TW202116809A - 免疫調節抗體及其使用方法 - Google Patents

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卡默爾 Ｄ 普里
席德達斯 強卓斯卡拉
莫莉莎 Ｌ 康奈力
藍迪 Ｍ 席夢思
泰瑞爾 Ｔ 史密斯
馬克 Ｅ 布雷努
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Abstract

本文提供抗體及其使用方法。如本文所揭示的抗體結合至細胞(諸如巨噬細胞)上的CD163+ 。此等抗體可用於治療方法中，諸如治療癌症之方法。

Description

免疫調節抗體及其使用方法
本文提供抗體及其使用方法。如本文所揭示的抗體結合至細胞(諸如巨噬細胞)上的CD163+ 。此等抗體可用於治療方法中，諸如治療癌症之方法。
暴露於某些炎性細胞介素或微生物相關分子模式的單核球及巨噬細胞區分為促炎性(M1或M1樣)或消炎性M2或M2樣巨噬細胞。M1及M2為用於定義活體外活化之巨噬細胞的分類，該等巨噬細胞分別定義為促炎性(當經典地使用IFN-γ及脂多醣活化時)或消炎性(當可替代地用IL-4或IL-10活化時)，而具有M1或M2表型的活體內或離體巨噬細胞定義為M1樣或M2樣巨噬細胞。在一些實施例中，M2巨噬細胞係藉由其暴露於某些細胞介素而產生。在一些實施例中，M2巨噬細胞係藉由IL-4、IL-10、IL-13或其組合來區分。
M2巨噬細胞亞型包括M2a、M2b、M2c及M2d亞型。M2a巨噬細胞係藉由IL-4及IL-13誘發CD163、精胺酸酶-1、甘露糖受體MRC1 (CD206)之表現上調、誘發MHC II系統呈遞抗原以及誘發IL-10及TGF-β產生來誘導，從而引起組織再生及抑制促炎性分子以防止發炎反應。M2b巨噬細胞產生IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α作為對免疫複合物的反應。M2c巨噬細胞係藉由IL-10、轉型生長因子β (TGF-β)及糖皮質激素暴露來誘導且產生IL-10及TGF-β，使得發炎反應被抑制。作為對IL-6及腺苷的反應，M2d亞型被活化。
M2巨噬細胞具有對應於M2巨噬細胞及其亞型的功能及表型。M2樣巨噬細胞為活體內或離體巨噬細胞，其具有M2巨噬細胞之功能或表型特徵的亞群。
本文提供適用於治療癌症及其他病症之抗體，包括抗原結合片段及其他抗原結合多肽。在一些實施例中，抗體特異性結合至M2及M2樣免疫抑制巨噬細胞，但不結合至M1及M1樣抗腫瘤巨噬細胞。所揭示之抗體結合至M2及M2樣腫瘤相關巨噬細胞且調節腫瘤相關M2及M2樣巨噬細胞的生理及功能特徵，以減輕對腫瘤微環境的免疫抑制且增強細胞毒性T細胞活化及增殖，從而促進腫瘤細胞殺滅。本發明的抗體分子特異性結合至M2及M2樣巨噬細胞表面上所表現的人類CD163。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性的重鏈可變區(VH)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少90%一致性的重鏈可變區(VH)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%一致性的重鏈可變區(VH)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少99%一致性的重鏈可變區(VH)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少100%一致性的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少90%一致性的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%一致性的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少99%一致性的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少100%一致性的輕鏈可變區(VL)。
本文在某些實施例中揭示與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性的輕鏈可變區(VL)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少90%一致性的輕鏈可變區(VL)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%一致性的輕鏈可變區(VL)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少99%一致性的輕鏈可變區(VL)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少100%一致性的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少90%一致性的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%一致性的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少99%一致性的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少100%一致性的重鏈可變區(VH)。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性的重鏈可變區(VH )及與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性的輕鏈可變區(VL )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少85%一致性的輕鏈可變區(VL )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少90%一致性的輕鏈可變區(VL )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%一致性的輕鏈可變區(VL )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少99%一致性的輕鏈可變區(VL )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少100%一致性的輕鏈可變區(VL )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少85%一致性的重鏈可變區(VH )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少90%一致性的重鏈可變區(VH )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%一致性的重鏈可變區(VH )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少99%一致性的重鏈可變區(VH )。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少100%一致性的重鏈可變區(VH )。
本文在某些實施例中揭示一種抗體或重組抗體，其包含：重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少80%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少80%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80%一致性的CDR H3；以及輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少80%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少80%一致性的CDR L3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少85%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少85%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少85%一致性的CDR L3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少90%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少90%一致性的CDR L3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少95%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少95%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%一致性的CDR L3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少99%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少99%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少99%一致性的CDR L3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少100%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少100%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少100%一致性的CDR L3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少85%一致性的CDR H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少85%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少85%一致性的CDR H3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少90%一致性的CDR H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%一致性的CDR H3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少95%一致性的CDR H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%一致性的CDR H3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少99%一致性的CDR H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少99%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少99%一致性的CDR H3。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少100%一致性的CDR H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少100%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少100%一致性的CDR H3。
本文在某些實施例中揭示一種包含重鏈序列的抗體或重組抗體，該重鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少80%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少80%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80%一致性的CDR H3。
本文在某些實施例中揭示一種包含重鏈序列的抗體或重組抗體，該重鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少90%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%一致性的CDR H3。
本文在某些實施例中揭示一種包含重鏈序列的抗體或重組抗體，該重鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少95%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%一致性的CDR H3。
本文在某些實施例中揭示一種包含重鏈序列的抗體或重組抗體，該重鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少99%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少99%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少99%一致性的CDR H3。
本文在某些實施例中揭示一種包含重鏈序列的抗體或重組抗體，該重鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少100%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少100%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少100%一致性的CDR H3。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80%一致性的互補決定區(CDR) L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少80%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少80%一致性的CDR L3。在一些實施例中，CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90%一致性，CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少90%一致性，且CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少90%一致性。在一些實施例中，CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少95%一致性，CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少95%一致性，且CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%一致性。在一些實施例中，CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少99%一致性，CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少99%一致性，且CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少99%一致性。在一些實施例中，CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少100%一致性，CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少100%一致性，且CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少100%一致性。在一些實施例中，輕鏈可變區(VL)與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性的重鏈可變區(VH)。
本文在某些實施例中揭示一種包含輕鏈序列的抗體或重組抗體，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80%一致性的互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少80%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少80%一致性的CDR L3。
本文在某些實施例中揭示一種包含輕鏈序列的抗體或重組抗體，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90%一致性的互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少90%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少90%一致性的CDR L3。
本文在某些實施例中揭示一種包含輕鏈序列的抗體或重組抗體，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少95%一致性的互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少95%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%一致性的CDR L3。
本文在某些實施例中揭示一種包含輕鏈序列的抗體或重組抗體，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少99%一致性的互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少99%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少99%一致性的CDR L3。
本文在某些實施例中揭示一種包含輕鏈序列的抗體或重組抗體，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少100%一致性的互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少100%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少100%一致性的CDR L3。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含重鏈序列，該重鏈序列包含至少一個與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少80%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少80%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80%一致性的CDR H3。在一些實施例中，CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少90%一致性，CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%一致性，且CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%一致性。在一些實施例中，CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少95%一致性，CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%一致性，且CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%一致性。在一些實施例中，CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少99%一致性，CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少99%一致性，且CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少99%一致性。在一些實施例中，CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少100%一致性，CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少100%一致性，且CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少100%一致性。在一些實施例中，重鏈可變區(VH)與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，輕鏈可變區(VL)與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含人類重鏈恆定區或人類輕鏈恆定區。在一些實施例中，人類重鏈恆定區為IgG1或IgG4或其片段。在一些實施例中，重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：10具有至少80%一致性。在一些實施例中，輕鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：9具有至少80%一致性。在一些實施例中，其中重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：12具有至少80%一致性。在一些實施例中，重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：11具有至少80%一致性。在一些實施例中，重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80%一致性。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含人類可變構架區及鼠類恆定區。在一些實施例中，該抗體或重組抗體進一步包含鼠類重鏈恆定區或鼠類輕鏈恆定區。在一些實施例中，該抗體或鼠類重鏈恆定區為IgG2A。在一些實施例中，重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：15具有至少80%一致性。在一些實施例中，重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少80%一致性。在一些實施例中，輕鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80%一致性。在一些實施例中，該抗體或重組抗體為抗體片段，包含單一重鏈、單一輕鏈、Fab、Fab'、F(ab)'、F(ab')2、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、NAR可變域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2、三特異性Fab3、單鏈結合多肽、dAb片段，或雙功能抗體。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至免疫抑制性人類骨髓細胞上所表現的CD163蛋白，其中抗體或重組抗體對骨髓細胞的結合促進免疫細胞功能，如根據以下參數中之一或兩者所量測：(i)CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及(ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。在一些實施例中，其中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依據IFN-γ、TNF-α或穿孔素或其任何組合的含量增加來量測。在一些實施例中，免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞或骨髓源抑制細胞。在一些實施例中，免疫細胞功能存在於腫瘤微環境中。在一些實施例中，免疫細胞功能存在於活體內。在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至人類巨噬細胞上所表現的CD163蛋白，其中抗體對巨噬細胞的結合使腫瘤微環境中的免疫刺激活性增加。在一些實施例中，腫瘤微環境存在於活體內。在一些實施例中，該抗體或重組抗體對巨噬細胞的結合使巨噬細胞的免疫抑制活性減少。在一些實施例中，抗體或重組抗體對巨噬細胞的結合使巨噬細胞的促腫瘤活性減少。在一些實施例中，巨噬細胞為腫瘤相關巨噬細胞。在一些實施例中，該抗體或重組抗體改變巨噬細胞上之至少一種標記物的表現。在一些實施例中，CD163蛋白為CD163之一種糖型。在一些實施例中，CD163蛋白為CD163之一種150 kDa糖型。在一些實施例中，抗體不特異性結合至人類巨噬細胞所表現之CD163的130 kDa糖型。
在一些實施例中，抗體或重組抗體具有能夠結合至Fc受體的恆定域。在一些實施例中，Fc受體表現於巨噬細胞上。在一些實施例中，該抗體或重組抗體具有抗體片段，包含單一重鏈、單一輕鏈、Fab、Fab'、F(ab)'、F(ab')2、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、NAR可變域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2、三特異性Fab3、單鏈結合多肽、dAb片段，或雙功能抗體。在一些實施例中，人類巨噬細胞上的至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15 (Siglec-15)。在一些實施例中，人類巨噬細胞為M2巨噬細胞或M2樣巨噬細胞。在一些實施例中，人類巨噬細胞為M2a、M2b、M2c或M2d巨噬細胞。在一些實施例中，CD163蛋白為細胞表面複合物的組分，該複合物包含由巨噬細胞表現的至少一種其他蛋白質。在一些實施例中，至少一種其他蛋白質為半乳糖凝集素-1蛋白、LILRB2蛋白、酪蛋白激酶II蛋白，或其任何組合。在一些實施例中，該抗體或重組抗體在與CD163蛋白結合後，被人類巨噬細胞內化。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合對巨噬細胞無細胞毒性。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖，或CD4+ T細胞活化與增殖。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD4+ T細胞對CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖，或CD8+ T細胞活化與增殖。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD8+ T細胞對ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合使腫瘤微環境中的免疫抑制減少。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進腫瘤微環境的腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進T細胞對IL-2的表現。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合使CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞或其任何組合增加。
在一些實施例中，對CD163的結合使巨噬細胞所引起之腫瘤微環境中的免疫抑制減少。在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至人類巨噬細胞上所表現的CD163蛋白，其中結合引起以下效應中之至少一者：(a)巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15；(b)巨噬細胞對抗體的內化；(c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；(d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及(e)促進腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，結合引起：(a)至(e)中之兩者或更多者；(a)至(e)中之三者或更多者；(a)至(e)中之四者或更多者；或(a)至(e)中之全部。在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至腫瘤微環境中之CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞，其中該結合使對細胞毒性T細胞介導腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅的抑制減少。在一些實施例中，抗體或重組抗體相應地特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15或其組合的表現，以用於治療癌症之方法中。在一些實施例中，該抗體或重組抗體對巨噬細胞的結合調節細胞在腫瘤微環境中的免疫功能。在一些實施例中，該抗體或重組抗體對巨噬細胞的結合促進抗腫瘤免疫功能。
在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：18的CD163抗原決定基。在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：19的CD163抗原決定基。在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：20的CD163抗原決定基。在一些實施例中，該抗體或重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20中之每一者的CD163抗原決定基。在一些實施例中，該抗體或重組抗體係以1 nM至100 nM的KD 特異性結合至CD163。在一些實施例中，該抗體或重組抗體係以1 nM至50 nM的KD 特異性結合至CD163。在一些實施例中，該抗體或重組抗體係以1 nM至10 nM的KD 特異性結合至CD163。在一些實施例中，抗體或CD163為人類CD163。在一些實施例中，該抗體或重組抗體係以1 nM至100 nM之KD 特異性結合至M2c巨噬細胞。在一些實施例中，該抗體或重組抗體係以1 nM至50 nM之KD 特異性結合至M2c巨噬細胞。在一些實施例中，該抗體或重組抗體係以1 nM至10 nM之KD 特異性結合至M2c巨噬細胞。在一些實施例中，M2c巨噬細胞為人類M2c巨噬細胞。
本文在某些實施例中揭示一種包含抗體或重組抗體及賦形劑的組合物。
本文在某些實施例中揭示一種醫藥組合物，其包含任一先前實施例的抗體或重組抗體及醫藥學上可接受之載劑。
本文在某些實施例中揭示任一先前實施例之抗體或重組抗體的用途，其用於製造供治療人類個體之癌症的藥劑。
本文在某些實施例中揭示任一先前實施例之抗體或重組抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑減少患有癌症之人類個體中之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制。
本文在某些實施例中揭示任一先前實施例之抗體或重組抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑促進患有癌症之人類個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示一種促進免疫細胞功能的方法，該方法包含：向有需要之個體投與任一先前實施例的抗體或重組抗體，及促進免疫細胞功能，如根據以下參數中之一或兩者所量測：(i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及(ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。在一些實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依據IFN-γ、TNF-α或穿孔素或其任何組合的含量增加來量測。在一些實施例中，免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞。在一些實施例中，免疫抑制性人類骨髓細胞為骨髓源抑制細胞。在一些實施例中，該抗體或重組抗體為任一先前實施例的抗體或重組抗體。
本文在某些實施例中揭示一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之任一先前實施例的抗體或重組抗體，從而治療該個體之癌症。
本文在某些實施例中揭示一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之任一先前實施例的抗體或重組抗體，藉此減少該個體中之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制。
本文在某些實施例中揭示一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之任一先前實施例的抗體或重組抗體，藉此增強該個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示一種減少有需要之個體中之腫瘤相關巨噬細胞之促腫瘤活性的方法，該方法包含向該個體投與有效調節腫瘤微環境中之CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖、CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖或其任何組合之量之任一先前實施例的醫藥組合物。
本文在某些實施例中揭示一種促進有需要之個體中之淋巴球介導腫瘤細胞殺滅的方法，該方法包含向該個體投與有效量之任一先前實施例的抗體或重組抗體或任一先前實施例的醫藥組合物。
在一些實施例中，該方法進一步包含促進腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，癌症為肺癌或肉瘤。在一些實施例中，肺癌為肺癌瘤或肺腺癌。在一些實施例中，該方法進一步包含向該個體投與另一種抗癌治療劑或抗癌療法。在一些實施例中，另一種抗癌療法為外科療法、化學療法、輻射療法、冷凍療法、激素療法、免疫療法及細胞介素療法，以及其組合。在一些實施例中，另一種抗癌療法為免疫療法。在一些實施例中，免疫療法為包含檢查點抑制劑之組合物。
本文在某些實施例中揭示一種調節腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤微環境中之活性的方法，該方法包含使該腫瘤相關巨噬細胞與抗體或重組抗體接觸，該抗體或重組抗體結合至表現CD163的人類巨噬細胞且包含以下效應中之至少一者：(a)抗體的結合減少巨噬細胞上之至少一種標記物的表現，其中至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15；(b)抗體與CD163蛋白結合後，該抗體被人類巨噬細胞內化；(c)抗體的結合對巨噬細胞無細胞毒性；(d)抗體或重組抗體的結合使CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合產生IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其任何組合；(e)抗體或重組抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；(f)抗體或重組抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及(g)抗體或重組抗體的結合促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，該結合引起：(a)至(g)中之兩者或更多者；(a)至(g)中之三者或更多者；(a)至(g)中之四者或更多者；(a)至(g)中之五者或更多者；(a)至(g)中之六者或更多者；或(a)至(g)的全部。
在一些實施例中，該方法係在腫瘤微環境中進行。在一些實施例中，該方法係在活體內進行。在一些實施例中，該抗體或重組抗體對巨噬細胞的結合調節細胞在腫瘤微環境中的免疫功能。在一些實施例中，該抗體或重組抗體對巨噬細胞的結合促進抗腫瘤免疫功能。在一些實施例中，該抗體或重組抗體包含恆定域且該恆定域結合至Fc受體。在一些實施例中，Fc受體表現於巨噬細胞上。在一些實施例中，該方法進一步包含在與CD163蛋白結合後，使該抗體或重組抗體被人類巨噬細胞內化。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合對人類巨噬細胞無細胞毒性。在一些實施例中，該方法進一步包含促進CD4+ T細胞對CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，該方法進一步包含促進CD8+ T細胞對ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，該方法包含減少腫瘤微環境中之免疫抑制。在一些實施例中，該方法包含促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。在一些實施例中，該方法包含促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，該方法包含促進T細胞對IL-2的表現。在一些實施例中，該方法包含增加CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞或其任何組合。
本文在某些實施例中揭示一種特異性結合至免疫抑制性人類骨髓細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中抗體對骨髓細胞的結合促進免疫細胞功能，如根據以下參數中之一或兩者所量測：(i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及(ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。在一些實施例中，免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞或骨髓源抑制細胞。在一些實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依據IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其任何組合的產生增加來量測。
本文在某些實施例中揭示一種特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中抗體對巨噬細胞的結合促進免疫細胞功能，如根據以下參數中之一或兩者所量測：(i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及(ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。在一些實施例中，免疫細胞功能存在於腫瘤微環境中。在一些實施例中，免疫細胞功能存在於活體內。在一些實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依據IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其任何組合的產生增加來量測。
本文在某些實施例中揭示一種特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中抗體對巨噬細胞的結合使腫瘤微環境中的免疫刺激活性增加。在一些實施例中，腫瘤微環境存在於活體內。在一些實施例中，抗體對巨噬細胞的結合使巨噬細胞的免疫抑制活性減少。在一些實施例中，抗體對巨噬細胞的結合使巨噬細胞的促腫瘤活性減少。在一些實施例中，巨噬細胞為腫瘤相關巨噬細胞。在一些實施例中，該抗體改變巨噬細胞上之至少一種標記物的表現。在一些實施例中，CD163蛋白為CD163之一種糖型。在一些實施例中，CD163蛋白為CD163之一種150 kDa糖型。在一些實施例中，抗體不特異性結合至人類巨噬細胞所表現之CD163的130 kDa糖型。在一些實施例中，抗體具有能夠結合至Fc受體的恆定域。在一些實施例中，Fc受體表現於巨噬細胞上。在一些實施例中，抗體片段包含單一重鏈、單一輕鏈、Fab、Fab'、F(ab)'、F(ab')2 、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、NAR可變域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2 、三特異性Fab3 、單鏈結合多肽、dAb片段，或雙功能抗體。在一些實施例中，人類巨噬細胞上的至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15。在一些實施例中，人類巨噬細胞為M2巨噬細胞或M2樣巨噬細胞。在一些實施例中，人類巨噬細胞為M2a、M2b、M2c或M2d巨噬細胞。在一些實施例中，CD163蛋白為細胞表面複合物的組分，該複合物包含由巨噬細胞表現的至少一種其他蛋白質。在一些實施例中，至少一種其他蛋白質為半乳糖凝集素-1蛋白、LILRB2蛋白、酪蛋白激酶II蛋白，或其任何組合。在一些實施例中，該抗體在與CD163蛋白結合後，被人類巨噬細胞內化。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合對巨噬細胞無細胞毒性。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖，或CD4+ T細胞活化與增殖。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD4+ T細胞對CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖，或CD8+ T細胞活化與增殖。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進CD8+ T細胞對ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合使腫瘤微環境中的免疫抑制減少。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進腫瘤微環境的腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合促進T細胞對IL-2的表現。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合使CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞或其任何組合增加。在一些實施例中，對CD163的結合使巨噬細胞所引起之腫瘤微環境中的免疫抑制減少。
本文在某些實施例中揭示一種特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中結合引起以下效應中之至少一者：(a)巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15；(b)巨噬細胞對抗體的內化；(c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；(d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及(e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，結合引起：(a)至(e)中之兩者或更多者；(a)至(e)中之三者或更多者；(a)至(e)中之四者或更多者；或(a)至(e)中之全部。在一些實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依據IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其任何組合的產生增加來量測。
本文在某些實施例中揭示一種特異性結合至腫瘤微環境中之CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞的抗體，其中該結合使對細胞毒性T細胞介導腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅的抑制減少。
本文在某些實施例中揭示一種抗體，其特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15或其組合的表現，以用於治療癌症之方法中。在一些實施例中，該抗體對巨噬細胞的結合調節細胞在腫瘤微環境中的免疫功能。在一些實施例中，該抗體對巨噬細胞的結合促進抗腫瘤免疫功能。
在一些實施例中，組合物包含根據如本文所揭示之任何實施例的抗體及賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含根據如本文所揭示之任何實施例的抗體及醫藥學上可接受之載劑。
在一些實施例中，如本文所揭示之抗體的用途係用於製造供治療人類個體之癌症用的藥劑。
在一些實施例中，如本文所揭示之抗體的用途係用於製造藥劑，該藥劑使患有癌症之人類個體中之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制減少。
在一些實施例中，如本文所揭示之抗體的用途係用於製造藥劑，該藥劑促進患有癌症之人類個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示一種促進免疫細胞功能的方法，該方法包含：使抗體特異性結合至免疫抑制性人類骨髓細胞上所表現的CD163蛋白；及促進免疫細胞功能，如依據以下參數中之一或兩者所量測：(i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及(ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。在一些實施例中，免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞。在一些實施例中，免疫抑制性人類骨髓細胞為骨髓源抑制細胞。在一些實施例中，抗體為如本文所揭示的任何實施例。
本文在某些實施例中揭示一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本文所揭示之任一個實施例的抗體，從而治療該個體之癌症。
本文在某些實施例中揭示一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本文所揭示之任一個實施例的抗體，藉此減少該個體中之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制。
本文在某些實施例中揭示一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之本文所揭示之任一個實施例的抗體，藉此增強該個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，癌症為肺癌或肉瘤。在一些實施例中，肺癌為肺癌瘤或肺腺癌。
本文在某些實施例中揭示一種使有需要之個體中之腫瘤相關巨噬細胞之促腫瘤活性減少的方法，該方法包含向該個體投與有效調節腫瘤微環境中之CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖、CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖或其任何組合之量的如技術方案43之醫藥組合物。在一些實施例中，該方法進一步包含促進腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示一種促進有需要之個體中之淋巴球介導腫瘤細胞殺滅的方法，該方法包含向該個體投與有效量之本文所揭示之任一個實施例的醫藥組合物。
本文在某些實施例中揭示一種調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞之活性的方法，該方法包含使該腫瘤相關巨噬細胞與抗體接觸，該抗體結合至表現CD163的人類巨噬細胞且包含以下效應中之至少一者：(a)抗體的結合使巨噬細胞上之至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15；(b)在抗體與CD163蛋白結合後，該抗體被人類巨噬細胞內化；(c)抗體的結合對巨噬細胞無細胞毒性；(d)抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；(e)抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及(f)抗體的結合促進腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，該結合引起：(a)至(f)中之兩者或更多者；(a)至(f)中之三者或更多者；(a)至(f)中之四者或更多者；(a)至(f)中之五者或更多者；或(a)至(f)的全部。在一些實施例中，CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依據IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其任何組合的產生增加來量測。在一些實施例中，該方法係在腫瘤微環境中進行。在一些實施例中，該方法係在活體內進行。在一些實施例中，該抗體對巨噬細胞的結合調節細胞在腫瘤微環境中的免疫功能。在一些實施例中，該抗體對巨噬細胞的結合促進抗腫瘤免疫功能。在一些實施例中，該抗體包含恆定域且該恆定域結合至Fc受體。在一些實施例中，Fc受體表現於巨噬細胞上。在一些實施例中，該方法進一步包含在與CD163蛋白結合後，使該抗體被人類巨噬細胞內化。在一些實施例中，對CD163蛋白的結合對人類巨噬細胞無細胞毒性。在一些實施例中，該方法進一步包含促進CD4+ T細胞對CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，該方法進一步包含促進CD8+ T細胞對ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合的表現。在一些實施例中，該方法包含減少腫瘤微環境中之免疫抑制。在一些實施例中，該方法包含促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。在一些實施例中，該方法包含促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，該方法包含促進T細胞對IL-2的表現。在一些實施例中，該方法包含增加CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞或其任何組合。
相關申請案的交叉參照
本申請案主張美國臨時申請案第62/876,580號(2019年7月19日申請)、第62/876,579號(2019年7月19日申請)及第62/878,265號(2019年7月24日申請)的優先權及權益，該等美國臨時申請案中之每一者的完整內容以引用的方式併入本文中。
本文揭示特異性結合至CD163+ 細胞的抗體。在一些實施例中，CD163+ 細胞為免疫抑制性骨髓細胞。在一些實施例中，CD163+ 細胞為表現CD163的人類骨髓細胞。在一些實施例中，CD163+ 細胞為腫瘤細胞。在一些實施例中，CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞為人類巨噬細胞。在一些實施例中，人類CD163+ 免疫抑制性巨噬細胞為M2或M2樣巨噬細胞。在一些實施例中，免疫抑制性骨髓細胞為骨髓源抑制細胞(MDSC)。在一些實施例中，人類巨噬細胞表現高量的CD163 (CD163Hi )。相比之下，其他人類造血細胞或初級非免疫人類細胞不表現CD163。舉例而言，M1及M1樣巨噬細胞不表現CD163。
暴露於某些炎性細胞介素或微生物相關分子模式的單核球及巨噬細胞區分為促炎性(M1或M1樣)或消炎性M2或M2樣巨噬細胞。M1及M2為用於定義活體外活化之巨噬細胞的分類，該等巨噬細胞分別定義為促炎性(當經典地使用IFN-γ及脂多醣活化時)或消炎性(當可替代地用IL-4或IL-10活化時)，而具有M1或M2表型的活體內或離體巨噬細胞定義為M1樣或M2樣巨噬細胞。在一些實施例中，M2巨噬細胞係藉由其暴露於某些細胞介素而產生。在一些實施例中，M2巨噬細胞係藉由IL-4、IL-10、IL-13或其組合來區分。
M2巨噬細胞亞型包括M2a、M2b、M2c及M2d亞型。M2a巨噬細胞係藉由IL-4及IL-13誘發CD163、精胺酸酶-1、甘露糖受體MRC1 (CD206)之表現上調、誘發MHC II系統呈遞抗原以及誘發IL-10及TGF-β產生來誘導，從而引起組織再生及抑制促炎性分子以防止發炎反應。M2b巨噬細胞產生IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α作為對免疫複合物的反應。M2c巨噬細胞係藉由IL-10、轉型生長因子β (TGF-β)及糖皮質激素暴露來誘導且產生IL-10及TGF-β，使得發炎反應被抑制。作為對IL-6及腺苷的反應，M2d亞型被活化。
M2巨噬細胞具有對應於M2巨噬細胞及其亞型的功能及表型。M2樣巨噬細胞為活體內或離體巨噬細胞，其具有M2巨噬細胞之功能或表型特徵的亞群。
在一些實施例中，本發明的抗體對免疫抑制性骨髓細胞(特定言之，腫瘤相關巨噬細胞，諸如M2及M2樣巨噬細胞)具有高親合力及特異性結合。在一些實施例中，抗體特異性結合至來自人類原發肺腫瘤的M2及M2樣TAM。在一些實施例中，如本文所揭示的抗體對M1或M1樣巨噬細胞的結合不明顯。M1活化的巨噬細胞表現轉錄因子，諸如干擾素調控因子(IRF5)、κ輕鏈多肽基因增強子之核因子(NF-κB)、活化蛋白(AP-1)及STAT1。M1巨噬細胞分泌促炎性細胞介素，諸如IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-12、IL-23及TNFα。M1巨噬細胞具有對應於M1巨噬細胞的功能及表型。M1樣巨噬細胞為任何活體內或離體巨噬細胞，其具有M1巨噬細胞之功能或表型特徵的亞群。
在一些實施例中，本發明之抗體不結合至初級人類細胞。在一些實施例中，本發明之抗體不結合至造血幹細胞、白血球、T細胞、B細胞、NK細胞及顆粒球。
腫瘤相關巨噬細胞(TAM)為異源類別的巨噬細胞，其大量存在於實體腫瘤的微環境中。大部分證據表明TAM具有促腫瘤表型，其似乎涉及腫瘤細胞增殖、腫瘤血管生成、活動性及侵襲、轉移、抗癌藥物抗性及腫瘤免疫逃避。
藉由腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)中的細胞毒性T細胞直接殺滅腫瘤細胞在免疫系統的抗腫瘤功能中起主要作用。然而，腫瘤微環境(TME)中的TAM抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫反應。TAM具有免疫抑制性轉錄特徵且表現包括IL-10及轉型生長因子β (TGFβ)之因子。在人類中，TAM已顯示經由肝細胞癌中之程式化死亡配位體1 (PD-L1)及卵巢癌中之B7同源物的表面呈遞而直接抑制T細胞功能，該程式化死亡配位體及同源物分別活化T細胞上的程式化死亡蛋白1 (PD-1)及細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA4)。PD-1及CTLA4的抑制信號為免疫檢查點，且此等抑制受體被其配位體結合抑制T細胞受體信號傳導及T細胞的細胞毒性功能且促進T細胞發生細胞凋亡。HIF-1α誘導TAM抑制T細胞功能。CD163已鑑別為僅表現於TAM上的免疫抑制分子，且可為癌症免疫療法的潛在治療標靶。
TAM基於其功能特徵(包括其與T輔助細胞(CD4+ )型Th1及Th2的關係)，通常分成兩類：M1樣抗腫瘤巨噬細胞及M2樣免疫抑制性巨噬細胞。M1巨噬細胞為「經典」模型且可在IFN-γ與內生免疫活化因子(諸如病原體相關分子模式(PAMP)(例如脂多醣(LPS))或損傷相關分子模式(DAMP)以及炎性細胞介素(例如腫瘤壞死因子-α (TNF-α))存在下產生。另外，經由CD40-CD40配位體路徑發生的T細胞依賴性巨噬細胞活化誘導M1分化。M1巨噬細胞具有促炎、殺菌及細胞毒性功能。此等巨噬細胞促進Th1細胞發生抗原依賴性誘導以及Th1及CD8+ T細胞活化。M1樣抗腫瘤巨噬細胞促進T細胞的細胞毒性活性為消除腫瘤細胞的關鍵。在一些實施例中，M1樣抗腫瘤巨噬細胞係以藉由流式細胞術所量測的表面標記物表現為特徵且具有CD80+ CD86+ CD163Lo /- 或CD206Lo /- 表型。M1巨噬細胞分泌IL-12及低量的IL-10及/或TGF-β。
相比之下，M2樣免疫抑制性巨噬細胞為可在IL-4或IL-10存在下活體外產生的「替代」或「非經典」活化模型，具有消炎性且促進傷口癒合及組織修復。在一些實施例中，M2樣免疫抑制性巨噬細胞係由單核球源巨噬細胞極化且藉由腫瘤分泌的因子募集。M2樣免疫抑制性巨噬細胞為主要的巨噬細胞類型，其涉及TAM之促腫瘤功能，包括促進腫瘤生長、轉移及免疫逃避。M2樣巨噬細胞表現表面標記物CD15、CD23、CD64、CD68、CD163Hi 、CD204Hi 、CD206Hi 及/或其他M2巨噬細胞標記物，如藉由流式細胞術所測定。M2巨噬細胞分泌高量的IL-10及TGF-β1以及低量的IL-12。
在許多腫瘤類型中，TAM浸潤程度具有相當大的預後價值。TAM已與多種腫瘤之不良預後關聯。舉例而言，已發現M2樣腫瘤相關巨噬細胞較多的乳癌患者具有較高惡性程度的腫瘤、較大微血管密度及較低總存活率。M1樣抗腫瘤TAM較多的患者顯示相反的效應。
因此，仍需要鑑別可改善治療癌症之免疫治療療法的化合物及方法。
CD163 (富含清道夫受體半胱胺酸之1型蛋白質M130；血紅素清道夫受體)為一種細胞表面蛋白，其充當血紅素結合球蛋白複合物的清道夫受體且保護組織以免血紅素介導的氧化性損傷。分子量為125,451、125,982、121,609及124,958 Da的四種CD163蛋白同功異型物已有報導。同功異型物1為最普遍的CD163同功異型物，其具有125,451 Da之分子量且由1115個胺基酸殘基多肽(包含胞外域、跨膜區段及胞質尾)組成。胞外域包含九個富含半胱胺酸之重複域。CD163蛋白之同功異型物1具有四個N連接型糖基化位點，且在M2巨噬細胞中，CD163蛋白在SDS-PAGE中、在還原條件下顯示兩個不同色帶：位於約150 kDa及約130 kDa。
CD163 mRNA表現通常侷限於骨髓細胞，但亦被某些人類癌症表現。TAM上的CD163表現已與免疫抑制性M2樣表型有關，該表型已顯示與癌症的不良臨床結果相關。CD163為巨噬細胞在人類及鼠類肉瘤中發生促腫瘤活化所必需的。CD163亦已報導為巨噬細胞清道夫受體且促進免疫抑制。在一些實施例中，血紅素-結合球蛋白複合物與CD163的相互作用誘導免疫抑制性細胞介素IL-10分泌及血基質加氧酶-1 (HO-1)表現。HO-1產生消炎代謝物Fe2 + 、CO及膽綠素。
可溶性CD163係人體內經由胞外域排出而產生且據報導具有消炎特性，諸如下調T細胞反應，包括藉由植物血球凝集素(PHA)刺激的淋巴球增殖或12-O-十四醯基佛波醇-13-乙酸酯(TPA)。
靶向CD163的抗體已顯示可調節表現CD163之巨噬細胞的先天免疫反應。舉例而言，RM3/1抗體(針對CD163的抗體)為一種小鼠單株IgG1 (κ輕鏈)，其針對人類單核球而產生。RM3/1抗體結合至人類CD163之富半胱胺酸域9，減少LPS誘導的TNFα，且增強巨噬細胞的IL-10分泌。 某些術語
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習所主張之標的物所屬技術者通常所瞭解相同之含義。一般而言，關於免疫學、腫瘤學、細胞及組織培養、分子生物學以及本文所述之蛋白質及寡核苷酸或聚核苷酸化學及雜交所使用以及其技術所使用的命名法為此項技術中熟知且常用的彼等命名法。應瞭解，以上一般描述及以下詳細描述僅具例示性及解釋性且不限制所主張之任何標的物。本文所用之章節標題僅出於組織目的，且不應解釋為限制所述標的物。
除非上下文另外明確指出，否則如本文所用，單數形式「一」及「該」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一種抗體」包括複數種抗體且提及「一種抗體」在一些實施例中包括多種抗體等。
除非上下文另外明確指示，否則如本文所用，所有數值或數值範圍包括此類範圍內之全部整數或涵蓋此類範圍及範圍內之值的分數或整數或涵蓋範圍。因此，舉例而言，提及範圍90-100%包括91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%等，以及91.1%、91.2%、91.3%、91.4%、91.5%等，92.1%、92.2%、92.3%、92.4%、92.5%等，諸如此類。在另一實例中，提及範圍1-5,000倍包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍等，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5倍等，2.1、2.2、2.3、2.4、2.5倍等，諸如此類。
如本文所用，「約」數係指範圍，包括該數及低於該數10%至高於該數10%的範圍。「約」範圍係指低於該範圍下限10%，直至高於該範圍上限10%。
「一致性百分比」及「一致性%」係指兩個序列(核苷酸或胺基酸)在比對時、在相同位置具有相同殘基的程度。舉例而言，「胺基酸序列與SEQ ID NO：Y具有X%一致性」係指胺基酸序列與SEQ ID NO：Y的一致性%且詳述為胺基酸序列中之X%殘基與SEQ ID NO：Y中所揭示之序列殘基一致。一般而言，使用電腦程式進行此類計算。比較及比對各對序列的例示性程式包括ALIGN (Myers及Miller, Comput Appl Biosci. 1988年3月;4(1):11-7)、FASTA (Pearson及Lipman, Proc Natl Acad Sci U S A. 1988年4月;85(8):2444-8；Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98)及空位式BLAST (Altschul等人, Nucleic Acids Res. 1997年9月1日;25(17):3389-40)、BLASTP、BLASTN或GCG (Devereux等人, Nucleic Acids Res. 1984年1月11日;12(1 Pt 1):387-95)。
如本文所用，「抗體」係指結合抗原的蛋白質。抗體之重鏈及輕鏈中之每一者中通常包含可變域及恆定域。因此，大部分抗體的重鏈可變域(VH)與輕鏈可變域(VL)一起形成結合至抗原的抗體部分。每個可變域內存在三個互補決定區(CDR)，其形成重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)中的環且與抗原表面接觸。「抗體」包括(但不限於)多株抗體、單株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、天然抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體、合成抗體、重組抗體、融合抗體、突變抗體、移植抗體、抗體片段(例如全長抗體的一部分，通常為其抗原結合或可變區，例如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)，及活體外產生的具有抗原結合活性之抗體。該術語亦包括單鏈抗體，例如單鏈Fv (sFv或scFv)抗體，其中可變重鏈與可變輕鏈連接在一起(直接或經由肽連接子)而形成連續多肽。
如本文所用，「互補決定區(CDR)」係指結合至特定抗原之抗體中之可變鏈的一部分。多種方法可以用於定義CDR。本發明領域係利用CDR長度及位置之定義不同的多種編號方案。舉例而言，Kabat編號方案係基於序列比對且利用指定胺基酸位置之「可變性參數」(不同胺基酸在指定位置出現的次數除以最常出現之胺基酸在該位置的頻率)預測CDR。另一方面，Chothia編號方案為基於結構的編號方案，其中如將環結構定義為CDR來比對抗體晶體結構。Martin編號方案聚焦於對非習知長度之不同構架區進行結構比對。IMGT編號方案為標準化編號系統，其基於對來自完整參考基因資料庫(包括整個免疫球蛋白超家族)之序列的比對。Honneger編號方案(AHo's)係基於可變區之3D結構的結構比對且利用結構上保守的Cα位置推導構架及CDR長度。熟習此項技術者應注意，CDR定義將基於所用方法而變化。本文揭示的序列考慮定義CDR的任何方法。
術語「接受者」、「個體(individual)」、「個體(subject)」、「宿主」及「患者」在本文中可互換地使用且係指需要診斷、治療或療法之任何哺乳動物個體，尤其人類。用於治療目的之「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農畜，以及實驗室、動物園、運動或寵物動物，諸如犬、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴等。在一些實施例中，哺乳動物為人類。
如本文所用，術語「療法」、「治療」及其類似術語在一些情況下係指出於獲得效應之目的，投與藥劑或執行程序。在一些實施例中，就完全或部分地預防疾病或其症狀而言，該效應係預防的；且/或就實現疾病及/或該疾病之症狀部分或完全治癒而言，該效應係治療的。如本文所用，「治療」包括哺乳動物(尤其人類)之疾病或病症(例如癌症)的治療且包括：(a)預防疾病或疾病之症狀發生於易患疾病、然而尚未診斷患有該疾病(例如包括與原發性疾病有關或由原發性疾病引起的疾病)的個體；(b)抑制該疾病，亦即，遏制其發展；及(c)緩解該疾病，亦即，引起該疾病消退。在一些實施例中，治療係指治療或改善或預防癌症成功之任何標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除；緩和；減弱症狀或使疾病病狀為患者更可耐受；減緩退化或衰退之速率；或使退化終點減少虛化。治療或改善症狀係基於一或多種客觀或主觀參數；包括醫師檢查結果。相應地，術語「治療」包括投與本發明之化合物或藥劑以預防或延遲、緩解或阻滯或抑制與疾病(例如癌症)有關之症狀或病狀的發展。術語「治療效果」係指減少、消除或預防個體之疾病、疾病之症狀或疾病之副作用。若在接受治療量之本發明抗體之後，患者之疾病或病症的參數或症狀顯示可觀測且/或可量測的變化，諸如在治療癌症的情況下，腫瘤細胞殺滅活性增強(如離體評估)、血液中之免疫抑制性分泌因子含量較低、腫瘤體積或質量較低、腫瘤切片中之細胞毒性淋巴球及Th1(如T細胞)數目增加、罹病率或死亡率降低、生活品質因數改善，或與疾病或病症之參數或症狀有關的任何客觀標誌改善，則個體就該疾病或病症而言「經治療」。在一些實施例中，參數包括免疫冷腫瘤轉化為免疫熱腫瘤，例如藉由增加細胞毒性淋巴球細胞數量以及腫瘤切片中之T細胞活化標記物(CD69、ICOS、OX40等)，或減少腫瘤切片中之TAM上之CD16、CD64、TLR2、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15的表現。
在一些實施例中，「誘導反應」係指個體之疾病之病徵或症狀緩解或減少，且特別包括(不限於)生存期的延長。
術語「親合力」係指兩種或更多種藥劑之複合物對稀釋後的解離存在抗性。
在一些實施例中，抗體「效應功能」係指可歸因於抗體Fc區(原生序列Fc區或胺基酸序列變異型Fc區)的彼等生物活性且隨抗體同型而變化。
「Fc受體」或「FcR」係指結合至抗體Fc區之受體。
如本文所用，「人類效應細胞」係指表現一或多種FcR且執行效應功能之白血球。舉例而言，該等細胞至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括(但不限於)周邊血液單核細胞(PBMC)、NK細胞、單核球、巨噬細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性球。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下溶解。經典補體路徑之活化始於補體系統之第一組分(C1q)結合至與其同源抗原結合的抗體(其適當子類)。為了評估補體活化，進行例如CDC分析。
「內化」的抗體為在結合至哺乳動物細胞上之抗原(例如細胞表面多肽或受體)後，被細胞吸收(亦即，進入細胞)的抗體。內化抗體包含抗體片段、人類或嵌合抗體，及抗體結合物。在一些情況下，抗體(例如本文所揭示)的內化使得細胞生物學發生變化，促使其改變其功能。
「抗原結合域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」為抗體的一部分，其含有與抗原相互作用的胺基酸殘基(或其他部分)且促成抗體對抗原的特異性及親和力。對於特異性結合至其抗原之抗體而言，此將包括至少一個其CDR域之至少一部分。
抗體的抗原結合區稱為「互補位」，其結合至抗原決定子，抗原的「抗原決定基」，亦即，能夠被抗體結合之抗原分子的一部分。在一些實施例中，抗原物質具有一或多個可被抗體識別的部分，亦即，超過一個抗原決定基，且因此，單一抗原物質被不同抗體特異性結合，該等抗體各自具有針對不同抗原決定基的特異性。在一些實施例中，抗原決定基包含抗原之非連續部分。例如在多肽中，在多肽一級序列中不連續、但在多肽三級及四級結構之情況下彼此足夠接近而被抗原結合蛋白結合的胺基酸殘基構成抗原決定基。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分。在一些實施例中，抗體片段包含完整抗體的抗原結合區或可變區。
術語「抗體的抗原結合部分」、「抗原結合片段」、「抗原結合域」、「抗體片段」在本文中可互換使用且係指抗體的一或多個片段，該等片段保持特異性結合至抗原的能力。此類術語內所包括之抗體片段之非限制性實例包括(但不限於) (i) Fab片段：由VL、VH、CL及CH1域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段：含有兩個Fab片段的二價片段，該兩個Fab片段在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接；(iii)由VH及CH域組成的Fd片段；(iv)含有抗體之單臂之VL及VH域的Fv片段；(v)含有VH域的dAb片段(Ward等人, Nature 341(6242):544-6 (1989))；及(vi)經分離之CDR。亦包括「一半」抗體，其包含單一重鏈及單一輕鏈。本文中亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。
如本文所用，「功能性抗體片段」在上下文中係指不僅結合抗體之抗原、而且具有表徵完整抗體之功能屬性的抗體片段。舉例而言，若抗體的功能取決於具有能夠發揮效應功能(諸如ADCC)的Fc域，則功能片段將具有此類功能。假設本發明之抗體當其包含結合至巨噬細胞Fc受體的Fc部分(諸如在一些實施例中為CD16 (FcγRIIIa)或CD64 (FcγRI))時，有效地調節腫瘤相關巨噬細胞之功能狀態，或重定向或抑制M2狀態巨噬細胞。
片語抗體之「功能片段或模擬物」為與全長抗體具有共同之定性生物活性的化合物。舉例而言，抗IgE抗體之功能片段或模擬物為結合至IgE免疫球蛋白的功能片段或模擬物，以阻止或實質上減少此類分子擁有結合至高親和力受體FcγRI之能力的能力。
「抗原結合蛋白」為一種蛋白質，其所含部分包含抗體之抗原結合部分，視情況亦包括允許抗原結合部分採用促進抗原結合蛋白結合至抗原之構形的支架或構架部分。
「完整」抗體為包含抗原結合位點以及CL 及至少重鏈恆定域CH 1、CH 2及CH 3的抗體。在一些實施例中，恆定域為原生序列恆定域(例如人類原生序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。
如本文所用，術語「重組抗體」係指一種抗體，其包含第一抗體之抗原結合域(諸如CDR、VH區或完整輕鏈)，及來自一或多種其他抗體或蛋白質之域。嵌合、融合及人類化抗體為重組抗體之實例。
「CDR移植抗體」為一種抗體，其包含來源於一個物種或同型之抗體的一或多個CDR及相同或不同物種或同型之另一種抗體的構架。
術語「人類抗體」包括具有一或多個來源於人類免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之所有抗體。在一個實施例中，抗體之所有可變域及恆定域皆來源於人類免疫球蛋白序列(稱為「完全人類抗體」)。
如本文所用，術語「親和力」係指兩種藥劑可逆結合的平衡常數且表示為KD 。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段對CD163展現的結合親和力範圍如藉由KD (平衡解離常數)所量測，為10- 6 M或更小，或範圍降至10- 16 M或更低(例如約10- 7 、10- 8 、10- 9 、10- 10 、10- 11 、10- 12 、10- 13 、10- 14 、10- 15 、10- 16 M或更小)。在某些實施例中，如本文所述的抗體以小於或等於10- 4 M、小於或等於約10- 5 M、小於或等於約10- 6 M、小於或等於10- 7 M或小於或等於10- 8 M的KD 特異性結合至huCD163多肽。
術語「優先結合」或「特異性結合」意謂抗體或其片段結合至抗原決定基的親和力大於其結合無關胺基酸序列的親和力，且若與含有該抗原決定基的其他多肽具有交叉反應性，則在其為了投與人類用途而調配的含量下無毒性。在一些實施例中，此類親和力為抗體或其片段針對無關胺基酸序列之親和力的至少1倍大、至少2倍大、至少3倍大、至少4倍大、至少5倍大、至少6倍大、至少7倍大、至少8倍大、至少9倍大、10倍大、至少20倍大、至少30倍大、至少40倍大、至少50倍大、至少60倍大、至少70倍大、至少80倍大、至少90倍大、至少100倍大或至少1000倍大。
術語「特異性」係指其中抗體將優先結合至除含有被抗體識別之抗原決定基之抗原之外之分子的情形。在例如抗原結合域特異性針對多種抗原所載之特定抗原決定基的情況下(在此情況下，載有抗原結合域之抗體或其抗原結合片段將能夠結合至載有抗原決定基的不同抗原)，該術語亦適用。
如本文所用，若抗體與抗原發生可偵測程度的反應，較佳為親和力常數Ka 大於或等於約104 M- 1 或大於或等於約105 M- 1 、大於或等於約106 M- 1 、大於或等於約107 M- 1 或大於或等於109 M- 1 ，則稱該抗體「免疫特異性」或「特異性」針對該抗原，或稱該抗體「特異性結合」至該抗原。
如本文所用，術語「單特異性」係指抗體組合物含有對一個特定抗原決定基呈現優先親和力的抗體。在一些實施例中，單特異性抗體製劑係由對特定抗原具有特異性結合活性的約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或99.9%抗體構成。
術語「多肽」係以其習知含義使用，亦即，作為胺基酸序列使用。多肽不限於產物之特定長度。多肽之定義內包括肽、寡肽及蛋白質，且除非另外特別指示，否則此類術語可在本文中互換使用。此術語亦非指或排除多肽之表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾，以及此項技術中已知之其他修飾(天然存在的與非天然存在的)。在一些實施例中，多肽為完整蛋白質或其子序列。在本發明抗體之情形下，所關注之特定多肽為包含CDR且能夠結合由此類細胞表現之人類M2巨噬細胞或CD163蛋白的胺基酸子序列。
如本文所用，「基本上純的」及「基本上不含」係指溶液或懸浮液含有小於例如約20%或更少的外來物質、約10%或更少的外來物質、約5%或更少的外來物質、約4%或更少的外來物質、約3%或更少的外來物質、約2%或更少的外來物質，或約1%或更少的外來物質。
術語「分離」係指蛋白質(例如抗體)、核酸或其他物質基本上不含其他細胞物質及/或化學物質。在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段及核酸為經分離的。在一些實施例中，本發明的抗體或其抗原結合片段及核酸為基本上純的。
「分離」當應用於多肽時，通常意謂多肽已與天然地隨其一起存在的其他蛋白質及核酸分離。較佳地，多肽亦與用於純化其的物質(諸如抗體或凝膠基質(聚丙烯醯胺))分離。在一些情況下，該術語意謂多肽或其一部分，根據其來源或操縱：(i)其作為表現載體之一部分的表現產物存在於宿主細胞中；或(ii)其連接至除其在自然界中所連接者之外的蛋白質或其他化學部分；或(iii)其不存在於自然界中，例如經化學方式操縱的蛋白質，此藉由附接或添加至少一個疏水性部分至蛋白質中，以使得該蛋白質呈現自然界中未發現之形式。「分離」進一步意謂蛋白質：(i)為化學合成的；或(ii)表現於宿主細胞中且經純化而脫離相關的污染蛋白質。
如本文所用，術語「有效量」係指當投與個體時，如本文所述之抗體或其抗原結合部分的量足以誘導反應，例如實現如本文所述之與巨噬細胞活性或TAM活性有關之疾病治療、預後或診斷的反應。本文所提供之抗體當單獨或組合使用時的治療有效量將視抗體及組合的相對活性(例如在抑制腫瘤細胞生長方面)而變且視以下因素而變：所治療的個體及疾病病狀、個體的體重及年齡、疾病病狀的嚴重程度、投藥方式及其類似因素，在一些情況下，此等因素容易由一般技術者確定。
術語「治療有效量」通常係指抗體或藥物有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症的量。在一些實施例中，本文所述的組合物以有效產生一些所需治療效果的量投與個體，其藉由以適用於任何醫學療法的合理收益/風險比抑制如本文所述的疾病或病症。治療有效量為針對器官或組織至少部分地達成所需治療或預防效果的量。對疾病或病症產生預防及/或治療性治療所需的抗體量本身並非固定的。在一些實施例中，抗體投與量因疾病類型、疾病程度及罹患疾病或病症之哺乳動物的體型而異。術語「治療有效」當結合涉及在個體展現疾病或病症之症狀之後投與治療劑的治療方法使用時，意謂在治療之後，疾病或病症之一或多種病徵或症狀得到改善或排除。
片語「醫藥學上可接受」係指分子實體及組合物當投與人類時，在生理上可耐受且典型地不產生過敏或類似不當反應，諸如胃不適、眩暈及其類似反應。
術語「接觸」在本文中定義為使如本文所提供的組合物在實體上接近如本文所述之細胞、器官、組織或體液的方式。免疫調節抗體
本文在某些實施例中揭示特異性結合至人類CD163+ 細胞上所表現之CD163蛋白的抗體。在一些實施例中，CD163+ 細胞為免疫抑制性骨髓細胞。在一些實施例中，免疫抑制性骨髓細胞為人類巨噬細胞。在一些實施例中，本文所揭示之抗體的結合改變人類巨噬細胞上之至少一種標記物的表現。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至人類M2或M2樣免疫抑制性巨噬細胞上所表現之人類CD163 (huCD163)蛋白。在一些實施例中，抗體特異性結合至CD163蛋白，該蛋白質為huCD163之約140 kDa糖型。在一些實施例中，抗體特異性結合至huCD163之胞外域3。在一些實施例中，抗體特異性結合至huCD163之胞外域4。在一些實施例中，抗體特異性結合至huCD163之胞外域3及胞外域4。在一些實施例中，抗體特異性結合至huCD163，引起huCD163之構形變化。在一些實施例中，humCD163之構形變化使humCD163之胞外域2、5及9暴露。在一些實施例中，抗體不特異性結合huCD163之低分子量(約115 kDa)糖型。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至人類CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞且引起表徵M2或M2樣免疫抑制性巨噬細胞(諸如M2c巨噬細胞)之某些細胞標記物的表現發生變化，表明巨噬細胞的功能分化成無免疫抑制性或更少免疫抑制性以及更多抗腫瘤狀態。在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至M2或M2樣免疫抑制性巨噬細胞且引起表徵M2或M2樣巨噬細胞之某些細胞標記物的表現減少，表明巨噬細胞的功能分化成改變的分化狀態。在一些實施例中，本文所揭示之抗體減少CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞對CD16、CD64、TLR2及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15中之一或多者的表現。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體對CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞的結合引起CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞發生功能變化。在一些實施例中，本文所揭示之抗體對CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞的結合引起M2或M2樣免疫抑制性巨噬細胞的標記物表現發生變化。在一些實施例中，抗體所結合之CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞的功能變化使得與其他細胞(諸如效應T細胞)的相互作用被修改，此隨後修改其對標靶腫瘤細胞的效應及相互作用。
在一些實施例中，本發明之抗體減少腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤微環境中所引起的免疫抑制。在一些實施例中，腫瘤相關巨噬細胞在腫瘤微環境中所引起之免疫抑制的減少對應於免疫刺激的增強，例如促進T細胞活化、T細胞增殖、NK細胞活化、NK細胞增殖或其任何組合的產生。在一些實施例中，T細胞活化及/或NK細胞活化引起T細胞及/或NK細胞增加IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其組合的產生。在一些實施例中，本發明之抗體增強免疫刺激，例如促進T細胞活化、T細胞增殖、NK細胞活化、NK細胞增殖或其任何組合的產生。在一些實施例中，T細胞活化及/或NK細胞活化引起T細胞及/或NK細胞增加IFN-γ、TNF-α、穿孔素或其組合的產生。在一些實施例中，本發明之抗體特異性結合至人類巨噬細胞上所表現的CD163蛋白，其中人類巨噬細胞在結合抗體之前具有第一免疫抑制活性且在結合抗體之後具有第二免疫抑制活性，且其中第二免疫抑制活性低於第一免疫抑制活性。在多個實施例中，第一與第二免疫抑制活性各自不為零。
在一些實施例中，本發明之抗體促進T細胞活化及增殖。在一些實施例中，抗體使T細胞群偏向抗腫瘤T細胞表型。在一些實施例中，抗體減少或阻斷骨髓細胞抑制T細胞活化。在一些實施例中，抗體減少TAM抑制T細胞活化的能力，引起更大的T細胞刺激及IL-2產生。在一些實施例中，抗體阻斷TAM抑制T細胞活化的能力，引起更大的T細胞刺激及IL-2產生。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體減少T細胞增殖之骨髓性抑制。在一些實施例中，抗體減少TAM抑制CD4+ 與CD8+ T細胞活化及增殖。在一些實施例中，抗體減少TAM抑制Th1細胞增殖。增殖的T細胞顯示活化標記物在CD4+ T細胞上的表現增強。
在一些實施例中，本發明之抗體改變M2極化巨噬細胞，使得巨噬細胞展現使M2巨噬細胞之免疫抑制效應減輕的M1樣表型。在一些實施例中，本文所述的抗體影響單核球源巨噬細胞分化成較少免疫抑制性及較大抗腫瘤分化狀態。
在一些實施例中，本文提供的抗體特異性結合至人類巨噬細胞上所表現的人類CD163蛋白(huCD163)且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15中之至少一者的表現。在一些實施例中，人類巨噬細胞為腫瘤相關免疫抑制性巨噬細胞。在一些實施例中，人類巨噬細胞為M2樣免疫抑制性巨噬細胞。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至巨噬細胞所表現之作為複合物組分的CD163蛋白，該複合物包含巨噬細胞所表現的至少一種其他蛋白質。在一些實施例中，該複合物為細胞表面複合物。在一些實施例中，該複合物包含至少一種選自以下的其他蛋白質：半乳糖凝集素-1蛋白、LILRB2蛋白及酪蛋白激酶II蛋白。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體結合至巨噬細胞上的CD163蛋白且被巨噬細胞內化。
在一些具體例中，本文所揭示之抗體對其所結合之巨噬細胞不具有細胞毒性。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體促進CD4+ T細胞活性或增殖。在一些實施例中，抗體促進CD4+ T細胞對CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3或CTLA4的表現。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體促進CD8+ T細胞活性或增殖。在一些實施例中，抗體促進CD8+ T細胞對ICOS、OX40、PD1、LAG3或CTLA4的表現。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體藉由促進CD8+ T細胞活性或增殖來促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。在一些實施例中，抗體促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。在一些實施例中，抗體促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體促進T細胞對IL-2的表現。在一些實施例中，本發明之抗體結合至CD163蛋白使CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞或其任何組合增加。在一些實施例中，抗體使CD4+ CD196- CXCR3+ CCR4- T細胞增加。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體具有結合至巨噬細胞上所表現之Fc受體的恆定域。在一些實施例中，抗體特異性結合huCD163且具有結合至Fc受體的恆定域。在一些實施例中，抗體具有的恆定域結合至CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞上所表現的Fc受體，諸如CD16 (FcγRIIIa)或CD64 (FcγRI)。在一些實施例中，huCD163及Fc受體表現於相同細胞上。在一些實施例中，huCD163及Fc受體表現於不同細胞上。在一些實施例中，抗體可變域特異性結合huCD163且抗體恆定域同時結合至Fc受體。
本文在某些實施例中揭示特異性結合至人類M2及M2樣巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該結合引起以下效應中之至少一者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示特異性結合至人類M2及M2樣巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該結合引起以下效應中之至少兩者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示特異性結合至人類M2及M2樣巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該結合引起以下效應中之至少三者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示特異性結合至人類M2及M2樣巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該結合引起以下效應中之至少四者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示特異性結合至人類M2及M2樣巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該結合引起以下效應中之至少五者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體選擇性地結合至腫瘤相關巨噬細胞(TAM)群中的人類CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞，其中該抗體特異性結合至M2巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少TAM群的免疫抑制性活性。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體選擇性地結合至腫瘤微環境中的人類CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞，其中該抗體特異性結合至M2巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少M2巨噬細胞介導的抑制。在一些實施例中，本文所揭示之抗體人類、人類化或嵌合抗體。在一些實施例中，本文所揭示之抗體為如所述結合的其抗原結合片段。
在一些實施例中，本發明之抗體為完整的免疫球蛋白分子，諸如人類抗體，以及含有抗原結合位點(亦即，互補位)或單一重鏈及單一輕鏈之人類化Ig分子的彼等部分，包括在此項技術中稱為以下的彼等部分：Fab、Fab'、F(ab)、F(ab')2、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、NAR可變域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2、三特異性Fab3、單鏈結合多肽、dAb片段、雙功能抗體，及其他，亦稱為抗原結合片段。當構築免疫球蛋白分子或其片段時，在一些實施例中，使可變區或其一部分與一或多個恆定區或其一部分融合、連接或以其他方式接合，以產生本文所述的任一種抗體或其片段。因此，在一些實施例中，上述任一種抗體的抗原結合片段為Fab、Fab'、Fd、F(ab')2、Fv、scFv、單鏈結合多肽(例如具有Fc部分的scFv)，或如本文所述的其任何其他功能片段。
在一些實施例中，本發明之抗體屬於任何免疫球蛋白類別，且因此，在一些實施例中，具有γ、μ、α、δ或ε重鏈。在一些實施例中，γ鏈為γ1、γ2、γ3或γ4。在一些實施例中，α鏈為α1或α2。
在一些實施例中，本發明之抗體為IgG免疫球蛋白。在一些實施例中，本發明之抗體屬於任何IgG子類。在一些實施例中，抗體為IgG1。
在一些實施例中，本發明之抗體包含κ或λ可變輕鏈。在一些實施例中，λ鏈屬於任一亞型，包括例如λ1、λ2、λ3及λ4。在一些實施例中，輕鏈為κ。
在一些實施例中，本文所揭示之抗體包含人類可變構架區及人類恆定區。在一些實施例中，抗體包含人類輕鏈可變構架區及人類輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含人類重鏈可變構架區及人類重鏈恆定區。在一些實施例中，抗體包含人類輕鏈可變構架區、人類輕鏈恆定區、人類重鏈可變構架區及人類重鏈恆定區。
在一些實施例中，人類重鏈恆定區為IgG1或IgG4或其片段。在一些實施例中，重鏈恆定區為人類IgG1。具有IgG1之抗體的一個實例為AB101。AB101包含含有SEQ ID NO：9的輕鏈及含有SEQ ID NO：10的重鏈，如下述實例1中所述。
在一些實施例中，重鏈恆定區為ADCC功能已減少的人類IgG1 (亦即，Fc剔除式抗體)。本發明之例示性Fc剔除式抗體為AB102。AB102包含含有SEQ ID NO：9的輕鏈及含有SEQ ID NO：11的重鏈，其含有AB101之可變區且其中重鏈恆定區為人類IgG1之Fc剔除形式。AB102進一步描述於以下實例中。
在一些實施例中，重鏈恆定區為經修飾以增強ADCC功能的人類IgG1。ADCC功能增強的本發明之例示性抗體為AB103。AB103包含含有SEQ ID NO：9的輕鏈及含有SEQ ID NO：12的重鏈，其含有AB101之可變區且其中重鏈恆定區為人類IgG1之ADCC增強形式。
在一些實施例中，重鏈恆定區為人類IgG4。具有IgG4的本發明之例示性抗體為AB104。AB104包含含有SEQ ID NO：9的輕鏈及含有SEQ ID NO：13的重鏈，其含有AB101之可變區且其中重鏈恆定區為人類IgG4。
在一些實施例中，本發明之抗體包含人類可變構架區及鼠類恆定區。在一些實施例中，本發明之抗體包含人類重鏈可變構架區及鼠類重鏈恆定區。在一些實施例中，本發明之抗體包含人類輕鏈可變構架區、鼠類輕鏈恆定區、人類重鏈可變構架區及鼠類重鏈恆定區。
在一些實施例中，重鏈恆定區為鼠類IgG2A。具有鼠類IgG2A之抗體的一個實例為AB211。AB211包含含有SEQ ID NO：14之輕鏈及含有SEQ ID NO：15之重鏈，其含有AB101之人類可變區且其中重鏈恆定區為鼠類IgG1之Fc剔除形式且輕鏈恆定區為鼠類κ。AB211進一步描述於以下實例中。
在一些實施例中，重鏈恆定區為鼠類IgG2A。具有鼠類IgG2A之重鏈之抗體的一個實例為AB212。AB212包含含有SEQ ID NO：14之輕鏈及含有SEQ ID NO：16之重鏈，其含有AB101之人類可變區且其中重鏈恆定區為鼠類IgG2a且輕鏈恆定區為鼠類κ。AB212進一步描述於以下實例中。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段結合至M2巨噬細胞上所表現的CD163蛋白部分地(例如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或其中的任何數字)或完全地調節此類M2巨噬細胞的生物功能。抗體或抗原結合片段的活性例如利用活體外分析測定且/或利用此項技術中公認的分析(諸如本文所述或此項技術中以其他方式已知的彼等分析)在活體內測定。
在一些實施例中，本發明之抗體經進一步修飾以改變抗體之具體特性，同時保持所需功能(若需要)。舉例而言，在一個實施例中，本發明抗體經修飾以改變抗體之藥物動力學特性，包括(但不限於)活體內穩定性、溶解性、生物可用性或半衰期。
在一些實施例中，本文所述的抗體具有約1至約10 pM、約10至約20 pM、約1至約29 pM、約30至約40 pM、約10至約100 pM或約20至約500 pM的解離常數(Kd)。
在一些實施例中，本文所述之抗體的解離常數(Kd)小於約500 pM、小於約400 pM、小於約300 pM、小於約200 pM、小於約100 pM、小於約75 pM、小於約50 pM、小於約30 pM、小於約25 pM、小於約20 pM、小於約18 pM、小於約15 pM、小於約10 pM、小於約7.5 pM、小於約5 pM、小於約2.5 pM或小於約1 pM。
在一些實施例中，本文所述的抗體對huCD163蛋白或肽的親和力為約10- 9 至約10- 14 、約10- 10 至約10- 14 、約10- 11 至約10- 14 、約10- 12 至約10- 14 、約10- 13 至約10- 14 、約10- 10 至約10- 11 、約10- 11 至約10- 12 、約10- 12 至約10- 13 ，或10- 13 至約10- 14 。
在一些實施例中，本文所述之抗體具有超過一個結合位點。在一些實施例中，結合位點彼此相同。在一些實施例中，結合位點彼此不同。天然存在之人類免疫球蛋白典型地具有兩個相同結合位點，而經工程改造之抗體例如具有兩個或更多個不同結合位點。
在一些實施例中，本發明之抗體為雙特異性或多特異性的。雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之抗體。在一些實施例中，例示性雙特異性抗體結合至單一抗原之兩個不同抗原決定基。在一些實施例中，其他此類抗體將第一抗原結合位點與第二抗原結合位點組合。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至少兩個不同抗原決定基且具有結合至Fc受體之恆定域。在一些實施例中，雙特異性抗體之一或多個抗原決定基的結合與雙特異性抗體之恆定域對Fc受體的結合同時進行。
在一些實施例中，本發明之抗體具有兩價或更多價數，亦稱為多價。在一些實施例中，本發明之抗體為三特異性的。在一些實施例中，多價抗體被表現抗體所結合之抗原的細胞內化(及/或分解代謝)比二價抗體快。在一些實施例中，本發明之抗體為具有三個或更多個抗原結合位點之多價抗體(例如四價抗體)。在一些實施例中，本發明之多價抗體係藉由重組表現編碼抗體之多肽鏈的核酸來產生。在一些實施例中，多價抗體包含二聚域及三個或更多個抗原結合位點。在一些實施例中，二聚域包含Fc區或鉸鏈區(或由其組成)。在此情境下，抗體將包含Fc區及位於Fc區胺基端的三個或更多個抗原結合位點。在一些實施例中，本文中之多價抗體包含約三至約八個，但較佳四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一個多肽鏈(且較佳兩個多肽鏈)，其中多肽鏈包含兩個或更多個可變區。舉例而言，多肽鏈包含VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc，其中VD1為第一可變區，VD2為第二可變區，Fc為Fc區的一條多肽鏈，X1及X2表示胺基酸或多肽，且n為0或1。在一些實施例中，多肽鏈各自獨立地包含：VH -CH 1-柔性連接子-VH -CH 1-Fc區鏈；或VH -CH 1-VH -CH 1-Fc區鏈。在一些實施例中，本文中之多價抗體進一步包含至少兩種(且較佳四種)輕鏈可變區多肽。在一些實施例中，本文中之多價抗體包含約兩種至約八種輕鏈可變區多肽。在一些實施例中，本文所述之輕鏈可變區多肽包含輕鏈可變區。在一些實施例中，本文所述之輕鏈可變區多肽進一步包含CL 域。
在一些實施例中，本發明抗體經構築而摺疊成多價形式，在一些實施例中，其改良結合親和力、特異性且/或增加血液半衰期。抗體之多價形式例如藉由此項技術中已知之技術製備。
在一些實施例中，本發明之抗體為特異性針對靶蛋白的SMIP或結合域免疫球蛋白融合蛋白。此等構築體為單鏈多肽，其包含抗原結合域與為了執行抗體效應功能所必需之免疫球蛋白域的融合。
在一些實施例中，本發明之抗體包含具有重鏈可變區及/或輕鏈可變區的單鏈結合多肽，該輕鏈可變區結合本文所揭示之抗原決定基且視情況具有免疫球蛋白Fc區。此類分子為單鏈可變片段(scFv)，其視情況具有經由免疫球蛋白Fc區之存在而達成的效應功能或增加的半衰期。抗 CD163 抗體
本文在某些實施例中提供特異性結合至CD163蛋白的抗體。在一些實施例中，CD163結合抗體包含至少一條重鏈及至少一條輕鏈。在一些實施例中，CD163結合抗體包含含有重鏈可變域(VH)的至少一條重鏈及含有輕鏈可變域(VL)的至少一條輕鏈。各VH及VL包含三個互補決定區(CDR)。VH及VL及CDR之胺基酸序列決定抗體之抗原結合特異性及抗原結合強度。VH及VL域概述於表 1 中。輕鏈及重鏈概述於表 2 中。CDR之胺基酸序列概述於表 3 中。
在一些實施例中，本文揭示之抗體為單株抗體。在一些實施例中，本文所揭示之抗體為抗原結合片段。在一些實施例中，本文所揭示之抗體係選自完整免疫球蛋白、scFv、Fab、F(ab')2，或二硫鍵連接之Fv。在一些實施例中，本文揭示之抗體為IgG或IgM。在一些實施例中，本文揭示之抗體為人類化抗體。在一些實施例中，本文所揭示之抗體為嵌合抗體。抗 CD163 抗體可變域 表 1 . 抗CD163可變域序列.
表 1 ：抗 CD163 可變域序列
序列 SEQ ID NO:
輕鏈可變域 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRGTFGQGTKVEIKR 7
重鏈可變域 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF 8
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約70%一致之輕鏈可變域(VL)的抗體。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈可變域(VH)的抗體。在一些實施例中，該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈可變域(VL)及胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列100%一致且該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列100%一致。抗 CD163 抗體輕鏈及重鏈 表 2 . 抗CD163輕鏈及重鏈序列
表 2 ：抗 CD163 輕鏈及重鏈序列
序列 SEQ ID NO:
 AB101、AB102、AB103或AB104輕鏈(hIgG1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 9
AB101重鏈(hIgG1) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 10
AB102重鏈(hIgG1 ADCC剔除式) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 11
AB103重鏈(hIgG1 eADCC) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 12
AB104重鏈(hIgG4) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 13
AB211或AB212輕鏈(μκ) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRGTFGQGTKVEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 14
AB211重鏈(muIgG2A) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 15
 AB212重鏈(muIgG2A ADCC剔除式) EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDVWGQGTTVTVSSKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK 16
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致之輕鏈的抗體。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈的抗體。在一些實施例中，重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈的抗體。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈的抗體。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈的抗體。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約70%一致之輕鏈的抗體。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈的抗體。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示包含胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約70%一致之重鏈的抗體。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列100%一致。
本文在某些實施例中揭示抗體，該等抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列100%一致。例示性抗 CD163 互補決定區 表 3 . 抗CD163 CDR序列
表3 ： 抗CD163 CDR 序列
序列 SEQ ID NO:
輕鏈CDR1 RASQSISSYLN 1
輕鏈CDR2 AASSLQS 2
輕鏈CDR3 QQSYSTPRGT 3
重鏈CDR1 SYAMH 4
重鏈CDR2 VISYDGSNKYYADSVKG 5
重鏈CDR3 ENVRPYYDFWSGYYSEYYYYGMDV 6
本文在某些實施例中揭示包含以下中之至少一者的抗體：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR3。在一些實施例中，結合至CD163的抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR2；及胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR3。在一些實施例中，結合至CD163的抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR3。
本文在某些實施例中揭示包含以下中之至少一者的抗體：胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，結合至CD163的抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR2；胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，結合至CD163的抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR3。
本文在某些實施例中揭示包含以下中之至少一者的抗體：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR3、胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，結合至CD163的抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR2；胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR3；胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR2；及胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，結合至CD163的抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR3、胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR3。結合親和力及免疫反應性
抗體或其抗原結合片段之結合親和力及/或親合力係藉由修飾構架區來改良。用於修飾構架區之任何適合方法為此項技術中已知的且涵蓋於本文中。選擇可改變的一或多個相關構架胺基酸位置視多種準則而定。選擇可變化之相關構架胺基酸的一個準則為例如胺基酸構架殘基在供體與受體分子之間的相對差異。利用此方案選擇可改變的相關構架位置具有在殘基測定時避免任何主觀偏差的優點或在殘基對CDR結合親和力之貢獻方面避免任何偏差的優點。
在一些實施例中，結合相互作用係作為與一或多個CDR之一或多個胺基酸殘基的分子間接觸體現。抗原結合涉及例如CDR或CDR對，或在一些情況下，涉及VH 與VL 鏈之直至所有六個CDR的相互作用。
抗體或抗原結合片段之結合親和力及親合力可以藉由表面電漿子共振(SPR)量測、AlphaLisa分析或流式細胞術分析平衡解離常數(KD )量測。
本文揭示以0.1 nM至1000 nM之KD 特異性結合至人類CD163的抗體。在一些實施例中，抗體特異性結合至人類CD163的KD 為約0.1至約500 nM、約0.1至約100 nM、約0.1至約50 nM、約0.1至約20 nM、約0.1至約10 nM、約0.1至約5 nM、約0.1至約2 nM、約0.1至約1 nM、約0.1至約0.5 nM、約0.5至約1000 nM、約0.5至約500 nM、約0.5至約100 nM、約0.5至約50 nM、約0.5至約20 nM、約0.5至約10 nM、約0.5至約5 nM、約0.5至約2 nM、約0.5至約1 nM、約1至約1000 nM、約1至約500 nM、約1至約100 nM、約1至約50 nM、約1至約20 nM、約1至約10 nM、約1至約5 nM、約1至約2 nM、約2至約1000 nM、約2至約500 nM、約2至約100 nM、約2至約50 nM、約2至約20 nM、約2至約10 nM、約2至約5 nM、約5至約1000 nM、約5至約500 nM、約5至約100 nM、約5至約50 nM、約5至約20 nM、約5至約10 nM、約10至約1000 nM、約10至約500 nM、約10至約100 nM、約10至約50 nM、約10至約20 nM、約20至約1000 nM、約20至約500 nM、約20至約100 nM、約20至約50 nM、約50至約1000 nM、約50至約500 nM、約50至約100 nM、約100至約500 nM、約100至約1000 nM、約500至約1000 nM。在一些實施例中，抗體以1.8 nM、12 nM、45 nM或89 nM的KD 特異性結合至人類CD163。
本文揭示的抗體結合至骨髓清道夫受體CD163，其高度表現於腫瘤相關巨噬細胞(TAM)上且已在不同來源的不同腫瘤細胞上偵測到。腫瘤組織中的CD163表現與不良預後相關。本文所揭示之抗體與IL-10極化的M2c巨噬細胞之間的結合親和力係藉由流式細胞術分析加以量測。
本文揭示以0.1 nM至1000 nM之KD 特異性結合至M2c巨噬細胞的抗體。在一些實施例中，抗體特異性結合至M2c巨噬細胞的KD 為約0.1至約500 nM、約0.1至約100 nM、約0.1至約50 nM、約0.1至約20 nM、約0.1至約10 nM、約0.1至約5 nM、約0.1至約2 nM、約0.1至約1 nM、約0.1至約0.5 nM、約0.5至約1000 nM、約0.5至約500 nM、約0.5至約100 nM、約0.5至約50 nM、約0.5至約20 nM、約0.5至約10 nM、約0.5至約5 nM、約0.5至約2 nM、約0.5至約1 nM、約1至約1000 nM、約1至約500 nM、約1至約100 nM、約1至約50 nM、約1至約20 nM、約1至約10 nM、約1至約5 nM、約1至約2 nM、約2至約1000 nM、約2至約500 nM、約2至約100 nM、約2至約50 nM、約2至約20 nM、約2至約10 nM、約2至約5 nM、約5至約1000 nM、約5至約500 nM、約5至約100 nM、約5至約50 nM、約5至約20 nM、約5至約10 nM、約10至約1000 nM、約10至約500 nM、約10至約100 nM、約10至約50 nM、約10至約20 nM、約20至約1000 nM、約20至約500 nM、約20至約100 nM、約20至約50 nM、約50至約1000 nM、約50至約500 nM、約50至約100 nM、約100至約500 nM、約100至約1000 nM、約500至約1000 nM。在一些實施例中，抗體以7.7 nM之KD 特異性結合至M2c巨噬細胞。結合性抗原決定基
抗體抗原決定基可為線性肽序列(亦即，「連續」)或可由非連續胺基酸序列構成(亦即，「構形」或「不連續」)。在一些實施例中，抗體識別一或多個胺基酸序列；因此，抗原決定基界定超過一個不同胺基酸序列。抗體所識別的抗原決定基係藉由例如熟習此項技術者熟知的肽定位及序列分析技術測定。結合性相互作用體現為與CDR之一或多個胺基酸殘基的分子間接觸。
人類CD163蛋白為人體中由CD163基因編碼之蛋白質。人類CD163之胺基酸序列為：MSKLRMVLLEDSGSADFRRHFVNLSPFTITVVLLLSACFVTSSLGGTDKELRLVDGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWSMEAVSVICNQLGCPTAIKAPGWANSSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHSNCTHQQDAGVTCSDGSNLEMRLTRGGNMCSGRIEIKFQGRWGTVCDDNFNIDHASVICRQLECGSAVSFSGSSNFGEGSGPIWFDDLICNGNESALWNCKHQGWGKHNCDHAEDAGVICSKGADLSLRLVDGVTECSGRLEVRFQGEWGTICDDGWDSYDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAIWQCKHHEWGKHYCNHNEDAGVTCSDGSDLELRLRGGGSRCAGTVEVEIQRLLGKVCDRGWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKIQATNTWLFLSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLTCDHYEEAKITCSAHREPRLVGGDIPCSGRVEVKHGDTWGSICDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSILGGAHFGEGNGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPEGTCSHSRDVGVVCSRYTEIRLVNGKTPCEGRVELKTLGAWGSLCNSHWDIEDAHVLCQQLKCGVALSTPGGARFGKGNGQIWRHMFHCTGTEQHMGDCPVTALGASLCPSEQVASVICSGNQSQTLSSCNSSSLGPTRPTIPEESAVACIESGQLRLVNGGGRCAGRVEIYHEGSWGTICDDSWDLSDAHVVCRQLGCGEAINATGSAHFGEGTGPIWLDEMKCNGKESRIWQCHSHGWGQQNCRHKEDAGVICSEFMSLRLTSEASREACAGRLEVFYNGAWGTVGKSSMSETTVGVVCRQLGCADKGKINPASLDKAMSIPMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWEKRLASPSEETWITCDNKIRLQEGPTSCSGRVEIWHGGSWGTVCDDSWDLDDAQVVCQQLGCGPALKAFKEAEFGQGTGPIWLNEVKCKGNESSLWDCPARRWGHSECGHKEDAAVNCTDISVQKTPQKATTGRSSRQSSFIAVGILGVVLLAIFVALFFLTKKRRQRQRLAVSSRGENLVHQIQYREMNSCLNADDLDLMNSSGGHSEPH (SEQ ID NO：17)。
本文揭示特異性結合至人類CD163中之抗原決定基的抗體。在一些實施例中，本文所揭示的抗體結合至包含非連續胺基酸序列的抗原決定基。在一些實施例中，抗體結合至包含胺基酸序列IGRVNASKGFGHIWLDSVSCQGHEPAI (SEQ ID NO：18)之人類CD163抗原決定基。在一些實施例中，抗體結合至包含胺基酸序列VVCRQLGCGSA (SEQ ID NO：19)之人類CD163抗原決定基。在一些實施例中，抗體結合至包含胺基酸序列WDCKNWQWGGLTCD (SEQ ID NO：20)之人類CD163抗原決定基。在一些實施例中，抗體結合至包含SEQ ID NO：18-20胺基酸序列之人類CD163抗原決定基。
本文亦揭示特異性結合至本文所揭示之抗原決定基的其他抗體。特異性結合至本文所揭示之抗原決定基的此等其他抗體或其抗原結合片段可以利用此項技術中已知的技術鑑別。舉例而言，利用計算方法設計抗原決定基特異性抗體。Nimrod等人, Computational Design of Epitope-Specific Functional Antibodies, Cell Reports 25, 2121-2131, 2018年11月20日(以引用之方式併入本文中)。另一種方法可以用於自結合至抗原之抗體庫中鑑別出結合至特異性抗原決定基的抗體，諸如以下：首先將非典型胺基酸(ncAA) 對苯甲醯基-L-苯丙胺酸(pBpa)及對疊氮基-L-苯丙胺酸(pAzF)併入標靶抗原決定基且接著選擇在UV照射之後與併有ncAA之抗原決定基交聯的抗體。由於交聯僅在抗體與抗原決定基之間的距離足夠接近時才發生，因此此方法可以有效地選擇特異性結合至標靶抗原決定基的抗體。Chen等人, Epitope-directed antibody selection by site-specific photocrosslinking, Science Advances, 第6卷, 第14期, eaaz7825, 2020年4月1日(以引用的方式併入)。抗體修飾
在一些情況下，利用此項技術中已知之用於各種目的的技術(諸如藉由添加聚乙二醇(PEG))修飾抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，PEG修飾(聚乙二醇化)產生以下中之一或多者：循環時間改良、溶解性改良、對蛋白質水解的抗性改良、抗原性及免疫原性減少、生物可用性改良、毒性降低、穩定性改良，及更易調配。
在一些情況下，當抗原結合片段不含有Fc部分時，將Fc部分添加至(例如重組)片段中，例如當投與個體時增加抗原結合片段在血液循環中的半衰期。選擇併入此類片段的適當Fc區及方法在此項技術中已知。將IgG之Fc區併入所關注多肽中以便增加其循環半衰期而非失去其生物活性係例如使用此項技術中已知之習知技術來實現。在一些實施例中，進一步修飾抗體之Fc部分，以便增加抗原結合片段當投與個體時在血液循環中之半衰期。舉例而言，修飾係使用此項技術中之習知方式測定。
另外，在一些實施例中，產生或表現抗體及其抗原結合片段，使得其在其複合物N-糖苷連接型糖鏈上不含岩藻糖。自複合物N-糖苷連接型糖鏈中移除岩藻糖已知可增強抗體及抗原結合片段的效應功能，包括(但不限於)抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。類似地，結合抗原決定基之抗體或其抗原結合片段在一些情況下係在其C端連接至來源於任何抗體同型(例如IgG、IgA、IgE、IgD及IgM，及同型子類中之任一者，特定言之，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)之免疫球蛋白重鏈的全部或一部分。
另外，在一些實施例中，本文所述的抗體或抗原結合片段亦經修飾，使得其能夠穿越血腦障壁。本文所述抗體或抗原結合片段的此類修飾允許治療腦疾病，諸如多形性膠質母細胞瘤(GBM)。允許蛋白質(諸如抗體或抗原結合片段)穿越血腦障壁的例示性修飾描述於美國專利公開案2007/0082380中。
免疫球蛋白之糖基化已顯示對其效應功能、結構穩定性及產抗體細胞分泌速率具有顯著影響。負責此等特性的碳水化合物基團通常連接至抗體之恆定(C)區。舉例而言，IgG在CH 2域中之天冬醯胺297處發生糖基化係IgG活化補體依賴性細胞溶解經典路徑之全部能力所必需的(Tao及Morrison,J Immunol 143:2595 (1989))。IgM在CH 3域中之天冬醯胺402處發生糖基化係抗體之正確組裝及溶胞活性所必需的(Muraoka及Shulman,J Immunol 142:695 (1989))。移除IgA抗體CH 1及CH 3域中之位置162及419的糖基化位點引起細胞內降解及對分泌的至少90%抑制(Taylor及Wall,Mol Cell Biol 8:4197 (1988))。另外，在一些實施例中，產生或表現抗體及其抗原結合片段，使得其在其複合物N-糖苷連接型糖鏈上不含岩藻糖。自複合物N-糖苷連接型糖鏈中移除岩藻糖已知可增強抗體及抗原結合片段的效應功能，包括(但不限於)抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施例中，此等「去岩藻糖基化」抗體及抗原結合片段係經由多種系統、利用此項技術中已知的分子選殖技術產生，包括(但不限於)已經基因工程改造的轉基因動物、轉基因植物或細胞株，使得其不再含有將岩藻糖納入複合物N-糖苷連接型糖鏈所必需的酶及生物化學路徑(亦稱為岩藻糖基轉移酶基因剔除型動物、植物或細胞)。經工程改造為岩藻糖基轉移酶基因剔除型細胞之細胞之非限制性實例包括CHO細胞、SP2/0細胞、NS0細胞及YB2/0細胞。
亦觀測到免疫球蛋白在可變(V)區中的糖基化。Sox及Hood報導約20%人類抗體的V區發生糖基化(Proc Natl Acad Sci USA 66:975 (1970))。咸信V域糖基化起因於V區序列偶然存在N連接型糖基化信號Asn-Xaa-Ser/Thr且此項技術中尚未認知在免疫球蛋白功能中起作用。
在一些情況下，可變域構架殘基糖基化使抗體與抗原的結合相互作用發生變化。本發明包括在人類化免疫球蛋白鏈之構架或CDR中選擇有限數目個胺基酸進行突變(例如藉由取代、缺失或添加殘基)以增強抗體親和力所依據的準則。
在一些實施例中，移除半胱胺酸殘基或將其引入抗體之Fc區或含有Fc之多肽中，從而排除或增加此區域中的鏈間二硫鍵形成。在一些實施例中，利用此類方法產生的特異性結合均二聚藥劑或抗體展現改良的內化能力及/或增強的補體介導細胞殺死及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
已顯示CDR內的序列促使抗體結合至II類MHC且在一些情況下觸發非所需的輔助T細胞反應。在一些實施例中，保守性取代允許抗體保持結合活性，然而減少其觸發非所需T細胞反應的能力。在一個實施例中，移除重鏈或輕鏈N端20個胺基酸中之一或多者。
在一些實施例中，產生碳水化合物結構改變、從而使效應子活性改變的抗體分子，包括岩藻糖基化缺乏或減少、展現改良之ADCC活性的抗體分子。此項技術中已知完成此的多種方式。舉例而言，ADCC效應子活性係藉由抗體分子結合至FcγRIII受體介導，其已顯示依賴於在CH 2域之Asn-297處發生N連接型糖基化的碳水化合物結構。相較於岩藻糖基化原生抗體，非岩藻糖基化抗體以增強的親和力結合此受體且更有效地觸發FcγRIII介導的效應功能。一些宿主細胞株，例如Lec13或大鼠融合瘤YB2/0細胞株，天然地產生岩藻糖基化含量較低的抗體。等分碳水化合物含量的增加(例如經由在過度表現GnTIII酶的細胞中重組產生抗體來達成)亦已測定可增強ADCC活性。在一些實施例中，兩個岩藻糖殘基缺乏僅一個便足以增加ADCC活性。
本文中亦包括抗體之共價修飾。在一些實施例中，若適用，則其藉由化學合成或藉由抗體之酶促或化學裂解製備。在一些實施例中，藉由使標靶胺基酸殘基與有機衍生劑反應來引入其他類型的共價修飾，該有機衍生劑能夠與所選側鏈或N端或C端殘基反應。
半胱胺醯基殘基最常與α-鹵代乙酸酯(及對應的胺)(諸如氯乙酸或氯乙醯胺)反應，得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸鹽、2-氯汞-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑反應進行衍生化。
在一些實施例中，組胺醯基殘基係藉由與pH 5.5-7.0之焦碳酸二乙酯反應而衍生化，原因在於此試劑對組胺醯基側鏈相對具有特異性。在一些實施例中，對溴苯甲醯甲基溴化物亦適用；在一些實施例中，反應係在0.1 M二甲胂酸鈉中、在pH 6.0下進行。
在一些實施例中，使離胺醯基及胺基端殘基與丁二酸或其他羧酸酸酐反應。用此等試劑進行衍生化具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。用於使含α-胺基之殘基衍生化的其他適合試劑包括醯亞胺酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯、吡哆醛磷酸酯、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮，及轉胺酶催化的與乙醛酸鹽之反應。
在一些實施例中，精胺醯基殘基係藉由與一種或數種習知試劑(諸如苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚三酮)反應而修飾。由於胍官能基具有高pKa，因此精胺酸殘基之衍生化需要反應在鹼性條件下進行。此外，在一些實施例中，此等試劑與離胺酸基團以及精胺酸ε-胺基反應。
在一些實施例中，對酪胺醯基殘基進行特定修飾，其中藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應將光譜標記引入酪胺醯基殘基中特別值得關注。在一些實施例中，最常使用N-乙醯咪唑及四硝基甲烷分別形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用125 I或131 I將酪胺醯基殘基碘化，以製備用於放射免疫分析中之經標記之蛋白質。
羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳化二亞胺(R-N=C=N-R')反應而經特定修飾，其中R及R'為不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。
在一些實施例中，使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基脫去醯胺基以分別形成相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。此等殘基係在中性或鹼性條件下脫去醯胺基。
其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基甲基化、N端胺之乙醯化，及任何C端羧基之醯胺化。
另一類型之共價修飾涉及以化學方式或酶促方式使糖苷與特異性結合劑或抗體偶合。此等程序不需要宿主細胞產生就N或O連接型糖基化而言具有糖基化能力的多肽或抗體。視所用偶合模式而定，在一些實施例中，使糖連接至(a)精胺酸及組胺酸；(b)游離羧基；(c)游離硫氫基，諸如半胱胺酸之硫氫基；(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等羥基；(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等殘基；或(f)麩醯胺酸之醯胺基。
在一些實施例中，存在於多肽或抗體上之任何碳水化合物部分之移除係以化學方式或以酶促方式實現。化學去糖基化涉及將抗體暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。除連接糖(N-乙醯基葡糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)之外，此處理引起大部分或所有糖裂解，同時保持抗體完整。在一些實施例中，抗體上之碳水化合物部分的酶促裂解係藉由使用多種內切糖苷酶及外切糖苷酶達成。
另一種類型的共價修飾包含使抗體連接至多種非蛋白質聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、聚氧乙基化山梨糖醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油、聚氧化烯，或多醣聚合物，諸如聚葡萄糖。此類方法在此項技術中已知。
用於結合預定多肽抗原的親和力通常藉由將一或多個突變引入V區構架(典型地位於一或多個CDR鄰近的區域中及/或一或多個構架區中)來調節。典型地，此類突變涉及引入保守胺基酸取代，該等保守胺基酸取代摧毀或建立糖基化位點序列，但基本上不影響多肽的親水結構特性。典型地，避免引入脯胺酸殘基的突變。效應功能
抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。典型地，Fc介導的功能涉及特殊受體分子(功能受影響之細胞所表現的「Fc受體」或「FcR」)結合抗體之Fc部分。
在一些實施例中，IgG被視為最通用的免疫球蛋白，原因在於其執行免疫球蛋白分子之所有功能。IgG為血清中之主要Ig，及穿越胎盤之唯一類別的Ig。IgG亦固定補體，而IgG4子類則不能。巨噬細胞、單核球、多形核白血球(PMN)及一些淋巴球具有針對IgG之Fc區的受體。並非所有子類的結合同樣好：IgG2及IgG4不結合至Fc受體。結合至PMN、單核球及巨噬細胞上之Fc受體的結果是，在一些情況下，細胞現將抗原更好地內化。IgG為增強吞噬的調理素。IgG結合至其他類型細胞上的Fc受體引起其他功能活化。
在某些實施例中，FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之受體(gamma(「γ」)受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，其具有相似的胺基酸序列，不同之處主要在於其細胞質域中。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的抑制基元(ITIM)。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)的所分泌Ig允許此等細胞毒性效應細胞特異性結合至帶有抗原的靶細胞且隨後經由細胞毒素殺滅靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且為此類殺滅所必需的。用於介導ADCC的初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。為了評估所關注分子的ADCC活性，在一些實施例中進行活體外ADCC分析。適用於此類分析的效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。
替代地或另外，在一些實施例中，評估所關注分子在活體內(例如在動物模型中)的ADCC活性。
在一些實施例中，本發明抗體結合至表面膜蛋白質且被M2樣巨噬細胞內化。此內化方法咸信涉及此等細胞之免疫抑制性功能特徵發生所觀測到的變化，亦即，細胞自M2狀態分化成微妙的活化狀態，而非殺滅其或抑制其增殖。在一些實施例中，內化後，抗體減少免疫抑制性可溶因子的表現，同時增強可溶因子的表現，從而刺激或促進T細胞(包括CD4+ 輔助T細胞及細胞毒性淋巴球)活性或增殖。
在某些治療應用中，內化方法的使用目的為殺滅或減少表現CD163蛋白之靶細胞的活性或增殖。內化之抗體分子數目將足以或足夠殺滅細胞或抑制其生長，尤其癌細胞。視抗體或抗體偶聯物之效能而定，在一些情況下，單個抗體分子吸收於細胞中足以殺滅抗體所結合的靶細胞。舉例而言，某些毒素具有高殺滅效能，使得與抗體偶聯的一個毒素分子內化便足以殺滅靶細胞。
在一些實施例中，本文所提供的抗體或抗原結合片段與治療部分、成像或可偵測部分或親和標籤偶聯或連接。偶聯或連接抗體之方法為此項技術中熟知。化合物與標記之間的締合(結合)包括此項技術中已知的任何方式，包括(但不限於)共價及非共價相互作用、化學偶聯以及重組技術。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段與親和標籤(例如純化標籤)偶聯或經重組工程改造而具有親和標籤(例如純化標籤)。親和標籤(諸如聚組胺酸(例如His6)標籤)在此項技術中為習知的。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段進一步包含可偵測部分。偵測係在例如活體外、活體內或離體實現。使用抗體或其抗原結合片段偵測及/或測定(定量、檢核等)巨噬細胞所表現之例如huCD163蛋白的活體外分析包括(但不限於)例如ELISA、RIA及西方墨點。在一些實施例中，活體外偵測、診斷或監測抗體之抗原係藉由獲得來自個體之樣品(例如血液樣品)且在例如標準ELISA分析中測試該樣品來進行。
本文在某些實施例中亦揭示包含如本文所揭示之抗體及載劑的組合物。醫藥組合物
本文在某些實施例中揭示包含如本文所揭示之抗體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
此類組合物適用於活體外或活體內分析，或在醫藥組合物的情況下，適用於活體內或離體投與個體以便用所揭示之抗體治療個體。
在一些實施例中，賦形劑為載劑、緩衝液、穩定劑或熟習此項技術者已知之其他適合材料。此類材料應為無毒的且不應干擾活性成分之功效。載劑或其他物質之確切性質將視投藥途徑而定。
在一些實施例中，藉由本文所述方法鑑別的包含抗體或抗原結合片段之醫藥調配物係藉由將具有所需純度的蛋白質與視情況存在之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(參見例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第16版, Osol, A.編(1980))混合而製備成凍乾調配物或水溶液形式以便儲存。可接受的載劑或穩定劑為在所用劑量及濃度下對接受者無毒的彼等物且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN®、PLURONICS®或聚乙二醇(PEG)。在某些實施例中，醫藥組合物包含濃度在5-200 mg/mL；較佳在10-100 mg/mL之間的抗體。
可接受的載劑在生理學上為所投與之個體可接受的且使隨其/其中投與之化合物保持治療特性。可接受的載劑及其配方大體描述於例如Remington ' s Pharmaceutical Sciences (同上)中。一種例示性載劑為生理鹽水。如本文所用，片語「醫藥學上可接受之載劑」意謂醫藥學上可接受的材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料，其參與將本發明化合物自一個器官或身體部分的投藥位點載運或輸送至另一個器官或身體部分；或參與活體外分析系統。各種載劑在與調配物之其他成分相容且對其所投與的個體無害的意義上為可接受的。可接受之載劑不應改變本發明化合物的特定活性。
在另一實施例中，本文揭示之醫藥組合物進一步包含可接受的添加劑以改良化合物在組合物中之穩定性及/或控制組合物之釋放速率。可接受的添加劑不改變本發明化合物的特定活性。例示性可接受添加劑包括(但不限於)糖類，諸如甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖、木糖醇、海藻糖、山梨糖、蔗糖、半乳糖、聚葡萄糖、右旋糖、果糖、乳糖及其混合物。在一些實施例中，將可接受的添加劑與可接受的載劑及/或賦形劑(諸如右旋糖)合併。可替代地，例示性可接受添加劑包括(但不限於)增加肽穩定性且減少溶液膠凝的界面活性劑，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。在一些實施例中，界面活性劑以0.01%至5%溶液之量添加至組合物中。添加此類可接受之添加劑增加組合物在儲存時之穩定性及半衰期。
在一個實施例中，本文揭示之醫藥組合物含有等張緩衝劑(諸如磷酸鹽、乙酸鹽或TRIS緩衝劑)與張力劑(諸如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化鈉)之組合，從而產生張力及穩定性。在一些實施例中，張力劑存在於組合物中之量為約5%。
在另一個實施例中，本文所揭示之醫藥組合物包括諸如0.01至0.02% wt/vol的界面活性劑，以阻止聚集且達成穩定。
在另一個實施例中，本文所揭示之醫藥組合物之pH在4.5-6.5或4.5-5.5範圍內。
在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物亦含有治療適應症所必需的超過一種活性化合物，諸如具有互補活性、彼此無有害影響的彼等物。舉例而言，治療方法進一步提供免疫抑制劑。此類分子宜以對預期目的有效之量組合存在。
在一些實施例中，將活性成分截留於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊))中、截留於膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或截留於巨乳液中。此類技術揭示於Remington ' s Pharmaceutical Sciences (同上)中。
本文中亦涵蓋抗體之懸浮液及結晶形式；製備懸浮液及結晶形式之方法已為熟習此項技術者所知。
在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物為無菌的。在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物藉由習知、熟知的滅菌技術滅菌。舉例而言，滅菌容易經由無菌過濾膜過濾來實現。在一些實施例中，所得溶液封裝待用或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑與無菌溶液合併後投與。
在一些實施例中，利用冷凍乾燥使多肽穩定以便長期儲存，諸如當多肽在液體組合物中相對不穩定時。
在一些實施例中，一些賦形劑，諸如多元醇(包括甘露糖醇、山梨糖醇及甘油)；糖類(包括葡萄糖及蔗糖)；及胺基酸(包括丙胺酸、甘胺酸及麩胺酸)，充當冷凍乾燥產物的穩定劑。在一些實施例中，多元醇及糖類亦用於保護多肽以免冷凍及乾燥誘發損傷且增強在乾燥狀態下在儲存期間的穩定性。在一些實施例中，糖類在冷凍乾燥製程中與在儲存期間均有效。亦已報導其他類別的分子(包括單醣及雙醣及聚合物，諸如PVP)為凍乾產物的穩定劑。
就注射而言，在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物為適於用如上文所述的適當溶液復原的粉末。此等粉末之實例包括(但不限於)冷凍乾燥、旋轉乾燥或噴霧乾燥的粉末、非晶形粉末、顆粒、沈澱物或微粒。就注射而言，組合物視情況含有穩定劑、pH調節劑、界面活性劑、生物可用性調節劑及此等之組合。
在一些實施例中，製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半滲透基質，該等基質呈成形製品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(參見例如美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與y乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物(諸如Lupron Depot.TM. (由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸酯(leuprolide acetate)構成之可注射微球體))，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物允許分子釋放逾100天，但某些水凝膠釋放蛋白質的時間較短。在一些實施例中，若囊封的抗體長時間留存於體內，則作為在37℃下暴露於水分的結果，其發生變性或聚集，導致生物活性損失及可能的免疫原性變化。在一些情況下，為了穩定化而設計的合理策略依賴於所涉及的機制。舉例而言，若發現聚集機制係經由硫-二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則穩定化在一些情況下係藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水分含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組合物來達成。
在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物設計成短效、速釋、長效或持續釋放，如本文所述。在一個實施例中，本文所揭示之醫藥組合物調配成控制釋放或緩慢釋放。
醫藥組合物係藉由例如注射投與，包括(但不限於)皮下、玻璃體內、皮內、靜脈內、動脈內、腹膜內、腦脊髓內或肌肉內注射。本文中涵蓋用於調配各注射類型之組合物的賦形劑及載劑。以下描述僅為了舉例且不希望限制組合物之範疇。用於注射之組合物包括(但不限於)水溶液(在水溶性情況下)或分散液，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投藥而言，適合載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL.TM. (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些實施例中，載劑為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物。流動性係藉由例如使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。抗細菌劑及抗真菌劑包括例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸及硫柳汞。在一些實施例中，組合物中包括等張劑，例如糖類、多元醇，諸如甘露糖醇、山梨糖醇，及氯化鈉。在一些實施例中，封裝所得溶液以供原樣使用，或凍乾；在一些實施例中，凍乾製劑隨後與無菌溶液合併再投與。對於靜脈內注射或在病痛位點注射而言，活性成分將呈非經腸可接受之水溶液形式，其不含熱原質且具有適合之pH、等張性及穩定性。熟習此項技術者充分能夠使用例如等張媒劑(諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液及乳酸化林格氏注射液)製備適合溶液。在一些實施例中，需要時包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。在一些實施例中，無菌可注射溶液係如下製備：將所需量之活性成分視需要與上文所列舉之成分之一或組合一起併入適當溶劑中，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將活性成分併入含有鹼性分散介質及選自上文所列成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其利用先前無菌過濾溶液產生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
在一些實施例中，組合物習知在靜脈內投與，諸如藉由注射單位劑量。對於注射而言，在一些實施例中，活性成分呈非經腸可接受之水溶液形式，其基本上不含熱原質且具有適合之pH、等張性及穩定性。在一些實施例中，吾人使用例如等張媒劑(諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸化林格氏注射液)製備適合溶液。在一些實施例中，需要時包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。另外，在一些實施例中，經由氣溶膠化投與組合物。(Lahn等人,Int Arch Allergy Immunol 134:49-55 (2004))。
對於非經腸投與而言，抗體聯合醫藥學上可接受之非經腸媒劑調配成可注射單位劑型(溶液、懸浮液、乳液)。此類媒劑之實例為水、鹽水、林格氏溶液、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。亦使用非水性媒劑，諸如不揮發油及油酸乙酯。脂質體用作載劑。媒劑含有少量添加劑，諸如增強等張性及化學穩定性的物質，例如緩衝劑及防腐劑。抗體典型地在此類媒劑中以約1 mg/ml至10 mg/mL的濃度調配。
在一個實施例中，本文所揭示之醫藥組合物經凍乾，例如以增加儲存時的存放期。當考慮組合物用於本文所提供之藥劑或任一方法中時，在一些實施例中，經審慎考慮，組合物基本上不含熱原質，使得組合物當投與人類個體時將不會引起發炎反應或不安全過敏反應。在一些實施例中，測試組合物之熱原質及製備基本上不含熱原質的組合物為一般技術者所熟知且使用市售套組來實現。
在一些實施例中，可接受之載劑含有穩定、增加或延遲吸收或清除之化合物。此類化合物包括例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖；低分子量蛋白質；減少肽清除或水解之組合物；或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。延遲吸收之試劑包括例如單硬脂酸鋁及明膠。在一些實施例中，洗滌劑亦用於穩定或增加或減少醫藥組合物(包括脂質體載劑)之吸收。為防止消化，在一些實施例中，使化合物與組合物複合以使得其對酸及酶水解具有抗性，或在一些實施例中，使化合物在具有適當抗性之載劑(諸如脂質體)中複合。保護蛋白質以免消化之方式在此項技術中已知。
在一些實施例中，組合物係以與劑型相容的方式且以治療有效量投與。投與量視以下而定：待治療之個體、個體免疫系統利用活性成分之能力及所需結合力程度。需要投與之活性成分之精確量取決於從醫者之判斷且為各個體所特有的。適用於初始投藥及加強注射之方案亦為可變的，但典型地為初始投藥，隨後藉由後續注射或其他投藥、在一或多個小時間隔重複給藥。或者，涵蓋足以維持血液中之濃度的連續靜脈內輸注。
在一些實施例中，本發明提供本文所述之組合物用於製備供治療本文所述之病狀、疾病或病症之藥劑的用途。在一些實施例中，藥劑係基於需治療之身體特徵調配，且基於病狀、疾病或病症之階段調配成單一或多種調配物。在一些實施例中，藥劑封裝於附有適當標籤的適合封裝中以便配送於醫院及診所，其中該標籤指明治療患有本文所述疾病的個體。在一些實施例中，藥劑封裝成單個或多個單元。在一些實施例中，關於組合物劑量及投與的說明書包括於封裝中，如下文所述。本發明進一步關於包含本文所述之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑的藥劑。
在一些實施例中，組合物(本文所述的抗體或抗原結合片段)單獨或與第二組合物組合投與(同時或依序)，此視待治療的病狀而定。在一個實施例中，第二治療劑治療為抗癌療法或抗癌治療劑。當投與兩種或更多種組合物時，組合物例如以組合(依序或同時)投與。在一些實施例中，組合物係以單次劑量或多次劑量投與。
在一些實施例中，當為了投與人類個體而調配時，組合物經調配而不含熱原質。測試組合物中的熱原質及製備不含熱原質的醫藥組合物已為一般技術者所熟知。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段經調配以任何適合途徑(包括(但不限於)注射)投與個體。注射包括例如皮下、腹膜內、靜脈內注射、肌肉內注射，或脊椎注射至腦脊髓液(CSF)中。在一些實施例中，在一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個注射位點投與。在一個實施例中，經由六個注射位點投與。
對於活體內應用而言，例如藉由任何適合方式將組合物(諸如本文所述)投與個體而發生接觸。在一些實施例中，本文所述的抗體藉由任何適合方式、全身性或局部投與，包括經由非經腸、皮下、腹膜內、腦脊髓內、肺內及鼻內投藥，及局部治療需要時，進行病灶內投藥。非經腸途徑包括例如靜脈內、動脈內、腹膜內、硬膜外、肌肉內及鞘內投藥。在一些實施例中，此類投藥為推注、連續輸注或脈衝輸注。在一些實施例中，組合物藉由注射投與，此部分地視投藥是否為短暫的或長期的而定。考慮投藥方法的其他模式，包括體表(尤其經皮)、經黏膜、直腸、口腔或局部投藥，例如經由靠近所需位點置放的導管。治療及使用方法
本文在某些實施例中揭示治療有需要之個體之癌症的方法，包含向該個體投與本文揭示的抗體。在一些實施例中，本發明提供如本文所述之抗體的用途，其用於製造供治療人類個體之癌症的藥劑。在一些實施例中，抗體特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15中之至少一者的表現。
本文在某些實施例中揭示調節有需要之個體之免疫活性的方法，包含向該個體投與本文所述的抗體。在一些實施例中，抗體特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15中之至少一者的表現。
本文在某些實施例中揭示治療個體的方法，該個體中的M2巨噬細胞含量發生病理性或不適當的升高(例如相對於適用於促進個體中之免疫介導性腫瘤細胞殺滅的含量，不適當地升高)，包含向該個體投與本文所述的抗體。在一些實施例中，抗體特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15中之至少一者的表現。
在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR3。在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR2；及胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR3。在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR3。
在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR2；胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR3。
在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈CDR3、胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR2；胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈CDR3；胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR1；胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR2；及胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈CDR3。在一些實施例中，抗體包含以下中之至少一者：胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR2、胺基酸序列與SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列100%一致的輕鏈CDR3、胺基酸序列與SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR1、胺基酸序列與SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR2，及胺基酸序列與SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列100%一致的重鏈CDR3。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈可變域(VL)。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈可變域(VL)及胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈可變域(VH)。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列100%一致且該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致，且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，該抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列100%一致。
此外，在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，抗體包含胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約70%一致的輕鏈及胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約70%一致的重鏈。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列至少約75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在一些實施例中，該輕鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列100%一致且該重鏈的胺基酸序列與SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列100%一致。
在一些實施例中，本發明提供如本文所述之抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑減少患有癌症之人類個體對腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制。
在一些實施例中，本發明提供如本文所述之抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑促進患有癌症之人類個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
在一些實施例中，本發明提供一種治療患有癌症之人類個體的方法，其包含向該個體投與治療有效量之如本文所述抗體，藉此減少個體中之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制。
在一些實施例中，本發明提供一種治療患有癌症之人類個體的方法，包含向該個體投與治療有效量之如本文所述的抗體，藉此增強個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示在功能上重定向腫瘤相關巨噬細胞以減少癌症患者之免疫抑制的方法，包含向患者投與有效改善腫瘤微環境中之CD4+ 或CD8+ T細胞活性或增殖之量的包含如本文所述抗體之醫藥組合物。
本文在某些實施例中揭示促進有需要之人類個體之淋巴球介導腫瘤細胞殺滅的方法，包含向該個體投與有效量的包含如本文所述抗體之醫藥組合物。
本文在某些實施例中揭示調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞活性的方法，該方法包含使腫瘤相關巨噬細胞與本文揭示之抗體接觸，其中該方法引起以下效應中之至少一者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞活性的方法，該方法包含使腫瘤相關巨噬細胞與本文揭示之抗體接觸，其中該方法引起以下效應中之至少兩者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞活性的方法，該方法包含使腫瘤相關巨噬細胞與本文所揭示之抗體接觸，其中該方法引起以下效應中之至少三者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞活性的方法，該方法包含使腫瘤相關巨噬細胞與本文揭示的抗體接觸，其中該方法引起以下效應中之至少四者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
本文在某些實施例中揭示調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞活性的方法，該方法包含使腫瘤相關巨噬細胞與本文揭示的抗體接觸，其中該方法引起以下效應中之至少五者： (a)該人類巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
在一些實施例中，本文揭示的方法減少骨髓細胞抑制CD8 T細胞活化及增殖。
M2向M1巨噬細胞極化係指藉以改變本發明之M2或M2樣巨噬細胞的方法，使得所得巨噬細胞具有與M1或M1樣巨噬細胞有關的某些功能或表型屬性。在一些實施例中，M2或M2樣巨噬細胞當其不再表現CD163時發生極化。
在一些實施例中，抗體減少骨髓細胞抑制CD19-CD3 BiTE介導CD8 T細胞殺滅拉吉細胞。
在一些實施例中，抗體減少骨髓細胞抑制CAR T細胞介導癌細胞殺滅。
在一些實施例中，抗體減少骨髓細胞抑制NK細胞介導ADCC殺滅癌細胞。
在一些情況下，本文所揭示之任一種方法進一步包含向該個體投與另一種抗癌療法。抗癌療法包括(但不限於)外科療法、化學療法、輻射療法、冷凍療法、激素療法、免疫療法及細胞介素療法，以及其組合。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段與抗癌療法同時或依序投與。
在一些實施例中，另一種抗癌療法為免疫療法。在一些實施例中，免疫療法為包含檢查點抑制劑之組合物。在一些實施例中，另一種抗癌療法為免疫檢查點抑制劑。
在一些實施例中，本發明提供用於鑑別細胞樣品中之表現huCD163之巨噬細胞的活體外或離體方法，該細胞樣品懷疑包含表現huCD163之巨噬細胞，該方法包含使細胞樣品與如本文所述的抗體接觸及量測對樣品中之細胞的結合，正信號指示樣品中存在表現huCD163的巨噬細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種鑑別細胞樣品中之人類M2c巨噬細胞的方法，該方法包含使包含懷疑包含人類M2c巨噬細胞之血細胞的細胞樣品與如本文所述的抗體接觸及量測對樣品中之細胞的結合，正信號指示樣品中存在人類M2c巨噬細胞。在一些實施例中，細胞樣品包含獲自人類個體的細胞。在一些實施例中，細胞樣品包含所培養細胞。在一些實施例中，用於偵測樣品中之M2細胞的方法包括使用在結合後未被細胞內化、但保持結合至細胞外部以促進偵測的抗體或片段。
在一些實施例中，本發明提供一種鑑別細胞樣品中之表現huCD163之癌細胞的方法，該方法包含使包含細胞的細胞樣品與如本文所述的抗體接觸及量測對樣品中之細胞的結合，該等細胞懷疑包含表現huCD163的癌細胞，正信號指示樣品中存在表現huCD163的癌細胞。在一些實施例中，細胞樣品包含獲自人類個體的細胞。在一些實施例中，細胞樣品包含所培養細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種調節M2c巨噬細胞上之細胞表面標記物表現的方法。在一些實施例中，CD16 (FcγRIIIa)、CD64 (FcγRI)、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15及TLR2中之至少一者的表現減少。在一些實施例中，CD16、CD64、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15及TLR2的表現減少。
在一些實施例中，本發明提供一種減少骨髓細胞抑制T細胞活化的方法。在一些實施例中，該方法誘導T細胞增強產生IL-2。在一些實施例中，本發明提供一種用於增強Th1細胞增殖的方法。在一些實施例中，本發明提供一種用於提高增殖T細胞中之Th1細胞比例的方法。在此等態樣中之每一者中，該等方法包含活體內投與如本文所述的抗體，或使抗體與複雜免疫細胞系統在活體外或離體接觸，其中允許巨噬細胞及效應T細胞及視情況存在之腫瘤靶細胞以再現的方式相互作用或對活體內相互作用進行模型化。
在一些實施例中，本發明提供一種減少骨髓細胞抑制T細胞增殖的方法。在一些實施例中，本發明提供一種增強CD4+ 細胞增殖或CD8+ T細胞增殖或兩者的方法。
在一些實施例中，本發明提供一種使有需要之患者中之CD69、ICOS、OX40、PD-1、LAG3及CTLA4中之至少一者之T細胞表現增強的方法。在一些實施例中，該方法增強CD4+ T細胞對CD69、ICOS、OX40、PD-1、LAG3及CTLA4中之至少一者的表現。在一些實施例中，該方法增強CD8+ T細胞對ICOS、OX40、PD-1、LAG3及CTLA4中之至少一者的表現。
在一些實施例中，本發明提供一種增強癌細胞殺滅的方法。在一些實施例中，增強細胞毒性淋巴球(CTL)對癌細胞的殺滅。在一些實施例中，增強T細胞介導MHC錯配癌細胞的殺滅。
在一些實施例中，本發明提供一種使骨髓細胞與本文所述抗體接觸以減少巨噬細胞介導抑制CD8+ T細胞活化或CD8+ T細胞增殖的方法。在一些實施例中，使抗體與包含M0巨噬細胞的骨髓細胞接觸。在一些實施例中，使抗體與包含M2巨噬細胞的骨髓細胞接觸。在一些實施例中，使抗體與包含M0及M2巨噬細胞的骨髓細胞接觸。
在一些實施例中，本發明提供一種治療患有肺癌之人類患者的方法，其包含向該患者投與有效量之如本文所述之抗體。在一些實施例中，肺癌為癌瘤或腺癌。在一些實施例中，肺癌為非小細胞肺癌。
當個體經歷疾病之病徵或症狀部分或完全緩解或減輕時，達成本發明之有效反應，且在治療癌症的情況下，特異性包括(不限於)治癒、緩和、延長生存期，或其他客觀反應。在一些實施例中，預期的無進展存活時間可以數月至數年度量，此視預後因素而定，包括復發次數、疾病階段及其他因素。延長存活期包括(不限於)至少1個月、約至少2個月、約至少3個月、約至少4個月、約至少6個月、約至少1年、約至少2年、約至少3年等時間。總存活期亦以例如數月至數年度量。可替代地，在一些實施例中，有效反應為個體症狀保持靜止。適應症之其他治療指標更詳細描述如下。
在一些實施例中，在非期望之疾病或病症之症狀顯現之前，藉由預防方法投與治療劑，使得該疾病或病症得到預防，或替代地延遲其進展。因此，當結合預防方法使用時，術語「治療有效」意謂在治療之後，較少量個體(平均而言)出現非期望的疾病或病症或症狀嚴重程度有所進展。
在一些實施例中，組合物中之活性成分的量、組合物配方及投藥模式為變化的因素，以提供有效達成每位個體所需治療反應之量的活性成分，而對個體無不當毒性。所選劑量含量將視多種因素而定，包括所用特定化合物之活性、投藥途徑、投藥時間、所用特定化合物之排出或代謝速率、治療持續時間、其他藥物、與所用特定組合物組合使用的化合物及/或物質、所治療個體的年齡、性別、體重、病狀、一般健康、膳食及先前醫療史，及醫學技術中熟知之類似因素。
在一些實施例中，本文所述的抗體及抗原結合片段以不同給藥量且在不同時間範圍內投與個體。非限制性劑量包括約0.01 mg/kg、約0.05 mg/kg、約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg、約20 mg/kg、約30 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg、約175 mg/kg、約200 mg/kg，或其間的任何整數。另外，在一些實施例中，抗體或抗原結合片段之劑量係一週兩次、每週、每兩週、每三週、每4週、每6週、每8週、每12週或其中之任何週組合投與。亦考慮給藥循環，諸如抗體或其抗原結合片段投與4週，一週一次或兩次，隨後兩週無治療。本發明內亦考慮其他給藥循環，包括例如本文所述之劑量與每週循環的不同組合。
在一些實施例中，組合物之治療有效量視疾病嚴重程度及所治療個體之體重及一般狀態而變化，但通常在每次施用每公斤體重約1.0 µg至約100 mg、或約10 µg至約30 mg、或約0.1 mg至約10 mg、或約1 mg至約10 mg範圍內。視對病症或病狀的反應及個體對療法的耐受性而定，投藥視需要可為每天一次、隔日、每週一次、一月兩次、每月一次或更頻繁或不太頻繁。在一些實施例中，需要在較長時間段(諸如4、5、6、7、8、10或12週或更長)內維持劑量直至病症症狀出現所需抑制，且視需要調節劑量。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監測。
在一些實施例中，本發明抗體於生理溶液中以0.01 mg/kg至100 mg/kg之間範圍的劑量、以每天一次至每週一次至每月一次範圍的頻率(例如每天、每隔一天、每三天，或每週2、3、4、5或6次)靜脈內投與，較佳地，劑量範圍為0.1至45 mg/kg、0.1至15 mg/kg，或0.1至10 mg/kg，頻率為每週2或3次；或最多45 mg/kg，一月一次。
當個體經歷疾病病徵或症狀的部分或完全緩解或減輕時，達成反應，且特異性包括(不限於)生存期延長。預期的無進展存活時間係以例如數月至數年來度量，此視預後因素而定，包括復發次數、疾病階段及其他因素。延長生存期包括(不限於)至少1個月、約至少2個月、約至少3個月、約至少4個月、約至少6個月、約至少1年、約至少2年、約至少3年或更久之時間。在一些實施例中，總存活期亦以數月至數年度量。在一些實施例中，個體的症狀保持靜止或減少。
具有一般技術的醫師或獸醫在一些情況下容易確定及規定所需組合物的有效量(ED50 )。舉例而言，醫師或獸醫可使組合物中所用化合物之起始劑量含量低於為達成所需治療效果所需之含量且逐漸增加劑量直至達成所需效果。可替代地，在一些實施例中，劑量保持恆定。
在一些實施例中，將其他抗體、小分子治療劑及/或其他藥劑合併成同時或依序投與的單獨組合物。在一個實施例中，同時投藥包含一或多種組合物同時或在彼此30分鐘內投與。在一些實施例中，投藥在相同或不同位點發生。
在一些實施例中，藉由標準醫藥程序測定此類成分在細胞培養或實驗動物中的毒性及治療功效，例如測定LD50 (群體50%致死劑量)及ED50 (群體50%有效治療劑量)。在一些實施例中，毒性作用與治療作用之間的劑量比為治療指數且其用比率LD50 /ED50 表示。雖然在一些實施例中使用展現毒副作用的化合物，但應謹慎設計使此類化合物靶向所影響組織位點的遞送系統，以最小化對健康細胞的潛在損傷且從而減少副作用。
在一些實施例中，利用獲自細胞培養分析及動物研究的資料調配用於人類的劑量範圍。此類化合物之劑量較佳處於循環濃度之範圍內，包括毒性很小或無毒性之ED50 。在一些實施例中，視所用劑型及所用投藥途徑而定，劑量在此範圍內變化。在一些實施例中，對於本發明方法中所用的任何化合物而言，初始利用細胞培養分析來估計治療有效劑量。在一些實施例中，藉由動物模型調配劑量，以達成循環血漿濃度配置，包括如在細胞培養中所測定的IC50 (亦即，測試化合物達成半最大抑制的濃度)。血漿中之含量係藉由例如高效液相層析量測。在一些情況下，此類資訊用於更精確地確定適用於人類之劑量。
在一些實施例中，本發明提供一種治療患有癌症之患者的方法，該方法包含向該患者投與治療有效量之如本文所述之抗體且進一步包含用選自以下之抗癌療法治療個體：外科療法、化學療法、輻射療法、冷凍療法、激素療法、免疫療法或細胞介素療法。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段及另一種抗癌療法同時或依序投與。診斷產物及方法
在一些實施例中，本文揭示偵測樣品或個體中之huCD163蛋白或M2巨噬細胞的方法，以評估患者之治療狀態或診斷與M2巨噬細胞或TAM活性有關或相關的疾病或病症，諸如本文所述的彼等疾病及病症。
活體內偵測、診斷或監測可溶性huCD163蛋白、細胞或組織對huCD163蛋白的表現或M2巨噬細胞的存在或活性時，向個體投與如本文所述的抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段結合至可偵測部分。在一些實施例中，可偵測部分使用此項技術中公認的方法可視化，諸如(但不限於)磁共振成像(MRI)、螢光、放射成像、內窺鏡、腹腔鏡或血管內導管提供光源(亦即，經由偵測光活性劑)、光掃描、正電子發射斷層攝影(PET)掃描、全身核磁共振(NMR)、放射性閃爍攝影、單光子發射電腦斷層攝影(SPECT)、靶向近紅外區域(NIR)掃描、X射線、超音波。使用此類方法偵測化合物的標記在此項技術中亦已知。在一些實施例中，可偵測部分的可視化允許偵測、診斷及/或監測與M2巨噬細胞活性或表現huCD163蛋白之另一種細胞之活性有關的病狀或疾病。利用特異性針對所需靶蛋白(亦即，huCD163蛋白)之抗體進行的其他診斷分析在此項技術中已知且亦涵蓋於本文中。
在活體外偵測方法中，自個體獲得樣品，包括(但不限於)血液、組織切片樣品及其體液。
因此，本發明提供的抗體及其抗原結合片段適用於偵測或診斷與疾病或病症有關之M2巨噬細胞或TAM巨噬細胞的含量，此潛在地指示對治療性治療之需求。在其他實施例中，抗體進一步包含第二藥劑。在一些實施例中，此類藥劑為分子或部分，諸如報導分子或可偵測標記。用於此類偵測方法的可偵測標記/部分在此項技術中已知且更詳細地描述如下。報導分子為使用例如分析偵測之任何部分。已與多肽偶聯之報導分子的非限制性實例包括酶、放射性標記、半抗原、螢光標記、磷光分子、化學發光分子、發色團、發光分子、光親和性分子、著色粒子或配位體，諸如生物素。在一些實施例中，可偵測標記包括由於特定功能特性而偵測到的化合物及/或元素，及/或化學特徵，其使用允許偵測到其所連接的多肽，且/或必要時進一步定量。許多適當的可偵測(成像)劑以及用於其連接至多肽的方法在此項技術中已知。
在一些實施例中，多肽與多種螢光染料、淬滅劑及半抗原(諸如螢光素、R-藻紅蛋白及生物素)偶聯。在一些實施例中，在多肽合成期間或在多肽已合成及純化之後，發生偶聯。
可替代地，在一些實施例中，使抗體、抗原結合片段或結合蛋白與螢光部分偶聯。多肽與螢光部分(例如R-藻紅蛋白、異硫氰酸螢光素(FITC)等)偶聯係例如使用此項技術中公認的技術實現。許多市售螢光染料及染料偶聯套組可根據特定應用來市購，諸如螢光顯微法、流式細胞術、螢光活化細胞分選(FACS)等。
在一個非限制性實施例中，使抗體的抗原結合片段與用於免疫偵測抗原結合之可偵測標記(諸如放射性核素、染料、成像劑，或螢光劑)締合(偶聯)，該可偵測標記用於對抗體與M2巨噬細胞或可溶性或所結合huCD163蛋白的結合進行可視化。
放射性標記之非限制性實例包括例如32 P、33 P、43 K、52 Fe、57 Co、64 Cu、67 Ga、67 Cu、68 Ga、71 Ge、75 Br、76 Br、77 Br、77 As、77 Br、81 Rb/81m Kr、87m Sr、90 Y、97 Ru、99 Tc、99m Tc、100 Pd、101 Rh、103 Pb、105 Rh、109 Pd、111 Ag、111 In、113 In、119 Sb、121 Sn、123 I、125 I、127 Cs、128 Ba、129 Cs、131 I、131 Cs、143 Pr、153 Sm、161 Tb、166 Ho、169 Eu、177 Lu、186 Re、188 Re、189 Re、191 Os、193 Pt、194 Ir、197 Hg、199 Au、203 Pb、211 At、212 Pb、212 Bi及213 Bi。在一些實施例中，放射性標記係使用抗體成像技術中已知之習知化學技術連接至化合物。放射性標記的化合物適用於活體外診斷技術及活體內放射成像技術及放射免疫療法。
在一些實施例中，本文所述抗體及抗原結合片段的組合物亦用作非治療劑(例如用作親和純化劑)。抗體技術
如熟習此項技術者將理解，本文中抗體之一般描述以及其製備及使用方法亦適用於個別抗體多肽組分及抗體片段。
本發明之抗體為多株或單株抗體。然而，在較佳實施例中，其為單株的。在特定實施例中，本發明抗體為人類抗體。產生多株及單株抗體之方法在此項技術中已知。
在一些實施例中，對使用此類方法產生之結合由M2巨噬細胞表現之huCD163的抗體、抗原結合片段及其他蛋白質的結合親和力、親合力及調節能力中之一或多者進行測試。
在一些實施例中，採用習知方法鑑別結合至huCD163蛋白之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，評估抗體及抗原結合片段之結合親和力、締合速率、解離速率及親合力中之一或多者。此類參數之量測例如使用包括(但不限於)以下的分析來實現：酶聯免疫吸附分析(ELISA)、ELISpot分析、史卡查分析(Scatchard analysis)、表面電漿子共振(例如BIACORE)分析等、競爭性結合分析及其類似分析。在一個非限制性實施例中，ELISA分析用於量測特異性抗體或抗原結合片段結合至huCD163蛋白之結合能力。表面電漿子共振技術描述於Liljeblad等人,Glyco J 17:323-9 (2000)中。
在一些實施例中，根據本發明的抗體係使用此項技術中可獲得的載體及方法重組產生，如下文進一步描述。在一些實施例中，人類抗體亦由活體外活化B細胞產生(參見美國專利第5,567,610號及第5,229,275號)。
在一些實施例中，在轉殖基因動物(例如小鼠)中產生人類抗體，該等轉殖基因動物能夠在不產生內源性免疫球蛋白的情況下產生完整譜系的人類抗體。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變小鼠中之抗體重鏈接合區(JH )基因的同型接合缺失導致內源抗體產生被完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變小鼠中使得在抗原攻擊後產生人類抗體。參見例如Jakobovits等人,Proc Natl Acad Sci USA , 90:2551 (1993)；Jakobovits等人,Nature 362:255-58 (1993)；Bruggemann等人, Year in Immunol., 7:33 (1993)；美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591,669號；美國專利第5,545,807號；及WO 97/17852。在一些實施例中，此類動物經基因工程改造以產生包含本發明多肽之人類抗體。
舉例而言，使用此項技術中已知之方法，諸如藉由飽和硫酸銨沈澱、優球蛋白沈澱方法、己酸方法、羊脂酸方法、離子交換層析(DEAE或DE52)或使用抗Ig管柱或蛋白質A、G或L管柱之親和層析，自培養上清液或腹水(若在動物中產生)分離且純化。
如上文所提及，本發明進一步提供抗體片段。在某些情形下，使用抗體片段、而非完整抗體具有優勢。舉例而言，在一些實施例中，片段的尺寸較小允許快速清除，且能夠改良對某些組織的近接，諸如實體腫瘤。抗體片段之實例包括：Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
已開發出產生抗體片段之各種技術。傳統上，此等片段經由完整抗體之蛋白水解消化而產生(參見例如Morimoto等人,J Biochem Biophys Methods 1992 24(1-2):107-17；及Brennan等人,Science 1985 229:81)。然而，在一些實施例中，此等片段現由重組宿主細胞直接產生。在一些實施例中，Fab、Fv及ScFv抗體片段皆在大腸桿菌中表現且自大腸桿菌分泌，從而允許大量此等片段快捷產生。在一些實施例中，Fab'-SH片段直接自大腸桿菌回收且化學偶合而形成F(ab')2 片段(Carter等人, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。根據另一種方法，在一些實施例中，直接自重組宿主細胞培養物中分離出F(ab')2 片段。美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中描述了活體內半衰期延長之Fab及F(ab')2 片段，該片段包含自IgG之Fc區之CH 2域之兩個環獲取的救助受體結合抗原決定基。產生抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
在其他實施例中，所選抗體為單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利第5,571,894號；及第5,587,458號。Fv及sFv為不含恆定區的具有完整組合位點的唯一物種。因此，其適合於在活體內使用期間用於減少非特異性結合。在一些實施例中，sFv融合蛋白經構築以產生效應蛋白在sFv之胺基或羧基端的融合體。參見Antibody Engineering , Borrebaeck編, 同上。在一些實施例中，抗體片段亦為例如「線性抗體」，如例如美國專利第5,641,870號中所述。在一些實施例中，此類線性抗體片段為單特異性或雙特異性的。.
用於製備雙特異性或其他多特異性抗體的方法在此項技術中已知且包括化學交聯、使用白胺酸拉鏈(Kostelny等人,J Immunol 148:1547-53 (1992))；雙功能抗體技術(Hollinger等人,Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-8 (1993))；scFv二聚體[Gruber等人,J Immunol 152:5368 (1994))、線性抗體(Zapata等人,Protein Eng 8:1057-62 (1995))；及螯合型重組抗體(Neri等人,J Mol Biol 246:367-73 (1995))。
全長雙特異性抗體之傳統產生係基於兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈之共表現，其中兩條鏈具有不同特異性(Millstein等人，Nature 305:537-9 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分類，因此此等融合瘤(四源融合瘤)產生十種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結構。正確分子之純化係藉由例如親和層析進行。Similar procedures are disclosed in WO 93/08829, and in Traunecker et al.,EMBO J 10:3655-9 (1991).
根據不同方法，使具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳與包含鉸鏈、CH 2及CH 3區之至少一部分的Ig重鏈恆定域融合。較佳地，至少一個融合體中存在含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恆定區(CH 1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入單獨的表現載體中，且共轉染至適合宿主細胞中。在實施例中，當用於建構之四個多肽鏈之不等比率提供所需雙特異性抗體之最佳產量時，則此在調節四種多肽片段之相互比例時提供較大靈活性。然而，當至少兩個多肽鏈的等比率表現引起高產量時或當該等比率對所需鏈組合之產量無顯著影響時，可將兩個或全部四個多肽鏈的編碼序列插入單一表現載體中。
雙特異性抗體由以下構成：例如一個臂中之具有第一結合特異性的融合免疫球蛋白重鏈，及另一臂中之融合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。發現此不對稱結構促進所需雙特異性化合物自非所需免疫球蛋白鏈組合的分離，因為雙特異性分子的僅一半存在免疫球蛋白輕鏈為分離提供便捷的方式。此方法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人,Methods Enzymol , 121:210 (1986)。
在一些實施例中，根據美國專利第5,731,168號所述的另一種方法，一對抗體分子之間的界面經工程改造以最大化自重組細胞培養物中回收雜二聚體的百分比。較佳界面包含CH 3域之至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子界面之一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換。在第二抗體分子的界面上，藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而建立尺寸與大側鏈相同或相似的補償性「空腔」。由此提供相對於其他非所需最終產物(諸如均二聚體)增加雜二聚體產量的機制。
雙特異性抗體包括交聯或「異偶聯物」抗體。舉例而言，異偶聯物中的一種抗體與抗生物素蛋白偶合，另一種抗體與生物素偶合。舉例而言，已提出此類抗體使免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/20373及EP 03089)。在一些實施例中，使用任何方便的交聯方法製備異偶聯物抗體。適合交聯劑以及許多交聯技術為此項技術中所熟知且揭示於美國專利第4,676,980號中。另一種方法設計成藉由在scFv C端添加抗生蛋白鏈菌素編碼序列來製備四聚體。抗生蛋白鏈菌素係由四個亞單元構成，因此當scFv-抗生蛋白鏈菌素摺疊時，四個亞單元締合而形成四聚體(Kipriyanov等人,Hum Antibodies Hybridomas 6(3):93-101 (1995))。
根據用於製備雙特異性抗體的另一種方法，在一些實施例中，一對抗體分子之間的界面經工程改造以使自重組細胞培養物回收之雜二聚體的百分比最大化。一個界面包含抗體恆定域之CH 3域的至少一部分。在此方法中，來自第一抗體分子界面的一或多個小胺基酸側鏈經較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換。在第二抗體分子的界面上，藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而建立尺寸與大側鏈相同或相似的補償性「空腔」。由此提供相對於其他非所需最終產物(諸如均二聚體)增加雜二聚體產量的機制。參見WO 96/27011。
利用抗體片段產生雙特異性抗體的技術亦已描述於文獻中。舉例而言，使用化學鍵聯製備雙特異性抗體。Brennan等人,Science , 229：81 (1985)描述一種程序，其中完整抗體以蛋白分解方式裂解而產生F(ab')2 片段。此等片段在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下還原以使鄰位二硫醇穩定化且阻止分子間二硫鍵形成。接著將所產生的Fab'片段轉化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。接著藉由巰基乙胺還原而使Fab'-TNB衍生物之一再轉化成Fab'-硫醇且與等莫耳濃度量的其他Fab'-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。在一些實施例中，所產生的雙特異性抗體用作酶選擇性固著劑。
最新進展已促進自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，其例如進行化學偶合而形成雙特異性抗體。Shalaby等人,J Exp Med 175：217-25 (1992)描述人類化雙特異性抗體F(ab')2 分子的產生。各Fab'片段分別自大腸桿菌分泌且經受活體外定向化學偶合而形成雙特異性抗體。由此形成的雙特異性抗體能夠結合至過度表現ErbB2受體的細胞及正常人類T細胞，且觸發人類細胞毒性淋巴球針對人類乳房腫瘤標靶的溶胞活性。
直接自重組細胞培養物製備及分離雙特異性抗體片段之各種技術亦已描述。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny等人,J Immunol 148(5):1547-53 (1992)。來自Fos及Jun蛋白質的白胺酸拉鏈肽藉由基因融合而連接至兩種不同抗體的Fab'部分。抗體均二聚體在鉸鏈區還原而形成單體且接著再氧化而形成抗體雜二聚體。在一些實施例中，此方法用於產生抗體均二聚體。鑑別及製備抗體
在一些實施例中，使用習知定序技術測定編碼抗體、其可變區或其抗原結合片段之聚核苷酸序列，且次選殖入用於重組產生抗體之表現載體中。此如下實現：自個體(例如癌症患者)之血液獲得單核細胞；自單核細胞產生B細胞純系；誘導B細胞變成產生抗體的漿細胞；及篩選漿細胞所產生的上清液以確定其是否含有抗體。在一些實施例中，使用類似方法實現具有本發明抗體之特異性的其他抗體之鑑別。舉例而言，在鑑別產生抗體之B細胞純系後，進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)以選殖編碼抗體之可變區或其一部分的DNA。接著將此等序列次選殖入適於重組產生人類抗體的表現載體中。在一些實施例中，藉由測定抗體或重組抗體結合M2細胞或表現人類CD163多肽之其他細胞的能力來確認結合特異性，該多肽由M2細胞表現。
在本文所述方法之特定實施例中，對自周邊血液或淋巴結分離出之B細胞進行分選，例如基於其為CD19陽性進行分選，且接種，例如低至每孔單個細胞特異性，例如接種於96孔、384孔或1536孔組態中。誘導細胞分化成產生抗體之細胞，例如漿細胞，且收集培養物上清液且使用例如FMAT或FACS分析來測試其表面上表現靶多肽之細胞的結合。接著使陽性孔經歷全孔RT-PCR以擴增由純系子代漿細胞表現之IgG分子的重鏈及輕鏈可變區。將編碼重鏈及輕鏈可變區或其一部分的所得PCR產物次選殖入用於重組表現的人類抗體表現載體中。接著測試所得重組抗體以確認其原始結合特異性且在一些實施例中，進一步測試針對其他細胞或蛋白質的交叉反應。
因此，在一個實施例中，如下實施鑑別抗體之方法。首先，將全長或約全長CD163 cDNA轉染至細胞株用於表現CD163多肽。其次，測試個別人類血漿或血清樣品中之結合表現細胞之多肽的抗體。且最後，根據對由相同細胞表現之CD163多肽的結合，對來源於血漿或血清陽性個體之MAb進行表徵。在一些實施例中，在此時，進一步定義MAb的細微特異性。
在一些實施例中，根據此項技術中可獲得的及本文所述的方法，自表現抗體之細胞中分離出編碼本發明之抗體或其一部分的聚核苷酸，包括使用對人類抗體多肽之保守區具有特異性的引子、藉由聚合酶鏈反應進行擴增。舉例而言，根據WO 92/02551；美國專利第5,627,052號；或Babcook等人,Proc Natl Acad Sci USA 93:7843-48 (1996)所述的分子生物學技術，自B細胞選殖輕鏈及重鏈可變區。在某些實施例中，對編碼IgG分子之重鏈與輕鏈可變區之全部或區域的聚核苷酸進行次選殖及定序，該IgG分子由表現抗體之純系子代漿細胞表現。在一些實施例中，所編碼多肽之序列容易由聚核苷酸序列測定。
使用在此項技術中已知及本文所述的程序將編碼本發明多肽之經分離之聚核苷酸次選殖入表現載體中以重組產生本發明之抗體及多肽。
在一些實施例中，通常使用免疫偵測方法(包括例如基於免疫螢光的分析，諸如免疫組織化學(IHC)及/或螢光活化細胞分選(FACS))測定且評估抗體(或其片段)對CD163多肽或M2細胞的結合特性。在一些實施例中，免疫分析方法包括確定抗體是否特異性結合至CD163多肽或結合至M2巨噬細胞且不識別對照細胞(例如M1細胞)或經轉染以表現對照蛋白質的宿主細胞，或與該等細胞發生交叉反應。
預篩選血清以鑑別出產生針對CD163多肽或針對M2巨噬細胞或TAM之抗體之患者之後，本發明之方法典型地包括自先前獲自患者或個體之生物樣品中分離或純化B細胞。在一些實施例中，患者或個體當前或先前已確診患有或懷疑患有或患有癌症或所關注之特定疾病，或認為患者或個體無癌症或疾病。典型地，患者或個體為哺乳動物且在特定實施例中，為人類。在一些實施例中，生物樣品為含有B細胞的任何樣品，包括(但不限於)淋巴結或淋巴結組織、胸膜積液、周邊血液、腹水、腫瘤組織或腦脊髓液(CSF)。在一些實施例中，自不同類型之生物樣品分離B細胞，諸如腫瘤切片或受特定疾病影響的其他生物樣品。然而，在一些實施例中，應瞭解，包含B細胞的任何生物樣品用於本發明之任一實施例。
B細胞一經分離，則誘導產生抗體，例如藉由在支持B細胞增殖或發育成漿細胞、漿母細胞或血漿細胞的條件下培養B細胞。接著篩選抗體，典型地使用高通量技術篩選，以鑑別出特異性結合至靶抗原(例如特定組織、細胞或多肽)的抗體。在某些實施例中，特異性抗原(例如抗體所結合之細胞表面多肽)為未知的，而在其他實施例中，抗體特異性結合之抗原為已知的。
根據本發明，在一些實施例中，B細胞藉由此項技術中已知且可獲得的任何方式自生物樣品(例如腫瘤、組織、周邊血液或淋巴結樣品)分離。B細胞典型地基於其表面上之B細胞特異性標記物(例如CD19、CD138及/或表面IgG)的存在、藉由FACS分選。然而，在一些實施例中使用此項技術中已知之其他方法，諸如使用CD19磁珠或IgG特異性磁珠進行管柱純化，隨後自管柱溶離。然而，在一些實施例中，利用任何標記物對B細胞進行磁性分離導致某些B細胞損失。因此，在某些實施例中，不分選經分離的細胞，而是相反，直接接種自腫瘤分離出的Ficoll純化單核細胞直至適當或每孔所要數目個特異性。
為了鑑別出產生抗體的B細胞，典型地將B細胞以低密度(例如每孔單個細胞特異性、每孔1至10個細胞、每孔10至100個細胞、每孔1至100個細胞、每孔少於10個細胞，或每孔少於100個細胞)接種於多孔或微量滴定盤中，例如接種於96孔、384孔或1536孔組態中。在一些實施例中，若初始以每孔大於一個細胞之密度接種B細胞，則本發明之方法包括隨後在經鑑別產生抗原特異性抗體之孔中稀釋細胞的步驟，直至達成每孔單個細胞特異性，從而有助於鑑別出產生抗原特異性抗體之B細胞。在一些實施例中，將細胞上清液或其一部分及/或細胞冷凍且儲存供未來測試及隨後回收抗體聚核苷酸。
在某些實施例中，B細胞係在有利於B細胞產生抗體之條件下培養。舉例而言，B細胞係在有利於B細胞增殖及分化產生產抗體漿母細胞、漿細胞或血漿細胞的條件下培養。在特定實施例中，B細胞係在B細胞有絲分裂原(諸如脂多醣(LPS)或CD40配位體)存在下培養。在一個特定實施例中，B細胞係藉由將其與飼養細胞及/或其他B細胞活化因子(諸如CD40配位體)一起培養而分化成產抗體細胞。
在一些實施例中，使用此項技術中可獲得的常規方法(包括本文所述的彼等方法)，測試自其獲得的細胞培養上清液或抗體結合至靶抗原之能力。在特定實施例中，使用高通量方法測試培養上清液中之結合至靶抗原之抗體的存在。舉例而言，在多孔微量滴定盤中培養B細胞，以便利用機器人盤處置器對多個細胞上清液同時取樣且測試結合至靶抗原之抗體的存在。在特定實施例中，抗原結合至珠粒(例如順磁或乳膠珠粒)，以促進捕捉抗體/抗原複合物。在其他實施例中，抗原及抗體經螢光標記(經不同標記標記)且執行FACS分析以鑑別結合至靶抗原之抗體的存在。在一個實施例中，使用FMAT™分析及儀器(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)測定抗體結合。FMAT為用於高通量篩選的螢光巨型共聚焦平台，其能夠使用活細胞或珠粒進行混合式讀取、非放射性分析。
在一些實施例中，在比較抗體對特定靶抗原(例如生物樣品，諸如癌症組織或細胞，或傳染媒介物)的結合與抗體對對照樣品(例如生物樣品，諸如正常細胞、來自另一物種的比較細胞、不同癌症組織或細胞，或不同傳染媒介物)的結合時，若相較於結合對照樣品之量為至少兩倍、至少三倍、至少五倍或至少十倍多的抗體結合至特定靶抗原，則認為該抗體優先結合特定靶抗原。
在一些實施例中，利用在此項技術中可獲得的任何方式自細胞中分離出編碼抗體鏈、其可變區或其片段的聚核苷酸。在一個實施例中，利用聚合酶鏈反應(PCR)分離出聚核苷酸，例如使用特異性結合至編碼聚核苷酸序列或其補體之重鏈或輕鏈的寡核苷酸引子、利用此項技術中可獲得的常規程序進行逆轉錄-PCR (RT-PCR)。在一個實施例中，使陽性孔經歷全孔RT-PCR以擴增由純系子代漿細胞表現之IgG分子的重鏈及輕鏈可變區。在一些實施例中，對此等PCR產物進行定序，且接著將編碼重鏈及輕鏈可變區或其一部分的產物次選殖入人類抗體表現載體中且根據此項技術中的常規程序重組表現(參見例如美國專利第7,112,439號)。在一些實施例中，根據用於核酸切除、接合、轉型及轉染之多種熟知程序中的任一者，將編碼如本文所述之M2巨噬細胞特異性抗體或其片段的核酸分子繁殖且表現。因此，在某些實施例中，抗體片段較佳在原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)中表現(參見例如Pluckthun等人,Methods Enzymol 178:497-515 (1989))。在某些其他實施例中，抗體或其抗原結合片段較佳在真核宿主細胞(諸如酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )、粟酒裂殖酵母(S. pombe )、甲醇酵母(Pichia pastoris )))；動物細胞(包括哺乳動物細胞)；或植物細胞中表現。適合動物細胞之實例包括(但不限於)骨髓瘤細胞、COS細胞、CHO細胞或融合瘤細胞。植物細胞之實例包括菸草、玉米、大豆及稻米細胞。在一些實施例中，藉由一般技術者已知之方法且基於本發明設計核酸載體以在特定宿主系統中表現外來序列，且接著插入編碼腫瘤特異性抗體(或其片段)之聚核苷酸序列。調控元件將根據特定宿主而變。
在一些實施例中，製備且使用含有編碼可變區及/或恆定區之聚核苷酸的一或多個可複製表現載體使其中將產生抗體的適當細胞株(例如非生產骨髓瘤細胞株，諸如小鼠NSO系或細菌，諸如大腸桿菌)轉型。為了獲得有效轉錄及轉譯，各載體中之聚核苷酸序列應包括適當調控序列，特定言之，可操作地連接至可變區序列的啟動子及前導序列。
以此方式產生抗體的特定方法通常為熟知的且以常規方式使用。舉例而言，分子生物學程序描述於Sambrook等人,Molecular Cloning ,A Laboratory Manual , 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989；亦參見Sambrook等人, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001))。雖然不需要，但在某些實施例中，對編碼重組抗體之聚核苷酸區域進行定序。DNA定序例如以任何方式或利用此項技術中已知的任何系統執行。基本定序技術描述於例如Sanger等人,Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463 ( 1977 )) 及Amersham International plc定序手冊中，且包括其改進。
在特定實施例中，接著測試所得重組抗體或其片段以確認其原始特異性，且在一些實施例中，進一步測試與例如相關多肽的交叉反應性。在特定實施例中，利用習知方法測試根據本文所述方法鑑別或產生的抗體進行內化或其他效應功能的能力。封裝、套組及預填充容器
本文亦提供含有一或多種上述化合物的套組。在一些實施例中，套組在適合的容器構件中包含如本文所述之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，提供一種容器構件，其包含本文所述之組合物。在一些實施例中，容器構件為容納例如液體或凍乾組合物之任何適合容器，包括(但不限於)小瓶、注射器、瓶、靜脈內(IV)袋或安瓿。注射器容納任何體積之適於注射至個體之液體，在一些實施例中，包括(但不限於) 0.5 cc、1 cc、2 cc、5 cc、10 cc或更多。
本文提供套組，其包含本文所述之一或多種組合物。在一些實施例中，本文提供一種用於治療患有癌症之個體的套組，其包含如本文所述之抗體及抗癌療法。
在一些實施例中，本文提供用於治療癌症之套組，其包含如本文所述之抗體及附接至容器或用容器封裝之標籤，該標籤描述抗體與抗癌療法組合之使用。
在一些實施例中，本文提供一種用於治療癌症的套組，其包含抗癌療法及附接至容器或用容器封裝的標籤，該標籤描述抗癌療法與如本文所述之抗體的使用。
在一些實施例中，套組之容器構件通常將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、安瓿、注射器、靜脈內(IV)袋及/或其他容器構件，至少一種多肽置放於其中，且/或較佳經適當等分試樣。本文提供一種包含本文所述組合物的容器構件。
在一些實施例中，套組包括用於容納至少一種融合蛋白、可偵測部分、報導分子之構件，及/或經密閉以用於市售的任何其他試劑容器。在一些實施例中，此類容器包括保持所需小瓶於其中的注塑及/或吹塑成型容器。在一些實施例中，套組亦包括套組中之材料所用的印刷材料。
在一些實施例中，封裝及套組另外包括含緩衝劑、防腐劑及/或穩定劑之醫藥調配物。在一些實施例中，套組之各組分封閉於個別容器內，且所有各種容器可納入單一封裝內。在一些實施例中，本發明套組經設計用於冷儲存或室溫儲存。
另外，在一些實施例中，製劑含有延長套組存放期的穩定劑且包括例如牛血清白蛋白(BSA)。在凍乾組合物的情況下，在一些實施例中，套組含有其他溶液製劑以復原凍乾製劑。可接受的復原溶液為此項技術中所熟知且包括例如醫藥學上可接受之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在一些實施例中，封裝及套組進一步包括一或多種用於分析之組分，諸如ELISA分析。本申請案中待測試之樣品包括例如血液、血漿、組織切片及分泌物、尿液、淋巴及其產物。在一些實施例中，封裝及套組進一步包括一或多種用於收集樣品之組件(例如注射器、杯、拭子等)。
在一些實施例中，封裝及套組進一步包括說明US FDA或類似管制機構所要求之資訊(例如產品描述、投藥量及模式，及/或治療指示)的標籤。本文所提供之封裝可包括如本文所述之任一種組合物。
術語「封裝材料」係指一種容納套組組分的物理結構。在一些實施例中，封裝材料使各組分無菌且由常用於此類目的之材料製成(例如紙、波紋狀纖維、玻璃、塑膠、箔、安瓿等)。在一些實施例中，標籤或藥品說明書包括適當書面說明書。因此，在一些實施例中，套組另外包括藉由本發明之任何方法使用套組組分之標籤或說明書。在一些實施例中，套組在包裝或分配器中包括化合物以及藉由本文所述方法投與化合物之說明書。
在另外其他實施例中，套組進一步包含用於抗癌療法的容器構件。
在一些實施例中，說明書包括用於實施本文所述任一方法(包括治療方法)的說明書。在一些實施例中，說明書另外包括令人滿意之臨床終點或所發生任何不良症狀之指示，或管制機構(諸如美國食品藥物管理局)關於用於人類個體所必要的其他資訊。
在一些實施例中，說明書存在於「印刷品」，例如位於套組內或附連至套組之紙或卡紙板上，或位於附連至套組或封裝材料之標籤上，或附接至容納套組組分之小瓶或管上。在一些實施例中，說明書另外包括於電腦可讀媒體上，諸如CDROM、DVD、快閃記憶體器件、固態記憶體、磁碟及磁碟器件、磁帶、雲計算系統及服務，及其類似物。在一些情況下，程式及說明書永久性地、基本上永久性地、半永久性地或非暫時地編碼於媒體上。
本文提供一種容器構件，其包含本文所述之組合物。在一些實施例中，容器構件為容納液體或凍乾組合物之任何適合容器，包括(但不限於)小瓶、注射器、瓶、靜脈內(IV)袋或安瓿。在一些實施例中，注射器容納適合於注射至個體中之任何體積的液體，包括(但不限於) 0.5 cc、1 cc、2 cc、5 cc、10 cc或更多。
本文提供包含本文所述之組合物的套組。在一些實施例中，本文提供用於治療癌症之套組，其包含如本文所述之抗體與抗癌治療劑之組合。
在一些實施例中，本文提供一種用於治療癌症之套組，其包含如本文所述之抗體及附接至容器或用容器封裝之標籤，該標籤描述抗體或其抗原結合片段與抗癌療法的使用。
在一些實施例中，本文提供一種用於治療癌症的套組，其包含抗癌療法及附接至容器或用容器封裝之標籤，該標籤描述抗癌療法與如本文所述之抗體的使用。 實例
本發明進一步說明於以下實例中，該等實例僅為了說明目的而明示且不希望限制本發明。實例 1 - 鑑別及選殖
分離出且選殖特異性結合至人類骨髓源抑制細胞(MDSC)的抗體，該等骨髓源抑制細胞由對檢查點抑制劑抗PD-1治療有反應之患者產生。進一步詢問此等單株抗體之免疫調節特性，目的在於鑑別具有靶向及逆轉MDSC之免疫抑制效應之治療潛力的抗體，從而增強腫瘤清除。
鑑別出對免疫檢查點抑制劑達成部分或完全反應至少6個月持續時間的癌症患者且選用於經由I-STAR平台進行記憶B細胞譜系分析。此平台使用短期B細胞培養系統查詢記憶B細胞譜系。基於CD19及IgG表面表現，自各供體患者之一千萬個周邊血液單核細胞(PBMC)中分離出超過15,000個記憶B細胞。接著在促進B細胞活化、增殖、終末分化及抗體分泌的條件下將此等記憶B細胞以每孔約1個細胞接種於四十個384孔微量滴定盤中。每孔1個細胞的接種密度允許擴增單一B細胞純系，使得可以自各培養孔中復原可靠的抗體重鏈及輕鏈對。使用高通量及小型化多工流式細胞術分析，在各孔中篩選出結合至MDSC之所分泌IgG抗體。鑑別出49種陽性B細胞純系。對基於MDSC結合特徵及抗體可變區序列優先排序的所選抗體亞群進行定序、選殖且以重組IgG1形式表現，用於進一步的活體外表徵。
藉由RT-PCR擴增、使用家族特異性引子組擴增免疫球蛋白基因之重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變區，該等免疫球蛋白基因來自產生MDSC特異性抗體的B細胞純系。根據家族特異性PCR陽性反應，將VH區或VL區純系池選殖入人類IgG1恆定域序列上游的表現載體中，從而產生結合特徵與B細胞純系所產生的抗體相同的功能抗體。在GenScript, NJ, USA設計DNA質體且需要在恆定區中進行基因合成。將此等質體的所有可能重鏈與輕鏈家族特異性對組合且用於瞬時轉染HEK293細胞。在基於流動的MDSC結合分析中篩選含有所分泌重組抗體的所有轉染物上清液。對於每孔含有超過一種B細胞純系之孔而言，如早先所述擴增且表現多種VH及VL域序列。接著利用MDSC篩選來鑑別重鏈及輕鏈組合池，該等組合池再現結合活性，如使用混合培養物中所發現的抗體所觀測。所有結合mAb之VH及輕鏈VL可變區的DNA序列係使用得自maxipreps (GenScript來源及Macherey Nagel擴增質體)的純化DNA、根據多重定序反應確認。
利用MDSC篩選來鑑別出一種B細胞純系(重鏈的生殖系ID：VH3.30-3/IGHG1且輕鏈的生殖系ID：VK1.O12)且表示為AB101，其包含含有SEQ ID NO：9的輕鏈及含有SEQ ID NO：10的重鏈。衍生得到純系的供者為診斷患有非小細胞肺癌(NSCLC)的患者。患者患有化學療法的漸進性疾病且接著在抗PD-1治療後完全緩解，且在抽血時仍接受治療。利用定序證實B細胞純系孔僅有一條重鏈及一條輕鏈。如使用來自單一B細胞純系之所分泌IgG抗體所觀測，再現的抗體亦對MDSC具有不同的雙峰結合，表明抗體標靶高度表現於MDSC之所選亞群上。參見圖 1 。在寬鬆的阻斷條件下，使用寬鬆阻斷液(10 µg/mL重組Fc阻斷液(Abcam)及嚴格阻斷液(10 µg/mL得自Abcam的重組Fc阻斷液 + 1 µg/mL抗CD16、抗CD32及抗CD64)條件、針對兩個MDSC供者的再現篩選結果顯示AB101對人類MDSC之劑量依賴性可飽和結合，IC50為約10 nM。在嚴格阻斷條件下，AB101之總體結合減少，如MFI減少所表明。
CD163為來自單核球/巨噬細胞譜系之細胞標記物。CD163在活體外分化MDSC上的表現已報導為雙峰。假設AB101之雙峰結合可能與CD163表現相關。為了測試此假設，產生活體外MDSC(參見實例 11 )與抗CD163 (BioLegend 333611)共染色且與AF647偶聯之AB101共染色，如實例 8 中所述，且藉由FACS分析結合。細胞首先圈選為CD163高或低且接著檢查與不同濃度之AB101或人類IgG1同型對照的結合。AB101抗體正結合的細胞亞群為CD163Hi 細胞。參見圖 2 。實例 2 - 自體單核球及 T 細胞的 分離
此實例顯示自體單核球及T細胞之分離。使用此項技術中常用的技術獲得人類單核球及T細胞。在血小板去除術收集過程期間，自截留於整合式腔室(稱為LeukoReduction系統(LRS)腔室)內的白血球(WBC)中分離出人類單核球及T細胞。藉由標準密度梯度離心(Ficoll™Paque Premium 1.073，GE Healthcare第17-5449-52號)，自LRS樣品純化周邊血液單核細胞(PBMC)。丟棄上清液，且使集結粒再懸浮於20 mL EasySep™緩衝液(StemCell Technologies第20144號)中，對PBMC計數且進一步分離單核球及T細胞。
使用EasySep人類單核球分離套組(Stem Cell第19359號)，依據製造商說明書分離單核球。
分別使用人類CD3+ T細胞分離套組(StemCell 19051)、EasySep™人類CD4+ T細胞分離套組(StemCell第17952號)、EasySep™人類CD8+ T細胞分離套組(StemCell第17953號)，依據製造商說明書分離全部CD3、CD4或CD8 T細胞。此等負向選擇套組使用抗體標記非所需的細胞類型進行移除，從而允許所需靶細胞自樣品分離。實例 3 - AB101 對 免疫抑制性骨髓細胞的特異性結合
為了評估特異性，測試與遠紅外螢光染料AF647偶聯之本發明抗體(抗體AB101)對不同細胞類型(包括如實例 11 及下文中所述產生的MDSC、免疫抑制性M2c及促炎性M1巨噬細胞)的結合。另外，評估來自健康供者之PBMC之單獨免疫群體的抗體結合。此等研究中之每一者使用至少3位個別供者。使用菲科爾梯度(Ficoll gradient)、使用標準程序自血液分離出PBMC。為了區分免疫細胞群，接著用造血譜系標記物(CD45-BV421 (BD 642275).CD3-BV510 (BD 563109)、CD11c-PE-Cy7 (BD 561356)、CD14-FITC (BD 347493)、CD20-APC-Cy7 (BD 562643)、CD56-PE (BD 347747)及CD66c (BD 551478)將PBMC細胞染色。單獨的譜系群體進一步藉由以下表現模式表徵且評估其對AB101的結合：T細胞CD45+ CD3+ ；B細胞CD45+ CD20+ ；單核球CD45+ CD14+ 、NK細胞CD45+ SSC低 CD14- CD3- CD56+ ；顆粒球CD45+ SSCHi CD14- CD66+ ；及樹突狀細胞CD45+ CD14- CD66- CD11c+ 。亦評估抗體對人類初級非免疫細胞(Lonza)的結合，包括小氣管上皮細胞(SAEC，#CC-2547)、腎近端小管上皮細胞(RPTEC，#CC-2553)、肺微血管內皮細胞(HMVEC，#CC-2527)、臍靜脈內皮細胞(HUVEC，#C2519A)、主動脈平滑肌細胞(AOSMC，#CC2571)及角質細胞(#00192627)。此等細胞係根據製造商說明書、在細胞類型特異性培養基及條件下培養直至60-70%匯合，接著收集以藉由流式細胞術測試抗體結合(圖 4 及圖 5 )。
活體外單核球MDSC係由分離的單核球藉由標準方法產生：第0天，以1.5×105 /cm2 將單核球接種於RPMI 1640 (Hyclone SH30027.02，無血清)中，在5% CO2 及37℃下培育1小時，接著用預溫熱的RPMI洗滌，隨後將MDSC培養基(RMPI + 10% FBS (Hyclone SH30070.03) + 50 ng/mL GM-CSF (R&D Systems 215-GM-010) + 50 ng/mL IL-6 (R&D Systems 206-IL-010)，每個T75燒瓶20 mL)添加至細胞中。接著使細胞在5% CO2 、37℃下培養7天而不更換培養基。7天後，如下收集細胞：用PBS (Hyclone SH30028.03) + 2 mM EDTA洗滌2次，接著以每個T75燒瓶15 mL添加巨噬細胞冷拆離溶液(PromoCell C-41330)，隨後在2-8℃下培育40分鐘。藉由對著手掌輕拍燒瓶而使細胞移位，收集且用PBS + 2 mM EDTA 1:1稀釋。藉由以450×g離心15分鐘而使細胞在錐形管中集結，用PBS + 2 mM EDTA洗滌一次，計數且以每毫升1x107 再懸浮於FACS阻斷緩衝液(寬鬆的染色條件為PBS + 1% FBS + 0.1 µg/mL Fc阻斷液(Abcam Ab90285)，或嚴格的染色條件為PBS + 1% FBS + Fc阻斷液及+ 0.01 µg/mL CDR阻斷液(針對FcR CD16、CD32及CD64的抗體；分別為BD Biosciences 556617，557333及555525))。細胞在室溫(RT)下在FACS阻斷緩衝液中培育20分鐘(min)，接著在4℃下培育30分鐘。接著用FACS緩衝液 + 5% BSA (Sigma A3059)將細胞稀釋至1x106 個細胞/毫升且將40 µL細胞(4x104 個細胞)等分至各孔中用於染色。將初級抗體(20、6、2、0.75、0.25、0.08及0.02 µg/mL的AB101或6 µg/mL的人類IgG1同型對照)添加至細胞中且在室溫下培育90分鐘。細胞用每孔250 µL FACS緩衝液 + 5% BSA洗滌3次。在FACS緩衝液 + BSA + e780活性染料(1:1000稀釋)中1:250製備二級APC山羊抗人類IgG (Jackson IR 109-136-097)抗體且添加至細胞中(每孔50 µL)。在4℃下培育45分鐘之後，細胞用250 µL FACS緩衝液洗滌3次。細胞接著在室溫下、在每孔100 µL 4% PFA中固定10-15分鐘，用250 µL FACS緩衝液洗滌一次，以650×g集結5分鐘，接著再懸浮於100 µL FACS緩衝液中以便藉由流式細胞術分析。
AB101抗體結合至人類免疫抑制性骨髓細胞(M2c巨噬細胞及單核球性MDSC)，如圖 3 所示，該圖繪製了AB101或同型在M2c、M1及M0上染色的MFI。AB101抗體不結合至B、T及NK細胞，以及顆粒球，如圖 4 中所說明，該圖顯示AB101在T、B及NKT細胞、嗜中性球、單核球及樹突狀細胞(黑色曲線)上的染色(相較於同型對照(灰色曲線))；且不結合至非免疫細胞，諸如SAEC、RPTEC、HMVEC、HUVEC、AOSMC及角質細胞，如圖 5 中所示。因此，AB101抗體特異性結合至表現CD163的免疫抑制性骨髓細胞而不影響其他免疫或非免疫細胞。實例 4 - AB101 FcNull 抗體使 CD163 多肽發生免疫沈澱
此實例顯示使用IgG1序列包含AB101可變域的FcNull抗體使CD163發生免疫沈澱，該序列經修飾以基本上減少抗體對Fc受體的結合(Fc剔除式)，該抗體表示為AB102，其包含含有SEQ ID NO：9的輕鏈及含有SEQ ID NO：11的重鏈。免疫沈澱(IP)係基於Klockenbusch及Kast, J Biomed Biotechnol論文ID 927585 (2010)執行。在較經典的交聯IP方法中，在多聚甲醛(PFA)固定劑之前，或在雙(磺基丁二醯胺基)辛二酸酯(BS3)交聯、隨後進行IP之前，添加抗體。
對於涉及使用PFA方法進行交聯的IP而言，自人類血液中分離出單核球且接著使用實例 2 及實例 11 之方案極化成M2細胞，使M2巨噬細胞在巨噬細胞拆離溶液(巨噬細胞拆離溶液DXF；PromoCell，第C-41330號)一起在37℃下培育約10分鐘之後自培養盤拆離，在此期間細胞呈圓形且開始拆離。緊拍燒瓶以促進細胞拆離。拆離之後，藉由向細胞中添加FACS緩衝液來淬滅巨噬細胞拆離溶液。使細胞以300×g集結10分鐘且移除上清液。使細胞集結粒再懸浮於30 mL含有5% BSA (w/v)及1 mM EDTA (pH 8.0)之PBS中且在冰上培育30分鐘。
將細胞分成6個等分試樣，每個等分試樣15×106 個細胞(每個等分試樣5 mL)且向各等分試樣中添加生物素化抗體。兩個等分試樣接受50 µg各種小鼠IgG1抗hCD163 (R&D，第MAB1607號)，兩個等分試樣接受100 µg各種同型對照抗體ISO2 (Fc剔除式構架)且兩個等分試樣接受100 µg各種測試抗體AB102 (IgG1序列中包含AB101可變域，該序列經修飾以基本上減少抗體對Fc受體的結合(Fc剔除式))。使細胞在4℃下培育1小時(hr)，偶而藉由倒置管來輕輕混合。使細胞以300×g集結5分鐘且用PBS-EDTA洗滌3次且接著再懸浮於5 mL PBS (不含鎂或鈣；HyClone，第SH30028.02號)中。向各管中添加多聚甲醛(PFA；5 mL 0.8%)，最終PFA濃度為0.4%。在輕輕搖盪下，在室溫下，在PFA中培育細胞5分鐘。藉由800×g離心5分鐘使細胞集結且移除上清液。使細胞再懸浮於含有1.25 M甘胺酸之10 mL冰冷PBS中以淬滅。以800×g使細胞集結5分鐘且再懸浮於冰冷PBS中。以800×g使細胞集結5分鐘且再懸浮於含有1×蛋白酶抑制劑(ThermoFisher Scientific，第89900號)的1.0 mL RIPA緩衝液中。將細胞在冰上培育2小時，且接著使其通過2 mL Dounce均質器15次。
使細胞溶解物在懸掛式桶離心機中旋轉以使細胞核集結，且IP使用上清液。蛋白質溶解物(50 µL)留作輸入溶離份且將2.0 mL含有1×蛋白酶抑制劑的冷PBS添加至剩餘上清液中。向各樣品中添加Dynabeads MyOne抗生蛋白鏈菌素(250 µL)( ThermoFisher Scientific ， 第 65601 號 ) 且使其在4℃下旋轉隔夜。次日，使用StemCell磁鐵收集珠粒且移除上清液。在4℃下用5 mL Paro緩衝液I、5 mL Paro緩衝液II及5 mL Paro緩衝液III依序洗滌珠粒5分鐘(Oncotarget. 2017；8(7)：11105-11113)。珠粒接著用冷PBS洗滌3次且最後再懸浮於100 µL PBS中且在-80℃下冷凍。
藉由質譜法分析珠粒。此分析通常根據Yan等人,Mol Cell Proteomics 10(3):M110.005611 (2011)所述的方法執行。在此方法中，逆轉甲醛交聯及自抗生蛋白鏈菌素珠粒溶離蛋白質係使用6 M胍、150 mM Tris緩衝液(pH 8.3)、在60℃下、在不斷攪拌下進行3小時。使上清液在具有10 mM參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)及50 mM氯乙醯胺(CAA)之相同緩衝液中、在95℃下變性、還原及烷基化10 min。接著將樣品稀釋10倍且在37℃下各自用1.3 µg胰蛋白酶消化隔夜。藉由C18濾筒純化肽。自C18濾筒溶離一個AB102 IP複本及一個抗CD163 IP複本用於直接MS/MS分析。將一個AB102 IP複本及一個抗CD163複本與0.1 M甲醛-d2、0.4 M氰基硼氫化鈉一起於PBS緩衝液pH 7.5中培育一小時以經由重同位素二甲基化(d4)進行標記，且ISO2 (Fc剔除式) IP的兩個複本均與0.1 M甲醛、0.4 M氰基硼氫化鈉一起在PBS緩衝液pH 7.5中培育一小時以經由C18濾筒上發生的輕同位素二甲基化(d0)進行標記。接著用0.1%三氟乙酸(TFA)洗滌C18濾筒且藉由80%乙腈(ACN)溶離。將d0/d4二甲基化肽再懸浮於緩衝液A (20% ACN，0.1% TFA)中且接著混合。使用內部製備的微毛細管HPLC強陽離子交換管柱(SCX)(200 mm×20 cm；Proteomix SCX 3 µm，Sepax Technologies)將肽分級分離。將肽負載於經緩衝液A平衡之微毛細管管柱上且用緩衝液A洗滌。所結合的肽用20 μL含有30%、50%緩衝液B (800 mM甲酸銨，20% ACN，pH 2.8)的緩衝液A溶離，隨後使用緩衝液D (0.5 M乙酸銨，50% ACN)進行20 μL的溶離。所有樣品均藉由Speed-Vac乾燥且藉由Thermo-Oritrap-Fusion直接分析。藉由Comet搜尋引擎(https://sourceforge.net/projects/comet-ms/)、針對人類UniProt資料庫搜尋光譜。對於去甲基化標記而言，使用N端及Lys側鏈上之28.03 Da (用於d0二甲基化)及32.06 Da (用於d4二甲基化)之不同修飾。
使重同位素/輕同位素樣品通過串聯HPLC管柱(使用強陽離子交換管柱(200 mm×20 cm；Proteomix SCX 3 µm，Sepax Technologies))且使用Thermo-Oritrap-Fusion經歷MS/MS。對於經重同位素及輕同位素標記的樣品而言，僅包括完全甲基化的光譜。鑑別出其中所有肽均含有重同位素的八十九種蛋白質，表明蛋白質鑑別於AB102 IP中，而非陰性對照中。在AB102 IP特有之89種蛋白質中，認為12種似乎真實地存在於細胞表面上：CD163、RIPK1、NEUA、SLC31、LRP8、SLIT1、RAF1、ILK、ATRN1、MCA32、FNBP2及LRRN3。發現一種另外的蛋白質TNR5具有兩種重同位素甲基化肽及一種未甲基化肽(IP起源未知)，表明其亦可為AB102 IP獨有的。
來自一個AB102 IP複本及一個對照抗CD163 IP複本的肽藉由質譜法個別地分析。在AB102 IP中所鑑別的360種蛋白質中，其中45種作為潛在的膜結合或分泌蛋白質而具治療作用。在其他資料集所鑑別之蛋白質中，AB102 IP中發現以下各者：CD163、半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3，及肽基-脯胺醯基順反式異構酶A (PPIA)。此資料集中亦鑑別出已報導與CD163直接相互作用的酪蛋白激酶IIb。
對於使用BS3方法、藉由交聯進行的IP而言，藉由將上清液自燒瓶收集至250 mL離心管中來收集巨噬細胞。向各燒瓶中添加巨噬細胞冷拆離溶液(30 mL)且在4℃下培育45分鐘。接著用刮擦器刮擦燒瓶且將細胞收集至250 mL離心管中且以650×g離心10分鐘。抽吸培養基，使細胞集結粒留在管中。接著將細胞再懸浮於20 mL冷PBS + 2 mM EDTA中。
接著使用PBS + 2 mM EDTA將細胞稀釋至1x107 個細胞/毫升且分成三種體積：40%、40%及20%總體積。將AB102 (2.5 mg)添加至40%溶離份之一中。將FcNull構架的抗PDL1抗體(2.5 mg)添加至作為陽性對照的另一個40%溶離份中。將同型對照物(FcNull構架的ISO2，1.25 mg)添加至作為陰性對照的20%溶離份中。各溶離份在4℃下、在輕輕混合下培育2小時。接著使其在650×g下離心10分鐘且小心傾析上清液。使集結粒各自再懸浮於15 mL PBS + EDTA中且接著以650×g離心10分鐘。接著重複此洗滌步驟。接下來小心地移除洗滌緩衝液而不擾亂集結粒。使來自40%溶離份之集結粒再懸浮於2 mL交聯緩衝液中。使來自20%溶離份之集結粒再懸浮於1 mL交聯緩衝液中。將儲備濃度的50 mM BS3溶解於70 µL超純水中，每個小瓶各8 mg。將BS3 (60 µl/mL細胞)添加至再懸浮的各細胞溶離份中直至最終濃度為3 mM BS3，且藉由渦旋將各細胞溶離份輕輕地混合。接著在冰上培育細胞溶離份1小時，每10分鐘渦旋混合。BS3培育之後，將15 mL淬滅溶液直接添加至細胞中且在室溫下培育15分鐘。使細胞在1200×g下離心15分鐘，且小心傾析淬滅緩衝液。如先前所述，集結粒用PBS + EDTA洗滌1次。接著藉由將20 mL溶解緩衝液(Pierce™ IP溶解緩衝液#87788)添加至各40%溶離份中及將10 mL添加至20%溶離份中且隨後在冰上培育15分鐘來溶解細胞。接著以13,000×g使細胞溶解物在4℃下離心10分鐘。
製備MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare Life Sciences，第17543801號)，用於對所製備的細胞進行IP及蛋白質純化。無菌的Mab Select Sure用20個管柱體積(CV)的無菌PBS平衡。AB102及陽性對照樣品使用一百五十微升Mab Select SuRe且ISO樣品使用75 µL。隨後將無菌及經平衡之MabSelect SuRe樹脂轉移至50 mL錐形管中。離心之後，將上清液添加至具有所製備之MabSelect SuRe樹脂的管中。在4℃下，在翻滾的情況下培育樣品隔夜。次日，允許樣品在冰上沈降10分鐘。藉由移液管將MabSelect SuRe樹脂轉移至拋棄式滴柱中。用20個管柱體積的無菌PBS洗滌樹脂。溶離之前，將管柱置於收集管中且在Eppendorf台式微量離心機中以9,000 rpm離心30秒以移除過量液體。將塞子置於管柱底部。如下使樣品自樹脂溶離：將一個管柱體積的50 mM甘胺酸pH 2.5作為溶離緩衝液添加至被塞住的管柱中且利用移液管混合，接著使混合物在室溫下培育8分鐘。(自各樣品中移除總體積(樹脂及溶離緩衝液)的十分之一且保留用於藉由西方墨點分析測定交聯。參見下文)。藉由添加1/10體積的2 M Tris pH 8.0來中和剩餘樣品。藉由自管柱底部移除塞子且立即將滴柱置放於1.8 mL Eppendorf離心管中來收集溶離液。將管柱組合件在台式微量離心機單元中以9,000 rpm離心30秒。藉由將十分之一溶離液體積的無菌2 M Tris pH 8.0添加至溶離液溶離份中來中和溶離液。重複溶離方案以確保蛋白質完全移除。在-80℃下儲存溶離液溶離份直至西方墨點法證實交聯。 用於證實交聯之西方墨點分析
將保留之溶離液部分與Laemmli樣品緩衝液(BioRad，第161-0747號) + 10% 2-巰基乙醇混合。在90℃下加熱樣品10分鐘。將樣品負載於4-12% Bis-Tris梯度聚丙烯醯胺凝膠上。凝膠在200 V下運作80分鐘。負載之後，將凝膠轉移至PVDF西方墨點膜中且在4℃下、在25 V下運作隔夜。次日晨，在室溫下用SuperBlock (ThermoFisher Scientific，第37515號)阻斷墨點3小時。阻斷之後，用SuperBlock洗膜1次。西方墨點在4℃下用1:1000抗人類IgG HRP探測隔夜。次日，用PBST洗滌墨點4次，每次洗滌10分鐘。西方墨點用PBS洗滌1次歷時10分鐘。接著使用SuperSignal West Dura Extended Duration受質(ThermoFisher Scientific，第34076號)使西方墨點顯影。暴露後，西方墨點顯示清晰的超位移色帶，表示AB102發生陽性交聯。陽性對照抗體亦觀測到交聯色帶 如所預期，未觀測到ISO發生分子量位移。
接著用丙酮使樣品剩餘部分發生沈澱，在SDS-PAGE凝膠上運作，接著切除交聯色帶且準備用於質譜評估。將溶離液樣品(AB101、ISO，及上述陽性對照物)解凍。將溶離液體積的冷(-20℃)丙酮分四次添加至各樣品中。接著使樣品劇烈渦旋且在-20℃下培育1小時。樣品以15,000×g離心10分鐘。傾析上清液，小心不使集結粒碎裂。使集結粒在speed vac中乾燥5分鐘或直至液體蒸發。使集結粒再懸浮於每管15 µL中且混合直至溶解。合併各條件之溶離液。添加樣品負載緩衝液 + 10% 2-巰基乙醇且在90℃下加熱樣品5分鐘。保留五微升各樣品用於SYPRO Ruby蛋白質凝膠染色劑(ThermoFisher Scientific，第S12000號)分析。將全部剩餘體積之樣品裝載於4-12% Bis-Tris梯度聚丙烯醯胺凝膠上且在凝膠上、在200 V下運作80分鐘。自卡匣中移除凝膠且用質譜級水洗滌3x10分鐘。凝膠接著用安全染色藍(Safe Stain blue)染色1小時。傾析染色劑且接著藉由2次洗滌、每次洗滌30分鐘、用質譜級水使凝膠脫色。解剖刀及鑷子用乙醇(EtOH)廣泛噴塗，隨後自凝膠切除交聯色帶且置於無菌Eppendorf管中。管用足夠的無菌超純水填充以覆蓋凝膠區段，堆積於濕冰上且裝運於MS Bioworks。
藉由MS Bioworks執行質譜分析。對於質譜法而言，使用ProGest機器人(DigiLab)、如下藉由凝膠內消化來處理所有每次提供的樣品：首先用25 mM碳酸氫銨洗滌，隨後用乙腈洗滌，在60℃下用10 mM二硫蘇糖醇還原，隨後在室溫下用50 mM碘乙醯胺進行烷基化，在37℃下用胰蛋白酶(Promega)消化4小時，且接著用甲酸淬滅，合併消化物且分析而不進一步處理。經消化的各樣品接著藉由奈米LC-MS/MS、使用與ThermoFisher Fusion Lumos介接的Waters M類NanoAcquity HPLC系統加以分析。將肽負載於捕集管柱上且在75 μm分析管柱上以350 nL/min溶離；兩個管柱均裝填Luna C18樹脂(Phenomenex，第00C-4041-E0號)。質譜儀係在資料相關模式下操作，對於MS及MS/MS而言，Orbitrap在60,000 FWHM及15,000 FWHM下操作，循環時間3秒。致高級峰測定(Advanced Peak Determination)。每個樣品使用4個小時儀器時間。藉由MS Bioworks進行資料處理時，使用具有以下參數之Mascot (Matrix Science)的本地複本搜尋資料：酶：胰蛋白酶/P；資料庫：SwissProt Human (正向及反向串聯加共同潛在污染物)；固定修飾：胺甲醯胺基甲基(C)；可變修飾：氧化(M)、乙醯基(N端)、Pyro-Glu (N端Q)、去醯胺化(N/Q)；質量值：單同位素；肽質量容限：10 ppm；片段質量容限：0.02 Da；及最大遺失裂解數：2。將Mascot DAT檔案輸入Scaffold(蛋白質組 軟體)解析驗證、過濾且建立每個樣品的非冗餘清單。以1%蛋白質及肽FDR過濾資料且每種蛋白質需要至少兩種獨特肽。將光譜豐度係數(SAF)換算成標準化光譜豐度係數(NSAF)，其用於估算指定樣品內之蛋白質的相對豐度，及指定蛋白質在樣品之間的相對豐度。
得自MS Bioworks之BS3交聯資料中所觀測到之蛋白質的檢查不支持涉及PFA之上述IP中所鑑別的完整標靶清單。重與輕同位素資料中均發現半乳糖凝集素-3，輕同位素資料集中的表示更大。重同位素與輕同位素資料中均發現半乳糖凝集素-1，僅3/5肽經重同位素標記。未觀測到LILRB2。未觀測到uPAR。重同位素與輕同位素資料中均發現PPIA，兩者的表示近似相等。圖 6A 顯示AB102的主要20種標靶。圖 6B 顯示AB102的主要細胞表面標靶。圖 6C 顯示AB102的主要細胞表面標靶與同型陰性對照(ISO)的比較情況。在使用BS3交聯連接子之AB102免疫沈澱的細胞表面蛋白中，CD163具有最高的光譜豐度係數(SAF)。使用AB102，藉由PFA與BS3方法均使CD163免疫沈澱。SAF = 相對於各標靶之蛋白質尺寸(分子量)標準化的光譜計數，且圖 6A 及圖 6B 中的SAF值為自各標靶之同型對照之SAF扣除的AB102值。實例 5 - FcNull 構架的 AB101 抗體使 CD163 糖型發生免疫沈澱
糖基化為影響蛋白質構形、穩定性及功能的經高度調控之轉譯後修飾，且其在建立蛋白質-蛋白質相互作用(亦即，配位體結合至其同源受體)方面起關鍵作用。AB102抗體及由此可推及AB101對CD163的不同較高分子量糖型具有特異性，其潛在地影響CD163與免疫抑制巨噬細胞之活性所必需之其他蛋白質的相互作用。
AB101 FcNull抗體的IgG1序列包含AB101可變域，該序列經修飾以基本上減少抗體對Fc受體的結合(Fc剔除式)，且該抗體表示為AB102。藉由西方墨點法及SYPRO Ruby蛋白質凝膠染色劑分析時，將12 µL具有10% 2-巰基乙醇的4x NuPAGE LDS樣品緩衝液(ThermoFisher，第NP0007號)添加至25 µL得自實例 4 的PBS珠粒等分試樣中且在95℃下培育25分鐘。在4-12% Bis-Tris梯度聚丙烯醯胺凝膠上運作樣品。為了直接目測，使用SYPRO Ruby蛋白質凝膠染色劑、根據製造商說明書將凝膠染色。對於西方墨點法而言，在4℃下、在20 V下將蛋白質轉移至PVDF膜隔夜。次日晨，將膜在5.0 mL SuperBlock (ThermoFisher，第37515號；無Tween 20)中阻斷1小時。將濃度為1 µg/mL的初級抗CD163抗體(山羊IgG多株抗體；R&D，第AF1607號)添加至膜中。初級Ab培育約3小時(在室溫下搖盪)之後，用約5 mL PBST洗膜3次，每次洗滌5分鐘。洗滌之後，將5 mL含有1:10,000 (v/v) HRP偶聯抗山羊F(ab')2 特異性二級Ab (不同供應商)的SuperBlock(無Tween 20)添加至膜中且在室溫下培育約1小時。與二級Ab一起培育之後，用5 mL PBST洗膜3次，每次洗滌約5分鐘。使用FotoDyne Analyst Luminary Convertible透照儀FX工作站，根據製造商說明書，使用SuperSignal West Dura延長期受質使膜成像。
如圖 7 中所示，AB102使CD163的不同較高分子量糖型發生免疫沈澱。由箭頭指示的呈二重峰的色帶似乎為CD163之不同糖型。實例 6 - AB101 結合至人類、但不結合至小鼠重組 CD163 蛋白
此實例顯示AB101結合至人類、但不結合至小鼠重組CD163蛋白。使用ELISA測定AB101對His標記之人類重組CD163 (R&D Systems，第1607-CD-050號)及鼠類重組CD163 (R&D Systems，第7435-CD-050號)蛋白質的結合。重組蛋白於PBS稀釋至5 µg/mL且以每孔25 µL添加至384孔高結合ELISA盤(Greiner Bio-One，第781061號)中且在4℃下培育隔夜。使用BioTek ELx405 Select微量盤洗滌器(洗滌程式ELISA_384_PBS_3x_wash)，用PBS將培養盤洗滌三次，且接著在室溫下用每孔90 µL阻斷緩衝液(2%脫脂乳粉/PBS + 0.05% Tween 20)阻斷1小時。
阻斷之後，向培養盤中添加每孔25 µL初級抗體且在室溫下培育1小時。測試抗體為AB101；對照抗huCD163抗體為鼠類IgG1構架的市售抗體(R&D Systems，#MAB1607)；同型對照為具有已知特異性的專有mAb，其具有人類IgG1、人類FcNull及鼠類IgG1構架。初級抗體結合之後，使用EL405x (洗滌程式ELISA_384_PBS_3x_wash)，用PBS洗盤三次。抗hu CD163的二級抗體為山羊抗小鼠IgGF(ab)'2 HRP (Jackson Immunoresearch，第115-035-072號)，且AB101及AB102的二級抗體為山羊抗人類IgG F(ab)'2 HRP (Jackson Immunoresearch，第109-035-097號)。二級抗體於2%脫脂乳粉/PBS中1:2500稀釋且各別盤每孔添加25 µL且在室溫下培育1小時。使用EL405x (洗滌程式ELISA_384_PBS_4x_wash)，用PBS洗盤四次。移除最終洗滌液之後，添加每孔25 µL純淨Ultra-TMB且將培養盤在室溫下避光培育10-15分鐘。顯影之後，藉由每孔添加25 µL 0.3 M HCl來中止反應且使用SpectraMax M5e儀器在450 nm下讀盤。
如圖 8 中所示，AB101、AB102及對照CD163抗體在此分析中結合至huCD163，而同型對照未顯示明顯的結合。AB101與對照抗huCD163抗體皆不結合至鼠類重組CD163，而市售抗muCD163抗體的結合如所預期(圖 9 )。實例 7 - 多株抗 CD163 抗體阻斷 AB101 對 M2c 巨噬細胞 的 結合
此實例顯示多株抗CD163抗體阻斷AB101對M2c細胞的結合。為了檢查AB101對M2c細胞上之CD163結合的特異性，使用針對人類CD163的市售多株抗體執行阻斷實驗。
將所收集的M2c細胞再懸浮(1百萬個細胞/100 µL)於FACS緩衝液(含有2 mM EDTA的PBS)(ThermoFisher第15575-038號)中且添加適當體積的人類Fc阻斷液(每百萬個細胞10 µg人類重組Fc阻斷液)。在室溫下培育細胞20分鐘。山羊抗huCD163多株抗體(R&D，#AF1607)及山羊對照多株抗體(Sigma，#PP40)以200 µg/mL的最終濃度添加且在室溫下培育1小時。細胞用FACS緩衝液稀釋至1百萬個細胞/毫升的最終體積且轉移40 µL/孔至v形底聚丙烯不透明96孔盤中。
添加經Alexa Fluor® 647標記的AB101及經APC標記的抗huCD163 (R&D Systems，#FAB1607A)抗體，且在4℃下培育細胞90分鐘。藉由使用multidrop將250 µL含有5% BSA的FACS緩衝液添加至各孔中來洗滌細胞，以350×g離心5分鐘且移除緩衝液。使用洗滌體積300 µL FACS緩衝液重複洗滌步驟2次。將50 µL含有活性染料e780 (1:1000稀釋)的FACS緩衝液添加至各孔中，且培養盤在室溫下培育20分鐘。接著藉由使用multidrop將250 µL FACS緩衝液添加至各孔中來洗滌細胞，以350×g離心5分鐘且移除緩衝液。將FACS緩衝液(75 µL)添加至各孔中且使用BD Canto II流式細胞儀進行樣品分析。
用多株抗CD163抗體預處理M2c巨噬細胞阻斷AB101抗體(圖 10 )及對照單株抗huCD163抗體(圖 11 )對M2c巨噬細胞的結合。用山羊對照多株抗體預處理M2c巨噬細胞不阻斷AB101抗體(圖 10 )及對照單株抗huCD163抗體(圖 11 )對M2c巨噬細胞的結合。實例 8 - 極化使 AB102 的 結合減少之後 ， siRNA 阻斷人類 M2c 巨噬細胞中之 CD163 基因表現
此實例顯示在極化使AB102的結合減少之後，siRNA阻斷人類M2c巨噬細胞中之CD163基因表現。此實例中使用的方法係基於Troegeler等人,Immunol Cell Biol 92:699-708 (2014)。
6孔盤中每孔分別接種1.5×106 個細胞的經分離單核球(來自三個供者)。第4天，移除培養基且將含有10% FBS、100 ng/ml M-CSF (Peprotech第300-25號)及50 ng/mL IL-10 (Peprotech第200-10號)的新製X-VIVO培養基添加至各孔中。第6天移除培養基，且用含有10% FBS的溫熱X-VIVO培養基洗滌細胞兩次。將一毫升的X-VIVO培養基 + 10% FBS添加至各孔中且將細胞返回至培育箱中，同時製備siRNA轉染溶液。
測試以下人類ON-TARGETplus siRNA-SMART池試劑(Dharmacon)：CD163 (目錄號L-007847-00-0005)；SCRAM (目錄號D-001810-10-05)；CD206 (目錄號L-011730-00-0005)；CD163L1 (目錄號L-008024-00-0005)；PPIA (目錄號L-004979-04-0005)；FCGR2A (目錄號L-014152-00-0005)；FCGR3A (目錄號L-016308-00-0005)；LGALS1 (目錄號L-011718-00-0005)；LGALS3 (目錄號L-010606-00-0005)；LILRB2 (目錄號L-020017-00-0005)；FCGR2C (目錄號L-027340-02-0005)；及UPAR (目錄號L-006388-00-0005)。
為了製備siRNA轉染物，利用ON-TARGETplus SMART siRNA池製備200 µM母料原液。將凍乾的寡核苷酸(各5 nmol)再懸浮於25 µL的1×Thermo siRNA緩衝液(Thermo第B002000號)中。在-80℃下儲存等分試樣。此等母料原液接著用細胞級超純水(Hyclone第SH3052902號)稀釋以製備20 µM工作原液。為了製備預混液(足夠用於6孔盤的6個孔)，將以下試劑混合：120 µL 20 µM siRNA池(最終濃度200 nM)、270 µL HiPerFect (Qiagen第301705號)，及2.64 mL溫熱RPMI (無FBS或其他添加劑)。siSCRAM (擾亂的siRNA)預混液含有以下量：720 µL 20 µM siSCRAM、1.23 mL HiPerFect及12.1 mL RPMI。合併混合物且在室溫下培育15分鐘，其中藉由倒置定期混合。臨用前，將管短暫離心，且將siRNA混合物(495 µL/孔)逐滴添加至細胞中。培養盤輕輕搖盪混合且接著在37℃下培育6小時。培育之後，添加2 mL含有10% FBS及IL-10 (最終濃度50 ng/mL)及M-CSF (Peprotech第300-25號；最終濃度50 µg/mL)的X-VIVO培養基。次日更換培養基(保留IL-10及M-CSF)以移除轉染劑及任何死細胞。
第8天，提離巨噬細胞且用抗體染色以便進行流式細胞術，或溶解用於RT-qPCR。
對於用於流式細胞術之彼等巨噬細胞，使用以下方法。使用巨噬細胞拆離溶液收集經siRNA處理的M2巨噬細胞，在拆離溶液中、在4℃下培育45分鐘，且接著輕輕地自培養盤刮下。用含有0.2 mM EDTA及0.1% HSA的冷PBS-/- (不含鈣及鎂的PBS；Hyclone第SH30028.02號)置換巨噬細胞拆離溶液。細胞以650×g短暫離心5分鐘且接著再懸浮於每百萬個細胞0.5 mL冷阻斷溶液(FACS緩衝液 + 10% NGS + 10 µg人類IgG Fc片段蛋白質(Abcam第ab90285號))中。將細胞計數且使用每mL平均1×106 進一步計算。在室溫下培育細胞15分鐘(增強FcR結合)，隨後在冰上培育30分鐘以便充分阻斷。未染色細胞的等分試樣留作補償型對照。e780活性染料(ThermoFisher eBioscience第65-0865-18號)以1:1000的最終稀釋度添加至剩餘部分中。將細胞等分至96孔盤(每孔40 µL)中，且將10 µL抗體溶液添加至各孔中。在FACS緩衝液中以100 µg/mL的初始濃度製備抗體且在FACS緩衝液中連續稀釋。添加抗體之後，使用抗體組(FcNull構架的AB101與AF647的偶聯物以及市售抗CD163與BV421的偶聯物[BioLegend第333612號])及同型組(FcNull構架的ISO2與AF647的偶聯物以及市售mIgG1與BV421的偶聯物)測試各組細胞。最終抗體濃度在20 µg/mL至0.3 µg/mL範圍內。細胞與初級抗體在4℃下培育1小時，接著以450×g集結且用150 µL PBS-EDTA洗滌三次。集結之後，接著將細胞再懸浮於100 µL 4%多聚甲醛(於PBS-/-中)且在室溫下培育15分鐘(避光)。細胞在固定之後，以650×g短暫離心5分鐘且用PBS-EDTA洗滌一次。將細胞再懸浮於100 µL PBS-EDTA中且在4℃下儲存整個週末(避光)。接著在BD Canto II機器上藉由流式細胞術分析細胞。
收集第二組細胞用於如下的RT-qPCR分析。收集細胞置於緩衝液RLT中且使用Qiagen RNeasy套組(Qiagen第74104號)(包括QIAshredders (Qiagen第79654號))分離RNA。溶離之後，使用SuperScript III第一股合成系統(Invitrogen第18080051號)、使用RNA製備cDNA。向1.5 µg RNA中添加不含核糖核酸酶的水直至10 µL的最終體積。向此物質中添加5 µL去氧核糖核酸酶I預混液((每個樣品) = 1.5 µL 10x去氧核糖核酸酶I緩衝液 + 2 µL不含核糖核酸酶的水 + 1.5 µL去氧核糖核酸酶I酶)。將樣品充分混合且在室溫下培育15分鐘。在培育之後，添加1.5 µL EDTA溶液以中止反應，在65℃下培育樣品10分鐘(以殺死酶)，且接著返回至冰中冷卻。向各樣品中添加dNTP (1.5 µL)及寡核苷酸-dT (1.5 µL)且充分混合。樣品在65℃下培育5分鐘且接著返回至冰中2分鐘。在冷卻樣品之後，移除13 µL樣品至新管中且向各管中添加+RT預混液(7 µL)。向剩餘7.5 µL樣品中添加-RT預混液(3.5 µL)作為陰性對照樣品。對於+RT預混液(每個樣品)而言：4 µL 5x第一股緩衝液、1 µL 0.1 M DTT、1 µL RNaseOUT，及1 µL SuperScript III逆轉錄酶(上文所提及之SuperScript III系統的所有部分)。對於-RT預混液而言，用不含核糖核酸酶的水置換SuperScript III酶。
將樣品充分混合且在25℃下培育5分鐘。培育之後，在50℃下培育樣品30分鐘，隨後在55℃下培育30分鐘，且接著在70℃下培育15分鐘。接著將樣品冷卻至4℃，隨後繼續進行且在冰上保持。在使用之前，將20 µL不含核糖核酸酶的水添加至+RT樣品中且將10 µL不含核糖核酸酶的水添加至-RT樣品中以稀釋cDNA用於RT-qPCR。
對於qPCR而言，將2 µL稀釋的cDNA與0.2 µL各引子(10 µM儲備液濃度)、2.6 µL不含核糖核酸酶的水及5 µL 2x SYBR Green qPCR混合物(BioRad第1725271號)混合。使用一系列經稀釋的未處理對照細胞製作標準曲線。在StepOne qPCR儀器上，使用預設配置(包括溫度熔融曲線)運作樣品。作為內部對照，使樣品相對於Rpl17a之擴增標準化。
如圖 12 中所示(代表三個重複實驗)，相較於擾亂的siRNA (siSCRAM)或未經siRNA處理的M2c巨噬細胞，用針對CD163的siRNA處理極化M2c巨噬細胞使AB102抗體的結合大幅度減少。實例 9 - siRNA 阻斷基因表現之後， AB102 結合 至 人類極化 M2c 巨噬細胞
此實例顯示在使用不同siRNA進行siRNA阻斷基因表現之後，AB102結合至人類極化M2c巨噬細胞。
自全血中分離出單核球，以每孔1.5×106 個細胞接種(6孔盤)，且在M2極化條件下培養，如以上實例 8 中所述。第6天，更換培養基且添加100 ng/mL M-CSF及50 ng/mL IL-10。
第8天，如先前所述用不同siRNA進行siRNA處理(參見實例 8 )。此日，抽吸培養基以移除轉染劑及任何死細胞，且添加新製培養基(仍含有IL-10及M-CSF)。第10天，對經siRNA處理的細胞執行FACS分析，且收集第二組細胞置於緩衝液RLT中用於RT-qPCR (參見實例 8 )。利用AB102結合幾何MFI，使資料相對於經siSCRAM處理的M2c標準化作為100%，且利用結合幾何MFI使同型對照抗體相對於未處理的M2c作為0%。
siRNA阻斷CD163基因表現使AB102抗體的結合減少。相比之下，在用siCD206、siCD163L1、siPPIA、siLGALS1、siLGALS3、siLILRB2或siUPAR阻斷基因表現之後，未發現AB102結合減少的跡象，但其中對於針對FCGR2A + FCGR3A (3個供者中有1個)、FCGR2C或FCGR3A之siRNA而言，稍微減少一些，如圖 13 中所示。實際上，AB102結合強度在若干siRNA條件下增加。RT-qPCR顯示標靶的基因表現被強烈阻斷。實例 10 - LPS 誘導 M2c 巨噬細胞之細胞表面上之 CD163 表現減少使得 AB101 對 巨噬細胞的結合減少
此實例顯示在LPS誘導CD163排出之後，AB101對M2c巨噬細胞的結合減少。如實例 2 中所述分離出單核球且以每孔1x104 個細胞接種於經組織培養物處理之平底96孔盤中的每孔100 µL X-VIVO培養基中，該培養基含有10% FBS、50 ng/mL M-CSF及50 ng/mL IL-10。第7天，半數細胞用10 ng/mL LPS (來自大腸桿菌O111:B4的脂多醣；Sigma第L5293-2ML號)處理24小時。根據前述方法，使用未偶聯初級抗體抗CD163 (R&D Systems MAB1607-100)及AB101的滴定液，使用各自八個連續5倍稀釋液(初始為200 nM)，對細胞進行標記。使用Alexa Fluor® 647 AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG (F(ab')2片段抗體)作為二級抗體(Jackson ImmunoResearch 109-606-006)。藉由流式細胞術分析細胞。
如圖 14 中所示，LPS處理所培養的M2c巨噬細胞使得AB101抗體與對照抗CD163抗體的結合均減少。實例 11 - AB101 阻斷骨髓細胞抑制 T 細胞活化 ( IL - 2 產生 ) 及增殖
此實例顯示AB101阻斷骨髓細胞抑制T細胞活化(IL-2產生)及增殖。
為了評估減輕M2巨噬細胞介導抑制T細胞活化的能力，用人類單核球產生M0、M1及M2c巨噬細胞。依據三種處理方案，將M0巨噬細胞與AB101或同型對照物一起培養：1)在M0極化為M2c巨噬細胞期間，在AB101 (或同型對照抗體)存在下(第5至7天，「極化期間」條件)；2)極化後，在AB101 (或同型抗體)存在下(第7天以後，「極化後」條件)；或3)條件1與2的組合(「極化期間」及「極化後」)。
產生M0巨噬細胞。第0天，將來自個別供體之單核球(如實例 2 中所述分離)以2.5×105 個細胞/孔接種於96孔組織培養盤中之M0培養基(X-VIVO培養基 + 10% FBS + 100 ng/mL M-CSF)中，且在37℃、5% CO2 下培育5天。
M0巨噬細胞極化為M1或M2c巨噬細胞。5日齡M0巨噬細胞係藉由將該等細胞在M0培養基100 ng/mL IL-10 (Peprotech第200-10號)中培養而極化為M2c，且藉由在M0培養基 + 100 ng/mL IFN-γ (Peprotech第300-03號)中培養而極化為M1。對於經AB101或IgG1同型對照物處理的細胞而言，彼等抗體以20 μg/mL添加於M2c培養基中。第6天，對於M1巨噬細胞而言，丟棄培養基且添加新製的M0培養基 + 100 ng/mL IFN-γ + 1 ng/mL LPS (來自大腸桿菌O111:B4的脂多醣；Sigma第L5293-2ML號)。
使用來自自體供者的PBMC分離CD8+ T細胞(如實例 2 中所述)。T細胞於X-VIVO + 10% FBS中接種於T75燒瓶中隔夜直至與巨噬細胞共培養之日(第7天)。
共培養之前，使用CellTrace™紫色增殖染料套組(ThermoFisher第C34557號)將T細胞染色，該套組允許流式細胞術使用染料稀釋液追蹤多代細胞。根據製造商方案執行CellTrace™染色。
第7天，自接種的巨噬細胞移除上清液，且用100 μL X-VIVO培養基 + 10% FBS + 0.5 μg/mL OKT3置換培養基。在37℃、5% CO2 下培育巨噬細胞1小時。自燒瓶收集T細胞且在AB101 (20 μg/mL)或同型對照(20 μg/mL)缺乏或存在下，以每孔100 μL、115,000個T細胞(1.15百萬/mL)再懸浮於平底96孔盤中用於「極化期間/後」及「極化後」處理。以100 μL的體積將T細胞添加至巨噬細胞中，得到每孔200 μL的最終體積及0.25 μg/mL OKT3的最終濃度。培養盤在37℃、5% CO2 下培育24小時。第8天收集上清液。使用CisBio HTRF IL-2套組(第62HIL02PEG號)，根據製造商方案量測IL-2含量，但其中有以下修改：在低體積384孔盤(Greiner Bio-One第784075號)中執行分析；所有體積減半；且短暫旋轉培養盤以將氣泡帶到表面。
如圖 15 中所示，AB101抗體阻斷骨髓細胞抑制T細胞活化的能力，如根據IL-2產生增加(T細胞刺激及增殖的標記)所證明。在極化(使用IL-10)期間(「極化期間」條件)，用AB101或同型對照物處理細胞。
第10天，將自各96孔盤共培養的T細胞轉移至V形96孔盤(ThermoFisher第249946號)，且藉由以300×g離心2分鐘而集結。將集結粒再懸浮於100 μL含有e780活性染料(eBiosciences第65-0865-14號)的PBS (0.5 μL/mL)中且在室溫下、在黑暗中培育10分鐘。
e780染色之後，藉由添加150 μL FACS緩衝液(1X PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS)洗滌細胞且以300×g離心2分鐘。移除上清液。將細胞集結粒再懸浮於每孔50 μL FACS阻斷液(人類TruStain FcX™ [Fc受體阻斷溶液；BioLegend第422302號]，5 μL/100 μL於FACS緩衝液中)，且在4℃下培育30分鐘。
抗體混合物(2次)係使用含有經APC標記之抗CD8 (BD Pharmingen第561953號)的FACS阻斷液、以1:50稀釋度(最終濃度為1:100)製備；且使用經FITC標記的抗CD14 (BD第347493號)、以1:50稀釋度(最終濃度為1:100)製備。此抗體混合物係以每孔50 μL添加且在冰上、在黑暗中培育30分鐘。用每孔150 μL FACS緩衝液洗滌染色劑。使細胞以300×g集結2分鐘。移除上清液，且使細胞在25 μL 4% PFA中、在冰上、在黑暗中固定15分鐘。在流式細胞儀上分析之前，每孔添加75 μL PBS。
如圖 16 及圖 17 中所示，在極化期間，在AB101處理的情況下，AB101抗體允許OKT3分別誘導CD4+ 及CD8+ T細胞增殖。另外，如圖 18 中所示，相較於同型抗體處理，極化後(與CD3+ T細胞共培養期間)(在圖上標識為「極化後」)或極化期間與極化後的組合(在圖上標識為「極化期間與極化後)」的AB101抗體處理引起IL-2產生增強。此等結果表明，AB101結合至M2c巨噬細胞減輕M2c介導抑制T細胞增殖及IL-2產生。AB101處理在使用IL-10極化期間是有效的，其克服組成性抑制信號，且在M2c極化之後是有效的，其代表活體內腫瘤微環境中之抑制TAM。實例 12 - M2c 表面標記物表現的減少
此實例顯示在AB101處理之後，M2c表面標記物表現減少。
分離出單核球(如實例 2 中所述)且在AB101或同型對照抗體存在下極化為M2c巨噬細胞(如實例 11 中所述)。接著根據實例 11 中所述之方案，針對表型分型抗體之表面標記物表現對細胞染色。用AB101或用同型對照抗體處理M2c巨噬細胞之後的巨噬細胞表面表現之標準化中值螢光強度(MFI)顯示於下圖中。使用e780可固定活性染料圈選活細胞。藉由將AB101處理之細胞的MFI除以經同型對照物處理之M2c細胞的MFI而計算標準化MFI。接著使樣品相對於M2c對照物百分比標準化，以顯示表面標記物表現的相對變化。將來自7個供者的資料取平均值且使用雙向ANOVA執行統計學分析。
如圖 19 中所示，在極化期間使用AB101抗體對M2巨噬細胞的「極化期間」處理使得CD16、CD64、鈣網蛋白及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15的表現減少。CD16(FcγRIIIa)(一種低親和力IgG受體)高度表現於M2抑制巨噬細胞上。CD64(FcγRI)(一種高親和力IgG受體)亦高度表現於M2上。唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15為涉及免疫抑制的含ITIM跨膜蛋白，其特異性表現於抑制巨噬細胞上。
未發現此等標記物在經同型對照抗體處理之M2c細胞中的變化。類似地，評估PD-L1、CD11b、CD14、CD32、CD163、CD206、HLA-DR、CD204、CD33、CD80、CD86、HLA-DR、DP、DQ、CD48、MARCO、LILRB2、CD172a (SIRPα)、IL10R及IL18R的表面表現，但在AB101處理的情況下，未觀測到此等標記物的表現有變化。實例 13 - 經 AB101 處理的 M2c 巨噬細胞使 OKT - 3 活化 T 細胞偏向 Th1 表型
此實例顯示經AB101處理的M2c巨噬細胞誘導經OKT3刺激的T細胞表現Th1相關表面標記物。資料表明，AB101處理M2c細胞抑制M2c介導的免疫抑制且調節抗腫瘤Th1細胞的活化。
腫瘤微環境中的骨髓細胞(腫瘤相關巨噬細胞(TAM))已顯示可協調衰減的免疫反應，促進腫瘤生長。通常，此效應可因使T細胞偏向較低的Th1/Th2比率(例如使T細胞偏向Th2表型)而可見。因此，吾人假設AB101將影響TAM與腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之間的交叉干擾，從而緩解TAM對TIL的抑制效應。
評估在AB101及同型對照物存在或不存在下的Th1與Th2-輔助細胞的比率。第5天(「前」=極化期間)及第7天(極化「後」，在共培養期間)用AB101或同型對照物處理M2c巨噬細胞。第7天開始，經處理的M2c巨噬細胞與OKT3刺激之CD3+ T細胞共培養3天以允許T細胞增殖。T細胞增殖之後，在第10天，自共培養物移除T細胞且用細胞表面標記物抗體組染色以測定Th1與Th2偏向比。表面標記物及細胞活性染色之後，使T細胞固定且藉由流式細胞術分析Th1或Th2標記物的存在。第1組用於測定Th1/Th2、Th17及Treg的比率，而第2組用於測定T細胞活化及耗竭。
獲得單核球且培養成巨噬細胞，且如先前實例中所述使巨噬細胞極化。
如實例 2 中所述，使用StemCell CD3+ 負向選擇套組，根據製造商說明書獲得CD3+ T細胞。
如實例 11 中所述，使巨噬細胞與T細胞共培養三天。
第10天，使用如下表4中所示的抗體混合物、根據實例 11 中所述之方法標記細胞。
使用剩餘每孔50 μL阻斷緩衝液製備抗體混合物2次，第1組抗體為1:50 (最終濃度為1:100)，且第2組抗體為1:50 (最終濃度為1:100)。表 4 . 用於評估Th1/Th2、Th17 (第1組)及耗竭/活化(第2組) T細胞的抗體混合物.
   第1組抗體： Th1/Th2、Th17 第2組抗體： 耗竭/活化
表面標記物 CD4 - PE (BD Pharmingen No. 55347) CD69 - PE-Cy7 (BioLegend第104511號) CD25 - APC (BioLegend第101909號) CD127 - BV510 (BD BIOSCIENCE第563086號) CXCR3 - PerCP-Cy5.5 (BioLegend第126513號) CD194 (CCR4) - BV421 (BioLegend第359413號) CD196 (CCR6) - BV510 (BioLegend第353423號) CD4 - PE (BD Pharmingen第55347號) CD8 - APC (BIOLEGEND第344721號) LAG3 - BV421 (BioLegend第369313號) OX40 - BV510 (BioLegend第745040號) PD-1 - PerCP-Cy5.5 (BioLegend第135207號) ICOS - PE-Cy7 (BioLegend第329805號) CTLA4 - FITC (eBioscience 11-1529-42)
標記物鑑別 Th1：CD4+ , CD69+ , CD196- , CXCR3+ , CCR4- Th2：CD4+ , CD196- , CXCR3- , CCR4+ Treg：CD4+ , CD25+ , CD127- Th17：CD4- , CD196+ , CXCR3- , CCR4+ 活化：ICOS+ , OX-40+ 耗竭：LAG-3+ , PD-1+ , CTLA-4+ Th T細胞：CD4+ Tc T細胞：CD8+
活體外骨髓細胞M2c細胞對於共培養的活化T細胞具有免疫抑制效應，其中M2c抑制T細胞增殖且使T細胞偏向Th2表型。
AB101處理使M2c細胞的抑制效應緩解，從而使經刺激的T細胞能夠產生IL-2、增殖(如實例 11 所示)，且使其偏向活化的Th1、促炎性、表型。圖 20 顯示相較於同型對照，AB101處理M2c細胞使Th1/Th2比率增加，表明AB101處理M2c細胞促使T細胞偏向Th1表型。此外，圖 21 顯示相較於同型對照，用AB101處理M2c細胞使CD4+ T細胞上的CD69表現增加，表明當M2c細胞用AB101處理時，AB101處理M2C細胞使得CD4+ T細胞偏向Th1表型。圖 22 及圖 23 顯示相較於同型對照，AB101處理M2c細胞分別使CD4+ T細胞上的ICOS及OX40表現增加，表明AB101處理M2c細胞促使增殖的CD4+ T細胞具有增強的活化標記物表現。實例 14 - 減少骨髓細胞抑制 CD19 - CD3 雙特異性 T 細胞 接合體介導 CD8 T 細胞 殺滅拉吉細胞
此實例顯示AB101處理減少骨髓細胞抑制CD19-CD3 BiTE介導CD8 T細胞殺滅拉吉細胞。使用雙特異性T細胞接合體(BiTE)抗體(針對人類CD19及人類CD3的雙特異性抗體；InvivoGen Bimab-hcd19cd3)，評估AB101相對於同型對照 抗體的腫瘤細胞殺滅。在(「極化」)期間的第5天及在極化(「後」)之後、在共培養期間的第7天，用AB101或同型對照物處理M2c巨噬細胞。第7天開始與T細胞共培養，持續3天，以允許T細胞增殖。第10天，自與巨噬細胞的共培養物中移除T細胞且隨後置於腫瘤細胞(+/- BiTE抗體)上培育以促進細胞毒性T淋巴球(CTL)與腫瘤細胞之間的接觸。用BiTE抗體處理後，將腫瘤細胞染色以便藉由流式細胞術量測存活率。
培養單核球，且使巨噬細胞極化，如實例 11 中所述。如實例 11 中所述獲得CD8+ T細胞。使用所述方法將巨噬細胞(25,000個細胞/孔)與CD8+ T細胞(115,000個細胞/孔)共培養三天。
第10天，使用實例 11 中所述之方法，用CellTrace紫將拉吉細胞(ATCC第CCL-86號)及K562 (ATCC第CCL-243號)細胞染色。接著以每孔100k個細胞將腫瘤細胞再懸浮於平底96孔組織培養盤中的M0培養基中。一些未染色及染色的細胞留作單一染色對照用於流動分析。
第10天，使用StemCell CD8負向選擇套組自T細胞/巨噬細胞共培養物中分離出CD8+ T細胞。將所回收的T細胞接種於拉吉細胞及K562細胞培養盤中，每孔100 μL。以10 ng/mL的最終濃度將雙特異性抗體添加至拉吉細胞及K562培養盤中，最終體積為每孔220 µL (不含BiTE的一些孔作為對照)。細胞在BiTE處理液中、在37℃、5% CO2 下培養隔夜。
第11天，將細胞置放於新V形底培養盤中且以300×g離心2分鐘。自所有培養盤收集上清液且轉移至新V形底96孔盤中，接著密封且在-80℃下儲存用於隨後的細胞介素分析。將細胞再懸浮於FACS緩衝液(PBS + 1% FBS)中，且用抗CD8、抗CD14 (排除非標靶細胞)及e780活性染料染色，如實例 11 中所述。染色之後，細胞用FACS緩衝液沖洗，使用4% PFA固定且再懸浮於PBS中用於流式細胞術分析。藉由將可固定的活性染料eFluor™ 780納入細胞內來評估經CellTrace紫標記之腫瘤細胞的腫瘤細胞死亡。eFluor™ 780染料呈陽性細胞的死亡百分比相較於無BiTE對照孔作圖。
AB101處理減輕M2c巨噬細胞的抑制效應，相較於同型對照，使T細胞增殖增加。相較於同型對照，增加的CTL在BiTE存在下使得拉吉腫瘤細胞殺滅增加，如圖 24 中所示。K562用作陰性對照且顯示+BiTE抗體殺滅沒有增加。實例 15 - 人類初級 M2c 巨噬細胞使抗體內化
第0天，以每孔1×105 個將單核球(參見實例 2 )接種於光學透明底的96孔組織培養盤中之100 μL (1×106 /mL) M0培養基中以分化成巨噬細胞。第5天，使培養盤渦旋以移去浮動細胞且輕輕地抽吸培養基。使巨噬細胞在每孔100 μL M2c培養基中極化為M2c，如先前實例中所述。
第6天，使用Alexa Fluor™ 647抗體標記套組(Invitrogen第A20186號)標記抗體。各種抗體(100 μg)在50 μL PBS中稀釋至2 mg/mL。所測試的抗體如下：AB101 huIgG1及AB102 huIgG1 ADCC剔除式；CD163小鼠單株IgG1抗體(R&D Systems MAB1607-100)；及同型對照：ISO1 huIgG1或ISO2人類Fc剔除式構架。
將來自套組的整瓶A-647羧酸丁二醯亞胺酯再懸浮於150 μL PBS中。將A-647溶液等分試樣(50 μL)添加至經稀釋抗體(現為1 mg/mL)的各管中，且在室溫下、在黑暗中培育混合物45分鐘。
藉由首先剪去底部且以4,100 rpm離心1分鐘以移除儲存緩衝液來洗滌Zebra脫鹽管柱(Thermo 87766)。管柱接著用300 μL PBS洗滌兩次(以4,100 rpm離心1分鐘)且用300 μL PBS洗滌一次(以4,100 rpm離心2分鐘)。將管柱置放於新琥珀色管中且個別地負載抗體。接著以4,100 rpm使管柱離心2分鐘，從而以1 mg/mL溶離經Alexa-647標記的抗體。
第7天，藉由輕擊自培養盤移除含有FBS的培養基且用250 μL冷PBS洗盤兩次，隨後添加90 μL含有20 µg/mL可阻斷Fc受體之未標記ISO1 IgG1抗體的X-VIVO培養基，用於經標記的AB101、ISO1及抗CD163抗體(R&D Systems MAB1607-100)染色，或添加不含未標記之ISO1阻斷液的培養基，用於AB102及ISO2染色。細胞在37℃、5% CO2 下培育30分鐘，隨後以5 μg/mL的最終濃度添加經標記的抗體。培育1小時之後，移除培養基且細胞用250 μL冷FACS緩衝液洗滌，隨後在室溫下、在黑暗中添加4% PFA (BD Cytofix/Cytoperm第554722號)維持10分鐘。如下製備細胞組分的對比染色劑：將每毫升2滴NucBlue™ (Molecular Probes第R37605號)及ActinGreen™ (Molecular Probes第R37110號)/mL添加至1x Perm緩衝液(BD Perm/Wash第554723號，於水中1:10稀釋)。輕擊培養盤以移除固定物且添加對比染色溶液(20微升/孔)。在室溫下、在黑暗中進行染色20分鐘。接著藉由添加每孔250 μL PBS洗滌細胞，移除且用每孔50 μL PBS置換。使用Cellomics儀器對細胞成像。
如藉由cellomics所測定，此等資料為細胞內的平均螢光值(意謂AF647的環平均強度)。根據DAPI染色的核(NucBlue)及FITC標記的細胞骨架(AcinGreen)界定且偵測細胞。圖 25 顯示至少4位個別供者的代表性結果。在所有情況下，同型對照抗體不發生內化，且AB102抗體內化的程度與市售抗CD163抗體相同(R&D Systems MAB1607-100)。AB101 (IgG1)抗體的內化超過AB102 (FcNull)或市售CD163抗體約2倍。實例 16-AB101 抑制人類肺癌異種移植模型中之腫瘤生長
在人類肺癌異種移植模型中活體內測試AB101之腫瘤生長抑制。在AB101處理之後，腫瘤尺寸及重量相比於對照組顯著減小，並且CD8+ T細胞之比例，以及脾中CD8+ T細胞上之T細胞活化標記物ICOS及OX40之表面表現相應增加。未觀測到關於CD4+ T細胞之差異。此等結果表明，AB101促進CD8+ T細胞活化及增殖，與先前實例中所示之活體外研究一致。此外，CD11b+ 細胞之比例增加。CD11b存在於單核球、巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞及自然殺手細胞上。綜合而言，此等發現表明AB101可具有增強免疫反應以控制腫瘤負荷的治療性應用。
為測定AB101之治療潛能，使用支持移植人類CD34+ 造血幹細胞及復原多譜系免疫細胞群之NSG-SGM3小鼠品系(The Jackson Laboratory)測試AB101活體內減少腫瘤生長之有效性。
A549 (人類肺癌，p53野生型)及NCI-H1975 (人類肺腺癌，p53突變型，p.R273H;)之冷凍等分試樣係購自ATCC (目錄號分別為CCL-185及CRL-5908)。使A549細胞在補充有10%胎牛血清(FBS；Corning，目錄號35-010-CV)及1%青黴素-鏈黴素(pen/strep，HyClone，目錄號SV30010)之F-12K培養基(ATCC編號30-2004)中生長。使H1975細胞在具有10% FBS及1% Pen/Strep之RPMI (HyClone，目錄號SH30096.02)中培養。細胞在37℃/5% CO2 下擴增多個繼代，隨後皮下注射至小鼠中。
NSG-SGM3小鼠移植有兩個人類臍帶血單元，如先前所述由The Jackson Laboratory進行：Shultz等人,Nat Rev Immunol 7(2):118-30 (2007) [PubMed：17259968]；Shultz等人,Nat Rev Immunol 12(11):786-98 (2012) [PubMed：23059428]；Ishikawa等人,Curr Top Microbiol Immunol 324:87-94 (2008) [PubMed：18481454]；Pearson等人,Curr Protoc Immunol ;第15章:第15.21單元(2008) [PubMed：18491294]。此等小鼠中之兩隻患病且安樂死。到達設施後，使此等小鼠適應新環境5天。在第6天對各小鼠之右側腹及左側腹進行刮毛。
在第7天，自培養物收集A549及H1975細胞，用PBS (無Ca2+ 或Mg2+ 之磷酸鹽緩衝鹽水；HyClone編號SH30028.02)洗滌3次且以5×106 個細胞/毫升之密度再懸浮於Corning Matrigel®膜基質(Fisher Scientific編號CB-40234C)中。以100 μL基質膠中5×105 個細胞之劑量，將A549細胞注射至各小鼠之右側腹中，並將H1975細胞注射至左側腹中。
注射後五天，藉由數位測徑規(Fisher Scientific編號NC0649232)量測腫瘤。一旦腫瘤達到50至75 mm3 (腫瘤體積=(W (2) × L)/2)，則小鼠接著使用基於網路之隨機化應用程式(https://www.randomizer.org/)隨機分組且分成每組7隻小鼠的2組(下文所示)： (1)同型對照抗體(ISO1 Hu IgG1)； (2) AB101抗體(Hu IgG1)；
小鼠在隨機分組當天開始且其後每三天接受抗體處理。各小鼠經由腹膜內注射在100 μL PBS中每次處理接受200 μg同型對照物或AB101。在星期一、星期三及星期五量測腫瘤尺寸，直至第26天。記錄展示致命發病病徵的任何小鼠且立即使其安樂死。在第26天處死小鼠。收集腫瘤及脾用於進一步分析。
對分離之腫瘤稱重且藉由移除脂肪、纖維及壞死區域且切割成2至4 mm之小塊進行處理。將經處理腫瘤添加至含有腫瘤解離酶混合溶液(小鼠腫瘤解離套組(Tumor Dissociation Kit, Mouse)；MACS Miltenyi Biotec，編號130-096-730)之gentleMACS C管(MACS Miltenyi Biotec，編號130-096-334)中。使用gentleMACS解離器(MACS Miltenyi Biotec，編號130-093-235)解離細胞且隨後在5% CO2 及95%濕度下培育30分鐘。使細胞集結，再懸浮於PBS中且使用100 μm細胞過濾器(Corning編號352360)過濾。藉由流式細胞術分析解離之單細胞。
處理脾且藉由按壓穿過細胞過濾器而解離成單細胞。使用10 mL注射器針筒頭部移除任何脂肪及纖維組織。使脾細胞集結且再懸浮於PBS中以藉由流式細胞術分析。
使用流式細胞術定量來自腫瘤及脾之骨髓及T細胞，其中抗體混合物組展示於下表 5 中。使用e780存活率染料(eBiosciences編號65-0865-14；1:500於PBS中)評估細胞存活率。在用初級或同型對照抗體染色之前，細胞在FACS緩衝劑(PBS+1% FBS+1 mM EDTA (Fisher Scientific編號15575-038))中在4℃下與e780一起培育10分鐘。隨後用200 μL FACS緩衝劑洗滌細胞，且在4℃下在25 μL Fc阻斷劑(FACS緩衝劑+5 μL/mL Fc阻斷劑(BioLegend編號422302))中阻斷30分鐘。向細胞中添加抗體染色劑(參見下表 5 ) (25 µL)且在4℃下在黑暗中再培育30分鐘。在FACS分析之前洗滌細胞3次。表 5. 抗體混合物組
骨髓第1 組 來源 來源編號
抗CD11b-APC BD Biosciences 550019
抗CD16 - PE BioLegend 302007
抗CD64 - 太平洋藍(Pacific Blue) BioLegend 305018
抗HLA-DR - PerCP-Cy5.5 BioLegend 361710
抗CD80 - FITC BioLegend 305206
抗LILRB2 - PE-Cy7 BioLegend 338711
骨髓第2 組 來源 來源編號
抗CD11b-APC BD Biosciences 550019
抗CD86 - BV510 BD Biosciences 563697
抗PD-L1 - BV421 BioLegend 329714
抗CD83 - PE-Cy7 BioLegend 305325
抗CD163 - FITC BD Biosciences 3563697
抗ICOSL - PE BioLegend 309403
T 細胞第1 組 來源 來源編號
抗CD4-FITC BioLegend 300505
抗CD194 (CCR4) - BV421 BioLegend 359413
抗CD196 (CCR6) - BV510 BioLegend 353423
抗CXCR3 - PerCP-Cy5.5 BioLegend 126513
抗CD69 - PE-Cy7 BioLegend 104511
抗CD25 - APC BioLegend 101909
抗IL-7Ra - PE BioLegend 135013
T 細胞第2 組 來源 來源編號
CD8-APC BD Biosciences 561953
抗LAG-3 - BV421 BioLegend 369313
抗OX40 - BV510 BD Biosciences 745040
抗PD-1 - PerCP-Cy5.5 BioLegend 135207
抗ICOS - PE-Cy7 BioLegend 329805
抗CTLA4 - PE BioLegend 106305
與同型對照抗體相比，AB101處理顯著減少A549及H1975腫瘤生長。圖 26 及圖 27 展示經30天分別針對A549及H1975標繪之腫瘤體積。箭頭指示注射抗體處理。各點表示7隻小鼠之平均量測值。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。統計顯著性係利用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)來計算。
在同型對照組中，A549及H1975腫瘤之體積隨時間增加。然而，在接受AB101處理之小鼠中，與同型對照組相比，A549腫瘤呈現更慢的生長，而H1975腫瘤在第17天展示消退且其後生長保持穩定。在D5隨機分組時，同型對照組及AB101之平均A549腫瘤體積分別為63.6 mm3 及63 mm3 ，且在D26，同型對照組之平均腫瘤體積為378 mm3 ，而AB101之平均腫瘤體積為198 mm3 。類似地，針對同型對照組及AB101，D5之H1975腫瘤體積分別為57.8及34.2，且在D26，同型對照組之平均腫瘤體積為164.4 mm3 ，而AB101之平均腫瘤體積為57.4 mm3 。
AB101處理顯著減小A549與H1975腫瘤之腫瘤尺寸。在D26切除腫瘤且稱重。AB101使A549腫瘤之尺寸相對於同型對照組減小49% (平均腫瘤重量：對於同型對照組為538.2 mg且對於AB101為273.0 mg，p=0.003)，且H1975腫瘤減小60% (平均腫瘤重量：對於同型對照組為217.2 mg且對於AB101為85.6 mg，p=0.0009)。
AB101處理顯著增加脾中總活細胞當中的CD8+ T細胞及骨髓細胞之比例。同型對照組的CD8+ T細胞平均百分比增加1.3至AB101的3.3，且CD11b+ 細胞平均百分比自同型對照組的2.1顯著增加至AB101的4。
AB101處理亦顯著增強脾中人類CD8+ T細胞上活化標記物的表現。CD8+ T細胞上ICOS表現之平均MFI自同型對照組的318增加至AB101的841，且OX40表現之平均MFI自同型對照組的586增加至AB101的1561。實例 17- 在 M2c/T 細胞共培養分析中 AB101 減輕對 T 細胞之 M2c 介導之免疫抑制
為了評價AB101是否可調節TME中之癌症介導之免疫逃避，與自體免疫抑制M2c巨噬細胞一起培養人類PBMC衍生之T細胞。在三種治療方案下評估拯救抗CD3 (OKT3)活化T細胞以免M2c介導之免疫抑制的AB101免疫調節活性，其中將T細胞增殖及IL-2產生作為治療功效之讀數。圖 28 展示實驗設計。
為判定AB101是否干擾M2樣腫瘤相關巨噬細胞之產生，在AB101或同型對照物存在下將M0巨噬細胞極化為M2c巨噬細胞(「前」方案)。洗滌處理抗體，隨後與T細胞共培養。為評價AB101處理是否拯救T細胞以免M2c介導之免疫抑制，在M2c巨噬細胞及AB101存在下使用抗CD3，或在M2c/T細胞共培養期間使用同型對照物活化T細胞(「後」方案)。為模擬活體內免疫療法，組合前及後方案(前/後)。
在第一組實驗中，藉由來自三個健康個體之人類單核球衍生之巨噬細胞及T細胞評價AB101對M2c極化之作用。在經AB101或同型對照物處理之自體M2c巨噬細胞存在下用OKT3活化CD4+ 及CD8+ T細胞。與單獨M2c巨噬細胞共培養之OKT3刺激之T細胞用於評估M2c介導之免疫抑制。與IFN-γ+LPS極化M1巨噬細胞共培養T細胞提供最佳T細胞活化之量度。無OKT3活化之情況下M2c/T細胞共培養物類似於休眠T細胞。圖 29 展示AB101處理使CD4+ 及CD8+ T細胞之增殖相對於同型對照組分別自7%顯著增強至54% (p＜0.01)及自21%顯著增強至83% (p＜0.05)分裂細胞。M1巨噬細胞及AB101處理之M2c巨噬細胞誘導類似程度之增殖。另外，圖 30 展示當相比於來自AB101處理或初始M2c組之經活化T細胞之IL-2分泌時，AB101前處理M2c巨噬細胞顯著增加來自所有三個研究個體之經活化T細胞的IL-2產生。來自與AB101處理之M2c巨噬細胞之共培養物的IL-2含量類似或高於與M1巨噬細胞的共培養物中所達成的含量。如所預期，在無OKT3活化之情況下與M2c共培養之T細胞未產生可偵測含量之IL-2。
隨後，評價AB101處理在前、前/後及後方案下對CD8+ T細胞/M2c共培養物的作用。用來自三個健康個體之PBMC進行實驗。來自3個研究個體之CD3+ T細胞在M2c巨噬細胞存在下用抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)活化。M2c巨噬細胞在極化期間(前，在共培養之前)用AB101 (20 µg/mL)、人類IgG1同型對照物(20 µg/mL)或單獨培養基處理。在抗CD3刺激之後72小時收集T細胞且藉由流式細胞術定量增殖。藉由對M2c、AB101及IgG1同型對照處理組進行鄧奈特式T3多重比較檢驗(Dunnett's T3 multiple comparisons test)來計算P值(p＜0.05，*；p＜0.01，** p＜0.001，***)。
圖 31 展示當與同型對照組相比時，AB101處理在極化期間及極化後方案下顯著增強CD8+ T細胞增殖(p＜0.05)。當與對應同型對照組值相比時，AB101極化期間及極化後方案分別使分裂CD8+ T細胞之百分比自23%增加至42%及自26%增加至47%。相比於同型對照物極化期間/極化後對照組之22%分裂CD8+ T細胞，在AB101前/後組中觀測到CD8+ T細胞增殖之最大增加，為49%分裂CD8+ T細胞(p=0.062)。
圖 32 展示個別研究個體之對應IL-2資料。當相比於單獨M2c及同型對照組時，AB101處理組中之所有三個個體均顯著增加CD8+ T細胞之IL-2產生。最高IL-2分泌藉由M2c/T細胞共培養物之極化期間/極化後組合處理實現。三種AB101處理方案之增殖及IL-2資料表明AB101不僅影響M2c細胞極化，且亦在T細胞/M2c共培養期間減輕M2c介導之免疫抑制。
圖 33 及圖 34 展示極化期間及極化期間/極化後AB101處理之編譯增殖資料。AB101對CD8+ T細胞之增殖的作用大於對CD4+ T細胞增殖的作用。AB101處理分別在極化期間(n=16，p＜0.001)及極化期間/極化後方案(n=13，p＜0.001)下相對於對應同型對照組值顯著增強CD8+ T細胞之增殖。當與同型處理之M2c巨噬細胞相比時，CD4+ T細胞回應於AB101極化期間及極化期間/極化後方案而增殖，其中分裂細胞百分比自31%增加至44% (前，n=18，p＜0.01)及自42%增加至49% (前/後，n=14，p＜0.05)。
圖 35 展示M2c/T細胞共培養分析中在M2c細胞極化期間用AB101處理亦顯著增強之T細胞之IL-2產生。極化期間處理AB101組中之T細胞產生顯著較高含量之IL-2，其中中值為292 ng/mL，為對應同型對照處理組(n=21，p＜0.0001)中之T細胞的104 ng/ml之幾乎三倍高。AB101極化期間/極化後處理產生333 ng/mL之T細胞之IL-2反應，比來自同型對照物處理之M2c/T細胞共培養物之227 ng/mL大50%；然而，此差異未達到顯著性。實例 18-AB101 在恢復與 M2c 巨噬細胞共培養之 T 細胞的 T 細胞增殖及細胞介素反應方面比 AB104 更強效
為判定AB101介導之免疫抑制之緩解是否需要與由M2c巨噬細胞表現之Fc受體之相互作用，在M2c/T細胞共培養分析中評價AB101-IgG4 (AB104)及AB101-IgG1Fcnull (AB102)同型。AB101 IgG1-Fc區結合至M2c巨噬細胞上之CD64、CD32及CD16，而IgG1Fcnull同型與Fcγ受體之結合最小。如同IgG1 Fc區，IgG4 Fc區對CD64具有奈莫耳親和力，但通常不結合於CD32或CD16 Fc受體。將AB101、AB102及AB104同型減輕對T細胞增殖之M2c介導之免疫抑制的能力與來自5個研究個體之細胞進行比較。
在M2c巨噬細胞存在下用抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)活化自4 (CD8+ T細胞)及5 (CD4+ T細胞)名人類個體分離之T細胞。M2c/T細胞共培養物在極化期間/極化後方案下用20 µg/mL指定AB101同型處理。單獨的M2/T細胞共培養物用作M2c介導之免疫抑制的對照物。在抗CD3刺激之後72小時收集T細胞且藉由流式細胞術定量增殖。符號表示個別研究個體。藉由比較指定處理組之成對雙尾t檢驗計算P值(p＜0.05，*；ns，不顯著)。
圖 36 展示當相比於IgG1同型對照組(52%至78% CD8+ T細胞；46%至65% CD4+ T細胞)及AB102 (52%至78% CD8+ T細胞；42%至65% CD4+ T細胞)時，AB101極化期間/極化後方案顯著(p＜0.05)增強抗CD3活化CD8+ 及CD4+ T細胞之平均增殖。當與各別同型對照組相比時，AB104及AB102處理僅略增強T細胞之增殖反應。僅AB104處理組中CD4+ T細胞之增殖反應達到顯著優於IgG4同型對照組(39至47%分裂細胞，p＜0.05)。
圖 37 展示當相比於IgG1同型對照組(40%分裂細胞，p＜0.05)及AB104處理(41%分裂細胞，p＜0.05)時，AB101極化期間/極化後方案對OKT3介導之CD8+ T細胞增殖具有強且顯著的刺激作用(70%分裂細胞)。另外，當相比於同型對照組(27%分裂細胞，p＜0.05)或AB104處理(20%分裂細胞，p＜0.05)時，AB101後方案展現顯著增強之CD8+ T細胞增殖(54%分裂細胞)。在極化期間/極化後或極化後方案中，相比於IgG4同型對照組AB104處理未顯著改良增殖反應。
在M2c/T細胞共培養(極化後方案)期間AB101處理減輕M2c介導之免疫抑制且誘導抗CD3活化之CD8+ T細胞的強效細胞介素反應。自3個研究個體分離之CD8+ T細胞在M2c巨噬細胞存在下用抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)活化。M2c/T細胞共培養物在極化後方案下用20 µg/mL之AB101、人類IgG1同型對照物、AB104、人類IgG4同型對照物及單獨培養基(M2c)處理。在抗CD3刺激之後72小時獲取上清液，且藉由基於磁珠之免疫分析定量細胞介素分泌。藉由比較指定處理組之成對雙尾t檢驗計算P值(p ＜0.05，*；p ＜ 0.01，**；p ＜ 0.001，***；ns，不顯著)。
圖 38 展示當相比於IgG1同型對照組時，AB101在所有研究個體中顯著增強IFN-γ及穿孔素含量。表 6 展示與IgG1同型對照組值相比，AB101處理組中之平均IFN-γ、穿孔素及IL-6含量自530增加至1600 pg/mL (IFN-γ)、210增加至1900 pg/mL (穿孔素)及203增加至690 pg/mL (IL-6)。另外，AB101處理在3個研究個體中之2個中恢復TNF-α分泌，其中相對於對應IgG1同型對照組值，自60 pg/mL顯著增加至830 pg/mL及自1 pg/mL顯著增加至120 pg/mL。如表 1 中所示，AB101極化期間/極化後方案藉由誘發針對穿孔素及測試之細胞介素之類似細胞介素含量來證實在極化後方案組中觀測到之結果。AB104不減輕任一處理組中之M2c介導之免疫抑制。所評價M2c共培養物中之IL-10含量在所有處理條件下處於分析之偵測下限。表 1 . AB101拯救CD8+ T細胞細胞介素反應以免M2c巨噬細胞介導之免疫抑制
CD8+ T 細胞之細胞介素分泌 [pg/mL]
細胞介素 對照組 極化期間/極化後方案 極化後方案
無抗體 AB101 AB104 AB101 AB104
M1 M2 抗體 同型 抗體 同型 抗體 同型 抗體 同型
IL-6 平均值 243 27 744 62 12 51 686 203 22 77
SEM 113 16 222 36 5 28 201 86 21 53
IL10 平均值 4 20 26 11 9 13 20 16 10 13
SEM 4 10 17 0 5 3 10 3 7 3
IFN-γ 平均值 3016 259 1730 461 14 134 1615 531 17 220
SEM 1209 295 1441 549 5 153 1439 632 2 255
TNF-α 平均值 53 14 330 23 2 12 312 31 2 14
SEM 24 15 310 25 1 12 272 32 2 15
穿孔素 平均值 220 91 2459 144 57 72 1912 213 48 73
SEM 129 34 1945 124 8 24 1494 147 19 23
AB101極化後及極化期間/極化方案M2c/CD4+ T細胞共培養物之對應細胞介素及穿孔素結果展示於圖 39 及表 2 中。自3個健康研究個體分離之CD4+ T細胞在M2c巨噬細胞存在下用抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)活化。M2c/T細胞共培養物在極化後方案下用AB101 (20 µg/mL)、人類IgG1同型對照物(20 µg/mL)、AB104 (20 µg/mL)、人類IgG4同型對照物(20 µg/mL)及單獨培養基(M2c)處理。在抗CD3刺激之後72小時獲取上清液，且藉由基於磁珠之免疫分析定量細胞介素分泌。藉由比較指定處理組之成對雙尾t檢驗計算P值(p＜0.05，*；p＜ 0.01，**；ns，不顯著)。
當相比於IgG1同型對照組及AB104時，AB101在所有研究個體中顯著增強IFN-γ、TNF-α及穿孔素含量。與IgG 1同型對照組值相比，AB101處理組中之平均IFN-γ、TNF-α、穿孔素及IL-6含量自770增加至1700 pg/mL (IFN-γ)、420增加至1400 pg/mL (TNF-α)、220增加至780 pf/mL(穿孔素)及1300增加至5100 (IL-6) pg/mL。AB101極化期間/極化後方案藉由誘發針對穿孔素及測試之細胞介素之類似細胞介素含量來證實在極化後方案組中觀測到之結果。當相比於IgG4同型對照組之對應含量時，AB104不增強細胞介素或穿孔素反應。表 2 . AB101拯救CD4+ T細胞細胞介素反應以免M2c巨噬細胞介導之免疫抑制
CD4+ T 細胞之細胞介素分泌 [pg/mL]
細胞介素 對照組 前/後方案 後方案
無抗體 AB101 AB104 AB101 AB104
M1 M2 抗體 同型 抗體 同型 抗體 同型 抗體 同型
IL-6 平均 372 112 5039 1092 1015 940 5129 1330 1101 738
SEM 205 33 1813 236 214 362 2372 388 380 153
IL10 平均 93 67 576 232 171 132 533 218 164 129
SEM 50 35 171 106 53 35 103 106 68 67
IFN-γ 平均 4202 84 1609 721 562 416 1678 774 588 366
SEM 1012 53 251 291 176 96 195 345 255 194
TNF-α 平均 175 133 1356 424 427 500 1377 423 417 419
SEM 95 82 402 70 70 95 261 59 87 121
穿孔素 平均 117 64 685 173 122 99 776 224 138 94
SEM 58 5 195 50 33 9 231 103 48 34
總之，AB101拯救T細胞細胞介素反應以免M2c介導之免疫抑制及AB104同型功效之缺乏表明AB101 Fc受體相互作用可能為AB101功能所需的。實例 19-AB101 處理 增強 CD8+ T 細胞之細胞毒性活性
為判定AB101是否增強TME中之CD8+ T細胞之腫瘤細胞殺滅，評價在M2c巨噬細胞存在下用抗CD3抗體刺激之CD8+ T細胞之細胞毒性活性。在此研究中，腫瘤細胞之腫瘤抗原特異性T細胞介導之殺滅經雙特異性T細胞接合體(Bispecific T cell Engager，BiTE®)技術取代。BiTE抗體為由兩個單株抗體之可變域組成之融合蛋白，其經設計以將癌細胞橋接至CTL。一個可變域靶向癌細胞表面上之抗原，且另一可變域接合T細胞表面上之CD3。BiTE®抗體之兩臂結合時，迫使T細胞及癌細胞彼此接近。因此，細胞溶解突觸在T細胞與癌細胞之間產生，穿孔素及顆粒酶自T細胞釋放，且發生腫瘤細胞死亡。
使用CD19-CD3 BiTE抗體評估AB101在表現BiTE之CD19目標之Raji B細胞淋巴瘤細胞之T細胞介導之腫瘤細胞殺滅中的功效。AB101處理M2c/CD8+ T細胞共培養物減輕M2c介導之免疫抑制且可擴大及增強CD8+ T細胞之細胞溶解活性。CD8+ T細胞亦可藉由同種異體HLA限制之細胞溶解在無BiTE之情況下殺死拉吉細胞。包括不表現BiTE或HLA之K562細胞(慢性骨髓白血病細胞株)以用於評價CD8+ T細胞之非HLA限制之細胞死亡。
M2c巨噬細胞與自體人類初級CD8+ T細胞之共培養物使用抗CD3活化且擴增3天。在前、前/後及後方案下，用AB101 (20 µg/mL)、人類IgG1同型對照物(20 µg/mL)或單獨培養基處理共培養物。在前及後方案下，治療性抗體僅分別在M2c極化期間及在M2c T細胞共培養期間添加。藉由分別比較AB101與M2c及同型對照處理組之成對雙尾t檢驗計算P值(p＜0.05，*；p＜0.01，**：p＜0.001，***；p＜0.0001，****；ns：不顯著)。具有細胞毒性讀數之M2/T細胞共培養分析之工作流程展示於圖 28 中。
圖 40 展示當與同型對照組相比時，AB101處理在M0至M2巨噬細胞之極化期間或在M2c/T細胞共培養期間顯著增強在CD19-CD3 BiTE®抗體存在下拉吉細胞之殺滅。拉吉細胞死亡百分比在前方案下自66%增加至77% (p＜0.01 )，在前/後方案下自64%增加至83%(p＜0.001 )，且在後方案下自65%增加至82% (p＜0.01 )。Raji BiTE®殺滅分析具有較小動態範圍及較高背景，其中與M2c細胞一起培養之休眠CD8+ T細胞(灰色條，黑色圓形)殺死71% 拉吉細胞。
值得注意的是，AB101處理亦增加靶向K562癌細胞之非HLA限制之CD8+ T細胞之細胞毒性活性。與相關同型對照組值相比，M2c巨噬細胞及T細胞之極化期間/極化後及極化後AB101處理使腫瘤細胞殺滅在極化期間/極化後條件下自12%增強至41% (p＜0.01 )及在極化後條件下自13%增強至36% (p＜0.05 )。
隨後，評價AB101對來自一組人類個體之CD8+ T細胞之細胞毒性活性的作用。來自8個研究個體之CD8+ T細胞在自體M2c巨噬細胞存在下與抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)一起繁殖。在極化期間、極化期間/極化後及極化後方案下，用AB101 (20 µg/mL)、人類IgG1同型對照物(20 µg/mL)或單獨培養基處理單獨M2c巨噬細胞及共培養物。在抗CD3刺激之後72小時收集T細胞且在存在或不存在CD19-CD3 BiTE抗體之情況下與拉吉細胞一起培養。在細胞溶解分析設置之後18小時藉由流式細胞術測定拉吉細胞之細胞死亡。藉由分別比較AB101與M2c及人類IgG1同型對照處理組之成對雙尾t檢驗計算P值(p＜0.01，**；p＜0.001，***)。
如圖 41 所示，當與人類IgG1同型對照組相比時，AB101極化期間/極化後處理將CD8+ T細胞介導之BiTE®輔助之拉吉細胞殺滅自49.5%顯著增加至63.5% (p＜0.001)。在無BiTE之情況下，來自AB101組之CD8+ T細胞使拉吉細胞之細胞溶解自35%增強至43% (p＜0.01)。
接著，評價AB101對非HLA限制之CD8+ T細胞之細胞毒性活性之作用。來自8個研究個體之CD8+ T細胞在自體M2c巨噬細胞存在下與抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)一起繁殖。在極化期間、極化期間/極化後及極化後方案下，用AB101 (20 µg/mL)、人類IgG1同型對照物(20 µg/mL)或單獨培養基處理單獨M2c巨噬細胞及共培養物。在抗CD3刺激之後72小時收集T細胞且與K562細胞一起培養。在分析設置之後18小時，藉由流式細胞術測定K562細胞之細胞死亡。藉由分別比較AB101與M2c及人類IgG1同型對照處理組之成對雙尾t檢驗計算P值(p＜0.01，**)。
圖 42 展示AB101處理在K562殺滅分析中對細胞溶解CD8+ T細胞活性具有最強作用。AB101處理組中之平均細胞死亡高達人類IgG1同型對照組的兩倍，分別使平均K562殺滅自14%提高至29% (p＜0.01)。實例 20-AB101 調節趨化因子受體在與 M2c 巨噬細胞共培養之 T 細胞上之表現
為了判定AB101是否改變CD4+ 及CD8+ T細胞之活化狀態，在M2c/T細胞共培養分析中評價趨化因子受體之表現及活化或耗竭之標記物，如圖 28 中所示。
將抗CD3活化T細胞與在極化期間經AB101或同型對照物處理之自體M2c細胞共培養。與初始M2c或IFN-γ LPS活化之M1巨噬細胞共培養之抗CD3活化T細胞分別作為免疫抑制及免疫活化之對照物包括在內。將休眠T細胞與無抗CD3活化之M2c巨噬細胞共培養。在抗CD3活化之後三天，藉由流式細胞術分析T細胞。流式細胞術染色第1組(表 8 )包括通常用於區分CD4+ T細胞亞群之活化標記物(CD25及CD69)、休眠T細胞標記物CD127以及趨化因子受體CXCR3、CXCR4 (CD194)及CCR6 (CD196)之抗體。流式細胞術抗體第2組(表 8 )含有T細胞活化及耗竭標記物LAG3、OX40、PD-1、ICOS及CTLA-4。
自3個研究個體分離之T細胞在M2c巨噬細胞存在下用抗CD3 (OKT3，0.25 µg/mL)活化。在M2c極化期間用AB101 (20 µg/mL)、人類IgG1同型對照物(20 µg/mL)或單獨培養基處理M2c/T細胞共培養物。包括M1/T細胞共培養物作為陽性對照組。在抗CD3刺激之後72小時收集上清液以用於流式細胞術。熱圖表示所有研究個體之組合處理組之FlowSOM叢集分析。
使用流式細胞術第1組及用於無偏向聚類(non-biased clustering)的FlowJo FlowSOM外掛程式評價CD4+ T細胞之表型。如圖 43 中所示，來自所有M2c/T細胞共培養組之CD4+ T細胞的FlowSOM聚類鑑別出具有不同表面標記物表現量之8個叢集(0-7號)。叢集1表示休眠T細胞且叢集6類似於活化的Th1樣T細胞。表 8. 用於評估趨化因子受體在CD4+ T細胞亞型上之表現的抗體組及耗竭/活化標記物
   第1組抗體： T細胞表型組 第2組抗體： 耗竭/活化
表面標記物 CD4 - FITC CD69 - PE-Cy7 CD25 - APC CD127 - PE CXCR3 - PerCP-Cy5.5 CD194 (CCR4) - BV421 CD196 (CCR6) - BV510 CD4 - FITC CD8 - APC LAG3 - BV421 OX40 - BV510 PD-1 - PerCP-Cy5.5 ICOS - PE-Cy7 CTLA4 - PE
表 9 及圖 43 中顯示AB101處理如何影響CD4+ T細胞群的可視化代表性實例。在叢集1 (來自3個研究個體中之3個)中發現在抗CD3不活化之情況下與M2c細胞共培養之大部分(平均值=74%) T細胞。叢集1細胞具有擁有較低或不擁有CD69、CXCR3、CCR4或CD25表現以及較高CD127表現之休眠表型。在免疫活化M1極化巨噬細胞存在下，大部分T細胞(57%，所有3個個體之平均值)採用表徵為較高CXCR3表現及較低CCR4、CD127、CCR6及活化標記物CD25及CD69表現的活化表型(叢集2)。M1共培養物亦誘導具有較高CD25、CXCR3及CCR4表現之較小獨特亞群(叢集7，21%T細胞與M1共培養)。M2c細胞對與休眠表型叢集1中之46% T細胞共培養之抗CD3活化CD4+ T細胞具有免疫抑制作用。另外，在活化T細胞表型叢集2中發現單獨M2c組之32% T細胞。表 9 . AB101調節活化CD4+ T細胞在FlowSOM叢集中之分佈
FlowSOM叢集 CD4+ T細胞在FlowSOM叢集中之分佈[%]
休眠T細胞 M2c M2c + OKT3 同型對照 M2c + OKT3 AB101 M2c + OKT3 M1 + OKT3
平均值 SEM 平均值 SEM 平均值 SEM 平均值 SEM 平均值 SEM
0 1.7 0.3 3.3 0.9 3.0 0.7 5.9 1.6 2.9 0.8
1 73.1 7.8 46.3 2.9 51.3 1.6 12.3 7.3 8.9 3.7
2 19.8 5.7 31.9 5.3 27.4 1.9 40.5 9.8 55.6 6.1
3 1.3 0.8 4.3 1.5 4.2 0.7 14.0 4.5 1.1 0.5
4 2.9 0.8 9.6 1.7 8.7 1.5 16.0 3.0 3.3 0.5
5 0.2 0.0 0.3 0.1 0.2 0.1 0.6 0.1 3.9 1.3
6 0.4 0.2 3.3 0.5 4.4 1.8 9.3 1.0 3.4 0.8
7 0.7 0.3 1.0 0.1 0.9 0.1 1.4 0.1 20.8 1.5
圖 43 顯示來自同型對照處理組之抗CD3活化CD4+ T細胞具有與來自對應單獨M2c組之T細胞類似的分佈概況，其中叢集1中的T細胞平均為51%且叢集2中的T細胞平均為27% (表 9 )。
相比之下，用AB101處理緩解M2c極化巨噬細胞之抑制作用。相比於同型對照，AB101使共用叢集2之活化表型的T細胞之比例顯著提高27%至40% (p＜0.05)。另外，AB101使共用休眠細胞表型的細胞之比例顯著降低51%至13% (叢集1；p＜0.0001)。此分佈類似於已在M1巨噬細胞存在下經刺激之T細胞的表型模式。
當相比於同型對照組時，叢集3、4及6亦藉由用AB101處理而提高。如圖 43 中所示，3個叢集中之差異在3位評估個體中之2位(p＜0.0001)中達到與各別M2c及同型對照相關之顯著性。
叢集3及叢集4係由較高CXCR3表現、中等CCR4表現及具有較高(叢集3)或較低(叢集4)活化標記物CD69表現之CD127之存在定義。叢集3之表型不與M1或休眠T細胞共用，對於AB101處理而言呈現獨特性。
叢集6展現具有較高CXCR3及CD69表現及最低CCR4及CCR6表現之活化Th1類T細胞之表型。AB101處理使叢集6中T細胞比例的平均百分比自同型處理組之4.4%增加至9.3% (表 9 )。
總之，藉由M2c共培養物擴增之CD4+ T細胞表型之FlowSOM分析指示AB101處理減輕M2c介導之免疫抑制且誘導藉由CXCR3及CCR4表現突出之獨特T細胞表型之表現。AB101處理亦增加M2c共培養物中活化Th1類CXCR3+ T細胞之比例。
為進一步研究AB101阻斷M2c介導之抑制使得T細胞活化增強的能力，評估CD4+ 及CD8+ T細胞的活化及耗竭LAG3、OX40、PD-1、ICOS及CTLA-4之標記物。藉由FlowSOM對CD4+ 及CD8+ T細胞之叢集技術鑑別出5個CD4+ (編號0-4)及4個CD8+ (編號0-3)叢集。
叢集0 (CD4+ T細胞)及叢集3 (CD8+ T細胞)中較低LAG3、OX40、PD-1及CTLA-4表現指示休眠表型。增加之PD-1及ICOS表現在叢集1 (CD4+ T細胞)中且叢集3 (CD8+ T細胞)展現此研究中之活化表型(圖 44 )。
叢集0 (ICOS+ PD-1- LAG3- CTLA4- OX40- )展現90%未受刺激CD4+ T細胞且叢集3 (ICOSlo PD-1- LAG3- CTLA4- OX40- )展現在抗CD3不活化之情況下與M2c巨噬細胞培養之93%休眠CD8+ T細胞(圖 44 )。當與M2c極化巨噬細胞共培養或經同型對照物處理時(抗CD3活化CD4+ 及CD8+ T細胞主要屬於對應的休眠叢集0 (65% CD4+ T細胞)且叢集3 (64%之CD8+ T細胞)證實M2c細胞介導之免疫抑制。
當與單獨M2c或同型對照處理組相比時，AB101顯著增強CD4+ 及CD8+ T細胞之活化。AB101處理組的百分之八十二之CD4+ T細胞及93%之CD8+ T細胞發現於各別活化T細胞表型叢集1 (ICOShi PD-1+ LAG3- CTLA4- OX40lo )及叢集0 (ICOShi PD-1+ LAG3lo CTLA4- OX40lo )中，該等叢集與M1極化巨噬細胞共培養之T細胞共用。實例 21- AB101 調節 m2c 表面標記物之表現
在M2c/T細胞共培養分析中，在M0至M2c巨噬細胞之極化期間AB101處理拯救抗CD3活化T細胞以免M2c介導之免疫抑制。為確定AB101是否調節表面標記物及免疫檢查點在M2c上之表現，在AB101或同型對照(20 µg/mL)存在下用IL-10至M2c巨噬細胞極化5天大的M0巨噬細胞且隨後用一組巨噬細胞表型抗體染色。將流動式細胞量測術特徵與天然、未經處理M2c細胞及LPS+IFN-γ極化M1巨噬細胞進行比較。M2c巨噬細胞表現M2c標記物CD163、CD206及Mer-TK、Fcγ受體CD16、CD32、CD64、模式識別受體TLR2、TNFR家族成員CD40。如所預期，在IFN-γ處理之後，相較於M2c巨噬細胞，M1巨噬細胞表現較高量之HLA-II類及檢查點配體PD-L1。相比之下，M2c巨噬細胞顯示免疫抑制配體唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15及LILRB2之含量高於M1巨噬細胞。經評估之表面標記物、共刺激分子及受體CD86、CD91、CD150、鈣網蛋白、凝集素(Dectin)-1、TIM4及TLR4不於M2c細胞上表現。
為了進一步分析藉由活化CD4+ T細胞之CXCR3表現，FlowSOM叢集3至6基於其CXCR3+ CD69+ CD25+ T細胞表型組合。所得表型比例顯示為圖 45 中之餅圖且表示圖 45 之表格中之表型。
當與同型處理組相比時，AB101處理使表現活化標記物CD69及CD25之活化CXCR3+ 、CD4+ T細胞之比例自18%增加至40%。OR2572及M2c單獨處理組具有類似分佈概況。
為了定量AB101對表面標記物表現之調節作用，自至多10個研究個體將經AB101處理之M2c細胞上之表型抗體的mMFI值相對於同型對照(nMFIiso)或未經處理之天然M2c巨噬細胞(nMFIM2c)上之對應標記物標準化(圖 46 )。相對於經同型對照處理之M2c細胞，AB101誘導CD16 (34% nMFIiso，p＜0.0001)及CD64 (30% nMFIiso，p＜0.0001)之高度顯著減少以及TLR2 (66% nMFIiso，p＜0.05)之顯著減少。當AB101 M2c表面標記物MFI相對於初始M2c巨噬細胞標準化時，觀察到類似趨勢。來自經AB101處理之巨噬細胞的表面標記物之nMFiM2c對於CD16 (44% nMFIM2c，p＜0.001)、CD64 (30% nMFIM2c，p＜0.0001)、TLR2 (63% nMFIM2c，p＜0.05)及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15 (66% nMFIM2c，p＜0.05)而言顯著降低。當與M2c巨噬細胞對照相比時，AB101處理增強HLA-II類之表現且不顯著影響CD163、CD206、MerkTK、LILRB2及PD-L1之表現。
總之，在M2c巨噬細胞極化期間AB101處理減少先天性受體TLR2及檢查點配體唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15之表現。另外，其抑制IL-10誘導的M2c細胞上之CD16及CD64之上調。實例 22-AB101 結合增加 SRCR 域 3 及 4 中之區域的保護 ( 較慢 HD 交換 ) 及暴露 CD163 之域 2 、 5 及 9 中之 ( 較快 HD 交換 ) 區域
進行比較HDX研究以檢查IgG結合對CD163之影響。由於大量來源於存在於複合物中之過量Ab的肽，許多引起許多肽在m/z及滯留時間裏重疊。最終，過濾雜訊及重疊肽之後，胃蛋白酶資料中一最終組107個肽，對應於74%之覆蓋率以及1.28之平均冗餘。對於豬籠草蛋白酶II資料集，最終過濾肽計數為230，對應於87%之覆蓋率以及2.8之平均冗餘。當資料集與兩個蛋白酶組合時，總序列覆蓋率為93%，具有4.1之平均冗餘。
用質譜分析進行氫/氘交換：在pH 7.2之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中將重組人類CD163 (rhCD163)之起始儲備溶液稀釋至0.36 mg/mL。內部交換報導子：向各溶液中添加四胜肽PPPF或三肽YPI以達到1 µM之最終濃度。抗體複合樣品以相同方式製成，但包括1.38 mg/mL之AB101，其對應於rhCD163之3倍莫耳濃度過剩。此等工作溶液在22℃下培育且在4℃下儲存1天，隨後開始氘交換反應。將10 µL之工作蛋白溶液稀釋10倍至90 µL氘化HBS緩衝液中：(20 mM HEPES，pH 7.2，150 mM NaCl，2 mM CaCl2 ，95% D2 O)且在22℃下培育3秒、15秒、1分鐘、5分鐘、30分鐘、4小時或20小時。氘化HBS亦含有0.2 µg/mL緩激肽以在所有實驗中提供完全氘化參考化合物以便監測反交換。另一樣品在37℃下培育20小時作為高度氘化樣品。將交換樣品添加至相等體積(100 µL)之冰冷淬滅緩衝液：1 M TCEP、0.2%甲酸(FA)，最終pH為2.5。在LC-MS分析之前，將樣品在乙醇乾冰浴(-60℃)中急驟冷凍且隨後儲存在-80℃下。除在水性HBS緩衝液中稀釋之外，相同地製備未氘化參考樣品。
用固定胃蛋白酶進行樣品處理：在5℃阻斷液上解凍冷凍樣品4分鐘，隨後注射至裝載環上。裝載樣品通過定製填充胃蛋白酶管柱上方(豬胃蛋白酶固定在POROS 20-AL樹脂上；2.1×50 mm管柱)，在12℃下保持，流量為0.1%三氟乙酸(TFA)及2%乙腈(ACN)，流速為200 µL/min。將經消化胃蛋白酶片段截留至Waters XSelect CSH C18 XP VanGuard濾筒(2.1×5 mm，2.5 µm)上。裝載、消化及截留5分鐘後，肽在分析管柱(Waters CSH 1×100 mm，1.7 µm，130Å)上使用梯度3%至40%溶劑B解析9分鐘(A：0.1% FA，0.025% TFA，2% ACN；B) 0.1% FA/ACN)。LC系統耦接至進行在300-2000之m/z範圍內之完整掃描且實現離子遷移分離之Waters Synapt G2-Si。最佳化來源條件以使去溶劑化期間之氘損失降至最低。在所有LCMS運作之前及結束時運行未氘化樣品。在分析型分離步驟期間，使用一系列250 µL注射來清潔胃蛋白酶管柱：1) 0.1% Fos-12與0.1% TFA；2)2 M GndHCl於0.1% TFA中；3) 10%乙酸、10%乙腈、5%異丙醇。在各梯度之後，用一系列250 µL注射來洗滌截留管柱：1) 10% FA；2) 30%三氟乙醇；3) 80%甲醇；4) 66%異丙醇，34% ACN；5) 80% ACN。在洗滌兩次期間，用三種快速梯度清潔分析管柱。對於所分析之各肽，此等清潔步驟為確保殘留含量低於5%所必需的。
用固定豬籠草蛋白酶II蛋白酶進行樣品處理：重複上文所描述之樣品處理，不同之處在於使用固定於POROS 20-AL上之豬籠草蛋白酶II蛋白酶用於線上消化步驟。
首先確保交換及取樣條件對於未結合狀態及抗體結合狀態為相同的，吾人首先檢查內標肽之交換概況。對於兩組資料，PPPI及YPI標準在無配體資料集與抗體結合資料集間相同，確保病狀一致且可解釋甚至細微變化，因為蛋白質結構及/或動力學改變。此外，併入至氘化緩衝液中之完全氘化緩激肽顯示相同氘含量，確保在各資料集內之樣品中反向交換之含量不變。
使用抗體結合之未結合狀態之間的HDX動力學之比較來評估在整個抗原中響應於抗體結合之變化。胃蛋白酶及豬籠草蛋白酶II資料集之變化之概述顯示於圖 50 及圖 51 中。不管在響應於抗體結合之HDX動力學中的較小變化(在單一時間點時之較小變化)或較大變化(超過兩個標準差或在若干時間點可見)，在一級序列上對變化著色。吾人注意到，對於此等比較，吾人僅利用如藉由複本間之標準差評估的統計顯著之變化，以及確保覆蓋幾乎相同區域之所有重疊肽一致。藉由此等準則，吾人確保吾人僅做出來自資料集之最保守推斷。
在圖 47 上所顯示之胃蛋白酶資料集中，存在兩個在抗體結合時顯示增加之保護位點。一個位點包括在若干時間點顯示急劇增加保護的醣肽271-285，及亦顯示交換動力學之顯著降低的覆蓋C端鄰近區286-299之若干肽。第二位點包括殘基405-418內之三個肽，其顯示保護略微增加。大量肽在抗體結合時顯示可撓性增加(較快交換)。最顯著的是在殘基125-139及479-488處，同時在殘基887-910及918-933處觀測到更多細微的增加。
圖 48 中所顯示之豬籠草蛋白酶II資料集總體上顯示與使用胃蛋白酶所觀測到之變化類似的變化。在殘基279-286處，保護之最大增加為顯而易見的，其中恰好此區域N端之區域(271-278)顯示較小增加。殘基408-415亦顯示抗體結合時保護之較小增加。如在胃蛋白酶資料中，跨越蛋白質之較大部分存在靈活性增加。在殘基471-483處觀測到靈活性之最大增加，在蛋白質之較多部分上具有更小變化。與此等資料集之一致性強烈指示OR2805之抗原決定基在與殘基279-285內，且亦可包括相鄰序列(279-299)以及殘基405-418。亦可能涉及未由HDX-MS觀測到之其他區域。
與胃蛋白酶資料中之許多類似，在豬籠草蛋白酶II資料集中跨蛋白質之較大部分之靈活性亦增加。在殘基471-483處觀測到靈活性之最大增加，在蛋白質之更多部分上具有較小變化(圖 49 )。總體而言，所提出之抗原決定基之遠端的較大變化與抗體結合時之大規模變構作用一致。所有在抗原決定基遠端之變化變得更暴露的事實指示抗體結合使跨越蛋白質之一些二級結構變鬆，很可能影響與鄰近蛋白質域之相互作用。在極N端域及C端域兩者處看到變化之事實指示此蛋白質在其天然(非配體)構形中具有若干域間相互作用。
圖 49 顯示AB101與人類CD163 ECD之結合之作用的示意性概述。在AB101存在下，保護域SRCR 3及4內之區域免受質子-氘交換。伴隨域3及4中之交換減少，SRCR域2、5及9顯現表示在AB101結合時之較大暴露的增加之交換。實例 23-AB101 結合經截斷人類 CD163 ECD SRCR 域 1-5 片段
人類CD163之胞外域在SRCR域5之後截斷且保留C端組胺酸標籤。此CD163 ECD片段在HEK293-6E細胞中表現且使用IMAC方法純化，如圖 50 中所示。AB101以次奈莫耳EC50結合經截斷ECD，如表 10 中所指示，然而，正如所預期的RM3/1不結合。RM3/1結合抗原決定基映射至SRCR域8及SRCR域9。經截斷CD163 ECD SRCR 1-5含有藉由HDX-MS鑑別出含有AB101結合抗原決定基之域3及4。AB101維持與SRCR 1-5之結合，進一步支持來自HDX-MS研究之抗原決定基鑑別結果。表 10 .與經截斷CD163 ECD SRCR 1-5結合之AB101、RM3/1、EDHu-1及215927的EC50值。
EC50 (nM)
抗原 AB101 R11 RM3/1 EDHu-1 215927
huCD163 ECD 0.26 0.061 0.052 0.017
huCD163 SRCR 1-5 0.76 --- 0.050 0.020
SRCR 1-5/ECD比率 2.9 --- 0.96 1.17
實例 24-AB101 與人類而非食蟹獼猴重組 CD163 ECD 蛋白質結合及在食蟹獼猴 CD163 ECD 中之單點突變 E323K 賦予 AB101 與人類 CD163 ECD 結合
在實例 6 中，使用固定於塑膠之重組CD163蛋白的ELISA分析，自26個單獨實驗中之14-點劑量反應曲線測定結合至重組人類之AB101，以具有0.52 nM之幾何平均EC50值。AB101未顯示與重組鼠類CD163之結合，而如所預期與市售大鼠抗muCD163 (Thermo Fisher Scientific #14-1631-82)抗體結合。
由於AB101未能結合鼠類CD163且與人類CD163之胺基酸序列一致性較低(72.9%)，因此聚焦於通常用於臨床前毒理學研究中之第二物種，亦即非人類靈長類動物(NHP)食蟹獼猴。食蟹獼猴CD163與人類CD163共有96.5%胺基酸序列一致性。具有C端8組胺酸標記之人類及食蟹獼猴CD163 ECD在HEK293-6E細胞中之產生，得到第7天短暫轉染CM的每公升約1至2 mg純化蛋白質。圖 51 顯示人類與食蟹獼猴CD163蛋白質之比對。
結合HDX-MS結果之知識，其鑑別出CD163上之結合抗原決定基及人類與食蟹獼猴CD163之間的顯著序列一致性及AB101不結合食蟹獼猴CD163，允許鑑別SRCR域3中牽涉AB101結合之關鍵殘基。人類CD163中位置323處之離胺酸殘基為在視為用於毒理學研究之所有潛在非人類物種中之麩胺酸殘基(圖 51 )。此位置位於SRCR域3之由HDX-MS定義之AB101結合抗原決定基內。食蟹獼猴麩胺酸在位置323對離胺酸之定點突變誘發賦予AB101與食蟹獼猴CD163 ECD之結合，其中EC50接近AB101與人類CD163 ECD之結合的彼值(圖 52 )。此功能增加強烈暗示AB101結合抗原決定基中位置323處之離胺酸。實例 25- 藉由 SPR 的 AB101 與人類 CD163 之結合親和力
表面電漿子共振(SPR)量測用於測定在不同操作緩衝液條件下與人類CD163結合之AB101及抗CD163純系GHI/61 (AB101親合力量測結果)。
使用Biacore T200儀器(GE Healthcare Life Sciences)進行AB101與抗CD163純系GHI/61與人類CD163之結合的SPR分析。使用胺偶合套組(GE Healthcare Life Sciences)將經純化重組CD163蛋白直接固定於晶片(Serie S型CM5)上。進行pH搜索(10 mM乙酸鈉pH 5.5/5.0/4.5/4.0)以確定適合之濃度及用於胺偶合固定之pH。選擇乙酸鈉(pH 5.5)作為CD163偶合至感測器晶片CM5上之最佳條件。偶合至CM5晶片上之CD163蛋白的量為80 RU (0.08 ng/mm2 )。
用於實驗之操作緩衝液：緩衝液(1) 10 mM Hepes、150 mM NaCl、3.0 mM EDTA及0.05% Tween 20，pH 7.4或緩衝液；緩衝液(2) 10 mM Hepes、150 mM NaCl、3.0 mM CaCl2 、1.0 mM EGTA及0.005% Tween 20，pH 7.4。
將MAb溶解於操作緩衝液中。對於AB101，使用流動速率在30 µl/min、6.25/12.5/25/50/100/200 µg/ml下之濃度、接觸時間300 s及解離時間600 s下產生感測器圖譜。對於GHI/61，使用流動速率在30 µl/min、在3.125/6.25/12.5/25/50/100 µg/ml下之濃度、接觸時間300秒及解離時間600秒下產生感測器圖譜。用10 mM甘胺酸HCl (pH 3.0) (GE Healthcare Life Sciences)再生流動池。在Biacore T200電腦及Biacore T200評估軟體下進行資料分析。
已顯示GHI/61及其他抗CD163抗體與人類CD163之結合視游離鈣而定。與含鈣緩衝液相比，GHI/61對含CD163在不含鈣緩衝液中具有較高親和力。為測定AB101結合是否為鈣依賴性的，吾人對在含2 mM鈣緩衝液或不含鈣EDTA緩衝液中與經固定之人類CD163結合之AB101進行SPR量測。如表 11 及圖 53 中所顯示，如與在不含鈣EDTA緩衝液中之2倍較弱親合力(KD =89 nM)相關，在含鈣緩衝液中，AB101在下具有45 nM之KD 的較強結合親合力。相比之下，SPR量測觀測到GHI/61在含鈣及EDTA緩衝液中結合至CD163之KD 值分別為63 nM及12 nM (圖 54 及表 11 )。表 11 . AB101與經固定之人類CD163之SPR結合結果
抗體與經固定之人類 CD163 之結合
緩衝液 AB101 GHI/61
KD [nM] ka [M-1 s-1 ] Kd [s-1 ] KD [nM] ka [M-1 s-1 ] Kd [s-1 ]
鈣 45 1.678 x 104 7.544 x 10-4 63 0.732 x 104 4.668  x 10-4
EDTA 89 1.280 x 104 11.39 x 10-4 12 1.476 x 104 1.783 x 10-4
SPR結果證實先前報導之GHI/61發現且表示AB101可能需要生理鈣濃度以用於最佳結合至人類CD163。
隨後，吾等對含鈣緩衝液中之固定AB101進行CD163結合親和力之SPR量測且觀測到12 nM之KD (圖 55 及表 12 )。當與AB101結合至經固定之CD163之對應的Ka (1.678×104 M-1 s-1 )相比時，CD163結合至經固定之AB101具有6.213×104 (M-1 s-1 )之3.7倍高ka。表 12 .人類CD163與經固定之AB101之SPR結合結果
人類 CD163 與 AB101 之結合
緩衝液 KD [nM] ka [M-1 s-1 ] Kd [s-1 ]
鈣 12 6.213 x 104 7.895 x 10-4
總而言之，SPR量測測定在2 mM游離鈣存在下AB101對CD163之12 nM結合親和力及45 nM親合力。實例 26- 藉由 AlphaLISA 之 AB101 與人類 CD163 蛋白在溶液中之結合
AB101與人類CD163於溶液中之結合親和力係藉由AlphaLisa分析測定。
分析由在C端上具有10-組胺酸標記之人類可溶性CD163、生物素標記抗hIgG1、抗生蛋白鏈菌素受體珠粒及鎳供體珠粒組成。
藉由以1500 nM之起始滴定濃度在無Ca2+ 、Mg2+ 之0.5% BSA/1×PBS中製備AB101及同型對照之連續稀釋液進行分析。將CD163在相同緩衝液中稀釋至1500 nM之濃度。
AB101與人類CD163之結合。以每孔5 µl之體積將AB101或同型對照連續稀釋液添加至每孔5 µl人類CD163，用鋁盤密封物密封且在室溫下在輕微震盪下培育1小時。
偵測AB101：使用2.5 nM生物素標記之抗人類IgG1抗體在1×AlphaLISA免疫分析緩衝液中以每孔5 µl之體積至10 µl結合混合物偵測到AB101。將培養盤密封且在室溫下在平緩震盪下培育1小時。
受體珠粒結合：在抗體偵測步驟之後，向各孔添加含5 µl的100 µg/ml抗生蛋白鏈菌素受體珠粒之1×AlphaLISA免疫分析緩衝液，隨後密封盤且在室溫下在輕微震盪下培育1小時。
結合供體珠粒：隨後，每孔添加含5 µl的100 µl/ml鎳供體珠粒之1×AlphaLISA免疫分析緩衝液，隨後密封盤且在室溫下在輕微震盪下培育1小時。
使用Envision盤讀取器根據製造商方案讀取盤，且使用GraphPad Prism 8分析資料以計算Kd 。
AB101與CD163之結合之AlphaLisa量測在AB101之30 nM下達到飽和(圖 56 )。藉由組合5個獨立量測值之1-位點飽和結合模型測定1.8 nM之Kd (表 13 )。2-位點飽和結合模型提供較低AB101濃度之較佳曲線擬合。表 13 . AB101與可溶性CD163蛋白之結合的AlphaLisa量測
結合 AB101 與可溶性 CD163
獨立分析 1- 位點結合模型
EC50 [nM] Max R2
1 4.1 31000 0.99
2 1.5 37000 0.97
3 1.9 52000 0.98
4 1.7 48000 0.99
5 0.51 44000 0.98
平均值 1.9 42400   
SD 1.3 8444   
幾何平均值 1.6 41692   
實例 27-AB101 與 M2c 巨噬細胞之結合
為測定AB101與細胞上所表現之CD163的結合動力學，吾人對來自4位研究個體之免疫抑制M2c巨噬細胞進行結合研究。
自四位健康人類個體(39歲女性、24歲男性、39歲男性及54歲男性)評估結合至M2c巨噬細胞之AB101。自購自BloodWorks之白血球分離單核球。
在第7天，M2c細胞在室溫下在巨噬細胞拆離溶液DXF中培育15分鐘且自燒瓶移除進入X-VIVO-15TM 培養基。離心後，用PBS洗滌細胞一次且在室溫下再懸浮於Zombie UV活/死染色劑(1:500)中持續20分鐘。細胞接著用FACS緩衝液洗滌且在室溫下再懸浮於FACS阻斷液(含有10% FBS及0.5 mg/ml人類IgG1之FACS緩衝液)中20分鐘。將阻斷緩衝液中之細胞以每孔2.5×104 個細胞轉移至384孔盤中，且將經滴定之抗體以2×最終分析濃度直接添加至各孔中。將細胞與抗體一起在室溫下培育20分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌三次，隨後再懸浮於FACS緩衝液中以用於在Symphony流式細胞儀(BD Biosciences)上獲取。
結合至M2c巨噬細胞之AB101呈現雙峰結合曲線(圖 57 )表明AB101與Fc受體之結合可影響與在M2c細胞上表現之CD163的結合。AB101在1-位點特異性飽和結合曲線中之計算Kd 值顯示於表 14 中。藉由1-位點模型計算的AB101與CD163之結合的Kd 值為7.7 nM，其中Bmax為46103 gMFI (R2 =0.91)。兩個-位點曲線擬合建模提供較佳曲線擬合(R2 =0.98)。表 14 . AB101結合至人類M2c巨噬細胞之平衡結合
AB101 之結合動力學
人類個體 ID 1- 位點結合模型
Kd [nM] Bmax R2
W 7.2 45800 0.93
X 6.6 41700 0.91
Y 8.1 45400 0.91
Z 8.9 51513 0.93
平均值 7.7 46103   
SD 1.0 4051   
幾何平均值 7.7 45972   
儘管已詳細地描述本發明及其優點，但應理解，在不脫離如所附申請專利範圍中所定義之本發明之精神及範疇的情況下，在本文中進行各種改變、替代及更改。
本發明之新穎特徵細緻闡述於隨附申請專利範圍中。參考闡述利用本發明原理之說明性實施例及其附圖的以下實施方式將對本發明之特徵及優點有更好的瞭解：
圖 1 顯示AB101抗體對人類MDSC群體的結合。
圖 2 顯示AB101結合至CD163Hi 細胞。
圖 3 顯示AB101對人類M2c、M1及M0的結合與同型對照的比較情況。
圖 4 顯示AB101對人類周邊血液T細胞、B細胞、NKT細胞、嗜中性球、單核球及樹突狀細胞的結合，其中同型對照以灰色顯示且AB101結合以黑色顯示。
圖 5 顯示AB101不結合至一組人類初級細胞，包括小氣管上皮細胞(SAEC)、腎近端小管上皮細胞(RPTEC)、肺微血管內皮細胞(HMVEC)、臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、主動脈平滑肌細胞(AOSMC)及角質細胞。
圖 6A 顯示AB102的前20種標靶，此基於免疫沈澱之後對樣品進行的質譜分析。
圖 6B 顯示AB102的主要細胞表面標靶，此基於免疫沈澱之後對樣品進行的質譜分析。
圖 6C 顯示AB102的主要細胞表面標靶與ISO (同型陰性對照)的比較情況，此基於免疫沈澱之後對AB102及ISO樣品進行的質譜分析。
圖 7 顯示AB102使CD163的相異較高分子量糖型發生共免疫沈澱。
圖 8 顯示AB101、AB102及對照CD163抗體結合至huCD163，而同型對照未顯示明顯的結合。
圖 9 顯示AB101與對照抗huCD163抗體皆不結合至重組鼠類CD163，相比之下，市售抗muCD163抗體的確結合至鼠類CD163。
圖 10 顯示多株抗CD163抗體對M2c巨噬細胞的預處理阻斷AB101抗體結合，相比之下，山羊對照多株抗體處理不阻斷AB101結合。
圖 11 顯示多株抗CD163抗體對M2c巨噬細胞的預處理阻斷對照單株抗huCD163抗體結合，相比之下，山羊對照多株抗體處理不阻斷對照單株抗huCD163抗體結合。
圖 12 顯示相較於擾亂的siRNA (siScramb)或未經siRNA處理的M2c巨噬細胞，用針對CD163的siRNA處理極化的M2c巨噬細胞使AB102抗體的結合實質上減少，且代表三次重複實驗。
圖 13 顯示siRNA阻斷CD163基因表現使AB102抗體的結合減少，用針對FCGR2A + FCGR3A (3位供者中有1位)、FCGR2C或FCGR3A的siRNA阻斷基因表現之後，AB102抗體稍微減少，且用siCD206、siCD163L1、siPPIA、siLGALS1、siLGALS3、siLILRB2及siUPAR阻斷基因表現之後，AB102結合無減少跡象。
圖 14 顯示LPS處理所培養的M2巨噬細胞使得AB101抗體與對照抗CD163抗體的結合均減少。
圖 15 顯示AB101抗體處理骨髓細胞之後，IL-2的產生增加。
圖 16 顯示極化促進之CD4+ T細胞增殖期間的AB101抗體處理。
圖 17 顯示極化促進之CD8+ T細胞增殖期間的AB101抗體處理。
圖 18 顯示極化期間(圖上標識為「前」)、極化後(圖上標識為「後」)或極化期間與極化後的組合(圖上標識為「前與後」的AB101抗體處理使得IL-2產生相較於同型抗體處理增強。
圖 19 顯示AB101抗體處理M2巨噬細胞使得CD16、CD64、鈣網蛋白及唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15的表現減少。
圖 20 顯示相較於同型對照，AB101處理M2c細胞使Th1/Th2比率增加。
圖 21 顯示相較於同型對照，AB101處理M2c細胞使得CD4 T細胞上的CD69表現增加。
圖 22 顯示相較於同型對照，AB101處理M2c細胞使得CD4 T細胞上的ICOS表現增加。
圖 23 顯示相較於同型對照，AB101處理M2c細胞使得CD4 T細胞上的OX40表現增加。
圖 24 顯示相較於同型對照，增加的CTL在BiTE存在下使得拉吉腫瘤細胞(Raji tumor cell)殺滅增加。
圖 25 顯示大致內化的AB102抗體以及市售抗CD163抗體(R&D Systems MAB1607-100)，且AB101抗體的內化為市售CD163抗體的約2倍。
圖 26 顯示A549腫瘤在30天期間的腫瘤體積圖。箭頭表示注射抗體療法。每個點表示7隻小鼠的平均量測值。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。統計顯著性係利用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)來計算。
圖 27 顯示H1975腫瘤在30天期間的腫瘤體積圖。箭頭表示注射抗體療法。每個點表示7隻小鼠的平均量測值。誤差條表示平均值之標準誤差(SEM)。統計顯著性係利用曼-惠特尼檢驗來計算。
圖 28 顯示M2c/T細胞共培養分析的實驗設計，以評估AB101處理對T細胞增殖及IL-2產生的影響。
圖 29 顯示在M2c/T細胞共培養分析中，在M2c巨噬細胞極化期間用AB101處理使T細胞增殖恢復。
圖 30 顯示在M2c/T細胞共培養分析中，在M2c巨噬細胞極化期間用AB101處理使得OKT3活化T細胞的IL-2分泌增強。
圖 31 顯示在M2c/T細胞共培養分析中，AB101前方案、前/後方案及後方案處理使CD8+ T細胞增殖增加。
圖 32 顯示在針對個別個體的M2c/T細胞共培養分析中，AB101前方案、前/後方案及後方案處理使CD8+ T細胞增殖增加。
圖 33 顯示AB101處理使來自多位個體的M2c/共培養物中的CD8+ T細胞增殖增強。
圖 34 顯示AB101處理使來自多位個體的M2c/共培養物中的CD4+ T細胞增殖增強。
圖 35 顯示在M2c/共培養期間，AB101處理使來自多個人之T細胞的IL-2產生增強。
圖 36 顯示在M2c/T細胞共培養分析中，AB101在增強T細胞增殖方面比AB104及AB102同型更強。
圖 37 顯示AB101 (而非AB104)前/後方案及後方案拯救CD8+ T細胞增殖以免M2c介導免疫抑制。
圖 38 顯示在M2c/T細胞共培養分析中，AB101恢復CD8+ T細胞細胞介素反應。
圖 39 顯示AB101拯救CD4+ T細胞IFN-γ、TNF-α及穿孔素反應以免M2c巨噬細胞介導免疫抑制。
圖 40 顯示AB101處理使CD8+ T細胞的細胞毒性活性增強。
圖 41 顯示AB101處理增強BiTE®助長CD8+ T細胞的細胞毒性活性。
圖 42 顯示AB101處理使非HLA限制之CD8+ T細胞的細胞毒性活性增強。
圖 43 顯示AB101處理使M2c細胞介導的免疫抑制減輕且誘導活化CD4+ T細胞產生獨特的表現模式。
圖 44 顯示AB101處理使M2c巨噬細胞的免疫抑制減輕且增強CD4+ 及CD8+ T細胞的活化。
圖 45 顯示活化CD4+ T細胞的CXCR3表現。
圖 46 顯示M2c巨噬細胞極化期間的AB101處理使M2c巨噬細胞對CD16、CD64、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15及TLR2的表現減少。
圖 47 顯示變化的概述，此基於胃蛋白酶對與huCD163結合之AB101的消化。
圖 48 顯示變化的概述，此基於豬籠草蛋白酶II (Nepenthesin II)對與huCD163結合之AB101的消化。
圖 49 顯示AB101對人類CD163 ECD之結合的示意圖，此基於HDX-MS研究。
圖 50 顯示AB101結合經截斷的CD163 ECD，該ECD由SRCR域1-5構成。
圖 51 顯示人類CD163相對於食蟹獼猴CD163之比對。信號序列。黑色條柱下的序列表示9個SRCR域且序列上方的灰色線條表示共同序列。經保護且暴露的區域係基於AB101結合抗原決定基顯示，如根據HDX-MS中所觀測到的保護所測定。序列下方的實心條柱表示豬籠草蛋白酶II保護區。序列下方勾勒的方塊指示胃蛋白酶保護區。序列下方的陰影方塊表示胃蛋白酶暴露區。序列下方的豎直條紋方塊表示豬籠草蛋白酶II暴露區。人類CD163之位置323的離胺酸(K)及食蟹獼猴CD163的麩胺酸(E)用方塊表示。
圖 52 顯示AB101結合人類及食蟹獼猴E323K突變體，但不結合野生型食蟹獼猴CD163 ECD。
圖 53 顯示SPR偵測到AB101結合至人類CD163。AB101用(A) EDTA或(B)含鈣操作緩衝液連續稀釋成不同濃度。接著以30 μl/min的流量、6.25/12.5/25/50/100/200 μg/ml的濃度將GHI/61注射至流動池2中，接觸時間為300秒且解離時間為600秒。
圖 54 顯示SPR偵測到GHI/61結合至人類CD163。抗CD163純系GHI/61用(A) EDTA或(B)含鈣操作緩衝液連續稀釋成不同濃度。接著以30 μl/min的流量、3.125/6.25/12.5/25/50/100 μg/ml的濃度將GHI/61注射至流動池2中，接觸時間為300秒且解離時間為600秒。
圖 55 顯示SPR偵測到CD163結合至AB101。人類CD163蛋白用含鈣操作緩衝液連續稀釋成不同濃度。接著以30 μl/min的流量、1.25/2.5/5.0/10.0/20.0/40.0 μg/ml的濃度將CD163蛋白注射至流動池2中，接觸時間為300秒且解離時間為600秒。
圖 56 顯示在AlphaLisa分析中，AB101結合至可溶性CD163。AB101 (圓)或同型對照(三角形)在指定濃度下與750 nM CD163-His一起培育1小時。使用生物素標記的抗hIgG1 mAb、抗生蛋白鏈菌素受體及鎳供體珠粒，藉由AlphaLisa定量結合。符號代表五次獨立量測的平均值±標準誤差。使用1位點及2位點飽和結合模型(GraphPad Prism)進行曲線擬合。(R2 = 0.92)。(A)線性及(B)對數x軸標度。
圖 57 顯示AB101對M1c巨噬細胞的結合。M2c巨噬細胞用含有0.5 mg/ml人類IgG1的嚴格FACS阻斷緩衝液阻斷且接著用指定濃度的AB101 (圓)或同型對照(三角形)染色30分鐘。藉由螢光強度定量經AlexaFluor 647標記的AB101及同型對照對M2c巨噬細胞的結合且以gMFI報導。符號代表四位研究個體之平均值±標準誤差。使用2位點飽和結合模型(GraphPad Prism)進行曲線擬合。(R2 = 0.99)。(A)線性及(B)對數x軸標度。

Claims (226)

  1. 一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性的重鏈可變區(VH )及與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性的輕鏈可變區(VL )。
  2. 如請求項1之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少85%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  3. 如請求項1之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少90%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  4. 如請求項1之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  5. 如請求項1之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少99%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  6. 如請求項1之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少100%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少85%一致性的重鏈可變區(VH )。
  8. 如請求項1至6中任一項之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少90%一致性之重鏈可變區(VH )。
  9. 如請求項1至6中任一項之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%一致性之重鏈可變區(VH )。
  10. 如請求項1至6中任一項之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少99%一致性之重鏈可變區(VH )。
  11. 如請求項1至6中任一項之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少100%一致性之重鏈可變區(VH )。
  12. 一種抗體或重組抗體，其包含：重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少80%一致性的互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少80%一致性的CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80%一致性的CDR H3；以及輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80%一致性的CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少80%一致性的CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少80%一致性的CDR L3。
  13. 如請求項12之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少85%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少85%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少85%一致性。
  14. 如請求項12之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少90%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少90%一致性。
  15. 如請求項12之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少95%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少95%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%一致性。
  16. 如請求項12之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少99%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少99%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少99%一致性。
  17. 如請求項12之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少100%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少100%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少100%一致性。
  18. 如請求項12至17中任一項之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少85%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少85%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少85%一致性。
  19. 如請求項12至17中任一項之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少90%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%一致性。
  20. 如請求項12至17中任一項之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少95%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%一致性。
  21. 如請求項12至17中任一項之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少99%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少99%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少99%一致性。
  22. 如請求項12至17中任一項之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少100%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少100%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少100%一致性。
  23. 一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性之重鏈可變區(VH )。
  24. 如請求項23之抗體或重組抗體，其中該重鏈可變區(VH )與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少90%一致。
  25. 如請求項23之抗體或重組抗體，其中該重鏈可變區(VH )與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少95%一致。
  26. 如請求項23之抗體或重組抗體，其中該重鏈可變區(VH )與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少99%一致。
  27. 如請求項23之抗體或重組抗體，其中該重鏈可變區(VH )與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少100%一致。
  28. 如請求項23至27中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  29. 如請求項23至27中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少90%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  30. 如請求項23至27中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少95%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  31. 如請求項23至27中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少99%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  32. 如請求項23至27中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少100%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  33. 一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少99%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  34. 如請求項33之抗體或重組抗體，其中該輕鏈可變區(VL )與胺基酸序列SEQ ID NO：7至少100%一致。
  35. 如請求項33至34中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性之重鏈可變區(VH )。
  36. 如請求項33至34中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少90%一致性之重鏈可變區(VH )。
  37. 如請求項33至34中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少95%一致性之重鏈可變區(VH )。
  38. 如請求項33至34中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少99%一致性之重鏈可變區(VH )。
  39. 如請求項33至34中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少100%一致性之重鏈可變區(VH )。
  40. 一種抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少80%一致性之互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少80%一致性之CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80%一致性之CDR H3。
  41. 如請求項40之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少90%一致性之互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%一致性之CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%一致性之CDR H3。
  42. 如請求項40之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少95%一致性之互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%一致性之CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%一致性之CDR H3。
  43. 如請求項40之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少99%一致性之互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少99%一致性之CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少99%一致性之CDR H3。
  44. 如請求項40之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少100%一致性之互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少100%一致性之CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少100%一致性之CDR H3。
  45. 如請求項40至44中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少80%一致性之至少一個互補決定區(CDR) L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少80%一致性之CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少80%一致性之CDR L3。
  46. 如請求項45之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少90%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少90%一致性。
  47. 如請求項45之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少95%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少95%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少95%一致性。
  48. 如請求項45之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少99%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少99%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少99%一致性。
  49. 如請求項45之抗體或重組抗體，其中該CDR L1與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少100%一致性，該CDR L2與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少100%一致性，且該CDR L3與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少100%一致性。
  50. 如請求項40至44中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  51. 如請求項45至49中任一項之抗體或重組抗體，其中該輕鏈可變區(VL )與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性。
  52. 如請求項40至51中任一項之抗體或重組抗體，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性之重鏈可變區(VH )。
  53. 一種抗體或重組抗體，其包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少99%一致性之互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少99%一致性之CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少99%一致性之CDR L3。
  54. 一種抗體或重組抗體，其包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有至少100%一致性之互補決定區(CDR) CDR L1、與胺基酸序列SEQ ID NO：2具有至少100%一致性之CDR L2及與胺基酸序列SEQ ID NO：3具有至少100%一致性之CDR L3。
  55. 如請求項53至54中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含重鏈序列，該重鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少80%一致性之至少一個互補決定區(CDR) H1、與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少80%一致性之CDR H2及與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少80%一致性之CDR H3。
  56. 如請求項55之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少90%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少90%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%一致性。
  57. 如請求項55之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少95%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少95%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少95%一致性。
  58. 如請求項55之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少99%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少99%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少99%一致性。
  59. 如請求項55之抗體或重組抗體，其中該CDR H1與胺基酸序列SEQ ID NO：4具有至少100%一致性，該CDR H2與胺基酸序列SEQ ID NO：5具有至少100%一致性，且該CDR H3與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少100%一致性。
  60. 如請求項53至54中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性之重鏈可變區(VH )。
  61. 如請求項55至59中任一項之抗體或重組抗體，其中該重鏈可變區(VH )與胺基酸序列SEQ ID NO：8具有至少80%一致性。
  62. 如請求項53至59中任一項之抗體或重組抗體，其中該輕鏈序列包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有至少80%一致性之輕鏈可變區(VL )。
  63. 如請求項1至62中任一項之抗體或重組抗體，其進一步包含人類重鏈恆定區或人類輕鏈恆定區。
  64. 如請求項63之抗體或重組抗體，其中該人類重鏈恆定區為IgG1或IgG4或其片段。
  65. 如請求項1至64中任一項之抗體或重組抗體，其中該重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：10具有至少80%一致性。
  66. 如請求項1至65中任一項之抗體或重組抗體，其中該輕鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：9具有至少80%一致性。
  67. 如請求項1至64或66中任一項之抗體或重組抗體，其中該重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：12具有至少80%一致性。
  68. 如請求項1至65或66中任一項之抗體或重組抗體，其中該重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：11具有至少80%一致性。
  69. 如請求項1至64中任一項之抗體或重組抗體，其中該重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少80%一致性。
  70. 如請求項1至69中任一項之抗體或重組抗體，其包含人類可變構架區及鼠類恆定區。
  71. 如請求項70之抗體或重組抗體，其進一步包含鼠類重鏈恆定區或鼠類輕鏈恆定區。
  72. 如請求項71之抗體或重組抗體，其中該鼠類重鏈恆定區為IgG2A。
  73. 如請求項72之抗體或重組抗體，其中該重鏈與SEQ ID NO：15之胺基酸序列具有至少80%一致性。
  74. 如請求項72之抗體或重組抗體，其中該重鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：16具有至少80%一致性。
  75. 如請求項72之抗體或重組抗體，其中該輕鏈與胺基酸序列SEQ ID NO：14具有至少80%一致性。
  76. 如請求項1至75中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體為抗體片段，該抗體片段包含單一重鏈、單一輕鏈、Fab、Fab'、F(ab)'、F(ab')2 、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、可變NAR域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2 、三特異性Fab3 、單鏈結合多肽、dAb片段，或雙功能抗體。
  77. 如請求項1至76中任一項之抗體或重組抗體，其特異性結合至免疫抑制性人類骨髓細胞上所表現之CD163蛋白，其中該抗體或該重組抗體結合至該骨髓細胞促進免疫細胞功能，如依據以下參數中之一者或兩者所量測： (i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及 (ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。
  78. 如請求項77之抗體或重組抗體，其中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依IFN-γ、TNF-α或穿孔素或其任何組合的含量增強來量測。
  79. 如請求項77之抗體或重組抗體，其中該免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞或骨髓源抑制細胞。
  80. 如請求項77之抗體或重組抗體，其中該免疫細胞功能存在於腫瘤微環境中。
  81. 如請求項77至80中任一項之抗體或重組抗體，其中該免疫細胞功能存在於活體內。
  82. 如請求項1至76中任一項之抗體或重組抗體，其特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白，其中該抗體或該重組抗體結合至該巨噬細胞增強腫瘤微環境中之免疫刺激活性。
  83. 如請求項82之抗體或重組抗體，其中該腫瘤微環境存在於活體內。
  84. 如請求項79至83中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體結合至該巨噬細胞減少該巨噬細胞之免疫抑制活性。
  85. 如請求項79至84中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體結合至該巨噬細胞減少該巨噬細胞之促腫瘤活性。
  86. 如請求項79至85中任一項之抗體或重組抗體，其中該巨噬細胞係腫瘤相關巨噬細胞。
  87. 如請求項79至85中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體改變至少一種標記物在該巨噬細胞上之表現。
  88. 如請求項77至86中任一項之抗體或重組抗體，其中該CD163蛋白為CD163之糖型。
  89. 如請求項77至87中任一項之抗體或重組抗體，其中該CD163蛋白為CD163之150 kDa糖型。
  90. 如請求項79至89中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或重組抗體不特異性結合至由該人類巨噬細胞表現之CD163的130 kDa糖型。
  91. 如請求項1至90中任一項之抗體或重組抗體，其具有能夠結合至Fc受體之恆定域。
  92. 如請求項91之抗體或重組抗體，其中該Fc受體表現於該巨噬細胞上。
  93. 如請求項1至92中任一項之抗體或重組抗體，其具有抗體片段，該抗體片段包含單一重鏈、單一輕鏈、Fab、Fab'、F(ab)'、F(ab')2 、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、可變NAR域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2 、三特異性Fab3 、單鏈結合多肽、dAb片段，或雙功能抗體。
  94. 如請求項79至93中任一項之抗體或重組抗體，其中該人類巨噬細胞上之至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2，或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15。
  95. 如請求項79至93中任一項之抗體或重組抗體，其中該人類巨噬細胞係M2巨噬細胞或M2樣巨噬細胞。
  96. 如請求項79至93中任一項之抗體或重組抗體，其中該人類巨噬細胞係M2a、M2b、M2c或M2d巨噬細胞。
  97. 如請求項79至96中任一項之抗體或重組抗體，其中該CD163蛋白為包含至少一種由該巨噬細胞表現之其他蛋白質的細胞表面複合物之組分。
  98. 如請求項97之抗體或重組抗體，其中該至少一種其他蛋白質為半乳糖凝集素-1蛋白、LILRB2蛋白、酪蛋白激酶II蛋白，或其任何組合。
  99. 如請求項79至98中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或重組抗體在與該CD163蛋白結合後，被該人類巨噬細胞內化。
  100. 如請求項79至99中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白對該巨噬細胞無細胞毒性。
  101. 如請求項79至100中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖，或CD4+ T細胞活化與增殖。
  102. 如請求項77至101中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD4+ T細胞表現CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合。
  103. 如請求項77至102中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖，或CD8+ T細胞活化與增殖。
  104. 如請求項77至103中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD8+ T細胞表現ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合。
  105. 如請求項77至104中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白減少腫瘤微環境中之免疫抑制。
  106. 如請求項77至105中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。
  107. 如請求項77至106中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。
  108. 如請求項77至107中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  109. 如請求項77至108中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白促進T細胞表現IL-2。
  110. 如請求項77至109中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至該CD163蛋白增加CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞，或其任何組合。
  111. 如請求項77至110中任一項之抗體或重組抗體，其中結合至CD163減少腫瘤微環境中由巨噬細胞引起的免疫抑制。
  112. 如請求項1至111中任一項之抗體或重組抗體，其特異性結合至人類巨噬細胞上所表現的CD163蛋白，其中結合引起以下效應中之至少一者： (a)該巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該巨噬細胞內化； (c) IFN-γ、TNF-α及穿孔素的分泌； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (e) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (f)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
  113. 如請求項112之抗體或重組抗體，其中該結合引起：(a)至(e)中之兩者或更多者；(a)至(e)中之三者或更多者；(a)至(e)中之四者或更多者；或(a)至(e)之全部。
  114. 如請求項1至113中任一項之抗體或重組抗體，其特異性結合至腫瘤微環境中之CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞，其中該結合減少抑制細胞毒性T細胞介導該腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。
  115. 如請求項1至114中任一項之抗體或重組抗體，其特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少該巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15或其組合的表現，以用於治療癌症之方法中。
  116. 如請求項79至115之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體對該巨噬細胞的結合調節腫瘤微環境中之細胞免疫功能。
  117. 如請求項79至115之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體結合至該巨噬細胞促進抗腫瘤免疫功能。
  118. 如請求項1至117中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：18之CD163抗原決定基。
  119. 如請求項1至117中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：19之CD163抗原決定基。
  120. 如請求項1至117中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：20之CD163抗原決定基。
  121. 如請求項1至117中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體特異性結合至包含胺基酸序列SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20中之每一者的CD163抗原決定基。
  122. 如請求項1至121中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體以1 nM至100 nM之KD 特異性結合至CD163。
  123. 如請求項122之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體以1 nM至50 nM之KD 特異性結合至CD163。
  124. 如請求項123之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體以1 nM至10 nM之KD 特異性結合至CD163。
  125. 如請求項1至121中任一項之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體以1 nM至100 nM之KD 特異性結合至人類M2c巨噬細胞。
  126. 如請求項125之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體以1 nM至50 nM之KD 特異性結合至人類M2c巨噬細胞。
  127. 如請求項126之抗體或重組抗體，其中該抗體或該重組抗體以1 nM至10 nM之KD 特異性結合至人類M2c巨噬細胞。
  128. 一種組合物，其包含如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體及賦形劑。
  129. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體及醫藥學上可接受之賦形劑。
  130. 一種如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體的用途，其用於製造供治療人類個體之癌症用的藥劑。
  131. 一種如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑使患有癌症之人類個體中之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制減少。
  132. 一種如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑促進患有癌症之人類個體中的T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  133. 一種促進有需要之個體之免疫細胞功能的方法，該方法包含：向有需要之個體投與如請求項1至132中任一項之抗體或重組抗體；其中 促進免疫細胞功能，如依據以下參數中之一或兩者所量測： (i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及 (ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。
  134. 如請求項133之方法，其中CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化係依IFN-γ、TNF-α或穿孔素或其任何組合的含量增加來量測。
  135. 如請求項133之方法，其中該免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞。
  136. 如請求項135之方法，其中該免疫抑制性人類骨髓細胞為骨髓源抑制細胞。
  137. 如請求項136之方法，其中該抗體為如請求項76至127中任一項之抗體或重組抗體。
  138. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體，從而治療該個體之該癌症。
  139. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體，藉此減少該個體中之腫瘤相關巨噬細胞所引起的免疫抑制。
  140. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體，藉此增強該個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  141. 一種減少有需要之個體中之腫瘤相關巨噬細胞之促腫瘤活性的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體，其有效調節CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖、CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖或任何組合。
  142. 一種促進有需要之個體中之淋巴球介導腫瘤細胞殺滅的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體。
  143. 如請求項138至142中任一項之方法，其中該癌症為肺癌或肉瘤。
  144. 如請求項143之方法，其中該肺癌為肺癌瘤或肺腺癌。
  145. 如請求項138至142中任一項之方法，其中該抗體或該重組抗體結合至腫瘤微環境中之巨噬細胞。
  146. 如請求項138至142中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與另一種抗癌療法。
  147. 如請求項146之方法，其中該另一種抗癌療法為外科療法、化學療法、輻射療法、冷凍療法、激素療法、免疫療法及細胞介素療法，以及其組合。
  148. 如請求項147之方法，其中該另一種抗癌療法為免疫療法。
  149. 如請求項148之方法，其中該免疫療法為包含檢查點抑制劑之組合物。
  150. 一種調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞活性的方法，該方法包含使該腫瘤相關巨噬細胞與結合至表現CD163之人類巨噬細胞的如請求項1至127中任一項之抗體或重組抗體接觸且包含以下效應中之至少一者： (a)該抗體的結合使該巨噬細胞上之至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體與該CD163蛋白結合後，該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c)該抗體的結合對該巨噬細胞無細胞毒性； (d)該抗體的結合使IFN-γ、TNF-α及穿孔素的含量增加； (e)該抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (f)該抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (g)該抗體的結合促進該腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
  151. 如請求項150之方法，其中該結合引起：(a)至(g)中之兩者或更多者；(a)至(g)中之三者或更多者；(a)至(g)中之四者或更多者；(a)至(g)中之五者或更多者；(a)至(g)中之六者或更多者；或(a)至(g)的全部。
  152. 一種特異性結合至免疫抑制性人類骨髓細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該抗體結合至該骨髓細胞促進免疫細胞功能，如依據以下參數中之一或兩者所量測： (i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及 (ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。
  153. 如請求項152之抗體，其中該免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞或骨髓源抑制細胞。
  154. 一種特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該抗體結合至該巨噬細胞促進免疫細胞功能，如依據以下參數中之一或兩者所量測： (i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及 (ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。
  155. 如請求項152至154中任一項之抗體，其中該免疫細胞功能存在於腫瘤微環境中。
  156. 如請求項152至155中任一項之抗體，其中該免疫細胞功能存在於活體內。
  157. 一種特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中該抗體結合至該巨噬細胞使腫瘤微環境中的免疫刺激活性增加。
  158. 如請求項157之抗體，其中該腫瘤微環境存在於活體內。
  159. 如請求項153至158中任一項之抗體，其中該抗體結合至該巨噬細胞使該巨噬細胞的免疫抑制活性減少。
  160. 如請求項153至159中任一項之抗體，其中該抗體結合至該巨噬細胞使該巨噬細胞的促腫瘤活性減少。
  161. 如請求項153至160中任一項之抗體，其中該巨噬細胞係腫瘤相關巨噬細胞。
  162. 如請求項153至161中任一項之抗體，其中該抗體改變至少一種標記物在該巨噬細胞上的表現。
  163. 如請求項152至162中任一項之抗體，其中該CD163蛋白為CD163之糖型。
  164. 如請求項152至163中任一項之抗體，其中該CD163蛋白為CD163之150 kDa糖型。
  165. 如請求項153至164中任一項之抗體，其中該抗體不特異性結合至由該人類巨噬細胞表現之CD163的130 kDa糖型。
  166. 如請求項152至165中任一項之抗體，其具有能夠結合至Fc受體之恆定域。
  167. 如請求項166之抗體，其中該Fc受體表現於該巨噬細胞上。
  168. 如請求項152至167中任一項之抗體，其具有抗體片段，該抗體片段包含單一重鏈、單一輕鏈、Fab、Fab'、F(ab)'、F(ab')2 、Fd、scFv、重鏈可變域、輕鏈可變域、可變NAR域、雙特異性scFv、雙特異性Fab2 、三特異性Fab3 、單鏈結合多肽、dAb片段，或雙功能抗體。
  169. 如請求項153至168中任一項之抗體，其中該人類巨噬細胞上之至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2，或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15。
  170. 如請求項153至169中任一項之抗體，其中該人類巨噬細胞係M2巨噬細胞或M2樣巨噬細胞。
  171. 如請求項170之抗體，其中該人類巨噬細胞係M2a、M2b、M2c或M2d巨噬細胞。
  172. 如請求項153至171中任一項之抗體，其中該CD163蛋白為包含至少一種由該巨噬細胞表現之其他蛋白質的細胞表面複合物之組分。
  173. 如請求項172之抗體，其中該至少一種其他蛋白質為半乳糖凝集素-1蛋白、LILRB2蛋白、酪蛋白激酶II蛋白，或其任何組合。
  174. 如請求項153至173中任一項之抗體，其中該抗體在與該CD163蛋白結合後，被該人類巨噬細胞內化。
  175. 如請求項153至174中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白對該巨噬細胞無細胞毒性。
  176. 如請求項152至175中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖，或CD4+ T細胞活化與增殖。
  177. 如請求項152至176中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD4+ T細胞表現CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合。
  178. 如請求項152至177中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖，或CD8+ T細胞活化與增殖。
  179. 如請求項152至178中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進CD8+ T細胞表現ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合。
  180. 如請求項152至179中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白減少腫瘤微環境中之免疫抑制。
  181. 如請求項152至180中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。
  182. 如請求項152至181中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。
  183. 如請求項152至182中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  184. 如請求項152至183中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白促進T細胞表現IL-2。
  185. 如請求項152至184中任一項之抗體，其中結合至該CD163蛋白增加CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞，或其任何組合。
  186. 如請求項152至185中任一項之抗體，其中結合至CD163減少腫瘤微環境中由巨噬細胞引起的免疫抑制。
  187. 一種特異性結合至人類巨噬細胞上所表現之CD163蛋白的抗體，其中結合引起以下效應中之至少一者： (a)該巨噬細胞對至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體被該巨噬細胞內化； (c) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (d) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (e)促進腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
  188. 如請求項187之抗體，其中該結合引起：(a)至(e)中之兩者或更多者；(a)至(e)中之三者或更多者；(a)至(e)中之四者或更多者；或(a)至(e)之全部。
  189. 一種抗體，其特異性結合至腫瘤微環境中之CD163+ 免疫抑制性骨髓細胞，其中該結合使對細胞毒性T細胞介導腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅的抑制減少。
  190. 一種抗體，其特異性結合至人類腫瘤相關巨噬細胞上所表現的CD163蛋白且減少巨噬細胞對CD16、CD64、TLR2、唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15或其組合的表現，以用於治療癌症之方法中。
  191. 如請求項153至190之抗體，其中該抗體結合至該巨噬細胞調節腫瘤微環境中之細胞免疫功能。
  192. 如請求項153至191之抗體，其中該抗體結合至該巨噬細胞促進抗腫瘤免疫功能。
  193. 一種組合物，其包含如請求項152至192中任一項之抗體及賦形劑。
  194. 一種醫藥組合物，其包含如請求項152至192中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  195. 一種如請求項152至192中任一項之抗體的用途，其用於製造供治療人類個體之癌症用的藥劑。
  196. 一種如請求項152至192中任一項之抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑使患有癌症之人類個體之腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制減少。
  197. 一種如請求項152至192中任一項之抗體用於製造藥劑的用途，該藥劑促進患有癌症之人類個體中的T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  198. 一種促進免疫細胞功能之方法，該方法包含： 使抗體特異性結合至免疫抑制性人類骨髓細胞上所表現的CD163蛋白；及 促進免疫細胞功能，如依據以下參數中之一或兩者所量測： (i) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化；及 (ii) CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖。
  199. 如請求項198之方法，其中該免疫抑制性人類骨髓細胞為巨噬細胞。
  200. 如請求項198之方法，其中該免疫抑制性人類骨髓細胞為骨髓源抑制細胞。
  201. 如請求項198之方法，其中該抗體為如請求項152至192中任一項之抗體。
  202. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項152至192中任一項之抗體，從而治療該個體之該癌症。
  203. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項152至192中任一項之抗體，藉此減少該個體中之腫瘤相關巨噬細胞所引起的免疫抑制。
  204. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項152至192中任一項之抗體，藉此增強該個體中之T細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  205. 如請求項198至204中任一項之方法，其中該癌症為肺癌或肉瘤。
  206. 如請求項205之方法，其中該肺癌為肺癌瘤或肺腺癌。
  207. 一種使有需要之個體中之腫瘤相關巨噬細胞之促腫瘤活性減少的方法，該方法包含向該個體投與有效調節腫瘤微環境中之CD4+ T細胞活化、CD4+ T細胞增殖、CD8+ T細胞活化、CD8+ T細胞增殖或其任何組合之量的如請求項194之醫藥組合物。
  208. 如請求項207之方法，其進一步包含促進該腫瘤微環境中之腫瘤細胞殺滅。
  209. 一種促進有需要之個體中之淋巴球介導腫瘤細胞殺滅的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項194之醫藥組合物。
  210. 一種調節腫瘤微環境中之腫瘤相關巨噬細胞之活性的方法，該方法包含使該腫瘤相關巨噬細胞與結合至表現CD163之人類巨噬細胞的抗體接觸且包含以下效應中之至少一者： (a)該抗體的結合使該巨噬細胞上之至少一種標記物的表現減少，其中該至少一種標記物為CD16、CD64、TLR2或唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-15； (b)該抗體與該CD163蛋白結合後，該抗體被該人類巨噬細胞內化； (c)該抗體的結合對該巨噬細胞無細胞毒性； (d)該抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的活化； (e)該抗體的結合促進CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞或其任何組合的增殖；及 (f)該抗體的結合促進該腫瘤微環境中的腫瘤細胞殺滅。
  211. 如請求項210之方法，其中該結合引起：(a)至(f)中之兩者或更多者；(a)至(f)中之三者或更多者；(a)至(f)中之四者或更多者；(a)至(f)中之五者或更多者；或(a)至(f)之全部。
  212. 如請求項198至211中任一項之方法，其中該方法發生於腫瘤微環境中。
  213. 如請求項198至212中任一項之方法，其中該方法發生於活體內。
  214. 如請求項198至213中任一項之方法，其中該抗體結合至該巨噬細胞調節腫瘤微環境中之細胞免疫功能。
  215. 如請求項198至214中任一項之方法，其中該抗體結合至該巨噬細胞促進抗腫瘤免疫功能。
  216. 如請求項198至215中任一項之方法，其中該抗體包含恆定域且該恆定域結合至Fc受體。
  217. 如請求項216之方法，其中該Fc受體表現於該巨噬細胞上。
  218. 如請求項198至217中任一項之方法，其進一步包含該抗體在與該CD163蛋白結合後，被該人類巨噬細胞內化。
  219. 如請求項198至218中任一項之方法，其中結合至該CD163蛋白對該人類巨噬細胞無細胞毒性。
  220. 如請求項198至219中任一項之方法，其進一步包含促進CD4+ T細胞表現CD69、ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合。
  221. 如請求項198至220中任一項之方法，其進一步包含促進CD8+ T細胞表現ICOS、OX40、PD1、LAG3、CTLA4或其任何組合。
  222. 如請求項198至221中任一項之方法，其包含減少腫瘤微環境中之免疫抑制。
  223. 如請求項198至222中任一項之方法，其包含促進細胞毒性淋巴球介導癌細胞殺滅。
  224. 如請求項198至223中任一項之方法，其包含促進NK細胞介導腫瘤細胞殺滅。
  225. 如請求項198至224中任一項之方法，其包含促進T細胞表現IL-2。
  226. 如請求項198至225中任一項之方法，包含增加CD4+ T細胞、CD196- T細胞、CXCR3+ T細胞、CCR4- T細胞，或其任何組合。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022000726A (es) 2019-07-19 2022-02-10 Oncoresponse Inc Anticuerpos inmunomoduladores y metodos de uso de los mismos.
US20240084029A1 (en) * 2021-01-20 2024-03-14 Oncoresponse, Inc. Use of immunomodulatory antibodies to treat fibrotic diseases
WO2022159349A1 (en) * 2021-01-20 2022-07-28 Oncoresponse, Inc. Immunomodulatory antibodies and uses thereof
CN116997357A (zh) * 2021-03-08 2023-11-03 免疫医疗有限责任公司 针对gdf-15的抗体
TW202317638A (zh) * 2021-08-30 2023-05-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 雙特異性樹突狀細胞接合體及其用途
TW202311293A (zh) * 2021-09-03 2023-03-16 美商昂科里斯龐司公司 免疫療法之組合及其用途

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
ATE444082T1 (de) 2000-10-16 2009-10-15 Cytoguide Aps Funktion eines haptoglobin-hämoglobin-rezeptors und anwendungszwecke dafür
AU2003243058A1 (en) 2002-05-27 2003-12-12 Bioceros B.V. Methods for using the cd163 pathway for modulating an immune response
EP1367393A1 (en) * 2002-05-27 2003-12-03 MacroZyme B.V. Methods for using the CD 163 pathway for modulating an immune response
WO2004063343A2 (en) 2003-01-09 2004-07-29 Macrogenics, Inc. Dual expression vector system for antibody expression in bacterial and mammalian cells
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
US8142781B2 (en) 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
GB0917044D0 (en) 2009-09-29 2009-11-18 Cytoguide As Agents, uses and methods
EP2496600A1 (en) 2009-11-04 2012-09-12 Fabrus LLC Methods for affinity maturation-based antibody optimization
RS57870B1 (sr) 2010-01-06 2018-12-31 Dyax Corp Proteini koji vezuju kalikrein plazme
BR112013010213A2 (pt) 2010-10-26 2019-09-24 Technion Research & Development Foundation Ltd anticorpos que unem ligantes solúveis de receptores de célula t
KR102107695B1 (ko) 2011-01-06 2020-05-07 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
WO2013008171A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Antibodies that bind to ox40 and their uses
WO2013167883A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
WO2014114801A1 (en) 2013-01-25 2014-07-31 Amgen Inc. Antibodies targeting cdh19 for melanoma
KR102204127B1 (ko) 2013-02-01 2021-01-20 키라 바이오테크 피티와이 리미티드 항-cd83 항체 및 이의 용도
US10519251B2 (en) * 2013-12-30 2019-12-31 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
SG11201610074YA (en) 2014-06-06 2016-12-29 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
LT3115376T (lt) 2015-07-10 2018-11-12 Merus N.V. Antikūnai, kurie jungiasi su žmogaus cd3
TW201713690A (zh) 2015-08-07 2017-04-16 再生元醫藥公司 抗ａｎｇｐｔｌ８抗體及其用途
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
EP3443001A4 (en) 2016-04-11 2020-04-29 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11596699B2 (en) 2016-04-29 2023-03-07 CureVac SE RNA encoding an antibody
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
JP7133551B2 (ja) 2016-11-17 2022-09-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ａｎｇｐｔｌ８抗体を用いて肥満を処置する方法
US20190359937A1 (en) 2016-11-17 2019-11-28 Innovative Targeting Solutions Inc. Chimeric receptors, biosensor host cells and methods/uses thereof
WO2018140831A2 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Silverback Therapeutics, Inc. Tumor targeting conjugates and methods of use thereof
WO2019084060A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Silverback Therapeutics, Inc. CONJUGATES AND METHODS OF USE FOR THE SELECTIVE DELIVERY OF IMMUNOMODULATORY AGENTS
WO2019126194A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Angptl8 assay and uses thereof
EP3732201A4 (en) 2017-12-19 2022-04-20 Surrozen Operating, Inc. WNT SUBSTITUTION MOLECULES AND THEIR USES
SG10201801219VA (en) 2018-02-13 2019-09-27 Agency Science Tech & Res Anti-HER2 Antibodies
CA3105000A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to cell adhesion molecule 3
WO2020018434A1 (en) 2018-07-17 2020-01-23 Scripps Health Compositions and methods for disrupting a macrophage network
CN113396160A (zh) 2018-09-19 2021-09-14 国家医疗保健研究所 治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法和药物组合物
MX2022000726A (es) 2019-07-19 2022-02-10 Oncoresponse Inc Anticuerpos inmunomoduladores y metodos de uso de los mismos.

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