TW202114667A - Mek抑制劑與cdk4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途 - Google Patents

Mek抑制劑與cdk4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途 Download PDF

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Abstract

本發明關於一種MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。具體而言，本發明所述MEK抑制劑選自式（I）所示化合物或其可藥用鹽，所述CDK4/6抑制劑選自式（II）所示化合物或其可藥用鹽。

Description

MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途
本發明要求申請日為2019年9月11日的中國專利申請CN201910859697.0的優先權。本發明引用上述中國專利申請的全文。
本發明關於一種MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途，屬於製藥領域。
惡性腫瘤的發生和發展與細胞內訊號傳導路徑的異常持續活化密切相關。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）組成的訊號路徑調控著細胞的多個重要生理過程，在脊椎動物以及所有的多細胞生物中共有4條MAPK路徑，其中ERK途徑（RAS-RAF-MEK1/2- ERK1/2）是在人類腫瘤中最常發生級聯訊號失調的一條經典的MAPK訊號路徑。ERK路徑的異常活化通常是由RAS和RAF基因家族成員的獲得性突變導致，比如33%的膽管癌、36%的大腸癌、19%的肺癌、18%的膀胱癌、63%的胰腺癌、15%的前列腺癌存在RAS編碼基因（主要是KRAS、NRAS和HRAS）的突變，但是目前FDA尚未批准有效的用於治療RAS突變的方法。
MEK（MEK1和MEK2）是ERK路徑上的一種絲/蘇胺酸和酪胺酸雙功能激酶，可被上游的RAS和RAF激酶磷酸化，活化後將訊號傳導至下游，最終可以磷酸化一些核心的轉錄因子，從而參與細胞增殖與分化的調控。所以抑制MEK的磷酸化可以阻止訊號的進一步傳導，從而達到抑制訊號路徑持續活化、抑制腫瘤生長的作用。
目前已公開了一系列MEK抑制劑，其中WO2015058589公開了其結構和製備方法，體外研究顯示其具有較好的腫瘤抑制活性，具體結構如式（I）所示，
Figure 02_image001
。
CN106795116A公開了式（I）所示化合物的對甲苯磺酸鹽及晶型。
細胞週期蛋白依賴型激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）是一類絲胺酸/蘇胺酸激酶，通過與相應的細胞週期蛋白（Cyclin）形成二聚體，進而磷酸化下游蛋白分子，從而推動細胞週期各時相的有序行進，實現細胞生長和增殖。目前，國外已有多種CDK4/6選擇性抑制劑在臨床試驗階段或已獲批上市，其中包括輝瑞公司的Palbociclib、諾華公司的Ribociclib及禮來公司的Abemaciclib等。
WO2014183520公開了一種化學名為6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-((5-(呱啶-4-基)吡啶-2-基)胺基)吡啶並[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，結構式如式（II）所示的CDK4/6抑制劑，其具有顯著的CDK4/6的抑制活性和高度選擇性，
Figure 02_image003
。 （II）
WO2016124067A公開了上述式（I）所示化合物的羥乙基磺酸鹽及其製備方法。
本發明提供一種MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
本發明所述的腫瘤選自結直腸癌、膽道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、胃癌、肝細胞癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、粘液瘤、惡性纖維組織細胞瘤、造血系統惡性腫瘤、神經母細胞瘤、頭頸部癌、子宮內膜癌、大腸癌、食管癌、卵巢癌、唾液腺癌、小腸癌、胸腺癌、中樞神經系統腫瘤、骨癌、腎上腺腺瘤、腎細胞癌、神經母細胞瘤。
本發明中所述膽道癌具體可以是肝內膽管癌、肝外膽管癌或膽囊癌；所述的甲狀腺癌具體可以是甲狀腺濾泡癌、甲狀腺未分化癌、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺Hurthle細胞癌；所述的淋巴瘤具體可以是伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、套細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病；所述的肺癌可以是非小細胞肺癌、小細胞肺癌、所述的非小細胞肺癌可以是腺癌、鱗癌或大細胞癌；所述的造血系統惡性腫瘤可以是急性髓性白血病、慢性粒細胞白血病、慢性粒單核細胞白血病、幼年型髓單核細胞白血病。
本發明可選的實施方案中，所述腫瘤為Ras基因突變腫瘤，具體可以為KRAS基因和/或NRAS基因和/或HRAS基因突變。
本發明中可選的實施方案中，所述腫瘤為晚期或者轉移性的Ras基因突變腫瘤。
本發明可選的實施方案中，所述MEK抑制劑選自AZD-8330、GDC-0623、CI-1040、WX-554、TAK-733、SL-327、APS-2-79、BI-847325、HL-085、BI-847325、CEP-1347、U-0126、Binimetinib、Pimasertib、Cobimetinib、PD-0325901、PD-318088、RO-5126766、BIX-02189、BIX-02188、PD-98059、Trametinib、Refametinib、AS-703988、E-6201、Selumetinib、或式（I）所示化合物或其可藥用鹽，
Figure 02_image001
。
本發明的一些實施方案中，所述MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其可藥用鹽。
在一些實施方案中，所述MEK抑制劑的每日劑量範圍選自0.01-500mg，給藥頻率為每日2次、每日1次、每2天1次、每3天一次。
在一些實施方案中，本發明中所述MEK抑制劑的每日劑量選自0.1mg、0.125mg、0.25mg、0.5mg、0.75mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、12.5mg、15mg、17.5mg、20mg、22.5mg、25mg、30mg、45mg、50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、400mg、500mg，優選0.25mg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、10mg、15mg、20mg、30mg、45mg、50mg、60mg、75mg、100mg；給藥頻率為每日2次、每日1次、每2天1次、每3天一次，優選每日2次或每日1次，最優選每日1次。
在一些實施方案中，所述MEK抑制劑的每日劑量範圍選自0.125mg-10mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，所述MEK抑制劑的每日劑量範圍選自0.125mg-4mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，所述MEK抑制劑的每日劑量選自0.100mg、0.125mg、0.250 mg、0.375 mg、0.500 mg、0.625 mg、0.750 mg、0.875 mg、1.000 mg、1.125 mg、1.250 mg、1.375 mg、1.500 mg、1.625 mg、1.750 mg、1.875 mg、2.000 mg、2.125 mg、2.250 mg、2.375 mg、2.500 mg、2.625 mg、2.750 mg、2.875 mg、3.000 mg、3.125 mg、3.250 mg、3.375 mg、3.500 mg、3.625 mg、3.750 mg、3.875 mg、4.000 mg、4.125 mg、4.250 mg、4.375 mg、4.500 mg、4.625 mg、4.750 mg、4.875 mg、5.000 mg、5.125 mg、5.250 mg、5.375 mg、5.500 mg、5.625 mg、5.750 mg、5.875 mg、6.000 mg、6.125 mg、6.250 mg、6.375 mg、6.500 mg、6.625 mg、6.750 mg、6.875 mg、7.000 mg、7.125 mg、7.250 mg、7.375 mg、7.500 mg、7.625 mg、7.750 mg、7.875 mg、8.000 mg、8.125 mg、8.250 mg、8.375 mg、8.500 mg、8.625 mg、8.750 mg、8.875 mg、9.000 mg、9.125 mg、9.250 mg、9.375 mg、9.500 mg、9.625 mg、9.750 mg、9.875 mg、10.000mg，給藥頻率為每日1次。
可選的實施方案中，所述的MEK抑制劑每日給藥劑量為0.25mg、0.375mg、0.5mg、0.75mg、1mg、1.25mg、1.50mg、1.75mg、2mg、2.25mg、2.50mg、2.75mg、3mg、3.25mg、3.50mg、3.75mg、4mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，所述的MEK抑制劑每日給藥劑量為0.25mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，所述的MEK抑制劑每日給藥劑量為0.375mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，所述的MEK抑制劑每日給藥劑量為0.5mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，所述的MEK抑制劑每日給藥劑量為0.75mg，給藥頻率為每日1次。
在一些實施方案中，本發明所述的CDK4/6抑制劑可選自palbociclib、FCN-437c、abemaciclib、ribociclib、Alvocidib、trilaciclib、lerociclib、birociclib、PF-06873600，或式（II）所示化合物或其可藥用鹽，優選式（II）所示化合物或其可藥用鹽，
Figure 02_image003
。 （II）
一些實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量為1-500mg，給藥頻率為每日一次或每日兩次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg，給藥頻率為每日一次或每日兩次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自50-200mg，給藥頻率為每日一次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg，給藥頻率為每日一次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自75mg，給藥頻率為每日一次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自100mg，給藥頻率為每日一次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自125mg，給藥頻率為每日一次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自150mg，給藥頻率為每日一次。
可選的實施方案中，所述的CDK4/6抑制劑每日劑量選自175mg，給藥頻率為每日一次。
本發明中所述式（I）所示化合物或式（II）所示化合物的藥學上可接受的鹽可以是鹽酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、丙二酸鹽、戊酸鹽、穀胺酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、對甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、羥乙基磺酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、苯甲酸鹽、雙羥萘酸鹽、水楊酸鹽、香草酸鹽、扁桃酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、乳糖酸鹽或月桂基磺酸鹽等。
在一些實施方案中所述MEK抑制劑為式（I）所示化合物的藥學上可接受的鹽，所述CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物的藥學上可接受的鹽。
在一些實施方案中，本發明中式（I）所示化合物的藥學上可接受的鹽為甲苯磺酸鹽。
在一些實施方案中，本發明中式（II）所示化合物的藥學上可接受的鹽為羥乙基磺酸鹽。
可選的實施方案中，CDK4/6抑制劑每日一次給藥，給藥三週，停藥一週；MEK抑制劑每日一次給藥，給藥三週，停藥一週。
可選的實施方案中，CDK4/6抑制劑每日一次給藥，給藥三週，停藥一週；MEK抑制劑每日一次給藥，給藥四週。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自75mg、100mg、125mg、150mg或175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為0.25mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自75mg、100mg、125mg、150mg或175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為0.375mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自75mg、100mg、125mg、150mg或175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為0.5mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自75mg、100mg、125mg、150mg或175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為0.75；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自75mg、100mg、125mg、150mg或175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為75mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為100mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為125mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為150mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為100mg或175mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為100mg。
在一些實施方案中，本發明提供的用途，MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg；CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其藥學上可接受的鹽，每日劑量為175mg。
本發明中所述MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合給藥時，給藥途徑選自經口給藥、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射。
可選的實施方案中，MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑均口服給藥。
本發明提供一種包含上述MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑的藥物組合物，所述藥物組合物除含有MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑作為活性成分外，另含有一種或多種可藥用的賦型劑、稀釋劑或載體。本發明中所述的組合物可以配製為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、注射劑（包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液）、栓劑、吸入劑或噴霧劑。
本發明提供的上述含MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑的藥物組合物可用於治療腫瘤。
本發明提供一種治療腫瘤的方法，包括給與患者治療有效量的上述MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑。
本發明另一方面提供一種用於治療腫瘤的MEK抑制劑，所述MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合使用。
本發明另一方面提供一種用於治療腫瘤的CDK4/6抑制劑，所述CDK4/6抑制劑與MEK抑制劑聯用。
本發明提供的治療腫瘤的方法，所述MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合給藥時，給藥途徑任選相同或者不同，所述給藥途徑選自經口給藥、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射，優選二者均經口給藥。
本發明中所述的「聯合」是一種給藥方式，是指在一定時間期限內給予至少一種劑量的MEK抑制劑和CDK4/6抑制劑，其中兩種藥物都顯示藥理學作用。所述的時間期限可以是一個給藥週期內，優選4週內、3週內、2週內、1週內、或24小時以內。可以同時或依次給予MEK抑制劑和CDK4/6抑制劑。這種期限包括這樣的治療，其中通過相同給藥途徑或不同給藥途徑給予給予MEK抑制劑和CDK4/6抑制劑。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制本發明的範圍。
實施例1、檢測藥物藥物A和藥物B單獨用藥以及聯合用藥在體外藥敏實驗中對3株Ras突變腫瘤細胞系A549、MIA PaCa-2和HCT116的抗增殖作用。
1、實驗材料
細胞株：A549、MIA PaCa-2、HCT116
藥物：式（I）所示化合物甲苯磺酸鹽（藥物A）；式（II）所示化合物羥乙基磺酸鹽（藥物B）。
2、實驗方法
復甦細胞並傳代2次後，待細胞生長鋪展面積達80%-90%時，使用胰酶將腫瘤細胞系A549，MIA PaCa-2和HCT116消化成單個細胞，依據細胞生長特點接種合適的細胞數到96孔板中，並放入37℃，5%二氧化碳培養箱中培養過夜，次日分別混合不同濃度的藥物（藥物A和藥物B），將96孔板放置於二氧化碳培養箱中培養3或4天，用CTG測定每個板孔中的細胞ATP含量，計算不同藥物濃度的抑制率並繪製抑制曲線。
3、實驗結果
3.1 細胞抑制實驗
在Ras突變肺癌A549、胰腺癌MIA PaCa-2、結直腸癌HCT116上進行藥效實驗，如圖1-3，兩藥聯用抑制細胞的生長，效果顯著優於單藥。
3.2 協同抑制實驗（Combination Index，CI） 表1. A549細胞株CI結果
藥物A(μM) 藥物B(μM)
100 20 4 0.8 0.16 0.032 0.0064
20 0.08 0.11 2.75 3.49 3.11 3.14 3.06
4 0.08 0.07 1.11 1.24 1.04 1.10 1.13
0.8 0.09 0.05 0.54 0.34 0.25 0.27 0.29
0.16 0.12 0.05 0.49 0.18 0.09 0.08 0.08
0.032 0.16 0.06 0.76 0.22 0.07 0.04 0.04
0.0064 0.24 0.08 1.00 0.32 0.09 0.04 0.03
0.00128 0.37 0.10 1.13 0.44 0.13 0.06 0.03
0.000256 0.81 0.18 1.30 0.54 0.19 0.39 1.80
表2. MIA PaCa-2細胞株CI結果
藥物A(μM) 藥物B(μM)
100 20 4 0.8 0.16 0.032 0.0064
100 0.22 1.14 1.54 3.21 3.11 3.46 3.54
20 0.23 0.70 1.18 1.04 1.07 1.05 1.24
4 0.26 0.76 0.51 0.37 0.38 0.35 0.45
0.8 0.28 0.63 0.53 0.27 0.23 0.21 0.27
0.016 0.32 0.66 0.87 0.41 0.28 0.25 0.33
0.032 0.39 0.65 1.11 0.46 0.28 0.31 0.50
0.0064 0.50 0.66 1.00 0.63 0.40 0.54 1.26
0.00128 0.74 0.73 1.70 0.74 0.47 1.09 21.03
表3.HCT116細胞株CI結果
藥物A(μM) 藥物B(μM)
100 20 4 0.8 0.16 0.032 0.0064
4 0.54 1.06 4.07 4.27 4.19 4.36 4.49
0.8 0.40 0.43 1.21 1.13 1.08 1.16 1.18
0.016 0.44 0.31 0.61 0.41 0.37 0.40 0.40
0.032 0.48 0.29 0.63 0.25 0.15 0.16 0.17
0.0064 0.55 0.30 0.71 0.27 0.09 0.08 0.10
0.00128 0.71 0.33 0.86 0.32 0.09 0.31 10.07
0.000256 0.89 0.34 1.00 0.33 0.11 8.24 3.05
0.0000512 1.26 0.41 0.97 0.36 0.11 6.83 1.65
根據表1-3，CI計算結果表明在臨床穩態藥物濃度Css（藥物A: 0.03 μM），Css（藥物B: 0.16 μM）範圍的協同效果明顯，有一定抑制效果。
實施例2、受試藥物對HCT116人源結腸癌CDX小鼠皮下移植瘤模型的藥效學研究
1、實驗材料
細胞株：人源結腸癌HCT116細胞，復蘇P4+1代開始擴增，來源於ATCC，培養於含10%胎牛血清（FBS）的McCoy’s 5A培養液中。
實驗動物：90隻BALB/c nude小鼠，雌性，週齡4-8週，體重18-22g，購買於江蘇集萃藥康生物科技有限公司（生產許可：SCXK（蘇）2018-0008），合格證號：201902032，動物使用許可證號：SYXK（滬）2015-0015。
藥物：式（I）所示化合物甲苯磺酸鹽（藥物A）；式（II）所示化合物羥乙基磺酸鹽（藥物B）。
2、實驗步驟及方法
2.1 HCT116人源結腸癌腫瘤細胞的培養、腫瘤接種和分組治療
將HCT116細胞培養在含10% 胎牛血清（FBS）的McCoy’s 5A培養液中。收集指數生長期的HCT116細胞，HBSS重懸至5×107/mL，無菌條件下，移植於BALB/c nude小鼠皮下，每隻小鼠接種0.1 mL細胞懸液即5×106個細胞。觀察接種後小鼠並監測腫瘤的生長。
藥效實驗，在接種12天時分組用荷瘤小鼠平均腫瘤體積達到123.47 mm3 ，即進行藥效實驗的分組和給藥觀察，具體分組訊息如下表4。 表4. 藥效實驗給藥和治療
組別 給藥組 N 劑量(mg/kg) 給藥方案 給藥方案
1 空白 8 -- BID×21 P.O.
2 藥物B 8 30 QD×21 P.O.
3 藥物A 8 0.3 QD×21 P.O.
4 藥物A 8 0.3 QD×21 P.O.
藥物B 30 QD×21 P.O.
註：N：動物隻數；給藥體積為10 μL/g；p.o.：灌胃給藥。
2.2 受試藥物的溶劑和配製（見表5） 表5. 受試藥物配製
藥物/對照 配製 濃度（mg/mL）
溶媒1 0.05% DMSO和0.5% CMC-Na --
溶媒2 0.05 M檸檬酸+0.5% CMC+0.5% Tween-80 --
藥物A 精確稱取1.697 mg 藥物A，充分溶解於28 µL DMSO溶劑中，之後加入55.972 mL 0.5%CMC-Na溶液，最終得到56 mL藥物A 0.03mg/mL澄清透明溶液 0.03
藥物B 精確稱取18.04 mg 藥物B，充分溶解於溶劑對照2 溶液中，最終得到6 mL藥物B 3mg/mL混勻均質溶液。 3
2.3 評估指標及數據分析
主要是檢測受試藥物對HCT116人源結腸癌CDX小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用或完全治癒能力。
2.3.1 腫瘤體積和荷瘤鼠體重測量：使用遊標卡尺每週兩次測量，腫瘤體積計算公式為V = 0.5 a× b2 ，a，b分別代表腫瘤的長徑和寬徑；
2.3.2 腫瘤生長抑制率TGI（%）= [1-(Ti-T0 )/(Vi-V0 )]×100 Ti 為化合物組開始給藥後的平均腫瘤體積，T0 為化合物組首次給藥時的平均腫瘤體積，V0 為溶媒對照組首次給藥時的平均腫瘤體積，Vi 為溶媒對照組開始給藥後的平均腫瘤體積。
2.3.3 相對腫瘤增殖率T/C（%）：計算公式如下：T/C% =100-[1-(Ti-T0 )/(Vi-V0 )]×100，其中Ti為化合物組開始給藥後的平均腫瘤體積，T0為化合物組首次給藥時的平均腫瘤體積，V0為溶媒對照組首次給藥時的平均腫瘤體積，Vi為溶媒對照組開始給藥後的平均腫瘤體積。
2.3.4 聯合給藥組增效效應：金氏公式Q=E(a+b)/[Ea+Eb-Ea × Eb]，Ea 為單藥TGI，Q值＞1反映藥物聯用具有增效效應。
2.3.5 所有荷瘤鼠體重每週測量兩次。同時計算給藥後小鼠體重相對變化比率：RCBW(%) = (BWi – BW0 )/BW0 ×100，BWi 為開始給藥後的平均體重，BW0 為首次給藥時的平均體重；
2.3.6 實驗結束後腫瘤照片和腫瘤塊的重量。T/Cweight %= Tweight /Vweight ×100%，Tweight 為化合物組實驗結束時的平均腫瘤重量，Vweight 為溶媒對照組實驗結束時的平均腫瘤重量。
所有數據均採用Mean±SEM表示，用One-way ANOVA LSD test比較治療組腫瘤體積和瘤重與對照組相比有無顯著性差異；用Student’s t test比較單藥治療組和聯合治療組兩組之間有無顯著性差異。所有的數據均用Graphpad進行分析。p ＜ 0.05即認為具有顯著性差異。
3、實驗結果
3.1 腫瘤體積
受試藥物作用於HCT116人源結腸癌CDX動物模型的抗腫瘤藥效實驗中的各治療組腫瘤體積變化、腫瘤重量以及統計分析結果見圖4、表6、表7和表8。 表6. 腫瘤體積（mm3 ）(Mean±SEM)
組別 實驗起始腫瘤體積/第0天 (mm3 ) 實驗結束腫瘤體積/第21天 (mm3 ) TGI(%)/ 第21天 T/C(%)/ 第21天 P值
1 125.29±17.67 1186.13±163.69 -- -- --
2 122.36±13.22 783.04±95.1 37.72 62.28 0.008**
3 121.59±13.29 614.02±65.4 53.58 46.42 0.0002***
4 123.47±13.73 340.3±33.17 79.56 20.44 0.0000***
註：用One-way ANOVA LSD test比較治療組腫瘤體積與對照組相比有無顯著性差異，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與空白比較。 表7. 聯合給藥組與單藥組相比較的統計學分析結果（第21天）
組別 實驗結束腫瘤體積/第21天(mm3 ) P值（vs 藥物B，30 mg/kg） P值（vs 藥物A，0.3 mg/kg） P值
2 783.04±95.1 -- -- --
3 614.02±65.4 -- -- --
4 340.3±33.17 0.0006▲▲▲ 0.002▼▼ 1.12
註：用Student’s t test比較相應單藥治療組和聯合治療組兩組之間有無顯著性差異，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001，與藥物B 30 mg/kg單藥組比較；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01，與藥物A 0.3 mg/kg單藥組比較。 表8. 腫瘤塊重量（g）（Mean±SEM）
組別 動物數量/（起始/結束） 治療後第22天（g） T/C(%) P值
1 8/8 1.31±0.25 -- --
2 8/8 0.89±0.08 68.00 0.027*
3 8/8 0.64±0.09 48.76 0.0006***
4 8/8 0.31±0.04 23.87 0.0000***
註：用One-way ANOVA LSD test比較治療組腫瘤瘤重與對照組相比有無顯著性差異，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與空白比較。
在第一次給藥開始後第21天，腫瘤體積方面，與空白l組比較，藥物B 30 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組均表現出統計學上明顯的抑制腫瘤生長的作用（P＜0.05）。此外，相比於相應各單藥組的抗腫瘤藥效學結果，藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組表現出統計學上更加明顯的抑制腫瘤生長作用（P＜0.05），並且均具有明顯的增效效應（Q＞1）。
實驗結束後(第22天)，所有治療小鼠被安樂死處理，剝離荷瘤鼠皮下移植瘤塊並進行稱量，腫瘤塊平均重量方面，與空白組相比較，藥物B 30 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組顯示出統計學上明顯抑制腫瘤生長的作用。T/Cweight與T/C總體趨勢一致。
3.2 小鼠體重
各治療組的相對體重變化的結果見表9。本次實驗過程中，所有治療組小鼠均沒有出現體重明顯下降和其他異常症狀，表明荷瘤小鼠對所有治療均耐受性良好。 表9. 治療小鼠體重變化（Mean±SEM）
組別 動物數量/ （起始/結束） 實驗起始動物 體重/第0天(g) 實驗結束動物 體重/第21天(g) 實驗結束動物相對體重變化（%）第21天
1 8/8 21.78±0.82 24.27±0.91 11.58±1.75
2 8/8 19.89±0.51 21.72±0.46 9.44±2.01
3 8/8 20.80±0.78 22.50±0.70 8.36±0.94
4 8/8 20.28±0.59 21.53±0.49 6.44±2.12
實施例3、受試藥物對MIA PaCa-2人源胰腺癌CDX小鼠皮下移植瘤模型的藥效學研究
1、實驗材料
細胞株：人源胰腺癌MIA PaCa-2細胞，復蘇P7+3代開始擴增，來源於ATCC，培養於含10%胎牛血清（FBS）及2.5%馬血清的DMEM培養液中。
實驗動物：100隻BALB/c nude小鼠，雌性，週齡4-8週，體重18-22g，購買於江蘇集萃藥康生物科技有限公司（生產許可：SCXK（蘇）2018-0008），合格證號：201901853，動物使用許可證號：SYXK（滬）2015-0015。
藥物：式（I）所示化合物甲苯磺酸鹽（藥物A）；式（II）所示化合物羥乙基磺酸鹽（藥物B）。
2、實驗步驟及方法
2.1 MIA PaCa-2人源胰腺癌腫瘤細胞的培養、腫瘤接種和分組治療將MIA PaCa-2細胞培養在含10%胎牛血清（FBS）及2.5%馬血清的DMEM培養液中。收集指數生長期的MIA PaCa-2細胞，HBSS重懸至5×107/mL，無菌條件下，移植於BALB/c nude小鼠皮下，每隻小鼠接種0.1 mL細胞懸液即5×106個細胞。觀察接種後小鼠並監測腫瘤的生長。
藥效實驗，在接種17天時分組用荷瘤小鼠平均腫瘤體積達到122.81 mm3 ，即進行藥效實驗的分組和給藥觀察，具體分組訊息如下表10。 表10. 藥效實驗給藥和治療
組別 給藥組 N 劑量(mg/kg) 給藥方案 給藥方案
1 空白 8 -- BID×62 P.O.
2 藥物B 8 30 QD×55 P.O.
3 藥物A 8 0.3 QD×69 P.O.
4 藥物A 8 0.3 QD×55 P.O.
藥物B 30 QD×55 P.O.
註：N：動物隻數；給藥體積為10 μL/g；p.o.：灌胃給藥。
2.2 受試藥物的溶劑和配製如實施例1。
2.3 評估指標及數據分析
主要是檢測受試藥物對MIA PaCa-2人源胰腺癌CDX小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用或完全治癒能力。
評估指標及數據分析同實施例1。
3、實驗結果
3.1 腫瘤體積
受試藥物作用於MIA PaCa-2人源胰腺癌CDX動物模型的抗腫瘤藥效實驗中的各治療組腫瘤體積變化、以及統計分析結果見圖5、表11、表12和表13。 表11. 腫瘤體積（mm3 ）（Mean±SEM）
組別 實驗起始腫瘤體積/第0天 (mm3 ) 實驗結束腫瘤體積/第55天 (mm3 ) TGI(%)/ 第55天 T/C(%)/ 第55天 P值
1 123.26±11.37 1599.48±206.40 -- -- --
2 123.33±12.48 1336.74±482.57 17.80 82.20 0.348
3 123.00±11.42 549.94±148.26 71.08 28.92 0.000***
4 120.54±10.39 147.27±36.74 98.19 1.81 0.000***
註：用One-way ANOVA LSD test比較治療組腫瘤體積與對照組相比有無顯著性差異，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與空白比較。 表12. 聯合給藥組與單藥組相比較的統計學分析結果（第55天）
組別 實驗結束腫瘤體積/ 第55天(mm3 ) P值（vs 藥物B， 30 mg/kg） P值（vs 藥物A，  0.3 mg/kg） P值
2 1336.74±482.57 -- -- --
3 549.94±148.26 -- -- --
4 147.27±36.74 0.03▲ 0.02▼ 1.29
註：用Student’s t test比較相應單藥治療組和聯合治療組兩組之間有無顯著性差異，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001，與藥物B 30 mg/kg單藥組比較；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01，與藥物A 0.3 mg/kg單藥組比較。
在第一次給藥開始後第55天，就平均腫瘤體積而言，與空白組比較，藥物A 0.3 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組均表現出統計學上明顯地抑制腫瘤生長的作用（P＜0.05）。此外，相比於相應各單藥組的抗腫瘤藥效學結果，藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組表現出統計學上更加明顯的抑制腫瘤生長作用（P＜0.05），並且均具有明顯的增效效應（Q＞1）。
實驗結束後，各治療組小鼠分別被實施安樂死並剝離腫瘤稱重。
3.2 小鼠體重
各治療組的相對體重變化的結果見表13。本次實驗過程中，所有治療組小鼠均沒有出現體重明顯下降和其他異常症狀，表明荷瘤小鼠對所有治療均耐受性良好。 表13. 治療小鼠體重變化（Mean±SEM）
組別 動物數量/ （起始/結束） 實驗起始動物 體重 (g) 實驗結束動物 體重 (g) 實驗結束動物相對體重變化（%）
1 8/8 20.80±0.17 26.68±0.44 (第62天) 28.28±1.96 (第62天)
2 8/8 21.64±0.52 25.16±0.94 (第55天) 16.10±2.10 (第55天)
3 8/7 22.13±0.73 26.10±1.05 (第69天) 18.30±2.23 (第69天)
4 8/8 21.48±0.27 23.33±0.38 (第55天) 8.64±1.41 (第55天)
實施例4、受試藥物對A549人源肺癌CDX小鼠皮下移植瘤模型的藥效學研究
1、實驗材料
細胞株：人源肺癌A549細胞，復蘇P1代開始擴增，來源於ATCC，培養於含10%胎牛血清（FBS）的F-12K培養液中。
實驗動物：95隻BALB/c nude小鼠，雌性，週齡4-8週，體重18-22 g，購買於江蘇集萃藥康生物科技有限公司（生產許可：SCXK（蘇）2018-0008），合格證號：201901374，動物使用許可證號：SYXK（滬）2015-0015。
藥物：式（I）所示化合物甲苯磺酸鹽（藥物A）；式（II）所示化合物羥乙基磺酸鹽（藥物B）。
2、實驗步驟及方法
2.1 人源肺癌腫瘤細胞的培養、腫瘤接種和分組治療
將A549人源肺癌細胞培養在含10% 胎牛血清（FBS）的F-12K培養液中。收集指數生長期的A549細胞，HBSS重懸至5×107/mL，按照1:1比例用Matrigel進行稀釋，隨後無菌條件下移植於BALB/c nude小鼠皮下，每隻小鼠接種0.2 mL細胞懸液（含50% Matrigel）即5×106個細胞。觀察接種後小鼠並監測腫瘤的生長。
藥效實驗，在接種6天時分組用荷瘤小鼠平均腫瘤體積達到124.57 mm3 ，即進行藥效實驗的分組和給藥觀察，具體分組如下表14。 表14. 藥效實驗給藥和治療
組別 給藥組 N 劑量(mg/kg) 給藥方案 給藥方案
1 空白 8 -- BID×44 P.O.
2 藥物B 8 30 QD×44 P.O.
3 藥物A 8 0.3 QD×44 P.O.
4 藥物A 8 0.1 QD×44 P.O.
5 藥物A 8 0.3 QD×44 P.O.
藥物B 30
6 藥物A 8 0.1 QD×44 P.O.
藥物B 30
註：N：動物隻數；給藥體積為10 μL/g；p.o.：灌胃給藥。
2.2 受試藥物的溶劑和配製
從藥物A 0.03 mg/mL溶液中吸出14 mL，再使用28 mL溶媒對照1進行稀釋，最終得到42 mL 藥物A 0.01 mg/mL澄清透明溶液，其餘同實施例1。
2.3 評估指標及數據分析
主要是檢測受試藥物對A549人源肺癌CDX小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用或完全治癒能力。
評估指標及數據分析同實施例1。
3、實驗結果
3.1 腫瘤體積
受試藥物作用於A549人源肺癌CDX動物模型的抗腫瘤藥效實驗中的各治療組腫瘤體積變化、腫瘤重量以及統計分析結果見圖6、表15、表16和表17。 表15. 腫瘤體積（mm3 ）（Mean±SEM）
組別 實驗起始腫瘤體積/第0天 (mm3 ) 實驗結束腫瘤體積/第44天 (mm3 ) TGI(%)/ 第44天 T/C(%)/ 第44天 P值
1 123.97±5.40 1237.68±293.20 -- -- --
2 124.10±4.60 795.04±163.99 39.76 60.24 0.200
3 125.64±6.21 356.93±41.62 79.23 20.77 0.013*
4 125.69±5.84 645.74±150.92 53.30 46.70 0.089
5 123.20±4.80 217.07±33.79 91.57 8.43 0.004**
6 124.55±5.41 578.10±124.26 59.28 40.72 0.058
註：用One-way ANOVA LSD test比較治療組腫瘤體積與對照組相比有無顯著性差異，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與空白比較。 表16. 聯合給藥組與單藥組相比較的統計學分析結果（第55天）
組別 實驗結束腫瘤積/ 第44天(mm3 ) P值（vs 藥物B， 30 mg/kg） P值（vs 藥物A， 0.3 mg/kg） P值（vs 藥物A， 0.1 mg/kg） P值
1 1237.68±293.20 -- -- -- --
2 795.04±163.99 -- -- -- --
3 356.93±41.62 -- -- -- --
4 645.74±150.92 -- -- -- --
5 217.07±33.79 0.004▲▲ 0.02▼ -- 1.05
6 578.10±124.26 0.310 -- 0.73 0.82
註：用Student’s t test比較相應單藥治療組和聯合治療組兩組之間有無顯著性差異，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，與藥物B 30 mg/kg單藥組比較；▼P＜0.05，與藥物A 0.3 mg/kg單藥組比較；∆P＜0.05，與藥物A 0.1 mg/kg單藥組比較。 表17.腫瘤塊重量（g）（Mean±SEM）
組別 動物數量/（起始/結束） 治療後第44天（g） T/C(%) P值
1 8/8 1.26±0.30 -- --
2 8/8 0.81±0.19 64.09 0.189
3 8/8 0.26±0.03 20.82 0.005**
4 8/8 0.61±0.18 48.04 0.059
5 8/8 0.17±0.03 13.25 0.002**
6 8/8 0.51±0.14 40.02 0.030*
註：用One-way ANOVA LSD test比較治療組腫瘤瘤重與對照組相比有無顯著性差異，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，與空白比較。
在第一次給藥開始後第44天，就腫瘤體積而言，與空白組比較，藥物A 0.3 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組均表現出統計學上明顯的抑制腫瘤生長的作用（P＜0.05）。此外，相比於相應各單藥組的抗腫瘤藥效學結果，藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組表現出統計學上更加明顯的抑制腫瘤生長作用（P＜0.05），並且具有明顯的增效效應（Q＞1）。
實驗結束後(第44天)，所有治療小鼠被安樂死處理，剝離荷瘤鼠皮下移植瘤塊並進行稱量，就腫瘤塊平均重量而言，與空白組相比較，藥物A 0.3 mg/kg給藥組、藥物A 0.3 mg/kg+藥物B 30 mg/kg聯合給藥組、藥物A 0.1 mg/kg + 藥物B 30 mg/kg聯合給藥組顯示出統計學上明顯抑制腫瘤生長的作用。T/Cweight與T/C總體趨勢基本一致。
3.2 小鼠體重
各治療組的相對體重變化的結果見表18。本次實驗過程中，所有治療組小鼠均沒有出現體重明顯下降和其他異常症狀，表明荷瘤小鼠對所有治療均耐受性良好。 表18. 治療小鼠體重變化（Mean±SEM）
組別 動物數量/ （起始/結束） 實驗起始動物體重 (g) 實驗結束動物 體重 (g) 實驗結束動物相對體重變化（%）
1 8/8 21.28±0.34 24.71±0.54 16.22±2.64
2 8/8 21.63±0.28 24.25±0.47 12.08±1.01
3 8/8 22.24±0.38 24.35±0.55 9.46±1.44
4 8/8 21.64±0.45 23.66±0.41 9.44±1.62
5 8/8 21.54±0.26 22.59±0.38 4.91±1.61
6 8/8 21.72±0.28 23.60±0.44 8.65±1.37
實施例5、CDK4/6抑制劑藥物B(式（II）所示化合物羥乙基磺酸鹽)聯合MEK抑制劑藥物A(式（I）所示化合物甲苯磺酸鹽)治療 KRAS突變晚期或轉移性結直腸癌/胰腺癌的I/Ⅱ期臨床研究
1、研究目的：初步評估CDK4/6抑制劑藥物B聯合MEK抑制劑藥物A治療KRAS突變晚期或轉移性結直腸癌/胰腺癌的耐受性、安全性和療效。第一階段研究目的：評價CDK4/6抑制劑藥物B聯合MEK抑制劑藥物A治療 KRAS突變晚期或轉移性結直腸癌/胰腺癌的耐受性、安全性
第二階段研究目的：觀察和評價CDK4/6抑制劑藥物B聯合MEK抑制劑藥物A治療 KRAS突變晚期或轉移性結直腸癌/胰腺癌的有效性和安全性
2、研究設計
2.1 總體設計
研究分為兩階段，第一階段為聯用劑量探索階段，第二階段為療效拓展階段。
第一階段：劑量探索研究
招募6-18例晚期或轉移性KRAS突變結直腸癌/胰腺癌受試者，探索藥物B與藥物A聯用劑量。在選定劑量先入組3例受試者，如果3例受試者在用藥第一週期內均未出現DLT，則認為該劑量程度可以耐受。如果在用藥第一週期內，有1例受試者出現DLT，增加3名受試者。如果這3位受試者中再出現≥1例DLT，則認為該劑量程度不能耐受；如果未再出現DLT，則認為該劑量程度為可以耐受。如果在用藥第一週期內，有≥2例DLT，則該劑量程度為不耐受。藥物A與藥物B聯合探索劑量見下表19。 表19. 藥物A與藥物B聯合劑量探索設置
劑量組 藥物B 藥物A 病例數
1 125mg qd 0.25mg 3-6
2 0.375mg 3-6
3 0.5mg 3-6
4 100mg qd   0.25mg 3-6
5 0.375mg 3-6
6 0.5mg 3-6
4週為1個週期，首先設置藥物B固定劑量，125mg qd，po，服藥3週停藥1週/4週，藥物A 按照0.25mg→0375mg→0.5mg梯度（qd，po，服藥3週停藥1週/4週）進行劑量探索。
如「藥物B 125mg qd，po，服藥3週停藥1週/4週+藥物A 0.25mg qd，po，服藥3週停藥1週/4週」劑量程度不耐受，調整藥物B為100mg qd，po，服藥3週停藥1週/4週，藥物A 按照0.25mg→0375mg→0.5mg梯度（qd，po，服藥3週停藥1週/4週）進行聯用方案的劑量探索。
如藥物B 100mg qd，po，服藥3週停藥1週/4週+藥物A 0.25mg qd，po，服藥3週停藥1週/4週劑量程度不耐受，則研究終止。
第二階段：療效拓展階段：待第一階段試驗完成，確定兩者聯用的劑量之後開展。入組20~30例晚期或轉移性KRAS突變結直腸癌/胰腺癌受試者，初步探索聯用方案的療效與安全性。
根據第一階段確定的可耐受聯合給藥劑量，藥物B按確定的劑量 qd，po，服藥3週停藥1週/4週+ 藥物A按確定的劑量, qd，po，服藥3週停藥1週/4週，連續用藥至出現符合治療終止標準的事件發生。
2.2 劑量限制性毒性（DLT）
第一階段研究DLT觀察期為聯合用藥的第一週期（4週）
DLT定義：在DLT觀察期內發生的與研究藥物相關且滿足以下任一條件的毒性 1. 持續＞3天的4級血液學毒性或伴有出血的≥3級血小板降低、伴有發熱、感染的≥3級中性粒細胞降低； 2. 3級及以上的非血液毒性（實驗室檢查指標異常除外），腹瀉、噁心及嘔吐須經過對症治療仍不能控制者； 3. ≥2級的視網膜靜脈阻塞（RVO）、葡萄膜炎和研究者判定的其他較嚴重的2級及以上眼部毒性，例如：中心性漿液性脈絡膜視網膜病變（CSR）、視網膜脫離、視網膜色素上皮脫離、視神經乳頭炎等及包括這些眼部毒性引起黃斑水腫、視覺障礙和視力模糊等症狀； 4. 3級及以上的實驗室檢查指標異常，須進行住院治療或持續＞7天； 5. 由於相關毒性導致的藥物B和/或藥物A停藥＞14天。
2.3 MTD的定義
劑量探索階段，在第一週期（28天）的給藥觀察期內，發生DLT的病例數＜總例數1/3的最大劑量。
3、受試者訊息
受試者為臨床診斷和病理學確診的KRAS突變結直腸癌/胰腺癌，晚期或轉移性腫瘤經標準治療失敗（疾病進展或無法耐受，如化療、靶向治療以及免疫治療等），或缺乏有效的治療方法。
小樣本量研究，I期計劃招募6-18例受試者，確定MTD。II期計劃招募20-30例受試者。
4、研究藥品
4.1 藥品訊息
試驗藥物1：式（I）所示化合物甲苯磺酸鹽（藥物A）；生產廠家：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；劑型：片劑；給藥途徑：口服；規格：0.125 mg片，0.5 mg/片，2 mg/片。
試驗藥物2：式（II）所示化合物羥乙基磺酸鹽（藥物B）；生產廠家：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；劑型：片劑；給藥途徑：口服；規格：25 mg/片，50mg/片，125 mg/片。
4.2 給藥方法
無論是第一階段還是第二階段，篩選合適的受試者即接受藥物B與藥物A的治療。
藥物B，口服，每日1次連續給藥21天，停藥7天，28天為一個治療週期。
藥物A，餐後2小時口服，每日1次連續給藥21天，停藥7天，28天為一個治療週期。
聯合治療直至疾病進展、毒性不耐受、受試者主動撤銷知情同意或研究者判斷受試者不再適合繼續接受治療。
4.3劑量暫停與調整
第一階段研究的第一週期，原則上不允許進行藥物A和藥物B的劑量調整，後續週期才能根據毒性進行劑量調整。第二階段研究，允許在研究過程中進行劑量調整。
為保證整個研究中劑量調整的一致性，在進行與AE相關劑量下調時，首先進行劑量暫停。
研究期間出現3級（CTCAE4.03）及以上的與研究藥物相關的AE或發生DLT時，須予以停藥。根據具體發生3級AE或DLT的性質，可以同時停止二藥，或分別單獨停止藥物A或藥物B用藥，並採取最佳支持治療。聯合用藥的週期隨著藥物暫停無需重新計算。
待毒性恢復到≤1級後，經研究者判斷藥物A或藥物B可將原劑量或下調1個劑量程度繼續服藥。藥物B劑量下調梯度為100和75mg qd。若藥物B或藥物A停藥後超過21天毒性仍不能恢復至≤1級，則該受試者需終止藥物B或藥物A治療，並觀察至毒性恢復。
如果受試者終止聯合治療，經研究者判斷，受試者能夠從藥物A單藥或藥物B單藥治療獲益，受試者仍可以接受上述相應的治療。
研究期間原則上只允許進行劑量下調。發生劑量下調後，經研究者判斷認為有必要時，可以進行劑量上調。
劑量下調的規定：
藥物B劑量下調：1）劑量為125mg或100mg時，允許劑量下調/劑量暫停或終止；2）下調梯度為100和75mg qd。75mg為最低劑量，不允許繼續下調，但允許劑量暫停或終止。
藥物A劑量下調：1）劑量為0.5mg或0.375mg時，允許劑量下調，劑量暫停或終止；2）下調梯度為0.375mg和0.25mg qd。0.25mg為最低劑量，不允許繼續下調，但允許劑量暫停或終止。
5、有效性評價
主要終點指標：第一階段研究：聯合用藥中藥物A的MTD；第二階段研究：客觀緩解率（ORR）
次要終點指標：
1）有效性指標： 1. 客觀緩解率（ORR）（第一階段研究） 2. 疾病控制率（DCR） 3. 緩解持續時間（DoR） 4. 至緩解發生時間（Time to response，TTR） 5. 無進展生存期（PFS）基於RECIST1.1 6. 總生存期（OS）基於RECIST1.1
2）安全性指標： 包括生命體征、實驗室指標、不良事件（AE）、嚴重不良事件（SAE）、藥物相關性AE及SAE。
實施例6、評價並比較藥物A及藥物B單獨或聯合給藥在人胰腺癌PDX模型PAN#039裸小鼠異種移植瘤模型中的治療作用
實驗動物：小鼠，品種：BALB/c裸鼠；性別：雌性；年齡：7-8週；體重：20g±20%。當腫瘤體積接近150-250 mm3 時用隨機區組法分組，每組8隻小鼠。
PAN#039為69歲男性患者，胰導管腺癌（所用代數P6）。
藥物配置：1% Tween-80+0.5 % CMC-Na；藥物A配置溶劑：0.05%DMSO和0.5%CMC-Na；藥物B配置溶劑：0.05M檸檬酸+0.5%CMC+0.5%Tween-80。
給藥方案見表20。 表20.給藥方案設置
組別 數量 藥物 mg/kg 給藥途徑 給藥方式
1 8 溶劑 / PO QD×25
2 8 藥物B 30 PO QD×25
3 8 藥物A 0.3 PO QD×25
4 8 藥物A 0.1 PO QD×25
5 8 藥物B 藥物A 30 PO QD×25
0.3 PO QD×25
6 8 藥物B 藥物A 30 PO QD×25
0.1 PO QD×25
實驗過程：
1.建議模型
選取若干600-800 mm3 大小的PAN#039腫瘤，除去壞死組織及結締組織，將其切成大小為15-30 mm3 的腫瘤組織塊；2）麻醉小鼠；3）移植腫瘤；4）PAN#039腫瘤移植37天後，選取72隻腫瘤體積為150-255 mm3 的小鼠，將動物按隨機區組法進行分組，使各組腫瘤體積差異小於均值的5%，每組8隻。
2. 數據分析
以時間點為X軸，腫瘤體積為Y軸繪製腫瘤生長曲線；以時間點為X軸，動物體重為Y軸繪製體重增長變化曲線。腫瘤體積及小鼠體重變化百分比的數據使用Two Way Analysis of Variance (Two Way ANOVA)方法進行方差分析，再用Bonferroni post-hoc multiple pair-wise comparisons方法進行顯著性檢驗 (p ≤ 0.05)。相對腫瘤增殖率T/C(%) 用於計算藥物對腫瘤生長抑制作用的標準如下：藥物對腫瘤有顯著抑制作用：T/C(%) ≤ 40%，且P ＜ 0.05；藥物對腫瘤無顯著抑制作用：T/C(%) ＞ 40%。
實驗結果：
1）受試物對人胰腺癌PDX模型PAN#039動物體重的影響
在整個實驗週期內，動物生長行為正常，受試藥物有較好的耐受性。與0天相比，25天時各組的動物平均體重沒有顯著變化（＜5%）。具體數據見表21。 表21. 各組的動物平均體重
組別 動物平均體重 （g）（Mean±SEM） 平均體重變化率（%）
0天 25天 25天/0天
1 22.19±0.57 22.69±0.72 2.25%
2 22.01±0.56 22.32±0.42 1.41%
3 22.04±0.54 22.28±0.48 1.09%
4 22.02±0.38 22.09±0.25 0.23%
5 22.26±0.62 22.37±0.53 0.49%
6 21.31±0.61 22.02±0.55 -1.3%
2）受試藥物對人胰腺癌PDX模型PAN#039腫瘤體積的影響
在整個實驗週期內，各組的腫瘤體積出現不同程度的變化。詳細結果見表22和圖7。 表22. 受試藥物對人胰腺癌PDX模型PAN#039腫瘤體積的影響
組別 腫瘤體積（mm3 ,Mean±SEM） 平均腫瘤體積變化率（%）
0天 25天 25天/0天
1 193.88± 11.81 1132.13± 162.28 483.93%
2 195.25± 12.17 631.75± 112.53 223.56%
3 193.25± 10.39 209.25± 33.46 8.28%
4 194.25± 11.41 391.63± 55.39 101.61%
5 193.13± 9.90 183.00± 24.60 -5.25%
6 194.38± 12.66 210.00±18.15 8.04%
3）受試藥物對人胰腺癌PDX模型PAN#039腫瘤生長抑制率
以上結果顯示，除第1組（溶劑對照）外，其它給藥組均有顯著抑制腫瘤生長作用。詳細結果見表23。 表23. 受試藥物對人胰腺癌PDX模型PAN#039的相對腫瘤增殖率和腫瘤生長抑制率（TGI%）
組別 T/C(%) TGI(%) p值
30 25天 　
1 100% 0 ＜0.05
2 55.8% 44.2% ＜0.05
3 18.48% 81.52% ＜0.05
4 34.59% 65.41% ＜0.05
5 16.16% 83.84% ＜0.05
6 18.55% 81.45% ＜0.05
P＜0.05 表示有統計學意義。
無
圖1為細胞系A549抑制曲線圖； 圖2為細胞系MIA PaCa-2抑制曲線圖； 圖3為細胞系HCT116抑制曲線圖； 圖4A為受試化合物作用於HCT116人源結腸癌CDX小鼠體內移植腫瘤模型後的腫瘤生長曲線（n=8）； 圖4B為受試化合物作用於HCT116人源結腸癌CDX小鼠體內移植腫瘤模型後腫瘤組織重量； 圖5為受試化合物作用於MIA PaCa-2人源胰腺癌CDX小鼠體內移植腫瘤模型後的腫瘤生長曲線； 圖6A為受試化合物作用於A549人源肺癌CDX小鼠體內移植腫瘤模型後的腫瘤生長曲線； 圖6B為受試化合物作用A549人源結腸癌CDX小鼠體內移植腫瘤模型後腫瘤組織重量； 圖7A為受試化合物作用於PAN#039腫瘤PDX小鼠體內移植腫瘤模型後的腫瘤生長曲線； 圖7B為受試化合物作用PAN#039腫瘤PDX小鼠體內移植腫瘤模型後腫瘤組織重量。
Figure 109131013-A0101-11-0002-3

Claims (13)

  1. 一種MEK抑制劑與CDK4/6抑制劑聯合在製備治療腫瘤的藥物中的用途。
  2. 如請求項1所述的用途，所述腫瘤選自結直腸癌、膽道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、胃癌、肝細胞癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、橫紋肌肉瘤、粘液瘤、惡性纖維組織細胞瘤、造血系統惡性腫瘤、神經母細胞瘤、頭頸部癌、子宮內膜癌、大腸癌、食管癌、卵巢癌、唾液腺癌、小腸癌、胸腺癌、中樞神經系統腫瘤、骨癌、腎上腺腺瘤、腎細胞癌、神經母細胞瘤，優選結腸癌、胰腺癌或肺癌。
  3. 如請求項2所述的用途，所述腫瘤為Ras基因突變腫瘤。
  4. 如請求項3所述的用途，所述Ras基因選自KRas基因和/或NRas基因和/或HRas基因突變。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的用途，所述MEK抑制劑選自AZD-8330、GDC-0623、CI-1040、WX-554、TAK-733、SL-327、APS-2-79、BI-847325、HL-085、BI-847325、CEP-1347、U-0126、Binimetinib、Pimasertib、Cobimetinib、PD-0325901、PD-318088、RO-5126766、BIX-02189、BIX-02188、PD-98059、Trametinib、Refametinib、AS-703988、E-6201、Selumetinib、或式（I）所示化合物或其可藥用鹽中的至少一種，優選式（I）所示化合物或其可藥用鹽
    Figure 03_image001
    。
  6. 如請求項5所述的用途，所述MEK抑制劑的每日劑量範圍選自0.01-500mg，給藥頻率為每日2次、每日1次、每2天1次、每3天一次，優選每日一次。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的用途，所述CDK4/6抑制劑選自palbociclib、FCN-437c、abemaciclib、ribociclib、Alvocidib、trilaciclib、lerociclib、birociclib、PF-06873600，或式（II）所示化合物或其可藥用鹽中的至少一種，優選式（II）所示化合物或其可藥用鹽，
    Figure 03_image003
    。 （II）
  8. 如請求項7所述的用途，所述CDK4/6抑制劑每日劑量為1-500mg，給藥頻率為每日一次或每日兩次，優選每日一次。
  9. 如請求項7-8中任一項所述的用途，所述MEK抑制劑為式（I）所示化合物或其可藥用鹽，所述CDK4/6抑制劑為式（II）所示化合物或其可藥用鹽。
  10. 如請求項9所述的用途，所述式（I）所示化合物可藥用鹽為甲苯磺酸鹽。
  11. 如請求項9所述的用途，所述式（II）所示化合物可藥用鹽為羥乙基磺酸鹽。
  12. 如請求項9所述的用途，所述MEK抑制劑每日劑量選自0.25mg、0.375mg、0.50mg、0.75mg，所述CDK4/6抑制劑每日劑量選自75mg、100mg、125mg、150mg或175mg。
  13. 一種藥物組合物，所述藥物組合物包含如請求項1-12中任一項所述的MEK抑制劑和CDK4/6抑制劑，進一步包含一種或多種可藥用的賦型劑、稀釋劑或載體。
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