2H), 5.23-5.33 (m, 3H), 5.43 (br dd, J = 10.27, 3.30Hz, 1H)
化合物31之合成 [化58]
Figure 02_image119
於氮氣環境下向化合物30（3.64 g，10.5 mmol）之DCM（218 mL）溶液中滴加三氯乙腈（10.48 mL，104.5 mmol），繼而滴加DBU（0.158 mL，1.05 mmol）。將混合物於氮氣環境、室溫下攪拌2.25小時。於減壓下進行濃縮，藉由使用Biotage Isolera（100 g KP-Sil，0-50%EtOAc/環己烷）之管柱層析法純化殘渣而獲得化合物31（4.567 g）。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm: 2.01 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 4.14-4.23 (m, 2H), 4.28 (dd, J = 12.47, 4.77Hz, 1H), 5.38-5.43 (m, 2H), 5.47 (br s, 1H), 6.28 (s, 1H), 8.79(s, 1H)
化合物33之合成 [化59]
Figure 02_image121
將化合物31（2.45 g，4.96 mmol）及N-Cbz-6-胺基-己烷-1-醇（1.87 g，7.45 mmol）之DCM（90 mL）溶液冷卻為2°C（內部溫度），於氮氣環境下滴加三氟化硼合二乙醚（0.126 mL，0.993 mmol）。將所獲得之混合物於2°C攪拌25分鐘，繼而於室溫下攪拌1小時20分鐘。於混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液進行萃取，利用DCM萃取水層。利用飽和食鹽水洗淨合併之有機層，利用疏水性濾紙加以過濾，並於減壓下進行濃縮。藉由使用Biotage Isolera（100 g KP-Sil，0-100%EtOAc/環己烷）之管柱層析法純化殘渣而獲得化合物33（1.37 g）。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm: 1.32-1.43 (m, 4H), 1.49-1.53 (m, 2H), 1.56-1.64 (m, 2H), 1.99 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 3.20 (q, J = 6.72Hz, 2H), 3.40-3.48 (m, 1H), 3.64-3.71 (m, 1H), 3.97 (ddd, J = 9.90, 5.32, 2.38Hz, 1H), 4.08-4.12 (m, 1H), 4.28 (dd, J = 12.29, 5.32Hz, 1H), 4.79 (d, J = 1.47Hz, 2H), 5.10 (s, 2H), 5.22 (dd, J = 3.30, 1.83Hz, 1H), 5.28 (t, J = 9.54Hz, 1H), 5.34 (dd, J = 10.64, 3.67Hz, 1H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.36 (d, J = 4.03Hz, 4H)
化合物34之合成 [化60]
Figure 02_image123
於氮氣環境下向化合物33（1.35 g，2.31 mmol）之IMS（38 mL）溶液中添加10%鈀-碳（0.293 g，50%含水品），於氫氣環境下在室溫下攪拌1.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。於濾液中添加4 N氯化氫之1,4-二噁烷溶液（0.78 mL，3.12 mmol），於減壓下進行濃縮而獲得化合物34（1.06 g）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.30-1.37 (m, 4H), 1.51-1.61 (m, 4H), 1.94 (s, 3H), 2.03 (s, 6H), 2.11 (s, 3H), 2.72-2.80 (m, 2H), 3.42-3.50 (m, 1H), 3.63 (dt, J = 9.72, 6.88Hz, 1H), 3.88-3.96 (m, 1H), 4.06 (dd, J = 12.10, 2.57Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 12.29, 5.32Hz, 1H), 4.87 (s, 1H), 5.04-5.15 (m, 3H), 7.80 (br s, 3H)
化合物35之合成 [化61]
Figure 02_image125
於化合物34（510 mg，1.05 mmol）及化合物25（128.4 mg，0.21 mmol）之DMF（3 mL）溶液中依序添加HOBt（161 mg，1.05 mmol）及EDCI（202 mg，1.05 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌10分鐘，繼而添加DIPEA（0.18 mL，1.05 mmol）。將所獲得之溶液於室溫下攪拌22小時。追加化合物34（505.9 mg，1.04 mmol）之DMF（1.5 mL）溶液、HOBt（161 mg，1.05 mmol）及EDCI（202 mg，1.05 mmol），10分鐘後添加DIPEA（0.18 mL，1.05 mmol）。將混合物進一步攪拌3小時。藉由製備型HPLC純化混合物而獲得化合物34（46.3 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.21-1.45 (m, 24H), 1.49-1.59 (m, 8H), 1.61-1.89 (m, 8H), 1.93 (s, 12H), 2.01 (s, 24H), 2.10 (s, 12H), 2.07-2.23 (m, 8H), 2.33-2.37 (m, 2H), 2.96-3.08 (m, 7H), 3.41-3.48 (m, 4H), 3.57-3.65 (m, 4H), 3.88-3.94 (m, 4H), 4.05 (dd, J = 12.10, 1.83Hz, 4H), 4.10-4.20 (m, 8H), 4.85 (s, 4H), 5.06-5.13 (m, 14H), 7.31-7.40 (m, 6H), 7.69-7.94 (m, 6H); LCMS (ESI+): m/z 1164.58 [M＋2H]2+ 。
化合物36之合成 [化62]
Figure 02_image127
於氮氣環境下向化合物35（40.7 mg，0.02 mmol）之IMS（6 mL）溶液中添加10%鈀-碳（11.5 mg，50%含水品），於氫氣環境下在室溫下攪拌2小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。將合併之濾液於減壓下進行濃縮而獲得化合物36（43.8 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.20-1.44 (m, 24H), 1.51-1.60 (m, 8H), 1.61-1.88 (m, 8H), 1.93 (s, 12H), 2.02 (s, 12H), 2.02 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.27 (m, 10H), 2.96-3.08 (m, 7H), 3.41-3.48 (m, 4H), 3.58-3.65 (m, 4H), 3.88-3.94 (m, 4H), 4.04 (br d, J = 10.27Hz, 4H), 4.09-4.29 (m, 8H), 4.85 (s, 4H), 5.04-5.14 (m, 12H), 7.71-8.01 (br m, 7H)
化合物37之合成 [化63]
Figure 02_image129
於化合物36（32.8 mg，0.015 mmol）之DMF（3 mL）溶液中添加三甲胺（16.3 μL，0.12 mmol），繼而滴加三氟乙酸五氟苯酯（10.0 μL，0.06 mmol），將所獲得之混合物於室溫下攪拌1.25小時。將反應混合物注入至水中，並添加飽和食鹽水，並利用EtOAc進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉水溶液、1 M硫酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水依序洗淨有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，於減壓下進行濃縮。利用戊烷濕磨殘渣。繼而，將固體於40°C減壓乾燥而獲得化合物37（36.7 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.20-1.47 (m, 24H), 1.51-1.61 (m, 8H), 1.62-1.91 (m, 8H), 1.93 (s, 12H), 2.01 (s, 24H), 2.10 (s, 12H), 2.12-2.33 (m, 8H), 2.80 (br t, J = 6.79Hz, 2H), 2.96-3.09 (m, 7H), 3.41-3.50 (m, 4H), 3.58-3.65 (m, 4H), 3.91 (br s, 4H), 4.04 (br d, J = 12.10Hz, 4H), 4.10-4.28 (m, 8H), 4.85 (br s, 4H), 5.06-5.15 (m, 12H), 7.68-8.03 (m, 7H); LCMS (ESI+): m/z 1202.46 [M＋2H]2+ 。
化合物44之合成流程 [化64]
Figure 02_image131
化合物39之合成 [化65]
Figure 02_image133
於氬氣下稱量無水氯化鋅（3.65 g，26.8 mmol）於250 mL之三口燒瓶中。將燒瓶於減壓下在110°C乾燥1小時，繼而於減壓下放置冷卻一晚。繼而，使燒瓶充滿氬氣，添加三乙酸(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-哌喃-2,4,5-三基酯（7.85 g，20.2 mmol）、N-Cbz-6-胺基-己烷-1-醇（6.74 g，26.8 mmol）及DCE（85 mL）。將混合物於氬氣下在70°C（外部溫度）加熱3小時後，將混合物冷卻，繼而利用乙酸乙酯及飽和碳酸氫鈉水溶液進行稀釋。將混合物攪拌20分鐘，利用矽藻土（註冊商標）進行過濾，並利用乙酸乙酯洗淨。分配合併之濾液，利用水、繼而利用飽和食鹽水洗淨有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，於減壓下進行濃縮。藉由使用CombiFlash之管柱層析法（330 g PuriFlash Si，20-100%EtOAc/環己烷）純化殘渣而獲得化合物39（9.42 g）。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ ppm: 1.30-1.43 (m, 4H), 1.45-1.65 (m, 4H), 1.94 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 3.12-3.29 (m, 2H), 3.48 (dt, J = 9.63, 6.50Hz, 1H), 3.79-4.02 (m, 3H), 4.06-4.21 (m, 2H), 4.65 (br d, J = 8.19Hz, 1H), 4.78-4.93 (m, 1H), 5.06-5.18 (m, 2H), 5.27 (dd, J = 11.25, 3.06Hz, 1H), 5.34 (d, J = 2.81Hz, 1H), 5.77 (br d, J = 8.44Hz, 1H), 7.29-7.42 (m, 5H) LCMS (m/z 581 [M＋H]+ )
化合物40之合成 [化66]
Figure 02_image135
於氮氣環境下向化合物39（9.23 g，15.9 mmol）之IMS（275 mL）溶液中添加4 M氯化氫之二噁烷溶液（5.17 mL，20.7 mmol）及10%鈀-碳（1.895 g，50%含水品），於氫氣環境下在室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物40（8.07 g）。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.22-1.35 (m, 4H), 1.39-1.62 (m, 4H), 1.78 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 2.69-2.82 (m, 2H), 3.41-3.47 (m, 2H), 3.64-3.77 (m, 1H), 3.81-3.93 (m, 1H), 3.95-4.12 (m, 2H), 4.49 (d, J = 8.56Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 11.25, 3.42Hz, 1H), 5.22 (d, J = 3.42Hz, 1H), 7.62-7.80 (m, 3H), 7.86 (d, J = 9.29Hz, 1H) LCMS (m/z 447 [M＋H]+ )
化合物41之合成 [化67]
Figure 02_image137
於250 mL之Quickfit（註冊商標）三角燒瓶中之CTC樹脂（1.33 mmol/g，1.31 g，1.74 mmol）、Fmoc-Glu(OtBu)-OH（0.370 g，0.87 mmol）、Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH（0.370 g，0.87 mmol）及DCM（105 mL）之混合物中滴加DIPEA（1.215 mL，6.96 mmol）。塞住燒瓶，安裝於盤式振盪器，以300 rpm振盪2小時。添加MeOH（0.7 mL，17.3 mmol），將混合物進一步振盪35分鐘。利用70 mL塑膠相分離筒過濾混合物，通入氮氣並利用20%哌啶之DMF溶液（50 mL）處理30分鐘。排出溶液，利用DMF洗淨樹脂。 於筒中之樹脂中添加Fmoc-D-Glu-OtBu（0.740 g，1.74 mmol）、N-Fmoc-L-麩胺酸-1-第三丁酯（0.740 g，1.74 mmol）及HBTU（1.253 g，3.30 mmol）之DMF（10 mL）溶液，繼而滴加DIPEA（1.22 mL，6.96 mmol）。對混合物通入氮氣並混合1小時。繼而，利用氮氣氣流將溶液之溶劑去除，藉由通入氮氣混合樹脂，並利用20%哌啶DMF（50 mL）溶液處理35分鐘。排出溶液，利用DMF洗淨樹脂。 於筒中之剩餘之樹脂中滴加1,5-戊二酸單苄基酯（0.580 g，2.61 mmol）及HBTU（1.253 g，3.30 mmol）之DMF（10 mL）溶液，繼而滴加DIPEA（1.215 mL，6.96 mmol）。對混合物通入氮氣80分鐘進行混合。排出溶液，利用DMF、繼而利用MeOH洗淨樹脂。繼而，將樹脂進行抽吸乾燥。將樹脂轉移至25×150 mm試管中，減壓乾燥30分鐘後，利用DCM（5 mL）及TFA（5 mL）進行處理，並利用盤式振盪器振盪2小時。繼而，將混合物通過相分離筒進行過濾，並利用DCM洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物41（0.5859 g）。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.68-1.84 (m, 4H), 1.86-2.01 (m, 2H), 2.13-2.23 (m, 4H), 2.23-2.29 (m, 2H), 2.38 (t, J = 7.52Hz, 2H), 4.11-4.22 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 7.29-7.42 (m, 5H), 8.06-8.17 (m, 2H) LCMS (m/z 481 [M＋H]+ )
化合物42之合成 [化68]
Figure 02_image139
於化合物40（4.06 g，8.41 mmol）及化合物41（0.5821 g，1.21 mmol）之DMF（8 mL）溶液中依序添加HOBt（1.392 g，9.09 mmol）、EDCI（1.742 g，9.09 mmol），繼而添加DIPEA（1.587 mL，9.09 mmol）。將混合物於室溫下攪拌20小時。藉由製備型HPLC純化混合物而獲得化合物42（0.48 g）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.23 (br s, 12H), 1.29-1.40 (m, 6H), 1.40-1.48 (m, 6H), 1.60-1.71 (m, 2H), 1.76 (s, 9H), 1.76-1.87 (m, 4H), 1.89 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.00-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.15 (m, 2H), 2.18 (br t, J = 7.15Hz, 2H), 2.34-2.38 (m, 2H), 2.94-3.07 (m, 6H), 3.36-3.43 (m, 3H), 3.65-3.73 (m, 3H), 3.82-3.91 (m, 3H), 3.98-4.06 (m, 9H), 4.10-4.20 (m, 2H), 4.48 (d, J = 8.44Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.19, 3.12Hz, 3H), 5.08 (s, 2H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.71-7.76 (m, 1H), 7.77-7.85 (m, 5H), 7.87-7.93 (m, 2H) LCMS (m/z 1766 [M＋H]+ )
化合物43之合成 [化69]
Figure 02_image141
於氮氣環境下向化合物42（0.43 g，0.243 mmol）之IMS（85 mL）溶液中添加10%鈀-碳（0.158 g，0.074 mmol，50%含水品），於氫氣環境下在室溫下攪拌2.75小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。於減壓下濃縮濾液，將殘渣溶解於DCM/EtOH（2 : 1）中，利用矽藻土（註冊商標）過濾，並利用DCM-EtOH（2 : 1）洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物43（0.4252 g）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.18-1.29 (m, 12H), 1.31-1.41 (m, 6H), 1.41-1.49 (m, 6H), 1.62-1.75 (m, 4H), 1.77 (s, 9H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.01-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.24 (m, 6H), 2.95-3.07 (m, 6H), 3.37-3.45 (m, 3H), 3.66-3.73 (m, 3H), 3.82-3.92 (m, 3H), 3.98-4.06 (m, 9H), 4.09-4.20 (m, 2H), 4.49 (d, J = 8.44Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.19, 2.38Hz, 3H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.73-8.04 (m, 8H), 11.81-12.20 (m, 1H)。 LCMS (m/z 1676 [M＋H]+ )。
化合物44之合成 [化70]
Figure 02_image143
於氮氣環境下向化合物43（0.4239 g，0.253 mmol）之DMF（50 mL）溶液中滴加三乙胺（0.282 mL，2.024 mmol），繼而滴加三氟乙酸五氟苯酯（0.174 mL，1.012 mmol）。將混合物於室溫下攪拌1小時，注入至水中。於水層中添加飽和食鹽水，並利用EtOAc進行萃取。依序利用飽和碳酸氫鈉水溶液、1 M硫酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨合併之有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，繼而於減壓下進行濃縮，於所獲得之殘渣中添加EtOAc，利用1 M硫酸氫鈉水溶液、繼而利用飽和食鹽水進行洗淨。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，於減壓下濃縮，藉此獲得化合物44（0.4513 g）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 )δ ppm: 1.24 (br s, 12H), 1.31-1.40 (m, 6H), 1.41-1.48 (m, 6H), 1.61-1.73 (m, 2H), 1.76 (s, 9H), 1.79-1.93 (m, 13H), 1.99 (s, 9H), 2.01-2.06 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.18 (m, 2H), 2.27 (br t, J = 7.34Hz, 2H), 2.80 (t, J = 6.97Hz, 2H), 2.96-3.07 (m, 6H), 3.37-3.43 (m, 3H), 3.69 (dt, J = 9.63, 6.19Hz, 3H), 3.82-3.91 (m, 3H), 3.98-4.06 (m, 9H), 4.09-4.22 (m, 2H), 4.48 (d, J = 8.44Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.37, 3.30Hz, 3H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.73 (br t, J = 5.14Hz, 1H), 7.77-7.85 (m, 5H), 7.91 (br dd, J = 11.19, 7.89Hz, 1H), 7.98 (br d, J = 8.07Hz, 1H) LCMS (m/z 1843.56 [M＋H]+ )
化合物47之合成流程 [化71]
Figure 02_image145
化合物45之合成 [化72]
Figure 02_image147
於化合物34（1383 mg，2.86 mmol）及化合物41（183.1 mg，0.381 mmol）之DMF（3.0 mL）溶液中依序添加HOBt（438 mg，2.86 mmol）、EDCI（548 mg，2.86 mmol）及DIPEA（0.50 mL，2.86 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌24小時。藉由製備型HPLC純化混合物而獲得化合物45（133.4 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.23-1.34 (m, 12H), 1.34-1.43 (m, 6H), 1.50-1.59 (m, 6H), 1.62-1.72 (m, 2H), 1.74-1.80 (m, 2H), 1.81-1.89 (m, 2H), 1.93 (s, 9H), 2.01 (s, 18H), 2.03-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.15 (m, 2H), 2.16-2.21 (m, 2H), 2.33-2.38 (m, 2H), 2.97-3.07 (m, 6H), 3.41-3.48 (m, 3H), 3.57-3.64 (m, 3H), 3.87-3.94 (m, 3H), 4.05 (dd, J = 12.10, 2.57Hz, 3H), 4.10-4.19 (m, 5H), 4.85 (s, 3H), 5.0-5.13 (m, 11H), 7.29-7.39 (m, 5H), 7.71 (br t, J = 4.95Hz, 1H), 7.76-7.84 (m, 2H), 7.85-7.91 (m, 2H) LCMS (m/z 1769 [M＋H]+ )
化合物46之合成 [化73]
Figure 02_image149
於氮氣環境下向化合物45（101.9 mg，0.058 mmol）之IMS（20 mL）溶液添加10%鈀-碳（37.4 mg，50%含水品）。於氫氣環境下將混合物於室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，繼而利用IMS洗淨。將合併之濾液於減壓下濃縮而獲得化合物46（95.9 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.28 (br s, 12H), 1.34-1.44 (m, 6H), 1.49-1.60 (m, 6H), 1.61-1.76 (m, 4H), 1.81-1.90 (m, 2H), 1.93 (s, 9H), 2.02 (s, 9H), 2.02 (s, 9H), 2.04-2.08 (m,2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.23 (m, 6H), 2.96-3.07 (m, 6H), 3.40-3.48 (m, 3H), 3.57-3.65 (m, 3H), 3.86-3.94 (m, 3H), 4.05 (dd, J = 12.10, 2.38Hz, 3H), 4.09-4.18 (m, 5H), 4.85 (s, 3H), 5.01-5.14 (m, 9H), 7.62-8.17 (m, 5H), 11.84-12.15 (m, 1H)。 LCMS (m/z 1679 [M＋H]+ )。
化合物47之合成 [化74]
Figure 02_image151
於氮氣環境下向化合物46（94.6 mg，0.056 mmol）之DMF（9 mL）溶液中添加三乙胺（62.8 μL，0.451 mmol），並滴加三氟乙酸五氟苯酯（38.7 μL，0.225 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌1小時。將混合物注入至水中，並添加飽和食鹽水，並利用EtOAc進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉水溶液、1 M硫酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水依序洗淨合併之有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，繼而於減壓下進行濃縮，藉此獲得化合物47（109.0 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.23-1.33 (m, 12H), 1.34-1.43 (m, 6H), 1.50-1.60 (m, 6H), 1.62-1.77 (m, 2H), 1.80-1.91 (m, 4H), 1.93 (s, 9H), 2.01 (s, 18H), 2.03-2.07 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.20 (m, 2H), 2.25-2.30 (m, 2H), 2.77-2.82 (m, 2H), 2.96-3.08 (m, 6H), 3.41-3.48 (m, 3H), 3.53-3.68 (m, 3H), 3.86-3.95 (m, 3H), 4.00-4.07 (m, 3H), 4.10-4.23 (m, 5H), 4.85 (s, 3H) 5.04-5.13 (m, 9H), 7.71 (br t, J = 5.32Hz, 1H), 7.78-7.85 (m, 2H), 7.89 (dd, J = 12.84, 8.07Hz, 1H), 7.96 (d, J = 8.07Hz, 1H) LCMS (m/z 1845.47 [M＋H]+ )
化合物53a、53b及53c之合成流程 [化75]
Figure 02_image153
化合物49a之合成 [化76]
Figure 02_image155
將裝入50 mL之三口燒瓶中之氯化鋅（285 mg，2.09 mmol）於減壓下在110°C乾燥1小時，於減壓下放置冷卻一晚。對燒瓶進行氮氣置換，添加化合物38（611 mg，1.57 mmol）及化合物48a（500 mg，2.09 mmol）之DCE（5 mL）溶液。於氮氣環境下在70°C（外部溫度）將混合物加熱3小時。將混合物放置冷卻，利用乙酸乙酯（10 mL）/飽和碳酸氫鈉水溶液（5 mL）加以稀釋。將混合物攪拌10分鐘，利用矽藻土（註冊商標）過濾，並利用乙酸乙酯洗淨。利用水及飽和食鹽水洗淨合併之濾液。利用疏水性濾紙過濾有機層，並於減壓下進行濃縮。藉由使用Biotage Isolera（50 g KP-Sil，0-50%（3 : 1 EtOAc-IMS）/MTBE）之管柱層析法純化殘渣，藉此獲得化合物49a（599.4 mg）。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm: 1.90 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 3.26-3.86 (m, 8H), 3.87-4.00 (m, 2H), 4.05-4.19 (m, 2H), 4.76 (br d, J = 7.70Hz, 1H), 5.10-5.20 (m, 2H), 5.26 (br dd, J = 6.60, 3.30Hz, 1H), 5.32 (br s, 1H), 5.43 (br s, 1H), 5.75 (br d, J = 7.34Hz, 1H), 7.28-7.42 (m, 5H)。 LCMS (m/z 569 [M＋H]+ )。
化合物50a之合成 [化77]
Figure 02_image157
於氮氣環境下向化合物49a（594.2 mg，1.05 mmol）之IMS（18 mL）溶液中添加4 M氯化氫之1,4-二噁烷溶液（0.34 mL，1.36 mmol）及10%鈀-碳（50%含水品，125 mg）。於氫氣環境下將混合物在室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。將合併之濾液於減壓下濃縮，藉此獲得化合物50a（507.9 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.77-1.84 (m, 3H), 1.86-1.92 (m, 3H), 1.97-2.03 (m, 3H), 2.06-2.13 (m, 3H), 2.92-3.00 (m, 2H), 3.52-3.75 (m, 5H), 3.83 (ddd, J = 11.28, 5.41, 3.85Hz, 1H), 3.86-3.93 (m, 1H), 3.95-4.17 (m, 3H), 4.57 (d, J = 8.44Hz 1H), 4.99 (dd, J = 11.19, 3.48Hz, 1H), 5.23 (d, J = 3.67Hz, 1H), 7.81 (br s, 3H), 7.85-7.92 (m, 1H) LCMS (m/z 435 [M＋H]+ )
化合物51a之合成 [化78]
Figure 02_image159
於化合物50a（506.5 mg，1.08 mmol）及化合物41（68.9 mg，0.14 mmol）之DMF（2.0 mL）溶液中依序添加HOBt（165 mg，1.08 mmol）、EDCI（206 mg，1.08 mmol）及DIPEA（188 μL，1.08 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌20小時。藉由製備型HPLC純化混合物，藉此獲得化合物51a（40.0 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.62-1.73 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.80-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.02-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.24 (m, 4H), 2.34-2.38 (m, 2H), 3.13-3.22 (m, 4H), 3.34-3.42 (m, 7H), 3.44-3.54 (m, 7H), 3.55-3.61 (m, 3H), 3.73-3.80 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 3.97-4.08 (m, 9H), 4.13-4.25 (m, 2H), 4.55 (dd, J = 8.07, 3.67Hz, 3H), 4.99 (br d, J = 11.00Hz, 3H), 5.07-5.10 (m, 2H), 5.22 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.31-7.40 (m, 5H), 7.60-7.97 (m, 8H) LCMS (m/z 1730/1731 [M＋H]+ )
化合物52a之合成 [化79]
Figure 02_image161
於氮氣環境下向化合物51a（42.7 mg，0.03 mmol）之IMS（8 mL）溶液中添加10%鈀-碳（50%含水品，16.0 mg）。於氫氣環境下將混合物於室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物52a（41.2 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.62-1.75 (m, 4H), 1.78 (s, 9H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.05-2.32 (m, 17H), 3.12-3.23 (m, 4H), 3.36-3.43 (m, 7H), 3.45-3.54 (m, 7H), 3.55-3.61 (m, 3H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.83-3.92 (m, 3H), 3.98-4.08 (m, 9H), 4.11-4.23 (m, 2H), 4.51-4.59 (m, 3H), 4.99 (br d, J = 11.00Hz, 3H), 5.22 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.62-8.04 (m, 8H) LCMS (m/z 1640/1641 [M＋H]+ )
化合物53a之合成 [化80]
Figure 02_image163
於氮氣環境下向化合物52a（41.6 mg，0.03 mmol）之DMF（4 mL）溶液中滴加三乙胺（28 μL，0.20 mmol），繼而滴加三氟乙酸五氟苯酯（17 μL，0.10 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌1.5小時，注入至水中，添加飽和食鹽水，並利用EtOAc進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉水溶液、1 M硫酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水依序洗淨合併之有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，於減壓下進行濃縮。將殘渣轉移至裝有DCM/MeOH之樣品瓶中，蒸發溶劑後，於40°C減壓乾燥2小時，藉此獲得化合物52c（27.1 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.57-1.75 (m, 4H), 1.77 (s, 9H), 1.86-1.95 (m, 11H), 2.00 (s, 9H), 2.05-2.33 (m, 15H), 2.77-2.88 (m, 2H), 3.11-3.24 (m, 4H), 3.41-3.54 (m, 14H), 3.55-3.62 (m, 3H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 3.98-4.07 (m, 9H), 4.11-4.23 (m, 2H), 4.55 (br dd, J = 8.07, 3.67Hz, 3H), 4.99 (br d, J = 11.00Hz, 3H), 5.22 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.65-8.04 (m, 8H) LCMS (m/z 1806.83 [M＋H]+ )
化合物49b之合成 [化81]
Figure 02_image165
將裝入50 mL之三口燒瓶中之氯化鋅（0.466 g，3.42 mmol）於減壓下在110°C乾燥95分鐘，於減壓下放置冷卻一晚。對燒瓶進行氮氣置換，並添加化合物38（1.00 g，2.57 mmol）及化合物48b（0.97 g，3.42 mmol）之DCE（10 mL）溶液。於氮氣環境下在70°C（外部溫度）將混合物加熱3小時。將混合物放置冷卻，利用乙酸乙酯（20 mL）/飽和碳酸氫鈉水溶液（10 mL）加以稀釋。將混合物攪拌15分鐘，利用矽藻土（註冊商標）過濾，並利用乙酸乙酯洗淨。利用水及飽和食鹽水洗淨濾液。利用疏水性濾紙過濾有機層，並於減壓下進行濃縮。藉由使用Biotage Isolera（100 g Sfar Duo Si，0-50%（3 : 1 EtOAc-IMS）/MTBE）之管柱層析法純化殘渣，藉此獲得化合物49b（1.14 g）。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δppm: 1.92 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 3.32-3.50 (m, 2H), 3.53-3.73 (m, 8H), 3.77-3.94 (m, 3H), 4.02-4.22 (m, 3H), 4.74 (br d, J = 8.44Hz, 1H), 5.03-5.08 (m, 1H), 5.11 (br s, 2H), 5.26 (br s, 1H), 5.40-5.53 (m, 1H), 6.11-6.21 (m, 1H), 7.30-7.40 (m, 5H)。 LCMS (m/z 613 [M＋H]+ )。
化合物50b之合成 [化82]
Figure 02_image167
於氮氣環境下向化合物49b（1.14 g，1.86 mmol）之IMS（32 mL）溶液中添加4 M氯化氫之1,4-二噁烷（0.60 mL，2.42 mmol）溶液及10%鈀-碳（50%含水品，0.221 g）。於氫氣環境下將混合物在室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。將合併之濾液於減壓下濃縮而獲得化合物50b（0.97 g）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.79 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 2.00 (s, 3H,) 2.11 (s, 3H), 2.94-3.02 (m, 2H), 3.50-3.62 (m, 9H), 3.77-3.84 (m, 1H), 3.86-3.94 (m, 1H), 3.98-4.10 (m, 3H), 4.54 (d, J = 8.44Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 11.19, 3.48Hz, 1H), 5.22 (d, J = 3.67Hz, 1H), 7.70-7.93 (m, 4H) LCMS (m/z 479 [M＋H]+ )
化合物51b之合成 [化83]
Figure 02_image169
於化合物50b（556 mg，1.08 mmol）及化合物41（74.1 mg，0.15 mmol）之DMF（3 mL）溶液中依序添加HOBt（165 mg，1.08 mmol）、EDCI（207 mg，1.08 mmol）、及DIPEA（189 μL，1.08 mmol）。於室溫下將所獲得之混合物攪拌19小時。藉由製備型HPLC純化混合物，藉此獲得化合物51b（67.5 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.61-1.74 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.80-1.85 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.03-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.24 (m, 4H), 2.35-2.38 (m, 2H), 3.10-3.23 (m, 4H), 3.36-3.42 (m, 7H), 3.44-3.63 (m, 22H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.83-3.91 (m, 3H), 3.99-4.08 (m, 9H), 4.13-4.25 (m, 2H), 4.55 (d, J = 8.44Hz, 3H), 4.95-5.00 (m, 3H), 5.09 (s, 2H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.31-7.41 (m, 5H), 7.72-7.86 (m, 4H), 7.86-7.99 (m, 4H) LCMS (m/z 1862/1863 [M＋H]+ )
化合物52b之合成 [化84]
Figure 02_image171
於氮氣環境下向化合物51b（66.1 mg，0.04 mmol）之IMS（13 mL）溶液中添加10%鈀-碳（50%含水品，23.1 mg）。於氫氣環境下將混合物於室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。將合併之濾液於減壓下濃縮而獲得化合物52b（61.3 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.63-1.75 (m, 4H), 1.77 (s, 9H), 1.81-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H),2.00 (s, 9H), 2.03-2.24 (m, 17H), 3.09-3.23 (m, 4H), 3.35-3.43 (m, 7H), 3.44-3.64 (m, 22H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 3.98-4.07 (m, 9H), 4.10-4.24 (m, 2H), 4.56 (br d, J = 8.80Hz, 3H), 4.98 (br d, J = 11.00Hz, 3H), 5.22 (d, J = 2.93Hz, 3H), 7.70-8.06 (m, 8H)。 LCMS (m/z 1772/1773 [M＋H]+ )
化合物53b之合成 [化85]
Figure 02_image173
於氮氣環境下向化合物52b（60.7 mg，0.03 mmol）之DMF（6 mL）溶液中滴加三乙胺（38 μL，0.27 mmol），繼而滴加三氟乙酸五氟苯酯（24 μL，0.14 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌77分鐘，注入至水中，添加飽和食鹽水，並利用EtOAc進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉水溶液、1 M硫酸氫鈉水溶液、4%氯化鋰水溶液及飽和食鹽水依序洗淨合併之有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，繼而進行濃縮，於40°C減壓乾燥4小時，藉此獲得化合物53b（29.3 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.62-1.75 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.85-1.95 (m, 13H), 2.00 (s, 9H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.33 (m, 6H), 2.78-2.86 (m, 2H), 3.12-3.24 (m, 4H), 3.35-3.44 (m, 7H), 3.45-3.64 (m, 22H), 3.75-3.81 (m, 3H), 3.83-3.92 (m, 3H), 3.99-4.06 (m, 9H), 4.12-4.26 (m, 2H), 4.55 (d, J = 8.44Hz, 3H), 4.98 (dd, J = 11.19, 2.02Hz, 3H), 5.21 (d, J = 3.67Hz, 3H), 7.64-8.03 (m, 8H) LCMS (m/z 1939.01 [M＋H]+ )
化合物49c之合成 [化86]
Figure 02_image175
將裝入50 mL之三口燒瓶中之氯化鋅（210 mg，1.54 mmol）於減壓下在110°C乾燥75分鐘，於減壓下放置冷卻一晚。對燒瓶進行氮氣置換，添加化合物38（450.2 mg，1.16 mmol）及化合物48c（503.4 mg，1.54 mmol）之DCE（5 mL）溶液。於氬氣環境下將混合物在70°C（外部溫度）加熱3小時。將混合物放置冷卻，利用乙酸乙酯（10 mL）/飽和碳酸氫鈉水溶液（5 mL）加以稀釋。將混合物攪拌15分鐘，利用矽藻土（註冊商標）過濾，並利用乙酸乙酯洗淨。利用水及飽和食鹽水洗淨濾液。利用疏水性濾紙過濾有機層，並於減壓下進行濃縮。藉由使用Biotage Isolera（50 g Sfar Si，0-50%（3 : 1 EtOAc-IMS）/MTBE）之管柱層析法純化殘渣，藉此獲得化合物49c（469.0 mg）。1 H NMR (600 MHz, CDCl3 ) δ ppm: 1.95 (s, 3H), 1.96 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 3.39 (br d, J = 4.77Hz, 2H), 3.52-3.72 (m, 12H), 3.79-3.94 (m, 3H), 4.09-4.14 (m, 1H), 4.14-4.18 (m, 1H), 4.18-4.25 (m, 1H), 4.77 (br d, J = 8.44Hz, 1H), 4.98-5.06 (m, 1H), 5.10 (br s, 2H), 5.31 (br s, 1H), 5.34-5.45 (m, 1H), 6.29-6.39 (m, 1H), 7.29-7.33 (m, 1H), 7.36 (d, J = 4.40Hz, 4H) LCMS (m/z 657 [M＋H]+ )
化合物50c之合成 [化87]
Figure 02_image177
於氮氣環境下向化合物49c（0.45 g，0.69 mmol）之IMS（12 mL）溶液中添加4 M氯化氫之1,4-二噁烷溶液（225 μL，0.90 mmol）及10%鈀-碳（50%含水品，0.083 g）。於氫氣環境下將混合物在室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物50c（0.40 g）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.78 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.94-3.01 (m, 2H), 3.48-3.62 (m, 13H), 3.76-3.82 (m, 1H), 3.85-3.93 (m, 1H), 3.99-4.08 (m, 3H), 4.55 (d, J = 8.44Hz, 1H), 4.94-5.01 (m, 1H), 5.22 (d, J = 3.67Hz, 1H), 7.75-7.88 (m, 4H) LCMS (m/z 423 [M＋H]+ )
化合物51c之合成 [化88]
Figure 02_image179
於化合物50c（379.8 mg，0.679 mmol）及化合物41（47.2 mg，0.10 mmol）之DMF（2 mL）溶液中依序添加HOBt（104 mg，0.68 mmol）、EDCI（130 mg，0.68 mmol）及DIPEA（119 μL，0.68 mmol）。於室溫下將所獲得之混合物攪拌19小時。藉由製備型HPLC純化混合物，藉此獲得化合物51c（53.8 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.61-1.73 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.79-1.85 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.03-2.08 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.22 (m, 4H), 2.33-2.37 (m, 2H), 3.07-3.23 (m, 4H), 3.34-3.42 (m, 7H), 3.43-3.55 (m, 30H), 3.55-3.62 (m, 4H), 3.75-3.81 (m, 3H), 3.85-3.92 (m, 3H), 3.99-4.07 (m, 9H), 4.13-4.24 (m, 2H), 4.56 (d, J = 8.80Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.00, 3.30Hz, 3H), 5.06-5.11 (m, 2H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.30-7.39 (m, 5H), 7.62-7.84 (m, 5H), 7.85-7.95 (m, 3H) LCMS (m/z 1994/1995 [M＋H]+ )
化合物52c之合成 [化89]
Figure 02_image181
於氮氣環境下向化合物51c（84 mg，0.04 mmol）之IMS（17 mL）溶液中添加10%鈀-碳（50%含水品，27.3 mg）。於氫氣環境下將混合物於室溫下攪拌2.5小時。利用矽藻土（註冊商標）過濾混合物，並利用IMS洗淨。於減壓下濃縮濾液而獲得化合物52c（78.9 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm 1.60-1.75 (m, 4H), 1.78 (s, 9H), 1.80-1.87 (m, 2H), 1.89 (s, 9H), 2.00 (s, 9H), 2.03-2.32 (m, 17H), 3.12-3.23 (m, 4H), 3.36-3.42 (m, 7H), 3.43-3.63 (m, 34H), 3.74-3.81 (m, 3H), 3.84-3.92 (m, 3H), 3.99-4.07 (m, 9H), 4.09-4.22 (m, 2H), 4.57 (br d, J = 8.44Hz, 3H), 4.98 (dd, J = 11.19, 3.12Hz, 3H), 5.21 (d, J = 3.30Hz, 3H), 7.61-8.05 (m, 8H), 12.01 (br s, 1H) LCMS (m/z 1904/1905 [M＋H]+ )
化合物53c之合成 [化90]
Figure 02_image183
於氮氣環境下向化合物52c（77.3 mg，0.04 mmol）之DMF（3 mL）溶液中滴加三乙胺（45 μL，0.33 mmol），繼而滴加三氟乙酸五氟苯酯（27 μL，0.16 mmol）。將所獲得之混合物於室溫下攪拌1.5小時，注入至水中，添加飽和食鹽水，繼而利用EtOAc進行萃取。利用飽和碳酸氫鈉水溶液、1 M硫酸氫鈉水溶液、繼而利用飽和食鹽水依序洗淨有機層。利用無水硫酸鈉使有機層乾燥並進行過濾，繼而於減壓下進行濃縮。將殘渣轉移至裝有DCM/MeOH之樣品瓶中，蒸發溶劑後，於40°C減壓乾燥2小時而獲得殘渣。將其溶解於EtOAc（20 mL）中，利用4%氯化鋰水溶液（5 mL）、繼而利用飽和食鹽水（5 mL）進行洗淨，利用無水硫酸鈉加以乾燥並過濾，繼而使其蒸發。將殘渣轉移至裝有EtOAc之樣品瓶中使其蒸發，於40°C減壓乾燥。將DCM添加至殘渣中，於減壓下進行濃縮，將殘渣於40°C減壓乾燥4小時，藉此獲得化合物53c（19.4 mg）。1 H NMR (600 MHz, DMSO-d6 ) δ ppm: 1.59-1.73 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.85-1.95 (m, 13H), 2.00 (s, 9H), 2.10 (s, 9H), 2.12-2.34 (m, 6H), 2.77-2.89 (m, 2H), 3.11-3.23 (m, 4H), 3.35-3.44 (m, 7H), 3.45-3.63 (m, 34H), 3.75-3.80 (m, 3H), 3.84-3.91 (m, 3H), 4.00-4.07 (m, 9H), 4.16-4.26 (m, 2H), 4.56 (d, J = 8.80Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.37, 3.30Hz, 3H), 5.21 (d, J = 3.67Hz, 3H), 7.62-8.03 (m, 8H)。 QC LCMS (m/z 1035.97 [M＋2H]2+ )
實施例9~12：核酸複合體9~12之合成 於B2M（β2-微球蛋白）靶siRNA之正義股（215 nmol）中添加四硼酸鈉緩衝液（pH值為8.5）及溶解於DMSO中之化合物28或44（1000 nmol），於室溫下進行攪拌。於反應液中添加水後，利用Vivaspin 3K（Sartorius公司）進行純化。於所獲得之粗產物中添加5倍量之28%氨水，於室溫下靜置2小時。於反應液中添加水後，利用Vivaspin 3K（Sartorius公司）反覆純化，藉此獲得核酸複合體9~12。藉由ESI-MS或MALDI-TOF-MS進行本實施例中所合成之核酸複合體之分子量。將所使用之正義股之序列、反義股之序列及分子量示於表5。
[表5]
序列名 序列（5’-3’） 理論分子量 測定值
siB2M-s A(F)^G(M)^G(F)A(M)C(F)U(M)G(F)G(M)U(F)C(M)U(F)U(F)U(M)C(F)U(M)A(F)U(M)A(F)U(M)^C(F)^U(M) 6838.5 6838.9
siB2M-s_3’ NH2 A(F)^G(M)^G(F)A(M)C(F)U(M)G(F)G(M)U(F)C(M)U(F)U(F)U(M)C(F)U(M)A(F)U(M)A(F)U(M)^C(F)^U(M)-NH2 7017.7 7018.5
siB2M-s_5’ NH2 NH2-A(F)^G(M)^G(F)A(M)C(F)U(M)G(F)G(M)U(F)C(M)U(F)U(F)U(M)C(F)U(M)A(F)U(M)A(F)U(M)^C(F)^U(M) 7017.7 7018.9
siB2M-s^_3’ NH2 A(F)^G(M)^G(F)A(M)C(F)U(M)G(F)G(M)U(F)C(M)U(F)U(F)U(M)C(F)U(M)A(F)U(M)A(F)U(M)^C(F)^U(M)^-NH2 7033.7 7035.6
siB2M-as A(F)^G(M)^A(F)U(M)A(F)U(M)A(F)G(M)A(F)A(M)A(M)G(F)A(M)C(F)C(M)A(F)G(M)U(F)C(M)C(F)U(M)^U(F)^G(M) 7633.1 7634.3
將核酸複合體之序列及分子量示於表6。
[表6]
化合物 序列（5’-3’） 理論分子量 測定值
核酸複合體9 siB2M-s-化合物28 8728.6 8729.2
核酸複合體10 siB2M-s-化合物44 8297.1 8299.8
核酸複合體11 化合物44-siB2M-s 8297.1 8297.2
核酸複合體12 siB2M-s^-化合物44 8313.2 8311.0
核酸複合體9 [化91]
Figure 02_image185
核酸複合體10 [化92]
Figure 02_image187
核酸複合體11 [化93]
Figure 02_image189
核酸複合體12 [化94]
Figure 02_image191
實施例13~16：核酸複合體13~16（si-RNA）之製備 等莫耳量添加反義股（siB2M-as）與核酸複合體9~12，藉此製備以B2M為靶之si-RNA。於表7中示出si-RNA之正義股及反義股。
[表7]
siRNA 正義股 反義股
siRNA-1 siB2M-s siB2M-as
siRNA-2 （核酸複合體13） 核酸複合體9 siB2M-as
siRNA-3 （核酸複合體14） 核酸複合體10 siB2M-as
siRNA-4 （核酸複合體15） 核酸複合體11 siB2M-as
siRNA-5 （核酸複合體16） 核酸複合體12 siB2M-as
＜試驗例4＞ 將實施例13~16中所製備之核酸複合體（si-RNA）以1.0 mg/kg或5.0 mg/kg皮下投予至BALB/c小鼠（每組3隻），投予起7天後取下肝臟。使用TaqMan探針（Applied Biosystems公司），藉由qPCR（quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶鏈反應）測定肝臟中之B2M及作為內部對照之GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）之mRNA表現量。將無處理組（對照組）之小鼠肝臟中之B2M mRNA表現量設為100%，算出核酸複合體投予組之B2M mRNA表現量（相對值）。將結果示於表8。
[表8]
siRNA 投予量 （mg/kg） B2M mRNA表現量
無處理 - 100%
siRNA-1 5.0 98%
siRNA-2 1.0 35%
siRNA-3 1.0 21%
siRNA-4 1.0 24%
siRNA-5 1.0 24%
siRNA-2 5.0 14%
siRNA-3 5.0 16%
siRNA-4 5.0 13%
siRNA-5 5.0 13%
根據表8所示之結果可知，siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4及siRNA-5表現出用量依賴性之基因表現抑制效果。不含糖配體之siRNA-1於5.0 mg/kg時亦大致未見基因表現抑制效果，與此相對，含有糖配體之siRNA於1.0 mg/kg時亦表現出較高之基因表現抑制效果。
實施例17~19：核酸複合體17~19之合成 使用具有3-10-3結構之Gapmer型LNA反義核酸（ASO；ISIS-549148）作為核酸，並使用化合物44、47或53a，除此以外，藉由與實施例9~11同樣之方法製備核酸複合體。將所使用之正義股之序列、反義股之序列及分子量示於表9。
[表9]
序列名 序列（5’-3’） 理論分子量 測定值
ASO_3’ Cy3 G(L)^G(L)^5(L)^t^a^5(x)^t^a^5(x)^g^5(x)^ 5(x)^g^T(L)^5(L)^A(L)-Cy3 6109.4 6110.4
ASO_5’NH2_3’ Cy3 5’NH2_G(L)^G(L)^5(L)^t^a^5(x)^t^a^5(x)^ g^5(x)^5(x)^g^T(L)^5(L)^A(L)-Cy3 6288.5 6290.8
5(L):LNA 5-甲基胞嘧啶；5(x) = DNA 5-甲基胞嘧啶
將核酸複合體之序列及分子量示於表10。
[表10]
化合物 序列（5’-3’） 理論分子量 測定值
核酸複合體17 化合物44-ASO_3’ Cy3 7569.9 7586.8
核酸複合體18 化合物47-ASO_3’ Cy3 7446.7 7463.5
核酸複合體19 化合物53a-ASO_3’ Cy3 7533.7 7549.2
核酸複合體17 [化95]
Figure 02_image193
核酸複合體18 [化96]
Figure 02_image195
核酸複合體19 [化97]
Figure 02_image197
＜試驗例5＞ 核酸複合體對人CD206表現Lenti-X 293T細胞之活體外吸收活性評估 以與試驗例1同樣之方式進行核酸複合體17~19之評估。於試驗例5中，將添加有未經糖配體修飾之核酸ASO_3’ Cy3之孔的螢光強度設為1，以相對值之形式算出添加有各核酸複合體之孔之螢光強度。
將結果示於表11。根據該結果可知，與不含糖配體之核酸ASO_3’ Cy3相比，含有GalNac之核酸複合體17及19未被有效率地吸收至CD206表現之細胞中，另一方面，含有甘露糖之核酸複合體18被有效率地吸收至CD206表現之細胞中。
[表11]
檢體編號 ASO_3’ Cy3 核酸複合體
17 18 19
配體 - GalNac 甘露糖 GalNac
螢光強度之相對值（ASO_3’ Cy3 = 1.0） 1.0 1.1 15.8 1.0
＜試驗例6＞ 核酸複合體對人ASGR1表現Lenti-X293T細胞之活體外吸收活性評估 以與試驗例2同樣之方式進行核酸複合體17~19之評估。於試驗例6中，將添加有未經糖配體修飾之核酸ASO_3’ Cy3之孔的螢光強度設為1，以相對值之形式算出添加有各核酸複合體之孔之螢光強度。
將結果示於表12。根據該結果可知，與未經糖配體修飾之核酸ASO_3’ Cy3相比，含有甘露糖之核酸複合體18未被有效率地吸收至ASGR1表現之細胞中，另一方面，含有GalNac之核酸複合體17及19被有效率地吸收至ASGR1表現之細胞中。
[表12]
檢體編號 ASO_3’ Cy3 核酸複合體
17 18 19
配體 - GalNac 甘露糖 GalNac
螢光強度之相對值（ASO_3’ Cy3 = 1.0） 1.0 24.6 0.6 10.7
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 110103325-A0101-11-0001-2

Claims (23)

  1. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（I）表示： [化1]
    Figure 03_image199
    [X為CH2 或O； Y為含有甘露糖或GalNac之糖配體； n表示1至8之整數； Z為含有寡核苷酸之基]。
  2. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（II）表示： [化2]
    Figure 03_image201
    [Y為含有甘露糖或GalNac之糖配體； Z為含有寡核苷酸之基]。
  3. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（III）表示： [化3]
    Figure 03_image203
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  4. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（IV）表示： [化4]
    Figure 03_image205
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  5. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（V）表示： [化5]
    Figure 03_image207
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  6. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（VI）表示： [化6]
    Figure 03_image209
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  7. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（VII）表示： [化7]
    Figure 03_image211
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  8. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（VIII）表示： [化8]
    Figure 03_image213
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  9. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（IX）表示： [化9]
    Figure 03_image215
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  10. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（X）表示： [化10]
    Figure 03_image217
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  11. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XI）表示： [化11]
    Figure 03_image219
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  12. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XII）表示： [化12]
    Figure 03_image221
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  13. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XIII）表示： [化13]
    Figure 03_image223
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  14. 一種核酸複合體或其藥劑學上容許之鹽，該核酸複合體係以下述式（XIV）表示： [化14]
    Figure 03_image225
    [Z為含有寡核苷酸之基]。
  15. 如請求項1至14中任一項之核酸複合體，其中寡核苷酸為單鏈。
  16. 如請求項15之核酸複合體，其中寡核苷酸經由3’末端而結合。
  17. 如請求項15之核酸複合體，其中寡核苷酸經由5’末端而結合。
  18. 如請求項1至14中任一項之核酸複合體，其中寡核苷酸為雙鏈。
  19. 如請求項18之核酸複合體，其中寡核苷酸經由一條鏈之3’末端而結合。
  20. 如請求項18之核酸複合體，其中寡核苷酸經由一條鏈之5’末端而結合。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至20中任一項之核酸複合體。
  22. 如請求項21之醫藥組合物，其對細胞中之靶基因之表現進行調節。
  23. 如請求項22之醫藥組合物，其中細胞為樹狀細胞、巨噬細胞或肝實質細胞。
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