TW202012624A - 用以調節atxn2 表達之寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本發明係涉及能夠調節目標細胞中ATXN2的表達之反義寡核苷酸。所述寡核苷酸係與ATXN2信使核糖核酸(mRNA)雜交。本發明進一步涉及所述寡核苷酸之複合體及藥物組成物，以及利用所述寡核苷酸治療例如第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀等神經退化性疾病之方法。

Description

用以調節ATXN2表達之寡核苷酸
本發明涉及與共濟失調2型編碼核酸(ATXN2)互補且將之標定的寡核苷酸(寡聚物)，從而提供降低ATXN2的表達的功效。降低ATXN2表達有助於控制多種醫學疾患，例如神經退化性疾病，包括第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症以及TDP-43蛋白質病症狀。
ATXN2基因中31次或以上的CAG重複可能使得共濟失調2型(ATXN2)蛋白質的麩醯胺酸重複擴增，從而引發第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)這種罕見的神經退化性疾患。此外，CAG重複擴增可能通過與TAR DNA結合蛋白質43 (TDP-43)產生RNA依賴性的相互作用，成為肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的遺傳風險因子。其他與TDP-43蛋白質病有關的神經退化性疾病還有例如阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)及帕金森症。近年來，ALS關聯小鼠模型的TDP-43轉殖基因小鼠(TDP-43T/Tg )與Atxn2 陰性小鼠交配繁殖的結果是使TDP-43T/Tg Atxn2-/ 小鼠的壽命大幅提升且在運動功能方面有所改善(Becker等人2017年Nature 544:367-371)。同篇文章顯示經過標定ATXN2的反義寡核苷酸治療的TDP-43T/Tg 小鼠能夠存活得更久，且運動能力增強。
US 2017/175113、WO 2015/143246及WO 2017/117496等專利亦有提及標定ATXN2的反義寡核苷酸，其中WO 2017/117496更針對ALS的治療進行探討。Scoles等人先前的研究(2017年Nature 544:362)評估了反義寡核苷酸減少小腦中ATXN2的能力，並指出定位於浦金氏細胞應可有助於SCA2的治療。 [本發明的目的]
本發明提供在體內及體外皆可調節ATXN2的反義寡核苷酸。本發明提出一個存在於人類ATXN2前信使核糖核酸(前-mRNA)的內含子9中的特定目標序列，此序列可為反義寡核苷酸所標定而產生抑制ATXN2的實際效果。具體而言，標定序列識別號：1的83118-83146位置有助於減少ATXN2。
本發明亦提供能夠抑制ATXN2的有效反義寡核苷酸序列和化合物，及其在治療例如神經退化性疾病等疾病或疾患上的用途，所述神經退化性疾病包括第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀。
本發明是關於標定智人共濟失調2型(ATXN2)轉錄並且能夠抑制ATXN2的表達之反義寡核苷酸。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其式為5’ ATTTtactttaaccTCC 3’ (序列識別號7)，其中大寫字母為β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，所有LNA C皆為LNA 5-甲基胞嘧啶，且所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
本發明提供一種如下式之寡核苷酸，
Figure 02_image003
或一種其藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，本發明提供一種反義寡核苷酸，其式為 TCAcAttttactttaacCTC (序列識別號15_4) 其中大寫字母為β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
本發明提供一種下式之寡核苷酸
Figure 02_image005
或一種其藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸的形式是一種藥學上可接受之鹽。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸的形式是一種藥學上可接受之鈉鹽。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸的形式是一種藥學上可接受之鉀鹽。
本發明提供一種複合體，其包含如本發明的反義寡核苷酸以及至少一個共價連附於所述寡核苷酸的複合體部分。換言之，在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸的形式是一種複合寡核苷酸。在某些實施例中，所述寡核苷酸並非複合式。
本發明提供一種藥物組成物，其係包含本發明之反義寡核苷酸或複合體，以及一種藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐藥。
在某些實施例中，所述組成物包含一種藥學上可接受之稀釋劑，例如無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸是以一種藥學上可接受之稀釋劑調製成濃度為50至300微莫耳的溶液。所述稀釋劑可為磷酸鹽緩衝生理鹽水。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸是以一種藥學上可接受之稀釋劑調製成每毫升1至100毫克的濃度，例如每毫升2至30或2至50毫克，或例如每毫升4至30毫克。所述稀釋劑可為磷酸鹽緩衝生理鹽水。
本發明提供一種用以調節正在表達ATXN2的目標細胞中之ATXN2表達的方法，所述方法包含對所述細胞施以有效量的本發明之反義寡核苷酸或複合體或藥物組成物。在某些實施例中，所述方法是體外方法。在某些實施例中，所述方法是體內方法。在某些實施例中，所述細胞是神經元細胞，例如小腦細胞，例如浦金氏細胞，或皮層細胞。
本發明提供用於藥品中的本發明之寡核苷酸、複合體或藥物組成物。
本發明提供用於治療疾病的本發明之寡核苷酸、複合體或藥物組成物，所述疾病選自以神經退化性疾病所構成之群組，所述神經退化性疾病選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組。
本發明提供上述本發明之寡核苷酸、複合體或藥物組成物在製備用於治療或預防神經退化性疾病的藥劑上的用途，所述神經退化性疾病例如是選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43症狀所構成之群組的疾病。
本發明提供一種用於治療或預防疾病之方法，其係包含對罹有或易於罹患所述疾病的對象施以治療或預防上有效量的本發明之反義寡核苷酸、複合體或藥物組成物，其中所述疾病選自以神經退化性疾病所構成之群組，所述神經退化性疾病選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組。
在某些實施例中，所述疾病是第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)。
在某些實施例中，所述疾病是肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。
例如在治療用途上，適合的治療對象是罹有或易於罹患所述疾病的人。
在又一態樣中，本發明提供藥物組成物，其包含本發明之寡核苷酸以及藥學上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐藥。
在又一態樣中，本發明提供的方法是藉由對正在表達ATXN2的目標細胞施以有效量的本發明之寡核苷酸或組成物而調節所述細胞中之ATXN2表達的體內或體外方法。
在又一態樣中，本發明提供用於治療或預防與ATXN2體內活性有關之疾病、疾患或機能障礙的方法，所述方法包含對罹有或易於罹患所述疾病、疾患或機能障礙之對象施用治療或預防上有效量之本發明寡核苷酸。
在又一態樣中，本發明提供用於治療或預防與ATXN2體內活性有關之疾病、疾患或機能障礙的方法，所述方法包含對罹有或易於罹患所述疾病、疾患或機能障礙之對象施用治療或預防上有效量之標定ATXN2的寡核苷酸，或其複合體或藥物組成物，例如本發明之反義寡核苷酸或是標定ATXN2的小干擾核糖核酸(siRNA)，其中至少所述方法包含施用至少連續兩劑標定ATXN2的寡核苷酸，其中至少連續兩劑之間的時間間隔為至少2週，例如至少3週，例如至少4週，例如至少一個月，例如至少6週，例如至少8週，例如至少兩個月。因此可例如每週、每兩週、每月或每兩個月給藥一次。
在又一態樣中，本發明提供用以治療或預防神經退化性疾病的方法，所述方法包含對罹有或易於罹患所述神經退化性疾病之對象施用治療或預防上有效量之標定ATXN2的寡核苷酸，或其複合體或藥物組成物，例如本發明之反義寡核苷酸或是標定ATXN2的siRNA，其中至少所述方法包含施用至少連續兩劑標定ATXN2的寡核苷酸，其中至少連續兩劑之間的時間間隔為至少2週，例如至少3週，例如至少4週，例如至少一個月，例如至少6週，例如至少8週，例如至少兩個月。因此給藥的實施可為例如每週、每兩週、每月或每兩個月。在又一態樣中，本發明提供一種用於治療或預防受試者身上神經退化性疾病的標定ATAXN2的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的給藥是至少連續兩劑，其中至少連續兩劑之間的時間間隔為至少2週，例如至少3週，例如至少4週，例如至少一個月，例如至少6週，例如至少8週，例如至少兩個月。因此可例如每週、每兩週、每月或每兩個月給藥一次。
在又一態樣中，本發明之寡核苷酸或組成物是用於治療或預防神經退化性疾病，例如選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組的神經退化性疾病。
在又一態樣中，本發明之寡核苷酸或組成物是用於治療或預防第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)。
在又一態樣中，本發明之寡核苷酸或組成物是用於治療或預防肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。
[定義]
寡核苷酸
本文所用的「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連結核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在實驗室中製作，先經固相化學合成後再加以純化和分離。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連結核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，通常經過純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如2’糖修飾核苷。
反義寡核苷酸
本文所用「反義寡核苷酸」的定義是能夠藉由與目標核酸雜交而調節目標基因之表達的寡核苷酸，其所雜交的對象具體而言是目標核酸上的連續序列。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是siRNA或shRNA。本發明之反義寡核苷酸較佳的是單股。應知，只要跨寡核苷酸全長的序列內或序列間自補程度低於50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙鏈體結構(同一寡核苷酸的兩個分子之間的雙鏈體)。
有利的是，本發明之單股反義寡核苷酸不含有RNA核苷(2’-OH 未修飾核糖)。
有利的是，本發明之反義寡核苷酸含有一個或多個修飾核苷或核苷酸，例如2’糖修飾核苷。此外，有利的是，所述未經修飾的核苷是DNA核苷。
連續核苷酸序列
「連續核苷酸序列」一詞意指寡核苷酸的與目標核酸互補的區域。在本文中，此詞可與「連續核鹼基序列」和「寡核苷酸模體序列」交替使用。在某些實施例中，所述寡核苷酸的全部核苷酸構成所述連續核苷酸序列。在某些實施例中，所述寡核苷酸包含連續核苷酸序列，例如F-G-F’缺口體區域，且可隨選包含其他核苷酸，例如可用於將官能基團附加至所述連續核苷酸序列的核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與目標核酸互補或不互補。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中包括自然產生及非自然產生核苷酸。在本質上，例如DNA及RNA核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根(核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
修飾核苷
本文中所用的「修飾核苷」或「核苷修飾」一詞意指藉由導入糖部分或(核)鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等 DNA或RNA核苷進行修飾的核苷。於一較佳實施例中，所述修飾核苷包含修飾糖部分。修飾核苷一詞在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾 DNA或RNA糖部分的核苷稱為DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克(Watson Crick)鹼基配對，則大體上仍稱為DNA或RNA。
修飾核苷間鍵合
「修飾核苷間鍵合」一詞，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯(PO)鍵合以外，可將兩個核苷共價耦接在一起的鍵合。因此本發明之寡核苷酸可包含修飾核苷間鍵合。在某些實施例中，所述修飾核苷間鍵合可使寡核苷酸的核酸酶抗性相較於磷酸二酯鍵合增加。就自然產生寡核苷酸而言，核苷間鍵合包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵的磷酸根。修飾核苷間鍵合特別能夠穩定寡核苷酸，利於體內使用，且可防止本發明之寡核苷酸中DNA或RNA核苷的區域發生核酸酶切斷的情形，例如在缺口體寡核苷酸的缺口區域G內，以及在修飾核苷的區域中，例如區域F及F’。
在一實施例中，所述寡核苷酸包含一個或多個修飾自天然磷酸二酯的核苷間鍵合。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少50%的所述核苷間鍵合經過修飾，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少60%，例如至少70%，例如至少75%，例如至少80%或例如至少90%的所述核苷間鍵合經過修飾。在某些實施例中，修飾範圍包括所述寡核苷酸的全部所述核苷間鍵合或其連續核苷酸序列。應知在某些實施例中，將本發明之寡核苷酸連結至例如複合體等非核苷酸功能基團的核苷可為磷酸二酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列的全部所述核苷間鍵合皆為抗核酸酶核苷間鍵合。
有利的是在本發明之寡核苷酸中使用硫代磷酸酯核苷間鍵合。
硫代磷酸酯核苷間鍵合由於具有核酸酶抗性、優良藥物動力學且易於製造，因此特別適用。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少50%的所述核苷間鍵合為硫代磷酸酯，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的例如至少60%，例如至少70%，例如至少75%，例如至少80%或例如至少90%的所述核苷間鍵合為硫代磷酸酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的全部所述核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯。
有利的是，所述寡核苷酸的連續核苷酸序列的所有所述核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯，或所述寡核苷酸的所有所述核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯鍵合。
硫代磷酸酯鍵合可能以不同的互變異構形式存在，例如以下所示者：
Figure 02_image007
應知，如EP 2 742 135中所揭露，反義寡核苷酸可包含其他核苷間鍵合(磷酸二酯及硫代磷酸酯除外)，例如磷酸烷酯/磷酸甲酯核苷間連結，其依據 EP 2 742 135可例如耐受於缺口區域中不同狀態之DNA 硫代磷酸酯。
核鹼基
核鹼基一詞包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)和嘧啶(例如脲嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，核鹼基一詞亦包含與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交過程中具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、脲嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變體。此類變體例如是Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055以及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1中所描述的變體。
在某些實施例中，所述核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為修飾嘌呤或嘧啶而修飾，例如取代嘌呤或取代嘧啶，例如選自異胞嘧啶、偽異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑并-脲嘧啶、2-硫基-脲嘧啶、2’硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。
所述核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如A、T、G、C或U，其中各字母可隨選包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。隨選的是，5-甲基胞嘧啶LNA核苷可用於LNA缺口體。
修飾寡核苷酸
修飾寡核苷酸一詞描述包含一個或多個糖修飾核苷及/或修飾核苷間鍵合的寡核苷酸。有些文獻中使用「嵌合寡核苷酸」來描述具有修飾核苷的寡核苷酸。
互補性
「互補性」一詞是用來形容核苷/核苷酸的瓦特生克立克 (Watson-Crick)鹼基配對能力。瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基對是鳥嘌呤(G) - 胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A) - 胸腺嘧啶(T)/脲嘧啶(U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此互補性一詞包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基配對(見例如Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055以及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。
本文所用的「%互補」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中的連續核苷酸序列中與參考序列(例如目標序列或序列模體)互補的核苷酸所佔的比例(百分比)，所述核酸分子橫跨所述連續核苷酸序列。互補性百分率的計算方式是先算出兩個序列間互補(形成瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基對)的對齊核鹼基(當對齊於目標序列5’-3’及寡核苷酸序列3’-5’)的數目，將該數字除以所述寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以100。在該等比對中，未對齊(形成鹼基對)的核鹼基/核苷酸稱為錯配。計算連續核苷酸序列的%互補性時不可進行插入和刪除。應知在判定互補性時，只要核鹼基形成瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾(例如在計算%相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
「完全互補」意指具有100%互補性。
以下是與目標序列完全互補的寡核苷酸實例。
以下是與目標序列(序列識別號：6)完全互補的寡核苷酸(序列識別號：15)實例。 5’ ttaaggaggttaaagtaaaatgtgaattt 3’ (序列識別號：6) 3’ ctccaatttcattttacact 5’ (序列識別號：15)
相同度
本文所用的「相同度」意指核酸分子(例如寡核苷酸)中的連續核苷酸序列中與參考序列(例如序列模體)完全相同的核苷酸所佔的比例(百分比)，所述核酸分子橫跨所述連續核苷酸序列。相同度百分比的計算方式是，算出兩個序列(在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在參考序列中)之間相同(為一個匹配)的對齊核鹼基的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域(例如連續核苷酸序列)長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時不可對序列進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克(Watson-Crick)鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾(例如在計算%相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
雜交
本文所用的「雜交」是指兩股核酸(例如一股寡核苷酸及一股目標核酸)在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙鏈體。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度(Tm )來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與目標核酸形成雙鏈體時的溫度。在生理條件下，Tm 並非確實與親和力成比例(Mergny與Lacroix, 2003年，Oligonucleotides 13:515–537)。標準狀態吉布斯自由能ΔG°更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數(Kd )之間具有ΔG° = -RTln(Kd )的關係，其中R是氣體常數，而T是絕對溫度。因此，寡核苷酸與目標核酸之間反應的非常低的ΔG°體現所述寡核苷酸與目標核酸之間的強勢雜交。ΔG°是與含水濃度為1M、pH為7、溫度為37℃的反應關聯的能量。寡核苷酸與目標核酸的雜交是自發性反應，而自發性反應的ΔG°小於零。ΔG°可經由實驗來測量，例如，利用如Hansen等人1965年在Chem. Comm. 36–38及Holdgate等人2005年在Drug Discov Today中所描述的等溫滴定微量熱法(ITC)。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量ΔG°的商用設備。ΔG°亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用SantaLucia 於1998年在Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460–1465中所描述的最近鄰模型或利用Sugimoto等人於1995年在Biochemistry 34:11211–11216中及McTigue等人於2004年在Biochemistry 43:5388–5405中所描述的適當取得的熱動力學參數。為了能夠經由雜交調節本發明之寡核苷酸的預期核酸目標，將長度為10-30個核苷酸的寡核苷酸以低於-10千卡的估計ΔG°值雜交至目標核酸。在某些實施例中，雜交的程度或強度是以標準狀態吉布斯自由能ΔG°來測量。長度為8至30個核苷酸的寡核苷酸可以低於-10千卡範圍的估計ΔG°值雜交至目標核酸，例如低於‑15千卡，例如低於-20千卡，及例如低於-25千卡。在某些實施例中，所述寡核苷酸以-10至-60千卡，例如-12至-40千卡，例如自-15至-30千卡或‑16至-27千卡，例如-18至-25千卡的估計ΔG°值雜交至目標核酸。
目標核酸
依據本發明，目標核酸是將哺乳動物ATXN2 編碼的核酸且可為例如基因、RNA、mRNA及前mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。因此所述目標可稱為ATXN2目標核酸。本發明之寡核苷酸可例如標定哺乳動物ATXN2的外顯子區域，或可例如標定ATXN2前mRNA中的內含子區域(見表1)。
表1. 人類ATXN2 外顯子與內含子
Figure 108119356-A0304-0001
適合的是，所述目標核酸可將ATXN2蛋白質編碼，特別是哺乳動物ATXN2，例如人類ATXN2 (見例如表2及表3)，其提供用於人類、猴子、大鼠及豬ATXN2的mRNA及前mRNA序列)。
在某些實施例中，所述目標核酸選自以序列識別號：1、2、3、4及5或其自然產生變體(例如哺乳動物共濟失調2型蛋白質的序列編碼)所構成之群組。
若在研究或診斷中使用本發明之寡核苷酸，則目標核酸可為cDNA或取自DNA或RNA的合成核酸。
在體內或體外應用方面，本發明之寡核苷酸通常能夠在表達ATXN2目標核酸的細胞中產生抑制ATXN2目標核酸表達的效果。本發明之寡核苷酸的核鹼基的連續序列在整個寡核苷酸長度上測量的結果通常是與ATXN2目標核酸為互補，隨選的是有一個或兩個錯配的例外，且隨選的是不包含能夠將寡核苷酸連結至例如複合體等隨選官能基團或其他非互補末端核苷酸(例如區域D’或D’’)的核苷酸基連接子區域。在某些實施例中，所述目標核酸可為RNA或DNA，例如信使RNA，例如成熟mRNA或前mRNA。
在某些實施例中，所述目標核酸是將哺乳動物Ataxin2蛋白質編碼的RNA或DNA，所述目標核酸例如是人類ATXN2，例如人類ATXN2 mRNA序列，例如序列識別號1所揭示者。表2及表3中提供有關例示目標核酸的進一步資訊。
表2. ATXN2 跨物種基因組及組裝資訊。
Figure 108119356-A0304-0002
 Fwd = 正向股。基因組座標提供前mRNA序列(基因組序列)。NCBI 參考提供 mRNA序列(cDNA序列)。 *美國國家生物技術資訊中心參考序列資料庫是全面的整合性非冗餘且註解完善的參考序列組，包括基因組、轉錄及蛋白質。其網址為www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq 。
表3. ATXN2 跨物種序列詳情。
Figure 108119356-A0304-0003
目標序列
本文所用的「目標序列」意指出現在目標核酸中的核苷酸的一個序列，其包含與本發明之寡核苷酸為互補的核鹼基序列。在某些實施例中，所述目標序列包含目標核酸上的一個區域，所述區域的核鹼基序列與本發明之寡核苷酸的連續核苷酸序列為互補。所述目標核酸的此一區域也可互換地稱為目標核苷酸序列、目標序列或目標區域。在某些實施例中，所述目標序列比單一寡核苷酸的互補序列更長，且可能例如代表所述目標核酸的較容易受本發明之數種寡核苷酸所標定的區域。
在某些實施例中，所述目標序列選自人類ATXN2 mRNA內含子9的序列(見上表1)。
在本發明之一種實施例中，所述目標序列為序列識別號：6。
本發明之寡核苷酸包含與所述目標核酸互補或雜交的連續核苷酸序列，例如本文所述的目標序列。
與所述寡核苷酸互補或雜交的所述目標序列通常包含具有至少10個核苷酸的連續核鹼基序列。所述連續核苷酸序列具有10至50個核苷酸，例如12至30個，例如14至20個，例如15至18個連續核苷酸。
目標細胞
本文所用的「目標細胞」一詞是指正在表達目標核酸的細胞。在某些實施例中，所述目標細胞可以是體內或體外的。在某些實施例中，所述目標細胞是哺乳動物細胞，例如囓齒動物細胞，例如小鼠細胞或大鼠細胞，或靈長類動物細胞，例如猴子細胞或人類細胞。
在某些實施例中，所述目標細胞可為浦金氏神經元，例如浦金氏細胞。其他相關目標細胞為運動神經元，例如上運動神經元及下運動神經元。
對於體外評估，所述目標細胞可為已建立的細胞系，例如A431或U2-OS細胞。或者，可將取自人類誘導式多能性幹細胞(iPCS)的運動神經元(見例如Sances等人2016年Nat Neurosci. 19(4): 542–553)或取自浦金氏細胞的iPCS (Wang等人2015年Scientific Reports 5:9232)用於體外篩選。
在較佳實施例中，所述目標細胞表達ATXN2 mRNA，例如ATXN2前mRNA或ATXN2成熟mRNA。ATXN2 mRNA的複A尾部在反義寡核苷酸標定上通常予以忽略。
自然產生變體
「自然產生變體」一詞意指與所述目標核酸源自相同基因座但可有差異的ATXN2 基因或轉錄的變體，所述差異可例如是出於基因碼簡併造成多重密碼子編碼同一個胺基酸，或因前mRNA的選擇性剪接，或多態性的存在，例如單核苷酸多態性(SNP)及等位基因變體。在與所述寡核苷酸有充分互補序列的條件下，本發明之寡核苷酸可因此標定目標核酸及其自然產生變體。
在某些實施例中，所述自然產生變體與哺乳動物ATXN2目標核酸具有至少95%，例如至少98%或至少99%的同源性，例如選自以序列識別號：1、2、3、4及5所構成之群組的目標核酸。在某些實施例中，所述自然產生變體與序列識別號：1的人類ATXN2目標核酸具有至少99%的同源性。
表達的調節
本文所用的「表達的調節」一詞是一個總體術語，用以描述與施用寡核苷酸前的ATXN2量相較之下，所述寡核苷酸改變 ATXN2量的能力。或者，表達的調節可參照對照組實驗進行判定。如普遍所知，對照組是以鹽水組成物處置的個體或目標細胞，或是以非標定寡核苷酸(仿製品)處置的個體或目標細胞。
一類調節是寡核苷酸抑制、調降、減少、壓制、去除、停止、阻止、預防、減輕、降低、避免或終止 ATXN2表達的能力，例如藉由降解 mRNA或阻擋轉錄。有利的是，本發明之反義寡核苷酸能夠抑制哺乳動物ATXN2的表達，例如人類ATXN2。
高親和力修飾核苷
高親和力修飾核苷是一種修飾核苷酸，當併入所述寡核苷酸中時，可提升所述寡核苷酸對其互補目標的親和力，例如以融化溫度(Tm )所測定者。本發明之高親和力修飾核苷較佳的是造成每一修飾核苷的融化溫度增加 +0.5至+12℃，更佳的是+1.5至+10℃，最佳的是+3至+8℃。此技術領域中已有眾多為人所知的高親和力修飾核苷，包括例如許多2’取代核苷以及鎖核酸(LNA)(見例如Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一個或多個具有修飾糖部分的核苷，亦即與DNA及RNA中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環(HNA)，或通常在核糖環上的C2與C4碳原子之間具有雙自由基橋的雙環(LNA)，或通常在C2與C3碳原子之間無鍵的未連結核糖環(例如UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸(PNA)或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在DNA及RNA核苷中自然存有的氫或2’-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在2’、3’、4’或5’位置導入。
2’糖修飾核苷
2’糖修飾核苷是在2’位置(2’取代核苷)具有非H或–OH的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的2’碳與第二碳之間形成架橋的2’連結雙自由基的核苷，例如LNA (2’ – 4’雙自由基架橋)核苷。
更確切地，2’糖取代核苷的開發頗受關注，目前也已發現許多2’取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2’修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2’取代修飾核苷的實例包括2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟基-RNA及2’-F-ANA核苷。更多實例請參看例如Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213以及Deleavey與Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為2’取代修飾核苷的圖解。
Figure 02_image009
Figure 02_image011
在本發明中，2’取代糖修飾核苷並不包括2’橋接核苷，如LNA。
鎖核酸核苷(LNA核苷)
「LNA核苷」是一種2’-修飾核苷，所述2’-修飾核苷包含連結所述核苷的核糖環之C2’與C4’的雙自由基(此雙自由基亦稱為「2’ - 4’架橋」)，其可限制或鎖定所述核糖環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。鎖定核糖的構造，可在將LNA併入寡核苷酸中而產生互補RNA或DNA分子時提升雜交親和力(雙鏈體穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙鏈體的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示 LNA核苷已於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人，Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81及Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238以及Wan與Seth，J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667中揭露。
方案1中揭露了其他非限制性例示 LNA核苷。 方案1：
Figure 02_image013
特定LNA核苷為β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基 LNA，例如(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)及ENA。
具有特定優勢的LNA為β-D-氧基-LNA。
本文所述的化合物可包含數個非對稱中心，且其形式可為純對映體、對映體的混合物例如外消旋物、非鏡像異構體的混合物、非鏡像異構外消旋物或非鏡像異構外消旋物的混合物。
「非對稱碳原子」一詞意指具有四個不同取代基的碳原子。依據 Cahn-Ingold-Prelog序列法則，非對稱碳原子可為「R」或「S」組態。
藥學上可接受之鹽
「藥學上可接受之鹽」一詞意指保有生物效應及自由鹼或自由酸特性，且並非在生物上或在其他方面有不利之處的鹽。
保護基
「保護基」一詞在單獨或結合使用時，代表一個能夠選擇性鎖住多功能化合物中的反應位置，而使化學反應可選擇性地在另一個未受保護的反應位置進行的基團。保護基可以去除。例示保護基為胺基保護基、羧基保護基或羥基保護基。
核酸酶中介降解
核酸酶中介降解意指一寡核苷酸能夠在與互補核苷酸序列形成雙鏈體時，居中影響所述序列的降解。
在某些實施例中，所述寡核苷酸可經由所述目標核酸的核酸酶中介降解而發揮作用，在其中，本發明之寡核苷酸能夠招募核酸酶，特別是核酸內切酶，較佳的是核糖核酸內切酶(RNase)，例如RNase H。在經由核酸酶中介機轉而運作的寡核苷酸設計實例中，所述寡核苷酸通常包含一個長度為至少5或6個連續DNA核苷的區域，且在所述區域的一側或兩側上側接有親和力提升型核苷，例如缺口體、頭聚物及尾聚物。
RNase H活性與招募
反義寡核苷酸的RNase H活性是指當其與互補RNA分子在雙鏈體中時，招募RNase H的能力。WO01/23613 提供判定RNaseH活性的體外方法，可用於判定招募RNaseH的能力。以具有與受測修飾寡核苷酸相同的鹼基序列但在寡核苷酸中的全部單體之間僅包含具有硫代磷酸酯鍵合的DNA單體的寡核苷酸為基準，使用WO01/23613 (經參照併入於此)提供的實例91 - 95所描述的方法，以皮莫耳/公升/分鐘(pmol/l/min)為單位判定初始速率，如果一寡核苷酸與互補目標核酸序列反應的初始速率為上述基準初始速率的至少5%，例如至少10%或超過 20%，則通常認為所述寡核苷酸能夠招募RNase H。在判定RHase H活性時可使用瑞士琉森Lubio Science GmbH的重組型人類RNase H1。
缺口體
本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可為一缺口體，亦稱為缺口體寡核苷酸或缺口體設計。反義缺口體常用於透過 RNase H中介降解來抑制目標核酸。一個缺口體寡核苷酸包含至少三個有區別的結構區域，也就是一個5’-側翼、一個缺口和一個3’-側翼，F-G-F’為‘5 -＞ 3’方向。所述「缺口」區域(G)包含一段讓寡核苷酸能夠招募RNase H的連續DNA核苷酸。所述缺口區域側接包含一或多個糖修飾核苷的5’側翼區域(F)，有利的是高親和力糖修飾核苷，且側接包含一或多個糖修飾核苷的3’側翼區域(F’)，有利的是高親和力糖修飾核苷。區域F及F’中的一個或多個糖修飾核苷可提升寡核苷酸對於目標核酸的親和力(亦即其為親和力提升型糖修飾核苷)。在某些實施例中，區域F及F’中的一或多個糖修飾核苷是2’糖修飾核苷，例如高親和力2’糖修飾，例如獨立選自LNA及2’-MOE。
在缺口體設計中，缺口區域的5’及3’多數核苷為DNA核苷，且位置分別鄰近 5’ (F)或3’ (F’)區域的糖修飾核苷。所述側翼可進一步定義為在距離所述缺口區域最遠之端具有至少一個糖修飾核苷，也就是在5’側翼的5’端及在3’側翼的3’端。
區域F-G-F’形成一個連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可包含式 F-G-F’的缺口體區域。
所述缺口體設計F-G-F’的整體長度可為，例如12至32個核苷，例如13至24個，例如14至22個核苷，例如14至17個，例如16至18個核苷。
舉例而言，本發明之缺口體寡核苷酸可由下式代表： F1-8 -G6-16 -F’1-8 ，例如 F1-8 -G8-16 -F’2-8
附帶條件是所述缺口體區域F-G-F’的整體長度為至少12個，例如至少14個核苷酸。
在本發明一種態樣中，所述反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列具有或包含式 5’-F-G-F’-3’之缺口體，其中區域F及F’ 係獨立包含或具有1個至8個，例如2個至6個，例如3個至4個2’糖修飾核苷，其中至少有一個2’糖修飾核苷位於區域F的3’端(鄰接區域G的DNA核苷)，且至少有一個2’糖修飾核苷位於區域F’的5’端(位置鄰接區域G的DNA核苷)，而G是一個具有6個至16個能夠招募RNaseH的核苷的區域，例如一個長度為6個至16個DNA核苷的區域，例如10個至15個連續DNA核苷，例如10個至14個連續DNA核苷酸，例如11個至15個連續DNA核苷酸，例如13個至15個連續DNA核苷酸。
LNA缺口體
LNA缺口體是指其中區域F及F’中任一者或兩者都包含或具有LNA核苷的缺口體。β-D-氧基缺口體是指其中區域F及F’中任一者或兩者都包含或具有β-D-氧基 LNA核苷的缺口體。
在某些實施例中，所述LNA缺口體係如下式：[LNA]1-5 -[區域G] -[LNA]1-5 ，其中區域G 具有如所述缺口體區域G 定義中的定義。
MOE缺口體
MOE缺口體是其中區域F及F’由MOE核苷所構成的缺口體。在某些實施例中，所述MOE缺口體的設計為[MOE]1-8 -[區域G]-[MOE]1-8 ，例如[MOE]2-7 -[區域G]5-16 -[MOE]2-7 ，例如[MOE]3-6 -[區域G]-[MOE]3-6 ，其中區域G 具有如所述缺口體定義中的定義。具有5-10-5 設計(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口體已廣泛用於本技術領域中。
混合型翼缺口體
混合型翼缺口體是一種LNA缺口體，其中區域F及F’中的一者或兩者都包含2’取代核苷，例如獨立選自以2’-O-烷基-RNA單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA單元、2’-氟基-DNA單元、2’-烷氧基-RNA、MOE單元、阿糖基核酸(ANA)單元及2’-氟基-ANA單元所構成之群組的2’取代核苷，例如MOE核苷。在某些實施例中，其中區域F及F’中之至少一者或區域F及F’兩者均包含至少一個LNA核苷，區域F及F’的其餘核苷係獨立選自以MOE及LNA所構成之群組。在某些實施例中，其中區域F或F’中的至少一者或區域F及F’兩者均包含至少兩個LNA核苷，區域F及F’的其餘核苷係獨立選自以MOE及LNA所構成之群組。在某些混合型翼的實施例中，區域F及F’中的一或兩者可進一步包含一或多個DNA核苷。
混合型翼缺口體設計已於WO2008/049085及WO2012/109395中揭露。
交替側翼缺口體
側翼區域可包含LNA及DNA核苷兩者，並且由於其包含LNA-DNA-LNA核苷的交替模體，因此稱為「交替側翼」。包含此種交替側翼的缺口體稱為「交替側翼缺口體」。如此，「選擇性側翼缺口體」是指 LNA缺口體寡核苷酸，其中至少一個側翼(F或F’)在LNA核苷之外還包含DNA。在某些實施例中，區域F或F’中的至少一者或兩者都包含LNA核苷及DNA核苷這兩者。在該等實施例中，側翼區域F或F’，或F和F’兩者，包含至少三個核苷，其中F及/或F’區域的5’及3’多數核苷為LNA核苷。
一種交替側翼區域可包含至多3個連續DNA核苷，例如1個至2個或1個或2個或3個連續DNA核苷。
寡核苷酸中的區域D’或D’’
本發明之寡核苷酸可在某些實施例中包含或具有所述寡核苷酸的所述連續核苷酸序列，其與所述目標核酸互補，所述連續核苷酸序列如是缺口體F-G-F’以及進一步的5’及/或3’核苷。所述進一步的5’及/或3’核苷可與或不與所述目標核酸為完全互補。該等進一步的5’及/或3’核苷本文中可稱為區域D’及D’’。
區域D’或D’’的加入可用於將所述連續核苷酸序列，例如缺口體，連接至複合體部分或另一官能基團。當用於接合所述連續核苷酸序列與複合體部分時，其可做為生物可切斷型連接子。或者其可用於提供外核酸酶保護或促進合成或製造。
區域D’及D’’可分別連附至區域F的5’端或區域F’的3’端，以產生下式設計：D’-F-G-F’、F-G-F’-D’’或D’-F-G-F’-D’’。在此實例中，F-G-F’是所述寡核苷酸的缺口體部位，且區域D’或D’’ 構成所述寡核苷酸的一個分離部分。
區域D’或D’’可獨立包含或具有1、2、3、4或5個外加核苷酸，其可與所述目標核酸為互補或不為互補。鄰接 F或F’區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如DNA或RNA或其鹼基修飾版本。D’或D’’區域可做為對核酸酶易感的生物可切斷型連接子(見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加 5’及/或3’端核苷酸是與磷酸二酯鍵合連結，且為DNA或RNA。適用為區域D’或D’’的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照WO2014/076195的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA二核苷酸。生物可切斷型連接子在聚寡核苷酸構造中的使用可參照WO2015/113922的揭露，在該案中其係用於連結單一寡核苷酸中的多重反義構造(例如缺口體區域)。
在一實施例中，本發明之寡核苷酸除包含構成所述缺口體的連續核苷酸序列之外，還包含區域D’及/或D’’。
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式代表： F-G-F’；特別是F1-8 -G6-16 -F’2-8 D’-F-G-F’；特別是D’1-3 -F1-8 -G6-16 -F’2-8 F-G-F’-D’’；特別是F1-8 -G6-16 -F’2-8 -D’’1-3 D’-F-G-F’-D’’；特別是D’1-3 - F1-8 -G6-16 -F’2-8 -D’’1-3
在某些實施例中，所述位在區域D’與區域F之間的核苷間鍵合是磷酸二酯鍵合。在某些實施例中，所述位在區域F’與區域D’’之間的核苷間鍵合是磷酸二酯鍵合。
複合體
本文所用的複合體一詞是指共價連結至非核苷酸部分(複合體部分或區域C或第三區域)的寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸對一個或多個非核苷酸部分的接合可例如藉由影響寡核苷酸的活性、細胞分佈、細胞攝入或穩定性，來改善寡核苷酸的藥理學。在某些實施例中，所述複合體部分是藉由改善寡核苷酸的細胞分佈、生物利用度、新陳代謝、排泄、滲透性及/或細胞攝入來調整或提升寡核苷酸的藥效學特性。具體而言，所述複合體將所述寡核苷酸標定至特定器官、組織或細胞類型，並藉此提升所述寡核苷酸在該器官、組織或細胞類型中的效應。同時，所述複合體可降低所述寡核苷酸在非目標細胞類型、組織或器官中的活性，例如目標外活性或在非目標細胞類型、組織或器官中的活性。
在一實施例中，所述非核苷酸部分(複合體部分)選自以碳水化合物、細胞表面受體配體、原料藥、荷爾蒙、親脂性物質、聚合物、蛋白質、胜肽、毒素(例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白質(例如衣殼)或其組合所構成之群組。
在某些實施例中，所述複合體是對運鐵蛋白受體具有特定親和力的抗體或抗體片段，例如WO 2012/143379中所揭露者，該案經參照併入本文。在某些實施例中，所述非核苷酸部分是抗體或抗體片段，例如一種有助於跨腦血管障壁提供藥性的抗體或抗體片段，特別是一種標定運鐵蛋白受體的抗體或抗體片段。
連接子
鍵合或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。複合體部分可直接或經由連結部分(例如連接子或繫鏈)連附至所述寡核苷酸。連接子可將第三區域，例如複合體部分(區域C)，共價連接至第一區域，例如與所述目標核酸互補的寡核苷酸或連續核苷酸序列(區域A)。
在本發明的某些實施例中，本發明之複合體或寡核苷酸複合體可隨選性包含一連接子區域(第二區域或區域B及/或區域Y)，其位在互補於所述目標核酸的所述寡核苷酸或所述連續核苷酸序列(區域A或第一區域)與複合體部分(區域C或第三區域)之間。
區域B 意指包含或具有一個生理不安定鍵的生物可切斷型連接子，所述生理不安定鍵在哺乳動物體內常態存在或與之類似的條件下會成為可切斷的鍵。生理不安定連接子經歷化學轉換(例如，切斷)的條件包括化學條件，例如pH、溫度、氧化或還原條件或作用劑，以及哺乳動物細胞內所常態存在或與之類似的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中的酵素活性，例如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一實施例中，所述生物可切斷型連接子易感於S1核酸酶切斷。於一較佳實施例中，所述核酸酶易感連接子包含的核苷數量在1與10之間，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個核苷，更佳的是2個至6個核苷，最佳的是2個至4個相連結的核苷，所述相連結的核苷包含至少兩個連續磷酸二酯鍵合，例如至少3個或4個或5個連續磷酸二酯鍵合。該核苷較佳的是DNA或RNA。包含生物可切斷型連接子的磷酸二酯的詳細說明請參閱WO 2014/076195 (經由參照併入本文) –亦請參照本文中的區域D’或D’’。
區域Y 意指未必為生物可切斷型但主要功能是將複合體部分(區域C或第三區域)共價連接至寡核苷酸(區域A或第一區域)的連接子。區域Y連接子可包含鏈狀結構或例如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基團等重複單元的寡聚物。本發明之寡核苷酸複合體可由以下區域元素建構而成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在某些實施例中，所述連接子(區域Y)是胺基烷基，例如C2至C36胺基烷基團，包括，例如C6至C12胺基烷基團。於一較佳實施例中，所述連接子(區域Y)是一個C6胺基烷基團。
治療
本文所用的「治療」一詞意指治療既有疾病(例如本文所提及之疾病或疾患)，或防範疾病，也就是預防。因此應知，本文中所稱的治療，於某些實施例中，是屬於預防疾病性質。
在某些實施例中，所述治療是在經診斷罹有神經性疾患的病患身上執行，例如選自以神經退化性疾病所構成之群組的神經性疾患，所述神經退化性疾病包括第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀。
在某些實施例中，本發明之化合物是用於治療第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)或肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。
本發明之寡核苷酸
本發明係涉及能夠調節ATXN2的表達，例如抑制(調降)ATXN2表達的寡核苷酸。舉例而言，目標核酸可為哺乳動物ATXN2序列，例如選自以序列識別號：1、2、3、4及5所構成之群組的序列。
本發明之寡核苷酸是一種標定ATXN2的反義寡核苷酸
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸的所述連續核苷酸序列與人類ATAXN2前mRNA的內含子9為至少90%互補，例如為完全互補，所述內含子9 例如是序列識別號1的i9 (表1)。
在某些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠藉由抑制或調降目標的表達而對其產生調節的效果。較佳的是，上述調節相較於目標的正常表達水平可產生至少20%的表達抑制，更佳的是產生相較於正常表達水平至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%，或至少90%的表達抑制。在某些實施例中，依據體外實驗，在對A431或U2-OS細胞使用25微莫耳寡核苷酸之後，本發明之寡核苷酸能夠將ATXN2 mRNA的表達水平抑制至少60%或70%。在某些實施例中，依據體外實驗，在對A431或U2-OS細胞使用5微莫耳寡核苷酸之後，本發明之化合物能夠將ATXN2蛋白質的表達水平抑制至少50%。適合的是，實例中提供了可用於測量ATXN2 mRNA或蛋白質抑制的檢驗(例如實例1及實例2)。
本發明的一種態樣涉及長度為10個至30個核苷酸的反義寡核苷酸，其包含一個長度為10個至22個核苷酸的連續核苷酸序列，所述連續核苷酸序列與序列識別號：6 具有至少90%互補性，例如100%互補性。
在某些實施例中，所述寡核苷酸包含一個長度為10個至30個，例如10個至22個核苷酸的連續序列，所述序列與所述目標核酸或目標序列的一個區域為至少90%互補，例如至少91%，例如至少92%，例如至少93%，例如至少94%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，或100%互補，所述目標核酸或目標序列具體而言是序列識別號：6。
有利的是，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與所述目標序列完全互補(100%互補)，或者，在某些實施例中，所述寡核苷酸與所述目標核酸之間可存有一或兩組錯配。
在某些實施例中，所述寡核苷酸包含長度為10個至22個核苷酸的連續核苷酸序列，其與序列識別號：1的自位置83118至83146的目標核酸區域為至少90%互補，例如完全(或100%)互補，所述目標核酸區域可例如為序列識別號：1的位置83122至83143。
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸在長度上包含或具有10個至30個核苷酸，其長度例如為11個至28個，例如10個至22個，例如12個至22個，例如14個至20個，例如15個至20個，例如16個至18個，例如17個至20個或18個至20個連續核苷酸。於一較佳實施例中，所述寡核苷酸的長度包含或具有17個至20個核苷酸。
在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列包含或具有24個或更少之核苷酸，例如22個或更少之核苷酸，例如20個或更少之核苷酸，例如17個、18個、19個或20個核苷酸。應知在本文中給定之所有範圍均包括範圍端點。據此，若本文中描述一寡核苷酸包括自10個至30個核苷酸，則 10個及30個核苷酸均包含在內。
在某些實施例中，所述連續核苷酸序列在長度上包含或具有10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個或30個連續核苷酸。於一較佳實施例中，所述寡核苷酸在長度上包含或具有17個、18個、19個或20個核苷酸。
在某些實施例中，所述寡核苷酸或連續核苷酸序列包含或具有一個選自以序列識別號：7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19；20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33及34 (見材料與方法段落中表4)所構成之群組的序列。
在某些實施例中，所述反義寡核苷酸或連續核苷酸序列在長度上包含或具有10個至30個，例如10個至22個核苷酸，其與選自以序列識別號：7、13、14、15、17及18所構成之群組的序列具有至少90%相同度，較佳的是100%相同度。
對於本發明之某些實施例，所述寡核苷酸選自具有CMP 識別號：7_1；8_1；9_1；10_1；11_1；12_1；13_1；14_1；15_1；16_1；17_1；18_1；19_1；20_1；21_1；22_1；23_1；24_1；25_1；26_1；27_1；28_1；29_1；30_1；31_1；32_1；33_1及34_1 (見材料與方法段落中表4)的寡核苷酸化合物群組。
對於本發明之某些實施例，所述寡核苷酸選自具有CMP 識別號：7_1；8_1；9_1；10_1；11_1；12_1；13_1；14_1；14_2；14_3；15_1；15_2；15_3；15_4；15_5；16_1；17_1；18_1；19_1；20_1；21_1；22_1；23_1；24_1；25_1；26_1；27_1；28_1；29_1；30_1；31_1；32_1；33_1及34_1 (見材料與方法段落中表4)的寡核苷酸化合物群組。
對於本發明之某些實施例，所述寡核苷酸選自具有CMP 識別號：7_1；13_1；14_1；15_1；17_1；18_1的寡核苷酸化合物群組。
在某些實施例中，所述化合物是化合物7_1。在某些實施例中，所述化合物是化合物15_4。
依據本發明的特別具有優勢的反義寡核苷酸是一種化合物，所述化合物選自以下列項目所構成之群組： ATTTtactttaaccTCC 序列識別號：7，CMP 識別號：7_1 TCACattttactttaacCT 序列識別號：13，CMP 識別號：13_1 TCACattttactttAACC 序列識別號：14，CMP 識別號：14_1 TCACattttactttaaccTC 序列識別號：15，CMP 識別號：15_1 TCAcAttttactttaacCTC 序列識別號：15，CMP 識別號：15_4 TTCAcattttacttTAAC 序列識別號：17，CMP 識別號：17_1 TTCAcattttactttaACC 序列識別號：18，CMP 識別號：18_1
其中大寫字母為β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
本發明提供一種複合體，其包含依據本發明之寡核苷酸或反義寡核苷酸，以及至少一個共價連附於所述寡核苷酸的複合體部分。在某些實施例中，所述複合體部分是有助於跨腦血管障壁遞送的複合體，例如標定運鐵蛋白受體的抗體或抗體片段。
製造方法
在又一態樣中，本發明提供用以製造本發明之寡核苷酸的方法，所述方法包含使核苷酸單元進行反應，藉此在所述寡核苷酸中形成共價連結連續核苷酸單元。較佳的是，所述方法是利用亞磷醯胺化學(見例如Caruthers等人，1987年，Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313)。在又一實施例中，所述方法進一步包含使所述連續核苷酸序列與一接合部分(配體)反應，以使複合體部分共價連附至所述寡核苷酸。在又一態樣中，提供一種用以製造本發明組成物的方法，所述方法包含將本發明之寡核苷酸或複合寡核苷酸與一種藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐藥混合。
藥用鹽
在又一態樣中，本發明提供上述反義寡核苷酸或其複合體的藥學上可接受之鹽。於一較佳實施例中，所述藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
藥物組成物
在又一態樣中，本發明提供的藥物組成物包含任一上述寡核苷酸及/或寡核苷酸複合體或其鹽以及一種藥學上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐藥。藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝生理鹽水 (PBS)，而藥學上可接受之鹽包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在某些實施例中，所述藥學上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水。在某些實施例中，所述寡核苷酸用於所述藥學上可接受之稀釋劑的濃度為50至300微莫耳溶液。
適合用於本發明的製劑可參閱Remington的Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985。有關藥物遞送方法的簡要說明，請參閱例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091進一步針對藥學上可接受之稀釋劑、載體及佐藥提供適當且可取的實例(經參照併入於此)。WO2007/031091對於適當劑量、製劑、給藥途徑、組成物、劑型、與其他治療劑的組合、前驅藥物製劑等方面亦有討論。
本發明之寡核苷酸或寡核苷酸複合體可與藥學上可接受之有效或惰性物質混合，用以製備藥物組成物或製劑。組成物及用以形成藥物組成物製劑的方法取決於若干標準，包括但不限於，給藥途徑、疾病程度或要施予的劑量。
這些組成物可經由習知消毒技術消毒或經過濾滅菌。如此製成的水溶液可經包裝後直接使用，或經凍乾，使用前先將凍乾製劑與無菌水性載體結合再行給藥。製劑的pH 通常為介於3和11之間，更佳的是介於5和9之間或是介於6和8之間，最佳的是介於7和8之間，例如7至7.5。製成的固態組成物可分為單劑包裝，每劑中包含固定數量的上述作用劑，例如為藥錠或膠囊的密封包裝。也可將固態組成物裝入容器中，以利靈活調整用量，例如裝入便於局部施用乳霜或軟膏的擠壓管。
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸複合體為前驅藥。特別在寡核苷酸複合體方面，待前驅藥遞送至如目標細胞等作用位置之後，便將複合體部分自寡核苷酸上裂解。
應用
本發明之寡核苷酸可於例如診斷學、治療法及預防法等領域用為研究試劑。
在研究中，可利用此種寡核苷酸特別調節Ataxin2蛋白質在細胞(例如體外細胞培養)及實驗動物中的合成，藉此促進目標的功能分析，或評估以其做為治療介入目標的實用性。一般而言，目標調節的做法是藉由調降或抑制可產生此蛋白質的mRNA，從而預防蛋白質形成，或藉由對致使基因或mRNA產生此蛋白質的調控物進行調降或抑制。
若在研究或診斷中使用本發明之寡核苷酸，則所述目標核酸可為cDNA或取自DNA或RNA的合成核酸。
本發明提供一種用以調節正在表達ATXN2的目標細胞中之ATXN2表達的體內或體外方法，所述方法包含對所述細胞施用有效量之本發明寡核苷酸。
在某些實施例中，所述目標細胞是哺乳動物細胞，特別是人類細胞。所述目標細胞可為體外細胞培養或為哺乳動物組織中的體內細胞形成部分。在較佳實施例中，所述目標細胞存在於腦部或中樞神經系統中，包括腦幹和脊椎神經。具體而言，小腦中的細胞是關聯目標細胞，例如浦金氏神經元或浦金氏細胞，特別是在罹有第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)的個體身上。
其他關聯目標細胞為位於腦皮層和脊椎神經中的運動神經元。在運動皮層中的上運動神經元，以及在腦幹和脊椎神經中的下運動神經元是本發明之目標細胞。具體而言，罹有肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)的個體體內的運動神經元即為關聯目標細胞。
在診斷學上，可藉由北方墨點法、原位雜交或類似技術，利用寡核苷酸偵測並定量細胞及組織內的ATXN2表達。
在治療方面，可對於疑似罹有可經由調節ATXN2表達而治療之疾病或疾患的動物或人施用寡核苷酸。
本發明提供用以治療或預防疾病的方法，所述方法包含對罹有或易於罹患該疾病的受試者施用治療或預防上有效量之本發明寡核苷酸、寡核苷酸複合體或藥物組成物。
本發明亦涉及如本文中定義而可用為藥劑的寡核苷酸、組成物或複合體。
依據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸複合體或藥物組成物通常是以有效量施用。
本發明亦提供如所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸複合體在製造用以治療本文中所述疾患的藥劑上的用途，或提供治療本文中所提及之疾患的方法。
本文中所提及之疾病或疾患與ATXN2的表達有關。在某些實施例中，所述疾病或疾患可與ATXN2 基因的轉變有關，例如CAG 重複區域的擴增。所述疾病或疾患可與基因有關，所述基因的蛋白質產物與ATXN2 關聯或與之相互作用。特別是在與TDP-43蛋白質病有關的疾病中，減少ATXN2可發揮有益效應，例如在肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)及帕金森症中。
本發明之方法較佳的是用於治療或預防因 ATXN2 異常水平及/或活性所導致的疾病。
本發明進一步涉及如本文中所定義之寡核苷酸、寡核苷酸複合體或藥物組成物在製造用以治療 ATXN2 異常水平及/或活性的藥劑上的用途。
在一實施例中，本發明係涉及用於治療疾病或疾患的寡核苷酸、寡核苷酸複合體或藥物組成物，所述疾病或疾患選自神經退化性疾病，所述神經退化性疾病包括第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀。本發明之寡核苷酸、寡核苷酸複合體或藥物組成物特別有益於治療第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)或肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。
給藥
本發明之寡核苷酸或藥物組成物可經由胃腸外方式施用(例如靜脈注射、皮下、肌内、腦內、腦室內、眼內或鞘內給藥)。
在某些實施例中，所述給藥是經由鞘內給藥。
有利的是，例如在治療神經性疾患時，本發明之寡核苷酸或藥物組成物是以鞘內或顱內方式施用，例如經由腦內或腦室內給藥。
本發明亦提供本發明之寡核苷酸或其複合體，例如藥用鹽或組成物，在製造藥劑上的用途，其中所述藥劑是用於皮下給藥的劑型。
本發明亦提供本發明之寡核苷酸，或其複合體，例如本發明之藥用鹽或組成物，在製造藥劑上的用途，其中所述藥劑是用於鞘內給藥的劑型。
本發明亦提供如所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸複合體在製造藥劑上的用途，其中所述藥劑是用於鞘內給藥的劑型。
此處實例說明標定ATXN2的化合物在皮層及小腦中的長效作用時間。
在某些實施例中，對需要治療的受試者施以至少連續兩劑有效量之標定ATXN2的寡核苷酸，例如本發明之反義寡核苷酸、複合體、鹽或藥物組成物。適合的是，至少連續兩劑之間的時間間隔為至少2週，例如至少3週，例如至少4週，例如至少一個月，例如至少6週，例如至少8週，例如至少兩個月。因此可例如每週、每兩週、每月或每兩個月給藥一次。所述給藥可經由例如鞘內給藥來進行。所述給藥之形式可例如為磷酸鹽緩衝生理鹽水組成物。
組合療法
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸複合體或藥物組成物是用以與另一治療劑進行結合治療。所述治療劑可例如為用以照護上述疾病或疾患的標準品。
實施例 本發明之以下實施例可與本文所述之任何其他實施例結合運用： 1. 一種長度為10個至30個核苷酸的反義寡核苷酸，其包含一個長度為10個至22個核苷酸的連續核苷酸序列，所述連續核苷酸序列與序列識別號：6 具有至少90%互補性，例如100%互補性。 2. 依據實施例1所述之反義寡核苷酸，其中所述連續核苷酸序列與序列識別號：1的83122至83143的核苷酸為至少90%互補，例如100%互補。 3. 依據實施例1或2所述之反義寡核苷酸，其中所述連續核苷酸序列包含一個序列，所述序列選自以序列識別號：7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19；20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；30；31；32；33及34；或其至少14個連續核苷酸所構成之群組。 4. 依據實施例1 - 3中任一者所述之反義寡核苷酸，其中所述連續核苷酸序列包含一個序列，所述序列選自以序列識別號：7、13、14、15、17及18；或其至少14個連續核苷酸所構成之群組。 5. 依據實施例1 - 4所述之反義寡核苷酸，其中所述連續核苷酸序列中的一個或多個核苷是2’糖修飾核苷。 6. 依據實施例5所述之反義寡核苷酸，其中所述一個或多個2’糖修飾核苷係獨立選自以2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟基-DNA、阿糖基核酸(ANA)、2’-氟基-ANA及LNA核苷所構成之群組。 7. 依據實施例5或6中任一者所述之反義寡核苷酸，其中所述一個或多個修飾核苷係為LNA核苷。 8. 依據實施例1 - 7中任一者所述之反義寡核苷酸，其中所述連續核苷酸序列中的至少一個核苷間鍵合是硫代磷酸酯核苷間鍵合。 9. 依據實施例1 - 8所述之反義寡核苷酸，其中所述連續核苷酸序列中的所有所述核苷間鍵合都是硫代磷酸酯核苷間鍵合。 10. 依據實施例1 - 9所述之反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能夠招募RNase H，例如人類RNaseH1。 11. 依據實施例1 - 10所述之反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，含有或包含式 5’-F-G-F’-3’之缺口體。 12. 依據實施例11所述之反義寡核苷酸，其中區域G 具有6個至16個DNA核苷。 13. 依據實施例11或12所述之反義寡核苷酸，其中區域F及F’ 各包含至少一個LNA核苷。 14. 依據實施例1 - 13中任一者所述之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸選自以CMP 識別號：7_1；8_1；9_1；10_1；11_1；12_1；13_1；14_1；14_2；14_3；15_1；15_2；15_3；15_4；15_5；16_1；17_1；18_1；19_1；20_1；21_1；22_1；23_1；24_1；25_1；26_1；27_1；28_1；29_1；30_1；31_1；32_1；33_1及34_1所構成之群組的化合物。 15. 依據實施例1 - 14中任一者所述之反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸是一種化合物，所述化合物選自以下列項目所構成之群組： ATTTtactttaaccTCC 序列識別號：7，CMP 識別號：7_1 TCACattttactttaacCT 序列識別號：13，CMP 識別號：13_1 TCACattttactttAACC 序列識別號：14，CMP 識別號：14_1 TCACattttactttaaccTC 序列識別號：15，CMP 識別號：15_1 TCAcAttttactttaacCTC 序列識別號：15，CMP 識別號：15_4 TTCAcattttacttTAAC 序列識別號：17，CMP 識別號：17_1 TTCAcattttactttaACC 序列識別號：18，CMP 識別號：18_1 其中大寫字母為β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。 16. 一種複合體，其係包含依據實施例1 - 15中任一者所述之反義寡核苷酸以及至少一個共價連附於所述寡核苷酸之複合體部分。 17. 一種依據實施例1 - 15中任一者所述之反義寡核苷酸的藥學上可接受之鹽，或依據實施例16所述之複合體。 18. 一種藥物組成物，其係包含實施例1 - 15之反義寡核苷酸或實施例16之複合體以及一種藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐藥。 19. 一種用以調節正在表達ATXN2的目標細胞中之ATXN2表達的體內或體外方法，所述方法包含對所述細胞施用有效量之如實施例1 - 15中任一者之反義寡核苷酸或實施例16之複合體或實施例17或18之藥物組成物。 20. 一種用於治療或預防疾病之方法，其係包含對罹有或易於罹患該疾病之受試者施用治療或預防上有效量之依據實施例1 - 15中任一者所述之反義寡核苷酸或依據實施例16所述之複合體或實施例17或18之藥物組成物。 21. 依據實施例20之方法，其中所述疾病係選自以神經退化性疾病所構成之群組，所述神經退化性疾病係選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組。 22. 用於藥品中之如實施例1 - 15中任一者所述之寡核苷酸或依據實施例16所述之複合體或實施例17或18之藥物組成物。 23. 依據實施例1 - 15中任一者所述之寡核苷酸或依據實施例16所述之複合體或實施例17或18之藥物組成物在治療或預防神經退化性疾病上的用途，所述神經退化性疾病例如為選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組的疾病。 24. 依據實施例1 - 15所述之寡核苷酸或依據實施例16所述之複合體或實施例17或18之藥物組成物在製備藥劑上的用途，所述藥劑係用以治療或預防神經退化性疾病，例如選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組的疾病。 25. 依據以上實施例中任一者所述之方法或用途或寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是經由至少連續兩劑標定ATXN2的寡核苷酸進行給藥，其中至少連續兩劑之間的時間間隔為至少2週，例如至少3週，例如至少4週，例如至少一個月，例如至少6週，例如至少8週，例如至少兩個月。 [實例 ] 材料與方法 寡核苷酸模體序列與寡核苷酸化合物 表4：寡核苷酸模體序列(以序列識別號表示)、其設計以及基於模體序列所設計的具體寡核苷酸化合物(以CMP 識別號表示)的清單。
Figure 108119356-A0304-0004
 模體序列代表寡核苷酸中存在的核鹼基的連續序列。
設計意指缺口體設計，F-G-F’，其中各數字代表連續修飾核苷的數目，例如2’修飾核苷(第一個數字 = 5’側翼)，接著是DNA核苷的數目(第二個數字 =缺口區域)，隨後是修飾核苷的數目，例如2’修飾核苷(第三個數字 = 3’側翼)，隨選的是前方或後方連接有DNA及LNA的進一步的重複區域，但與所述目標核酸互補的連續核苷酸序列並不必須具有此等重複區域。
寡核苷酸化合物代表模體序列的具體設計。大寫字母代表β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，且5-甲基 DNA 胞嘧啶以「e」表示，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。以下就可採用的合成方式加以說明。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。
在Oligomaker 48 上，以1微莫耳刻度，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，以氨水於60℃處理 5至16小時，將所述寡核苷酸自撐體上裂解。使用逆相 HPLC (RP-HPLC)或固相萃取來進行所述寡核苷酸的純化，之後以UPLC進行特性分析，再用ESI-MS進一步確定分子質量。
寡核苷酸的延長：
利用5’-O-DMT-保護醯胺在乙腈中的0.1莫耳溶液以及DCI (4,5–二氰基咪唑)的乙腈(0.25莫耳)溶液做為激活物，進行β-氰乙基-亞磷醯胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)的耦合。於最終循環時，可使用具有所需修飾的亞磷醯胺，所需修飾例如用以連附複合基團的C6連接子，或複合基團本身。為導入硫代磷酸酯鍵合，使用氫化黃原素(0.01莫耳於乙腈/吡啶9:1)執行硫醇化處理。可利用0.02莫耳的碘於THF/吡啶/水 7:2:1 導入磷酸二酯鍵合。其餘試劑為通常用於寡核苷酸合成者。
可於固相合成的最後循環使用經商購取得的C6胺基連接子亞磷醯胺來進行後固相合成接合，在脫保護及自撐體裂解後，便可分離出胺基連結脫保護寡核苷酸。接著使用標準合成方法，透過官能基團的活化來導入複合體。
以RP-HPLC純化：
使用製備性RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10µ 150x10毫米管柱上對粗產化合物進行純化。使用0.1莫耳pH為8的醋酸銨及乙腈為緩衝液，流速為每分鐘 5毫升。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。
縮寫： DCI： 4,5-二氰基咪唑 DCM： 二氯甲烷 DMF： 二甲基甲醯胺 DMT： 4,4’-二甲氧三苯甲基 THF： 四氫呋喃 Bz： 苯甲醯基 Ibu： 異丁醯基 RP-HPLC： 逆相高效液相層析
Tm 檢驗：
將寡核苷酸及RNA目標(磷酸鹽連結，PO)雙鏈體在500毫升無 RNase水中稀釋至3毫莫耳，而後與500毫升2x Tm 緩衝液(200毫莫耳氯化鈉、0.2毫莫耳EDTA、20毫莫耳磷酸鈉，pH 7.0)混合。將所述溶液加熱至95℃並維持3分鐘，而後放置在室溫中退火30分鐘。在配備有Peltier溫度編程器PTP6的Lambda 40 UV/VIS分光光度計上利用PE Templab 軟體(Perkin Elmer)測量雙鏈體融化溫度(Tm )。溫度自20℃漸升至95℃，然後降至25℃，於260奈米處記錄吸收度。利用第一衍生物及融化和退火的局部最大值來評估雙鏈體Tm 。
細胞系
表5 實例1及實例2中所用細胞系的相關詳情
Figure 108119356-A0304-0005
 *所有培養基及添加物均購自Sigma Aldrich
實例1 測試LNA寡核苷酸在A431、NCI-H23及ARPE19細胞系中於25及5微莫耳的體外功效
使用表4中的LNA寡核苷酸於三種人類細胞系中進行寡核苷酸篩選，標定序列識別號：1的自位置83121至83144的區域。人類細胞系 A341、NCI-H23及ARPE19 購自表5中所列廠商，按照供應商建議的條件，存放於37℃且具有5%二氧化碳的加濕培養箱。進行篩選檢驗時，將細胞種於裝有供應商建議之培養基的96孔盤(見材料與方法段落中表5)。針對各細胞系優化其細胞數/孔數(見材料與方法段落中表5)。
細胞經培養0到24小時之後，加入寡核苷酸，濃度為5或25微莫耳(溶解於PBS)。加入寡核苷酸後3-4天收穫細胞(各細胞系培養時間如材料與方法段落中表5所示)。
使用Qiagen RNeasy 96套件(74182)，依據製造商指示萃取RNA。使用qScript XLT單一步驟RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行cDNA合成及qPCR。使用Thermo Fisher Scientific所提供的FAM標定TaqMan檢驗，以VIC標定GUSB對照組在多重反應中對目標轉錄水平進行定量。以TaqMan引子檢驗關注的ATXN2 (Hs01002833_m1(FAM-MGB))目標轉錄，及管家基因 GUSB (4326320E VIC-MGB 探針)。採用技術雙鏈體設置，n=1 生物重複。
相對ATXN2 mRNA表達水平以相較於對照組(PBS處置後細胞)的百分比顯示於表6，數值越低表示抑制越大。
表6：抗ATXN2化合物的體外功效(雙鏈體qPCR單一實驗)。ATXN2 mRNA水平經標準化至GUSB，以相較於對照組(PBS處置後細胞)的百分比顯示。
Figure 108119356-A0304-0006
實例2，測試實例1所選化合物在A431、NCI-H23、U251及U2-OS細胞系中的體外EC50及功效。
透過實例1所述檢驗，利用寡核苷酸濃度50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05及0.016微莫耳的寡核苷酸(半對數稀釋，自50微莫耳起8點)，且n=1-2 生物重複，判定實例1中在NCI-H23細胞中於5微莫耳顯示低於20%殘餘ATXN2 mRNA的寡核苷酸的EC50及功效(KD)。
兩個外加細胞系的條件顯示於材料與方法段落中的表5，且用於細胞系 U2-OS的TaqMan引子檢驗為ATXN2，Hs00268077_m1 (FAM-MGB)及管家 GAPDH，4326137E (VIC-MGB)。實例1中所用細胞系的TaqMan引子與此實例相同。
使用GraphPad Prism6 計算EC50值，ATXN2 mRNA在50微莫耳的最大減少量(Max KD)顯示於表中，以相較於對照組(PBS處置後細胞)百分比的方式表示。各細胞系的結果列於表7 -表10。
表7：抗ATXN2化合物在A431細胞中的體外EC50及最大功效。ATXN2 mRNA水平經標準化至GUSB後，以相較於對照組(PBS處置後細胞)百分比的方式表示。此實驗在雙鏈體中進行(樣本A及B)
Figure 108119356-A0304-0007
表8：抗ATXN2化合物在NCI-H23細胞中的體外EC50及最大功效。ATXN2 mRNA水平經標準化至GUSB後，以相較於對照組(PBS處置後細胞)百分比的方式表示。此實驗在雙鏈體中進行(樣本A及B)
Figure 108119356-A0304-0008
表9：抗ATXN2化合物在U251細胞中的體外EC50及最大功效。ATXN2 mRNA水平經標準化至GUSB後，以相較於對照組(PBS處置後細胞)百分比的方式表示。此實驗在雙鏈體中進行(樣本A及B)
Figure 108119356-A0304-0009
表10：抗ATXN2化合物在US-O2細胞中的體外EC50及最大功效。ATXN2 mRNA水平經標準化至GAPDH後，以相較於對照組(PBS處置後細胞)百分比的方式表示。
Figure 108119356-A0304-0010
實例3：標定「區域12」化合物與標定整個人類AXTN2化合物的對照
跨整個ATXN2前mRNA序列(序列識別號1)設計超過 1500個LNA缺口體寡核苷酸，並在A431及U2OS細胞中評估其 0.5微莫耳的低劑量體外功效。結果示於圖6中。資料證實，以實心圓圈所代表的熱點區域(序列識別號6)提供具高度功效的化合物。圖7 僅顯示所選熱點區域化合物。
實例4：測試LNA寡核苷酸在U2OS及A431細胞系中於0.5微莫耳展現的體外功效
在三種人類細胞系中使用表11的LNA寡核苷酸進行寡核苷酸篩選，標定序列識別號：1中從 83121至83144位置的區域。如以上實例中所述。相對ATXN2 mRNA表達水平以相較於對照組(PBS處置後細胞)的百分比顯示於表11，數值越低表示抑制越大。
表11
Figure 108119356-A0304-0011
 對於化合物，大寫字母代表β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
實例5：測試所選化合物的體外EC50及功效
使用如實例2中所描述的方法判定在實例3中所測試化合物的EC50，以10毫莫耳為開始濃度。EC50值的計算方式如下：
表12
Figure 108119356-A0304-0012
實例6：於小鼠初代皮層神經元細胞內以前案化合物ASO7 (化合物37_1)為基準評估所選化合物7_1及15_4。
化合物37_1 = gtggg atacaaattc taggc ，其中加粗底線字母代表2’-O-MOE核苷，非粗體字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯(見 Scholes等人，Nature volume 544, pages 362–366 (2017年4月20日))。
小鼠初代皮層神經元細胞培養物的製備
依據標準程序，取15天齡小鼠胚胎腦部製備初代皮層神經元培養物。簡言之，在培養皿上塗佈聚-L-離胺酸(50微克/毫升聚-L-離胺酸、10毫莫耳四硼酸鈉、pH 8緩衝液)在37℃且具有5%二氧化碳的加濕培養箱中培養2-3小時。培養皿在使用前先以1xPBS 清洗。將收穫的小鼠胚胎腦經以剃刀切割並均質化後，浸入38毫升分散性培養基 (HBSS、0.01莫耳4-羥乙基哌嗪乙磺酸、青黴素/鏈黴素)。加入2毫升胰蛋白酶，並將細胞在37℃中培養30分鐘。培養後，加入4毫升的胰蛋白酶擋止劑，以離心方式收集細胞。
將細胞分散於20毫升DMEM (+ 10% FBS)中，並通過附有13克重的針頭的注射器，達成進一步均質化。之後以500 rpm 速度離心15分鐘。去除上層液，將細胞分散於DMEM (+10% FBS)，並種入96孔盤(0.1 x 10^6細胞/孔，於100微升)。如此處理的神經元細胞培養物可在種下後立即使用。
小鼠初代皮層神經元細胞培養物中的寡核苷酸篩選
翌日，將培養基改為成長性培養基(Gibco Neurobasal培養基、B27 補充劑、Glutamax、青黴素-鏈黴素)並在96孔盤中加入5微莫耳FdU，並與寡核苷酸在所需濃度下培養6天。自細胞分離出總 RNA，以qPCR分析測量調降功效。在進行單一步驟qPCR (cDNA合成及qPCR)時，各樣本均使用一個ATXN2 探針組(IDT，比利時魯汶)(ATXN2_assay1，Mm.PT.58.7178341)進行重複實驗，執行於雙鏈體RPL4，Mm.PT.58.17609218或RPS29，Mm.PT.58.21577577中。在各反應物中加入4微升先前稀釋的RNA、0.5微升水及5.5微升TaqMan MasterMix。培養皿經離心處理後，在90℃熱緊迫40秒，接著在冰上短暫培養，再使用qPCR來分析樣本(在50℃培養15分鐘，90℃培養3分鐘，隨後是40週期的95℃持續5秒及60℃持續45秒)。
使用相對標準曲線方法分析資料，其中各樣本首先標準化至兩個管家基因(RPL4及RPS29)的幾何平均數，而後以相較於未經處置對照組動物的百分比表示。
所用化合物：7_1、15_4及37_1 (ASO7)
結果示於圖8中。
實例7：體內ICV小鼠研究
動物照護
在5至6隻分為一龍的C57BL/6JBomTac 雌性小鼠(16-23克，Taconic Biosciences，丹麥艾比)身上測試化合物的體內活性及耐受性。使動物居住於維持在固定溫度(22 ± 2℃)及濕度(55 ± 10%)的聚落室中，並且每天照光 12小時(早晨 6:00 開始光照)。所有動物在研究期間均可任意取用食物及飲水。所有小鼠實驗方式均經丹麥國家動物實驗倫理委員會核准。
給藥途徑 - 顱內注射。
經由腦室內(ICV)注射對小鼠施用化合物。進行ICV用藥前，先將小鼠秤重，並以異氟醚或異丙酚(每公斤30毫克)麻醉。進行腦室內注射時，將附有FEP 導管及23 號針的Hamilton微注射器固定在支架上，調整至刺穿正確距離(3.9毫米)，通過皮膚及頭骨後進入右側腦室。以一手拇指及食指握住待注射小鼠的頸背。施加輕柔但穩定的壓力，將頭部向上壓迫，使針頭在中間偏右(中間外側)的1-2毫米及眼睛後方的1-2毫米處刺穿頭骨。將測試化合物的快速推注劑或載體在30秒時間內以預設的輸注率注入。為避免回流，將小鼠在此位置多固定5秒鐘，然後小心放下，離開針頭。此程序不需要手術或切開。將動物置於加熱燈下，直到從麻醉中恢復為止。給藥後的2或4週，將腦組織(皮層及小腦)以及肝臟和腎臟皮層收集於乾冰上，用於藥物濃度分析及ATXN2 mRNA和蛋白質分析。
以多組不同化合物進行的三項獨立實驗如下表所示(表13)。
化合物36_1 = TCCattaactactCTTT，其中大寫字母代表β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母代表DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
表13
Figure 108119356-A0304-0013
耐受性結果：
藉由WO2016/126995中所述的監控動物行為方法測量急性毒性(見實例9)。藉由監控每一隻動物在實驗時間過程中的體重測量慢性毒性，體重減輕 ＞5% 代表產生慢性毒性。請注意，由於會對展現毒性徵象的動物進行安樂死，有些情況下實驗必須因此提前終止(若動物中大部分展現毒性徵象，則將全部動物進行安樂死)。
實驗 1
化合物7_1：所有動物皆未顯示急性毒性徵象。1隻小鼠在實驗過程中(27天)體重逐漸減輕。
化合物14_1：10隻動物中有2隻展現急性毒性，在給藥後1天需要進行安樂死。其餘8隻動物中的5隻顯示在實驗過程中(終止於第8天)體重逐漸減輕。
化合物15_1：10隻動物中有1隻展現急性毒性，在給藥後1天需要進行安樂死。其餘全部 8隻動物中，5隻顯示在實驗過程中(終止於第8天)體重逐漸減輕。
實驗 2
化合物37_1 (ASO7)對全部 10隻動物都具有急性毒性，給藥後30分鐘內發生嚴重抽搐，需在給藥後1小時進行安樂死。
化合物36_1：10隻動物中有3隻展現急性毒性，在給藥後1天需要進行安樂死。其餘7隻動物中的4隻顯示在實驗過程中(終止於第12天)體重逐漸減輕。
化合物17_1：所有動物皆未顯示急性毒性徵象。10隻動物中有2隻在實驗過程中(29天)體重逐漸減輕。
化合物18_1：10隻動物中有1隻顯示急性毒性，予以安樂死。其餘9隻動物中的3隻在實驗過程中(29天)體重逐漸減輕。
實驗 3
化合物15_3：6隻動物中有2隻展現急性毒性，在給藥後的1天後需要進行安樂死。在其餘4隻動物中，2隻在實驗過程中(終止於第15天)體重逐漸減輕。
化合物15_4：6隻動物中有2隻展現急性毒性，在給藥後的1天後需要進行安樂死。其餘4隻動物皆未在實驗過程中(第14天完成)有體重逐漸減輕現象。
化合物14_3：6隻動物中有1隻展現急性毒性，需在給藥後1天進行安樂死。在其餘5隻動物中，3隻在實驗過程中(終止於第9天)體重逐漸減輕。
化合物14_2：6隻動物中有2隻展現急性毒性，需在給藥後1天進行安樂死。在其餘4隻動物中，3隻在實驗過程中(終止於第15天)體重逐漸減輕。
化合物15_2：6隻動物中有2隻展現急性毒性，在給藥後1天需要進行安樂死。在其餘4隻動物中，3隻在實驗過程中(終止於第10天)體重逐漸減輕。
化合物15_5：全部 6隻動物均展現急性毒性，需在給藥後1天進行安樂死。
寡核苷酸含量組織均質化與ATXN2 mRNA分析
使用Qiagen TissueLyzer II以MagNA Pure LC RNA分離組織裂解液(Roche，美國印地安納州印第安納波利斯)對小鼠腦、肝臟及腎臟樣本進行均質化。均質物在室溫下培養30分鐘，使其完全裂解。將裂解後的均質物以13000 rpm 速度離心處理 3分鐘，取上層液進行分析。留下一半用於生物分析，另一半直接進行RNA 萃取。
寡核苷酸含量分析
在生物分析時，將樣本稀釋 10-50 倍，以雜交 ELISA 法測量寡核苷酸含量。生物素化LNA捕捉探針及洋地黃毒複合 LNA 偵測探針(皆為35奈莫耳於5xSSCT，各與待偵測 LNA寡核苷酸的一端互補)與稀釋的均質物或關聯標準物混合，在室溫下培養30分鐘，然後加進塗有鏈親和素的ELISA微盤(Nunc型錄號碼436014)。
將培養皿在室溫下培養1小時，於2xSSCT (300毫莫耳氯化鈉、30毫莫耳檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中清洗。使用與鹼性磷酸酶複合的抗DIG 抗體(Roche Applied Science型錄號碼11093274910)及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos 基質，KPL產品代碼50-88-00)偵測捕捉到的LNA雙鏈體。在615奈米以Biotek讀取器測量吸光度，判定寡核苷酸複合物的量。
將資料標準化至組織重量，並以寡核苷酸奈莫耳數表示。
ATXN2 mRNA減少
使用MagNA Pure 96儀器搭配套件Cellular RNA Large Volume Kit (Roche，美國印地安納州印第安納波利斯)，自350微升的上層液中將RNA純化出來。RNA樣本以無核酸酶水標準化至每微升2奈克，並存放於-20℃備用。
在進行單一步驟qPCR (cDNA合成及qPCR)時，各樣本以四個探針組(IDT，比利時魯汶)進行重複實驗(ATXN2_assay1，Mm.PT.58.7178341與RPL4，Mm.PT.58.17609218成雙鏈體，以及ATXN2_assay2，Mm.PT.58.11673123與RPS29，Mm.PT.58.21577577成雙鏈體)。在各反應物中加入4微升先前稀釋的RNA、0.5微升水及5.5微升TaqMan MasterMix。培養皿經離心處理後，在90℃熱緊迫40秒，接著在冰上短暫培養，再使用qPCR來分析樣本(在50℃培養15分鐘，90℃培養3分鐘，隨後是40週期的95℃持續5秒及60℃持續45秒)。
使用相對標準曲線方法分析資料，其中各樣本(兩次ATXN2檢驗的幾何平均數)首先標準化至兩個管家基因(RPL4及RPS29)的幾何平均數，而後以相較於未經處置對照組動物的百分比表示。
ATXN2蛋白質分析所需組織均質化
使用Qiagen TissueLyzer II，將小鼠腦樣本置於含有1% Halt™蛋白酶及磷酸酶抑制劑(Thermo Fisher Scientific)的RIPA緩衝液中進行均質化。將均質物在4℃培養30分鐘，使其完全裂解。裂解後，將均質物以14000 rcf 離心處理 10分鐘，再將上層液均分為小份，並存放於‑20℃備用。
ATXN2蛋白質減少
基於使用BCA套件(Thermo Fisher Scientific)測得的總蛋白質，將樣本標準化至每毫升0.05毫克。在雙鏈體中測量ATXN2蛋白質減少(初級抗體：Mouse Anti-Ataxin-2，1:50，#611378，BD Bioscience and Anti-HPRT，1:100，#ab109021，Abcam，二級抗體：抗小鼠及抗兔二級抗體，Protein Simple，美國加州聖荷西)並依據製造商標準協定在毛細管 Western 免疫檢驗 WES儀器(Protein Simple)上進行分析。
對資料進行相對數量分析，先將各樣本的ATXN2表達標準化至管家蛋白質(HPRT)，然後以相較於未經處置的對照組動物的百分比方式表達。
結果示於圖9至圖11中。
圖9：11種所選化合物的調降(mRNA)比較，彙編來自三項實驗的資料，研究1資料為實心點，研究2資料為空心點，研究3資料為半實心點。
圖10：化合物7_1的蛋白質及mRNA水平調降及對皮層、小腦區域的接觸。僅顯示皮層的蛋白質資料。
圖11：化合物15_4 調降的蛋白質及mRNA水平調降及對皮層、小腦區域的接觸。僅顯示皮層的蛋白質資料。
實例8：體內ICV小鼠研究- 作用時間
設定另一項研究以調查化合物7_1的作用時間。15_4 僅限一個時間點加入(7天)。程序如同實例7中所述，使用協定如下：
表14
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mRNA 調降結果示於圖12中，顯示 ATXN2 mRNA在皮層及特別在小腦組織中的強效調降可持續至少56天(最高功效維持7至56天，表示有效作用時間遠大於56天。有些小鼠的治療效果並非如此優異，而由於在不同時間都是關聯於同一些小鼠，故可能是與程序有關。
實例9：體內食蟹猴研究
對象
對象為開始用藥前體重 2-4 公斤的雄性及雌性食蟹猴。對每隻食蟹猴在腰部鞘內空間植入聚胺酯導管。導管近端連接至皮下輸液口，以利注射進入鞘內空間及取出 CSF樣本。
對食蟹猴施用鹽水、化合物ID 7_1或化合物ID 15_4，其溶解於鹽水，速率為每分鐘 0.33毫升，用量1.0毫升，後續施用1.5毫升aCSF。總輸注時間為4.5分鐘。劑量、時間、群組大小及組織資訊請參閱表15。
表15
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利用重力從腰部輸液口收集CSF，最大流量為每個樣本0.8毫升CSF。CSF經離心處理後，在分析前將上層液保存於-80℃備用。自可用血管取得血漿，在分析前保存於-80℃備用。
以氯胺酮及異氟醚麻醉後，對食蟹猴施予適當用量的商購安樂死溶液。隨後立即取得屍體組織，將腦搬移至低溫表面，進行解剖。所有樣本皆採用潔淨取出技術收集，經秤重後以乾冰冷凍，用於藥物濃度分析及ATXN2 mRNA分析。
耐受性
在生命階段並無臨床負面效應的報告。組織病理學顯示兩種化合物於測試用量下皆無問題。
寡核苷酸含量組織均質化與ATXN2 mRNA分析
見實例7 -所用程序相同。
寡核苷酸含量分析
在生物分析時，將樣本稀釋 50-100 倍，以雜交ELISA法測量寡核苷酸含量。生物素化LNA捕捉探針及洋地黃毒複合LNA偵測探針(皆為35奈莫耳於5xSSCT，各與待偵測 LNA寡核苷酸的一端互補)與稀釋的均質物或關聯標準物混合，在室溫下培養30分鐘，然後加進塗有鏈親和素的ELISA微盤(Nunc型錄號碼436014)。
將培養皿在室溫下培養1小時，於2xSSCT (300毫莫耳氯化鈉、30毫莫耳檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中清洗。使用與鹼性磷酸酶複合的抗DIG 抗體(Roche Applied Science型錄號碼11093274910)及鹼性磷酸酶基質系統(Blue Phos 基質，KPL產品代碼50-88-00)偵測捕捉到的LNA雙鏈體。在615奈米以Biotek讀取器測量吸收度，判定寡核苷酸複合物的量。
將資料標準化至組織重量，並以寡核苷酸奈莫耳數表示。
ATXN2 mRNA減少
使用MagNA Pure 96儀器搭配套件Cellular RNA Large Volume Kit (Roche，美國印地安納州印第安納波利斯)，自350微升的上層液中將RNA純化出來。RNA樣本以無核酸酶水標準化至每微升2奈克，並存放於-20℃備用。
在進行單一步驟qPCR (cDNA合成及qPCR)時，各樣本以四個探針組(IDT，比利時魯汶)進行ATXN2 實驗(見表16)，並以四個探針組用於不同管家基因(GAPDH，Mf04392546_g1、POLR3F，Mf02860939_m1、YWHAZ，Mf02920410_m1及UBC，Mf02798368_m1) (Thermo Fisher Scientific)，以單重方式進行實驗。
表16：用於Mf (食蟹獼猴) ATXN2檢驗的引子及探針序列。
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在各反應物中加入4微升先前稀釋的RNA、0.5微升水及5.5微升TaqMan MasterMix。培養皿經離心處理後，在90℃熱緊迫40秒，接著在冰上短暫培養，再使用qPCR來分析樣本(在50℃培養15分鐘，90℃培養3分鐘，隨後是40週期的95℃持續5秒及60℃持續45秒)。
利用相對標準曲線法分析資料，先將各樣本(四項ATXN2檢驗的平均值)標準化至各組織三項表現最佳之管家基因的平均值 -以Vandesompele等人，2002年，Genome Biology 2002, 3(7): research 0034.1–0034.11中所述的geNORM分析判定- 而後以相較於未經處置對照組動物的百分比方式表達(見圖13)。
ATXN2蛋白質分析所需組織均質化
與小鼠研究相同
ATXN2蛋白質減少
基於使用BCA套件(Thermo Fisher Scientific)測得的總蛋白質，將小腦及皮層樣本標準化至每毫升0.2毫克。在雙鏈體中測量ATXN2蛋白質減少(初級抗體：Mouse Anti-Ataxin-2，1:50，#611378，BD Bioscience and Anti-HPRT，1:50，#ab109021，Abcam，二級抗體：抗小鼠及抗兔二級抗體，Protein Simple，美國加州聖荷西)並依據製造商標準協定在毛細管 Western 免疫檢驗 WES儀器(Protein Simple)上進行分析。
對資料進行相對數量分析，先將各樣本的ATXN2表達標準化至管家蛋白質(HPRT)，然後以相較於未經處置的對照組動物的百分比方式表達。
結果示於圖13及圖14中。
圖1化合物7_1 (核鹼基之序列顯示於序列識別號7) 圖2化合物13_1 (核鹼基之序列顯示於序列識別號13) 圖3化合物17_1 (核鹼基之序列顯示於序列識別號17) 圖4化合物18_1 (核鹼基之序列顯示於序列識別號18) 圖5化合物15_4 (核鹼基之序列顯示於序列識別號15) 圖1、圖2、圖3及圖4中所示的化合物以質子化形式示出，也就是硫代磷酸酯鍵合上的硫原子經質子化；應知質子的存在將取決於分子的環境酸性以及是否有選擇性陽離子的存在(例如當所述寡核苷酸的形式為鹽時)。質子化硫代磷酸酯是以互變異構的形式存在。 圖6對標定人類細胞系中人類共濟失調2型前mRNA序列的1500種以上化合物所進行的篩選。化合物7_1以空心菱形表示。 圖7依據圖6，但僅包含熱點區域序列識別號6標定化合物。化合物7_1以空心菱形表示。 圖8化合物7_1及15_4相較於化合物37_1 (ASO7)的體外功效評估。 圖9體內小鼠研究-11種選定化合物調降(mRNA)的對照，彙編來自三項實驗的資料，研究1資料為實心點，研究2資料為空心點，研究3資料為半實心點。 圖10體內小鼠研究-在蛋白質及mRNA水平上調降並於皮層、小腦區域中接觸化合物7_1。僅顯示皮層的蛋白質資料。 圖11體內小鼠研究-在蛋白質及mRNA水平上調降並於皮層、小腦區域中接觸化合物15_4。僅顯示皮層的蛋白質資料。 圖12小鼠體內研究，ICV給藥150微克化合物7_1及化合物15_4後的時間過程(僅於7天時測量)。 圖13 NHP體內PK/PD研究-施用4、8或24毫克(化合物7_1)及8毫克化合物15_4之後，於治療後14天測量的重要組織內的mRNA及蛋白質表達水平。 圖14 NHP體內PK/PD研究-施用4、8或24毫克(化合物7_1)及8毫克化合物15_4之後，於治療後14天測量的重要組織內的mRNA及蛋白質表達水平。所呈現的資料是用來說明兩種化合物的相對活性比度。
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Claims (14)

  1. 一種反義寡核苷酸，其係如下式 ATTTtactttaaccTCC (序列識別號7) 其中大寫字母為β-D-氧基 LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，所有LNA C皆為5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵合皆為硫代磷酸酯核苷間鍵合。
  2. 如請求項1之反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸係如下式
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    或其一種藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸之形式為一種藥學上可接受之鹽。
  4. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸之形式為一種藥學上可接受之鈉鹽。
  5. 如請求項1或2之反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸之形式為一種藥學上可接受之鉀鹽。
  6. 一種複合體，其係包含如請求項1至5中任一項之反義寡核苷酸，以及至少一個共價連附於所述寡核苷酸之複合體部分。
  7. 一種藥物組成物，其係包含如請求項1至5中任一項之反義寡核苷酸或如請求項6之複合體以及一種藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐藥。
  8. 如請求項7之藥物組成物，其中所述組成物包含一種藥學上可接受之稀釋劑，例如無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水。
  9. 如請求項7 或8之藥物組成物，其中所述反義寡核苷酸用於所述藥學上可接受之稀釋劑中之濃度為每毫升溶液1至100毫克，例如每毫升溶液2至30毫克。
  10. 一種用以調節表達ATXN2的目標細胞中之ATXN2表達的體外方法，所述方法包含對所述細胞施用有效量之如請求項1 至5中任一項之反義寡核苷酸或如請求項6之複合體或如請求項7 至9中任一項之藥物組成物。
  11. 一種如請求項1 至5中任一項之寡核苷酸或如請求項6之複合體或如請求項7 至9中任一項之藥物組成物之用途，其係用於製備用於調節表達ATXN2的目標細胞中之ATXN2表達的藥劑。
  12. 一種如請求項1 至5中任一項之寡核苷酸或如請求項6之複合體或如請求項7至9項中任一項之藥物組成物之用途，其係用於製備用以治療或預防神經退化性疾病的藥劑，所述神經退化性疾病例如是選自以第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、阿茲海默症、額顳葉型失智症(FTD)、帕金森症及TDP-43蛋白質病症狀所構成之群組的疾病。
  13. 如請求項12之用途，其中所述疾病為第二型脊髓小腦共濟失調症(SCA2)。
  14. 如請求項12之用途，其中所述疾病為肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)。
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