TW202137978A - 造血幹細胞之培養方法 - Google Patents

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中根淳
永田英孝
浅野成宏
宮西正憲
須田仁志
塩田勇介
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日商大日本住友製藥股份有限公司
日商次世代醫療股份有限公司
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Abstract

本發明之課題在於提供一種可利用於造血幹細胞移植之造血幹細胞之培養方法及製造方法。本發明之造血幹細胞之培養方法包括：將含有造血幹細胞之細胞集群於含有式(1)所表示之化合物或其鹽之1種以上的培養基中進行培養。

Description

造血幹細胞之培養方法
本發明係關於一種造血幹細胞之培養方法。又，本發明係關於一種造血幹細胞之製造方法。進而，本發明係關於一種用以在生物體外使造血幹細胞增殖之造血幹細胞用培養基。
造血幹細胞(hematopoietic stem cell，HSC)主要存在於骨髓中，且被定義為具有自我複製能力及多潛能之血細胞，並且利用於造血幹細胞之移植等。然而，造血幹細胞移植存在優質骨髓源不足之課題。作為該課題之一種解決對策，考慮將優質之造血幹細胞(例如長期造血幹細胞)純化，並在體外(in vitro)使之大量地增殖，但尚未知曉能夠實現長期造血幹細胞(long-term HSC，LT-HSC)純化之特異性標記物，培養方法亦未得到確立。
另一方面，近年來，作為對小鼠長期造血幹細胞特異性地表現之標記物，鑑定出同源匣B5(Hoxb5)(專利文獻1、非專利文獻1)。
作為促進造血幹細胞增殖之化合物，報告有吲哚衍生物(參照專利文獻2、非專利文獻2)，但業界謀求一種維持培養造血幹細胞、尤其是長期造血幹細胞之方法。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：美國專利申請公開第2017/0350879號說明書 專利文獻2：WO2013/110198 非專利文獻
非專利文獻1：James Y.Chen et al., “Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals ahomogenous perivascular niche”, Nature, Vol 530, 223-227 (2016) 非專利文獻2：Fares I et al. (2014) Science 345, 1509-1512
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種可利用於造血幹細胞移植之造血幹細胞之培養方法及製造方法。 [解決問題之技術手段]
本發明者等人針對上述課題，使用Hoxb5陽性造血幹細胞，實施對長期造血幹細胞之增殖有效之低分子化合物之篩選，上述Hoxb5陽性造血幹細胞係自表現作為小鼠長期造血幹細胞之特異性標記物的Hoxb5基因之內源性啟動子之螢光蛋白(mCherry)的報導小鼠所單離出。結果發現，藉由使用包含下述蒿甲醚(Artemether)等化合物之培養基，可使長期造血幹細胞增殖，從而完成了本發明。
即，本發明例如係關於以下之各發明。 [1] 一種造血幹細胞之培養方法，其包括：將含有造血幹細胞之細胞集群於含有式(1)所表示之化合物或其鹽之1種以上的培養基中進行培養。 [化1]
Figure 02_image004
[式中， [化2]
Figure 02_image006
為單鍵或雙鍵， X為O-O或O， Y為氫原子、羥基、側氧基、巰基、羧基、胺甲醯基、氰基、OR1 、SR1 、SOR1 、SO2 R1 、COR1 、OCOR1 、R2 、COOR1 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、NR5 CONR3 R4 或鹵素， Z與縮合環之任意位置之碳鍵結，分別獨立為C1-6 烷基， n為0～10之整數， R1 為可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、或可經取代之脂肪族雜環基， R2 為可經取代之烷基、可經取代之烯基、可經取代之炔基、可經取代之環烷基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、或可經取代之脂肪族雜環基， R3 、R4 及R5 獨立為氫原子、可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之脂肪族雜環基、可經取代之芳基、或可經取代之雜芳基，此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的4～10員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環亦可經取代] [2] 如[1]中記載之培養方法，其中式(1)之化合物為式(2)所表示之化合物。 [化3]
Figure 02_image008
[式中， [化4]
Figure 02_image010
為單鍵或雙鍵， X及Y與式(1)中之定義相同， Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或C1-6 烷基] [3] 如[2]中記載之培養方法，其中式(2)之化合物為式(3-1)、(3-2)或(3-3)所表示之化合物。 [化5]
Figure 02_image012
[式中， X及Y與式(1)中之定義相同， Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或C1-6 烷基] [4] 如[3]中記載之培養方法，其中式(3-1)、(3-2)或(3-3)中，Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或甲基。 [5] 如[1]中記載之培養方法，其中式(1)之化合物為式(4-1)、(4-2)或(4-3)所表示之化合物。 [化6]
Figure 02_image014
[式中， X及Y與式(1)中之定義相同] [6] 如[1]至[5]中任一項所記載之培養方法，其中Y為氫原子、羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、COR1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、或氟原子。 [7] 如[1]至[6]中任一項所記載之培養方法，其中， [化7]
Figure 02_image016
為雙鍵之情形時，Y為氫原子或羥基， [化8]
Figure 02_image018
為單鍵之情形時， Y為羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、或氟原子， R1 為可經選自群1之1～7個取代基取代之C1-8 烷基、可經選自群1之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群1之1～5個基取代之苯基、可經選自群1之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、或可經選自群1之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～10員之雜芳基， R2 為可經選自群2之1～7個取代基取代之C1-8 烷基、可經選自群2之1～7個取代基取代之C1-8 烯基、可經選自群1之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群1之1～5個基取代之苯基、可經選自群1之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、或可經選自群1之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～10員之雜芳基， R3 及R4 獨立為氫原子、可經選自群1之1～7個取代基取代之C1-6 烷基、或可經選自群1之1～5個基取代之苯基，此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的3～8員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環可經選自以下之群1之取代基中之1～3個取代基取代， R5 為氫原子或C1-3 烷基。 ＜群1＞ 羧基、羥基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基、C1-8 烷基羰基胺基、C1-8 烷基磺醯基胺基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、鹵素 ＜群2＞ 羧基、羥基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、胺基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～8員之脂肪族雜環基、鹵素 ＜群3＞ 羧基、羥基、C1-8 之烷基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、C1-8 烷基羰基胺基、C1-8 烷基磺醯基胺基、鹵素 [8] 如[1]至[7]中任一項所記載之培養方法，其中， [化9]
Figure 02_image020
為單鍵， Y為羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、或氟原子， R1 為可經選自群1'之1～3個基取代之C1-4 烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之苯基、可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子之4～6員之脂肪族雜環基、或可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基， R2 為可經選自群2'之1～3個基取代之C1-4 烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之苯基、可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的4～6員之脂肪族雜環基、或可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基， R3 為氫原子或C1-3 烷基， R4 為氫原子、可經選自群1'之1～3個基取代之C1-4 烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之苯基、可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子之4～6員之脂肪族雜環基、或可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基， 此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的3～8員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環可經選自以下之群1'之取代基中之1～3個基取代， R5 為氫原子。 ＜群1'＞ 氟原子、羥基、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、可經選自群3'之1～3個基取代之苯基、可經選自群3'之1～3個基取代之C3-6 之環烷基、可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子之4～6員之脂肪族雜環基 ＜群2'＞ 氟原子、羥基、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、C1-4 烷氧基羰基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、可經選自群3'之1～3個基取代之苯基、可經選自群3'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子之4～6員之脂肪族雜環基 ＜群3'＞ 氟原子、羥基、C1-4 之烷基 [9] 如[1]至[8]中任一項所記載之培養方法，其中X為O-O。 [10] 如[1]中記載之培養方法，其中式(1)之化合物為選自由以下之化合物所組成之群中之化合物。 蒿甲醚(Artemether)、 青蒿素(Artemisinin)、 青蒿醇(Artenimol)、 蒿乙醚(Artemotil)、 青蒿琥酯(Artesunate)、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-10-氟-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(甲基硫基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(甲基硫基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-10-(甲磺醯基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9,10-四甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-(呋喃-2-基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-羧酸、 4-苯基-1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]-1H-1,2,3-三唑、 N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]乙醯胺、 N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲磺醯胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-N,N,3,6,9-五甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-胺、 4-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]𠰌啉、 乙酸(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基酯、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-[(丙烷-2-基)氧基]十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(環己氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯氧基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(2,2,2-三氟乙氧基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(2-甲氧基乙氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(苄氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯氧基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯、 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯、 (3R,5aS,6R,8aS,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-3,4,5,5a,6,7,8,8a-八氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,3aS,6R,6aS,9S,10aS,10bR)-3,6,9-三甲基八氫-10aH-9,10b-環氧吡喃并[4,3,2-jk][2]苯并㗁庚英-2(3H)-酮、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-甲氧基-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [10-2] 如[1]中記載之培養方法，其中式(1)之化合物為選自以下群中之化合物。 蒿甲醚(Artemether)、 青蒿素(Artemisinin)、 青蒿醇(Artenimol)、 蒿乙醚(Artemotil)、 青蒿琥酯(Artesunate)、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 1-[3R,(5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(2-甲氧基乙氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [11] 如[1]中記載之培養方法，其中式(1)之化合物係選自由蒿甲醚(Artemether)、青蒿素(Artemisinin)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)所組成之群。 [12] 如[1]至[11]中任一項所記載之培養方法，其中上述造血幹細胞為CD34陽性細胞。 [13] 如[1]至[12]中任一項所記載之培養方法，其中上述造血幹細胞為長期造血幹細胞。 [14] 如[1]至[12]中任一項所記載之培養方法，其中上述造血幹細胞為Hoxb5陽性之小鼠造血幹細胞。 [15] 如[1]至[14]中任一項所記載之培養方法，其中培養後之細胞集群中之造血幹細胞相對於總細胞數之比率為培養前細胞集群中之造血幹細胞相對於總細胞數之比率之10%以上。 [16] 如[1]至[15]中任一項所記載之培養方法，其中培養後之細胞集群中之造血幹細胞數為培養前細胞集群中之造血幹細胞數之3倍以上。 [16-2] 如[1]至[15]中任一項所記載之培養方法，其中培養後之細胞集群中之造血幹細胞數為培養前細胞集群中之造血幹細胞數之10倍以上。 [17] 如[1]至[16]中任一項所記載之培養方法，其中上述培養基為進而包含UM171或其衍生物之培養基。 [18] 一種造血幹細胞之製造方法，其包括：準備含有造血幹細胞之細胞集群之步驟；及 培養含有造血幹細胞之細胞集群之步驟，其係藉由如[1]至[17]中任一項之培養方法培養上述含有造血幹細胞之細胞集群。 [19] 一種造血幹細胞，其係藉由如[1]至[17]中任一項所記載之培養方法進行培養而獲得。 [20] 一種造血幹細胞，其係藉由如[18]中記載之製造方法製得。 [21] 一種造血幹細胞培養用試劑，其包含式(1)所表示之化合物或其鹽之至少一種。 [發明之效果]
根據本發明之培養方法，可於維持自我複製能力及多潛能之狀態下培養造血幹細胞、尤其是長期造血幹細胞並使之增殖，並且可製造適合移植之長期造血幹細胞。由該培養方法獲得之造血幹細胞可利用於造血幹細胞移植。
[培養方法] 作為一形態，本發明之造血幹細胞之培養方法包括：將含有造血幹細胞之細胞集群於含有式(1)所表示之化合物或其鹽之1種以上的培養基中進行培養。
作為一形態，本發明之造血幹細胞之培養方法包括：將含有造血幹細胞之細胞集群於含有選自由蒿甲醚(Artemether)、青蒿素(Artemisinin)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)所組成之群中之1種以上之化合物或其衍生物、或該等之鹽之培養基中進行培養。
＜造血幹細胞＞ 「造血幹細胞(hematopoietic stem cell，HSC)」係一種主要存在於骨髓中，且具有自我複製能力(self-renewal capacity)、及能夠分化成全部血細胞之多潛能(multipotency)之血細胞。此處，自我複製係指藉由細胞分裂而產生具有和自身相同功能、性質之細胞。即，造血幹細胞藉由自我複製所產生之細胞具有分化成全部血細胞之多潛能及自我複製能力。
造血幹細胞基於其造血維持能力，被分類為短期造血幹細胞與長期造血幹細胞。一般而言，長期造血幹細胞係指與短期造血幹細胞相比，能夠更長期地持續自我複製能力之造血幹細胞，長期造血幹細胞具有長期骨髓重建能力(例如2次移植時亦會重建骨髓之能力)。另一方面，短期造血幹細胞雖然在體外或1次移植時能夠重建骨髓，但2次移植時無法維持該能力。此處，2次移植係指將源自由1次移植所重建之骨髓之造血幹細胞移植到另一個體。於本說明書中，只要未特別提及，則造血幹細胞係指短期造血幹細胞與長期造血幹細胞這兩者。
所謂造血幹細胞之分化，係指長期造血幹細胞(long-term HSC，LT-HSC)轉化為短期造血幹細胞、短期造血幹細胞轉化為多能性造血前驅細胞、多能性造血前驅細胞轉化為寡能性造血前驅細胞、寡能性造血前驅細胞轉化為單能性造血前驅細胞、單能性造血前驅細胞轉化為具有特有功能之成熟細胞、即紅血球、白血球、巨核細胞、血小板等成熟血細胞。與該等一系列之造血幹細胞分化相關之細胞種類之中，具有自我複製能力之細胞侷限於長期造血幹細胞及短期造血幹細胞，較多能性造血前驅細胞更下游之細胞雖然具有伴隨分化之細胞分裂能力，但認為其不具有自我複製能力。
於本說明書中，所謂造血幹細胞之「增殖」，意指通常藉由在生物體外培養造血幹細胞等而使該造血幹細胞數增加。此種造血幹細胞之增殖可藉由自至少一部分造血幹細胞中之具有相同性質之造血幹細胞之自我複製來達成。已知造血幹細胞係在生物體內進行自我複製，但未鑑定出誘發該自我複製之特定因子，難以在生物體外對於造血幹細胞誘發與生物體內同樣之自我複製以使其增殖。藉由本發明之培養方法，可於生物體外維持自我複製能力及多潛能之狀態下使造血幹細胞增殖。
造血幹細胞可將進行表現之標記物、較佳為對造血幹細胞特異性地表現之標記物、及未發現在造血幹細胞中表現之標記物(陰性標記物)作為指標進行鑑定。
例如作為對小鼠長期造血幹細胞特異性地表現之標記物，可例舉Hoxb5(非專利文獻1)。作為一形態，小鼠長期造血幹細胞可為識別選自由譜系(Lineage)陰性、c-Kit陽性、Sca-1陽性、Flk2陰性、CD34陰性或弱陽性、CD150陽性及Hoxb5陽性所組成之群中之1種以上作為指標的細胞。
另一方面，確認到小鼠短期造血幹細胞中Hoxb5不表現。作為一形態，小鼠短期造血幹細胞可為識別選自由譜系陰性、c-Kit陽性、Sca-1陽性、Flk2陰性、CD34陰性或弱陽性、CD150陽性及Hoxb5陰性所組成之群中之1種以上作為指標的細胞。
細胞譜系標記物(Lineage maker)係指在成熟之血液系細胞中表現之抗原之總稱。例如可例舉Ter-119(紅血球)、B220(B細胞)等，但並不限定於此。關於人類細胞譜系標記物之一例，例如於Notta F et al., Science.2011 Jul 8；333(6039)：218-21、Sugimura R. et al., Nature.2017 May 25；545(7655)：432-438、及Taya Y. et al., Science. 2016 Dec2；354(6316)：1152-1155等中有所報告。有時將不表現細胞譜系標記物之全部或一部分之細胞表示為譜系(Lineage)陰性(Lin陰性或Lin-)細胞。作為一形態，小鼠譜系(Lineage)陰性細胞可為不表現Ter-119、B220、CD3、CD4、CD8a、Gr-1、CD11b及IL-7R等之細胞。
作為一形態，人類造血幹細胞可為識別是否有選自由CD34、CD38、Lineage、CD90、CD45RA、CD49f所組成之群中之1種以上標記物之表現作為指標的細胞(例如CD34陽性細胞、CD34陽性且CD38陰性細胞、CD34陽性、CD38陰性、CD90陽性且CD45RA陰性細胞、CD34陽性、CD38陰性細胞、CD90陰性且CD45RA陰性細胞、CD34陽性、CD38陰性、CD90陰性且CD45RA陽性細胞)。認為於CD34陽性細胞集群中之CD34陽性且CD38陰性細胞集群中，長期造血幹細胞以更高之比率存在。
於本說明書中，「陽性」細胞係指表現特定之標記物蛋白之細胞，「陰性」細胞係指不表現特定之標記物蛋白之細胞。例如CD34陽性係指於細胞表面上表現CD(cluster of differentiation，分化簇)34抗原之細胞。又，CD38陰性係指於細胞表面上不表現CD38抗原之細胞。
是否有特定標記物蛋白之表現可使用業者周知之方法進行確認。作為一形態，可憑以下方式進行判斷，即，與使用經螢光標記之對照抗體對細胞進行處理之情形相比，使用針對該標記物之螢光標記抗體對細胞進行處理之情形時是否確認到螢光強度之顯著增加。
此處，上述標記物為業者周知之標記物，各種標記物之基因序列及胺基酸序列可由基因庫(GenBank)等進行確認。例如作為小鼠Hoxb5基因，可例舉基因庫登錄號(GenBank Accession)No.：15413(NC＿ 000077.6)，作為小鼠Hoxb5蛋白，可例舉基因庫登錄號No.：NP＿ 032294.2)等。又，針對各種標記物之抗體等亦可購入市售品，使用該抗體可檢測出標記物之表現或表現量。
造血幹細胞之自我複製能力可利用業者公知之方法進行測定。例如，人類造血幹細胞可將基於是否有上述標記物(例如CD34陽性且CD38陰性)之表現所識別之細胞數之增加作為指標進行測定。又，作為一形態，小鼠造血幹細胞之自我複製能力可將cKit陽性Lin陰性Sca1陽性細胞數之增加作為指標進行測定。又，亦可測定小鼠長期造血幹細胞之自我複製能力。例如，可將Hoxb5陽性細胞數之增加作為指標進行測定。
造血幹細胞之多潛能可藉由如下方式進行測定，即，對於培養所得之細胞，實施分化成至少2種以上之不同造血前驅細胞或自其等衍生之血細胞之分化誘導處理，確認分化成所需之造血前驅細胞或血細胞。
關於對作為人類造血幹細胞或長期造血幹細胞之功能進行確認之方法，經常使用移植到免疫缺陷小鼠之方法。例如可使用當移植人類造血幹細胞時可產生幾乎全部人類成熟血細胞的免疫缺陷小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/Jic：以下稱為「NOG小鼠」，Blood (2012), 100(9):113-1124)。藉由將所培養之造血幹細胞移植到該小鼠，能夠測定所移植之細胞對於骨髓之成活能力、多潛能、骨髓重建能力。進而，採集一次移植有效之免疫缺陷小鼠之骨髓，並再次移植(2次移植)到另一NOG小鼠，藉此能夠測定所移植之細胞之自我複製能力及長期骨髓重建能力。又，長期骨髓重建能力亦可藉由如下方式進行確認，即，對照射致死量放射線之免疫功能不全之NOG小鼠移植造血幹細胞，所移植之細胞長期(移植後1個月以上，較佳為2個月以上、3個月以上、4個月以上)成活。移植人類細胞之情形時，藉由檢測NOG小鼠血液中表現人類標記物之細胞，來對移植細胞之成活進行確認即可。具體而言，對作為白血球共同抗原之人類CD45利用其抗體等進行檢測即可。移植後1個月(較佳為2個月、3個月、4個月)時之血液中人類白血球細胞(例如人類CD45陽性細胞)之比率只要與比較對象相比增加即可。即，於相對於比較對象，該比率得以維持或增加之情形時，可確認對象之長期造血幹細胞得以維持或擴增。此處，所謂比較對象，例如可為利用除不含本發明之化合物以外使其餘之培養條件一致之培養方法所獲得之細胞集群、或培養前之細胞集群。移植後1個月(較佳為2個月、3個月、4個月)時之血液中人類白血球細胞(例如人類CD45陽性細胞)之比率很大程度上依賴於移植細胞數等實驗條件。因此，雖然血液中之人類白血球細胞(例如人類CD45陽性細胞)比率高或低不會成為問題，但例如該比率宜為0.1%以上、0.5%以上、1%以上、5%以上、10%以上。再者，有時將受血者(recipient)中一部分置換為來自供體之細胞(例如白血球細胞)稱為嵌合(或供體嵌合)，將來自供體之細胞(例如白血球細胞)之比率稱為嵌合率。即，於將人類細胞移植到上述NOG小鼠之移植實驗中，有時將小鼠血液中一部分置換為人類白血球細胞(例如人類CD45陽性細胞)稱為嵌合，將人類白血球細胞之比率稱為嵌合率。藉由該方法確認到作為造血幹細胞之功能的細胞可認為是適合應用於實際之造血幹細胞移植之細胞。
即，關於上述[1]至[11]中記載之培養方法，其亦為於移植到哺乳動物之情形時，使產生成熟血細胞之能力提昇之細胞集群之培養方法。
又，關於上述[1]至[11]中記載之培養方法，其亦為使對於骨髓之成活能力、多潛能及骨髓重建能力之至少一種、較佳為全部能力提昇之細胞集群之培養方法。
本說明書中之造血幹細胞可來自哺乳動物，例如可為來自人類、猴、大鼠、小鼠等之造血幹細胞。造血幹細胞(含有造血幹細胞之細胞集群)可藉由[製造方法](步驟(1))中記載之方法加以準備。
＜作為培養對象之含有造血幹細胞之細胞集群＞ 本說明書中之「細胞集群」係指存在2個以上之相同種類或不同種類之細胞之集群。較佳為，細胞集群存在於培養基等介質中。細胞集群包括細胞懸浮液及細胞凝集體，較佳為細胞懸浮液或細胞凝集體之形態。
作為培養對象之含有造血幹細胞之細胞集群只要為含有造血幹細胞之2個以上細胞之集群，則並無特別限定，可為僅含有造血幹細胞(長期造血幹細胞及/或短期造血幹細胞)之細胞集群，亦可為含有造血幹細胞及其以外之細胞之細胞集群。於本說明書中，只要未特別提及，則「含有造血幹細胞之細胞集群」係指僅含有造血幹細胞之細胞集群、以及含有造血幹細胞及其以外之細胞之細胞集群這兩者。造血幹細胞較佳為長期造血幹細胞。即，本說明書中之培養對象即「含有造血幹細胞之細胞集群」包含長期造血幹細胞。
於本說明書中，作為上述細胞集群所能夠包含之除造血幹細胞以外之細胞，可例舉造血前驅細胞、成熟血細胞等。
造血前驅細胞有多能性造血前驅細胞、寡能性造血前驅細胞及單能性造血前驅細胞。多能性、寡能性及單能性之區別在於分化成血細胞之分化能力之程度。
多能性造血前驅細胞係一種具有能夠分化成全部血細胞之多潛能的細胞，但該細胞無法自我複製。因此，雖然可暫時產生血細胞，但若細胞全部分化，則造血前驅細胞便會枯竭，無法重建被破壞之骨髓。
寡能性造血前驅細胞係一種能夠分化成複數種血細胞但並非全部，且無法自我複製之細胞。例如有粒細胞-單核球系前驅細胞(CFU-GEMM)、粒細胞-巨噬細胞群落形成細胞(CFU-GM)等。GEMM代表的是粒細胞(granulocyte)、紅血球(erythrocyte)、單核球(monocyte)、巨核細胞(megakaryocyte)之首字母。
單能性造血前驅細胞係一種能夠分化成特定且單一之血細胞，但不具有自我複製能力之細胞。例如，單能性造血前驅細胞有作為紅血球母細胞系前驅細胞的爆發形成單位紅細胞(BFU-E)等。
作為基於功能性方法之造血前驅細胞之測定法，先前一直使用群落法(例如Ueda T. et al, J.Clin. Invest. (2000) 105: 101013-1021)。由群落法(亦稱為CFU檢定)所測定之最不成熟之群落為混合存在紅血球與白血球之混合群落(以下稱為「CFU-GEMM」)。於使用含有造血幹細胞之細胞集群進行群落法之情形時，造血幹細胞一面分化一面形成各種群落。因此，於由含有特定之造血幹細胞之細胞集群形成大量混合群落(CFU-GEMM)之情形時，認為該細胞集群中包含大量之含有造血幹細胞或長期造血幹細胞之未分化細胞組分。
即，關於上述[1]至[11]中記載之培養方法，其亦為具有形成來自造血幹細胞之混合群落(CFU-GEMM)之能力的細胞或細胞集群之培養方法。
成熟血細胞係指由造血幹細胞經過造血前驅細胞所形成之成熟細胞集群。成熟血細胞有紅血球、嗜中性球、單核球、嗜酸性球、嗜鹼性球、巨噬細胞、血小板、肥大細胞、T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞等，可使造血幹細胞或位於該成熟血細胞之上游之造血前驅細胞分化而獲得。又，該等成熟血細胞可使用公知之方法，利用在細胞中表現之特異性標記物來進行判別。例如，作為單核球、巨噬細胞及粒細胞系之標記物，已知有CD33，作為巨核細胞系-血小板標記物，已知有CD41，作為紅血球系標記物，已知有CD235a，作為B細胞系標記物，已知有CD19，作為T細胞系標記物，已知有CD3等。
於本說明書中，作為培養對象之含有造血幹細胞之細胞集群例如可為自血液或骨髓採集之細胞集群，亦可為由多能性幹細胞(例如iPS細胞(Induced pluripotent stem cell，誘導性多能幹細胞)、ES細胞(Embryonic stem cell，胚胎幹細胞)以人工方式所製作之細胞集群。作為具體方法，可例舉[製造方法]中記載之方法。
＜化合物＞ 作為一形態，本發明之化合物為上述式(1)之化合物或其鹽，較佳為例舉式(2)、或式(3-1)、式(3-2)或式(3-2)，更佳為例舉式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)之化合物或其鹽。
作為一形態，本發明之化合物為以下之化學式所表示之化合物或其鹽。認為該等化合物均為具有抗瘧疾活性之倍半萜烯內酯化合物，且對於具有多藥劑耐性之熱帶瘧疾亦有效(Jigang Wang et al., NATURE COMMUNICATIONS 2015 6：10111 DOI：10.1038)。其中，青蒿素(Artemisinin)係自先前便一直被用作漢方藥之作為艾草屬植物之黃花蒿(Artemisia annua，中文名：青蒿素(Qinghaosu))中分離並被命名的化合物。 [化10]
Figure 02_image022
(各式中，Me表示甲基，Et表示乙基)
亦有報告稱青蒿素及其衍生物具有抗癌作用(YinKwanWong et al., Med Res Rev 2017；37：1492-1517)。根據上述文獻，抗瘧疾作用之IC50 為數nM級，抗癌作用之IC50 約為100 μM。迄今尚未報告有該等化合物對於造血幹細胞之作用。
可用於本發明之培養方法之化合物可為選自由蒿甲醚(Artemether)、青蒿素(Artemisinin)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)所組成之群中之1種以上之化合物或其鹽，又，亦可為選自由蒿甲醚(Artemether)、青蒿素(Artemisinin)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)所組成之群中之1種以上之化合物之衍生物或其鹽。再者，可認為式(1)之化合物為蒿甲醚、青蒿素、青蒿醇、蒿乙醚、或青蒿琥酯之衍生物。
以下，對式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)之化合物或其鹽進行說明。 [化11]
Figure 02_image024
式(1)中， [化12]
Figure 02_image026
為單鍵或雙鍵， X為O-O或O， Y為氫原子、羥基、側氧基、巰基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SOR1 、SO2 R1 、COR1 、OCOR1 、R2 、COOR1 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、NR5 CONR3 R4 或鹵素， Z與縮合環之任意位置之碳鍵結，分別獨立為C1-6 烷基， n為0～10之整數， R1 為可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、或可經取代之脂肪族雜環基， R2 為可經取代之烷基、可經取代之烯基、可經取代之炔基、可經取代之環烷基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、或可經取代之脂肪族雜環基， R3 、R4 及R5 獨立為氫原子、可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之脂肪族雜環基、可經取代之芳基、或可經取代之雜芳基，此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的3～8員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環亦可經取代。 n可為0～10之整數，較佳為0～6，更佳為0～3之整數。
式(2)中， [化13]
Figure 02_image028
為單鍵或雙鍵， X及Y與式(1)中之定義相同， Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或C1-6 烷基。式(2)中，較佳為Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或甲基。
式(3-1)、式(3-2)及式(3-3)中， X及Y與式(1)中之定義相同， Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或C1-6 烷基。此處，較佳為Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或甲基。 式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)中， X及Y與式(1)中之定義相同。
關於「可經取代」或「經取代」所定義之基中之取代基個數，只要能夠取代，便無特別限制。又，除特別明示之情形以外，各基之說明亦適於該基為其他基之一部分或取代基之情形。
作為「鹵素」，例如可例舉氟、氯、溴、或碘。較佳為氟或氯。更佳為氟。
「烷基」係指直鏈狀或支鏈狀之飽和烴基，可例舉碳數1～25之烷基、較佳為碳數1～10之烷基。作為更佳之烷基，可例舉「C1-8 烷基」、「C1-6 烷基」或「C1-4 烷基」。
「C1-10 烷基」係指碳原子數為1～10之直鏈狀或支鏈狀之飽和烴基。再者，其他數字之情形亦同樣。 作為「C1-10 烷基」，較佳為例舉「C1-8 烷基」，更佳為例舉「C1-6 烷基」，進而較佳為例舉「C1-4 烷基」。 作為「C1-8 烷基」，較佳為例舉「C1-6 烷基」，更佳為例舉「C1-4 烷基」。 作為「C1-6 烷基」，較佳為例舉「C1-4 烷基」。作為「C1-4 烷基」之具體例，例如可例舉：甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1,1-二甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基等。作為「C1-6 烷基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、己基等。作為「C1-8 烷基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基、辛基等。
「烯基」係指具有1個或複數個、較佳為1～3個雙鍵之直鏈狀或支鏈狀之不飽和烴基，可例舉碳數2～7之烯基。於本說明書中，作為烯基，可例舉：乙烯基、烯丙基、丁二烯基等。
「炔基」係指具有1個或複數個、較佳為1～2個三鍵之直鏈狀或支鏈狀之不飽和烴基，可例舉碳數2～5之炔基。於本說明書中，作為炔基，可例舉乙炔基、丙炔基等。
「環烷基」係指飽和之環狀烷基，亦包括經部分交聯之結構者。作為環烷基，可例舉「C3-8 環烷基」、或「C3-6 環烷基」。
「C3-8 環烷基」係指構成環之碳原子數為3～8之環烷基。作為「C3-8 環烷基」，較佳為例舉「C3-6 環烷基」。作為「C3-6 環烷基」之具體例，例如可例舉：環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。作為「C3-8 環烷基」之具體例，例如可例舉作為上述「C3-6 環烷基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉環庚基、環辛基等。
「芳基」係指單環式或二環式之芳香族烴，可例舉「C6-10 芳基」。 「C6-10 芳基」係指碳原子數為6～10之芳基。作為「C6-10 芳基」之具體例，例如可例舉苯基、1-萘基、2-萘基等。作為「C6-10 芳基」，較佳為例舉苯基。
「雜芳基」係指單環式或雜環式之包含獨立地選自由1～4個氮原子、1個氧原子及1個硫原子所組成之群中之1～4個環內雜原子的芳香族雜環基。 再者，於雜芳基經取代之情形時，只要化學穩定，則可於任意之碳原子或氮原子上進行取代。
「5～10員之雜芳基」係指由5～10個原子所構成之單環式或二環式之雜芳基。作為「5～10員之雜芳基」，較佳為例舉「5～6員之雜芳基」，具體而言，可例舉：呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、三唑基、四唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡𠯤基、嗒𠯤基、異噻唑基、噻二唑基、吡唑基、㗁唑基、異㗁唑基、三𠯤基、三唑基、咪唑啶基、㗁二唑基等。作為「5～10員之雜芳基」之具體例，例如可例舉作為上述「5～6員之雜芳基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：吲哚基、吲唑基、喹啉基、異喹啉基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并㗁唑基、苯并噻唑基、苯并異㗁唑基、苯并異噻唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、6,11-二氫二苯并[b,e]硫雜䓬基等。
「脂肪族雜環基」係指單環式或二環式之除碳原子以外還包含獨立地選自由1～2個氮原子、1～2個氧原子及1～2個硫原子所組成之群中之1～4個雜原子的飽和或不飽和之脂肪族雜環基。 再者，於脂肪族雜環基經取代之情形時，只要化學穩定，則可於任意之碳原子或氮原子上進行取代。
「4～10員之脂肪族雜環基」係指由4～10個原子所構成之脂肪族雜環基，亦包括經部分交聯之結構者、經部分螺環化者、或者與C6-10 芳基或C5-10 雜芳基形成縮環者。作為「4～10員之脂肪族雜環基」，較佳為例舉4～6員之單環式飽和雜環基。作為「4～6員之單環式飽和雜環基」之具體例，例如可例舉：氮雜環丁基、吡咯啶基、哌啶基、哌𠯤基、𠰌啉基、四氫呋喃基、四氫吡喃基等。作為「4～10員之飽和雜環基」之具體例，例如可例舉作為上述「4～6員之單環式飽和雜環基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：氮雜䓬基、氧雜環庚基、二氮雜䓬基、高哌啶基等。
作為「4～10員之含氮脂肪族雜環」，可例舉：可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的4～10員之含氮脂肪族雜環。該含氮脂肪族雜環可為單環式或二環式，且可為飽和或不飽和之含氮脂肪族雜環。作為「4～10員之含氮脂肪族雜環」，較佳為例舉4～6員之單環式飽和含氮雜環。作為「4～6員之單環式飽和含氮雜環」之具體例，例如可例舉：吖丁啶、吡咯啶、哌啶、哌𠯤、𠰌啉等。作為「4～10員之飽和雜環」之具體例，例如可例舉作為上述「4～6員之單環式飽和雜環」之具體例所例舉者，此外還可例舉：氮雜環庚烷、氧雜環庚烷、二氮雜環庚烷、高哌啶等。
「烷氧基」係指經烷基取代之氧基，作為較佳之烷氧基，可例舉「C1-8 烷氧基」、「C1-6 烷氧基」或「C1-4 烷氧基」。 「C1-8 烷氧基」係指經上述「C1-8 烷基」取代之氧基。作為「C1-8 烷氧基」，較佳為例舉「C1-6 烷氧基」、或「C1-4 烷氧基」。作為「C1-4 烷氧基」之具體例，例如可例舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1,1-二甲基乙氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基。作為「C1-6 烷氧基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷氧基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：戊氧基、3-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、2,2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、1,1-二甲基丙氧基、己氧基、4-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、1-甲基戊氧基、3,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基等。作為「C1-8 烷氧基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷氧基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚氧基、辛氧基等。
「C1-8 烷基羰基」係指經上述「C1-8 烷基」取代之羰基。作為「C1-8 烷基羰基」，較佳為例舉「C1-6 烷基羰基」、或「C1-4 烷基羰基」。作為「C1-4 烷基羰基」之具體例，例如可例舉：甲基羰基、乙基羰基、丙基羰基、1-甲基乙基羰基、丁基羰基、1,1-二甲基乙基羰基、1-甲基丙基羰基、2-甲基丙基羰基等。作為「C1-6 烷基羰基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基羰基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：4-甲基戊基羰基、3-甲基戊基羰基、2-甲基戊基羰基、1-甲基戊基羰基、己基羰基等。作為「C1-8 烷基羰基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基羰基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基羰基、辛基羰基等。
「C1-8 烷基羰氧基」係指經上述「C1-8 烷基羰基」取代之氧基。作為「C1-8 烷基羰氧基」，較佳為例舉「C1-6 烷基羰氧基」、或「C1-4 烷基羰氧基」。作為「C1-4 烷基羰氧基」之具體例，例如可例舉：乙醯氧基、丙醯氧基、丁醯氧基、2-甲基丙醯氧基、戊醯氧基、2,2-二甲基丙醯氧基、2-甲基丁醯氧基、3-甲基丁醯氧基。作為「C1-6 烷基羰氧基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基羰氧基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：己醯氧基、3,3-二甲基丁醯氧基、3-甲基戊醯氧基、4-甲基戊醯氧基、2,2-二甲基丁醯氧基、2,3-二甲基丁醯氧基、2-乙基丁醯氧基、3-乙基丁醯氧基、庚醯氧基、2-甲基己醯氧基、3-甲基己醯氧基、4-甲基己醯氧基、5-甲基己醯氧基、2,2-二甲基戊醯氧基、3,3-二甲基戊醯氧基、4,4-二甲基戊醯氧基、2,3-二甲基戊醯氧基、2,4-二甲基戊醯氧基、2-乙基戊醯氧基、3-乙基戊醯氧基、4-乙基戊醯氧基等。作為「C1-8 烷基羰氧基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基羰氧基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基羰氧基、辛基羰氧基等。
「C1-8 烷氧基羰基」係指經上述「C1-8 烷氧基」取代之羰基。作為「C1-8 烷氧基羰基」，較佳為例舉「C1-6 烷氧基羰基」、或「C1-4 烷氧基羰基」。作為「C1-4 烷氧基羰基」之具體例，例如可例舉：甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、1-甲基乙氧基羰基、丁氧基羰基、1,1-二甲基乙氧基羰基、1-甲基丙氧基羰基、2-甲基丙氧基羰基。作為「C1-6 烷氧基羰基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷氧基羰基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：戊氧基羰基、3-甲基丁氧基羰基、2-甲基丁氧基羰基、2,2-二甲基丙氧基羰基、1-乙基丙氧基羰基、1,1-二甲基丙氧基羰基、己氧基羰基、4-甲基戊氧基羰基、3-甲基戊氧基羰基、2-甲基戊氧基羰基、1-甲基戊氧基羰基、3,3-二甲基丁氧基羰基、2,2-二甲基丁氧基羰基、1,1-二甲基丁氧基羰基、1,2-二甲基丁氧基羰基等。作為「C1-8 烷氧基羰基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷氧基羰基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：庚氧基羰基、辛氧基羰基等。
「C1-8 烷基硫基」係指經上述「C1-8 烷基」取代之巰基。作為「C1-8 烷基硫基」，較佳為例舉「C1-6 烷基硫基」、或「C1-4 烷基硫基」。作為「C1-4 烷基硫基」之具體例，例如可例舉：甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、1-甲基乙基硫基、丁基硫基、1,1-二甲基乙基硫基、1-甲基丙基硫基、2-甲基丙基硫基。作為「C1-6 烷基硫基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基硫基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：戊基硫基、3-甲基丁基硫基、2-甲基丁基硫基、2,2-二甲基丙基硫基、1-乙基丙基硫基、1,1-二甲基丙基硫基、己基硫基、4-甲基戊基硫基、3-甲基戊基硫基、2-甲基戊基硫基、1-甲基戊基硫基、3,3-二甲基丁基硫基、2,2-二甲基丁基硫基、1,1-二甲基丁基硫基、1,2-二甲基丁基硫基等。作為「C1-8 烷基硫基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基硫基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基硫基、辛基硫基等。
「C1-8 烷基磺醯基」係指經「C1-8 烷基」取代之磺醯基。作為「C1-8 烷基磺醯基」，較佳為例舉「C1-6 烷基磺醯基」、或「C1-4 烷基磺醯基」。作為「C1-4 烷基磺醯基」之具體例，例如可例舉：甲基磺醯基、乙基磺醯基、丙基磺醯基、1-甲基乙基磺醯基、丁基磺醯基、1,1-二甲基乙基磺醯基、1-甲基丙基磺醯基、2-甲基丙基磺醯基。作為「C1-6 烷基磺醯基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基磺醯基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：戊基磺醯基、3-甲基丁基磺醯基、2-甲基丁基磺醯基、2,2-二甲基丙基磺醯基、1-乙基丙基磺醯基、1,1-二甲基丙基磺醯基、己基磺醯基、4-甲基戊基磺醯基、3-甲基戊基磺醯基、2-甲基戊基磺醯基、1-甲基戊基磺醯基、3,3-二甲基丁基磺醯基、2,2-二甲基丁基磺醯基、1,1-二甲基丁基磺醯基、1,2-二甲基丁基磺醯基等。作為「C1-8 烷基磺醯基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基磺醯基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基磺醯基、辛基磺醯基等。
「C1-8 烷基磺醯基胺基」係指經「C1-8 烷基磺醯基」取代之胺基。作為「C1-8 烷基磺醯基胺基」，較佳為例舉「C1-6 烷基磺醯基胺基」、或「C1-4 烷基磺醯基胺基」。作為「C1-4 烷基磺醯基胺基」之具體例，例如可例舉：甲基磺醯基胺基、乙基磺醯基胺基、丙基磺醯基胺基、1-甲基乙基磺醯基胺基、丁基磺醯基胺基、1,1-二甲基乙基磺醯基胺基、1-甲基丙基磺醯基胺基、2-甲基丙基磺醯基胺基。作為「C1-6 烷基磺醯基胺基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基磺醯基胺基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：戊基磺醯基胺基、3-甲基丁基磺醯基胺基、2-甲基丁基磺醯基胺基、2,2-二甲基丙基磺醯基胺基、1-乙基丙基磺醯基胺基、1,1-二甲基丙基磺醯基胺基、己基磺醯基胺基、4-甲基戊基磺醯基胺基、3-甲基戊基磺醯基胺基、2-甲基戊基磺醯基胺基、1-甲基戊基磺醯基胺基、3,3-二甲基丁基磺醯基胺基、2,2-二甲基丁基磺醯基、1,1-二甲基丁基磺醯基、1,2-二甲基丁基磺醯基胺基等。作為「C1-8 烷基磺醯基胺基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基磺醯基胺基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基磺醯基胺基、辛基磺醯基胺基等。
「C1-8 烷基羰基胺基」係指經「C1-8 烷基羰基」取代之胺基。作為「C1-8 烷基羰基胺基」，較佳為例舉「C1-6 烷基羰基胺基」、或「C1-4 烷基羰基胺基」。作為「C1-4 烷基羰基胺基」之具體例，例如可例舉：乙醯基胺基、丙醯基胺基、丁醯基胺基、2-甲基丙醯基胺基、戊醯基胺基、2,2-二甲基丙醯基胺基、2-甲基丁醯基胺基、3-甲基丁醯基胺基。作為「C1-6 烷基羰基胺基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-4 烷基羰基胺基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉：己醯基胺基、3,3-二甲基丁醯基胺基、3-甲基戊醯基胺基、4-甲基戊醯基胺基、2,2-二甲基丁醯基胺基、2,3-二甲基丁醯基胺基、2-乙基丁醯基胺基、3-乙基丁醯基胺基、庚醯基胺基、2-甲基己醯基胺基、3-甲基己醯基胺基、4-甲基己醯基胺基、5-甲基己醯基胺基、2,2-二甲基戊醯基胺基、3,3-二甲基戊醯基胺基、4,4-二甲基戊醯基胺基、2,3-二甲基戊醯基胺基、2,4-二甲基戊醯基胺基、2-乙基戊醯基胺基、3-乙基戊醯基胺基、4-乙基戊醯基胺基等。作為「C1-8 烷基羰基胺基」之具體例，例如可例舉作為上述「C1-6 烷基羰基胺基」之具體例所例舉之基，此外還可例舉庚基羰基胺基、辛基羰基胺基等。
作為可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基之一形態，例如可例舉：胺基、或經1個或2個相同或不同之上述「C1-6 烷基」、或「C1-4 烷基」取代之胺基。具體而言，例如可例舉：胺基、甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、2-丙基胺基、丁基胺基、二甲胺基、二乙基胺基、甲基乙基胺基、二丙基胺基等。 作為可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基之一形態，胺基之2個取代基可與鄰接之氮原子一起形成4～10員之含氮脂肪族雜環。作為該含氮脂肪族雜環，較佳為例舉：哌啶、吡咯啶、哌𠯤、𠰌啉等。
作為可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基之一形態，例如可例舉：胺甲醯基、或經1個或2個相同或不同之上述「C1-6 烷基」、或「C1-4 烷基」取代之胺甲醯基。具體而言，例如可例舉：胺甲醯基、甲基胺甲醯基、乙基胺甲醯基、丙基胺甲醯基、2-丙基胺甲醯基、丁基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、甲基乙基胺甲醯基、二丙基胺甲醯基等。 作為可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基之一形態，胺甲醯基之2個取代基可與鄰接之氮原子一起形成4～10員之含氮脂肪族雜環。作為該含氮脂肪族雜環，較佳為例舉：哌啶、吡咯啶、哌𠯤、𠰌啉等。
式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)中之Y較佳為氫原子、羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、COR1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、或氟原子。
作為本發明之一形態，式(1)、或式(2)中， [化14]
Figure 02_image030
所表示之鍵係指單鍵或雙鍵。此處，於Y為側氧基之情形時，上述鍵為單鍵。
作為本發明之一形態，較佳為，式(1)、或式(2)中， [化15]
Figure 02_image032
為雙鍵之情形時，Y為氫原子或羥基， [化16]
Figure 02_image034
為單鍵之情形時， Y為羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 或氟原子， R1 為可經選自群1之1～7個取代基取代之C1-8 烷基、可經選自群1之1～3個基取代之3～8員之環烷基、可經選自群1之1～5個基取代之苯基、可經選自群1之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、或可經選自群1之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～10員之雜芳基， R2 為可經選自群2之1～7個取代基取代之C1-8 烷基、可經選自群2之1～7個取代基取代之C1-8 烯基、可經選自群1之1～3個基取代之3～8員之環烷基、可經選自群1之1～5個基取代之苯基、可經選自群1之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、或可經選自群1之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～10員之雜芳基， R3 及R4 獨立為氫原子、可經選自群1之1～7個取代基取代之C1-6 烷基、或可經選自群1之1～5個基取代之苯基，此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的3～8員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環可經選自以下之群1之取代基中之1～3個取代基取代， R5 為氫原子或C1-3 烷基。 作為本發明之一形態，較佳為X為O-O。
於本說明書中，R1 、R3 、R4 及R5 中之烷基經取代之情形時，可經選自以下之群1中之1～7個、較佳為1～3個取代基取代。
於本說明書中，R2 中之烷基、烯基或炔基經取代之情形時，可經選自以下之群2中之1～7個、較佳為1～3個取代基取代。
＜群1＞ 羧基、羥基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、C1-8 烷基羰基胺基、C1-8 烷基磺醯基胺基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之3～8員之環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、鹵素 ＜群2＞ 羧基、羥基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、胺基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之3～8員之環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～8員之脂肪族雜環基、鹵素 ＜群3＞ 羧基、羥基、C1-8 之烷基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、C1-8 烷基羰基胺基、C1-8 烷基磺醯基胺基、鹵素
於環烷基經取代之情形時，可經選自上述群1之1～3個、較佳為1～2個之取代基取代。作為環烷基之取代基，較佳為例舉羥基、C1-8 烷氧基、鹵素。
於脂肪族雜環基經取代之情形時，可經選自上述群1之1～3個、較佳為1～2之取代基取代。作為脂肪族雜環基之取代基，較佳為例舉羥基、C1-8 烷氧基、鹵素。
於芳基經取代之情形時，可經選自上述群1之1～5、較佳為1～3個取代基取代。作為芳基之取代基，較佳為例舉羥基、C1-8 烷氧基、鹵素。
於雜芳基經取代之情形時，可經選自上述群1之1～4、較佳為1～3個取代基取代。作為雜芳基之取代基，較佳為例舉羥基、C1-8 烷氧基、鹵素。
群1、群1及群3較佳為分別為下述群1'、群2'及群3'。 ＜群1'＞ 氟原子、羥基、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C2-4 烷基羰氧基、可經選自群3'之1～3個基取代之苯基、可經選自群3'之1～3個基取代之3～6員之環烷基、可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子之4～6員之脂肪族雜環基 ＜群2'＞ 氟原子、羥基、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C2-4 烷基羰氧基、C1-4 烷氧基羰基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、可經選自群3'之1～3個基取代之苯基、可經選自群3'之1～3個基取代之3～6員之環烷基、可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子之4～6員之脂肪族雜環基 ＜群3'＞ 氟原子、羥基、C1-4 之烷基
於烯基或炔基經取代之情形時，可經選自下述群3''之1～3個、較佳為1～2個取代基取代。 ＜群3''＞ 氟原子
X、Y、Z、Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、Z6 、R1 、R2 、R3 、R4 、及R5 中，較佳者如下所述，但本發明之技術範圍不限定於下述例舉之化合物之範圍。
作為式(1)中之Z，較佳為例舉C1-4 烷基，更佳為例舉C1-3 烷基，進而較佳為例舉甲基或乙基。 式(1)中，Z可與構成縮合環之任意碳原子鍵結，只要化學穩定，則可鍵結於同一碳原子上，亦可鍵結於複數個環共用之碳原子上，Z可相同或亦可不同。
構成式(1)中Z所鍵結之環(縮合環)之碳原子之立體組態只要可形成化學穩定之結構，則並無特別限定，例如作為式(2-1) [化17]
Figure 02_image036
(式中，X、Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 及Z6 與式(1)或式(2)中之定義相同) 所表示之基之具體例，可例舉下述式(3-1')、式(3-2')及式(3-3') [化18]
Figure 02_image038
(式中，X、Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 及Z6 與式(1)或式(2)中之定義相同) 所表示之基。
作為式(2)中之Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 及Z6 ，較佳為例舉氫原子或C1-4 烷基，更佳為例舉氫原子或C1-3 烷基，進而較佳為例舉氫原子或甲基或乙基。
作為式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)之化合物之一形態，可例舉X為O-O之化合物。
作為式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)之化合物之一形態，於Y為側氧基之情形時，可例示以下之式(2')所表示之化合物。式(2')之化合物存在式(2'')所表示之互變異構物，只要能夠化學穩定地存在，則本發明一併包含該等物質。 [化19]
Figure 02_image040
(式中，X與式(1)中之定義相同) 作為式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)之化合物之一形態，於X為O之情形時，較佳為例舉上述式(2')或式(2'')所表示之化合物。
以下，對式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)中之Y之形態進行說明。 作為Y之較佳形態，可例舉氫原子、羥基、羧基、胺甲醯基或鹵素。 於Y為鹵素之情形時，較佳為氟原子。 於Y為OR1 、SR1 、SOR1 、SO2 R1 、或COR1 之情形時，作為R1 ，較佳為例舉可經取代之C1-4 烷基、可經取代之苯基、或可經取代之環烷基。
此處，作為R1 之一形態，可例舉可經取代之C1-3 烷基，更佳為例舉分別可經取代之甲基或乙基。作為取代基，可例舉鹵素、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、或C1-4 烷基羰氧基等、可經選自上述群2之1個或複數個取代基取代之芳基等，可分別獨立地取代有1個或複數個、1～3個。作為上述鹵素，較佳為例舉氟原子。
作為Y為OCOR1 時之R1 ，可例舉可經取代之C1-4 烷基。作為取代基，可例舉：鹵素、羧基、經1個或2個相同或不同之C1-3 烷基取代之胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、可經選自上述群3之1個或複數個取代基取代之芳基等，可分別獨立地取代有1個或複數個、1～3個。作為上述鹵素，較佳為例舉氟原子。
作為Y為OCOR1 時之R1 之一形態，可例舉經羧基取代之C1-4 烷基。
於Y為NR3 R4 之情形時，R3 及R4 較佳為獨立為氫原子或C1-4 烷基，或者R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成4～10員之含氮脂肪族雜環。作為該4～10員之含氮脂肪族雜環，較佳為例舉4～6員之單環式飽和含氮雜環，具體而言，可例舉：吖丁啶、吡咯啶、哌啶、哌𠯤、𠰌啉。
於Y為NR5 COR1 或NR5 SO2 R1 之情形時，作為R1 ，可例舉可經取代之C1-4 烷基。作為取代基，可例舉：鹵素、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、可經選自上述群3之1個或複數個取代基取代之芳基，可分別獨立地取代有1個或複數個、1～3個。作為上述鹵素，較佳為例舉氟原子。 又，R5 較佳為氫原子或C1-4 烷基，更佳為氫原子、甲基或乙基。
於Y為NR5 CONR3 R4 之情形時，R3 及R4 較佳為例舉獨立為氫原子、可經取代之C1-4 烷基、或可經選自群3之1個或複數個取代基取代之苯基。作為上述C1-4 烷基之取代基，可例舉：鹵素、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、可經選自上述群3之1個或複數個取代基取代之芳基，分別獨立地取代有1個或複數個、1～3個。作為上述鹵素，較佳為例舉氟原子。又，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成4～10員之含氮脂肪族雜環。作為該4～10員之含氮脂肪族雜環，較佳為例舉4～6員之單環式飽和含氮雜環，具體而言，可例舉：吖丁啶、吡咯啶、哌啶、哌𠯤、𠰌啉。作為上述可經取代之C1-4 烷基之取代基，較佳為例舉：鹵素、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基等、分別可經選自上述群2之1個或複數個取代基取代之芳基、雜芳基、環烷基及脂肪族雜環基，可分別獨立地取代有1個或複數個、1～3個。作為上述鹵素，較佳為例舉氟原子。 又，R5 較佳為氫原子或C1-4 烷基，更佳為氫原子、甲基或乙基。
於Y為R2 之情形時，作為R2 ，較佳為例舉：可經選自上述群2或群2'之1個或複數個取代基取代之C1-4 烷基、可經選自上述群3或群3'之1個或複數個取代基取代之苯基、可經選自上述[6]或[7]中之群3之1個或複數個取代基取代之5或6員之雜芳基。作為上述雜芳基，具體而言，可例舉分別可經取代之呋喃-2-基、三𠯤-1-基等。
於一形態中，當Y為R2 時，作為R2 ，可例舉C1-4 烷基，較佳為例舉甲基或乙基。
於一形態中，當Y為R2 時，作為R2 ，可例舉：可經選自以下之群4之1個或複數個、較佳為1～3個取代基取代之C1-4 烷基，較佳為例舉分別可經選自以下之群4之1～3個取代基取代之C1-4 烷基、甲基或乙基。
＜群4＞ 羧基、羥基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰基、C1-4 烷基羰氧基、C1-4 烷氧基羰基、可經1個或2個C1-4 烷基取代胺甲醯基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之3～6員之環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～8員之脂肪族雜環基、氟原子
作為式(2)所表示之化合物之一形態，可例舉具有以下特徵(A1)～(A5)之化合物或其鹽： (A1)Z1 、Z3 及Z5 為甲基，且Z2 、Z4 及Z6 為氫原子； (A2)X為O或O-O； (A3)Y為羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、氟原子、OR1 、OCOR1 、SR1 、SO2 R1 、R2 、NHCOR1 、或NR3 R4 ； (A4)R1 或R2 為可經取代之C1-8 烷基、可經取代之苯基、可經取代之5-6員之環烷基、可經取代之5-6員之雜芳基，取代基選自氟原子、胺基、羧基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰氧基及苯基； (A5)R3 及R4 表示甲基，或者與鄰接之氮原子一起形成𠰌啉、硫代𠰌啉、硫代𠰌啉-1-氧化物、硫代𠰌啉-1,1-二氧化物、哌𠯤、吲哚啉、四氫異喹啉。
作為式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)所表示之化合物之一形態，可例舉具有以下特徵(B1)～(B2)之化合物或其鹽： (B1)X為O-O； (B2)Y為NR5 SO2 R1 。 作為式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)所表示之化合物之一形態，可例舉除上述(B1)～(B2)以外還具有以下特徵(B3)～(B4)之化合物或其鹽： (B3)R1 為可經取代之C1-8 烷基、可經取代之苯基、可經取代之5-6員之環烷基、可經取代之5-6員之雜芳基，取代基選自氟原子、胺基、羧基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰氧基及苯基； (B4)R5 為氫原子。
作為式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)所表示之化合物之具體例，為實施例1-1～1-35之化合物。
本發明之化合物包含上述式(1)所表示之化合物之鹽。作為該鹽，只要於細胞培養中不會對細胞之存活或分化等造成影響，則無特別限定，可例舉作為醫藥品原料所可容許之鹽。
作為「鹽」，可例舉酸加成鹽及鹼加成鹽。例如，作為酸加成鹽，可例舉：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；或檸檬酸鹽、草酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、三氟乙酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、樟腦磺酸鹽等有機酸鹽。又，作為鹼加成鹽，可例舉：鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋇鹽、鋁鹽等無機鹼鹽；或三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺丁三醇、[三(羥基甲基)甲基胺]、第三丁胺、環己胺、二環己胺、N,N-二苄基乙基胺等有機鹼鹽等。進而，作為「鹽」，亦可例舉與精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、天冬胺酸、或麩胺酸等鹼性胺基酸或酸性胺基酸之胺基酸鹽。
於欲獲取本發明之化合物之鹽時，以鹽之形態獲得本發明之化合物之情形時，只要直接進行純化即可，又，於以游離形態獲得之情形時，使其溶解或懸浮於適當之有機溶劑中，添加酸或鹼，利用通常之方法形成鹽即可。
將本發明之化合物之任一個或任兩個以上之1 H轉化為2 H(D)而得之氘轉化體亦包含於本發明之化合物中。
本發明之化合物有時亦以水合物及/或與各種溶劑之溶劑合物(乙醇合物等)之形態存在，因此，該等水合物及/或溶劑合物亦包含於本發明之化合物中。進而，本發明亦包括：本發明化合物之所有互變異構物、存在之所有立體異構物、及所有樣態之結晶形者、進而該等之混合物。
例如為如下概念：於式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)中，Y表示側氧基或羥基之情形時，當存在以下之式所表示之互變異構物時，Y表示羥基之化合物、或Y表示側氧基之化合物分別包含互變異構物。 [化20]
Figure 02_image042
本發明之化合物中，有可能存在基於光學活性中心之光學異構物、由分子內旋轉受限所產生之基於軸手性或平面手性之旋轉對映異構物、其他立體異構物、互變異構物、及幾何異構物等，包括該等在內之全部可能形成之異構物及其等之混合物均包含於本發明之範圍內。
具體而言，關於式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)所表示之化合物，於具有未明示出立體組態之光學活性中心之情形時，可包括單一之立體異構物及複數種立體異構物之混合物。
又，例如式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)所表示之化合物之光學異構物或該化合物與其光學異構物之混合物(例如外消旋體)亦為本發明之範疇。
尤其是光學異構物或旋轉對映異構物可以外消旋體之形式獲得，或者於使用光學活性之起始原料或中間物之情形時，可以光學活性體之形式獲得。必要時，可於下述製造法之適當階段，藉由使用光學活性管柱之方法、分級結晶法等公知之分離方法，以物理方式或化學方式將對應之原料、中間物或最終品之外消旋體拆分為其等之旋光對映體。具體而言，例如在非鏡像異構物法中，藉由使用光學活性拆分劑之反應，由外消旋體形成2種非鏡像異構物。該不同之非鏡像異構物通常物理性質不同，故可藉由分級結晶等公知之方法進行拆分。 ＜化合物之製造方法＞
以下，對本發明之化合物之製造方法進行說明，但本發明之化合物之製造法並不限定於該等方法。
式(1)所表示之化合物為公知之化合物，或者可由公知化合物利用業者所周知之化學合成法進行製造。
作為具體之公知化合物，可例舉：本說明書實施例中記載之青蒿素(Artemisinin)(實施例1-33)、蒿甲醚(Artemether)(實施例1-30)、青蒿醇(Artenimol)(實施例1-29)、蒿乙醚(Artemotil)(實施例1-31)、青蒿琥酯(Artesunate)(實施例1-32)、及實施例1-1～實施例1-28、1-34、及1-35所示之化合物。蒿甲醚(Artemether)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)均為青蒿素之衍生物，可由青蒿素以半合成之方式進行製造。例如，蒿甲醚及蒿乙醚可依據Tetrahedron Letters 2002, 43, 7235-7237中記載之方法進行合成，青蒿琥酯可依據J. Med. Chem. 1988, 31, 645-650中記載之方法進行合成，青蒿醇可依據Chem Commun 2014, 50, 12652-12655中記載之方法進行合成。其他化合物亦為文獻公知者，或者可由青蒿素以半合成方式進行製造。
例如式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)所表示之化合物可由青蒿醇或青蒿素等公知化合物以半合成之方式進行製造。
以下，例舉式(1)所表示之化合物之例進行說明，式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)所表示之化合物亦可依據以下之製造方法進行製造。
例如，Y為羥基、鹵素、氫原子、羧基、COOR1 、R2 (呋喃等雜芳基、或甲基等烷基)之化合物可利用以下之反應式或類似之方法進行製造。 [化21]
Figure 02_image044
(式中，X、Z、n及R1 與式(1)中之定義相同，L係指鹵素等脫離基)
作為起始原料之化合物a1能夠獲取青蒿醇、去氧雙氫青蒿素等公知之化合物。青蒿醇例如可依據Chem Commun 2014, 50, 12652-12655中記載之方法進行合成，該文獻中記載之雙氫青蒿酸例如可依據Tetrahedron 2016, 72 (32), 4931-4937中記載之方法進行化學合成。去氧雙氫青蒿素可以青蒿醇為原料，例如依據ChemMedChem 2012, 7 (12), 2204-2226中記載之方法進行化學合成。因此，可參考該等中記載之方法來製造各種a1。
化合物A1及A2可藉由使化合物a1與氟化試劑進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷。作為氟化試劑，可例舉N,N-二乙基胺基三氟化硫。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～100℃，較佳為-30℃～40℃。
化合物A3可藉由使化合物A1於適當之溶劑中、在路易斯酸之存在下與呋喃進行反應來製造。作為路易斯酸，可例舉三氟化硼二乙醚錯合物。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～20℃，較佳為-78℃～-20℃。再者，此處藉由使用其他雜芳基代替呋喃，可製造式(1)中之R2 為雜芳基之化合物。
化合物A4可藉由使化合物A3在金屬觸媒之存在下與各種過碘酸進行反應來製造。作為金屬觸媒，可例舉二氧化釕。作為過碘酸，可例舉過碘酸鈉或過碘酸鉀。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉乙腈、四氯化碳、水。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-20℃～70℃，較佳為-0℃～40℃。
化合物A5可藉由使化合物A4在各種縮合劑及/或鹼之存在下或未存在下，於適當之溶劑中與對應之醇進行反應來製造，可視需要使用觸媒。作為縮合劑，可使用常規方法中使用之各種縮合劑，較佳為例舉1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺(包括鹽酸鹽)。作為鹼，可自下述例示之鹼等中適當選擇，較佳為例舉二異丙基乙基胺或三乙胺。作為觸媒，可例舉4-二甲胺基吡啶。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、二甲基甲醯胺或二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為0℃～100℃。
化合物A6可藉由使化合物A1於適當之溶劑中與三甲基鋁進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉甲苯或二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～50℃，較佳為-40℃～30℃。同樣地，藉由使用業者周知之烷化劑等試劑，可製造式(1)中之R2 為烷基之化合物等。
化合物A7例如可根據Organic Letters 2007, 9, 21, 4107-4110或ACS Catalysis 2017, 7, 3, 1998-2001中記載之方法或其組合方法進行製造。
化合物A8例如可根據J. Org. Chem. 2002, 67, 4, 1253-1260方法進行製造。即，於存在或未存在適當添加劑之條件下，使各種親核試劑與化合物A7之羰基反應，使產物之三級醇轉化為脫離基後進行脫水之方法。作為親核試劑，可例舉三氟甲基三甲基矽烷或格林納(Grignard)試劑等。作為添加劑，可例舉四丁基氟化銨。作為轉化為脫離基之轉化劑，可例舉亞硫醯氯。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、吡啶。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～150℃，較佳為-40℃～120℃。
例如，Y為SR1 、SOR1 、或SO2 R1 之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化22]
Figure 02_image046
(式中，X、Z、n及R1 與式(1)中之定義相同，q為1或2)
化合物B1可藉由使化合物a1於適當之溶劑中、在路易斯酸及還原劑之存在下與對應之二硫醚化合物進行反應來製造。作為路易斯酸，可例舉三氟化硼二乙醚錯合物。作為還原劑，可例舉三苯基膦。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉乙腈。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-50℃～100℃，較佳為-20℃～50℃。
化合物B2及B3可藉由使化合物B1於適當之溶劑中、在鹼存在下與三氟乙酸酐及尿素/過氧化氫溶液試劑進行反應來製造。作為鹼，可例舉碳酸氫鈉。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉乙腈。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-40℃～50℃，較佳為-30℃～30℃。
例如，Y為R2 (苯基等芳基)、或NR3 R4 之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化23]
Figure 02_image048
(式中，X、Z、n、R3 及R4 與式(1)中之定義相同，TMS係指三甲基矽烷基)
化合物c1可藉由使化合物a1於適當之溶劑中、在鹼存在下與三甲基氯矽烷進行反應來製造。作為鹼，可自下述例示之鹼等中適當選擇，較佳為例舉二異丙基乙基胺或三乙胺。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-50℃～100℃，較佳為-20℃～50℃。
化合物C1可藉由使化合物c1於適當之溶劑中、在三甲基溴矽烷之存在下與苯基溴化鎂進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-50℃～100℃，較佳為-20℃～70℃。同樣地，藉由使用業者周知之芳基溴化鎂等試劑，可製造式(1)中之R2 為芳基之化合物等。
化合物C2可藉由使化合物c1於適當之溶劑中、在三甲基溴矽烷之存在下與對應之胺進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-50℃～100℃，較佳為-20℃～70℃。
例如，Y為OCOR1 之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化24]
Figure 02_image050
(式中，X、Z、n或R1 與式(1)中之定義相同)
例如化合物D1可藉由使化合物a1於各種鹼之存在下、在適當之溶劑中與醯亞胺酯化試劑反應而獲得醯亞胺酯化合物後，在存在或未存在路易斯酸之條件下，利用羧酸進行處理，藉此進行製造。醯亞胺酯化步驟中所使用之醯亞胺酯化試劑可例舉三氯乙腈或三氟-N-苯基乙醯亞胺氯。又，醯亞胺基化步驟中使用之鹼可例舉二氮雜雙環十一烯或三乙胺等有機鹼、或者氫化鈉或碳酸鉀等無機鹼，可根據所使用之醯亞胺基化試劑來適當選擇。羧酸處理步驟中使用之羧酸較佳為例舉苯甲酸或乙酸，更佳為例舉苯甲酸。羧酸處理步驟中使用之路易斯酸較佳為例舉三氟化硼二乙醚錯合物。醯亞胺基化步驟中使用之溶劑可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉鹵素系溶劑或醚系溶劑，更佳為例舉二氯甲烷或四氫呋喃。反應時間通常為5分鐘～48小時，較佳為10分鐘～2小時。反應溫度通常為-78℃～100℃，較佳為-10℃～30℃。或者，可藉由在存在或未存在各種鹼之條件下與對應之醯鹵、對應之羧酸或對應之酸酐等進行反應來製造，可視需要使用縮合劑及觸媒。作為鹼，可自下述例示之鹼等中適當選擇，較佳為例舉二異丙基乙基胺或三乙胺。作為縮合劑，可使用常規方法中使用之各種縮合劑，較佳為例舉1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺(包括鹽酸鹽)。作為觸媒，可例舉4-二甲胺基吡啶。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、二甲基甲醯胺或二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為0℃～100℃。本反應可使用Eur. J. Org. Chem. 2002, 113-132等中記載之方法同樣地製造。
例如，Y為NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、NR5 CONR3 R4 、或1,2,3-三唑之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化25]
Figure 02_image052
(式中，X、Z、n、R1 、R3 、R4 及R5 與式(1)中之定義相同，W為[6]之＜群1＞中記載之取代基)
化合物e1可藉由使化合物a1於適當之溶劑中、在三甲基溴矽烷存在下與疊氮化鈉進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-50℃～70℃，較佳為-20℃～40℃。
化合物e2可藉由使化合物e1於適當之溶劑中與適當之還原劑進行反應來製造。作為還原劑，可例舉三苯基膦。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、水。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為-20℃～120℃，較佳為0℃～80℃。
化合物E1可藉由使化合物e2於存在或不存在各種鹼之條件下與對應之醯鹵、對應之羧酸或對應之羧酸酐等進行反應來製造，可視需要使用縮合劑及觸媒。作為鹼，可自下述例示之鹼等中適當選擇，較佳為例舉二異丙基乙基胺或三乙胺。作為縮合劑，可使用常規方法中使用之各種縮合劑，較佳為例舉1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺(包括鹽酸鹽)。作為觸媒，可例舉4-二甲胺基吡啶。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、二甲基甲醯胺或二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為0℃～100℃。
化合物E2可藉由使化合物e2於各種鹼之存在下、在適當之溶劑中與對應之磺醯氯進行反應來製造。作為鹼，可例舉：三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲吡啶。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為0℃～80℃。
化合物E3可藉由使化合物e2於存在或未存在鹼之情況下、在適當之溶劑中與對應之異氰酸酯進行反應來製造，或者利用光氣衍生物、羰基二咪唑、氯甲酸酯等羰基化試劑進行處理後與對應之胺進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷、四氫呋喃。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為0℃～80℃。
於化合物E1、E2及E3中，R5 為氫原子以外之情形時，可藉由如下方式進行製造：利用業者周知之方法對化合物e2導入對應之R5 後，以與上述相同之方法進行處理；或者於鹼之存在下利用適當之R5 -Cl、R5 -Br等反應劑對化合物E1、E2或E3中R3 為氫原子之化合物進行處理。
化合物E4可藉由使化合物e1於適當之溶劑中與對應之炔烴化合物進行反應來製造，即所謂Huisgen環化反應。本反應之條件已有各種相關報告，藉由在適當之溶劑中使金屬觸媒起作用而更順利地進行反應。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷、水。作為金屬觸媒，較佳為一價之銅，更佳為藉由抗壞血酸對硫酸銅(II)進行處理而於系統中產生一價銅之方法。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為20℃～80℃。
例如，Y為OR1 之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化26]
Figure 02_image054
(式中，X、Z、n或R1 與式(1)中之定義相同)
化合物F1可藉由使化合物a1於各種路易斯酸之存在下、在適當之溶劑中與對應之醇進行反應來製造。作為路易斯酸，可自下述例示之路易斯酸等中適當選擇，較佳為例舉三氟化硼二乙醚錯合物、三甲基氯矽烷、過氯酸銀。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷或二乙醚。反應時間通常為5分鐘～48小時，較佳為10分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～100℃，較佳為-78℃～50℃。
例如，Y為氰基、胺甲醯基、或胺基甲基之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化27]
Figure 02_image056
(式中，X、Z、n、及R1 與式(1)中之定義相同，此時，R1 較佳為苯基或甲基，更佳為苯基)
化合物g1可藉由使化合物D1於存在或未存在各種路易斯酸之情況下、在適當之溶劑中與各種氰化試劑進行反應來製造。作為路易斯酸，可自下述例示之路易斯酸等中適當選擇，較佳為例舉四氯化錫。作為氰化試劑，可例舉氰化三甲基矽烷或氰化鈉、氰化鉀。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉鹵素系溶劑、二甲基甲醯胺。反應時間通常為5分鐘～48小時，較佳為10分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～100℃，較佳為-78℃～50℃。
化合物G1可藉由使化合物g1於適當之溶劑中、在存在或未存在過氧化氫之情況下與各種鹼進行反應來製造。作為鹼，可自下述例示之鹼等中適當選擇，可例舉碳酸鉀、氫氧化鉀。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、第三丁醇、水。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～100℃，較佳為20℃～70℃。
化合物G2可藉由使化合物g1或化合物G1於適當之溶劑中、在路易斯酸之存在下與各種還原劑進行反應來製造。作為路易斯酸，可例舉三氟化硼二乙醚錯合物或十二羰基三釕。作為還原劑，可例舉氫化還原劑或氫矽烷系還原劑，更佳為例舉硼氫化鈉或1,1,3,3-四甲基二矽氧烷。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、甲苯。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為20℃～100℃。
例如，Y為巰基之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化28]
Figure 02_image058
(式中，X、Z、或n與式(1)中之定義相同)
化合物h1可藉由使化合物a1於各種路易斯酸之存在下、在適當之溶劑中與硫代乙酸進行反應來製造。作為路易斯酸，可自下述例示之路易斯酸等中適當選擇，較佳為例舉三氟化硼二乙醚錯合物。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～48小時，較佳為10分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～100℃，較佳為-78℃～50℃。
化合物H1可藉由使化合物h1於適當之溶劑中與鹼進行反應來製造。作為鹼，可自下述例示之鹼中適當選擇，較佳為例舉乙醇鈉。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉乙醇。反應時間通常為5分鐘～48小時，較佳為10分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～150℃，較佳為-20℃～80℃。
例如，Y為COR1 所表示之化合物可利用以下之方法進行製造。 [化29]
Figure 02_image060
(式中，X、Z、n及R1 與式(1)中之定義相同)
化合物i1可藉由使化合物A4於存在或未存在各種縮合劑及/或鹼之情況下、在適當之溶劑中與N,O-二甲基羥基胺或其鹽進行反應來製造，視需要可使用觸媒。作為縮合劑，可使用常規方法中使用之各種縮合劑，較佳為例舉1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺(包括鹽酸鹽)。作為鹼，可自下述例示之鹼等中適當選擇，較佳為例舉二異丙基乙基胺或三乙胺。作為觸媒，可例舉4-二甲胺基吡啶。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、二甲基甲醯胺或二氯甲烷。反應時間通常為5分鐘～72小時，較佳為30分鐘～24小時。反應溫度通常為0℃～200℃，較佳為0℃～100℃。
化合物I1可藉由使化合物i1於適當之溶劑中與格林納試劑進行反應來製造。作為溶劑，可自下述例示之溶劑等中適當選擇，較佳為例舉四氫呋喃、二乙醚。反應時間通常為5分鐘～48小時，較佳為10分鐘～24小時。反應溫度通常為-78℃～150℃，較佳為-20℃～80℃。
上述各製造法之各步驟中使用之鹼應根據反應或原料化合物之種類等適當進行選擇，例如可例舉：碳酸氫鈉、碳酸氫鉀之類之碳酸氫鹼金屬類；碳酸鈉、碳酸鉀之類之碳酸鹼金屬類；氫化鈉、氫化鉀之類之氫化金屬類；氫氧化鈉、氫氧化鉀之類之鹼金屬氫氧化物；甲醇鈉、第三丁醇鈉之類之鹼金屬烷氧化物類；丁基鋰、二異丙基醯胺鋰之類之有機金屬鹼類；三乙胺、二異丙基乙基胺、吡啶、4-二甲胺基吡啶(DMAP)、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯(DBU)之類之有機鹼類。
上述各製造法之各步驟中使用之溶劑應根據反應或原料化合物之種類等適當進行選擇，例如可例舉：甲醇、乙醇、異丙醇之類之醇類；丙酮、甲基酮之類之酮類；二氯甲烷、氯仿之類之鹵化烴類；四氫呋喃(THF)、二㗁烷之類之醚類；甲苯、苯之類之芳香族烴類；己烷、庚烷之類之脂肪族烴類；乙酸乙酯、乙酸丙酯之類之酯類；N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、N-甲基-2-吡咯啶酮之類之醯胺類；二甲基亞碸(DMSO)之類之亞碸類、乙腈之類之腈類；該等溶劑可單獨使用或混合2種以上使用。又，根據反應之種類，亦可使用有機鹼類作為溶劑。
式(1)等所表示之本發明之化合物或其中間物可利用業者公知之方法進行分離、純化。例如可例舉：萃取、分配、再沈澱、管柱層析(例如矽膠管柱層析、離子交換管柱層析或分取液相層析)或再結晶等。
作為再結晶溶劑，例如可使用：甲醇、乙醇或2-丙醇等醇系溶劑；二乙醚等醚系溶劑；乙酸乙酯等酯系溶劑；苯或甲苯等芳香族烴系溶劑；丙酮等酮系溶劑；二氯甲烷或氯仿等鹵素系溶劑；己烷等烴系溶劑；二甲基甲醯胺或乙腈等非質子系溶劑；水、或該等之混合溶劑等。作為其他之純化方法，可使用實驗化學講座(日本化學會編，丸善)1卷等中記載之方法等。又，本發明之化合物之分子結構之確定可參照源自各原料化合物之結構，利用核磁共振法、紅外吸收法、圓二色光譜分析法等分光學方法、及質譜法而容易地進行。
又，上述製造方法中之中間物或最終生成物藉由採取將其官能基適當轉化、另外尤其是自胺基、羥基、羰基、鹵素等擴展各種側鏈、及此時視需要進行上述保護、去保護之措施，從而亦可轉化為本發明所包含之其他化合物。即，於式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)或式(4-3)所表示之化合物中各基可經取代之情形時，藉由利用業者周知之方法適當選擇用於原料之試劑、或將官能基進行轉化、或者擴展側鏈來製造。官能基之轉化及側鏈之擴展可利用通常進行之一般方法(例如參照Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, John Wiley ＆ Sons Inc.(1999)等)進行。又，可依據Protective Groups in Organic Synthesis(Theodora W. Greene, Peter G. M. Wuts著、John Wiley ＆ Sons, Inc.發行，1999年)中記載之方法等適當進行保護、去保護。
式(1)等所表示之本發明之化合物或其製藥學上容許之鹽存在產生不對稱之情形或具有含不對稱碳之取代基之情形，此種化合物存在光學異構物。本發明之化合物亦包含該等各異構物之混合物或經單離者，可依據通常之方法進行製造。作為製造方法，例如可例舉使用具有不對稱點之原料之方法、或在中途之階段導入不對稱之方法。
例如式(3-1)所表示之化合物之光學異構物可利用Angewandte Chemie International Edition 2018, 57, 8293-8296中記載之方法進行製造(例如Y為側氧基之化合物)。又，式(3-2)所表示之化合物可利用Organic Process Research & Development 2007, 11, 3, 336-340、或Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2010, 20, 14, 4112-4115等中記載之方法進行製造。
例如於光學異構物之情形時，使用光學活性原料、或在製造步驟之適當階段進行光學拆分等，藉此可獲得光學異構物。作為光學拆分法，例如於式(1)所表示之化合物或其中間物具有鹼性官能基之情形時，可例舉非鏡像異構物法，即，於惰性溶劑中(例如甲醇、乙醇、2-丙醇等醇系溶劑；二乙醚等醚系溶劑；乙酸乙酯等酯系溶劑；甲苯等烴系溶劑；乙腈等非質子系溶劑；或選自上述溶劑中之2種以上之混合溶劑)，使用光學活性酸(例如苦杏仁酸、N-苄氧基丙胺酸、乳酸等單羧酸，酒石酸、鄰二亞異丙基酒石酸、蘋果酸等二羧酸，樟腦磺酸、溴樟腦磺酸等磺酸)來形成鹽。於式(1)所表示之本發明之化合物或其中間物具有羧基等酸性官能基之情形時，亦可使用光學活性胺(例如1-苯基乙基胺、奎寧、奎尼丁、辛可尼丁、辛可寧、番木鼈鹼等有機胺)形成鹽，從而進行光學拆分。
作為形成鹽之溫度，可自-50℃至溶劑沸點之範圍、較佳為0℃至沸點之範圍、更佳為室溫至溶劑沸點之範圍進行選擇。為了提昇光學純度，較理想為暫時使溫度提昇至溶劑之沸點附近。當過濾取出所析出之鹽時，可視需要進行冷卻而提昇產率。光學活性酸或胺之使用量宜相對於原料物質為約0.5～約2.0當量之範圍、較佳為1當量左右之範圍。亦可視需要將結晶於惰性溶劑中(例如甲醇、乙醇、2-丙醇等醇系溶劑；二乙醚等醚系溶劑；乙酸乙酯等酯系溶劑；甲苯等烴系溶劑；乙腈等非質子系溶劑；或選自上述溶劑中之2種以上之混合溶劑)進行再結晶，而獲得高純度之光學活性鹽。又，亦可視需要利用通常之方法用酸或鹼對經光學拆分之鹽進行處理，而以游離體之形態獲得。
關於以上說明之各製造法中之原料、中間物中尤其是未再次記載其製造法之物質，為市售之化合物、或可由市售化合物利用業者公知之方法、或基於其之方法進行合成
＜培養基及培養條件＞ 作為培養含有造血幹細胞之細胞集群之培養基，只要為適合維持培養造血幹細胞之培養基即可，例如可為如下培養基，其係於StemSpan SFEM培養基(STEMCELL Technologies公司製造)、StemPro34(Life Technologies公司製造)、HemEx-Type9A(Nipro公司製造)、哈姆氏F12培養基(Ham's Nutrient Mixture F12)、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，杜氏改良伊格爾培養基)、RPMI1640培養基、IMDM培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，Iscove改良杜氏培養基)等中添加幹細胞因子(Stem Cell Factor)(SCF，Peprotech公司製造)與血小板生成素(Thrombopoietin)(TPO，Peprotech公司製造)而製備。
上述培養基包含式(1)所表示之化合物或其鹽。作為式(1)所表示之化合物之例，可例舉：蒿甲醚(Artemether)、青蒿素(Artemisinin)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)。各化合物於培養基中之濃度為可以維持自我複製能力及多潛能之狀態使造血幹細胞增殖之濃度即可，例如可為0.01 μM～100 μM、較佳為0.03 μM～10 μM、0.1 μM～10 μM、0.1 μM～3 μM、0.1 μM～1 μM。蒿甲醚(Artemether)及青蒿素(Artemisinin)可為0.1 μM～10 μM，較佳為0.3 μM～10 μM、1 μM～10 μM。相對於人類造血幹細胞而言，可為更低之濃度。例如，蒿甲醚可為0.001 μM～10 μM、0.003 μM～10 μM、0.01 μM～10 μM、0.03 μM～10 μM。
上述培養基除上述化合物以外，亦可適當包含血清、脂肪酸或脂質、胺基酸、維生素、生長因子、細胞激素、胰島素、運鐵蛋白、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、抗生素等成分。血清濃度可以25%以下、較佳為5%至15%、更佳為8%至10%之濃度添加。
於本說明書中，「血清培養基」係指包含未調整或未純化之血清之培養基，「無血清培養基」係指不含未調整或未純化之血清之培養基。無血清培養基可含有血清替代物。作為血清替代物，例如可例舉適當含有白蛋白、運鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇或3-硫代甘油、或者該等之均等物等之物質。血清替代物亦可利用市售品。例如可例舉Knockout(商標)血清替代物(Serum Replacement)(KSR，Life Technologies公司製造)、化學成分確定之脂質濃縮物(Chemically-defined Lipid concentrated)(Life Technologies公司製造)、Glutamax(商標，Life Technologies公司製造)等。
培養造血幹細胞之條件並無特別限定，例如可於CO2 培養箱內以37℃、5%CO2 之條件進行培養。當接種含有造血幹細胞之細胞集群時，亦可為10細胞/mL～1×108 細胞/mL。較佳為100細胞/mL～1×107 細胞/mL。
＜培養後之細胞集群＞ 利用本發明之培養方法進行培養而獲得之細胞集群(於本說明書中，有時稱為「培養後之細胞集群」)為含有造血幹細胞之細胞集群。先前之培養方法中，絕大多數造血幹細胞因分化而逐漸消失，相對於此，根據本發明之培養方法，至少一部分造血幹細胞未分化，能夠在維持自我複製能力及多潛能之狀態下進行增殖。
作為一形態，培養後之細胞集群中之造血幹細胞數相對於總細胞數之比率為培養前細胞集群中之造血幹細胞數相對於總細胞數之比率之0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上，較佳為50%以上，更佳為60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。較佳為，培養後之細胞集群中之長期造血幹細胞數相對於總細胞數之比率為培養前細胞集群中之長期造血幹細胞數相對於總細胞數之比率之0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上，較佳為50%以上，更佳為60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。再者，利用本發明之培養方法進行培養而獲得之細胞集群中之造血幹細胞之比率有可能視培養前細胞集群中之造血幹細胞之比率而發生變化。又，藉由上述方法，亦可功能性(例如多潛能)地評價造血幹細胞之存在。基於與單離出之造血幹細胞加以比較，亦可對細胞集群中之造血幹細胞之大致比率進行評價。
即，本發明包含如下方法，即，將含有長期造血幹細胞之細胞集群中之長期造血幹細胞之比率維持0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上、較佳為50%以上、更佳為60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。
作為另一形態，培養後之細胞集群中之造血幹細胞數為培養前細胞集群中之造血幹細胞數之1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上，較佳為10倍以上，更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。作為一形態，與利用除不含本發明之化合物以外使其餘之培養條件一致之培養方法所獲得之細胞集群中之造血幹細胞數相比，培養後之細胞集群中之造血幹細胞數為1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上，較佳為10倍以上，更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。較佳為，培養後之細胞集群中之長期造血幹細胞數為培養前細胞集群中之長期造血幹細胞數之1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上，較佳為10倍以上，更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。作為一形態，與利用除不含本發明之化合物以外使其餘培養條件一致之培養方法所獲得之細胞集群中之長期造血幹細胞數相比，培養後之細胞集群中之長期造血幹細胞數為1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上，較佳為10倍以上，更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。即，只要與適當之比較對象相比，造血幹細胞數或長期造血幹細胞數得到維持或增加即可。
即，本發明包含如下方法，即，於含有造血幹細胞之細胞集群中，使造血幹細胞之細胞數與上述比較對象相比增大至1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、較佳為10倍以上、更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。又，本發明包含如下方法，即，於含有長期造血幹細胞之細胞集群中，使長期造血幹細胞之細胞數與上述比較對象相比增大至1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、較佳為10倍以上、更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。
又，本發明包含如下培養方法，即，於含有造血幹細胞之細胞集群中，使造血幹細胞數與上述比較對象相比增大至1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、較佳為10倍以上、更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上，並且，將造血幹細胞相對於總細胞數之比率維持為0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上、較佳為50%以上、更佳為60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。
又，本發明包含如下培養方法，即，於含有長期造血幹細胞之細胞集群中，使長期造血幹細胞之細胞數與上述比較對象相比增大至1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、較佳為10倍以上、更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上，並且，使長期造血幹細胞相對於總細胞數之比率維持為0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上、較佳為50%以上、更佳為60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。
又，本發明包含一種使CFU檢定中形成CFU-GEMM群落之細胞擴增之培養方法。作為一形態，由利用本發明之培養方法所獲得之細胞集群獲得之CFU-GEMM群落數相對於由比較對象獲得之CFU-GEMM群落數，增加1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、5倍以上、10倍以上。此處，比較對象例如可為利用除不含本發明之化合物以外使其餘之培養條件一致之培養方法所獲得之細胞集群、或培養前之細胞集群。即，上述[1]至[11]中記載之培養方法亦為具有形成來自造血幹細胞之混合群落(CFU-GEMM)之能力的細胞或細胞集群之培養方法。
又，本發明包含一種使如下細胞擴增之培養方法，該細胞可於向照射致死量之放射線後之免疫功能不全之NOG小鼠移植之移植實驗中長期(移植後1個月以上、較佳為2個月以上、3個月以上、4個月以上)成活。於人類造血幹細胞之培養方法之情形時，如上所述可以NOG小鼠血液中之人類CD45陽性細胞之比率作為指標，實施該評價之移植後之天數可由業者任意地設定(例如：移植後1個月後、2個月後、3個月後或4個月後)。作為一形態，包含如下培養方法，其係於移植利用本發明之培養方法所獲得之細胞集群時，人類CD45陽性細胞之比率相對於移植比較對象時之人類CD45陽性細胞之比率，增加1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、10倍以上。此處，比較對象例如可為利用除不含本發明之化合物以外使其餘之培養條件一致之培養方法所獲得之細胞集群、或培養前之細胞集群。即，上述[1]至[11]中記載之培養方法亦為如下細胞集群之培養方法，該細胞集群係當移植到哺乳動物時會使產生成熟血細胞之能力提昇。又，上述[1]至[11]中記載之培養方法亦為如下細胞集群之培養方法，其使對於骨髓之成活能力、多潛能及骨髓重建能力之至少一者、較佳為全部能力提昇。
利用本發明之培養方法進行培養而獲得之含有造血幹細胞之細胞集群可立即用於移植，當未立即使用時宜進行冷凍保存。關於冷凍保存之方法，例如於將采自血液之細胞進行冷凍之情形時，可將紅血球、血漿及白血球組分分離去除，並使用含8%二甲基亞碸與0.8%葡聚糖之保存液、或HSC-BANKER GMP級(ZENOAQ公司製造)。
移植治療時，重要的是所移植之細胞於移植接受者(受血者)之體內連續地發揮功能，為此，移植含有大量具有自我複製能力、尤其是長期自我複製能力之造血幹細胞的細胞極為重要。利用本發明之培養方法進行培養而獲得之含有造血幹細胞之細胞集群含有大量造血幹細胞、尤其是長期造血幹細胞，自我增殖能力強且具有多潛能，因此，將其用於造血幹細胞移植之情形時，長期成活能力、多潛能、骨髓重建能力優異。藉由移植長期造血幹細胞等未分化細胞組分，可期待GVHD(Graft-versus-host disease，移植物抗宿主病)抑制作用。
[培養物] 本發明之一形態提供一種培養物，其係含有造血幹細胞之細胞集群之培養物，且包含(1)利用本發明之培養方法進行培養而獲得之含有造血幹細胞之細胞集群、及(2)用以維持造血幹細胞集群之存活能力所需之介質。造血幹細胞較佳為長期造血幹細胞。
本說明書中之「培養物(culture)」係指如下液體，其包含用以維持存活能力所需之介質及細胞集群，且可包含進而添加或自細胞集群產生之生物物質。作為生物物質，例如包括細胞激素、趨化因子等，但並不限定於該等。
於一形態中，在培養物之細胞集群中，造血幹細胞(上述表現標記物之細胞、例如CD34陽性CD38陰性細胞)相對於總細胞數之比率為0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上，較佳為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。作為另一形態，於培養物之細胞集群中，長期造血幹細胞數相對於總細胞數之比率為0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上，較佳為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上。
作為本說明書中之「用以維持存活能力所需之介質」，可例舉培養基、生理緩衝溶液等，只要含有造血幹細胞之細胞集群存活，則並無特別限定，業者可適當進行選擇。作為一例，可將通常用於培養動物細胞之培養基作為基礎培養基，可列舉上述培養基。該培養基中可包含：胎牛血清、人類血清、馬血清、胰島素、運鐵蛋白、乳鐵蛋白、膽固醇、乙醇胺、亞硒酸鈉、單硫代甘油、2-巰基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、聚乙二醇、各種維生素、各種胺基酸、瓊脂、瓊脂糖、膠原蛋白、甲基纖維素等。又，該介質中可包含式(1)所表示之化合物或該等之鹽。該等化合物或其衍生物、或該等之鹽之濃度可為上述濃度範圍。例如可為0.001 μM～100 μM、0.01 μM～100 μM，較佳為0.003 μM～100 μM、0.03 μM～10 μM。
本說明書中「用以維持存活能力所需之介質」可進而包含細胞激素或作用於造血幹細胞之物質。作為細胞激素，包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、SCF、FlT3-L、血小板生成素(TPO)、紅血球生成素、及其等之類似物等，但並不限定於該等。本說明書中，所謂「類似物」包括具有生物活性之如天然型之細胞激素及生長因子之所有結構性變異形。作為作用於造血幹細胞之物質，可例舉：UM171((1r,4r)-N1-(2-benzyl-7-(2-methyl-2H-tetrazol-5-yl)-9H-pyrimido[4,5-b]indol-4-yl) cyclohexane -1,4- diamine，(1r,4r)-N1-(2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺)及其衍生物、即專利文獻2中記載之嘧啶并[4,5-b]吲哚衍生物(例如UM729(Methyl 4-((3-(piperidin-1-yl)propyl)amino)-9H-pyrimido[4,5-b]indole-7-carboxylate，4-((3-(哌啶-1-基)丙基)胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-羧酸甲酯)等，但並不限定於該等。有報告稱UM171等有造血幹細胞之維持或擴增效果(專利文獻2、非專利文獻2)。
本發明之培養方法中使用之培養基亦可包含UM171及其衍生物。作為該衍生物，例如可參照專利文獻2(WO2013/110198)。
[製造方法] 本發明之造血幹細胞之製造方法包括：準備含有造血幹細胞之細胞集群之步驟；及培養含有造血幹細胞之細胞集群之步驟，其係藉由本發明之培養方法培養含有造血幹細胞之細胞集群。
作為本發明之造血幹細胞之製造方法之一形態，包括如下步驟： (1)準備含有造血幹細胞之細胞集群、 (2)培養包含上述細胞集群之細胞集群、及 (3)回收造血幹細胞。
＜步驟(1)＞ 於本發明之製造方法中之步驟(1)、即準備含有造血幹細胞之細胞集群之步驟中，含有造血幹細胞之細胞集群可利用業者周知之方法加以準備。例如，可藉由自血液(末梢血、或臍帶血)或骨髓進行採集、或由多能性幹細胞(例如iPS細胞、ES細胞)以人工方式製作來準備。又，含有造血幹細胞之細胞集群亦可以市售品獲取。
作為自骨髓採集之方法，可自哺乳動物、例如人類、猴、小鼠、大鼠等動物中採集適量之骨髓，於無Ca2 ＋ 及Mg2 ＋ 之PBS中添加含有最終濃度2%熱處理失活牛血清(Gibco公司製造)及最終濃度2 mM之EDTA(Ethylene diaminetetra acetic acid，乙二胺四乙酸)溶液的緩衝液，以機械方式破壞骨髓組織，從而獲得含有造血幹細胞之細胞集群。
作為自血液採集之方法，可自哺乳動物、例如人類、猴、小鼠、大鼠等動物採集適量之血液，依據常規方法製備PBMC(Peripheral blood mononuclear cell，周邊血單核細胞)組分，藉此獲得含有造血幹細胞之細胞集群。血液使用末梢血、臍帶血均可。血液亦可為依據常規方法投予粒細胞群落刺激因子(G-CSF)等藥劑而得之動員血液。藉由投予粒細胞群落刺激因子(G-CSF)等藥劑，可於末梢血中動員造血幹細胞。
作為自臍帶血採集之方法，可使用業者已知之方法。作為一例，自哺乳動物、例如人類、猴、小鼠、大鼠等動物，將該等動物之新生兒與臍帶切斷後，向臍帶血管中紮入採集用針，將臍帶血採集至採集袋中。其次，添加羥乙基澱粉而使紅血球凝集並進行離心後，去除紅血球及血漿，而可獲得含有造血幹細胞之細胞集群。
可利用100 μm、70 μm、40 μm之過濾器對上述含有造血幹細胞之細胞集群進行過濾。又，亦可將過濾後之細胞集群利用經螢光標記之針對上述造血幹細胞標記物之抗體進行染色，藉由MACS(Magnetic-activatedcell sorting，磁激活細胞分選)或FACS(Fluorescence activated cell sorter，螢光激發細胞分選儀)等回收造血幹細胞標記物陽性細胞，藉此使造血幹細胞及前驅物細胞集群富集。
所獲得之含有造血幹細胞之細胞集群中之造血幹細胞、造血前驅細胞等之細胞種類可藉由利用流式細胞分析或qRT-PCR(real-time quantitative-polymerase chain reaction，即時定量-聚合酶鏈反應)，進行造血幹細胞、造血前驅細胞等之標記物表現解析來確認。又，亦可使用於標記物基因啟動子之下游表現mCherry等螢光蛋白之系統，以螢光蛋白表現作為指標來回收標記物基因陽性細胞(即，長期造血幹細胞)。作為標記物基因，可使用上述基因。
如此獲得之含有造血幹細胞之細胞集群中，造血幹細胞之比率並無限定，其比率高為佳，例如較佳為含有0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、或90%以上之造血幹細胞。小鼠造血幹細胞如上所述，可利用流式細胞分析或qRT-PCR進行造血幹細胞標記物之表現解析，藉此進行確認。
如此獲得之含有造血幹細胞之細胞集群較佳為含有長期造血幹細胞，較佳為例如含有0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、或90%以上之長期造血幹細胞。長期造血幹細胞如上所述，例如可藉由Hoxb5等標記物之表現進行確認。
作為由多能性幹細胞(例如iPS細胞、ES細胞)以人工方式製作含有造血幹細胞之細胞集群之方法，可使用公知之方法。作為一形態，可例舉下述非專利文獻中記載之方法。具體而言，由iPS細胞製作胚狀體後，單離出CD34陽性FLK1陽性細胞。其後，使作為轉錄因子之ERG、HoxA5、HoxA9、HoxA10、LCOR、RUNX1、SPI1表現，可獲得含有造血幹細胞之細胞集群(Nature. 201725：545 (7655)432-438)。
步驟(1)中亦可包括：預培養含有造血幹細胞之細胞集群之步驟、及/或將使用特定標記物之造血幹細胞(長期造血幹細胞)回收之步驟等。
＜步驟(2)＞ 本發明之製造方法中之步驟(2)、即培養步驟，如本發明之培養方法中記載之方法所述。即，培養步驟包括於含有本發明之化合物之培養基中進行培養。步驟(2)中獲得的是含有造血幹細胞之細胞集群(以下有時稱為「利用本發明之製造方法所製造之含有造血幹細胞之細胞集群」)。利用本發明之製造方法所製造之含有造血幹細胞之細胞集群如利用本發明之培養方法進行培養而獲得之含有造血幹細胞之細胞集群所述。
本發明之培養方法之含有造血幹細胞之細胞集群之培養條件可由業者適當設定。本發明之化合物之濃度只要於上述濃度之範圍內進行設定即可。又，培養天數亦無特別限定，例如可為1天至30天，較佳為21天、14天、7天、3天。該等培養條件亦可基於所需之造血幹細胞之擴增狀態進行設定。作為一形態，可將造血幹細胞數(宜為以上述各種標記物之陽性及陰性之狀態所定義之細胞集群)進行培養直至與上述比較對象相比增大至1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、較佳為10倍以上、更佳為20倍以上、50倍以上、100倍以上。作為一形態，亦可對於CFU檢定中CFU-GEMM群落數增加之條件(例如相對於比較對象，CFU-GEMM群落數增加1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、10倍以上之條件)進行設定。
亦可使用進而含有上述細胞激素之培養基進行培養。具體而言，可為含有選自由IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、SCF、FlT3-L、血小板生成素(TPO)、紅血球生成素、及其等之類似物所組成之群中之1種以上的培養基。作為一形態，可使用含有IL-6、SCF、FLT3-L及TPO之培養基。
於不阻礙本發明之化合物效果之範圍內，亦可與已知使造血幹細胞得以維持、擴增之公知物質組合來進行培養。例如，可使用進而含有UM171或其衍生物之培養基進行培養。UM171或其衍生物之濃度視培養條件而異，可由業者適當設定。作為一形態，UM171或其衍生物之濃度宜為1 nM～10 μM。如上所述，亦可將造血幹細胞數或CFU-GEMM群落數作為指標來設定濃度。
＜步驟(3)＞ 本發明之製造方法中之步驟(3)、即回收步驟為如下步驟，即，自步驟(2)中培養而獲得之含有造血幹細胞之細胞集群中，使用特定之標記物回收造血幹細胞(長期造血幹細胞)。例如，可使用上述造血幹細胞之標記物，藉由MACS或FACS等，自步驟(2)中培養而獲得之含有造血幹細胞之細胞集群中回收造血幹細胞或長期造血幹細胞。
本發明之製造方法亦可進而包括：將步驟(3)中回收之造血幹細胞填充至容器(輸注袋等)之步驟、及/或將所獲得之細胞冷凍之步驟等。
[造血幹細胞培養用試劑] 本發明之一形態提供一種造血幹細胞培養用試劑，其含有至少一種式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)之任一式所表示之化合物或其鹽。
[套組] 本發明之一形態提供一種造血幹細胞培養套組，其包含(1)適於維持培養造血幹細胞之培養基、及(2)式(1)、式(2)、式(3-1)、式(3-2)、式(3-3)、式(4-1)、式(4-2)及式(4-3)之任一式所表示之化合物或該等之鹽(於本說明書中稱為「本發明之化合物」)。
作為式(1)所表示之化合物之一例、即本發明之化合物之較佳例，可例舉以下之化合物。 蒿甲醚(Artemether)、 青蒿素(Artemisinin)、 青蒿醇(Artenimol)、 蒿乙醚(Artemotil)、 青蒿琥酯(Artesunate)、以及實施例1-1～1-28之化合物及實施例1-33～1-34之化合物。 作為式(1)所表示之化合物之較佳例，可例舉以下之化合物。 蒿甲醚(Artemether)、 青蒿素(Artemisinin)、 青蒿醇(Artenimol)、 蒿乙醚(Artemotil)、 青蒿琥酯(Artesunate) (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 1-[3R,(5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(2-甲氧基乙氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英
該套組亦可含有UM171或其衍生物。UM171或其衍生物如上所述。
適於維持培養造血幹細胞之培養基只要為上述培養基，則無特別限定。
該套組中亦可包含用以將造血幹細胞單離之抗體及/或用以進行細胞分選之試劑。用以將造血幹細胞單離之抗體只要為針對上述標記物之抗體即可，較佳為經螢光蛋白等標記。作為用以進行細胞分選之試劑，例如包含用於MACS或FACS之經標記之二次抗體或分離用管柱等。
該套組可以單一組合物之形式包含(1)適於維持培養造血幹細胞之培養基、及(2)式(1)所表示之化合物或該等之鹽，亦可以個別之組合物之形式包含該兩者。
於一形態中，包含(2)式(1)所表示之化合物、或該等之鹽之組合物可作為用以維持培養造血幹細胞之培養輔助組合物，有別於(1)適於維持培養造血幹細胞之培養基另行提供。
[移植] 利用上述方法等製造之含有造血幹細胞之細胞集群可移植到需要移植之對象(例如哺乳動物)，移植後之造血幹細胞於對象(受血者)之骨髓中成活，從而可產生血液。作為能夠成為對象之哺乳動物，例如可例舉：人類、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、山羊、猴等。含有造血幹細胞之細胞集群較佳為製備成醫藥組合物後再進行移植。
含有造血幹細胞之細胞集群之移植例如藉由靜脈內投予(點滴靜注等)等實施。
於用以治療白血病等血癌進行移植之情形時，為了儘可能地殺毀體內殘存之癌細胞，使患者自身之免疫力下降而容易使移植細胞成活，存在進行將抗癌劑、CAR-T細胞療法、或全身放射線照射、進而免疫抑制劑組合之處理等移植前處理之情況。
[醫藥組合物] 本發明之一形態提供一種醫藥組合物，其包含有效量之利用上述製造方法製造之造血幹細胞之細胞集群。移植用細胞集群之有效量視投予目的、投予方法、及投予對象之狀況(性別、年齡、體重、症狀等)而不同，例如可以細胞數計，相對於患者體重設為1×107 個～1×1010 個/kg。
一形態之醫藥組合物包含有效量之利用本發明之製造方法製造之上述移植用細胞集群、及作為醫藥所容許之載體。
關於作為醫藥所容許之載體，可使用生理水性溶劑(生理鹽水、緩衝液、無血清培養基等)。必要時，於醫藥組合物中，在移植醫療方面，於包含待移植之組織或細胞之醫藥中亦可含有通常用作副成分之保存劑、穩定劑、還原劑、等張劑等。例如可例舉：二甲基亞碸、葡聚糖、人血清白蛋白、乙醯基色胺酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣水合物、氯化鎂、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉水合物、二氧化碳等，但並不限定於該等。
作為本說明書中之醫藥組合物之一形態，可以細胞懸浮液之形式進行靜脈內投予(點滴靜注)。作為一形態，提供一種含有造血幹細胞之細胞集群之輸注袋。該輸注袋中亦可包含上述副成分。例如可將該袋內容物利用生理鹽水等進行稀釋後再使用。
作為本說明書中之醫藥組合物之一形態，醫藥組合物可以冷凍狀態提供。例如，可藉由在37℃之水浴中解凍而使用。解凍後亦可利用生理鹽水等進行稀釋。
本發明之一形態提供一種醫藥組合物，其含有本發明之化合物本身，且用於治療要求造血幹細胞之再生或增強之疾病、具體而言為白血病等血癌。一形態之醫藥組合物包含有效量之本發明之化合物、及作為醫藥所容許之載體。
[治療用藥及治療方法] 利用本發明之製造方法所製造之造血幹細胞之細胞集群於針對血癌等失去造血幹細胞功能之患者補充造血幹細胞之移植醫療中有用。因此，本發明之一形態提供一種用以補充造血幹細胞之治療用藥(例如血癌之治療用藥)，其含有利用本發明之製造方法所製造之造血幹細胞。對需要移植之罹患血癌、再生不良性貧血、先天性障礙性貧血、後天性免疫缺陷症候群(AIDS)等免疫缺陷症候群、無γ-球蛋白血症、骨髓障礙性血小板減少症、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、鐮刀型紅血球疾病等先天性貧血等疾病之患者移植利用本發明之製造方法所製造之含有造血幹細胞之細胞集群，該造血幹細胞產生新的血液，藉此可對該患者進行治療。作為血癌，可例舉：白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤等。作為白血病，例如可例舉：急性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓化生不良症候群、成人型T細胞性白血病(adult T-cell leukemia，ATL)、慢性淋巴球性白血病等。作為惡性淋巴瘤，例如可例舉濾泡性淋巴瘤、侵略性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等。 又，本發明之一形態提供一種要求造血幹細胞之再生或增強之疾病、具體而言為白血病等血癌之治療方法，其包括將本發明之化合物本身投予至對象。
以下，藉由參考例、實施例及試驗例對本發明更具體地進行說明，當然，本發明並不限定於此。再者，以下之參考例及實施例中示出之化合物名係使用ACD/Labs 2016.2.2命名，未必依據IUPAC命名法。
為了簡化說明書之記載，於參考例、實施例及實施例中之表中，有時亦使用以下所示之縮寫。至於用作取代基之縮寫，Me係指甲基、CN係指氰基、Bz係指苯甲醯基、TMS係指三甲基矽烷基、N3 係指疊氮基、tert係指第三(tertiary)。作為NMR中所使用之記號，s係指單峰、d係指二重峰、t係指三重峰、m係指多重峰及J係指耦合常數。作為單位中所使用之記號，M係指莫耳濃度。
以下例舉實施例對本發明進行詳細說明，但本發明不受該等任何限定。 [實施例]
實施例1-17 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺 [化30]
Figure 02_image062
a)苯甲酸(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基酯(化合物Q2)之製造 將市售之二氫青蒿素(Q1、Adams Reagent Ltd.(目錄編號01108787)、284 mg)、三氯乙腈(156 mg)、二氮雜雙環十一烯(7.58 mg)之二氯甲烷溶液(5mL)於室溫下徹夜攪拌。向反應溶液中添加苯甲酸(365 mg)之二氯甲烷溶液(5 mL)，於室溫下攪拌2小時。反應結束後，添加飽和碳酸氫鈉溶液(10 mL)、水(10 mL)，利用硫酸鈉對有機層進行乾燥。減壓蒸餾去除溶劑而獲得化合物Q2(250 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 8.03-8.01 (2H, m), 7.61 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.49 (2H, d, J = 4.6 Hz), 6.53 (1H, d, J = 3.2 Hz), 5.59 (1H, s), 2.98-2.94 (1H, m), 2.46-2.38 (1H, m), 2.10-1.89 (4H, m), 1.83-1.79 (1H, m), 1.68-1.64 (1H, m), 1.64-1.49 (5H, m), 1.45-1.35 (1H, m), 1.08-1.02 (4H, m), 0.98 (3H, d, J = 7.6 Hz).
b)(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲腈(化合物Q3)之製造 將上述實驗中獲得之化合物Q2(100 mg)、氰化三甲基矽烷(76.4 mg)之二氯甲烷溶液(2 mL)於-78℃下攪拌5分鐘。其後添加四氯化錫(26.7 mg)，於-78℃下攪拌2小時。減壓蒸餾去除反應溶劑，利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)對所獲得之殘渣進行純化，藉此獲得化合物Q3(40 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.55 (1H, s), 4.79 (1H, d, J = 6.0 Hz), 2.93-2.88 (1H, m), 2.43-2.35 (1H, m), 2.12-2.06 (1H, m), 2.01-1.91 (2H, m), 1.87-1.76 (2H, m), 1.67-1.62 (1H, m), 1.56-1.43 (5H, m), 1.42-1.41 (1H, m), 1.09 (3H, d, J = 7.2 Hz), 1.10-0.99 (4H, m).
c)1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺(實施例1-17)之製造 將化合物Q3(100 mg)、硼氫化鈉(64.6 mg)、三氟化硼二乙醚錯合物(115 mg)之四氫呋喃溶液(4 mL)於65℃下攪拌2小時。反應結束後，利用二氯甲烷-碳酸氫鈉溶液進行分液萃取。利用飽和食鹽水清洗有機層，並利用硫酸鈉進行乾燥，其後進行減壓蒸餾去除。將所獲得之殘渣、二碳酸二第三丁酯(110 mg)、三乙胺(101 mg)之四氫呋喃溶液(3 mL)於室溫下攪拌2小時。反應結束後，減壓蒸餾去除反應溶劑，利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得產物(45 mg)。將該產物(25 mg)、3M鹽酸-乙酸乙酯(1 mL)之二氯甲烷溶液(2 mL)於室溫下攪拌2小時。將反應溶劑蒸餾去除，獲得作為鹽酸鹽之實施例1-17之化合物(10 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 8.36 (3H, s), 5.56-5.36 (1H, m), 4.65-4.44 (1H, m), 3.26 (2H, s), 3.01-2.78 (1H, m), 2.43-2.11 (1H, m), 2.02-1.91 (2H, m), 1.78-1.76(1H, m), 1.66 (3H, s), 1.48 (3H, s), 1.30-1.19 (3H, m), 0.98-0.87 (7H, m).
實施例1-1及1-28 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-10-氟-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英(實施例1-1)、及(3R,5aS,6R,8aS,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-3,4,5,5a,6,7,8,8a-八氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英(實施例1-28) [化31]
Figure 02_image064
向Q1(1.136 g)之二氯甲烷溶液(24 mL)中，以0℃滴加N,N-二乙基胺基三氟化硫(0.6 mL)，於室溫下攪拌16小時。反應結束後冷卻至0℃，添加5%碳酸鈉水溶液(20 mL)，於室溫下攪拌2小時。利用1 M鹽酸水溶液、碳酸氫鈉溶液、水清洗有機層後，利用硫酸鈉進行乾燥。減壓蒸餾去除溶劑後，對所獲得之殘渣利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得實施例1-1之化合物(283 mg)及實施例1-28之化合物(59 mg)。 實施例1-1 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): 5.60 (1H, d, J = 54.4, 2.0 Hz), 5.56 (1H, d, J = 1.6 Hz), 2.72-2.56 (1H, m), 2.38 (1H, m), 2.09-2.02 (1H, m), 1.95-1.81 (2H, m), 1.72-1.65 (1H, m), 1.62-1.58 (1H, m), 1.55-1.50 (2H, m), 1.50-1.45 (1H, m), 1.43 (3H, s), 1.40-1.32 (1H, m), 1.32-1.23 (1H, m), 0.99 (3H, d, J = 7.6 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.0 Hz). 實施例1-28 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 6.19 (1H, d, J = 1.6 Hz), 5.54 (1H, s), 2.40 (1H, m), 2.10-2.00 (2H, m), 1.95-1.86 (1H, m), 1.73-1.62 (2H, m), 1.59 (3H, s), 1.54-1.51 (1H, m), 1.48-1.38 (5H, m), 1.26-1.03 (2H, m), 0.98 (3H, d, J = 5.6 Hz).
實施例1-7 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-(呋喃-2-基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化32]
Figure 02_image066
向上述實驗中獲得之實施例1-1之化合物(285 mg)、呋喃(338 mg)之二氯甲烷溶液(10 mL)中於氮氣氛圍下、-78℃下添加三氟化硼二乙醚錯合物(16.8 mg)，於-50℃下攪拌5小時。反應結束後，利用二氯甲烷-碳酸氫鈉溶液進行分液萃取。減壓蒸餾去除有機層之溶劑，並對所獲得之殘渣利用逆相管柱層析法(洗提溶劑；乙腈：水(添加甲酸))進行純化，藉此獲得實施例1-7之化合物(33 mg)。 1H NMR (500 MHz, CDCl3 ): δ  7.39 (1H, s), 6.33-6.31 (1H, m), 5.38 (1H, s), 4.46 (1H, d, J = 10.5Hz), 2.90-2.82 (1H, m), 2.39(1H, m), 2.08-2.01 (1H, m), 1.93-1.83 (1H, m), 1.77-1.71 (2H, m), 1.66-1.60 (1H, m) , 1.53-1.47 (2H, m), 1.42-1.34 (4H, m), 1.33-1.24 (1H, m), 1.11-1.02 (1H, m), 0.98 (4H, d, J = 5.5 Hz), 0.93 (3H, d, J = 7.5 Hz).
實施例1-8 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-羧酸 [化33]
Figure 02_image068
將實施例1-7(90 mg)溶解於乙腈(1 mL)、四氯化碳(1 mL)及水(1 mL)之混合物中。添加過碘酸鈉(286 mg)，繼而添加氯化銠(III)三水合物(7 mg)，於室溫下攪拌3小時。反應結束後，利用二氯甲烷-碳酸氫鈉溶液進行分液萃取，減壓蒸餾去除有機層之溶劑。對所獲得之殘渣利用逆相管柱層析法(洗提溶劑；乙腈：水(添加甲酸))進行純化，藉此獲得實施例1-8之化合物(35 mg)。 1H NMR (500 MHz, CDCl3 ): δ 5.37 (1H, s), 4.06 (1H, d,  J = 11.5 Hz), 2.61-2.53 (1H, m), 2.39 (1H, m), 2.08-2.02 (1H, m), 1.95- 1.88 (1H, m), 1.80-1.73 (2H, m), 1.64-1.37 (1H, m), 1.50-1.44 (1H, m), 1.43 (3H, s), 1.39-1.25 (3H, m), 1.10-1.02 (1H, m), 0.98 (3H, d, J = 1.5 Hz), 0.97 (3H, s).
實施例1-6 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9,10-四甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化34]
Figure 02_image070
使用Tetrahedron Lett. 1998, 39, 1533-1536中記載之方法，由實施例1-1之化合物(70 mg)製造實施例1-6之化合物(11 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.36 (1H, s), 4.36-4.33 (1H, m), 2.73-2.66 (1H, m) , 2.34 (1H, m), 2.06-2.01 (1H, m), 1.93-1.78 (2H, m), 1.70-1.62 (1H, m), 1.60-1.51 (1H, m ), 1.51-1.45 (1H, m), 1.45-1.39 (4H, m), 1.36-1.28 (1H, m), 1.26-1.22  (4H, m), 0.99-0.92 (4H, m), 0.86 (3H, d, J = 7.6 Hz).
實施例1-2 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化35]
Figure 02_image072
a)三甲基{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}矽烷(化合物Q4)之製造 於0℃下，向Q1(300 mg)、三乙胺(132 mg)之二氯甲烷溶液(4 mL)中添加氯三甲基矽烷(142 mg)，於0℃下攪拌1.5小時。反應結束後添加冰水(5 g)，利用二氯甲烷萃取出水層，利用硫酸鈉對有機層進行乾燥。減壓蒸餾去除溶劑後，對所獲得之殘渣利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得化合物Q4(70 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.34 (1H, s), 4.78 (1H, d, J = 9.2 Hz), 2.42-2.31(2H, m), 2.06-2.01 (1H, m), 1.93-1.86 (1H, m), 1.79-1.67 (2H, m), 1.57-1.47 (2H, m), 1.44 (3H, s), 1.40-1.30 (3H, m), 1.05-0.95 (4H, m), 0.88 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.21 (9H, s).
b)(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英(實施例1-2)之製造 使用Eur.J.Org.Chem.2003, 2098-2114中記載之方法，由化合物Q4(200 mg)製造實施例1-2之化合物(24.2 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 7.34-7.31 (4H, m), 7.27-7.22 (1H, m), 5.74 (1H, d, J = 6.8 Hz), 5.60 (1H, s), 2.80-2.74 (1H, m), 2.40-2.32 (1H, m), 2.11-2.00 (2H, m), 1.91-1.85 (1H, m), 1.78-1.67 (2H, m), 1.47-1.43 (1H, m), 1.41 (3H, s), 1.37-1.26(4H, m), 1.01 (3H, d, J = 6.0 Hz), 0.53 (3H, d, J = 7.6 Hz).
實施例1-3及實施例1-4 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(甲基硫基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英(實施例1-3)與(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(甲基硫基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英(實施例1-4) [化36]
Figure 02_image074
使用J. Org. Chem. 2004, 69, 984-986中記載之方法，由Q1(100 mg)製造實施例1-3之化合物(50 mg)與實施例1-4之化合物(6.8 mg)。 實施例1-3 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.34 (1H, s), 4.48 (1H, d, J = 5.2 Hz), 2.65-2.60 (1H, m), 2.43-2.35 (1H, m), 2.21 (3H, s), 2.07-2.01 (1H, m), 1.94-1.87 (1H, m), 1.78-1.71 (2H, m), 1.64-1.62 (1H, m), 1.56-1.48 (1H, m), 1.45 (3H, s), 1.42-1.33 (2H, m), 1.31-1.23 (1H, m), 1.07-1.03 (1H, m), 0.99-0.94 (6H, m). 實施例1-4 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.60 (1H, s), 5.19 (1H, d, J = 5.2 Hz), 3.07-3.03 (1H, m), 2.42-2.34 (1H, m), 2.21 (3H, s), 2.08-2.02 (1H, m), 1.92-1.81 (2H, m), 1.74-1.65 (2H, m), 1.54-1.44 (2H, m), 1.40 (3H, s), 1.39-1.35 (1H, m), 1.26-1.25 (1H, m), 0.98-0.92 (7H, m).
實施例1-5 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-10-(甲磺醯基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化37]
Figure 02_image076
使用J. Org. Chem. 2004, 69, 984-986中記載之方法，由實施例1-3之化合物(55 mg)製造實施例1-5之化合物(18.5 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.40 (1H, s), 4.35 (1H, d, J = 11.2 Hz), 2.96 (3H, s), 2.87-2.82 (1H, m), 2.42-2.34 (1H, m), 2.06-2.01 (1H, m), 1.95-1.88 (1H, m), 1.84-1.73 (2H, m), 1.50-1.40 (4H, m), 1.37-1.26 (4H, m), 1.14 (3H, d, J = 7.2 Hz), 1.10-1.03 (1H, m), 0.97 (3H, d, J = 6.0 Hz).
實施例1-9 4-苯基-1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]-1H-1,2,3-三唑 [化38]
Figure 02_image078
a)(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-疊氮基-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英(化合物Q5)之製造 使用Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 382-385中記載之方法，由Q1(100 mg)製造化合物Q5(30 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.41 (1H, s), 4.63 (1H, d, J = 10.0 Hz), 2.37-2.47 (2H, m), 2.03-2.09 (1H, m), 1.89-1.95 (1H, m), 1.71-1.81 (2H, m), 1.48-1.57 (1H, m), 1.47 (3H, s), 1.25-1.37 (4H, m), 0.89-1.09 (1H, m), 0.86 (3H, d, J = 4.0 Hz), 0.86 (3H, d, J = 2.4 Hz).
b)4-苯基-1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]-1H-1,2,3-三唑(實施例1-9)之製造 使用Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 382-385中記載之方法，由化合物Q5(90 mg)製造實施例1-9之化合物(20 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 7.98 (1H, s), 7.86-7.84 (2H, m), 7.45-7.41 (2H, m), 7.36-7.32 (1H, m), 5.89 (1H, d, J = 10.4 Hz), 5.49 (1H, s), 3.63-3.60 (1H, m), 2.97-2.92 (1H, m), 2.14-1.88 (5H, m), 1.67-1.60 (4H, m), 1.35-1.15 (4H, m), 0.94 (3H, d, J=6.4 Hz), 0.85 (3H, d, J = 7.2 Hz).
實施例1-10 N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]乙醯胺 [化39]
Figure 02_image080
a)(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-胺(化合物Q6)之製造 使用Bioorg. Chem. 2016, 66, 63-71中記載之方法，由化合物Q5(100 mg)製造化合物Q6(87 mg)。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ: 5.33 (1H, s), 4.20 (1H, d, J = 9.7Hz), 1.94-1.84 (2H, m), 1.75 (3H, m), 1.52 (2H, m), 1.46-1.41 (4H, m), 1.31-1.22 (4H, m), 0.98-0.90 (6H, m).
b)N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]乙醯胺(實施例1-10)之製造 將化合物Q6(87 mg)、乙酸酐(15.6 mg)與4-二甲胺基吡啶(44.9 mg)之二氯甲烷溶液(5.0 mL)於室溫下攪拌15小時。反應結束後，利用二氯甲烷-5%鹽酸水溶液進行分液萃取，將有機層利用硫酸鈉乾燥後進行減壓蒸餾去除。對所獲得之殘渣利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；二氯甲烷：甲醇)進行純化，藉此獲得實施例1-10之化合物(43 mg)。 1H-NMR (500 MHz, CDCl3 ) δ:6.01 (1H, d, J = 9.7 Hz), 5.42 (1H, s), 5.34 (1H, t, J = 10.2 Hz), 2.42-2.34 (2H, m), 2.03 (3H, s), 1.92-1.88 (1H, m), 1.80-1.77 (2H, m), 1.72 (1H, d, J = 3.3 Hz), 1.57-1.52 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.29 (1H, d, J = 4.2 Hz), 1.28-1.25 (2H, m), 1.13-1.04 (1H, m), 1.02 (1H, d, J = 12.2 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.87 (3H, d, J = 7.2 Hz).
實施例1-11 N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲磺醯胺 [化40]
Figure 02_image082
向化合物Q6(20 mg)之二氯甲烷溶液中，於0℃下添加甲磺醯氯(24.1 mg)與三乙胺(21.3 mg)，於室溫下攪拌17小時。反應結束後，利用二氯甲烷-飽和碳酸氫鈉溶液進行分液萃取，利用1 M鹽酸水溶液清洗有機層，利用硫酸鈉進行乾燥，其後進行減壓蒸餾去除。對所獲得之殘渣利用逆相管柱層析法(洗提溶劑；乙腈：水(添加甲酸))進行純化，藉此獲得實施例1-11之化合物(14 mg)。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.37 (1H, s), 5.05 (1H, d, J = 10.5 Hz), 4.78 (1H, t, J = 10.4 Hz), 3.18 (3H, s), 2.44-2.33 (2H, m), 2.08-2.01 (1H, m), 1.95-1.88 (1H, m), 1.78-1.73 (2H, m), 1.53-1.49 (2H, m), 1.42 (3H, s), 1.39-1.28 (3H, m), 1.02 (1H, d, J = 14.9 Hz), 0.96 (6H, m).
實施例1-13 4-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]𠰌啉 [化41]
Figure 02_image084
使用Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2082-2088中記載之方法，由化合物Q4(150 mg)獲得實施例1-13之化合物(24 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.30 (1H, s), 4.00 (1H, d, J = 10.0 Hz), 3.76-3.66 (4H, m), 3.03-2.98 (2H, m), 2.71-2.66 (2H, m), 2.63-2.57 (1H, m), 2.41-2.33 (1H, m), 2.06-2.00 (1H, m), 1.92-1.85 (1H, m), 1.77-1.69 (2H, m), 1.58-1.48 (2H, m), 1.42 (3H, s), 1.40-1.32 (2H, m), 1.26-1.22 (1H, m), 1.08-1.01 (1H, m), 0.97 (3H, d, J = 6.0 Hz), 0.84 (3H, d, J = 7.6 Hz).
實施例1-12 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-N,N,3,6,9-五甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-胺 [化42]
Figure 02_image086
使用對應之原料化合物，與實施例1-13同樣地進行反應、處理，獲得實施例1-12之化合物。1 H-NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.31 (1 H, s), 4.05 (1H, d, J = 10.2 Hz), 2.56-2.51 (1H, m), 2.42 (6H, s), 2.40-2.33 (1H, m), 2.06-2.00 (1H, m), 1.91-1.88 (1H, m), 1.76-1.76 (1H, m), 1.57-1.54 (2H, m), 1.42(3H, d, J = 8.8 Hz), 1.42-1.37 (1H, m), 1.27-1.21 (2H, m), 1.09 (1H, m), 1.04-0.98 (1H, m), 0.95 (3H, d, J = 6.3 Hz), 0.82 (3H, d, J = 7.2 Hz).
實施例1-14 乙酸(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基酯 [化43]
Figure 02_image088
使用Eur. J. Org. Chem. 2002, 113-132中記載之方法，由Q1(100 mg)製造實施例1-14之化合物(28 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.81 (1H, d, J = 10.0 Hz), 5.47 (1H, s), 2.62-2.56 (1H, m), 2.44-2.36 (1H, m), 2.15 (3H, s), 2.09-2.03 (1H, m), 1.95-1.88 (1H, m), 1.83-1.72 (2H, m), 1.68-1.62 (1H, m), 1.56-1.48 (1H, m), 1.46 (3H, s), 1.44-1.40 (1H, m), 1.34-1.27 (2H, m), 1.09-1.02 (1H, m), 0.99 (3H, d, J = 6.0 Hz), 0.88 (3H, d, J = 6.8 Hz).
實施例1-15 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺 [化44]
Figure 02_image090
使用ChemMedChem 2016, 11, 1469-1479中記載之方法，由化合物Q3(100 mg)獲得實施例1-15之化合物(50 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 6.58 (1H, s), 5.50-5.34 (2H, m), 4.83 (1H, d, J = 6.4 Hz), 2.94-2.88 (1H, m), 2.41-2.33 (1H, m), 2.09-1.95 (2H, m), 1.87-1.67 (3H, m), 1.43 (3H, s), 1.32-1.22 (4H, m), 1.13 (3H, d, J = 7.6 Hz), 1.00-0.97 (4H, m).
實施例1-16 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺 [化45]
Figure 02_image092
使用ChemMed Chem 2016, 11, 1469-1479中記載之方法，由化合物Q3(30 mg)獲得實施例1-16之化合物(10 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 6.58 (1H, s), 5.35-5.34 (2H, m), 3.93 (1 H, d, J = 11.2 Hz), 2.56-2.50 (1H, m), 2.43-2.37 (1H, m), 2.09-2.04 (1H, m), 1.97-1.90 (1H, m), 1.81-1.74 (2H, m), 1.56-1.48 (2H, m), 1.45 (3H, s), 1.41-1.28 (3H, m), 1.12-1.05 (1H, m), 1.00-0.97 (6H, m).
實施例1-18 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺 [化46]
Figure 02_image094
將實施例1-16之化合物(400 mg)、十二羰基三釕(24.5 mg)、1,1,3,3-四甲基二矽氧烷(686 mg)之甲苯溶液(8 mL)於50℃下徹夜攪拌。反應結束後添加水，利用二氯甲烷進行萃取。將有機層利用硫酸鈉乾燥後進行減壓蒸餾去除。將所獲得之殘渣、二碳酸二第三丁酯(766 mg)、三乙胺(590 mg)之二氯甲烷溶液(8 mL)於室溫下攪拌5小時。反應結束後，減壓蒸餾去除反應溶劑，利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得產物(150 mg)。將該產物(75 mg)、鹽酸-乙酸乙酯(1.5 mL)之二氯甲烷溶液(2.5 mL)於室溫下攪拌5小時。將反應溶劑蒸餾去除，獲得作為鹽酸鹽之實施例1-18之化合物(28.6 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 8.31 (3H, s), 5.37-5.32 (1H, m), 3.98-3.96 (1H, m), 3.35-3.34 (1H, m), 3.08-3.09 (1H, m), 240-2.33 (2H, m), 2.10-2.01 (2H, m), 1.74-1.68 (2H, m), 1.56-1.37 (7H, m), 1.30-1.26 (1H, m), 1.04-1.02 (1H, m), 0.97 (3H, m), 0.90-0.85 (3H, m).
實施例1-19 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-[(丙烷-2-基)氧基]十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化47]
Figure 02_image096
於15℃下，向Q1(100 mg)、異丙醇(42.1 mg)之二氯甲烷溶液(1 mL)中添加三氟化硼二乙醚錯合物(99.6 mg)，以15℃攪拌16小時攪拌。將反應溶液利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得實施例1-19之化合物(22 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): 5.46 (1H, s), 4.90 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.03-3.97 (1H, m), 2.64-2.60 (1H, m), 2.43-2.35 (1H, m), 2.08-2.03 (1H, m), 1.93-1.82 (2H, m), 1.78-1.72 (1H, m), 1.68-1.62 (1H, m), 1.55-1.51 (1H, m), 1.46 (3H, s), 1.39-1.32 (1H, m), 1.30-1.26 (1H, m), 1.23-1.16 (4H, m), 1.10 (3H, d, J = 6.4 Hz),  0.98-0.93 (4H, m), 0.90 (3H, d, J = 7.2 Hz).
實施例1-20、1-23及1-24 使用對應之原料化合物，與實施例1-19同樣地進行反應、處理，獲得表1中所示之化合物。 [表1]
Figure 02_image098
實施例 R 化合物名
1-20
Figure 02_image100
 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(環己氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英
1-23
Figure 02_image102
 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(2-甲氧基乙氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英
1-24
Figure 02_image104
 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(苄氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英
實施例1-20 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): 5.47 (1H, s), 4.94 (1H, d, J = 4.0 Hz), 3.75-3.71 (1H, m), 2.65-2.60 (1H, m), 2.43-2.35 (1H, m), 2.08-2.02(1H, m), 1.96-1.86 (2H, m), 1.79-1.73 (2H, m), 1.72-1.62 (3H, m), 1.57-1.48 (2H, m), 1.46 (3H, s), 1.40-1.26 (8H, m), 0.97 (3H, d, J = 6.4 Hz), 0.95-0.85 (5H, m). 實施例1-23 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.46 (1H, s), 4.85 (1H, d, J = 3.6 Hz), 3.99-3.94 (1H, m),  3.64-3.52 (3H, m), 3.39 (1H, s), 2.67-2.62 (1H, m), 2.43-2.35 (1H, m), 2.08-2.03 (1H, m), 1.94-1.74 (3H, m), 1.67-1.62 (1H, m), 1.51-1.46 (4H, m), 1.40-1.21 (3H, m), 0.98-0.87 (7H, m). 實施例1-24 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 7.39-7.30 (5H, m), 5.49 (1H, s), 4.95-4.92 (2H, m), 4.53 (1H, d, J = 12.0 Hz), 2.72-2.68 (1H, m), 2.45-2.37 (1H, m), 2.10-2.04 (1H, m), 1.94-1.79 (3H, m), 1.67-1.62 (1H, m), 1.56-1.51 (1H, m), 1.49 (3H, s), 1.38-1.24(3H, m), 0.98-0.96 (6H, m), 0.92-0.88 (1H, m).
實施例1-22 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(2,2,2-三氟乙氧基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化48]
Figure 02_image106
於0℃下，向Q1(100 mg)、2,2,2-三氟乙醇(351 mg)之甲苯溶液(5 mL)中添加三苯基膦(184 mg)、偶氮二甲酸二乙酯(119 mg)，於0℃下攪拌2小時。反應結束後，將反應溶液減壓蒸餾去除，對所獲得之殘渣利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得實施例1-22之化合物(35 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 5.43 (1H, s), 4.90 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.20-4.10 (1H, m),  3.95-3.85 (1H, m), 2.74-2.66 (1H, m), 2.44-2.36 (1H, m), 2.10-2.04 (1H, m), 1.95-1.88 (1H, m), 1.84-1.76 (1H, m), 1.74-1.66 (2H, m), 1.57-1.49 (2H, m), 1.46 (3H, s), 1.40-1.24 (2H, m), 0.99-0.97 (6H, m), 0.95-0.89 (1H, m).
實施例1-21及1-25 使用對應之原料化合物，與實施例1-19同樣地進行反應、處理，獲得表2中所示之化合物。 [表2]
Figure 02_image108
實施例 R 化合物名
1-21
Figure 02_image110
 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯氧基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英
1-25
Figure 02_image112
 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯氧基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英
實施例1-21 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 7.33-7.29 (2H, m), 7.15-7.13 (2H, m), 7.03-7.00 (1H, m), 5.54-5.52 (2H, m), 2.84-2.81 (1H, m), 2.44-2.38 (1H, m), 2.08-1.88 (4H, m), 1.75-1.70 (1H, m), 1.61-1.59 (1H, m), 1.55-1.46 (4H, m), 1.41-1.36 (1H, m), 1.34-1.30 (1H, m), 1.04 (3H, d, J = 6.0 Hz),  1.01-0.96 (4H, m). 實施例1-25 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ): δ 7.33-7.28 (2H, m), 7.14-7.12 (2H, m), 7.04-7.00 (1H, m), 5.51 (1H, s), 5.07 (1H, d, J = 10.0 Hz), 2.78-2.73 (1H, m), 2.47-2.39 (1H, m), 2.09-2.04 (1H, m), 1.91-1.97 (1H, m), 1.86-1.80 (1H, m), 1.76-1.71 (1H, m), 1.69-1.65 (1H, m), 1.56-1.49 (1H, m), 1.46 (3H, s), 1.42-1.28 (3H, m), 1.11-1.04 (1H, m), 1.02-1.00 (6H, m).
實施例1-26及實施例1-27 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯(實施例1-26)、及 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯(實施例1-27) [化49]
Figure 02_image114
實施例1-26 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯 [化50]
Figure 02_image116
a)2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙烷-1-醇(化合物Q7)及2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙烷-1-醇(化合物Q8)之製造
於室溫下，向Q1(200 mg)、乙二醇(130 mg)之二氯甲烷溶液(4 mL)中添加三氟化硼二乙醚錯合物(56.5 mg)，於室溫下徹夜攪拌。反應結束後，添加飽和碳酸氫鈉溶液(5 mL)、二氯甲烷，用水清洗有機層，減壓蒸餾去除溶劑。對所獲得之殘渣利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得化合物Q7(54 mg)、化合物Q8(62 mg)。 化合物Q7 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ: 5.46 (1H, s), 4.86 (1H, d, J = 3.6 Hz), 3.93-3.88 (1H, m), 3.78-3.75 (2H, m), 3.68-3.63 (1H, m), 2.73-2.66 (1H, m), 2.39 (1H, m), 2.08-2.03 (1H, m), 1.94-1.87 (1H, m), 1.81-1.78 (2H, m), 1.75-1.71 (1H, m), 1.69-1.63 (1H, m), 1.54-1.47 (2H, m), 1.45 (3H, s), 1.39-1.30 (2H, m), 1.00-0.93 (7H, m). 化合物Q8 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ: 5.39 (1H, s), 4.49 (1H, d, J = 9.2 Hz), 3.89-3.87 (2H, m), 3.77-3.71 (2H, m), 2.51-2.36 (2H, m), 2.08-2.02 (1H, m), 1.95-1.88 (1H, m), 1.83-1.77 (1H, m), 1.75-1.70 (1H, m), 1.59-1.64 (1H, m), 1.53-1.49 (1H, m), 1.44 (3H, s), 1.36-1.24 (4H, m), 1.07-1.01 (1H, m), 0.98 (3H, d, J = 5.6 Hz), 0.94 (3H, d, J = 6.8 Hz).
b)乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯(實施例1-26)之製造 向上述實驗中獲得之化合物Q7(54 mg)之二氯甲烷溶液(3 mL)中添加乙酸酐(83.7 mg)與三乙胺(82.9 mg)，於室溫下徹夜攪拌。反應結束後，添加二氯甲烷、水，減壓蒸餾去除有機層之溶劑，對所獲得之殘渣利用矽膠管柱層析法(洗提溶劑；戊烷：乙酸乙酯)進行純化，藉此獲得實施例1-26(29.1 mg)。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ: 5.45 (1H, s), 4.84 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.30-4.20 (2H, m), 4.05-4.00 (1H, m), 3.69-3.64 (1H, m), 2.69-2.62 (1H, m), 2.39 (1H, m), 2.10-2.03 (4H, m), 1.94-1.88 (1H, m), 1.86-1.75 (2H, m), 1.67-1.64 (1H, m), 1.51-1.49 (1H, m), 1.46 (3H, s), 1.34-1.24 (3H, m), 0.98-0.88 (7H, m).
實施例1-27 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯 使用對應之原料化合物Q8，與實施例1-26同樣地進行反應、處理，獲得實施例1-27之化合物。 1H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ: 5.36 (1H, s), 4.50 (1H, d, J = 9.2 Hz), 4.26 (2H, t, J = 5.0 Hz), 4.14-4.09 (1H, m), 3.76-3.70 (1H, m), 2.49-2.36 (2H, m), 2.09 (3H, s), 2.07-2.02 (1H, m), 1.94-1.87 (1H, m), 1.82-1.76 (1H, m), 1.73-1.69 (1H, m), 1.60-1.55 (1H, m), 1.52-1.51 (1H, m), 1.49 (3H, s), 1.34-1.27 (3H, m), 1.07-0.97 (4H, m), 0.90 (3H, d, J = 7.2 Hz).
實施例1-34 (3R,3aS,6R,6aS,9S,10aS,10bR)-3,6,9-三甲基八氫-10aH-9,10b-環氧吡喃并[4,3,2-jk][2]苯并㗁庚英-2(3H)-酮 [化51]
Figure 02_image118
使用自Sigma-Aldrich購入(目錄編號：CDS010483)之化合物。
實施例1-35 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-甲氧基-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英 [化52]
Figure 02_image120
使用自Toronto Research Chemicals購入(目錄編號：A777410)之化合物。
＜小鼠之飼養＞ 使用如下小鼠：於小鼠內源性HoxB5基因之C末端插入有包含3次複製之編碼mCherry螢光蛋白之基因之核酸序列(Hoxb5-tri-mCherry)的小鼠(triple-mCherry Hoxb5嵌入小鼠(knock-in mouse)；非專利文獻1)。小鼠之飼養係於室溫20～26℃、濕度40～70%、亮暗各12小時(照明：上午8點～下午8點)之環境條件下飼養。
＜骨髓細胞之採集＞ 骨髓細胞係採自上述小鼠之兩側脛骨、股骨、肱骨及骨盆，並收集到研缽中。於無Ca2 ＋ 及Mg2 ＋ 之PBS中添加含有最終濃度2%之熱處理失活牛血清(Gibco公司製造)及最終濃度2 mM之EDTA的緩衝液，利用杵將該等物質加以破壞，藉此獲得含有造血幹細胞之細胞集群。
＜利用流式細胞分析進行之小鼠長期造血幹細胞之區分＞ 首先，使上述獲得之含有造血幹細胞之細胞集群通過100 μm、70 μm、40 μm之過濾器(篩網)。為了使造血幹細胞及前驅物細胞集群富集，由APC結合抗c-Kit(2B8)將細胞集群染色，使用抗APC磁珠及LS管柱(兩者均由Miltenyi Biotec公司製造)進行區分。
其次，使用針對以下細胞表面標記物之抗體，將c-Kit陽性之細胞染色。 細胞表面標記物：Sca-1、Flk2、CD150、CD34、Ter-119、B220、CD3、CD4、CD8a、Gr-1、CD11b、IL-7R及CD16/32
利用抗體進行之染色係於4℃下進行，將細胞保溫30分鐘。利用CD34抗體進行之染色係將細胞保溫90分鐘。死細胞染色係利用廠商推薦之方法，藉由SYTOX Red死細胞染料(Dead Cell Stain)(Life Technologies公司製造)進行。
流式細胞分析及細胞區分(細胞分選)係將譜系(Lineage)陰性、c-Kit陽性、Sca-1陽性、Flk2陰性、CD34陰性或弱陽性、CD150陽性、mCherry陽性組分作為長期造血幹細胞，使用FACS Aria II細胞分選儀(cell sorter)(BD Bioscience公司製造)進行分選，並利用Flow Jo軟體(Tree Star公司製造)進行解析。
將區分後之細胞接種於96孔板。細胞培養用培養基係於StemSpan SFEM培養基(STEMCELL Technologies公司製造)中添加幹細胞因子(SCF，Peprotech公司製造)與血小板生成素(TPO，Peprotech公司製造)來製備，預先向細胞培養用96孔板(BD Bioscience公司製造)中添加100 μL/孔後，以10細胞/孔之方式接種經FACS Aria II細胞分選儀(BD Biosciences)分選後之細胞。
[實施例2 化合物之一次篩選] 關於受檢化合物，將10 mM之DMSO溶液利用細胞培養用培養基進行稀釋以使最終濃度為1 μM，向上述區分後接種之細胞中基於培養基交換之方式以最終體積200 μL/孔進行添加。其後，將細胞於CO2 培養箱中以37℃、5%CO2 之條件培養1週。
培養後，將細胞利用針對表面標記物之c-Kit及Sca-1、Ter-119、B220、CD3、CD4、CD8a、Gr-1、CD11b之抗體進行染色，使用FACS Aria II細胞分選儀進行分選，利用Flow Jo(BD)對KLS組分(c-Kit＋ 、Lin- 、Sca-1＋ )或mCherry陽性組分之比率及增殖後細胞數進行解析。mCherry陽性組分係表現Hoxb5基因之細胞組分，KLS組分係c-Kit陽性、Lin陰性且Sca-1陽性之細胞組分，且係以造血幹細胞及多能性前驅細胞作為主要組分。
關於解析之結果，將KLS陽性率為30%以上或mCherry陽性率為30%以上、細胞數為10細胞以上者作為苗頭(hit)化合物。苗頭化合物為下述5種化合物。再者，KLS陽性率係KLS(c-Kit＋ 、Lin- 、Sca-1＋ )細胞數相對於總活細胞數之比率(%)，mCherry陽性係mCherry陽性細胞數相對於總活細胞數之比率(%)。 [化53]
Figure 02_image122
(各式中，Me表示甲基，Et表示乙基)
[實施例3 苗頭化合物之再現性試驗及濃度依存性試驗] 將5種苗頭化合物之DMSO溶液利用細胞培養用培養基調整為5種最終濃度(0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM)，以n＝2且利用與實施例1相同之方法進行細胞培養。對活細胞數、KLS陽性率、mCherry陽性率進行解析，將其結果示於表3。細胞之培養及評價指標與實施例2相同。 [表3]
   各化合物之濃度(μM)
10 3 1 0.3 0.1
蒿甲醚 活細胞數(個) 108.5 115 1170.5 2632 1109
KLS陽性率(%) 65.9 50.3 21.4 22.05 50.25
mCherry陽性率(%) 94.45 98.05 57.85 36.85 67.2
青蒿素 活細胞數(個) 282.5 229 728 1020 445.5
KLS陽性率(%) 52 50.8 46.85 18.2 33.2
mCherry陽性率(%) 80 81.3 60.85 28.15 49.25
青蒿醇 活細胞數(個) 0 0 666.5 2268 1563
KLS陽性率(%) 0 0 20.05 18 8.92
mCherry陽性率(%) 0 0 84.8 42.4 16.9
蒿乙醚 活細胞數(個) 0 8 249 1529 1073
KLS陽性率(%) 0 66.65 30.8 21.95 28.85
mCherry陽性率(%) 0 100 92.85 47.65 57.4
青蒿琥酯 活細胞數(個) 0.5 0.5 266 540 1065.5
KLS陽性率(%) 0 0 45.3 46.4 36.3
mCherry陽性率(%) 0 50 91.2 35.1 23.59
由表3可知，於利用分別含有各化合物之培養基培養7天後之細胞中，基於化合物之不同濃度，所獲得之效果有差異，但成功確認到高mCherry陽性細胞比率。據此可知，藉由該等化合物，能夠在維持自我複製能力及多潛能之狀態下培養長期造血幹細胞，並可使長期造血幹細胞增殖。
除5種化合物(實施例1-29、1-30、1-31、1-32、1-33：分別為青蒿醇(Artenimol)、蒿甲醚(Artemether)、蒿乙醚(Artemotil)、青蒿琥酯(Artesunate)、青蒿素(Artemisinin))以外，還將實施例1-1～1-28、1-34、1-35之化合物之DMSO溶液利用細胞培養用培養基調整為5種最終濃度(0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM)，以n＝2並利用與實施例2相同之方法進行細胞培養。對活細胞數、KLS陽性率、mCherry陽性率進行解析，將其結果示於表4。細胞之培養及評價指標與實施例2相同。 [表4]
實施例 評價項目 各化合物之濃度(μM)
10 3 1 0.3 0.1
1-1 活細胞數(個) 0.0 0.0 0.5 0.0 477.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 0.0 0.0 46.5
mCherry陽性率(%) 0.0 0.0 50.0 0.0 0.5
1-2 活細胞數(個) 0.0 0.5 0.5 0.5 340.5
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 0.0 50.0 16.0
mCherry陽性率(%) 0.0 50.0 0.0 50.0 59.9
1-3 活細胞數(個) 3.5 139.0 299.5 324.0 445.0
KLS陽性率(%) 83.4 24.2 20.3 18.6 15.8
mCherry陽性率(%) 100.0 97.0 38.6 4.7 8.0
1-4 活細胞數(個) 7.5 87.5 181.5 103.0 353.0
KLS陽性率(%) 61.4 30.7 31.1 37.9 17.2
mCherry陽性率(%) 90.9 100.0 85.2 44.7 8.0
1-5 活細胞數(個) 1.5 184.0 308.0 221.5 443.5
KLS陽性率(%) 0.0 30.8 20.0 41.7 18.2
mCherry陽性率(%) 0.0 41.5 4.5 8.5 11.5
1-6 活細胞數(個) 37.5 215.5 183.5 190.0 147.0
KLS陽性率(%) 47.8 17.6 19.8 20.9 34.8
mCherry陽性率(%) 98.4 80.8 24.4 15.6 2.0
1-7 活細胞數(個) 0.0 0.0 73.0 269.0 225.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 36.1 19.6 26.9
mCherry陽性率(%) 0.0 0.0 96.7 62.2 42.9
1-8 活細胞數(個) 286.5 204.5 248.0 379.5 396.5
KLS陽性率(%) 20.6 37.3 28.7 18.2 17.3
mCherry陽性率(%) 29.0 12.9 12.0 7.7 3.0
1-9 活細胞數(個) 491.5 479.0 625.0 500.0 627.5
KLS陽性率(%) 27.1 14.1 34.3 31.1 10.6
mCherry陽性率(%) 11.4 8.1 9.4 4.5 5.9
1-10 活細胞數(個) 46.5 579.0 325.5 387.0 717.5
KLS陽性率(%) 53.1 33.1 32.9 23.1 19.7
mCherry陽性率(%) 99.3 38.5 9.1 16.5 6.5
1-11 活細胞數(個) 1.5 31.0 196.0 267.0 452.5
KLS陽性率(%) 100.0 32.4 26.0 17.6 13.2
mCherry陽性率(%) 100.0 86.2 60.4 29.2 14.3
1-12 活細胞數(個) 234.5 217.0 431.5 262.0 450.5
KLS陽性率(%) 36.6 14.4 19.3 15.8 27.2
mCherry陽性率(%) 12.1 19.4 8.2 15.2 7.3
1-13 活細胞數(個) 0.0 0.0 136.5 605.0 201.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 21.0 14.7 22.1
mCherry陽性率(%) 0.0 0.0 6.7 2.9 24.3
1-14 活細胞數(個) 0.5 1.0 119.0 340.0 497.5
KLS陽性率(%) 0.0 50.0 47.3 30.1 20.6
mCherry陽性率(%) 0.0 100.0 22.1 9.0 0.2
1-15 活細胞數(個) 42.5 111.0 258.0 540.0 379.0
KLS陽性率(%) 54.9 40.0 17.9 13.0 6.8
mCherry陽性率(%) 97.6 87.1 47.3 13.3 7.1
1-16 活細胞數(個) 29.0 182.5 310.0 388.5 504.5
KLS陽性率(%) 52.6 9.2 33.4 11.6 13.3
mCherry陽性率(%) 99.0 92.4 68.2 29.2 6.8
1-17 活細胞數(個) 80.0 315.0 641.5 902.0 947.0
KLS陽性率(%) 51.8 24.0 19.4 16.1 15.9
mCherry陽性率(%) 100.0 70.1 16.1 2.5 4.9
1-18 活細胞數(個) 72.5 154.0 162.0 191.0 405.0
KLS陽性率(%) 49.6 30.9 22.4 16.7 10.9
mCherry陽性率(%) 98.6 80.5 19.2 15.4 23.5
1-19 活細胞數(個) 0.5 0.0 6.0 151.0 469.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 4.2 41.7 9.5
mCherry陽性率(%) 50.0 0.0 50.0 96.2 56.3
1-20 活細胞數(個) 0.5 0.5 1.0 0.0 0.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
mCherry陽性率(%) 50.0 50.0 0.0 0.0 0.0
1-21 活細胞數(個) 0.5 0.5 0.5 2.0 0.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
mCherry陽性率(%) 50.0 50.0 0.0 50.0 0.0
1-22 活細胞數(個) 0.5 0.5 0.5 12.5 216.0
KLS陽性率(%) 0.0 50.0 0.0 87.0 26.7
mCherry陽性率(%) 0.0 50.0 0.0 100.0 90.9
1-23 活細胞數(個) 63.5 252.0 729.0 509.0 712.5
KLS陽性率(%) 42.3 23.2 5.3 15.4 12.4
mCherry陽性率(%) 100.0 97.3 72.7 46.5 17.9
1-24 活細胞數(個) 0.5 0.0 0.5 0.5 18.0
KLS陽性率(%) 0.0 0.0 0.0 0.0 73.6
mCherry陽性率(%) 0.0 0.0 50.0 50.0 94.1
1-25 活細胞數(個) 0.0 0.5 0.0 0.5 181.5
KLS陽性率(%) 0.0 50.0 0.0 0.0 40.0
mCherry陽性率(%) 0.0 50.0 0.0 0.0 52.3
1-26 活細胞數(個) 30.5 43.5 20.0 48.5 13.5
KLS陽性率(%) 28.9 26.9 55.4 68.5 56.1
mCherry陽性率(%) 100.0 100.0 96.7 95.0 80.7
1-27 活細胞數(個) 17.5 6.0 6.0 14.5 122.0
KLS陽性率(%) 49.8 90.0 100.0 75.0 45.4
mCherry陽性率(%) 100.0 100.0 100.0 94.7 44.3
1-28 活細胞數(個) 138.0 283.0 522.0 305.0 275.5
KLS陽性率(%) 41.2 16.5 10.5 13.5 21.5
mCherry陽性率(%) 96.4 80.3 35.5 15.0 12.9
1-29 活細胞數(個) 0.5 4.5 248.0 215.0 469.5
KLS陽性率(%) 50.0 80.0 11.3 13.7 19.4
mCherry陽性率(%) 50.0 100.0 3.9 6.0 13.3
1-30 活細胞數(個) 65.0 44.5 135.5 184.0 238.0
KLS陽性率(%) 71.4 57.4 40.1 38.4 35.3
mCherry陽性率(%) 98.2 100.0 99.0 100.0 71.2
1-31 活細胞數(個) 1.5 2.5 19.5 194.0 201.5
KLS陽性率(%) 25.0 87.5 62.3 19.7 26.5
mCherry陽性率(%) 50.0 100.0 98.3 96.3 84.9
1-32 活細胞數(個) 1.0 238.5 9.0 355.5 597.5
KLS陽性率(%) 0.0 21.2 90.6 12.4 21.0
mCherry陽性率(%) 25.0 53.3 100.0 6.0 9.4
1-33 活細胞數(個) 178.0 85.0 268.0 309.5 268.5
KLS陽性率(%) 16.1 26.1 20.3 11.2 20.2
mCherry陽性率(%) 78.8 81.8 56.8 23.5 28.1
1-34 活細胞數(個) 70.0 268.0 713.5 389.0 136.5
KLS陽性率(%) 27.5 27.7 21.8 28.4 77.3
mCherry陽性率(%) 0.4 14.6 15.2 18.3 11.7
1-35 活細胞數(個) 121.5 104.5 554.0 544.5 763.5
KLS陽性率(%) 46.7 48.7 17.9 19.9 13.8
mCherry陽性率(%) 99.6 92.2 74.0 48.5 3.0
由表4可知，於利用分別含有各化合物之培養基培養7天後之細胞中，基於化合物之不同濃度，所獲得之效果有差異，但成功確認到高mCherry陽性細胞比率。據此判明，藉由該等化合物，均可在維持自我複製能力及多潛能之狀態下培養長期造血幹細胞，並可使長期造血幹細胞增殖。針對於獲得尤佳結果之化合物，以如下所述之方式使用人類細胞進行評價。
[實施例4 基於小鼠HoxB5基因表現之確認試驗] 於蒿甲醚之存在下所培養之細胞係藉由小鼠HoxB5基因表現進行評價。與實施例3同樣地培養細胞，利用Single Cell to CT qRT-PCR套組(Life Technologies公司製造)，按照該套組之指示說明對培養後之細胞進行處理。將處理後之細胞利用PBS清洗1次後，添加細胞溶解液，RNA萃取後實施用以合成cDNA之逆轉錄反應，藉由14次循環之Taqman基因表現分析(Gene Expression Assay)進行擴增，利用1×TE緩衝液(pH值8.0)加以稀釋。為實施即時PCR，使用以下之Taqman探針，以95℃、3秒及60℃、30秒之條件進行40次循環，而使試樣擴增(HoxbB5：Mm00657672(Thermo Fisher Scientific公司製造)、Gapdh：Mm99999915-g1(Thermo Fisher Scientific公司製造))。所有溫控循環機係使用Quant Stadio 6(Applied Biosystem公司製造)，並進行解析(表5)。 [表5]
   各化合物之濃度(μM)
10 3 1 0.3 0.1 0.03
mHoxB5 Ct值 27.62 28.99 31.18 28.79 30.57 30.72
mGAPDH Ct值 17.68 13.90 13.02 14.47 13.23 13.12
Ct值差 9.94 15.10 18.16 14.31 17.34 17.60
由表5可知，藉由使化合物發揮作用，於培養7天後之細胞中，在小鼠HoxB5 Ct值30以下、ΔCT值16以下之培養條件下成功確認到長期造血幹細胞標記物之HoxB5表現。據此提示出，就基因標記物表現之方面而言，本化合物亦具有體外維持長期造血幹細胞之功能。
[實施例5 與UM171之組合試驗] 將蒿甲醚(Artemether)之DMSO溶液利用細胞培養用培養基調整為3種最終濃度(0.1 μM、1 μM、10 μM)，進而將UM171之DMSO溶液利用細胞培養用培養基調整為4種最終濃度(0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM)，以n＝2並利用與實施例1相同之方法進行細胞培養。對活細胞數、KLS陽性率、mCherry陽性率進行解析，將其結果示於表6。細胞之培養及評價指標與實施例2相同。 [表6]
化合物 評價項目 UM171(μM)
0.1 0.3 1 3
DMSO 活細胞數(個) 508.0 281.0 24.5 82.5
KLS陽性率(%) 41.0 71.6 98.0 82.2
mCherry陽性率(%) 4.7 17.1 38.9 16.2
蒿甲醚 0.1 μM 活細胞數(個) 430.0 257.0 28.5 101.5
KLS陽性率(%) 52.0 42.0 93.4 60.6
mCherry陽性率(%) 51.8 78.1 100.0 82.4
蒿甲醚 1 μM 活細胞數(個) 269.0 151.0 23.0 23.5
KLS陽性率(%) 33.1 48.6 93.7 67.3
mCherry陽性率(%) 96.3 99.1 100.0 100.0
蒿甲醚 10 μM 活細胞數(個) 122.0 38.0 9.5 19.0
KLS陽性率(%) 56.7 91.1 95.9 94.7
mCherry陽性率(%) 99.6 100.0 100.0 96.9
由表6可知，於不含蒿甲醚(Artemether)之情形時，由UM17提高mCherry陽性細胞比率之效果有限。然而，確認到由UM171提高KLS陽性細胞比率之效果。另一方面，確認到若利用含有蒿甲醚及UM171之培養基進行培養，則與分別單獨進行培養之情形相比，mCherry陽性細胞比率及KLS陽性細胞比率提高。據此判明，蒿甲醚(Artemether)及UM171確認有組合效果。
[實施例6 使用人類細胞之化合物之確認試驗] ＜源自人臍帶血之單核細胞之採集＞ 源自人臍帶血之單核細胞係使用EasySep紅細胞去除試劑(RBC Depletion Reagent)(STEMCELL Technologies公司製造)進行紅血球去除、濃縮處理，獲得含有造血幹細胞之細胞集群。
＜利用流式細胞分析進行之人類造血幹細胞(CD34陽性細胞)之區分＞ 首先，對於上述獲得之含有造血幹細胞之細胞集群，使用EASYSep人臍帶血CD34陽選試劑盒II(Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II)(STEMCELL Technologies公司製造)，將CD34陽性細胞組分粗純化。對於使造血幹細胞及前驅物細胞集群富集而得之CD34陽性濃縮細胞，使用針對以下細胞表面標記物之抗體進行染色。 細胞表面標記物：CD34、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD235ab、CD3、CD4、CD56、CD8a。
利用抗體進行之染色係於4℃下進行，將細胞保溫30分鐘。利用CD34抗體進行之染色係將細胞保溫90分鐘。死細胞染色係利用廠商推薦之方法，藉由SYTOX Red死細胞染料(Dead Cell Stain)(Life Technologies公司製造)進行。
流式細胞分析及細胞區分(細胞分選)係將譜系(Lineage)陰性、CD34陽性之組分作為造血幹細胞，使用FACS Aria III細胞分選儀(cell sorter)(BD Bioscience公司製造)進行細胞區分，並使用Flow Jo軟體(Tree Star公司製造)進行解析。
將區分後之細胞接種於96孔板。細胞培養用培養基係於IMDM培養基(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司製造)中添加幹細胞因子(SCF，Peprotech公司製造)、血小板生成素(TPO、Peprotech公司製造)、L-麩醯胺酸、青黴素(Penicillin)、鏈黴素(Streptomycin)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製造)、胰島素-運鐵蛋白-硒-乙醇胺(Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine)(ThermoFisher SCIENTIFIC公司製造)來製備，預先向細胞培養用96孔板(CORNING公司製造)中添加200 μL/孔後，以30細胞/孔之方式接種經FACS Aria III細胞分選儀(BD Biosciences)分選後之細胞。
將蒿甲醚(Artemether)、或實施例1-23、實施例1-16、及實施例1-7之化合物利用細胞培養用培養基調整為9種最終濃度(0.001 μM、0.003 μM、0.01 μM、0.03 μM、0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM)，並以最終體積200 μL/孔之方式添加至經上述區分並接種之人類細胞，並使其等產生作用。一部分添加UM171(35 nM)，研究有無協同效應。其後，將細胞於CO2 培養箱中以37℃、5%CO2 之條件培養1週。對活細胞數、CD34陽性細胞數進行解析。 將於存在蒿甲醚(Artemether)之條件下(UM171+/-)進行培養時之活細胞數及CD34陽性細胞數示於圖1及圖2。又，將於存在各種化合物之條件下進行培養時之活細胞數及CD34陽性細胞數示於表7～11。
培養後，將細胞利用針對表面標記物之CD34、CD11b、CD14、CD19、CD20、CD235ab、CD3、CD4、CD56、CD8a之抗體進行染色，使用FACS Aria III細胞分選儀，測定活細胞數、CD34組分(CD34＋ 、Lin- )之比率及增殖後細胞數，並使用Flow Jo(BD)進行解析。CD34組分係以造血幹細胞及多能性前驅細胞作為主要組分。
由表7～11可知，於利用分別含有各化合物之培養基培養7天後之細胞中，基於化合物之不同濃度，所獲得之效果有差異，但成功確認到活細胞數、CD34組分之細胞數增加。進而，亦確認到由併用UM171獲得之協同效應。據此，對於人類細胞確認到，藉由該等化合物，在維持自我複製能力及多潛能之狀態下培養造血幹細胞並使其增殖。 [表7]
培養條件 活細胞數(個) CD34陽性細胞數(個)
培養前 180 180
DMSO 786 53
蒿甲醚(0.001 μM) 484 59
蒿甲醚(0.003 μM) 921 88
蒿甲醚(0.01 μM) 498 57
蒿甲醚(0.03 μM) 298 23
蒿甲醚(0.1 μM) 555 45
蒿甲醚(0.3 μM) 550 61
蒿甲醚(1 μM) 479 35
蒿甲醚(3 μM) 380 26
蒿甲醚(10 μM) 250 27
[表8]
培養條件 活細胞數(個) CD34陽性細胞數(個)
培養前 180 180
DMSO 90 14
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.001 μM) 301 36
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.003 μM) 765 102
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.01 μM) 323 43
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.03 μM) 216 56
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.1 μM) 376 93
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.3 μM) 240 9
UM171(35 nM)及蒿甲醚(1 μM) 31 0
[表9]
培養條件 活細胞數(個) CD34陽性細胞數(個)
培養前 180 180
DMSO 665 44
實施例1-23(0.001 μM) 1581 156
實施例1-23(0.003 μM) 797 65
實施例1-23(0.01 μM) 1152 72
實施例1-23(0.03 μM) 901 63
實施例1-23(0.1 μM) 537 28
實施例1-23(0.3 μM) 462 19
實施例1-23(1 μM) 480 16
實施例1-23(3 μM) 269 15
實施例1-23(10 μM) 333 0
[表10]
培養條件 活細胞數(個) CD34陽性細胞數(個)
培養前 180 180
DMSO 1098 129
實施例1-16(0.001 μM) 1306 143
實施例1-16(0.003 μM) 1224 173
實施例1-16(0.01 μM) 1301 116
實施例1-16(0.03 μM) 590 130
實施例1-16(0.1 μM) 811 92
實施例1-16(0.3 μM) 549 32
實施例1-16(1 μM) 368 13
實施例1-16(3 μM) 300 13
實施例1-16(10 μM) 264 3
[表11]
培養條件 活細胞數(個) CD34陽性細胞數(個)
培養前 180 180
DMSO 1321 145
實施例1-7(0.001 μM) 1314 175
實施例1-7(0.003 μM) 1013 113
實施例1-7(0.01 μM) 1115 150
實施例1-7(0.03 μM) 905 86
實施例1-7(0.1 μM) 693 80
實施例1-7(0.3 μM) 439 5
實施例1-7(1 μM) 196 4
實施例1-7(3 μM) 202 0
實施例1-7(10 μM) 181 0
[實施例7 使用人類細胞之化合物之功能試驗] 將蒿甲醚(Artemether)、或實施例1-23、實施例1-16、及實施例1-7化合物利用細胞培養用培養基製備成9種最終濃度(0.001 μM、0.003 μM、0.01 μM、0.03 μM、0.1 μM、0.3 μM、1 μM、3 μM、10 μM)，向經上述區分並接種之人類細胞以最終體積為200 μL/孔之方式添加，並使該等化合物產生作用。一部分添加UM171 35 nM，研究有無協同效應。其後，將細胞於CO2 培養箱中，以37℃、5%CO2 之條件培養1週並進行回收，其後，向96孔板之1個孔中，利用FACS AriaIII細胞分選儀逐個細胞地接種CD34陽性細胞，利用Methocult H4435(StemCell technologies公司)培養2週。培養後，利用光學顯微鏡(KEYENCE公司製造)拍攝各孔，以目視方式計數群落數，並目視判別群落形態。根據群落之形態，判別出源自骨髓系前驅細胞之粒細胞-紅血球-巨噬細胞-巨核細胞群落形成單位(Colony Formation Unit-Granulocyte、Erythroid、Macrophage、Megakaryocyte，CFU-GEMM)、及爆發形成單位紅細胞(Burst Forming Unit-Erythroid，BFU-E)、粒細胞-巨噬細胞群落形成細胞(Colony FormationgUnit-Granulocyte、Macrophage，CFU-GM)並進行計數。
將結果示於表12～16。又，將於存在蒿甲醚(Artemether)之條件下(UM171+/-)進行培養時之CFU-GEMM之群落數示於圖3。自表12～16及圖3確認到CFU-GEMM群落數之增加。進而，亦確認到由併用UM171獲得之協同效應。據此，對於人類細胞確認到，藉由該等化合物，在維持自我複製能力及多潛能之狀態下培養造血幹細胞及造血前驅細胞並使其等增殖。 [表12]
培養條件 培養後之群落數(個) (CFU-GEMM)
培養前 28.5
DMSO 26.2
蒿甲醚(0.001 μM) 40.3
蒿甲醚(0.003 μM) 61.4
蒿甲醚(0.01 μM) 33.2
蒿甲醚(0.03 μM) 34.8
蒿甲醚(0.1 μM) 37.0
蒿甲醚(0.3 μM) 36.7
蒿甲醚(1 μM) 63.9
蒿甲醚(3 μM) 31.7
蒿甲醚(10 μM) 0.0
[表13]
培養條件 培養後之群落數(個) (CFU-GEMM)
培養前 20.3
DMSO 12.6
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.001 μM) 40.1
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.003 μM) 204.0
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.01 μM) 53.8
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.03 μM) 46.8
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.1 μM) 94.0
UM171(35 nM)及蒿甲醚(0.3 μM) 40.0
UM171(35 nM)及蒿甲醚(1 μM) 0.0
[表14]
培養條件 培養後之群落數(個) (CFU-GEMM)
培養前 9.0
DMSO 16.6
實施例1-23(0.001 μM) 171.3
實施例1-23(0.003 μM) 39.9
實施例1-23(0.01 μM) 76.8
實施例1-23(0.03 μM) 22.5
實施例1-23(0.1 μM) 13.4
實施例1-23(0.3 μM) 3.9
實施例1-23(1 μM) 12.0
實施例1-23(3 μM) 4.5
實施例1-23(10 μM) 0.0
[表15]
培養條件 培養後之群落數(個) (CFU-GEMM)
培養前 20.3
DMSO 73.2
實施例1-16(0.001 μM) 130.6
實施例1-16(0.003 μM) 112.2
實施例1-16(0.01 μM) 65.1
實施例1-16(0.03 μM) 68.8
實施例1-16(0.1 μM) 40.6
實施例1-16(0.3 μM) 22.9
實施例1-16(1 μM) 15.7
實施例1-16(3 μM) 10.0
實施例1-16(10 μM) 8.8
[表16]
培養條件 培養後之群落數(個) (CFU-GEMM)
培養前 20.3
DMSO 33.0
實施例1-7(0.001 μM) 43.8
實施例1-7(0.003 μM) 33.8
實施例1-7(0.01 μM) 74.3
實施例1-7(0.03 μM) 83.0
實施例1-7(0.1 μM) 64.1
實施例1-7(0.3 μM) 19.5
實施例1-7(1 μM) 0.0
實施例1-7(3 μM) 0.0
實施例1-7(10 μM) 0.0
[實施例8 使用人類細胞之體內(In Vivo)成活試驗] 將蒿甲醚(Artemether)、或實施例1-23之化合物利用細胞培養用培養基分別製備成最終濃度0.003 μM或0.01 μM，向經上述區分並接種之人類細胞(每孔接種166個細胞)中以最終體積為200 μL/孔之方式添加，並使該等化合物產生作用。其後，關於各條件，將總計10000個CD34陽性組分之細胞於CO2 培養箱中以37℃、5%CO2 之條件培養1週，並計數細胞數。將培養後之細胞中之與培養前個數相同之10000個細胞移植到經致死量之放射線照射之免疫功能不全之NOG小鼠。作為比較對象，移植10000個來自新鮮臍帶血之CD34陽性細胞(無培養)。對於移植後所顯示出之時間點之末梢血供體嵌合，使用人特異性CD45抗體與小鼠特異性CD45抗體，測定人類CD45陽性細胞數與小鼠CD45陽性細胞數，並以人類CD45陽性細胞相對於人類CD45陽性細胞與小鼠CD45陽性細胞之合計值的比率(嵌合率)表示。
表17示出移植後1個月、2個月、3個月時之末梢血供體嵌合，表18示出移植後1個月、2個月時之末梢血供體嵌合。
根據使移植細胞數一致之移植實驗之結果，於蒿甲醚(Artemether)、或實施例1-23之化合物存在下進行體外培養之細胞顯示出與培養前細胞同等之嵌合率、或高於DMSO對照之嵌合率。又，與培養前比較時，總細胞數增加。又，與DMSO對照比較時，嵌合率大幅上升(約10倍左右)。因此，藉由體內成活試驗成功確認到，利用本化合物，既可維持具有成活能力之長期造血幹細胞之功能又能進行增殖培養。 [表17]
培養條件 活細胞數 (個) 供體嵌合(%)
移植期間(月)
1 2 3
新鮮 9960 1.243±0.975 4.251±5.035 4.996±3.932
DMSO 198409 0.081±0.124 0.118±0.184 0.204±0.445
蒿甲醚 (0.003 μM) 95954 0.041±0.022 0.605±0.95 2.108±2.479
[表18]
培養條件 活細胞數 (個) 供體嵌合(%)
移植期間(月)
1 2 3
新鮮 9960 0.286±0.329 1.302±0.926 -
DMSO 20262 0.014※ 0.091※ -
實施例1-23 (0.01 μM) 20071 0.299±0.049 0.748±0.585 -
※以n＝1實施
圖1表示培養含有人類造血幹細胞之細胞集群之結果，(A)表示利用僅含蒿甲醚之培養基進行培養後之活細胞數，(B)表示利用含有蒿甲醚及UM171之培養基進行培養後之活細胞數。 圖2表示培養含有人類造血幹細胞之細胞集群之結果，(A)表示利用僅含蒿甲醚之培養基進行培養後之CD34陽性細胞數，(B)表示利用含有蒿甲醚及UM171之培養基進行培養後之CD34陽性細胞數。 圖3表示培養含有人類造血幹細胞之細胞集群之結果，(A)表示利用僅含蒿甲醚之培養基進行培養後之CFU-GEMM群落數、(B)表示利用含有蒿甲醚及UM171之培養基進行培養後之CFU-GEMM群落數。
Figure 109146309-A0101-11-0001-2

Claims (21)

  1. 一種造血幹細胞之培養方法，其包括：將含有造血幹細胞之細胞集群於含有式(1)所表示之化合物或其鹽之1種以上的培養基中進行培養； [化1]
    Figure 03_image124
    [式中， [化2]
    Figure 03_image126
    為單鍵或雙鍵， X為O-O或O， Y為氫原子、羥基、側氧基、巰基、羧基、胺甲醯基、氰基、OR1 、SR1 、SOR1 、SO2 R1 、COR1 、OCOR1 、R2 、COOR1 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、NR5 CONR3 R4 或鹵素， Z與縮合環之任意位置之碳鍵結，分別獨立為C1-6 烷基， n為0～10之整數， R1 為可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、或可經取代之脂肪族雜環基， R2 為可經取代之烷基、可經取代之烯基、可經取代之炔基、可經取代之環烷基、可經取代之芳基、可經取代之雜芳基、或可經取代之脂肪族雜環基， R3 、R4 及R5 獨立為氫原子、可經取代之烷基、可經取代之環烷基、可經取代之脂肪族雜環基、可經取代之芳基、或可經取代之雜芳基，此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的4～10員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環亦可經取代]。
  2. 如請求項1之培養方法，其中式(1)之化合物為式(2)所表示之化合物； [化3]
    Figure 03_image128
    [式中， [化4]
    Figure 03_image130
    為單鍵或雙鍵， X及Y與式(1)中之定義相同， Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或C1-6 烷基]。
  3. 如請求項2之培養方法，其中式(2)之化合物為式(3-1)、(3-2)或(3-3)所表示之化合物； [化5]
    Figure 03_image132
    [式中， X及Y與式(1)中之定義相同， Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或C1-6 烷基]。
  4. 如請求項3之培養方法，其中式(3-1)、(3-2)或(3-3)中，Z1 、Z2 、Z3 、Z4 、Z5 、及Z6 獨立為氫原子或甲基。
  5. 如請求項1之培養方法，其中式(1)之化合物為式(4-1)、(4-2)或(4-3)所表示之化合物； [化6]
    Figure 03_image134
    [式中， X及Y與式(1)中之定義相同]。
  6. 如請求項1至5中任一項之培養方法，其中Y為氫原子、羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、COR1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、或氟原子。
  7. 如請求項1至6中任一項之培養方法，其中， [化7]
    Figure 03_image136
    為雙鍵之情形時，Y為氫原子或羥基， [化8]
    Figure 03_image138
    為單鍵之情形時， Y為羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、或氟原子， R1 為可經選自群1之1～7個取代基取代之C1-8 烷基、可經選自群1之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群1之1～5個基取代之苯基、可經選自群1之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、或可經選自群1之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～10員之雜芳基， R2 為可經選自群2之1～7個取代基取代之C1-8 烷基、可經選自群2之1～7個取代基取代之C1-8 烯基、可經選自群1之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群1之1～5個基取代之苯基、可經選自群1之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、或可經選自群1之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～10員之雜芳基， R3 及R4 獨立為氫原子、可經選自群1之1～7個取代基取代之C1-6 烷基、或可經選自群1之1～5個基取代之苯基，此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的3～8員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環可經選自以下之群1之取代基中之1～3個取代基取代， R5 為氫原子或C1-3 烷基； ＜群1＞ 羧基、羥基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基、C1-8 烷基羰基胺基、C1-8 烷基磺醯基胺基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～10員之脂肪族雜環基、鹵素 ＜群2＞ 羧基、羥基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、胺基、可經選自群3之1～5個基取代之苯基、可經選自群3之1～4個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基、可經選自群3之1～3個基取代之C3-8 環烷基、可經選自群3之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～4個環內雜原子的4～8員之脂肪族雜環基、鹵素 ＜群3＞ 羧基、羥基、C1-8 之烷基、C1-8 烷氧基、C1-8 烷基羰基、C1-8 烷基羰氧基、C1-8 烷氧基羰基、巰基、C1-8 烷基硫基、C1-8 烷基磺醯基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、C1-8 烷基羰基胺基、C1-8 烷基磺醯基胺基、鹵素。
  8. 如請求項1至7中任一項之培養方法，其中， [化9]
    Figure 03_image140
    為單鍵， Y為羥基、側氧基、羧基、胺甲醯基、OR1 、SR1 、SO2 R1 、OCOR1 、R2 、NR3 R4 、NR5 COR1 、NR5 SO2 R1 、或氟原子， R1 為可經選自群1'之1～3個基取代之C1-4 烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之苯基、可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的4～6員之脂肪族雜環基、或可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基， R2 為可經選自群2'之1～3個基取代之C1-4 烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之苯基、可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的4～6員之脂肪族雜環基、或可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基， R3 為氫原子或C1-3 烷基， R4 為氫原子、可經選自群1'之1～3個基取代之C1-4 烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群1'之1～3個基取代之苯基、可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的4～6員之脂肪族雜環基、或可經選自群1'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的5～6員之雜芳基， 此處，R3 與R4 可與鄰接之氮原子一起形成可進而包含1個或2個構成環之氧原子、氮原子或硫原子的3～8員之含氮脂肪族雜環，該含氮脂肪族雜環可經選自以下之群1'之取代基中之1～3個基取代， R5 為氫原子； ＜群1'＞ 氟原子、羥基、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、可經選自群3'之1～3個基取代之苯基、可經選自群3'之1～3個基取代之C3-6 之環烷基、可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的4～6員之脂肪族雜環基 ＜群2'＞ 氟原子、羥基、羧基、胺基、C1-4 烷氧基、C1-4 烷基羰氧基、C1-4 烷氧基羰基、可經1個或2個C1-8 烷基取代之胺甲醯基、可經選自群3'之1～3個基取代之苯基、可經選自群3'之1～3個基取代之C3-6 環烷基、可經選自群3'之1～3個基取代之包含選自氧原子、氮原子及硫原子中之1～3個環內雜原子的4～6員之脂肪族雜環基 ＜群3'＞ 氟原子、羥基、C1-4 之烷基。
  9. 如請求項1至8中任一項之培養方法，其中X為O-O。
  10. 如請求項1之培養方法，其中式(1)之化合物為選自由以下之化合物所組成之群中之化合物； 蒿甲醚(Artemether)、 青蒿素(Artemisinin)、 青蒿醇(Artenimol)、 蒿乙醚(Artemotil)、 青蒿琥酯(Artesunate)、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-10-氟-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(甲基硫基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12S,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(甲基硫基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12S,12aR)-10-(甲磺醯基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9,10-四甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-(呋喃-2-基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-羧酸、 4-苯基-1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]-1H-1,2,3-三唑、 N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]乙醯胺、 N-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲磺醯胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-N,N,3,6,9-五甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-胺、 4-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]𠰌啉、 乙酸(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基酯、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-甲醯胺、 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 1-[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]甲胺、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-[(丙烷-2-基)氧基]十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(環己氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯氧基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-(2,2,2-三氟乙氧基)十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(2-甲氧基乙氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-(苄氧基)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-10-苯氧基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯、 乙酸2-{[(3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英-10-基]氧基}乙酯、 (3R,5aS,6R,8aS,12R,12aR)-3,6,9-三甲基-3,4,5,5a,6,7,8,8a-八氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英、 (3R,3aS,6R,6aS,9S,10aS,10bR)-3,6,9-三甲基八氫-10aH-9,10b-環氧吡喃并[4,3,2-jk][2]苯并㗁庚英-2(3H)-酮、 (3R,5aS,6R,8aS,9R,10R,12R,12aR)-10-甲氧基-3,6,9-三甲基十氫-12H-3,12-環氧吡喃并[4,3-j][1,2]苯并二㗁庚英。
  11. 如請求項1之培養方法，其中式(1)之化合物係選自由蒿甲醚(Artemether)、青蒿素(Artemisinin)、青蒿醇(Artenimol)、蒿乙醚(Artemotil)、及青蒿琥酯(Artesunate)所組成之群。
  12. 如請求項1至11中任一項之培養方法，其中上述造血幹細胞為CD34陽性細胞。
  13. 如請求項1至12中任一項之培養方法，其中上述造血幹細胞為長期造血幹細胞。
  14. 如請求項1至12中任一項之培養方法，其中上述造血幹細胞為Hoxb5陽性之小鼠造血幹細胞。
  15. 如請求項1至14中任一項之培養方法，其中培養後之細胞集群中之造血幹細胞相對於總細胞數之比率為培養前細胞集群中之造血幹細胞相對於總細胞數之比率之10%以上。
  16. 如請求項1至15中任一項之培養方法，其中培養後之細胞集群中之造血幹細胞數為培養前細胞集群中之造血幹細胞數之3倍以上。
  17. 如請求項1至16中任一項之培養方法，其中上述培養基為進而包含UM171或其衍生物之培養基。
  18. 一種造血幹細胞之製造方法，其包括：準備含有造血幹細胞之細胞集群之步驟；及 培養含有造血幹細胞之細胞集群之步驟，其係藉由如請求項1至17中任一項之培養方法培養上述含有造血幹細胞之細胞集群。
  19. 一種造血幹細胞，其係藉由如請求項1至17中任一項之培養方法進行培養而獲得。
  20. 一種造血幹細胞，其係藉由如請求項18之製造方法製得。
  21. 一種造血幹細胞培養用試劑，其包含式(1)所表示之化合物或其鹽之至少一種。
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