TW202012437A - 腦利尿鈉肽植入抗體 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種抗體或其片段，其包含至少一個合併在該抗體或其片段之至少一個CDR區內之異源胺基酸序列，其中該至少一個異源胺基酸序列包含N端連接子序列(Ntls)、腦利尿鈉肽(BNP)及C端連接子序列(Ctls)。視情況地，該至少一個CDR區的至少一部分由合併在其中的該至少一個異源胺基酸序列置換。本發明亦係關於此類抗體或其片段在治療方法中之用途、包含此類抗體或其片段之組合物、編碼此類抗體或其片段之核酸或核酸混合物、包含此類核酸或此類核酸混合物之宿主細胞及用於製備此類抗體或其片段之方法。

Description

腦利尿鈉肽植入抗體

本發明係關於一種抗體或其片段，其包含至少一個合併在該抗體或其片段之至少一個CDR區內之異源胺基酸序列，其中該至少一個異源胺基酸序列包含N端連接子序列(Ntls)、腦利尿鈉肽(BNP)及C端連接子序列(Ctls)。視情況地，該至少一個CDR區的至少一部分由合併在其中的該至少一個異源胺基酸序列置換。在以下之間存在至少12個胺基酸殘基：在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC (重鏈)res25與BNP之第一個胺基酸殘基；在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51與BNP之第一個胺基酸殘基；在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92與BNP之第一個胺基酸殘基；在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC (輕鏈)res26與BNP之第一個胺基酸殘基；在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49與BNP之第一個胺基酸殘基；及/或在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88與BNP之第一個胺基酸殘基。此外，在BNP之最後一個胺基酸殘基與以下之間存在至少9個胺基酸殘基：在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a；在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res57；在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res106；在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res32；在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res57；及/或在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res98。本發明亦係關於此類抗體或其片段在治療方法中之用途、包含此類抗體或其片段之組合物、編碼此類抗體或其片段之核酸或核酸混合物、包含此類核酸或此類核酸混合物之宿主細胞及用於製備此類抗體或其片段之方法。

利尿鈉肽為具有神經液遞作用之三種結構上相關之肽之家族。心房利尿鈉肽(ANP)為具有28個胺基酸之肽，其包含藉由半胱胺酸殘基7與23之間的二硫橋鍵形成之中心環結構。人類ANP表現為心房肌細胞中153個胺基酸長度之前激素原。信號肽裂解產生前激素形式，其接著進一步裂解成成熟ANP及N端殘粒，稱為NT-proANP。與ANP類似，腦尿鈉肽(BNP)及C型利尿鈉肽(CNP)亦由前驅體蛋白質產生且包含中心環結構。ANP主要由左心房及右心房之心肌細胞產生及釋放，而BNP主要由心室之心肌細胞產生。CNP係由血管之內皮細胞合成。除此等位置以外，利尿鈉肽亦在身體之其他部分中少量產生，例如在腦部、腎臟及腎上腺中。利尿鈉肽由三種獨立基因編碼，即NPPA、NPPB及NPPC。三種肽之胺基酸序列在哺乳動物中具有高度保守性(Potter等人, Handb Exp Pharmacol. 2009; (191):341-66)。又，已描述利尿鈉肽之重要序列修飾(諸如截短、胺基酸交換及嵌合融合，例如CD-NP (McKie等人, Curr Heart Fail Rep. 2010年9月; 7 (3): 93-9))可產生強效利尿鈉肽，其活化或結合於細胞受體且可引發相關生理學作用。

利尿鈉肽結合於三種不同的膜結合受體類型，即NPR-A、NPR-B及NPR-C，籍此調節其生物作用。ANP及BNP以最大親和力與NPR-A結合；相比之下，CNP對NPR-B受體具有最高親和力。NPR-A及NPR-B包含(粒狀)鳥苷酸環化酶結構域(pGC)，其酶促活性引起(細胞內)環單磷酸鳥苷(cGMP)增加。作為第二信使，cGMP調節不同細胞過程。NPR-C受體不呈現鳥苷酸環化酶活性且亦稱為「清除」受體，因為其可結合利尿鈉肽，引起其由內飲作用降解。已描述經由cAMP之調節實現的NPR-C之其他信號傳導功能(Anand-Srivastava, Peptides. 2005年6月; 26 (6): 1044-59)。

心肌激素ANP及BNP在心室及心房伸縮時分泌，例如由於過量血漿容量。其經由血管平滑肌之鬆弛發揮血管舒張作用且引起血壓降低。在腎臟中，ANP引起尿頻，即尿液分泌增加(多尿)，以及尿液中鈉離子之濃度增加(尿鈉排泄)。認為ANP組成腎素-血管收縮素-醛固酮系統(RAAS)之補償性拮抗劑，該系統在許多心血管疾病中過度活化。此外，ANP發揮其他神經體液作用，包括對交感神經系統之抑制作用，以及對壓力反射之複雜調節作用(Woods等人, Clin Exp Pharmacol Physiol. 2004年11月; 31 (11): 791-4)。對於ANP以及BNP及CNP，已在不同疾病之動物模型中證明消炎、抗肥大及抗纖維化作用(例如Knowles等人, 2001, J. Clin. Invest. 107: 975-984；Dahrouj等人, J Pharmacol Exp Ther. 2013年1月; 344 (1): 96-102；Baliga等人, Br J Pharmacol. 2014年7月; 171 (14): 3463-75；Mitaka等人 Intensive Care Med Exp. 2014年12月; 2 (1): 28；Werner等人, Basic Res Cardiol. 2016年3月; 111 (2): 22；Kimura等人, Respir Res. 2016年2月19日; 17: 19)。藉由CNP進行之NPR-B活化在骨骼生長(Yasoda等人, Clin. Calcium. 2009年7月; 19 (7): 1003-8)及血管內皮完整性(Moyes等人, J Clin Invest. 2014年9月; 124 (9): 4039-51)中起重要作用。

利尿鈉肽及受體之廣泛範圍之生理學作用使得其成為藥物研究中有吸引力的目標(Lumsden等人, Curr Pharm Des. 2010; 16 (37): 4080-8；Buglioni等人, Annu Rev Med. 2016; 67: 229-43)。舉例而言，利鈉cGMP系統可在各種病理生理學條件下受抑制，其可引起高血壓、細胞增殖增加、纖維化、炎症、內皮細胞功能不良、糖尿病、代謝症候群、動脈粥樣硬化、心機能不全、心肌梗塞、肺高血壓、眼部及腎臟疾病、骨骼病症、中風及/或性功能障礙。

利尿鈉肽之治療用途之主要障礙為其在生物體中僅幾分鐘之極短的血漿半衰期(Hunt等人, J Clin Endocrinol Metab. 1994年6月; 78 (6): 1428-35；Kimura等人, Eur J Clin Pharmacol. 2007年7月; 63 (7): 699-702)。除藉由NPR-C受體進行之內飲作用以外，利尿鈉肽由酶腦啡肽酶(NEP)及胰島素降解酶(IDE)有效蛋白水解降解。所投與之利尿鈉肽之相關短期生物作用使得其治療用途主要限於急性適應症。舉例而言，在不同國家，批准重組型卡培立肽(carperitide，ANP)及奈西立肽(nesiritide，BNP)之輸注用於治療急性失代償心臟衰竭。

提供具有延長之血漿半衰期、更高的蛋白水解穩定性及長作用持續時間之NPR-A及NPR-B促效劑將極大地促進慢性疾病之治療。

近年來，已描述若干利尿鈉肽衍生物及變異體，例如CD-NP (McKie等人, Curr Heart Fail Rep. 2010年9月; 7 (3): 93-9)、ZD100/MANP (McKie等人, Hypertension. 2010年12月; 56 (6): 1152-9)、PL-3994 (Edelson等人, Pulm Pharmacol Ther. 2013年4月; 26 (2): 229-38)、烏拉立肽(Ularitide)(Anker等人, Eur Heart J. 2015年3月21日; 36 (12): 715-2)、ANX-042 (Pan等人, Proc Natl Acad Sci USA. 2009年7月7日; 106 (27): 11282-7)及BMN-111 (Wendt等人, J. Pharmacol Exp Ther. 2015年4月; 353 (1): 132-49)。CD-NP之半衰期為約18.5分鐘(Lee等人, BMC Pharmacology 2007, 7 (增刊I): P38)。其他ANP及CNP衍生物分別揭示於US 9,193,777及EP 2 432 489 A中。

此外，已描述利尿鈉肽融合物，包括Fc融合物、白蛋白融合物及聚乙二醇化利尿鈉肽。利尿鈉肽-Fc融合物例如揭示於US 2010/0310561、WO 2008/154226、WO 2010/117760、WO 2006/107124、WO 2008/136611及WO 2008/079995中。利尿鈉肽-白蛋白融合物揭示於US 7,521,424及US 2014/0148390中且聚乙二醇化利尿鈉肽揭示於US 2014/0148390中。

WO 2005/060642描述藉由將在兩端上具有兩個隨機翻邊胺基酸之ANP或BNP插入人類破傷風類毒素特異性抗體之CDRH3區域來實現ANP及BNP肽植入抗體文庫之產生。類似地，WO 2005/082004揭示藉由用在任一側上由兩個隨機胺基酸殘基側接之ANP模擬肽置換2G12抗體之整個初始CDRH3區域來實現ANP模擬劑植入抗體文庫之產生。WO 2005/060642及WO 2005/082004皆未揭示任何特異性利尿鈉肽植入抗體，亦未功能性表徵此類抗體。

本發明之目標 鑒於先前技術，本發明之一個目標為提供新穎的利尿鈉肽受體促效劑，其與天然存在之野生型利尿鈉肽相比在血清中具有增加之穩定性。

以上所述目標係藉由標的獨立請求項之教示來實現。儘管免疫球蛋白CDR區具有短長度及高序列保守性，其對生物活性肽之合併具有顯著構形限制，但本發明人意外發現可藉由將利尿鈉肽胺基酸序列併入免疫球蛋白分子或其片段之一個CDR區中來獲得與天然存在之野生型利尿鈉肽相比，在血清中具有顯著增加之穩定性之生物活性利尿鈉肽變異體。然而，證實併入免疫球蛋白CDR區內之利尿鈉肽之活性顯著變化。本發明人發現可產生生物活性利尿鈉肽變異體之成功合併之決定性因素為所併入之利尿鈉肽與距離所併入之利尿鈉肽最近的相鄰CDR構架接面N端及C端之間的胺基酸殘基之數目。若利尿鈉肽與相鄰CDR構架接面之間的N端及C端側接胺基酸殘基少於某一數值，則僅可獲得不具有或具有顯著降低之生物活性之利尿鈉肽免疫球蛋白融合構築體。發現側接所併入之利尿鈉肽之特異性連接序列尤其有利於實現高肽活性、良好表現量及/或低蛋白質片段化量。

因此，在第一態樣中，本發明係關於抗體或其片段，其包含至少一個併入該抗體或其片段之至少一個CDR區內之異源胺基酸序列，其中該至少一個異源胺基酸序列包含N端連接子序列(Ntls)、利尿鈉肽及C端連接子序列(Ctls)，其中該至少一個CDR區的至少一部分視情況由併入其中之該至少一個異源胺基酸序列置換，且其中 a) 在以下之間存在至少12個胺基酸殘基： i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res S25)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res I51)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res C96)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res S25)及利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res Y51)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88 (在具有Seq ID No 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res C90)與第一利尿鈉肽之胺基酸殘基；且其中 b) 在利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與以下之間存在至少9個胺基酸殘基： i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res M34)； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res57 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res T58)； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res106 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res G111)； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res D34)； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res57 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res G59)；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res98 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res F102)。

在其他態樣中，本發明係關於此類抗體或其片段在治療方法中之用途、包含此類抗體或其片段之組合物、編碼此類抗體或其片段之核酸或核酸混合物、包含此類核酸或此類核酸混合物之宿主細胞及用於製備此類抗體或其片段之方法。

藉由參考以下本發明之詳細描述及其中包括之實例可更易於理解本發明。

在第一態樣中，本發明係關於抗體或其片段，其包含至少一個併入該抗體或其片段之至少一個CDR區內之異源胺基酸序列，其中該至少一個異源胺基酸序列包含N端連接子序列(Ntls)、利尿鈉肽及C端連接子序列(Ctls)，其中該至少一個CDR區的至少一部分視情況由併入其中之該至少一個異源胺基酸序列置換。

本發明人發現可藉由將利尿鈉肽胺基酸序列併入免疫球蛋白分子或其片段之一個CDR區中來獲得與天然存在之野生型利尿鈉肽相比，在血清中具有顯著增加之穩定性之生物活性利尿鈉肽。此結果為完全出人意料的。如此項技術中熟知，免疫球蛋白CDR區之短長度及高序列保守性，其在CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2中尤其明顯，對生物活性肽之合併造成顯著構形限制，且周圍免疫球蛋白序列可能不利地影響所併入之肽之表現、摺疊及/或生物活性。實情為，本發明人發現併入免疫球蛋白CDR區內之利尿鈉肽之活性視利尿鈉肽植入抗體之確切構築方式而顯著變化。已證實可產生功能性，亦即生物活性利尿鈉肽變異體之成功合併之決定性因素為所併入之利尿鈉肽與距離所併入之利尿鈉肽最近的相鄰CDR構架接面N端及C端之間的胺基酸殘基之數目。若利尿鈉肽與相鄰CDR構架接面之間的N端及C端側接胺基酸殘基少於某一數值，則無法獲得生物活性利尿鈉肽免疫球蛋白融合構築體。

術語「併入式」、「插入式」、「整合式」、「植入式」及「嵌入式」以及「併入」、「插入」、「整合」、「植入」及「嵌入」在本文中可互換地使用。在本發明之情形中，此等術語係指藉由將異源序列引入抗體或抗體片段之初始序列中來產生雜交聚核酸或雜交多肽。此類合併可藉由任何手段進行。典型地，藉由如本文中所描述之重組型DNA技術及表現來產生包含由N端及C端連接子序列側接之利尿鈉肽之抗體或其片段。

將藉由N端及C端連接子序列側接之利尿鈉肽併入初始抗體或抗體片段序列之CDR區中可引起至少一部分該CDR區之缺失。舉例而言，可進行編碼該異源胺基酸序列(包含N端連接子序列、利尿鈉肽及C端連接子序列)之核酸序列之選殖，使得一部分CDR編碼序列由所併入之異源核酸序列置換。在特定其他實施例中，併入包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列不會引起其中插入有異源胺基酸序列之CDR區之胺基酸殘基之缺失。

在本發明之情形中，術語「異源胺基酸序列」係指不源於其所併入之初始「空」抗體或其片段之胺基酸序列。因此，將異源胺基酸序列植入抗體或其片段中可產生由不同來源之胺基酸序列構成的經工程改造之重組型抗體分子。

術語「利尿鈉肽」係指可誘導尿鈉排泄(由腎分泌鈉)之肽。利尿鈉肽包括心房利尿鈉肽(ANP)、腦利尿鈉肽(BNP)、C型利尿鈉肽(CNP)、曼巴蛇(Dendroaspis)利尿鈉肽(DNP)及尿擴張素。在本發明之含義中，利尿鈉肽可具有任何來源。利尿鈉肽包括天然利尿鈉肽，諸如野生型利尿鈉肽及其突變版本，以及不同物種之同源利尿鈉肽。然而，該術語亦涵蓋經工程改造之利尿鈉肽，諸如不同利尿鈉肽之經工程改造之嵌合變異體。已知密碼子之用途在各物種之間不同。因此，當在目標細胞中表現異源蛋白質時，使核酸序列適應目標細胞之密碼子用途可能為必需或至少為有幫助的。用於設計及構築既定蛋白質之衍生物之方法為任何一般熟習此項技術者所熟知的。

在特定實施例中，利尿鈉肽係選自任何物種之野生型利尿鈉肽及任何此類野生型利尿鈉肽之功能變異體。在本發明之情形中，術語「利尿鈉肽之功能變異體」或「功能性利尿鈉肽變異體」係指任何來源之利尿鈉肽，包括天然及經工程改造之肽，其在胺基酸序列及/或編碼既定利尿鈉肽(諸如既定物種之野生型利尿鈉肽)之胺基酸序列之核酸序列方面不同，但仍具有功能活性。在本發明之情形中，術語「功能活性」係指利尿鈉肽變異體發揮天然存在之利尿鈉肽，特定言之，野生型利尿鈉肽之生物學功能之能力。特定言之，「功能活性」意指利尿鈉肽變異體能夠結合於其各別受體。在NPR-A及NPR-B配位體之情況下，「功能活性」尤其意謂藉由結合於此等受體中之一者或兩者來介導(細胞內)環單磷酸鳥苷(cGMP)增加之能力。

在特定實施例中，功能性利尿鈉肽變異體能夠發揮既定利尿鈉肽，諸如任何既定物種之野生型利尿鈉肽之一或多種生物學功能達至少約50%，特定言之，至少約60%、至少約70%、至少約80%且最特定言之，至少約90%，其中該一或多種生物學功能包括(但不限於)利尿鈉肽與其各別受體之結合及/或誘導細胞內cGMP之增加。

可藉由任何方法量測利尿鈉肽之功能活性，包括使得有可能量測(細胞內)環單磷酸鳥苷(cGMP)之增加或量測由cGMP調節之細胞過程之變化之活體外方法，包括實例3及5中描述之方法。在特定實施例中，若(非植入)利尿鈉肽變異體之EC₅₀ 值低於500 nM，更特定言之，低於250，更特定言之，低於150 nM，更特定言之，低於100 nM，更特定言之，低於50 nM，最特定言之，低於25 nM，如藉由實例3中所描述之螢光分析法所測定，則認為其具有功能活性。

如實例中所示，將此類功能性利尿鈉肽變異體併入如本文中所描述之免疫球蛋白分子或其片段之一個CDR區中可產生與非植入功能性利尿鈉肽變異體相比，具有利尿鈉肽功能活性及血清中之顯著增加之穩定性之利尿鈉肽植入免疫球蛋白。若利尿鈉肽植入免疫球蛋白直接地或藉由評估由cGMP調節之細胞過程之變化而間接地在任何量測(細胞內)環單磷酸鳥苷(cGMP)之增加的方法中提供顯著陽性信號，則認為其具有生物活性(亦即功能性)。特定言之，可藉由實例3及5中描述之方法評估利尿鈉肽植入免疫球蛋白之功能活性。在利尿鈉肽植入免疫球蛋白之情況下，通常基於以下來評估顯著性：i)與陰性樣品進行比較，該陰性樣品為諸如空免疫球蛋白骨架，例如構築體#209，一種包含SEQ ID NO 65及SEQ ID NO 66之抗體，TPP-5657，ii)與陽性樣品進行比較，該陽性樣品為例如構築體#117，一種包含SEQ ID NO 67及SEQ ID NO 66之抗體，TPP-5661，及iii)劑量依賴性。

儘管本發明之功能性利尿鈉肽變異體與參考利尿鈉肽相比可含有任何數目之突變，包含一或多個胺基酸之添加、缺失及/或取代，但功能性利尿鈉肽變異體將通常保持相應利尿鈉肽之關鍵特徵，諸如中心環結構域內之關鍵殘基。利尿鈉肽之保守性殘基例如描述於Lincoln R. Potter等人 (Handb Exp Pharmacol. 2009; (191): 341-366)中。因此，在特定實施例中，功能性利尿鈉肽變異體與以下展示之序列共有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性： X₁ CFGX₂ X₃ X₄ DRIX₅ X₆ X₇ SX₈ LGC 其中X₁ 及X₅ 為G或S； X₃ 為R或K； X₆ 為A或S；及 X₂ 、X₄ 、X₇ 及X₈ 可為任何胺基酸。

原則上，可在如本文中所描述之免疫球蛋白或其片段之CDR區內併入任何類型之利尿鈉肽。特定言之，本發明人發現一種利尿鈉肽之關於所植入之利尿鈉肽之令人滿意的生物活性之最小需求及尤其適合的N端及C端胺基酸序列之發現結果可用於其他類型之利尿鈉肽。不希望受理論約束，假設在不同利尿鈉肽類型中，在免疫球蛋白分子內成功嵌入利尿鈉肽之此等類似需求可歸因於利尿鈉肽家族內之結構類似性及/或作用機制。

在特定實施例中，利尿鈉肽係選自由以下組成之群：具有SEQ ID NO 23之序列之人類ANP、具有SEQ ID NO 24之序列之人類BNP、具有SEQ ID NO 25之序列之人類CNP及與SEQ ID NO 23至25中之任一者具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少98%序列一致性之肽。又，具有與野生型人類利尿鈉肽ANP、BNP及CNP不同之序列之利尿鈉肽可具有任何天然來源，例如野生型人類利尿鈉肽之突變版本，或不同物種之同源物，或經工程改造之利尿鈉肽。用於設計及構築肽變異體之方法為任何一般熟習此項技術者所熟知的。

在特定此類實施例中，與SEQ ID NO 23至25中之任一者具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少98%序列一致性之利尿鈉肽為功能性利尿鈉肽變異體。

分別相對於參考聚核苷酸或多肽序列之「序列一致性百分比(%)」分別定義為在比對序列及視情況引入之間隙(視需要)以獲得最大序列一致性百分比之後，候選人序列中分別與分別在聚核苷酸或多肽序列中之核酸或胺基酸殘基一致的核酸或胺基酸殘基之百分比。保守性取代不視為序列一致性之一部分。在特定實施例中，候選序列及/或參考序列中所引入之任何間隙之總量可不超過參考序列之殘基總量之50%、不超過40%、不超過30%、不超過25%、不超過20%、不超過15%或不超過10%。在特定實施例中，在不向候選或參考序列中引入任何間隙之情況下測定序列一致性百分比(亦即，使用無間隙比對)。用於測定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以在此項技術之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較之序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。

與既定參考利尿鈉肽，例如具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列之人類BNP共有既定序列一致性百分比之利尿鈉肽與參考利尿鈉肽相比可含有一或多個突變，包含一或多個胺基酸之添加、缺失及/或取代。根據本發明之教示，該等經刪除、添加及/或取代之胺基酸可為連續胺基酸，或可穿插於與參考利尿鈉肽(例如具有SEQ ID NO 24之胺基酸序列之人類BNP)共有既定序列一致性百分比之利尿鈉肽之整個胺基酸序列中。在DNA方面，由於基因碼之簡併，編碼與既定參考利尿鈉肽共有既定序列一致性百分比之利尿鈉肽之核酸序列可能在更大程度上不同。

根據本發明之教示，可添加、刪除及/或取代任何數目之胺基酸，只要符合所規定的與參考利尿鈉肽之胺基酸序列一致性即可。在特定實施例中，符合所規定的胺基酸序列一致性且利尿鈉肽變異體具有生物活性，亦即為功能性利尿鈉肽變異體。較佳地，與既定參考利尿鈉肽(例如具有如在SEQ ID NO 24中發現之胺基酸序列之人類BNP)相比，與該參考利尿鈉肽共有既定序列一致性百分比之利尿鈉肽之生物活性降低小於90%、小於80%、小於70%、小於60%、小於50%、小於25%或小於10%，如在上述分析法中所量測。

如本文中所使用，術語「抗體」意指免疫球蛋白分子，尤其包含四個多肽鏈(通常為藉由二硫鍵互連之兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)之二聚免疫球蛋白分子。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區可包含例如三個結構域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域(CL)。VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR)之保守性更高的區域。各VH及VL通常由自胺基端至羧基端例如按以下次序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

如本文中所使用，術語「互補決定區」 (CDR；例如，CDR1、CDR2及CDR3)係指抗體可變域之胺基酸殘基，其之存在為抗原結合所必需的。各可變域通常具有三個CDR區，標識為CDR1、CDR2及CDR3。各互補決定區可包含來自如由Kabat所定義之「互補決定區」之胺基酸殘基(例如輕鏈可變域中之約殘基24-34 (CDRL1)、50-56 (CDRL2)及89-97 (CDRL3)及重鏈可變域中之31-35 (CDRH1)、50-65 (CDRH2)及95-102 (CDRH3)；(Kabat等人, Sequences of Proteins of Immulological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))及/或來自「高變環」之殘基(例如輕鏈可變域中之約殘基26-32 (CDRL1)、50-52 (CDRL2)及91-96 (CDRL3)及重鏈可變域中之26-32 (CDRH1)、53-55 (CDRH2)及96-101 (CDRH3)(Chothia及Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987))。在一些情況下，互補決定區可包括來自根據Kabat定義之CDR區及高變環兩者之胺基酸。

取決於完整抗體之重鏈之恆定域之胺基酸序列，可將其指定為不同「類別」。存在五種主要類別之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等抗體中之若干者可進一步分成「子類」(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。在本發明之情形中，術語「抗體」包括任何主類之免疫球蛋白分子，包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY，及自自然界分離或藉由重組型手段製備之任何子類之免疫球蛋白分子，包括IgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA1及IgA2，且包括所有習知地已知的抗體。用於本發明之免疫球蛋白之較佳類別為IgG。術語「抗體」亦擴展至其他滿足以下條件之蛋白質骨架：能夠將抗體CDR插入物定向至相同活性結合構形中(如在天然抗體中發現)，使得與衍生CDR之天然抗體之結合活性相比，保持所觀測到的目標抗原與此等嵌合蛋白質之結合。

在本發明之情形中，術語抗體/免疫球蛋白之「片段」係指抗體/免疫球蛋白中之任何包含至少一個CDR區之部分。特定言之，本發明之抗體片段保持延長併入其中之生物活性肽，較佳利尿鈉肽之血清半衰期之能力。本發明之抗體片段包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；單域抗體(Dab)；線形抗體；單鏈抗體分子(scFv)；及二硫鍵穩定之Fv抗體片段(dsFv)；以及由抗體片段及包含VL或VH域之片段形成之多特異性抗體，其由完整免疫球蛋白製備或由重組手段製備。

F(ab')₂ 或Fab可經工程改造以最小化或完全移除CH1與CL域之間發生的分子間二硫化物相互作用。本發明之抗體片段可包含單獨或與以下中之全部或一部分組合之可變區：鉸鏈區、CH1、CH2、CH3及CL域。亦包括包含可變區與鉸鏈區、CH1、CH2、CH3及CL域之任何組合之抗體片段。

抗體或其片段組成賦予併入其中之利尿鈉肽穩定性之骨架。舉例而言，與天然存在之利尿鈉肽相比，併入如本文中所描述之抗體之CDR區內的利尿鈉肽之血清半衰期可延長。

大體上，可將包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列併入任何免疫球蛋白分子或其片段內。特定言之，可根據本發明使用任何物種(包括(但不限於)人類、牛、鼠類、大鼠、豬、犬、鯊魚、羊駝及駱駝)之免疫球蛋白以及任何主類別及子類別。然而，對於治療用途，人類或人類化抗體可為較佳的。在本發明之情形中，術語「人類抗體」係指具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列之抗體且包括自人類免疫球蛋白文庫、人類B細胞或針對一或多種人類免疫球蛋白以及合成人類抗體進行轉殖基因之動物分離的抗體。在特定實施例中，可變域之胺基酸輕鏈及重鏈序列分別源於人類生殖系序列LV 1-40及HV 3-23 (關於更多資訊，參見實例1)。

在本發明之情形中，術語「人類化抗體」或「人類化抗體片段」係指滿足以下條件之抗體或其片段：(i)源於非人類來源(例如基因轉殖小鼠，其具有異源免疫系統)，該抗體係基於人類生殖系序列；或(ii)嵌合性，其中可變域係源於非人類來源且恆定域係源於人類來源，或(iii)CDR接枝，其中可變域之CDR來自非人類來源，而可變域之一或多個構架為人源性且恆定域(若存在)為人源性。

本發明之抗體或其片段可為單特異性、雙特異性、三特異性或更高的多特異性。

在本發明之情形中，術語「包含」或「包含有」意謂「包括(但不限於)」。該術語意欲為開放式，指明任何所述特徵、元素、整數、步驟或組分之存在，但不排除存在或添加一或多種其他特徵、元素、整數、步驟、組分或其群。因此，術語「包含」包括限制性更高的術語「由……組成」及「基本上由……組成」。在一個實施例中，如遍及本申請案且尤其在申請專利範圍中所使用，術語「包含」可由術語「由……組成」置換。

在本發明之情形中，術語「約」或「大致」意謂在既定值之80%至120%內，或者90%至110%內，包括95%至105%內。

在本發明之抗體或其片段中，a)在以下之間存在至少12個胺基酸殘基： i) 在異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res S25)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； ii) 在異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res I51)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； iii) 在異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res C96)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； iv) 在異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res S25)及利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； v) 在異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res Y51)與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基；及/或 vi) 在異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88 (在具有Seq ID No 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res C90)與第一利尿鈉肽之胺基酸殘基； 及b) 在利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與以下之間存在至少9個胺基酸殘基： i) 在異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res M34)； ii) 在異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res57 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res T58)； iii) 在異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res106 (在具有SEQ ID NO 65之胺基酸序列之重鏈中，此對應於res G111)； iv) 在異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res D34)； v) 在異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res57 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res G59)；及/或 vi) 在異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res98 (在具有SEQ ID NO 66之胺基酸序列之輕鏈中，此對應於res F102)。

上文所列舉之胺基酸殘基之名稱係指在併入異源胺基酸序列之前，原始免疫球蛋白分子中之胺基酸位置。在本發明之情形中，上文所列舉之胺基酸殘基稱為「參考胺基酸」或「參考aa」。此等參考胺基酸殘基位於CDR構架接面處或附近，但未必對應於標準CDR邊界定義(標準CDR邊界定義為胺基酸殘基S25及W36，對於CDRH1；S49及R67，對於CDRH2；K98及W108，對於CDRH3；C22及W37，對於CDRL1；Y51及G59，對於CDRL2；C90及F102，對於CDRL3，Jarasch及Skerra, Proteins 2017年1月; 85 (1): 65-71)。

在參考aa與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基之間的距離所插入之利尿鈉肽最近的該相鄰參考aa的N端加胺基酸延伸部分在本文中稱為「N端序列」。N端序列包含Ntls。在特定實施例中，N端序列由Ntls加相鄰N端參考aa組成。

在所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與距離所插入之利尿鈉肽最近的相鄰參考aa的C端之間的胺基酸延伸部分加該參考aa在本文中稱為「C端序列」。C端序列包含Ctls。在特定實施例中，C端序列由Ctls加相鄰C端參考aa組成。

在特定實施例中，Ntls包含GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，尤其作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列，或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15、16、17、19或21中之任一者之序列；或與SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15、16、17、19或21中之任一者共有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列一致性之序列。Ntls亦可包含上文所列舉之胺基酸序列之任何組合。

在特定此類實施例中，Ntls包含GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，尤其作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列，或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15或21中之任一者之序列；或與SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15或21中之任一者共有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列一致性之序列；或其任何組合。

在特定實施例中，Ctls包含GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列，或與SEQ ID NO 1、3或5中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、17、18、19、20或22中之任一者之序列；或與SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、17、18、19、20或22中之任一者共有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列一致性之序列。Ctls亦可包含上文所列舉之胺基酸序列之任何組合。

在特定實施例中，Ctls包含GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、3或5中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、20或22中之任一者之序列；與SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、20或22中之任一者共有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列一致性之序列；或其任何組合。

在特定實施例中，Ntls及/或Ctls中所包含之序列與SEQ ID NO 1至22中之任一者之間的序列一致性為至少60%，特定言之，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%。

在本發明之情形中，術語「GS連接子序列」係指主要包含甘胺酸及絲胺酸殘基之肽連接子。特定言之，本發明之GS連接子序列中至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的胺基酸殘基係選自甘胺酸及絲胺酸殘基。本發明之GS連接子序列可例如包含總共1至30個胺基酸殘基。特定言之，本發明之GS連接子序列包含不超過3、2或1個除甘胺酸或絲胺酸以外的胺基酸殘基。

在本發明之情形中，術語「PN連接子序列」係指主要包含脯胺酸及天冬醯胺殘基之肽連接子。特定言之本發明之PN連接子序列中至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的胺基酸殘基係選自脯胺酸及天冬醯胺殘基。本發明之PN連接子序列可例如包含總共1至30個胺基酸殘基。特定言之，本發明之PN連接子序列包含不超過3、2或1個除脯胺酸或天冬醯胺以外的胺基酸殘基。可存在於本發明之PN連接子序列中之其他胺基酸殘基為例如離胺酸或麩胺酸殘基。

在特定實施例中，連接子序列包含於Ntls及/或Ctls中且選自GS連接子序列；PN連接子序列；人類IgG抗體骨架連接子序列；人類IgG fab域骨架序列；與人類IgG抗體骨架連接子序列共有至少80%序列一致性之序列、人類IgG fab域骨架序列或SEQ ID NO 1至5中之任一者之序列；及與SEQ ID NO 6至22中之任一者共有至少60%序列一致性之序列，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基。包含於Ntls及/或Ctls中之連接子序列可例如包含至多30、28、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個胺基酸殘基。

在連接子包含人類IgG抗體骨架之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列之情況下，可尤其有利地使用與合併有異源胺基酸序列之CDR相鄰的骨架區之序列。舉例而言，在異源胺基酸序列併入CDRH2域之情況下，Ntls及/或Ctls可包含有包含作為構架區FRH2或FRH3之一部分的胺基酸序列之連接子。類似地，在異源胺基酸序列併入CDRL2區之情況下，Ntls及/或Ctls可包含有包含作為構架區FRL2或FRL3之一部分的胺基酸序列之連接子。

在特定實施例中，Ntls由以下組成：GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，尤其作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15、16、17、19或21中之任一者之序列；或與SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15、16、17、19或21中之任一者共有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列一致性之序列；或其任何組合。

在特定實施例中，Ctls由以下組成：GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列、與SEQ ID NO 1、3或5中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、17、18、19、20或22中之任一者之序列；與SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、17、18、19、20或22中之任一者共有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列一致性之序列；或其任何組合。

在特定實施例中，Ntls及Ctls皆包含上文所列舉之連接序列中之至少一者或其任何組合。原則上，以上所列舉之Ntls連接序列中之任一者可與以上所列舉之Ctls連接序列中之任一者組合。特定言之，任何連接子序列可與GS連接子組合。作為非限制性實例，GS Ctls連接子可與Ntls連接子組合，該Ntls連接子包含SEQ ID NO 6、9或15中之任一者之序列或與SEQ ID NO 6、9或15中之任一者共有至少60%序列一致性之序列。其他非限制性實例為GS Ntls連接子與包含SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性的序列之Ctls連接子組合。

已證實上文所列舉之連接序列尤其有利於實現良好利尿鈉肽活性，提供足夠的N端及C端側接序列之總長度。不希望受理論所束縛，咸信上文所列舉之連接肽延伸部分產生有助於將生物活性利尿鈉肽在最小空間位阻下呈現至其各別受體之有利系統狀態之構形/摺疊。

在特定實施例中，i)Ntls包含GS連接子序列；PN連接子序列；SEQ ID NO 2、4、9、11、13或15之序列；與SEQ ID NO 2、4、9、11、13或15共有至少60%序列一致性之序列；或其任何組合，及ii)Ctls包含GS連接子序列；PN連接子序列；SEQ ID NO 3、5、12、14、15或20之序列；與SEQ ID NO 3、5、12、14、15或20共有至少60%序列一致性之序列；或其任何組合。已證實此等連接子序列尤其適用，因為其不僅實現高利尿鈉肽活性，且亦在重組型表現中具有良好表現量且在表現時不易於蛋白質片段化(參見表9)。

在特定實施例中，Ntls及Ctls各自包含GS連接子序列；Ntls及Ctls各自包含PN連接子序列；Ntls及Ctls各自包含作為人類IgG抗體骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，尤其作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，Ntls包含SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列；Ntls及Ctls各自包含SEQ ID NO 6之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 7之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 8之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 10之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 11之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 12之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 13之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 14之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls及Ctls各自包含SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 16之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 17之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 17之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 18之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls及Ctls各自包含SEQ ID NO 19之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 20之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；或Ntls包含SEQ ID NO 21之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 22之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列。

在特定此類實施例中，Ntls及Ctls各自包含GS連接子序列；Ntls及Ctls各自包含PN連接子序列；Ntls及Ctls各自包含作為人類IgG抗體骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，Ntls包含SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列；Ntls及Ctls各自包含SEQ ID NO 6之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 7之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 8之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 10之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 11之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 12之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 13之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 14之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls及Ctls各自包含SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 20之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；或Ntls包含SEQ ID NO 21之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 22之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列。

在特定此類實施例中，Ntls及Ctls各自包含GS連接子序列；Ntls及Ctls各自包含PN連接子序列；Ntls包含SEQ ID NO 2之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 3之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 4之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 5之序列或與其共有至少80%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 11之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 12之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls包含SEQ ID NO 13之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 14之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；Ntls及Ctls各自包含SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；或Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列，且Ctls包含SEQ ID NO 20之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列。已證實此等連接子組合尤其適用於實現高利尿鈉肽活性、重組型表現中之良好表現量及最小或無蛋白質片段化，如表9中所示。

在特定實施例中，Ntls在其C端進一步包含錨定元件A1及/或Ctls在其N端進一步包含錨定元件A2，其中A1及A2主要包含甘胺酸及絲胺酸殘基。在特定實施例中，A1及/或A2包含至少1、2、3、4或5個胺基酸殘基。A1及/或A2可包含總共多達10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基。在特定實施例中，A1及/或A2中至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%的胺基酸殘基係選自甘胺酸及絲胺酸殘基。特定言之，A1及/或A2包含不超過3、2或1個除甘胺酸或絲胺酸以外的胺基酸殘基。

在特定實施例中，Ntls由以下組成：i)位於其C端之錨定元件A1，及ii)GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，尤其作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15、16、17、19或21中之任一者之序列；或與SEQ ID NO 6、7、9、11、13、15、16、17、19或21中之任一者共有至少60%序列一致性之序列；或其任何組合。

在特定實施例中，Ctls由以下組成：i)位於其N端之錨定元件A2，及ii)GS連接子序列；PN連接子序列；作為人類IgG抗體骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分的胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列，或與SEQ ID NO 1、3或5中之任一者共有至少80%序列一致性之序列；SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、17、18、19、20或22中之任一者之序列；與SEQ ID NO 6、8、10、12、14、15、17、18、19、20或22中之任一者共有至少60%序列一致性之序列；或其任何組合。

在特定實施例中，Ntls及/或Ctls包含總共至少3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基。Ntls及/或Ctls可例如包含總共至多30、28、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個胺基酸殘基。

在特定實施例中，存在於以下之間的胺基酸延伸部分： i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88與利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基； 包含SEQ ID NO 26至38中之任一者之序列或與SEQ ID NO 26至38中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%序列一致性之序列。

在特定實施例中，存在於利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與以下之間的胺基酸延伸部分 i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res57； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res106； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res57；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res98； 包含SEQ ID NO 39至51中之任一者之序列或與SEQ ID NO 39至51中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%序列一致性之序列。

在特定實施例中，異源胺基酸序列由Ntls、利尿鈉肽及Ctls組成。

在特定實施例中，存在於以下之間的胺基酸延伸部分： i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25與根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51與根據Kabat之胺基酸殘基HC res57； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92與根據Kabat之胺基酸殘基HC res106； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26與根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49與根據Kabat之胺基酸殘基LC res57；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88與根據Kabat之胺基酸殘基LC res98； 包含SEQ ID NO 52至64中之任一者之序列或與SEQ ID NO 52至64中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%序列一致性之序列。

在特定實施例中，抗體或其片段包含至少兩個利尿鈉肽。在特定實施例中，兩個利尿鈉肽皆包含於進一步包含Ntls及Ctls之異源胺基酸序列中且併入該抗體或其片段之CDR區內，如本文中所描述。該至少兩個利尿鈉肽可併入兩個輕鏈或兩個重鏈之兩個相應CDR區內，或該至少兩個利尿鈉肽可併入兩個單獨的CDR區內。該至少兩個利尿鈉肽可相同或不同。在特定此類實施例中，抗體或其片段包含併入至少兩個CDR區內之至少兩個不同的利尿鈉肽。

歸因於抗體分子之二聚結構，將一個編碼異源胺基酸序列(Ntls-利尿鈉肽-Ctls)之核酸序列插入編碼免疫球蛋白分子之輕鏈或重鏈之核酸中通常可產生具有兩個位於兩個一致輕鏈或兩個一致重鏈之相應CDR區中的利尿鈉肽之抗體蛋白質。然而，亦設想將兩個編碼利尿鈉肽之核酸插入編碼輕鏈及/或重鏈之核酸序列之兩個不同的CDR編碼區中，籍此產生具有四個位於二聚抗體之兩個相應CDR對中的利尿鈉肽之抗體分子。亦涵蓋輕鏈及/或重鏈不一致之二聚免疫球蛋白分子，例如包括具有單一利尿鈉肽之二聚抗體以及在兩個輕鏈或兩個重鏈之兩個相應CDR區中具有兩個不同利尿鈉肽之二聚抗體。

在特定實施例中，將利尿鈉肽插入CDRH1及CDRH2、CDRH1及CDRH3、CDRH2及CDRH3、CDRH1及CDRL1、CDRH1及CDRL2、CDRH1及CDRL3、CDRH2及CDRL1或CDRH2及CDRL2中。在特定實施例中，抗體或其片段包含一個ANP及一個BNP分子；一個ANP及一個CNP分子；或一個BNP及一個CNP分子。

在特定實施例中，包含於併入該抗體或其片段之至少一個CDR區內的至少一個異源胺基酸序列中之利尿鈉肽為BNP且抗體或其片段包含至少另一個利尿鈉肽。在特定實施例中，至少另一個利尿鈉肽亦包含於進一步包含Ntls及Ctls之異源胺基酸序列中且併入該抗體或其片段之CDR區內。在特定實施例中，BNP及至少另一個利尿鈉肽併入抗體或其片段之兩個輕鏈或兩個重鏈之兩個相應CDR區內。在特定其他實施例中，BNP及至少另一個利尿鈉肽併入至少兩個單獨的CDR區內。特定言之，該至少另一個利尿鈉肽係選自ANP、BNP及CNP，更特定言之，係選自ANP及CNP。

不具有包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列之「空」抗體分子稱為TPP-5657，該利尿鈉肽由具有SEQ ID NO 65之序列之兩個重鏈及具有SEQ ID NO 66之序列之兩個輕鏈構成。在特定實施例中，由具有SEQ ID NO 65之序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列的兩個重鏈及具有SEQ ID NO 66之序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列的兩個輕鏈構成之抗體分子充當初始或親本抗體，將包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列併入該抗體中。在特定此類實施例中，將包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列併入此類抗體分子之一個或兩個重鏈之CDR區內。

在特定此類實施例中，包含至少一個合併於至少一個CDR區內之異源胺基酸序列之重鏈具有SEQ ID NO 67至79中之任一者之序列或與SEQ ID NO 67至79中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列。在特定實施例中，本發明之抗體由以下構成：兩個具有SEQ ID NO 67至79中之任一者之序列或與SEQ ID NO 67至79中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列之一致重鏈，及兩個具有SEQ ID NO 66之序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列之一致輕鏈。

在特定其他實施例中，將包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列併入此類抗體分子之一個或兩個輕鏈之CDR區內。在特定此類實施例中，包含至少一個合併於至少一個CDR區內之異源胺基酸序列之輕鏈具有SEQ ID NO 80或81中之任一者之序列或與SEQ ID NO 80或81中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列。在特定實施例中，本發明之抗體由以下構成：兩個具有SEQ ID NO 80或81中之任一者之序列或與SEQ ID NO 80或81中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列之一致輕鏈，及兩個具有SEQ ID NO 65之序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列之一致重鏈。

下表描繪本發明之例示性抗體之重鏈及輕鏈組成。

表 1 ：例示性利尿鈉肽植入抗體構築體

本發明之抗體或其片段包括天然存在之經純化之產物、化學合成程序之產物及藉由重組技術產生之產物。取決於其來源，本發明之抗體或其片段可經糖基化或未經糖基化。

舉例而言，標準重組型DNA方法可用於製備及/或獲得編碼重鏈及輕鏈之核酸，將此等核酸併入表現載體中及將載體引入宿主細胞中以用於重組型表現(參見例如Sambrook, Fritsch及Maniatis (編), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)；Ausubel, F. M.等人(編) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)；Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)；及Boss等人之US 4,816,397)。

因此，在第二態樣中，本發明係關於編碼本發明之抗體或其片段之核酸或核酸混合物。在某些情況下，此等核酸序列可經最佳化以用於哺乳動物表現。本發明之DNA分子不限於本文中所揭示之序列，且亦包括其變異體。

本發明亦提供重組型核酸構築體，其包含一或多種本發明之核酸序列。本發明之重組型核酸構築體可例如包含核酸載體，諸如質體，其中已插入編碼本發明之抗體或其片段之核酸分子。應理解，表現載體之設計，包括調節序列之選擇受諸如宿主細胞之選擇、所需蛋白質表現量及所需表現為組成性或誘導性之因素影響。

適用於細菌用途之表現載體可藉由插入一或多種本發明之核酸序列以及具有功能性啟動子之處於可操作的讀取相之適合的轉譯起始及終止信號來構築。細菌表現載體通常包含一或多個表現型可選標記及複製起點以確保維持載體及(若需要)提供細菌宿主內之擴增。細菌表現載體可包含源於可商購的質體(諸如熟知的選殖載體pBR322 (ATCC 37017))之元件。可取決於經表現之抗體或其片段之所欲用途來有利地選擇多種細菌表現載體。舉例而言，若需要大量此類抗體，則可能需要易於純化之介導大量抗體融合蛋白質表現之載體。

意欲用於真核宿主細胞中之抗體表現之重組型核酸構築體可包含調節序列，其能夠控制真核細胞中之開放閱讀框架之表現，較佳為啟動子及聚腺苷酸化信號。較佳選擇在意欲用於抗體表現之特定細胞類型內具有功能性之啟動子及聚腺苷酸化信號。適合的啟動子之實例包括(但不限於)來自以下之啟動子：巨細胞病毒(CMV)(諸如強CMV早期立即啟動子)、猴病毒40 (SV40)、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)(諸如HIV長末端重複序列(LTR)啟動子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus，EBV)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤病毒及勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)；由CMV早期強化子元件、雞β-肌動蛋白基因之啟動子、第一外顯子及第一內含子以及兔β血球蛋白基因之剪接受體構成之合成CAG啟動子；以及來自哺乳動物基因(諸如肌動蛋白、肌凝蛋白、血紅蛋白、肌肉肌酸及金屬硫蛋白)之啟動子。在特定實施例中，真核表現卡匣含有CMV啟動子。在本發明之情形中，術語「CMV啟動子」係指強早期立即巨細胞病毒啟動子。

適合的聚腺苷酸化信號之實例包括(但不限於)牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化位點、SV40聚腺苷酸化信號及LTR聚腺苷酸化信號。

此外，重組型核酸序列可包含一或多個強化子序列。強化子可為例如哺乳動物肌動蛋白、肌凝蛋白、血紅蛋白、肌肉肌酸之強化子或病毒強化子，例如來自CMV、RSV、SV40或EBV之強化子。關於病毒調節元件及其序列之進一步說明，參見例如Stinski之US 5,168,062、Bell等人之US 4,510,245及Schaffner等人之US 4,968,615。

調節序列及密碼子通常為物種依賴性，因此為了最大化蛋白質產生，較佳選擇在意欲用於抗體表現之物種/細胞類型中有效的調節序列及密碼子。熟習此項技術者可製備在既定個體物種中具有功能性之重組型DNA分子。

哺乳動物重組型表現載體亦可包括複製起點及可選標記(參見例如US 4,399,216、US 4,634,665及US 5,179,017)。適合的可選標記包括賦予對藥物(諸如G418、嘌呤黴素、潮黴素、殺稻瘟菌素、吉歐黴素(zeocin)/博萊黴素(bleomycin)或甲胺喋呤)之抗性之基因或採用營養缺陷現象之可選標記，諸如其中已引入載體之宿主細胞上之麩醯胺酸合成酶。舉例而言，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予對甲胺喋呤之抗性、neo基因賦予對G418之抗性、來自土麴菌(Aspergillus terreus)之bsd基因賦予對殺稻瘟菌素(blasticidin)之抗性、嘌呤黴素N-乙醯基-轉移酶賦予對嘌呤黴素之抗性、Sh ble基因產物賦予對吉歐黴素之抗性且大腸桿菌(E. coli)潮黴素抗性基因(hyg或hph)賦予對潮黴素之抗性。諸如DHFR或麩醯胺酸合成酶之可選標記亦與MTX及MSX一起適用於擴增技術。

在一些實施例中，將編碼重鏈及輕鏈之核酸序列插入單獨的載體中。在其他實施例中，將編碼重鏈及輕鏈之核酸序列插入同一載體中。此外，編碼重鏈及/或輕鏈之可變區之核酸序列可轉化成例如編碼全長抗體鏈、Fab片段之核酸序列，或轉化成scFv。編碼VL或VH之DNA片段可以可操作方式連接(使得由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列處於框內)至編碼例如抗體恆定區或可撓性連接子之另一DNA片段。作為實例，為了產生編碼scFv之聚核苷酸序列，可使編碼VH及VL之核酸可操作地連接至編碼可撓性連接子之另一片段，使得VH及VL序列可表現為相鄰單鏈蛋白質，其中VL及VH區由可撓性連接子接合(參見例如Bird等人 (1988) Science 242:423-426；Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人, Nature (1990) 348:552-554)。人類重鏈及輕鏈恆定區之序列為此項技術中已知的(參見例如Kabat, E. A.等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號)且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。

在特定實施例中，編碼重鏈之核酸序列包含SEQ ID NO 82或83中之任一者之序列或與SEQ ID NO 82或83中之任一者具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列，該重鏈合併有包含利尿鈉肽之異源胺基酸序列。在特定此類實施例中，編碼輕鏈之核酸序列包含SEQ ID NO 84之序列或與其具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列一致性之序列。

在第三態樣中，本發明係關於宿主細胞，其包含本發明之核酸或核酸混合物。在本發明之情形中，術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換地使用且係指其中已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型物」、「轉型細胞」、「轉染物」、「轉染細胞」及「轉導細胞」，其包括原生轉型/轉染/轉導細胞及由其衍生之後代，與繼代次數無關。後代之核酸含量可能不與母細胞一致，且所包含之外源核酸可能含有突變。本文中包括針對原始轉型細胞篩選或選擇的具有相同功能或生物活性之突變後代。

可使用標準技術進行將表現載體轉染至宿主細胞中，諸如電致孔、核轉染、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、諸如基於聚乙烯亞胺之轉染的基於聚陽離子之轉染及DEAE-聚葡萄糖轉染。

適合的宿主細胞包括原核細胞及真核細胞。原核宿主細胞之實例為例如細菌且包括(但不限於)大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium)及假單胞菌(Pseudomonas)屬、鏈黴菌(Streptomyces)屬及葡萄球菌(Staphylococcus)屬內的各種物種。

真核宿主細胞之非限制性實例包括酵母、昆蟲及昆蟲細胞、植物及植物細胞、轉殖基因動物及哺乳動物細胞。用於抗體表現之適合的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO細胞)，諸如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV (包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub及Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220及Urlaub等人，Cell. 1983年6月；33(2):405-12中，與DHFR可選標記(例如，如R. J. Kaufman及P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中所描述)一起使用；及例示於Fan等人，Biotechnol Bioeng. 2012年4月；109(4):1007-15中之其他基因剔除細胞)；NS0骨髓瘤細胞；COS細胞；HEK293細胞；HKB11細胞；BHK21細胞；CAP細胞；EB66細胞及SP2細胞。

表現在表現系統中亦可為短暫或半穩定的，該等表現系統諸如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-自由式、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO自由式、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T細胞(例如Durocher等人，Nucleic Acids Res. 2002年1月15日；30(2):E9)。

在第四態樣中，本發明係關於一種用於製備抗體或其片段之方法，其包含培養本發明之宿主細胞。特定言之，在適合抗體或其片段之表現的條件下培養本發明之宿主細胞。

抗體表現可為組成性或經調節的(例如誘導性)。關於誘導性抗體表現，通常使本發明之宿主細胞生長至適合的細胞密度，接著藉由適合的手段(例如溫度偏移或化學誘導，諸如添加或移除小分子感應器，諸如四環素及Tet系統)進行所選擇之啟動子之脫抑制/誘導，且再培養宿主細胞一段時間。

在特定實施例中，用於製備本發明之抗體或其片段之方法進一步包含自宿主細胞培養物回收抗體或其片段之步驟。細胞可例如藉由離心來收集，藉由物理或化學手段分裂，且可自所得粗提取物進一步純化抗體或其片段。在一些實施例中，表現載體經設計使得經表現之抗體或其片段分泌至宿主細胞生長所處之培養基中。在此情況下，可使用標準蛋白質純化方法自培養基直接回收抗體或其片段。

在特定實施例中，本發明之方法進一步包含純化所回收之抗體或其片段之步驟。特定言之，抗體純化至(1)超過90%，如例如藉由分析型層析或SDS-毛細管凝膠電泳測定(例如，在Caliper LabChip GXII、GX 90或Biorad Bioanalyzer裝置上)，且更特定言之，純化使得抗體均質性為至少約92.5%、95%、98%或99%；或者，抗體純化至(2)足以獲得至少15個N端或內部胺基酸序列之殘基之程度，或(3)具有均質性，使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染料，在還原或非還原條件下藉由SDS-PAGE發現。

可藉由熟知方法自重組型細胞培養物回收及純化本發明之抗體或其片段，包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沈澱、酸提取、蛋白質A層析、蛋白質G層析、尺寸排阻層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及凝集素層析。亦可使用高效液相層析(「HPLC」)進行純化(參見例如Colligan, Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章)。

在第五態樣中，本發明係關於包含本發明之抗體或其片段之組合物。特定言之，本發明之組合物為適用於治療方法之醫藥組合物，其中以可有效實現所欲目的(亦即，預防或治療特定疾病病況)之量含有本發明之抗體或其片段。

組合物視情況進一步包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在本發明之情形中，術語「賦形劑」係指與藥物之活性成分一起調配之天然或合成物質。適合的賦形劑包括抗黏劑、結合劑、塗料、崩解劑、調味劑、顏料、潤滑劑、滑動劑、吸附劑、防腐劑及甜味劑。醫藥學上可接受之賦形劑之特定實例包括(但不限於)生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、右旋糖及水。在本發明之情形中，術語「醫藥學上可接受」係指醫藥組合物之分子實體及其他成分在投與哺乳動物(例如人類)時為生理學上可耐受且通常不產生不良反應。術語「醫藥學上可接受」亦可意謂由聯邦或州政府之監管機構批准，或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常公認用於哺乳動物且更特定言之，人類之藥典中。

本發明之組合物可進一步包含一或多種其他治療活性劑。

醫藥組合物可呈溶液、懸浮液、包覆腸溶包衣之膠囊、凍乾粉末之形式或任何其他適用於預期用途之形式。

可使用此項技術中熟知的醫藥學上可接受之賦形劑以適用於口服投藥之劑量調配用於口服投藥之醫藥組合物。此等賦形劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿料、懸浮液及其類似物，以便患者攝入。

口服使用之醫藥製劑可經由組合活性化合物與固體賦形劑，視情況研磨所得混合物且視需要在添加適合的助劑之後處理顆粒之混合物以獲得錠劑或糖衣藥丸核心來獲得。適合的賦形劑為碳水化合物或蛋白質填充劑，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；來自玉米、小麥、大米、馬鈴薯或其他植物之澱粉；纖維素，諸如甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素或羧基甲基纖維素鈉；及膠，包括阿拉伯膠及黃蓍膠；及蛋白質，諸如明膠及膠原蛋白。視需要，可添加崩解劑或增溶劑，諸如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂及海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。

糖衣藥丸核心可提供有適合的包衣，諸如濃縮糖溶液，其亦可含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波莫膠(carbopol gel)、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆液及適合的有機溶劑或溶劑混合物。可將染料或顏料添加至錠劑或糖衣藥丸包衣中以用於產品鑑別或表徵活性化合物之量，亦即劑量。

可經口使用之醫藥製劑包括由明膠製成之配合插入式膠囊以及由明膠及包衣(諸如甘油或山梨糖醇)製成之軟密封膠囊。配合插入式膠囊可含有活性成分與以下之混合物：填充劑或結合劑(諸如乳糖或澱粉)、潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)及視情況選用之穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物可在存在或不存在穩定劑之情況下溶解或懸浮於諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇之適合的液體中。

用於非經腸投藥之醫藥調配物包括治療活性劑之水性溶液。對於注射，本發明之醫藥組合物可在水性溶液中，較佳在生理學上相容的緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理緩衝食鹽水)中調配。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。此外，活性劑之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質體。視情況地，懸浮液亦可含有適合的穩定劑或提高治療活性劑之可溶性之試劑，以使得能夠製備高度濃縮之溶液。

關於局部或經鼻投藥，調配物中使用適合於待滲透之特定障壁之滲透劑。此類滲透劑通常為此項技術中已知的。

本發明之醫藥組合物可以此項技術中已知的方式製造，例如借助於習知混合、溶解、粒化、糖衣藥丸製造、水磨、乳化、囊封、包覆或凍乾過程。

醫藥組合物可以鹽形式提供且可由酸形成，包括(但不限於)鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、丁二酸等。與相應的游離鹼形式相比，鹽傾向於更可溶於水性及其他質子溶劑中。在其他情況下，較佳製劑可為在4.5至7.5之pH值範圍內之於1 mM-50 mM組胺酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露糖醇中之凍乾粉末，其在使用之前與緩衝液組合。

關於調配及投藥之其他細節可見於最新版的Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, Pa.出版)中。

在製備包含本發明之抗體或其片段之醫藥組合物後，可將其置放於適合的容器中且經標記以用於所指示之病狀之治療。關於本發明之抗體或片段之投藥，此類標記將包括投藥之量、頻率及方法。

本發明亦提供醫藥學封裝及套組，其包含一或多個填充有本發明之前述組合物之成分中之一或多者之容器。與此類容器視情況相關聯的可為由管理藥品或醫藥產物之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式的注意事項，該注意事項反映由用於人類投藥之製造、使用或銷售機構的批准。

在第六態樣中，本發明係關於本發明之抗體或其片段或本發明之組合物在治療方法中之用途。

特定言之，此類治療方法涉及向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗體或其片段。個體可為人類或非人類動物(例如，家兔、大鼠、小鼠、犬、猴或其他低等靈長類動物)。

在本發明之情形中，術語「治療有效量」定義為足以預防或緩解本文中提及之病症及疾病中之任一者之疾病症狀的本發明之抗體或其片段之量，無論以單次劑量形式或根據多次給藥方案、單獨或與其他藥劑組合。在特定實施例中，該「治療有效量」為毒理學上可耐受的。有效劑量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內。治療劑之治療有效量通常主要取決於特定患者特徵，諸如年齡、體重、性別及疾病病況、投藥時間、頻率及途徑、藥物組合及所治療之病症之性質。視投藥途徑而定，抗體之常用劑量在0.1至100,000微克範圍內變化，至多為約10 g之總劑量。

其測定之一般指導可見於例如國際協調會議(International Conference on Harmonization)之出版物及REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第27及28章, 第484-528頁 (第18版, Alfonso R. Gennaro編, Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990)中。更特定言之，測定治療有效量將取決於諸如可使用此項技術中熟知及前述參考文獻中發現之方法測定之藥劑之毒性及功效之因素。簡言之，可分別在細胞培養物分析法或動物模型中測定治療劑之治療功效及毒性，例如ED50 (在50%的群體中治療有效之劑量)及LD50 (對50%的群體具有致死性之劑量)。ED50與LD50之間的劑量比為治療指數。

本發明之抗體或其片段適用於治療及/或預防心臟血管、腎、肺、骨骼、眼部、血栓栓塞及纖維化疾病及病症、侏儒症、軟骨發育不全以及其他cGMP相關及/或利尿鈉肽反應性病症。因此，在特定實施例中，抗體或其片段係用於治療及/或預防此等病症及疾病中之任一者或其任何組合。

因此，本發明之抗體或其片段可在用於治療及/或預防以下之藥劑中使用：心臟血管病症，例如動脈及肺高血壓、耐藥性及難治性高血壓、急性及慢性心臟衰竭、冠心病、阻塞性細支氣管炎症候群(BOS)腫瘤相關及致癌性疾病、移植物抗宿主疾病、鐮狀細胞疾病、穩定及不穩定型心絞痛、周邊及心肌血管病症、心律不齊、心房及心室心律不齊及傳導損傷，例如I-III級房室傳導阻滯(AB阻滯I-III)、室上性快速性心律失常、心房顫動、房顫、心室性震顫、心室顫動、心室快速性心律失常、尖端扭轉型室速心搏過速、心房及心室期外收縮、AV交界性早搏、心房腔失調症候群、暈厥、AV結節複入性心動過速、沃夫-帕金森-懷特症候群(Wolff-Parkinson-White syndrome)、急性冠狀動脈症候群(ACS)、自體免疫性心臟病症(心包炎、心內膜炎、肺泡炎、主動脈炎、心肌病)、諸如心因性休克、敗血性休克及過敏性休克之休克、動脈瘤、拳師犬心肌病(prematur心室收縮(PVC))；用於治療及/或預防血栓栓塞病症及缺血，諸如心肌局部缺血、心肌梗塞、中風、心臟肥大、短暫及缺血發作、先兆子癇、發炎性心臟血管病症、冠狀動脈及周邊動脈之痙攣、水腫形成，例如肺水腫、腦水腫、腎水腫或由心臟衰竭引起之水腫、周邊循環紊亂、再灌注損傷、動脈及靜脈形成血栓、微白蛋白尿、心肌功能障礙、內皮細胞功能不良；預防再狹窄，例如在血栓溶解療法、經皮腔內血管成形術(PTA)、腔內冠狀動脈血管成形術(PTCA)、心臟移植及旁路操作之後；以及預防微血管及大血管損傷(血管炎)、血纖維蛋白原及低密度脂蛋白(LDL)含量增加以及纖維蛋白溶酶原活化因子抑制劑1 (PAI-1)之濃度增加，以及用於治療及/或預防勃起功能障礙及雌性性功能障礙。

在本發明之情形中，術語「心臟衰竭」涵蓋心臟衰竭之急性及慢性形式，以及疾病之更特定或相關類型，諸如急性失代償心臟衰竭、右心臟衰竭、左心臟衰竭、整體衰竭、缺血性心肌病、擴張型心肌症、肥厚性心肌症、特發性心肌病、先天性心臟缺陷、與心瓣膜缺陷相關聯之心臟衰竭、二尖瓣狹窄、二尖瓣關閉不全、主動脈瓣膜狹窄、主動脈瓣膜關閉不全、三尖瓣膜狹窄、三尖瓣膜關閉不全、肺瓣膜狹窄、肺瓣膜關閉不全、組合心臟瓣膜缺陷、心肌炎症(心肌炎)、慢性心肌炎、急性心肌炎、病毒性心肌炎、糖尿病性心臟衰竭、酒精性心肌病、心肌儲存病症、舒張性心臟衰竭及收縮性心臟衰竭、具有保留射血分數之心臟衰竭(HFpEF)、具有降低之射血分數(HFrEF)之心臟衰竭以及現有慢性心臟衰竭之惡化之急性狀態(惡化型心臟衰竭)。

此外，本發明之抗體或其片段亦可用於治療及/或預防動脈硬化、外周動脈疾病(PAD)、脂質代謝減弱、高脂蛋白血症、血脂異常、高甘油三酯血症、高脂質血症、高膽固醇血症、無β脂蛋白血症、穀固醇血症、黃瘤症、丹吉爾病(Tangier disease)、肥胖、肥胖症及組合型高脂質血症及代謝症候群。

此外，本發明之抗體或其片段可用於治療及/或預防原發性及繼發性雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon)、微循環障礙、跛行、周邊及自主神經病變、糖尿病性微血管病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性肢體潰瘍、壞疽、CREST症候群、紅斑、甲真菌病、風濕病以及用於促進傷口癒合。

本發明之抗體或其片段亦適用於治療泌尿病症，例如良性前列腺症候群(BPS)、良性前列腺增生(BPH)、良性前列腺增大(BPE)、膀胱出口堵塞(BOO)、下尿道症候群(LUTS，包括貓泌尿症候群(Feline Urological Syndrome，FUS))；泌尿生殖系統病症，包括神經性膀胱過動症(OAB)及(IC)、失禁(UI)，例如混合性尿失禁、衝動性尿失禁、應力性尿失禁或充溢性尿失禁(MUI、UUI、SUI、OUI)、骨盆疼痛、雄性及雌性泌尿生殖系統器官之良性及惡性病症。

本發明之抗體或其片段亦適用於治療及/或預防腎臟病症，尤其急性及慢性腎功能衰竭以及急性及慢性腎衰竭。在本發明之情形中，術語「腎功能衰竭」涵蓋腎功能衰竭之急性及慢性表現，以及潛伏或相關腎功能異常，諸如腎灌注不足、透析性低血壓、阻塞性尿路病、腎小球病、絲球體腎炎、急性絲球體腎炎、腎小球硬化症、小管間質性疾病、腎病病症(諸如原發性及先天性腎病)、腎炎、免疫性腎臟病症(諸如腎臟移植排斥及免疫複合體誘導之腎臟病症)、由有毒物質誘發之腎病、由對比劑誘發之腎病、糖尿病性及非糖尿病性腎病變、腎盂腎炎、腎囊腫、腎硬化、高血壓性腎硬化及腎病症候群，其可以診斷方式表徵，例如由異常降低之肌酐及/或水分泌、異常升高之脲、氮、鉀及/或肌酐之血液濃度、腎酶(例如麩胺醯基合成酶)活性改變、尿液容積莫耳滲透濃度或尿量改變、微白蛋白尿升高、大量白蛋白尿、腎小球及小動脈上之病灶、血管膨脹、高磷酸鹽血症及/或需要透析。本發明亦涵蓋本發明之抗體或其片段之用途，其用於治療及/或預防腎功能衰竭後遺症，例如肺水腫、心臟衰竭、尿毒症、貧血、電解質紊亂(例如高鉀血症、低鈉血症)以及骨骼及碳水化合物代謝中之異常。

此外，本發明之抗體或其片段亦適用於治療及/或預防哮喘病症、肺動脈高血壓(PAH)及包括左心疾病之其他形式的肺高血壓(PH)、HIV、鐮狀細胞貧血、血栓栓塞症(CTEPH)、類肉瘤病、COPD或肺纖維化相關肺高血壓、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性肺損傷(ALI)、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)、肺纖維化、肺氣腫(例如由香菸煙霧誘發之肺氣腫)、阻塞性細支氣管炎症候群(BOS)及囊腫性纖維化(CF)。

本發明之抗體或其片段亦適用於控制由NO/cGMP系統之紊亂表徵之中樞神經系統病症。其尤其適用於在認知障礙後改良感知、注意力、學習或記憶，該等認知障礙如尤其與情境/疾病/症候群相關發生之認知障礙，諸如輕度認知障礙、年齡相關之學習及記憶障礙、年齡相關之記憶喪失、血管性癡呆、顱腦創傷、中風、中風後發生之癡呆(中風後癡呆)、創傷後顱腦創傷、一般注意力障礙、具有學習及記憶問題之兒童的注意力障礙、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、路易體性癡呆(Lewy body dementia)、伴有額葉退化之癡呆(包括皮克氏症候群(Pick's syndrome))、帕金森氏病(Parkinson's disease)、進行性細胞核麻痹、伴有皮質基底核退化症之癡呆、肌萎縮性側索硬化(ALS)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、脫髓鞘、多發性硬化症、丘腦退化、庫賈氏癡呆(Creutzfeld-Jacob dementia)、HIV癡呆、伴有癡呆之精神分裂症或科爾薩科夫氏精神病(Korsakoff's psychosis)。其亦適用於治療及/或預防中樞神經系統病症，諸如焦慮、緊張及抑鬱狀態、CNS相關之性功能障礙及睡眠紊亂，以及適用於控制攝入食物、刺激劑及成癮物質之病理性紊亂。

此外，本發明之抗體或其片段亦適用於控制大腦血液流動速率且因此代表用於控制偏頭痛之有效藥劑。其亦適用於預防及控制腦梗塞(腦卒中)後遺症，諸如中風、大腦缺血及腦外傷。其亦可用於控制疼痛及耳鳴病況。

此外，本發明之抗體或片段具有消炎作用，且因此可用作治療及/或預防敗血症(SIRS)、多重器官衰竭(MODS、MOF)、腎臟之發炎性病症、慢性腸道炎症(IBD、克羅恩氏病、UC)、胰臟炎、腹膜炎、類風濕性病症、發炎性皮膚病及發炎性眼病之消炎劑。

此外，本發明之抗體或其片段亦可用於治療及/或預防自體免疫性疾病。 抗體或其片段亦適用於治療及/或預防內部器官(例如肺、心臟、腎臟、骨髓且尤其肝臟)之纖維化病症，以及皮膚纖維化及纖維化眼病。在本發明之情形中，術語纖維化病症尤其包括以下術語：肝纖維化、肝硬化、肺纖維化、心內膜心肌纖維化、腎病、絲球體腎炎、間質性腎纖維化、由糖尿病引起之纖維化損傷、由糖尿病引起之纖維化損傷、子宮肌瘤、子宮內膜異位、骨髓纖維化及類似纖維化病症、硬皮病、硬斑病、瘢痕瘤、肥大性瘢痕形成(亦在手術操作後)、痣、糖尿病性視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變及結締組織病症(例如類肉瘤病)。

本發明之抗體或其片段亦適用於控制手術後疤痕，例如由青光眼手術引起。

本發明之抗體或其片段亦可作為化妝品用於老化及角質化之皮膚。

此外，本發明之抗體或其片段適用於治療及/或預防肝炎、贅瘤、骨質疏鬆、青光眼及胃輕癱。

此外，本發明之抗體或其片段適用於治療及/或預防眼部病症，諸如對利尿鈉肽起反應之眼科疾病、視網膜病症、青光眼(包括原發性開角型青光眼(POAG))、閉角型青光眼以及先天性/發育性青光眼、視網膜病、眼部創傷、光學神經病變、眼部高血壓、眼內壓升高、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性(AMD)、年齡相關之眼病、黃斑水腫、鞏膜炎、葡萄膜炎、乾眼、角膜上皮磨損、角膜潰瘍。

此外，本發明之抗體或其片段適用於治療骨骼及軟骨病症，諸如對利尿鈉肽起反應之骨骼及軟骨疾病、關節炎、軟骨組織之退化性疾病、骨關節炎、軟骨退化、骨骼破裂、骨架發育不良、軟骨發育不全、骨質疏鬆、成骨不全、骨骼之佩吉特氏疾病(PDB)、代謝性骨骼疾病、年齡相關之骨骼疾病、骨髓炎、骨壞死、佝僂病、骨質軟化、生長板傷害及疾病、關節及骨骼更換相關之缺陷、馬凡氏症候群(Marfan syndrome)、運動損傷、肌肉營養不良、杜氏肌肉營養不良(Duchenne muscular dystrophy)。

因此，在另一態樣中，本發明係關於本發明之抗體或其片段之用途，其係用於治療及/或預防病症，尤其上文提及之病症。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段係用於治療及/或預防以下之方法中：心臟衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病症、腎功能衰竭、血栓栓塞病症、纖維化病症、骨架及骨骼病症、眼部病症及動脈硬化。

在另一態樣中，本發明係關於本發明之抗體或其片段之用途，其係用於製備用以治療及/或預防病症，尤其前述病症之藥劑。

在特定實施例中，本發明係關於本發明之抗體或其片段之用途，其係用於製備用以治療及/或預防以下之藥劑：心臟衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病症、腎功能衰竭、血栓栓塞病症、纖維化病症、癡呆病、動脈硬化、骨架及骨骼病症、眼部病症、侏儒症、軟骨發育不全及勃起功能障礙。

在另一態樣中，本發明係關於一種使用有效量之至少一種本發明之抗體或其片段治療及/或預防病症，尤其上文提及之病症之方法。

在特定實施例中，本發明係關於一種使用有效量之至少一種本發明之抗體或其片段治療及/或預防以下之方法：心臟衰竭、心絞痛、高血壓、肺高血壓、缺血、血管病症、腎功能衰竭、血栓栓塞病症、纖維化病症、腫瘤及致癌性疾病、骨架及骨骼病症、眼部病症、侏儒症軟骨發育不全及動脈硬化。

本發明之抗體或其根據本發明之片段可以單獨的藥劑形式或與一或多種其他治療劑投與且在一些情況下，抗體本身可為經修飾的。舉例而言，抗體或其片段可與化學實體結合，例如以進一步增加功效、穩定性及/或半衰期。特定言之，本發明之抗體或其片段可經聚乙二醇化及/或羥乙基澱粉化。

因此，在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與至少一種其他治療劑組合用於治療方法中，尤其用於上文所述之目的。

本發明亦提供醫藥組合，其包含至少一種本發明之抗體或其片段及至少一種其他治療劑。

在本發明之情形中，術語「醫藥組合」係如熟習此項技術者已知的使用，其可能用於諸如固定組合、非固定組合或分裝部分之套組之組合。

在本發明之情形中，術語「固定組合」係如熟習此項技術者已知的使用且定義為其中例如第一活性成分(諸如一或多種本發明之抗體或其片段)及另一種活性成分共同以一個單位劑量或單一實體(例如單一劑量調配物)形式存在之組合。「固定組合」之一個實例為醫藥組合物，其中第一活性成分與另一種活性成分存在於供同時投藥用的混合物中，諸如調配物。「固定組合」之另一實例為醫藥組合，其中第一活性成分與另一活性成分存在於一個單元中，而非存在於混合物中。因此，本發明提供此類醫藥組合物，其包含至少一種抗體或其片段及至少一種其他治療劑，尤其用於治療及/或預防前述病症。

在本發明之情形中，術語「非固定組合」及「分裝部分之套組」係如熟習此項技術者已知的使用且定義為其中第一活性成分及另一活性成分存在於超過一個單元(例如單獨的劑量調配物)中之組合。非固定組合或分裝部分之套組之一個實例為其中第一活性成分與另一活性成分單獨存在之組合。

非固定組合或分裝部分之套組之組分有可能單獨、依序、同時、並行或按交錯時間順序投與。

本發明之抗體或其片段可與該另一種治療活性劑同時、在其之前或在其之後投與。在本發明之情形中，術語「同時」意謂在同一天，更特定言之在12小時內，更特定言之，在2小時內投與本發明之抗體或其片段及至少一種另外的治療活性劑。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段及至少一種另外的治療活性劑之投藥係在連續八週內，更特定言之，在連續一至六週內進行。本發明之抗體或其片段及至少一種另外的治療活性劑可經由相同途徑或經由不同途徑投與。

本發明之抗體或其片段可例如與相同適應症治療組之已知藥劑組合，諸如用於治療及/或預防與以下相關之疾病及/或病狀之藥劑：高血壓、心臟衰竭、肺高血壓、COPD、哮喘、囊腫性纖維化、軟骨發育不全、高磷酸鹽血症、慢性腎病(CKD)、軟組織鈣化、慢性腎病相關之鈣化、非慢性腎病相關之鈣化、介質鈣化(包括蒙氏內側硬化(Moenckeberg's medial sclerosis))、動脈粥樣硬化、內膜鈣化、CKD相關之心臟肥大、CKD相關之腎變性、骨質疏鬆、絕經後骨質疏鬆、糖尿病II、慢性腎病、老化、低磷酸鹽尿、副甲狀腺高能症、維生素D病症、維生素K不足、維生素K拮抗性凝集劑、川崎病(Kawasaki disease)、ACDC (由CD73不足引起之動脈鈣化)、GACI (嬰兒期廣泛性動脈鈣化)、IBGC (特發性基底節鈣化)、PXE (彈性假黃瘤)、類風濕性關節炎、休-梅氏症候群(Singleton-Merten syndrome)、P-地中海貧血、鈣過敏、異養骨化、早產胎盤鈣化、子宮鈣化、鈣化之子宮肌瘤、莫氏病(morbus fahr)、主動脈瓣膜之微鈣化及鈣化。

其他適合與本發明之抗體或其片段組合之治療劑之較佳實例： ─ 有機硝酸酯及NO供體，例如硝普鈉、硝化甘油、異山梨糖醇單硝酸酯、異山梨糖醇二硝酸酯、嗎多明(molsidomine)或SIN-1及吸入之NO； ─ 抑制環單磷酸鳥苷(cGMP)分解之化合物，例如磷酸二酯酶(PDE)1、2及/或5之抑制劑，尤其PDE 5抑制劑，諸如西地那非(sildenafil)、伐地那非(vardenafil)、他達那非(tadalafil)、烏地那非(udenafil)、迪薩他非(desantafil)、阿伐那非(avanafil)、米羅那非(mirodenafil)、羅地那非(lodenafil)或PF-00489791； ─ 抗血栓劑，例如及較佳來自以下之群：血小板凝集抑制劑、抗凝劑或促纖維蛋白溶解物質； ─ 降血壓活性成分，例如及較佳來自以下之群：鈣拮抗劑、血管收縮素AII拮抗劑、ACE抑制劑、NEP抑制劑、血管肽酶抑制劑、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、α-受體阻斷劑、β-受體阻斷劑、鹽皮質激素受體拮抗劑、rho-激酶抑制劑及利尿劑； ─ 抗心律不齊藥劑，例如及較佳來自以下之群：鈉離子通道阻斷劑、β-受體阻斷劑、鉀通道阻斷劑、鈣拮抗劑、If通道阻斷劑、洋地黃、副交感神經阻斷劑(瓦格力提(vagoliytics))、擬交感神經藥及其他抗心律不整藥，諸如腺苷、腺苷受體促效劑以及維納卡蘭(vernakalant)； ─ 正性肌力劑，例如心肌糖苷(多戈星(Dogoxin))、β-腎上腺素及多巴胺激導性促效劑，諸如異丙基腎上腺素、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺或多巴酚丁胺； ─ 升壓素受體拮抗劑，例如及較佳來自以下之群：考尼伐坦(conivaptan)、托伐普坦(tolvaptan)、利希普坦(lixivaptan)、莫紮伐普坦(mozavaptan)、薩特普坦(satavaptan)、SR-121463、RWJ 676070或BAY 86-8050，以及WO 2010/105770、WO 2011/104322及WO 2016/071212中描述之化合物； ─ 改變脂質代謝之活性成分，例如及較佳來自以下之群：甲狀腺受體促效劑、PCSK9抑制劑、膽固醇合成抑制劑(諸如且更佳為HMG-CoA還原酶抑制劑或角鯊烯合成抑制劑)、ACAT抑制劑、CETP抑制劑、MTP抑制劑、PPAR-α、PPAR-γ及/或PPAR-δ促效劑、膽固醇吸收抑制劑、脂肪酶抑制劑、聚合膽酸吸收劑、膽酸再吸收抑制劑及脂蛋白(a)拮抗劑； ─ 消炎劑，例如及較佳來自以下之群：糖皮質激素，諸如且更佳為強的松(prednison)、強的松龍(prednisolon)、甲基強的松龍、曲安西龍(triamcinolon)、地塞米松(dexamethason)、貝克沙松(beclomethason)、貝他米松(betamethason)、福尼索德(flunisolid)、布地索德(budesonid)或福替卡松(fluticason)，以及非類固醇消炎劑(NSAID)，例如且更佳為乙醯基水楊酸(阿司匹林(aspirin))、布洛芬(ibuprofen)及萘普生(naproxen)、5-胺基水楊酸衍生物、白三烯拮抗劑、TNF-α抑制劑及趨化因子受體拮抗劑，諸如CCR1、2及/或5抑制劑； ─ 抑制信號轉導級聯之藥劑，例如及較佳來自以下之群：激酶抑制劑，例如及較佳來自以下之群：酪胺酸激酶及/或絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑； ─ 抑制細胞外基質之降解及修飾之藥劑，例如及較佳來自以下之群：基質-金屬蛋白酶(MMP)抑制劑，例如及較佳來自以下之群：凝乳酶、基質溶解素、膠原酶、白明膠酶及聚集素酶(較佳來自以下之群：MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11及MMP-13)以及金屬彈性蛋白酶(MMP-12)及嗜中性白血球-彈性蛋白酶(HNE)，例如西維來司他(sivelestat)或DX-890； ─ 阻斷血清素與其受體之結合之藥劑，例如及較佳為5-HT2b-受體之拮抗劑； ─ 抗纖維化劑，例如及較佳為尼達尼布(nintedanib)、吡非尼酮(pirfenidone)、腺苷A2b受體拮抗劑、神經鞘胺醇-1-磷酸受體3(S1P3)拮抗劑、自分泌運動因子抑制劑、溶血磷脂酸受體1 (LPA-1)及溶血磷脂酸受體2 (LPA-2)拮抗劑、離胺酸氧化酶(LOX)抑制劑、類離胺酸氧化酶-2抑制劑、CTGF抑制劑、IL-13拮抗劑、整合素拮抗劑、TGF-β拮抗劑、wnt信號傳導抑制劑、CCR2拮抗劑； ─ 充當支氣管擴張劑之藥劑，例如及較佳為5-HT2b-受體之拮抗劑；β2 (「β二」)-腎上腺素促效劑(短效及長效)、抗膽鹼激導性劑及茶鹼； ─ 作為細胞介素及趨化因子之拮抗劑之藥劑，例如及較佳為TGF-β、CTGF、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13、IL-25、IL-33、TSLP及整合素之拮抗劑； ─ 有機硝酸及NO供體，例如及較佳為硝普鈉(sodium nitroprussid)、硝基丙三醇、單硝酸異山梨酯、二硝酸異山梨酯、嗎多明(molsidomine)或SIN-1，以及吸入之NO； ─ 可溶性鳥苷酸環化酶之NO獨立性，但血紅素依賴性刺激劑，例如及較佳為WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301、WO 03/095451、WO 2011/147809、WO 2012/004258、WO 2012/028647及WO 2012/059549中描述之化合物； ─ 可溶性鳥苷酸環化酶之NO獨立性及血紅素獨立性活化劑，例如及較佳為WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/19780、WO 02/070462及WO 02/070510中描述之化合物； ─ 刺激cGMP合成之藥劑，例如sGC調節劑，例如及較佳為瑞司瓜特(riociguat)、茨納瓜特(cinaciguat)、維瑞瓜特(vericiguat)； ─ 前列腺環素類似物或IP受體促效劑，例如及較佳為伊洛前列素(iloprost)、貝前列素(beraprost)、曲前列腺環素(treprostinil)、依前列醇(epoprostenol)或司西帕格(Selexipag)； ─ 內皮素受體拮抗劑，例如及較佳為波生坦(Bosentan)、達盧生坦(Darusentan)、安立生坦(Ambrisentan)或西他生坦(Sitaxsentan)； ─ 抑制可溶性環氧化物酶(sEH)之藥劑，例如及較佳為N,N'-二-環己基脲、12-(3-金剛烷-1-基-脲基)-十二酸或1-金剛烷-1-基-3-{5-[2-(2-乙氧基乙氧基)乙氧基]戊基}-脲； ─ 與葡萄糖代謝相互作用之藥劑，例如及較佳為胰島素、二胍、噻唑啶二酮、磺醯基脲、阿卡波糖(acarbose)、DPP4抑制劑、GLP-1類似物或SGLT-1抑制劑； ─ 利尿鈉肽，例如及較佳為心房利尿鈉肽(ANP，卡培立肽(Carperitide))、腦部利尿鈉肽(BNP，奈西立肽(Nesiritide))、C型利尿鈉肽(CNP)或尿擴張素； ─ 利尿鈉肽衍生物，例如及較佳為森德立肽(cenderitide)、PL 3994； ─ 心肌肌凝蛋白活化劑，例如及較佳為奧米卡比(omecamtiv mecarbil)(CK-1827452)； ─ 鈣敏化劑，例如及較佳為左西孟旦(levosimendan)； ─ 影響心臟能量代謝之藥劑，例如及較佳為乙莫克舍(etomoxir)、二氯乙酸酯、雷諾嗪(ranolazine)或曲美他嗪(trimetazidine)、完全或部分腺苷A1受體促效劑，諸如GS-9667 (先前稱為CVT-3619)、卡帕諾松(capadenoson)及尼拉諾松(neladenoson)； ─ 影響心跳速率之藥劑，例如及較佳為伊伐布雷定(ivabradin)。

抗血栓劑較佳理解為意謂來自以下之群的化合物：血小板凝集抑制劑、抗凝劑或促纖維蛋白溶解物質。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與血小板凝集抑制劑組合投與，例如及較佳為阿司匹林(aspirin)、克羅匹多(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、替卡格雷(ticagrelor)、替洛匹定(ticlopidin)或雙嘧達莫(dipyridamole)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與凝血酶抑制劑組合投與，例如及較佳為希美加群(ximelagatran)、達比加群(dabigatran)、美拉加群(melagatran)、比伐盧定(bivalirudin)或克力先(clexane)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與GPIIb/IIIa拮抗劑組合投與，例如及較佳為替羅非班(tirofiban)或阿昔單抗(abciximab)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與因子Xa抑制劑組合投與，例如及較佳為利伐沙班(rivaroxaban)、DU-176b、阿派沙班(apixaban)、貝曲沙班(betrixaban)、奧米沙班(otamixaban)、費德沙班(fidexaban)、雷紮沙班(razaxaban)、立他沙班(letaxaban)、艾瑞沙班(eribaxaban)、方達珀魯(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、PMD-3112、達瑞沙班(darexaban)(YM-150)、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512或SSR-128428。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與肝素或低分子量(LMW)肝素衍生物組合投與。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與維生素K拮抗劑組合投與，例如及較佳為香豆素。

低血壓劑較佳理解為意謂來自以下之群的化合物：鈣拮抗劑、血管緊張素AII拮抗劑、ACE抑制劑、內皮素拮抗劑、腎素抑制劑、α受體阻斷劑、β受體阻斷劑、鹽皮質激素受體拮抗劑、rho激酶抑制劑及利尿劑。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與鈣拮抗劑組合投與，例如及較佳為硝苯地平(nifedipine)、胺氯地平(amlodipine)、維拉帕米(verapamil)或地爾硫卓(diltiazem)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與α-1-受體阻斷劑組合投與，例如及較佳為哌唑嗪(prazosin)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與β-受體阻斷劑組合投與，例如及較佳為普萘洛爾(propranolol)、阿替洛爾(atenolol)、噻嗎洛爾(timolol)、品多洛爾(pindolol)、阿普洛爾(alprenolol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、布拉洛爾(bupranolol)、美替洛爾(metipranolol)、納多洛爾(nadolol)、甲吲洛爾(mepindolol)、卡拉洛爾(carazalol)、索他洛爾(sotalol)、美托洛爾(metoprolol)、倍他洛爾(betaxolol)、塞利洛爾(celiprolol)、比索洛爾(bisoprolol)、卡替洛爾(carteolol)、艾司洛爾(esmolol)、拉貝洛爾(labetalol)、卡維洛爾(carvedilol)、阿達洛爾(adaprolol)、蘭迪洛爾(landiolol)、奈必洛爾(nebivolol)、依泮洛爾(epanolol)或布新洛爾(bucindolol)。

在特定實施例中本發明之抗體或其片段與血管收縮素AII拮抗劑組合投與，例如及較佳為氯沙坦(losartan)、坎地沙坦(candesartan)、纈沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)或恩布沙坦(embusartan)或雙重血管收縮素AII拮抗劑/腦啡肽酶抑制劑，例如及較佳為LCZ696 (纈沙坦/沙庫必曲(sacubitril))。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與ACE抑制劑組合投與，例如及較佳為依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、賴諾普利(lisinopril)、雷米普利(ramipril)、地拉普利(delapril)、福辛普利(fosinopril)、奎諾普利(quinopril)、培哚普利(perindopril)或特多普利(trandopril)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與內皮素拮抗劑組合投與，例如及較佳為波生坦(bosentan)、達盧生坦(darusentan)、安立生坦(ambrisentan)或西他生坦(sitaxsentan)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與腎素抑制劑組合投與，例如及較佳為阿力克倫(aliskiren)、SPP-600或SPP-800。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與鹽皮質激素受體拮抗劑組合投與，例如及較佳為非瑞桐(finerenone)、螺內酯或依普利酮(eplerenone)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與以下組合投與：亨氏環利尿劑(loop diuretic)，例如呋喃苯胺酸(furosemide)、托拉塞米(torasemide)、布美他尼(bumetanide)及吡咯他尼(piretanide)；留鉀利尿劑，例如胺氯吡脒(amiloride)及胺苯喋啶(triamterene)；醛固酮拮抗劑，例如螺內酯、坎利酸鉀及依普利酮；以及噻嗪利尿劑，例如氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、希伯胺(xipamide)及吲達帕胺(indapamide)。

脂質代謝修飾劑較佳理解成意謂來自以下之群的化合物：CETP抑制劑、甲狀腺受體促效劑、膽固醇合成抑制劑(諸如HMG-CoA還原酶抑制劑或角鯊烯合成抑制劑)、ACAT抑制劑、MTP抑制劑、PPAR-α、PPAR-γ及/或PPAR-δ促效劑、膽固醇吸收抑制劑、聚合膽酸吸收劑、膽酸再吸收抑制劑、脂肪酶抑制劑及脂蛋白(a)拮抗劑。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與CETP抑制劑組合投與，例如及較佳為達塞曲匹(dalcetrapib)、安特普(anacetrapib)、托徹普(torcetrapib)(CP至529 414)、JJT-705或CETP疫苗(Avant)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與甲狀腺受體促效劑組合投與，例如及較佳為D-甲狀腺素、3,5,3'-三碘甲狀腺素(T3)、CGS 23425或阿昔替羅(axitirome)(CGS 26214)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與來自士他汀(statins)類之HMG-CoA還原酶抑制劑組合投與，例如及較佳為洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)或匹伐他汀(pitavastatin)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與角鯊烯合成抑制劑組合投與，例如及較佳為BMS-188494或TAK-475。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與ACAT抑制劑組合投與，例如及較佳為阿伐麥布(avasimibe)、甲亞油醯胺(melinamide)、帕替醯胺(pactimibe)、艾弗醯胺(eflucimibe)或SMP-797。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與MTP抑制劑組合投與，例如及較佳為英普他派(implitapide)、BMS-201038、R-103757或JTT-130。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與PPAR-γ促效劑組合投與，例如及較佳為吡格列酮(pioglitazone)或羅格列酮(rosiglitazone)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與PPAR-δ促效劑組合投與，例如及較佳為GW 501516或BAY 68-5042。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與膽固醇吸收抑制劑組合投與，例如及較佳為依澤替米貝(ezetimibe)、替曲希德(tiqueside)或帕瑪希德(pamaqueside)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與脂肪酶抑制劑組合投與，較佳實例為羅氏鮮(orlistat)。

在特定實施例中,本發明之抗體或其片段與聚合膽酸吸收劑組合投與，例如及較佳為消膽胺(cholestyramine)、考來替潑(colestipol)、科立索瓦(colesolvam)、考來膠(CholestaGel)或科利醯胺(colestimide)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與膽酸再吸收抑制劑組合投與，例如及較佳為ASBT (=IBAT)抑制劑，例如AZD-7806、S-8921、AK-105、BARI-1741、SC-435或SC-635。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與脂蛋白(a)拮抗劑組合投與，例如及較佳為吉卡賓鈣(gemcabene calcium)(CI-1027)或菸鹼酸。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與脂蛋白(a)拮抗劑組合投與，例如及較佳為吉卡賓鈣(CI-1027)或菸鹼酸。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與sGC調節劑組合投與，例如及較佳為瑞司瓜特、茨納瓜特或維瑞瓜特。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與影響葡萄糖代謝之藥劑組合投與，例如及較佳為胰島素、磺醯基脲、阿卡波糖、DPP4抑制劑、GLP-1類似物或SGLT-1抑制劑。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與TGFβ拮抗劑組合投與，例如及較佳為吡非尼酮、尼達尼布或福萊索單抗(fresolimumab)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與CCR2拮抗劑組合投與，例如及較佳為CCX-140。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與TNFα拮抗劑組合投與，例如及較佳為阿達木單抗(adalimumab)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與半乳糖凝集素-3抑制劑組合投與，例如及較佳為GCS-100。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與Nrf-2抑制劑組合投與，例如及較佳為巴多曲龍(bardoxolone)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與BMP-7促效劑組合投與，例如及較佳為THR-184。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與NOX1/4抑制劑組合投與，例如及較佳為GKT-137831。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與影響維生素代謝之藥劑組合投與，例如及較佳為促鈣三醇(calcitriol)、阿法骨化醇(alfacalcidol)、度骨化醇(doxercalciferol)、馬沙骨化醇(maxacalcitol)、帕利骨化醇(paricalcitol)、膽鈣化醇(cholecalciferol)或帕拉骨化醇(paracalcitol)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與細胞生長抑制劑組合投與，例如及較佳為環磷醯胺。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與免疫抑制劑組合投與，例如及較佳為環孢菌素。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與磷酸結合劑組合投與，例如及較佳為考來替蘭(colestilan)、鹽酸司維拉姆(sevelamer hydrochloride)及碳酸司維拉姆(sevelamer carbonate)、鑭及碳酸鑭。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與腎近端小管磷酸鈉共轉運體組合投與，例如及較佳為菸酸或菸鹼醯胺。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於副甲狀腺高能症之療法之擬鈣劑組合投與。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於缺鐵療法之藥劑組合投與，例如及較佳為鐵產品。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於高尿酸血症之療法之藥劑組合投與，例如及較佳為安樂普利諾(allopurinol)或拉布立酶(rasburicase)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於貧血之療法之糖蛋白激素組合投與，例如及較佳為紅血球生成素。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於免疫療法之生物製劑組合投與，例如及較佳為阿巴西普(abatacept)、利妥昔單抗(rituximab)、依庫珠單抗(eculizumab)或貝利單抗(belimumab)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於治療心臟衰竭之升壓素拮抗劑(瓦普坦(vaptanes)之群)組合投與，例如及較佳為托伐普坦(tolvaptan)、考尼伐坦(conivaptan)、利希普坦(lixivaptan)、莫紮伐普坦(mozavaptan)、薩特普坦(satavaptan)或瑞科普坦(relcovaptan)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與Jak抑制劑組合投與，例如及較佳為盧佐替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、CYT387、GSK2586184、來他替尼(lestaurtinib)、帕瑞替尼(pacritinib)(SB1518)或TG101348。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與用於微血栓之療法之前列腺環素類似物組合投與。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與鹼金屬療法組合投與，例如及較佳為碳酸氫鈉。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與mTOR抑制劑組合投與，例如及較佳為依維莫司(everolimus)或雷帕黴素(rapamycin)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與NHE3抑制劑組合投與，例如及較佳為AZD1722或替那帕諾(tenapanor)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與eNOS調節劑組合投與，例如及較佳為沙丙蝶呤(sapropterin)。

在特定實施例中，本發明之抗體或其片段與CTGF抑制劑組合投與，例如及較佳為FG-3019。

用於本發明之治療方法中之抗體或其片段可使用一或多種生理學上可接受之載劑或賦形劑以任何習知方式調配。本發明之抗體或其片段可藉由任何適合的手段投與，該手段可視所治療之病症之類型而變化。可能的投藥途徑包括腸內(例如口服)、非經腸(例如靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、心內、室內、鞘內、髓內、病灶內)、肺內及鼻內投藥。此外，本發明之抗體或其片段可藉由脈衝輸注在例如降低劑量之抗體或其片段之情況下投與。較佳地，部分視病狀為急性或慢性而定，藉由注射，最佳靜脈內或皮下注射來給藥。所投與之量將取決於多種因素，諸如個體之臨床症狀、性別、年齡及/或體重、是否投與其他藥物等。熟習此項技術者將認識到，投藥途徑將視所治療之病症或病狀而變化。

非經腸遞送之方法包括局部、動脈內、瘤內、肌肉內、皮下、髓內、鞘內、室內、靜脈內、腹膜內或鼻內投藥。

在特定實施例中，治療方法包含抗體或其片段或包含其之醫藥組合物之單次或多次投藥。投藥之單次劑量可相同或不同。特定言之，治療方法包含本發明之抗體或其片段之1、2、3、4、5或6次投藥，較佳其中多次投藥在連續的一至六個月內進行。視本發明之抗體或其片段之半衰期及清除率而定，其可例如每3至4天一次、每週一次、每兩週一次或每三週一次投與。

實例 實例 1 ： 構築候選 TPP - 5661 藉由以下方式設計候選TPP-5661：使包含Ntls、野生型大鼠ANP及Ctls之異源胺基酸序列藉由用異源胺基酸序列之兩個N端殘基取代HV 3-23之兩個C端殘基而與HV 3-23 (SEQ ID NO 85)之C端融合且藉由用異源胺基酸序列之9個C端殘基取代IGHJ1之九個N端殘基而與IGHJ1 (SEQ ID NO 86)之N端融合。SEQ ID NO 67之相應全長重鏈序列進一步包含胺基酸序列恆定-H (SEQ ID NO 87)。

藉由組合序列LV 1-40 (SEQ ID NO 88)、IGLJ2 (SEQ ID NO 89)及恆定-L (SEQ ID NO 90)而建構的具有所插入之大鼠ANP (rANP)之SEQ ID NO 67之全長重鏈序列與SEQ ID NO 66之全長輕鏈序列之配對，產生完全IgG候選TPP-5661 (參見表1)。

下文展示全長重鏈序列(SEQ ID NO 67)；併入之異源胺基酸序列(Ntls-rANP-Ctls)帶下劃線；源於HV 3-23及IGHJ1之序列以粗體展示：

根據此項技術中熟知的方法選殖經設計及合成之抗體構築體且使用質體特異性寡核苷酸藉由DNA測序來確認。

實例 2 ： 在抗體 - CDR 內插入 NP 引起 血清半衰期延長 活體內藥物動力學參數之測定 在雄性威斯塔大鼠(Wistar rat)(n=3)中之5 mg/kg之靜脈內投藥之後測定的TPP-10992 (SEQ ID NO 76及SEQ ID NO 66)及TPP-5661 (SEQ ID NO 67及SEQ ID NO 66)之藥物動力學參數。經由尾部靜脈以快速注射形式投與TPP-10992及TPP-5661。以至多14天(336小時)之時間間隔，經由預先植入之導管自頸靜脈收集血液樣品。在-20℃下儲存所產生之EDTA-血漿直至進一步分析。

使用抗人類IgG ELISA (酶聯結免疫吸附分析法)格式進行血漿樣品中TPP-10992及TPP-5661之定量。使用非分區資料分析自血漿濃度時間概況計算藥物動力學參數。

在靜脈內投藥之後隨時間推移的TPP-10992及TPP-5661之平均血漿濃度以圖形方式描繪於圖1中。

TPP-10992及TPP-5661之平均清除率及終末半衰期概述於以下表2中。

表 2 ： 大鼠中在 5 mg / kg 之靜脈內投藥之後的 TPP - 10992 及 TPP - 5661 之平均清除率 ( CL ) 及終末半衰期 ( t_{1 / 2} ) 。

活體內藥物動力學參數之測定 在向雌性Balb/c小鼠(n=3)腹膜內投藥之後測定TPP-12897之藥物動力學參數。在施用後15分鐘至72小時收集血液樣品。在-20℃下儲存所產生之EDTA-血漿直至進一步分析。藉由抗人類IgG (免疫球蛋白G)ELISA格式進行血漿樣品中TPP-12897之定量。

使用非分區資料分析自血漿濃度時間概況計算藥物動力學參數。

在腹膜內投藥之後隨時間推移的TPP-12897之平均血漿濃度以圖形方式描繪於圖2中。

TPP-12897之平均曲線下面積(AUC)及終末半衰期概述於以下表3中。

表 3 ： 小鼠中在 5 mg / kg 之腹膜內投藥之後的 TPP - 12897 之平均曲線下面積 ( AUC ) 及終末半衰期 ( t_{1 / 2} ) 。

實例 3 ： NP 植入抗體 之 活體外、離體及活體內效能 NPR - A 受體細胞株中 ANP 植入抗體之活性資料 如先前所描述產生基於發光之大鼠ANP受體(NPR-A)細胞株(Wunder等人 (2013),Eur J Pharmacol . 698: 131)。因此，藉由用編碼CNGA2 (cGMP生物感測器)及大鼠NPR-A之質體構築體共轉染穩定表現螢光鈣感測器蛋白質GCaMP6之CHO細胞株來產生基於螢光之大鼠ANP受體(NPR-A)細胞株。

在黑色、透明底部384孔微量滴定盤(2500細胞個/孔)上培養ANP受體GCaMP6細胞一天。在移除細胞培養基之後，在37℃及5% CO₂ 下，將含有黑色掩蔽染料之Tyrode (130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂ 、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂ 、4.8 mM NaHCO₃ ，在pH 7.4下)給予報導子細胞20分鐘。使用IBMX (0.2 mM)防止由內源性磷酸二酯酶引起之cGMP降解。

在促效劑添加後直接開始螢光量測(3 min，動力學模式)。在含有黑色掩蔽染料及0.1% BSA之Tyrode中添加受體配位體。在FLIPR Tetra®上進行量測。

ANP (Bachem，H-2100)刺激NPR-A細胞株上之濃度依賴性螢光信號，其中EC₅₀ 值為0.22 nM。TPP-5661及TPP-10992刺激大鼠ANP受體報導體細胞株，其中EC₅₀ 值分別為17 nM及180 nM。對照抗體構築體TPP-5657不顯著刺激NPR-A細胞株(在至多460 nM之最大濃度下測試)。

為了測定針對蛋白水解降解之敏感性，亦在與0.6 µg/ml之中性內肽酶(NEP，R&D Systems，1182-ZNC)或0.6 µg/ml之胰島素降解酶(IDE，Merck，407241-50UG)一起在37℃下培育4小時之後表徵受體配位體之活性。

圖3以圖形方式描繪ANP (A-C)、TPP-10992 (D-F)及TPP-5661 (G-I)針對蛋白水解降解之穩定性。如圖3中所示，利尿鈉肽ANP (Bachem，H-2100)對由NEP及IDE引起之降解展示高敏感性。相反，TPP-5661及TPP-10992對由NEP及IDE引起之蛋白水解降解展示高抗性。

NPR - A 受體細胞株中 BNP 植入抗體之活性資料 如先前所描述產生基於發光之大鼠BNP受體(NPR-A)細胞株(Wunder等人 (2013),Eur J Pharmacol . 698: 131)。因此，藉由用編碼CNGA2 (cGMP生物感測器)之質體構築體及大鼠NPR-A共轉染穩定表現螢光鈣感測器蛋白質GCaMP6之CHO細胞株來產生基於螢光之大鼠BNP受體(NPR-A)細胞株。

在黑色、透明底部384孔微量滴定盤(2500細胞個/孔)上培養BNP受體GCaMP6細胞一天。在移除細胞培養基之後，在37℃及5% CO₂ 下，將含有黑色掩蔽染料之Tyrode (130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl₂ 、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂ 、4.8 mM NaHCO₃ ，在pH 7.4下)給予報導子細胞20分鐘。使用IBMX (0.2 mM)防止由內源性磷酸二酯酶引起之cGMP降解。

在促效劑添加後直接開始螢光量測(3 min，動力學模式)。在含有黑色掩蔽染料及0.1% BSA之Tyrode中添加受體配位體。在FLIPR Tetra®上進行量測。

BNP (Bachem，H-5968)刺激NPR-A細胞株上之濃度依賴性螢光信號，其中EC₅₀ 值為2.9 nM。TPP-9902、TPP-11153、TPP-1154、TPP-11155、TPP-11156及TPP-11157刺激大鼠BNP受體報導體細胞株，其中EC₅₀ 值分別為2.3 µM、＞1.9 µM、7 nM、12 nM、1.2 µM及11 nM。對照抗體構築體TPP-5657不顯著刺激NPR-A細胞株(在至多460 nM之最大濃度下測試)。

為了測定針對蛋白水解降解之敏感性，亦在與0.6 µg/ml之中性內肽酶(NEP，R&D Systems，1182-ZNC)或0.6 µg/ml之胰島素降解酶(IDE，Merck，407241-50UG)一起在37℃下培育4小時之後表徵受體配位體之活性。利尿鈉肽BNP (Bachem，H-5968)對由NEP及IDE引起之降解展示高敏感性。相反，TPP-11155及TPP-11157對由NEP及IDE引起之蛋白水解降解展示高抗性。

圖4以圖形方式描繪BNP (A-C)及TPP-11155 (D-F)針對蛋白水解降解之穩定性。

NPR - B 受體細胞株中 CNP 植入抗體之活性資料 如先前所描述產生基於發光之大鼠CNP受體(NPR-B)報導體細胞株及進行發光量測(Wunder等人 (2013),Eur J Pharmacol . 698: 131)。

在不透明384孔微量滴定盤上培養CNP受體細胞(2500個細胞/孔)1天。在移除細胞培養基之後，在37℃及5% CO₂ 下，給予細胞於Tyrode (130 mM NaCl、5 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM MgCl₂ 、4.8 mM NaHCO₃ ，在pH 7.4下)中之2.5 µg/ml不含Ca^{2 +} 之腔腸素3小時。在含有0.1% BSA之不含Ca^{2 +} 之Tyrode中經10分鐘添加受體配位體。使用IBMX (0.2 mM)防止由內源性磷酸二酯酶引起之cGMP降解。在即將添加鈣離子(最終濃度3 mM)之前，在避光盒中使用電荷耦合裝置(CCD)相機開始發光量測。持續監測發光50秒。

CNP (Bachem，H-1296)刺激大鼠NPR-B細胞株上之濃度依賴性發光信號，其中EC₅₀ 值為0.024 nM。TPP-9465、TPP-12377、TPP-12378、TPP-12897及TPP-12899刺激大鼠CNP受體報導體細胞株，其中EC₅₀ 值分別為5.2 nM、4.1 nM、25 nM、10 nM及3.2 nM。TPP-12374刺激大鼠CNP受體報導體細胞株，其中EC₅₀ 值為150 nM，且TPP-12375、TPP-12376僅展示弱活性跡象。

為了測定針對蛋白水解降解之敏感性，亦在與0.6 µg/ml之中性內肽酶(NEP，R&D Systems，1182-ZNC)或0.6 µg/ml之胰島素降解酶(IDE，Merck，407241-50UG)一起在37℃下培育4小時之後表徵受體配位體之活性。

與利尿鈉肽CNP (Bachem，H-1296)相反，TPP-12377、TPP-12897及TPP-12899對由NEP及IDE引起之蛋白水解降解展示高抗性。

圖5以圖形方式描繪CNP (A-C)及TPP-12897 (D-F)針對蛋白水解降解之穩定性。

藉由經分離之大鼠主動脈環測定之 ANP 植入抗體之活性資料 所有實驗係根據機構指南進行且由當地動物實驗委員會批准。用戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)(40 mg/kg，腹膜內)使雄性史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat)(體重250-300 g)麻醉，藉由斷頭術殺死且放血。切除胸部主動脈且置放於含有以下組成之冰冷的Krebs緩衝液中：130 mM NaCl、14.9 mM NaHCO₃ 、5.5 mM右旋糖、4.7 mM KCl、1.18 mM KH₂ PO₄ 、1.17 mM MgSO₄ 7H₂ O及1.6 mM CaCl₂ 2H₂ O。將容器釘在填充有經冷卻的克氏溶液(Krebs'solution)之Sylgard皮氏培養皿(Petri dish)中，清洗脂肪及結締組織，且切割成長度為約3至4 mm之環段。在37℃下，將主動脈環垂直安裝於含有克氏溶液之50 ml腔室(ADIinstruments)中，用95% O₂ 及5% CO₂ 之混合物連續鼓泡。使用PowerLab資料獲取系統(軟體Lab Chart 7.0)記錄等距力之變化。

在平衡週期之後，用80 mM KCl攻擊主動脈環以檢驗組織存活率。接著，在用苯腎上腺素(PE，1 μM)預先收縮之容器中，藉由檢驗對乙醯膽鹼(ACh，1 μM)之反應來測定製劑之內皮完整性。在洗滌及平衡週期之後，使用苯腎上腺素(PE，1 μM)誘導收縮，隨後針對血管舒張評估利尿鈉肽及利尿鈉肽植入IgG。使用大鼠ANP肽(ADH-GM-10057T，Santai Labs)作為參考。

如圖6中所示，ANP肽及TPP-10992皆誘導PE收縮之主動脈環中之劑量依賴性血管擴張。

如圖7中所示，ANP肽及TPP-5661皆誘導PE收縮之主動脈環中之劑量依賴性血管擴張。

在有意識的大鼠中獲得之 ANP 植入抗體之活性資料 藉由無線電遙測(Data Sciences International)在自由移動的有意識的動物中監測血壓及心跳速率。體重為210-300 g之雌性自發性高血壓大鼠(SHR/N Crl BR，Charles River)用於此等研究。所有動物在22-24℃環境溫度下圈養於個別籠子中且維持12小時光照/黑暗循環，隨意自由獲得標準實驗室大鼠食物及水。在動物用於血壓量測之前最少14天進行遙測儀(HD-10，DSI)植入。在無菌條件下進行手術。在將腹壁刮毛之後，切開腹部的正中間位置，且將流體填充之感測器導管向上插入髂分叉與腎動脈之間的暴露之降主動脈中。根據DSI指南，遙測導管之頂端位於腎動脈之尾側且由組織黏著劑固定。在閉合腹部之前，使傳輸器本體附著至內腹膜壁。關於針對感染及疼痛之手術後保護措施，注射單一劑量之抗生素(Oxytetracyclin® 10%，60 mg/kg皮下，0.06 ml/100 g體重，Beta-Pharma GmbH & Co, Germany)及鎮痛劑(Rimadyl®，4 mg/kg皮下，Pfizer, Germany)。藉由DSI軟體進行遙測資料獲取，針對樣品血液動力學資料預定成10秒，每5分鐘重複一次。在藥物投藥之前至少2小時開始資料收集且在量測循環完成之後結束。資料表示為至少4隻動物/組之基礎值±SEM之百分比。各動物之基礎值計算為在物質施用之前兩小時(7:00 -9:00 AM)量測之值之平均值。接著，資料表示為每半小時之平均值，自施用後15分鐘開始。藉由單次腹膜內(ip)施用溶解於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中之測試物質來處理所有動物。在9:00 AM (第0小時)進行藥物投藥。

ANP肽之血液動力學作用以圖形方式描繪於圖8中。TPP-5661之血液動力學作用以圖形方式描繪於圖9中。TPP-10992之血液動力學作用以圖形方式描繪於圖10中。

實例 4 ：產生不同的 NP 植入抗體構築體 關於在除CDRH3以外的CDR區中合併有利尿鈉肽之構築體，藉由使三個殘基延伸部分Leu Thr Gly (IGHD7-27*01)與HV 3-23之C端及IGHJ1之N端(比較實例1)融合來設計可能的功能性中性CDRH3。SEQ ID NO 65之相應全長重鏈序列進一步包含胺基酸序列恆定-H (SEQ ID NO 87)。

無任何利尿鈉肽插入物之SEQ ID NO 65之全長重鏈序列與實例1中描述之SEQ ID NO 66之全長輕鏈序列之配對產生合成及可能的中性IgG陰性對照物TPP-5657。

根據此項技術中熟知的方法選殖經設計及合成之抗體構築體且使用質體特異性寡核苷酸藉由DNA測序來確認。

以此抗體骨架為起始物質，產生以下ANP植入抗體構築體。

表 4 ： ANP 植入抗體構築體之設計

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目

表 4 續： ANP 植入抗體構築體之設計

³ N端序列對應於在參考aa與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基之間的距離所插入之利尿鈉肽最近的該相鄰參考aa之N端加胺基酸延伸部分⁴ C端序列對應於在所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與距離所插入之利尿鈉肽最近的相鄰參考aa之C端之間的胺基酸延伸部分加該參考aa

此外，以抗體骨架TPP-5657為起始物質，產生以下BNP植入人類IgG1抗體構築體。

表 5 ： BNP 植入抗體構築體之設計

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目³ 對應ANP化合物係指具有相同整合基因座且包含相同N端及C端序列之ANP植入抗體構築體

表 5 續： BNP 植入抗體構築體之設計

³ N端序列對應於在參考aa與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基之間的距離所插入之利尿鈉肽最近的該相鄰參考aa之N端加胺基酸延伸部分⁴ C端序列對應於在所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與距離所插入之利尿鈉肽最近的相鄰參考aa之C端之間的胺基酸延伸部分加該參考aa

此外，產生以下CNP植入人類IgG1抗體構築體。

表 6 ： CNP 植入抗體構築體之設計

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目³ 對應ANP化合物係指具有相同整合基因座且包含相同N端及C端序列之ANP植入抗體構築體

表 6 續 ： CNP 植入 抗體 構築體之設計

³ N端序列對應於在參考aa與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基之間的距離所插入之利尿鈉肽最近的該相鄰參考aa之N端加胺基酸延伸部分⁴ C端序列對應於在所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與距離所插入之利尿鈉肽最近的相鄰參考aa之C端之間的胺基酸延伸部分加該參考aa

實例 5 ： 所產生之構築體之活體外活性 所有構築體根據此項技術中的熟知方法在HEK293細胞中短暫表現，靶向約2×10⁶ 個細胞/毫升之細胞密度，兩種編碼輕鏈及重鏈之質體之總DNA濃度為約1 µg/ml且進行5天培育以用於表現。

未經處理之化合物樣品(rcs)在0.4 ml體積之培養物中表現，且藉由離心分離之上清液直接用於測試。根據此項技術中熟知的方法藉由IgG-Fc定量ELISA評估化合物濃度。簡言之，在37℃下，將以1:1500稀釋之上清液及人類參考血清(Bethyl，RS-110-4)之以400 ng/ml起始之2倍連續稀釋物固定於塗有在1x塗佈緩衝液(Candor，121125)中以1:440稀釋之抗人類Fc [Sigma I2136]之黑色Maxisorp 384微量滴定盤(MTP)中保持1小時。在用100% SMART Block (Candor，113125)阻斷之後，以1:10000稀釋度施用抗人類Fc-HRP [Sigma，A0170]以偵測rcs及參考樣品中之抗體。參考樣品之劑量曲線用於表7及8，「µg/ml rcs」欄中展示之化合物濃度之定量評估。一式四份地施用所有樣品。

經由蛋白質-A且根據此項技術中熟知的方法藉由1-步驟純化自6 ml表現培養物產生經分離之化合物樣品(ics)。藉由添加8% (v/v)1M Tris/HCl pH 9.0中和酸溶離液，經由在280 nm下之吸收來定量且針對125 nM之濃度標準化。

經由蛋白質-A藉由2步驟純化及後續在PBS緩衝液中之SEC自至少35 ml之表現培養物產生經純化之化合物樣品(pcs)。值展示於表7及8中，「µg/ml pcs」欄係指藉由分析型蛋白質A層析測定之表現培養物上清液中之化合物濃度。

表7及8中展示之所有活性係使用根據製造商說明(cisbio；62GM2PEH)進行之cGMP定量分析法，在具有人類NPRA (hNPRA)之異源過表現之細胞上量測。簡言之，分析法基於作為經由(利尿鈉肽)樣品進行之NPRA刺激之結果的由細胞產生之cGMP與d2標記之cGMP之間關於結合於穴狀化合物標記之抗體之競爭來定量緩衝溶液或細胞培養物上清液中之cGMP。樣品cGMP及d2標記之cGMP競爭結合於穴狀化合物標記之抗cGMP抗體上之有限數目個位點且因此，HTRF®特異性螢光信號(亦即，能量傳遞)與樣品中之cGMP濃度成反比。

用GraphPad Prism (7.00版本，用於Windows，GraphPad Software, La Jolla California USA)分析劑量-反應曲線資料且根據Y = 底部 +( 頂部 - 底部 )/( 1 + 10 ^{(( LogEC50 - X ) × 希爾斜率 )} ) 擬合 EC50，施加關於底部、頂部及斜率之限制(共享各別實驗之所有資料集之值)。

藉由與陰性對照物TPP-5657及陽性樣品(尤其TPP-5661)進行比較來首先評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上之未經處理之化合物樣品活性。以兩種濃度，一式四份地測試對照物及rcs，其中相對稀釋因子為5，以分析法之動態範圍中之螢光信號為目標。分析法窗口定義為非活性(最大信號，s_max)與高活性樣品(最小信號，s_min)之信號之差，且對於兩種化合物濃度，活性百分比計算為100×(s_max-s)/(s_max-s_min)。表7，「活性rcs」及「活性rcs標準差」欄中列舉之值表示兩種濃度及各別標準差之結果之平均值。Rcs信號小於參考化合物TPP-5661 (36%)之信號之一半評估為無活性(n.a.)。

以5倍稀釋為起始，藉由以2.5倍連續稀釋物(8種濃度)形式與參考樣品TPP-5661進行比較來再評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上之若干未經處理之化合物樣品之活性。藉由計算δ「logEC50」_compound-「logEC50」_TPP-5661，相對於參考rcs TPP-5661之相應值設定作為rcs之活性量測該「logEC50」擬合值；所得值列舉於表7，「相對活性rcs」欄中。值得注意的是，不考慮rcs中之化合物濃度，且因此所給出之值受相同量測中之化合物活性及濃度影響。一式四份地施用所有樣品。

藉由EC50測定及與參考樣品TPP-5661進行比較來評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上之經分離之化合物樣品之活性。在80 nM至0.13 nM之2.5倍連續稀釋物中測試樣品。藉由計算δlogEC50_compound - logEC50_TPP-5661，相對於參考ics TPP-5661之相應值(-8.8)設定作為ics之活性量測之logEC50擬合值；所得值列舉於表7，「相對logEC50 ics」欄中。一式四份地施用所有樣品。

藉由EC50測定及與參考樣品TPP-5661進行比較來評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上之經純化之化合物樣品之活性。在連續稀釋物中至少一式四份地測試樣品。表7，「相對logEC50 pcs 1、3及4」欄中列舉之值為以20或25 nM為起始，5倍連續稀釋物(≥4種濃度)之結果。表7，「相對logEC50 pcs 2」欄中列舉之值為以25 nM為起始，10倍連續稀釋物(4種濃度)之結果。表7，「相對logEC50 pcs5、6、7、8及9」欄中列舉之值為以40至200 nM為起始，2.5倍連續稀釋物(分別具有8或12種濃度)之結果。藉由計算δlogEC50_compound - logEC50_TPP-5661，相對於各別實驗中參考TPP-5661之相應值(平均值-9.2標準差0.5)設定作為pcs之活性量測之logEC50擬合值。

藉由EC50測定及與參考樣品TPP-5661進行比較，在三個實驗中評估短暫hNPRA-HEK293細胞上經純化之化合物樣品之活性。在1000 nM至0.013 nM之5倍連續稀釋物中測試樣品。藉由計算δlogEC50_compound - logEC50_TPP-5661，相對於各別實驗中參考TPP-5661之相應值(三個實驗之平均值-9.0，標準差0.4)設定作為pcs之活性量測之logEC50擬合值；所得值列舉於表7，「相對logEC50* pcs」欄中。一式兩份地施用所有樣品。

所概述之化合物之活性之定性評估提供於「定性活性」欄中，「平均相對logEC50」欄中列舉之值計算為既定相對logEC50值之平均值。展示EC50值＞參考化合物TPP-5661之50倍(意謂平均相對logEC50＞1.7)之化合物定性評估為無活性(「-」)，展示在0.7與1.7之間的相對logEC50之化合物評估為活性(「+」)，展示相對logEC50＜0.7之化合物評估為極具活性(「++」)；在低於-0.7之相對logEC50下觀測到最高活性(「+++」)。在未確認為ics或pcs之rcs中展示活性之化合物統一標記為「y」，且因此標記可能由於極低表現量(≤1 µg/ml，「µg/ml rcs」欄中之「n.e.」)而評估為無活性之化合物(「活性rcs」欄中之「n.a.」)。

表 7 ： 心房利尿鈉肽植入抗體構築體之表現量及活性 未測定(n.d.)，無活性(n.a.)，未表現(n.e.)，不適用(na)

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目

未獲得化合物#104及#135之結論性資料。12種化合物(#54、#61、#89、#139、#162、#168、#170、#171、#172、#173、#176、#196)展示極低表現量(在rcs中≤1 µg/ml)且因此無活性；在化合物製備(pcs)之後展示#61之活性。7種化合物(#7、#24、#70、#83、#90、#154、#167)在大多數情況下展示低活性，如rcs，但其表現量極低；藉由化合物製備(pcs)確認#24及#90之活性。未在化合物#18、#26、#29、#92、#96、#101、#104、#158、#164、#179之rcs中觀測到活性；然而，使用較高濃度(相對活性rcs)證實化合物#18、#92、#158、#164之活性；籍此確認#26無活性。

表 8 ：腦部利尿鈉肽植入抗體構築體之表現量及活性 不適用(na)

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目³ 對應ANP化合物係指具有相同整合基因座且包含相同N端及C端序列之ANP植入抗體構築體

在穩定的hNPRA-CHO k1細胞上，在連續稀釋物中，如實例3中所描述一式四份地測試經純化之化合物樣品。BNP植入抗體構築體之活性以圖形方式描繪於圖11中。

與TPP-1154、TPP-11155及TPP-11157相反，TPP-11156、TPP-9902及TPP-11153在hNPRA細胞上展示顯著活性。對於TPP-1154、TPP-11155及TPP-11157，在EC50＜20 nM下，且對於TPP-9902、TPP-11153及TPP-11156，在EC50＞1 µM下，在rNPRA上觀測到相反結果(參見實例3)。此可由TPP-11156、TPP-9902及TPP-11153中存在人類BNP序列說明，而TPP-1154、TPP-11155及TPP-11157包含大鼠BNP序列(參見表5)。與所有其他人類BNP植入抗體構築體相反，具有低數目之針對BNP之其他胺基酸N端及C端之TPP-18031及TPP-18032在hNPRA上不展示活性。

實例 6 ：特異性連接子序列尤其有利於實現良好均質性及表現量 在還原條件下，根據製造商說明(LabChip GX，Caliper Life Sciences)藉由毛細管凝膠電泳測定經純化之化合物樣品之純度(實例5，表7，「%純度pcs」欄)。純度百分比計算為相對於所觀測到的所有峰之總和的對應於完整輕鏈及重鏈之峰值面積之總和。

已證實包含GS連接子序列 、PN連接子序列或SEQ ID NO 2、4、9、11、13或15之序列的Ntls序列及包含GS連接子序列、PN連接子序列或SEQ ID NO 3、5、12、14、15或20之序列的Ctls序列尤其適用，因為其不僅實現高利尿鈉肽活性(限制條件為各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間存在至少12個胺基酸殘基)，且亦實現良好表現量(與例如化合物#186、#195及#202中使用之序列相反)及(例如化合物6及7中使用之序列相反)、低非均質性程度(參見表9)。在包含GS連接子序列之連接子序列以及包含PN連接子序列之連接子序列的情況下，觀測到98%之平均極好純度。在具有包含SEQ ID NO 2、3、4、5、9、11、12、13、14、15及20之序列的連接子之化合物下觀測到類似的良好值。值得注意的是，具有SEQ ID NO 9之序列之Ntls僅在與化合物中具有SEQ ID NO 20之序列之Ctls組合時產生極好純度；含有SEQ ID NO 11之序列之Ntls與具有SEQ ID NO 12之序列之Ctls之組合的化合物僅在SEQ ID NO 11由N端側上之Asp (D)而非Thr (T)或Val (V)側接時且在SEQ ID NO 12 VNHLRSEKLT由C端側上之Gly (G)而非Tyr (Y)或Phe (F)側接時展示極好純度，如化合物#126及#135中。

表 9 ： Ntls 及 Ctls 對抗體純度之影響 ( 表 7 之摘錄 )

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目³ N端序列對應於在參考aa與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基之間的距離所插入之利尿鈉肽最近的該相鄰參考aa之N端加胺基酸延伸部分⁴ C端序列對應於在所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與距離所插入之利尿鈉肽最近的相鄰參考aa之C端之間的胺基酸延伸部分加該參考aa

實例 7 ： IgG1 、 IgG2 及 IgG4 同型提供相同適合的抗體骨架 以不同IgG同型形式產生化合物9、33、65、91、127及191 (分別為人類IgG1 TPP-10294、TPP-10277、TPP-10279、TPP-10282、TPP-10269及TPP-10355)。在穩定的hNPRA-CHO k1細胞上，在連續稀釋物中，如實例3中所描述一式四份地測試經純化之化合物樣品。ANP植入人類IgG2及IgG4同型構築體(例如化合物9 IgG4 TPP-10992)之活性與其相應IgG1同型類似，如圖12中以圖形方式描繪。

實例 8 ： 人類及非人類 IgG 提供相同適合的抗體骨架 以非人類IgG同型形式產生化合物9 (人類IgG1 TPP-10294及IgG4 TPP-10992)及化合物117 (人類IgG1 TPP-5665)。在穩定的hNPRA-CHO k1細胞上，在連續稀釋物中，如實例3中所描述一式四份地測試經純化之化合物樣品。ANP植入大鼠及小鼠同型構築體(例如化合物9大鼠IgG1 TPP-13992)展示與其相應人類IgG同型類似的活性(圖13)。

實例 9 ： 包含不同生殖系序列之人類 IgG 提供相同適合的抗體骨架 構築22種其他ANP植入IgG4抗體(化合物A至S)。在各種情況下，ANP併入CDRH1內。此等構築體之重鏈包含不同的HV及CDRH3序列且與不同的λ或κ輕鏈配對。化合物A至S之結構概述於表10及11中。

表 10 ： ANP 植入抗體構築體 A 至 S 之設計

¹ 各別N端參考胺基酸殘基與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸之間的胺基酸殘基之數目；² 所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸與各別C端參考胺基酸殘基之間的胺基酸殘基之數目³ N端序列對應於在參考aa與所插入之利尿鈉肽之第一個胺基酸殘基之間的距離所插入之利尿鈉肽最近的該相鄰參考aa之N端加胺基酸延伸部分⁴ C端序列對應於在所插入之利尿鈉肽之最後一個胺基酸殘基與距離所插入之利尿鈉肽最近的相鄰參考aa之C端之間的胺基酸延伸部分加該參考aa

表 11 ： ANP 植入抗體構築體 A 至 S 之設計

在穩定的hNPRA-CHO k1細胞上，在連續稀釋物中，如實例3中所描述一式四份地測試包含不同生殖系序列之IgG骨架構築體A至S之經純化之化合物樣品。例示性活性資料以圖形方式描繪於圖14中。

實例 10 ： CNP 植入 IgG 保護避免誘導型內皮障壁滲透性 利用覆蓋有微電極之微量滴定孔盤(E-Plates)，用xCELLigence RTCA系統藉由即時阻抗量測來分析內皮單層滲透性。相對阻抗變化表示為無單位細胞指數(CI)值。

在預塗有膠原蛋白之E-Plates中，在低繼代下接種原生人類肺動脈內皮細胞(HPAEC)。在在恆定CI值之緊密單層及細胞障壁形成之後，用所指示之濃度之化合物TPP-12899或各別陰性對照抗體構築體TPP-5657預先處理HPAEC，接著用斷裂促效劑LPS (200 ng/ml)IL-1β (0.5 ng/ml)或凝血酶(2 U/ml)破壞EC障壁。每10分鐘一次記錄CI以監測對細胞生長及單層滲透性之影響。在測試物質施用之前，在最後一個記錄點標準化所有細胞指數(=標準化CI)。

在n=4下，3次在技術上各自一式三份地進行實驗。結果表示為平均值±SEM。使用單向ANOVA，接著斯氏多重事後檢定(Sidak's multiple post-test)以統計方式分析資料；p值＜0.05視為顯著。

圖15以圖形 方式描繪對內皮單層滲透性之影響，表示為細胞指數值。如圖15中所示，用TPP-12899預處理人類內皮單層培養物可以劑量依賴性方式保護避免誘導型內皮障壁滲透性。此與所施用之障壁斷裂劑無關；觀測到快速及強效作用凝血酶以及長效促炎性刺激LPS及IL-1β顯著作用。各別陰性對照物未展示影響。

實例 11 ： ANP 植入 IgG 在 慢性心臟衰竭大鼠模型 ( TGR ( mRenR2 ) 27 中之長期作用 TGR (mRenR2)27大鼠模型展示高血壓及內皮功能障礙，以及末梢器官損傷。使用年齡為8週之雄性腎素轉殖基因大鼠(Ganten D., Nature. 1990; 344(6266):541-4)。在所有研究組中，經由飲用水長期投與氧化氮合成酶L-NAME (Nω-硝基-L-精胺酸甲酯)之非選擇性抑制劑(20 mg/l)以誘導內皮功能障礙。每週一次腹膜內投與TPP-13992 (實例8中使用之TPP-10294之大鼠IgG1對應物)及TPP-10155 (大鼠IgG1同型對照抗體)。評估體重及存活率。用媒劑(PBS)處理安慰劑組且自斷奶用卡托普利-食品處理健康對照組。隨意取食食品及水。進行動物之行為及一般健康狀況之每天觀測。在實驗結束時(第14週)，將大鼠麻醉。接著，將大鼠放血且自胸腔移出心臟以用於分析。在研究結束時收集尿液以測定不同尿液參數，例如尿液蛋白質肌酐比。圖16以圖形方式描繪TPP-13992對存活率、體重增加、尿液蛋白質/肌酐比及左心房重量之治療效果。

實例 12 ：健康米格魯犬 ( beagle dog ) 中 ANP 植入 IgG 之血液動力學作用 在有意識的遙測米格魯犬中，在初步藥效學研究中評估在單次皮下投藥之後，TPP-10992對心臟血管及ECG參數之影響。

以手術方式植入遙測裝置 (DSI™, USA)以量測血壓以及心跳速率，接著進行恢復期以使傷口癒合。在研究當天，啟動遙測感測器以進行連續血液動力學量測。藉由位於動物設備中之遙測接收器收集所傳輸之信號。藉由資料獲取程式處理所有所收集之資料且在預定12小時週期內取平均值。使用TPP-10992 NaCl(0.9%)作為媒劑且經由皮下注射施用0.1 mg/kg、0.3 mg/kg及1.0 mg/kg體重之劑量。

結果以圖形方式描繪於圖17中。在健康的犬中，TPP-10992展示血壓中之劑量依賴性及長期(＞5天)降低，其在1.0 mg/kg皮下情況下顯著(與安慰劑相比)。未觀測到對心跳速率之影響。

圖 1 ： 大鼠中在5 mg/kg之靜脈內投藥之後，TPP-10992及TPP-5661之平均血漿濃度。圖 2 ： 小鼠中在5 mg/kg之腹膜內投藥之後，TPP-12897之平均血漿濃度。圖 3 ： ANP (A-C)、TPP-10992 (D-F)及TPP-5661 (G-I)針對蛋白水解降解之穩定性。在穩定的大鼠ANP受體細胞株上直接(A、D、G)或在37℃下與0.6 µg/ml之NEP (B、E、H)或0.6 µg/ml之IDE (C、F、I)一起培育4小時之後測試ANP、TPP-10992及TPP-5661活性。圖 4 ： BNP (A-C)及TPP-11155 (D-F)針對蛋白水解降解之穩定性。在穩定的大鼠BNP受體細胞株上直接(A、D)或在37℃下與0.6 µg/ml之NEP (B、E)或0.6 µg/ml之IDE (C、F)一起培育4小時之後測試BNP及TPP-11155活性。圖 5 ： CNP (A-C)及TPP-12897 (D-F)針對蛋白水解降解之穩定性。在穩定的大鼠CNP受體細胞株上直接(A、D)或在37℃下與0.6 µg/ml之NEP (B、E)或0.6 µg/ml之IDE (C、F)一起培育4小時之後測試CNP及TPP-11155活性。圖 6 ： PE感染之主動脈環中ANP肽及TPP-10992誘導之血管擴張劑量反應曲線。由苯腎上腺素(1 μM)感染之內皮完整大鼠主動脈環中針對ANP肽(空心圓)及TPP-10992(實心圓)之濃度反應曲線(0.0001-10 μM；n =3隻大鼠)。相對於各組織中由苯腎上腺素產生之收縮(其視為100%)之最大變化來計算實驗值。ANP肽及TPP-10992之效能分別為-7.4及-6.7 (logEC₅₀ 值)。資料表示2個實驗之平均值±S.E.M.。圖 7 ： PE感染之主動脈環中ANP肽及TPP-5661誘導之血管擴張劑量反應曲線。由苯腎上腺素(1 μM)感染之內皮完整大鼠主動脈環中針對ANP肽(空心圓)及TPP-5661(實心圓)之濃度反應曲線(0.0001-10 μM；n =3隻大鼠)。相對於各組織中由苯腎上腺素產生之收縮(其視為100%)之最大變化來計算實驗值。ANP肽及TPP-5661之效能分別為-7.4及-6.5 (logEC₅₀ 值)。資料表示2個實驗之平均值±S.E.M.。圖 8 ： 有意識的大鼠中ANP之血液動力學作用。在第0小時腹膜內投與大鼠ANP。500 µg劑量之ANP引起平均動脈血壓(MAP)降低約25%，作用持續時間為約6-8小時。圖 9 ： 有意識的大鼠中之血液動力學作用TPP-5661。在第0小時腹膜內投與TPP-5661。15 mg/kg劑量引起平均動脈血壓(MAP)降低約20%，在施用後24-48小時實現最大作用且作用持續時間超過6天。圖 10 ： 有意識大鼠的中之血液動力學作用TPP-10992。在第0小時腹膜內投與TPP-10992。30 mg/kg劑量引起平均動脈血壓(MAP)降低約20%，在施用後48小時實現最大作用且作用持續時間超過6天。圖 11 ： hNPRA細胞上BNP植入抗體構築體之活性。藉由與參考樣品TPP-5661及TPP-5657進行比較來評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上經純化之化合物樣品之活性。在連續稀釋物中一式四份地測試樣品。圖 12 ： 不同的人類IgG同型提供同等適合的抗體骨架。化合物9、33、65、91、127及191 IgG1 (分別為TPP-10294、TPP-10277、TPP-10279、TPP-10282、TPP-10269及TPP-10355)、IgG2及IgG4同型之例示性活性測定。藉由與參考樣品化合物117人類IgG1 TPP-5661及化合物209人類IgG1 TPP-5657進行比較來評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上經純化之化合物樣品之活性。在連續稀釋物中一式四份地測試樣品。圖 13 ： 源於不同物種之同等適合的IgG抗體骨架。化合物117人類IgG1 (TPP-5661)及化合物9人類IgG1 (TPP-10294)以及其非人類IgG1對應物之例示性活性測定。藉由與參考樣品化合物209人類IgG1 (TPP-5657)進行比較來評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上經純化之化合物樣品之活性。在連續稀釋物中一式四份地測試樣品。圖 14 ： 源於不同生殖系序列之同等適合的人類IgG抗體骨架。藉由與參考樣品TPP-10992進行比較來評估穩定的hNPRA-CHO k1細胞上經純化之化合物樣品之活性。在連續稀釋物中一式四份地測試樣品。圖 15 ： TPP-12899針對LPS、IL-1β及凝血酶誘導之內皮障壁滲透性之保護作用，如藉由即時阻抗量測來評估。圖 16 ： TPP-13992對存活率(A)、體重增加(B)、尿液蛋白質/肌酐比(C)及左心房重量(D)之治療效果；(n=8-12 (健康對照物n=5))，平均值±SEM，單向ANOVA對比TPP-10155 (同型特異性對照抗體)。圖 17 ： 在安慰劑、0.1、0.3及1.0 mg/kg之TPP-10992之後的血液動力學評估。TPP-10992展示血壓之劑量依賴性及長效(＞5天)降低。使用單向ANOVA測試進行重複量測，接著進行塔基多重對比測試(Tukey's multiple comparison test)，與安慰劑組相比，**p＜0.01，****p＜0.0001。

Claims (18)

1. 一種抗體或其片段，其包含至少一個併入該抗體或其片段之至少一個CDR區內之異源胺基酸序列，其中該至少一個異源胺基酸序列包含N端連接子序列(Ntls)、腦利尿鈉肽(BNP)及C端連接子序列(Ctls)，其中該至少一個CDR區的至少一部分視情況由併入其中之該至少一個異源胺基酸序列置換，且其中 a) 在以下之間存在至少12個胺基酸殘基： i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25與該BNP之第一個胺基酸殘基； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51與該BNP之第一個胺基酸殘基； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92與該BNP之第一個胺基酸殘基； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26與該BNP之第一個胺基酸殘基； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49與該BNP之第一個胺基酸殘基；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88與該BNP之第一個胺基酸殘基；且其中 b) 在該BNP之最後一個胺基酸殘基與以下之間存在至少9個胺基酸殘基： i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res57； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res106； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res57；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res98。
2. 如請求項1之抗體或其片段，其中該BNP係選自由以下組成之群：具有SEQ ID NO 24之序列之人類BNP及與其具有至少80%序列一致性之肽。
3. 如請求項1或2之抗體或其片段，其中 a) 該Ntls包含 i) GS連接子序列； ii) PN連接子序列； iii) 作為人類IgG抗體骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列； iv) SEQ ID NO 6之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； v) SEQ ID NO 7之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； vi) SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； vii) SEQ ID NO 11之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； viii) SEQ ID NO 13之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； ix) SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； x) SEQ ID NO 21之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；或 xi) 其任何組合，且其中 b) 該Ctls包含 i) GS連接子序列； ii) PN連接子序列； iii) 作為人類IgG抗體骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、3或5中之任一者共有至少80%序列一致性之序列； iv) SEQ ID NO 6之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； v) SEQ ID NO 8之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； vi) SEQ ID NO 10之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； vii) SEQ ID NO 12之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； viii) SEQ ID NO 14之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； ix) SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； x) SEQ ID NO 20之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； xi) SEQ ID NO 22之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；或 xii) 其任何組合。
4. 如請求項3之抗體或其片段，其中 i) 該Ntls及該Ctls各自包含GS連接子序列； ii) 該Ntls及該Ctls各自包含PN連接子序列； iii) 該Ntls及該Ctls各自包含作為人類IgG抗體骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，特定言之，作為人類IgG抗體之fab域骨架之一部分之胺基酸序列或與其共有至少80%序列一致性之序列，更特定言之，該Ntls包含SEQ ID NO 1、2或4中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、2或4中之任一者共有至少80%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 1、3或5中之任一者之序列或與SEQ ID NO 1、3或5中之任一者共有至少80%序列一致性之序列； iv) 該Ntls及該Ctls各自包含SEQ ID NO 6之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； v) 該Ntls包含SEQ ID NO 7之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 8之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； vi) 該Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 10之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； vii) 該Ntls包含SEQ ID NO 11之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 12之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； viii) 該Ntls包含SEQ ID NO 13之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 14之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； ix) 該Ntls及該Ctls各自包含SEQ ID NO 15之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列； x) 該Ntls包含SEQ ID NO 9之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 20之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列；或 xi) 該Ntls包含SEQ ID NO 21之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列且該Ctls包含SEQ ID NO 22之序列或與其共有至少60%序列一致性之序列。
5. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其中該Ntls在其C端進一步包含錨定元件A1及/或其中該Ctls在其N端進一步包含錨定元件A2，其中A1及/或A2主要包含甘胺酸及絲胺酸殘基，特定言之，其中A1及/或A2中之至少60%的該等胺基酸殘基係選自甘胺酸及絲胺酸殘基。
6. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其中該存在於以下之間的胺基酸延伸部分 i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25與該BNP之第一個胺基酸殘基； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51與該BNP之第一個胺基酸殘基； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92與該BNP之第一個胺基酸殘基； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26與該BNP之第一個胺基酸殘基； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49與該BNP之第一個胺基酸殘基；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88與該BNP之第一個胺基酸殘基； 包含SEQ ID NO 26至38中之任一者之序列或與SEQ ID NO 26至38中之任一者具有至少80%序列一致性之序列； 且其中該存在於該BNP之最後一個胺基酸殘基與以下之間的胺基酸延伸部分 i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res57； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res106； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res57；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res98； 包含SEQ ID NO 39至51中之任一者之序列或與SEQ ID NO 39至51中之任一者具有至少80%序列一致性之序列。
7. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其中該Ntls及/或該Ctls包含總共至少3、4、5、6、7、8、9或10個且至多30、28、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10個胺基酸殘基。
8. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其中該存在於以下之間的胺基酸延伸部分 i) 在該異源胺基酸序列併入CDRH1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res25與根據Kabat之胺基酸殘基HC res35a； ii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res51與根據Kabat之胺基酸殘基HC res57； iii) 在該異源胺基酸序列併入CDRH3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基HC res92與根據Kabat之胺基酸殘基HC res106； iv) 在該異源胺基酸序列併入CDRL1內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res26與根據Kabat之胺基酸殘基LC res 32； v) 在該異源胺基酸序列併入CDRL2內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res49與根據Kabat之胺基酸殘基LC res57；及/或 vi) 在該異源胺基酸序列併入CDRL3內之情況下，根據Kabat之胺基酸殘基LC res88與根據Kabat之胺基酸殘基LC res98； 包含SEQ ID NO 52至64中之任一者之序列或與SEQ ID NO 52至64中之任一者具有至少80%序列一致性之序列。
9. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其包含至少一種另外的利尿鈉肽，特定言之，其中該BNP及該至少一種另外的利尿鈉肽併入至少兩個單獨的CDR區內，更特定言之，其中該至少一種另外的利尿鈉肽係選自ANP、BNP及CNP，最特定言之，係選自ANP及CNP。
10. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其中該抗體或其片段為人類或人類化抗體或其片段，特定言之，其中該抗體或其片段為IgG類別。
11. 如前述請求項中任一項之抗體或其片段，其中該輕鏈包含SEQ ID NO 66之胺基酸序列或由其組成且該重鏈包含SEQ ID NO 442至444中之任一者之胺基酸序列或由其組成。
12. 如前述請求項中任一項之抗體片段，其中該抗體片段係選自由以下組成之群：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；單域抗體(Dab)；線形抗體；單鏈抗體分子(scFv)；及二硫鍵穩定之Fv抗體片段(dsFv)。
13. 一種組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或其片段及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑。
14. 一種核酸或核酸混合物，其編碼如請求項1至12中任一項之抗體或其片段。
15. 一種宿主細胞，其包含如請求項14之核酸或核酸混合物。
16. 一種用於製備抗體或其片段之方法，其包含在適合於該抗體或其片段之表現的條件下培養如請求項15之宿主細胞。
17. 如請求項1至12中任一項之抗體或其片段，其係用於治療方法中。
18. 如請求項1至12中任一項之抗體或其片段，其係用於治療心臟血管、腎、肺、骨骼、眼部、血栓栓塞或纖維化疾病或病症、侏儒症、軟骨發育不全或其他cGMP相關及/或利尿鈉肽反應性病症。

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