TW202100555A - 一種Ｈｅｒ２伴隨診斷免疫組化檢測抗體及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種人表皮生長因數受體2(Her2)伴隨診斷免疫組化檢測(IHC)用抗體，該抗體作為一抗對樣品的Her2表達情況進行免疫組化檢測時，能夠有效地避免因胞外區缺失導致的檢測結果的假陽性。除此之外，本發明提供的Her2檢測抗體在患者免疫組化檢測樣本不經抗原(或表位元)修復處理的情況下，仍然能夠識別並結合檢測樣本中的相應表位元。從而有效的降低了IHC檢測中因抗原(或表位)修復處理方法的差異所產生的假陰性問題。由於不需要上述修復處理步驟，能夠有效的降低工作強度，縮短檢測時間，從而提高IHC檢測的效率。

Description

一種Her2伴隨診斷免疫組化檢測抗體及其應用
本發明涉及生物藥物伴隨診斷領域，具體涉及一種針對靶向Her2(human epidermal growth factor receptor 2，人表皮生長因數受體2)藥物的伴隨診斷用檢測抗體及其檢測應用及方法。
癌症是當今危害人類健康的主要疾病。在中國，癌症發生率正處於快速上升期。越來越多的證據顯示，癌症是一種複雜和多樣性疾病，患者可能表現出類似的症狀，並具有相同的病理改變，卻可能由完全不同的基因變化而造成。正因為這樣的異質性(heterogeneity)，病理同類型癌症患者對目前可用藥物的反應率差別很大。某一特定治療往往只有一部分腫瘤患者有反應，因為無法在治療前判斷不同腫瘤個體對藥物的敏感性和耐藥性，許多患者往往遭受不必要的和(或)損害性大(副作用)的治療。目前支持個體化或精准醫療的理論和實踐基礎就是個體間在分子遺傳上的差異，後者被認為是人類疾病易感性和藥物反應的決定性因素。早期的例子充分證明了遺傳與腫瘤精准醫療的關係：靶向抗癌藥物吉非替尼(Iressa)和厄洛替尼(Tarceva)最初上市時，在肺癌患者中應用的藥品副作用雖較化療有很大提高，但藥效並不是非常顯 著，僅僅作為肺癌治療的二線藥物。但其後發現在攜帶EGFR特定基因突變的肺癌患者中，吉非替尼和厄洛替尼治療效果優異，現在已成為臨床治療這類患者的一線標準治療藥物。這證明了腫瘤基因突變與藥物和治療反應的相關性，而根據基因突變的資訊和組合來決定患者的靶向治療方案是精准醫療的大方向(文獻1：腫瘤的精准醫療：概念、技術和展望，杭渤等，科技導報，第33卷，第15期，第14-21頁，2015年)。
伴隨診斷(companion diagnostics，CDx)則是一種與靶向藥物相關的體外診斷技術，主要通過測量人體內蛋白、變異基因的表達水準，瞭解不同患者對特定藥物的治療反應，篩選出最合適的用藥人群並有針對性地進行個體化治療，從而改善其治療預後和降低保健開支。美國FDA於2014年8月6日頒佈了《伴隨診斷指南》。伴隨診斷有助於確定最有可能針對治療藥物產生響應的患者群體，促進藥物在相對有限的市場中使用，提高藥物的有效性和安全性。在藥物的開發中，CDx有利於設計小樣本的臨床試驗方案，在開發過程中，以更少的投入獲得更清楚明確的結果。伴隨診斷的優勢在於可以為患者篩選出有效的治療方案，節省無效治療的時間和費用，提高患者服藥的依從性，降低不良反應的發生率，保證了藥物安全性和療效(文獻2：伴隨診斷--個體化治療助推器，湯森路透，藥學進展，第39卷，第6期，第463-477頁，2015年)。
Her2，又名ErbB2，是EGFR家族的第二個成員，其通過與EGFR家族中其它三位成員構成異源二聚體從而引起EGFR信號通路的活 化，該信號通路的活化通常與細胞的異常增殖和腫瘤形成有關，因此Her 2成為多種癌症(諸如：乳腺癌、胃癌、胃食管癌、食道癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、尿路上皮癌、膀胱癌等；參見文獻16：Human Epidermal Growth Factor Receptor 2(HER2)in Cancers：Overexpression and Therapeutic Implications，Nida Iqbal and Naveed Iqbal，Molecular Biology International，Volume 2014,Article ID 852748)的治療靶點之一，目前已有包括曲妥珠單抗和帕妥珠單抗在內的多種以Her2為靶點的治療性藥物上市或處於在臨床階段。Her-2活性升高通常被認為與Her2基因擴增、Her2蛋白表達上調以及Her-2蛋白的突變有關。其中以HER2基因擴增並由此引起Her-2蛋白表達上調最為常見。在美國FDA批准(截止至2019年2月底)的34種伴隨診斷試劑中(文獻3：https：//www.fda.gov/MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)。顯示出自1998年以來，批准的涉及靶向Her2藥物的伴隨診斷試劑盒產品有9種(文獻4：HER2 testing：Current status and future directions，Edith A.Perez等，Cancer Treatment Reviews,第40卷，第276-284頁，2014年)(見表1)。這表明針對該靶向藥物的伴隨診斷試劑持續的市場需求。
表1 FDA批准的HER-2靶向治療前的伴隨診斷試劑盒(文獻4)
Figure 109106589-A0101-12-0003-1
Figure 109106589-A0101-12-0004-2
Figure 109106589-A0101-12-0005-12
 注：CISH,chromogenic in situ hybridization，顯色原位雜交；FISH,fluorescence in situ hybridization(螢光原位雜交)；HER2,human epidermal growth factor receptor 2，人表皮生長因數受體2；IHC,immunohistochemistry，免疫組化。
目前美國FDA批准的靶向Her2藥物的伴隨診斷試劑盒中，基於免疫組化檢測的有四種(2種半定量IHC，2種IHC)，基於原位雜交的有五種(兩種FISH，三種CISH)。免疫組化(IHC)檢測細胞膜上的Her2蛋白表達，原位雜交(ISH)檢測的則是Her2基因的擴增。三種方法用於檢測的原理及特點如表2所示。
表2 IHC，CISH及FISH檢測原理及特點
Figure 109106589-A0101-12-0005-4
儘管CISH和FISH的檢測結果相對於IHC的檢測具有更高的準確性，但由於IHC法不但經濟(根據McGill University Health Centre(MUHC)在2006年所作的一份評估報告中給出了採用IHC和FISH的大致價格比較，IHC單次檢測價格約85美元而FISH單次檢測價格約381美元(文獻5： https：//muhc.ca/sites/default/files/micro/m-TAU/HER2reportdraft4finalMay2006.pdf，第15頁)；Seema Jabbar等人(文獻6：Comparison of Two FDA-Approved Her2 Immunohistochemical Assays for Breast Carcinoma：HercepTest and Pathway Her2(4B5),Am J Clin Pathol 2018；149：S93-S94)針對共計95份樣本檢測，使用FISH檢測的總花費分別為5066美元(25份)和14590美元(72份)，平均單次測202美元。以上地區的FISH檢測費用約為IHC檢測費用的3-4倍。而根據中國目前階段醫院實際的檢測費來看，FISH費用1200元左右，IHC收費150元左右，FISH費用達到了IHC檢測費用的8倍之多)、快捷，而且閱片有形態學基礎，尤其對大量樣本易於操作，敏感性較高，實驗室內部與實驗室之間可重複性相對高，所以IHC法作為初篩工具優於CISH法。病理醫師通常把IHC法作為狀態評價的首選檢測方法。但基於IHC法2+判斷陽性的病例中會出現假陽性的結果，目前ASCO/CAP(American society of clinical oncology/College of American Pathologists)推薦的針對乳腺癌的Her2檢測流程為：首先通常過IHC方法檢測，針對結果為3+的病例往往也是FISH檢測陽性，IHC檢測結果為1+及以下通常FISH檢測為陰性。IHC檢測結果為2+的病例，需要經過FISH方法進行再次確認(具體見圖1，文獻7：Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer，American Society of Clinical OncologyCollege of American Pathologists Clinical Practice Guideline Focused Update，Antonio C.Wolff等，Arch Pathol Lab Med，第142卷，第1364-1382頁，2018年11月)。
現有技術中IHC法中的假陽性問題：目前對患者樣本Her2表達狀態的初次檢測主要依賴於IHC檢測。在IHC檢測中，篩選到有效性 和可靠性高的一抗(primary antibody)是尤其關鍵的一步。IHC檢測中的抗體從根本上決定了整個檢測結果的靈敏性或特異性。Prescott等人指出，IHC檢測中42.1%的診斷差異均是由於抗體不佳的原因導致的(文獻8：Immunohistochemistry as an Important Tool in Biomarkers Detection and Clinical Practice，Leandro Luongo de Matos等，Biomarker Insights，第5卷，第9-20頁，2010年；文獻9：Audit of tumour histopathology reviewed by a regional oncology centre.Prescott RJ等.J Clin Pathol.第48卷，第245-249頁.1995年)。目前常用的Her2表達狀態檢測抗體主要有Roche公司的4B5克隆、Leica公司的CB11克隆等，上述檢測抗體均為識別Her2分子胞內區的抗體，而所有以Her2為靶點的治療性抗體藥物均識別Her2分子的胞外區，鑒於Her2分子存在胞外區缺失的突變形式(95-100kDa p95HER2(648-CTF),100-115kDa p95HER2(611-CTF))(文獻10：p95HER2 and breast cancer.Arribas J.等，Cancer Res.第71卷第5期，第1515-1519頁，2011年)，相應的病例對曲妥珠單抗和帕妥珠單抗等以Her2胞外區為靶點的藥物無反應或不敏感，但通過上述商用伴隨診斷試劑檢測，該部分病例將顯示假陽性，這也正是目前接受抗體類Her-2靶向藥的響應率只有約60%的一個主要原因。因此開發特異識別Her2分子胞外區的檢測抗體及基於相應抗體開發的伴隨診斷IHC試劑產品，將能有效降低目前her2伴隨檢測中所出現的假陽性問題，從而為相應患者節省無效治療的時間和巨額的費用。
現有技術中IHC法中的假陰性問題：在免疫組化檢測中，正確的抗原(或表位)修復(Antigen(or epitope)retrieval)是免疫組化檢 測結果準確度的關鍵步驟。由於在組織固定過程中，甲醛與蛋白質發生交聯形成醛交聯蛋白，這種化合物封閉了抗原，導致抗體對抗原的特異性反應降低，從而導致假陰性。全自動多功能組織病理檢測系統具有染色著色均勻、定位準確、可重複性強等優點，但設備昂貴，試劑成本高，使用範圍受到限制，基層醫院病理科目前仍普遍使用手工操作方法。目前手工操作中各科的修復方法以及採用的修復液不盡相同，即使相同的方法修復細節也有很大的差別，正確的修復對於抗體的表達非常重要。因此提高不同基層醫院人員操作結果的重複性，如何避免修復過程中產生的假陰性問題也是目前IHC檢測中需要解決的問題(文獻11：乳腺癌HER-2免疫組化檸檬酸高溫高壓抗原修復手工操作的最佳條件，朱國良等，臨床與實驗病理學雜誌，第33卷，第2期，第219-220頁；文獻12：比較不同抗原修復液對免疫組化結果的影響，王琦等，中國實驗診斷學，第19卷，第8期，第1246-1248頁，2018年8月；文獻13：病理學高級教程，來茂德主編，出版發行：北京：人民軍醫出版社，2013.03；ISBN號：978-7-5091-6426-6，第856頁)。
在靶向Her2的藥物中，WO2015074528A1和CN105008398A中公開了一種包含能夠特異性結合Her2的抗體藥物綴合物(即抗體藥物偶聯物，ADC)，其中所述抗體與一個或更多個選自MMAE和MMAF的治療劑偶聯，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中(i)重鏈CDR1-3區的氨基酸序列分別為DYYIH，RVNPDHGDSYYNQKFKD，ARNYLFDHW；和(ii)所述輕鏈CDR 1-3的氨基酸序列分別為KASQDVGTAVA，WASIRHT，HQFATYT；或者進一步所述抗體衍生 自在2013年08月22日以保藏編號CGMCC No.8102保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的雜交瘤所分泌的抗體。或者進一步所述抗體衍生自在2013年11月06日以保藏編號CCTCC C2013170保藏于中國典型培養物保藏中心的CHO細胞所分泌的抗體。所述的包含能夠特異性結合HER2的抗體的綴合物用於治療Her2陽性癌症患者，所述Her2陽性癌症包括乳腺癌、卵巢癌或胃癌，或者進一步為拉帕替尼和/或赫賽汀耐藥的乳腺癌、卵巢癌或胃癌。為了保障IHC檢測抗體結果與所述綴合物治療的高度對應性，開發所述綴合物的配套性伴隨診斷抗體檢測產品也存在極大的迫切性。
為了解決上述問題，本發明提供了一種靶向Her2胞外區的檢測抗體，上述抗體特異性結合Her2蛋白胞外結構域IV區。
Her2的一個示例氨基酸序列如NCBI GenBank ID：AAA75493.1所示，相應的蛋白胞外結構域IV區位於第511-643位氨基酸。Johan Rockberg等人(文獻14：Discovery of epitopes for targeting the human epidermal growth factor receptor 2(HER2)with antibodies，Johan Rockberg等，MOLECULAR ONCOLOGY，第3卷，第238-247頁，2009年)以及北京義翹神州科技有限公司(Sino Biological)所市售的“Her2/ERBB2 Protein,Human,Recombinant(ECD,domain IV,HisTag)”(連接有多聚組氨酸標籤的人ERBB2(AAA75493.1)(Pro489-Cys630)區域)(Cat：10004-H08H4，https：//www.sinobiological.com/Human-HER2-ErbB2-Protein-ECD-domain-IV-His-Tag-p223119.html)(特性描述：通過功能性ELISA檢測了其結合能力；且能結合herceptin，herceptin的EC50值是10-40ng/mL)證明了Her2蛋白胞外結構域IV區可以作為一個獨立的免疫原且仍然保持有處於完整Her2中時相應區域的的立體構型。
現在技術中公開了具有以下CDR組合的抗體靶向Her2蛋白胞外結構域IV：(i)重鏈可變區CDR1-3分別是：GFNIKDTYIH， RIYPTNGYTRYADSVKG，WGGDGFYAMDV；和輕鏈可變區CDR1-3分別是：RASQDVNTAVAW，SASFLES，QQHYTTPPT(WO9222653A1)；(ii)重鏈可變區CDR1-3分別是：GFNIKDTYIH，RIYPTNGYTRYADSVKG，WGGDGFYAMDY；輕鏈可變區CDR1-3分別是：RASQDVNTAVA，SASFLES，QQHYTTPPT；(文獻15：Molecular dynamic simulation of Trastuzumab F(ab’)2 structure in corporation with HER2 as a theranostic agent of breast cancer，S Hermanto等，Journal of Physics：Conference Series，第835卷，第1期，第1-11頁，2017年)。此類抗體用途均為治療性抗體。
本發明驚奇的發現，一些特異性結合於Her2蛋白胞外結構域IV區上的抗體，可以作為免疫組織化學檢測中的一抗(primary antibody)，這些抗體在患者免疫組化檢測樣本不經抗原(或表位元)修復處理的情況下，仍然能夠被這些抗體特異性有效識別並檢測。從而有效的降低了IHC檢測中因抗原(或表位)修復處理方法的差異所產生的假陰性問題。 同時由於不需要上述修復處理步驟，能夠有效的降低工作強度，縮短檢測時間，從而提高IHC檢測的效率。
此外，本發明也驚奇的發現，與WO2015074528A1和CN105008398A中公開的靶向Her2的抗體(RC48)藥物綴合物(RC48-ADC)中的抗體(重鏈CDR1-3區的氨基酸序列分別為DYYIH，RVNPDHGDSYYNQKFKD，ARNYLFDHW；和( )輕鏈CDR 1-3的氨基酸序列分別為KASQDVGTAVA，WASIRHT，HQFATYT)結合相同表位(位於Her2蛋白胞外結構域IV區)的或具有以上相同輕鏈和重鏈CDR的抗體，可以作為確定Her2陽性的伴隨診斷IHC抗體使用，由於該表位位於Her2蛋白胞外結構域IV區，因此相應IHC抗體檢測避免了將Her2分子存在胞外區缺失的突變形式也檢測出陽性的可能，因此也有效的解決了一抗(primary antibody)針對Her2胞內區檢測所產生的假陽性問題。同時，由於與靶向藥物中抗體的CDR區相同，因此檢測時所結合的表位與治療藥物的靶向表位完全相同，這種檢測抗體與藥用抗體結合表位的高度對應性，高度保障了靶向藥物使用時的針對性和有效性。
本發明的技術方案如下所示：
本發明提供了一種人表皮生長因數受體2(Her2)伴隨診斷免疫組化檢測(IHC)用抗體，所述抗體特異性結合Her2蛋白胞外結構域IV區，且所述抗體具備有效檢測未經抗原或表位元修復處理的IHC樣本的性能。
進一步的，所述抗體Fc段為非人哺乳動物抗體Fc段，優選為鼠源Fc片段或兔源Fc片段。
進一步的，所述抗體與以下CDR限定的抗體競爭性結合相同或相近表位，所述以下CDR限定的抗體的重鏈可變區的CDR 1-3分別如SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；所述CDR限定的抗體的輕鏈可變區的CDR 1-3分別如SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列。
進一步的，所述抗體中：
(i)重鏈可變區的CDR1具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：1進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR2具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：2進行1，2，3，4或5個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR3具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：3進行1，2或3個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或
(ii)輕鏈可變區的CDR1具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：4進行1，2，3或4個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR2具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：5進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR3具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：6進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或
(iii)所述的免疫球蛋白Fc片段為鼠源IgG Fc片段，或進一步為鼠源IgG1 Fc片段。
進一步的，所述抗體中：
(i)重鏈可變區的CDR1-3分別為SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；和
(ii)輕鏈可變區的CDR1-3分別為SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列。
進一步的，所述抗體：
(i)所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或者與其具有至少80%序列同一性的序列；和/或
(ii)所述抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或者與其具有至少80%序列同一性的序列；並且
(iii)所述抗體的重鏈可變區的CDR1-3分別如SEQ ID NO：1-3所示的氨 基酸序列；所述抗體的輕鏈可變區的CDR1-3分別如SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列。
進一步的，提供一種抗體R48M，其氨基酸序列資訊如下：
1)重鏈(Hc)
Figure 109106589-A0101-12-0012-5
Figure 109106589-A0101-12-0012-6
(SEQ ID NO：7)
2)輕鏈(Lc)
Figure 109106589-A0101-12-0012-7
Figure 109106589-A0101-12-0012-8
(SEQ ID NO：8)
本發明進一步提供了一種核酸分子，其編碼上述的抗體。
本發明進一步提供了一種載體，其包含上述的核酸分子。
本發明進一步提供了上述抗體在製備Her2伴隨診斷免疫組化檢測產品中的用途，所述免疫組化檢測產品具備在免疫組化檢測過程中無需抗原或表位元修復步驟的功能。
本發明進一步提供了一種Her2伴隨診斷免疫組化檢測試劑盒，其包含上述抗體，所述試劑盒具備在免疫組化檢測過程中無需抗原或表位元修復步驟的功能。
本發明進一步提供了一種Her2伴隨診斷免疫組化檢測方法，其使用上述抗體作為檢測一抗。或進一步的在所述免疫組化檢測過程中無抗原或表位元修復步驟。
本發明所述Her2伴隨診斷所針對的適應症為Her2相關癌症，進一步優選為乳腺癌、胃癌、胃食管癌、食道癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、尿路上皮癌或膀胱癌。(參見文獻16)
本發明的技術方案帶來的有益效果為：本發明提供了一種能夠靶向Her2蛋白胞外結構域IV區的抗體，採用該抗體作為一抗對樣品的Her2表達情況進行免疫組化檢測時，能夠有效地避免因胞外區缺失導致的檢測結果的假陽性。除此之外，本發明提供的Her2檢測抗體在免疫組化檢測過程中，由於不需要上述修復處理步驟，有效的降低了IHC檢測中因抗原(或表位)修復處理方法的差異所產生的假陰性問題。同時能夠有效的降低工作強度，縮短檢測時間，從而提高IHC檢測的效率。
圖1 使用經過驗證的免疫組化方法進行Her2檢測指南；
圖2A顯示了表7中序號為1的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖2B顯示了表7中序號為1的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖3A顯示了表7中序號為2的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖3B顯示了表7中序號為2的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖4A顯示了表7中序號為3的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖4B顯示了表7中序號為3的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖5A顯示了表7中序號為4的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖5B顯示了表7中序號為4的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖6A顯示了表7中序號為5的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖6B顯示了表7中序號為5的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖7A顯示了表7中序號為6的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖7B顯示了表7中序號為6的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖8A顯示了表7中序號為7的病例，一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果；
圖8B顯示了表7中序號為7的病例，一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果；
圖9顯示了一種RC48-ADC藥物的結構式，其中RC48代表RC48抗體。
定義
除非另有定義，本文使用的所有術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
本文所使用的“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段。特別的，本文所使用的“抗體”指包含通過二硫鍵而互連的至少兩條重鏈和兩條輕鏈的蛋白。每條重鏈包含一重鏈可變區(重鏈上靠近N端的五分之一或四分之一的區域)和一重鏈恒定區(重鏈上靠近C端四分之三或五分之四的區域)。每條輕鏈包含一輕鏈可變區(輕鏈上靠近N端二分之一的區域)和一輕鏈恒定區(輕鏈上靠近C端二分之一的區域)。重鏈可變區和輕鏈可變區區域還可再細分為具有高可變性的多個區，被稱為互補決定區(CDR)。所述的“CDR”是指免 疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區，包括Kabat、Chothia或IMGT體系等確定的。每個抗體存在三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR。根據情況，本文所用術語CDR是為了指示這些區域之一、或者這些區域的幾個或者甚至全部，所述區域包含通過抗體對抗原或其識別表位的親和力而負責結合的大部分氨基酸殘基。
本發明所使用的術語“Her2檢測抗體”是指能夠檢測病例中Her2表達狀態的抗體，其能夠與Her2結合，在免疫組化化學中，Her2檢測抗體做為一抗進行Her2表達狀態的檢測。本發明涉及的“Her2檢測抗體”能夠靶向Her2蛋白胞外結構域IV區。
本發明所使用的術語“RC48M抗體”指重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的抗體。
本發明所使用的術語“RC48-ADC”或“RC48-ADC藥物”或“RC48-ADC靶向藥物”是指專利WO2015074528A1和CN105008398A中公開的包含能夠特異性結合Her2的抗體藥物綴合物(即抗體藥物偶聯物，ADC)，其中所述抗體稱為“RC48抗體”，其(i)重鏈CDR 1-3區的氨基酸序列分別為DYYIH，RVNPDHGDSYYNQKFKD，ARNYLFDHW；和(ii)所述輕鏈CDR 1-3的氨基酸序列分別為KASQDVGTAVA，WASIRHT，HQFATYT；或者進一步所述抗體衍生自在2013年08月22日以保藏編號CGMCC No.8102保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的雜交瘤所分泌的抗體。或者進一步所述抗體衍生自在2013年11月06日以保藏編號CCTCC C2013170保藏于中國典型培養物保藏中心的CHO細胞所分泌的抗體。一種RC48-ADC藥物的結構如圖9所示。
實施例
下面將通過實施例對本發明進行進一步的闡述，需要說明的是，以下實施例是對本發明進行進一步的闡述和解釋，而不應被看作是對本發明的限制。
以下實施例中採用RC48M抗體作為靶向Her2蛋白胞外結構域IV區的IHC檢測抗體的一個示例，其重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。以檢測乳腺癌樣本作為示例。
實施例1 RC48M抗體(Primary Antibody)IHC檢測與PATHWAY -anti-Her2/neu(4B5)Rabbit Monoclonal Primary Antibody(以下簡稱4B5抗體)IHC檢測的總體符合率比較及假陰性問題
針對49例浸潤性乳腺癌樣本進行對比檢測分析。
1)4B5抗體，按照產品指導方法進行操作；
2)RC48M IHC檢測主要操作步驟
表3 RC48M IHC檢測主要操作步驟
Figure 109106589-A0101-12-0016-9
檢測結果列表見表4。
表4 49例樣本檢測結果清單
Figure 109106589-A0101-12-0016-10
Figure 109106589-A0101-12-0017-11
注：對染色結果的分級判斷參考《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》中規則進行判讀，下同。對以上結果進行匯總統計，結果見表5。
表5檢測結果統計分析表
Figure 109106589-A0101-12-0018-14
從以上統計結果來看，檢測分級完全相同的共33例(18+6+1+8)，占比67.3%(33/49)。從目前醫學決定的判斷指導來看，0及1+定為陰性，2+為可疑，3+為陽性，則共計26例(18+7+1)+6例+1例+8例=41例(占比83.7%)，採用二者將得出相同的醫學決定。存在決定差異的病例匯總如表6。
表6 醫學決定存在差異樣本清單
Figure 109106589-A0101-12-0018-15
在上文中提及，Seema Jabbar等人(文獻6：Comparison of Two FDA-Approved Her2 Immunohistochemical Assays for Breast Carcinoma：HercepTest and Pathway Her2(4B5),Am J Clin Pathol 2018；149：S93-S94)針對共計95份乳腺癌(Breast Carcinoma)樣本進行了HercepTest和Pathway Her2(4B5)(簡稱4B5)檢測。HercepTest檢測結果為72份可疑+23份陽性；其中72份可疑樣本經4B5檢測，52 份(52/72=72%)為陰性。4B5檢測的95份樣本中，52例(55%)為陰性，25例(26%)為可疑，18例(19%)為陽性。通過FISH對結果進行確認檢測，顯示4B5相對於HercepTest檢測與FISH檢測結果有更高的一致性。另外，在4B5檢測的52例陰性中，有3例經FISH檢測驗證為陽性，則表明4B5檢測的結果存在一定的假陰性。結合表6的結果，R48M檢測的結果將部分4B5檢測的結果判讀為2+，成為可疑病例，從而需進入FISH或CISH檢測(ISH檢測)判定的流程，儘管採用RC48M檢測導致部分病例增加了進一步ISH確認檢測步驟，但這在一定程度上避免了4B5存在的檢測結果存在部分假陰性的問題。從而避免了部分患者由於檢測假陰性的問題而錯過較佳治療期及錯失使用靶向治療藥物開展靶向治療的問題。此外，結合文獻6的結果及上述檢測資料，RC48M的檢測結果與FISH檢測結果的一致性也應高於HercepTest檢測的結果。
實施例2 假陽性問題分析
採用RC48M抗體與4B5針對RC48-ADC藥物I期臨床樣本共7例進行了平行檢測對比。每組各使用7片乳腺癌組織石蠟切片。第1組一抗為RC48M抗體；第2組一抗為4B5抗體；兩組實驗統一使用兔鼠通用型免疫組化二抗試劑盒(購自福州邁新生物技術開發有限公司)，具體的實驗過程如下所示：
(1)脫蠟水化：65℃烤片2h，之後依次用二甲苯浸泡20min，用無水乙醇浸泡5min，用95%乙醇浸泡5min，用75%乙醇浸泡5min，之後將上述切片轉移到0.01MPBST中備用；
(2)抗原修復：將第2組切片轉移到檸檬酸鈉緩衝中，98℃條件下加熱20min；第1組切片無需進行抗原修復。
(3)封閉：將第1組和第2組切片用3%過氧化氫封閉10min，之後用0.01MPBST浸泡兩次，一次3min；
(4)一抗：將第1組和第2組切片放置在濕盒中，將RC48M抗體稀釋至1μg/ml，之後將稀釋後的RC48M抗體和4B5抗體分別滴加到對應的第1組和第2組切片上，37℃孵育60min，恢復室溫後，用0.01MPBST浸泡兩次，一次3min；
(5)二抗：將兔鼠通用型免疫組化二抗試劑盒中的兔鼠通用型二抗分別滴加至第1組和第2組切片上，滴加量為100μl/片，37℃孵育20min，用PBST(0.01M)浸泡兩次，一次3min；之後再將上述試劑盒 中的反應放大劑滴加至第1組和第2組切片上，滴加量為100μl/片，37℃孵育20min，用PBST(0.01M)浸泡兩次，一次3min；
(6)DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒(購自福州邁新生物技術開發有限公司)，取1mL試劑盒中的稀釋緩衝液，DAB色原和底物各50μl，混勻後加至切片，室溫顯色1-3分鐘，蒸餾水洗滌；
(7)蘇木素複染：每張切片滴加100μL的蘇木素染色液(購自福州邁新生物技術開發有限公司)，室溫染色2-5min，自來水沖洗5min返藍。
(8)脫水：將第1組和第2組切片依次浸泡在75%乙醇中浸泡5min、95%乙醇中5min、100%乙醇中5min、二甲苯中10min，之後取出切片，揮幹二甲苯。
(9)封片。
之後顯微鏡下觀察拍照，物鏡10×，目鏡20×，放大倍數200倍。染色結果如圖2-8，其中圖2A、圖3A、圖4A、圖5A、圖6A、圖7A、圖8A顯示的是一抗為RC48M抗體的免疫組織化學染色結果，其中圖2B、圖3B、圖4B、圖5B、圖6B、圖7B、圖8B顯示的是一抗為4B5抗體的免疫組織化學染色結果。在序號2、3、4、5、6、7病例中RC48M抗體與4B5抗體具有相近的染色，而在序號1的病例中RC48M與4B5表現出區別，其中RC48M染色為陰性，而4B5則染色陽性。根據《乳腺癌HER2檢測指南(2014版)》中規則對上述染色結果進行判讀，判讀結果見表7。在序號3、4、5、6病例中RC48M抗體與4B5抗體的染色結果同為3+，在序號2病例中二者染色結果同為2+，序號7病例中二者染色出現1個等級的差異，序號1病例中二者染色顯示出陰性和3+的區別。根據各序號代表的病例對應的臨床試驗藥效資訊可知，序號1代表的病例在經過臨床用藥後疾病仍持續進展，即對該檢測陽性患者而言，採用靶向藥物無效，這也就是說序號1的病例採用4B5抗體進行檢測時出現了假陽性。結果表明RC48M抗體能夠有效的降低如Her2胞外區突變等導致的檢測假陽性問題，從而能夠更為準確的為此類患者確定後續治療方案，避免無效的靶向用藥治療，從而極大的節約了此類患者的無效治療投入，並為後續選擇其他治療方案給出更準確的檢測參考。
表7 檢測結果及臨床藥效
Figure 109106589-A0101-12-0021-16
 注：PD代表疾病進展；PR代表部分緩解；SD代表疾病穩定。
本發明已通過各具體實施例作了舉例說明。但是，本領域普通技術人員能夠理解，本發明並不限於各具體實施方式，普通技術人員在本發明的範文內可以作出各種改動或變型，並且在本說明書中各處提及的各個技術特徵可以相互組合，而仍不背離本發明的精神和範圍。這樣的改動和變型均在本發明的範圍之內。
<110> 荻汜昜秶狻ㄗ捈怢ㄘ衄癹鼠侗
<120> 珨笱Her2圈呴淖剿轎砮郪趙潰聆蕨极摯 茼蚚
<130> CP0020-TW-0054
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 1
Figure 109106589-A0101-12-0022-17
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 2
Figure 109106589-A0101-12-0022-18
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 3
Figure 109106589-A0101-12-0022-19
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 4
Figure 109106589-A0101-12-0023-20
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 5
Figure 109106589-A0101-12-0023-21
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 6
Figure 109106589-A0101-12-0023-22
<210> 7
<211> 439
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 7
Figure 109106589-A0101-12-0023-23
Figure 109106589-A0101-12-0024-24
Figure 109106589-A0101-12-0025-26
<210> 8
<211> 212
<212> PRT
<213> 馱唗蹈
<400> 8
Figure 109106589-A0101-12-0025-27
Figure 109106589-A0101-12-0026-28

Claims (11)

  1. 一種人表皮生長因數受體2(Her2)伴隨診斷免疫組化檢測(IHC)用抗體，其特徵在於，所述抗體特異性結合Her2蛋白胞外結構域IV區，且所述抗體具備有效檢測未經抗原或表位元修復處理的IHC樣本的性能。
  2. 權利要求1所述的抗體，所述抗體Fc段為非人哺乳動物抗體Fc段，優選為鼠源Fc片段或兔源Fc片段。
  3. 根據權利要求1或2所述的抗體，其特徵在於，所述抗體與以下CDR限定的抗體競爭性結合相同或相近表位，所述以下CDR限定的抗體的重鏈可變區的CDR 1-3分別如SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；所述CDR限定的抗體的輕鏈可變區的CDR 1-3分別如SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列。
  4. 根據權利要求1-3中任一項所述的抗體，其特徵在於，所述抗體中：
    (i)重鏈可變區的CDR1具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：1進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR2具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：2進行1，2，3，4或5個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR3具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：3進行1，2或3個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或
    (ii)輕鏈可變區的CDR1具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：4進行1，2，3或4個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR2具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：5進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或/和CDR3具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或對SEQ ID NO：6進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；
    和/或
    (iii)所述的免疫球蛋白Fc片段為鼠源IgG Fc片段，或進一步為鼠源IgG1 Fc片段。
  5. 根據權利要求4所述的抗體，其特徵在於，所述抗體中：
    (i)重鏈可變區的CDR1-3分別為SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；和
    (ii)輕鏈可變區的CDR1-3分別為SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列。
  6. 根據權利要求1-5任一項所述的抗體，其特徵在於，
    (i)所述抗體的重鏈包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或者與其具有至少80%序列同一性的序列；和/或
    (ii)所述抗體的輕鏈包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或者與其具有至少80%序列同一性的序列；並且
    (iii)所述抗體的重鏈可變區的CDR1-3分別如SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列；所述抗體的輕鏈可變區的CDR1-3分別如SEQ ID NO：4-6所示的氨基酸序列。
  7. 根據權利要求6所述的抗體，其特徵在於，
    (i)所述抗體的重鏈如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和
    (ii)所述抗體的輕鏈如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
  8. 一種核酸分子，其編碼權利要求1至7中任一項所述的抗體。
  9. 一種載體，其包含權利要求7所述的核酸分子。
  10. 權利要求1-7任一項所述的抗體在製備Her2伴隨診斷免疫組化檢測產品中的用途，所述免疫組化檢測產品具備在免疫組化檢測過程中無需抗原或表位元修復步驟的功能；優選的，所述Her2伴隨診斷免疫組化檢測產品是用於RC48-ADC靶向藥物治療前配套的Her2伴隨診斷免疫組化檢測產品；更優選的，所述Her2伴隨診斷免疫組化檢測產品所針對的適應症為Her2相關癌症，進一步優選為乳腺癌、胃癌、胃食管癌、食道癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、尿路上皮癌或膀胱癌。
  11. 一種Her2伴隨診斷免疫組化檢測試劑盒，其包含權利要求1-7任一項權利要求所述的抗體，所述試劑盒具備在免疫組化檢測過程中無需抗原或表位元修復步驟的功能；優選的，所述Her2伴隨診斷免疫組化檢測試劑盒是用於RC48-ADC靶向藥物治療前配套的Her2伴隨診斷免疫組化檢測試劑盒；更優選的，所述Her2伴隨診斷免疫組化檢測試劑盒所針對的適應症為Her2相關癌症，進一步優選為乳腺癌、 胃癌、胃食管癌、食道癌、卵巢癌、子宮內膜癌、肺癌、尿路上皮癌或膀胱癌。
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