BR112020020188A2

BR112020020188A2 - Anticorpos enxertados com peptídeo natriurético cerebral

Info

Publication number: BR112020020188A2
Application number: BR112020020188-0A
Authority: BR
Inventors: Damian Brockschnieder; Jan Tebbe; Andreas Wilmen; Frank Wunder
Original assignee: Bayer Aktiengesellschaft
Priority date: 2018-04-12
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2021-01-19
Also published as: KR20210003788A; JP2021520803A; TW202012437A; WO2019197475A1; IL277867A; US20210147504A1; EP3553082A1; JP2024050761A; EP3773902A1; CA3096725A1; AU2019250367A1; AR114482A1; PE20210019A1; SG11202009460VA; CN112236197A; MX2020010699A

Abstract

anticorpos enxertados com peptídeo natriurético cerebral. a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo que compreende pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma região de cdr do referido anticorpo ou fragmento do mesmo, em que a referida pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido compreende uma sequência de ligante n-terminal (ntls), um peptídeo natriurético cerebral (bnp) e uma sequência de ligante c-terminal (ctls). opcionalmente, pelo menos uma porção da referida pelo menos uma região de cdr é substituída pela referida sequência heteróloga de aminoácido incorporada na mesma. a presente invenção também se refere a tal anticorpo ou fragmento do mesmo para uso em um método para tratamento, uma composição que compreende tal anticorpo ou fragmento do mesmo, um ácido nucleico ou uma mistura de ácidos nucleicos que codificam tal anticorpo ou fragmento do mesmo, uma célula hospedeira que compreende tal ácido nucleico ou tal mistura de ácidos nucleicos e a um processo para a produção de tal anticorpo ou fragmento do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ENXERTADOS COM PEPTÍDEO NATRIURÉTICO CEREBRAL". Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo que compreende pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma região de CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo, em que a referida pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido compreende uma sequência de ligante N-terminal (Ntls), um Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) e uma sequência de ligante C-terminal (Ctls).

[002] Opcionalmente, pelo menos uma porção da referida pelo menos uma região de CDR é substituída pela referida sequência heteróloga de aminoácido incorporada na mesma. Pelo menos 12 resíduos de aminoácidos estão entre o resíduo de aminoácido de HC (cadeia pesada) res25 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; resíduo de aminoácido de LC (cadeia leve) res26 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de

CDRL2; e/ou resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3. Adicionalmente, pelo menos 9 resíduos de aminoácido estão presentes entre o último resíduo de aminoácido do BNP e resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3. A presente invenção também se refere a tal anticorpo ou fragmento do mesmo para uso em um método para tratamento, uma composição que compreende tal anticorpo ou fragmento do mesmo, um ácido nucleico ou uma mistura de ácidos nucleicos que codificam tal anticorpo ou fragmento do mesmo, uma célula hospedeira que compreende tal ácido nucleico ou tal mistura de ácidos nucleicos e a um processo para a produção de tal anticorpo ou fragmento do mesmo. Antecedentes da Invenção

[003] Os peptídeos natriuréticos são uma família de três peptídeos estruturalmente relacionados com as ações neuro-humorais. Peptídeo Natriurético Atrial (ANP) é um peptídeo de 28 aminoácidos que compreende uma estrutura de anel central formada por uma ponte de dissulfeto entre os resíduos de cisteína 7 e 23. O ANP humano é expresso com um pré-pró-hormônio de 153 aminoácidos de comprimento em células de miócito atrial. A clivagem de peptídeo de sinal produz uma forma de pró-hormônio, que é subsequentemente também clivada no ANP maduro e no N-terminal remanescente, conhecido como NT-proANP. Similares ao ANP, também o Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) e o Peptídeo Natriurético do Tipo C (CNP) são produzidos a partir de proteínas precursoras e compreendem uma estrutura de anel central. ANP é principalmente produzido e liberado por cardiomiócitos dos átrios direito e esquerdo do coração, enquanto o BNP é principalmente produzido por cardiomiócitos dos ventrículos. CNP é sintetizado por células endoteliais de vasos sanguíneos. Além destes locais, os peptídeos natriuréticos também são produzidos em menor quantidade em outras partes do corpo, por exemplo, no cérebro, rim e glândula adrenal. Os peptídeos natriuréticos são codificados por três genes separados, NPPA, NPPB, e NPPC. As sequências de aminoácido dos três peptídeos são altamente conservadas em mamíferos (Potter et al., Handb Exp Pharmacol. 2009; (191):341-66).

[004] Ainda, modificações significantes de sequência dos peptídeos natriuréticos, tais como truncações, permutas de aminoácido, bem como fusões quiméricas (por exemplo, CD-NP (McKie et al., Curr Heart Fail Rep. Setembro de 2010; 7 (3): 93-9)) foram descritas resultar em potentes peptídeos natriuréticos que ativam ou se ligam aos receptores celulares e podem eliciar relevantes efeitos fisiológicos.

[005] Os peptídeos natriuréticos ligam-se a três tipos diferentes de receptor ligado à membrana - NPR-A, NPR-B, e NPR-C – desse modo mediando seus efeitos biológicos. ANP e BNP se ligam com maior afinidade ao NPR-A; ao contrário, CNP tem maior afinidade com o receptor de NPR-B. NPR-A e NPR-B compreendem um domínio

(particulado) de guanilato ciclase (pGC), cuja atividade enzimática causa um aumento no monofosfato cíclico de guanosina (intracelular) (cGMP). Como um segundo mensageiro, cGMP regula diversos processos celulares. O receptor de NPR-C não exibe nenhuma atividade de guanilato ciclase e é também chamado receptor de "depuração", visto que ele pode ligar os peptídeos natriuréticos, que induz a sua degradação por endocitose. Uma função de sinalização adicional do receptor de NPR-C por meio de modulação de cAMP foi descrita (Anand-Srivastava, Peptides. 26 de junho de 2005 (6): 1044- 59).

[006] Os hormônios cardíacos ANP e BNP são excretados no alongamento dos ventrículos e átrios, por exemplo, devido ao volume plasmático excessivo. Eles exercem efeitos vasodilatadores por meio do relaxamento do músculo liso vascular e levam à redução da pressão arterial. No rim, o ANP causa i.a. um aumento na excreção urinária (diurese), bem como um aumento na concentração de íons de sódio na urina (natriurese). ANP é considerado constituir um antagonista compensatório do sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), que é superativado em diversas doenças cardiovasculares. Além disso, ANP exerce outros efeitos neuro-humorais, incluindo um efeito inibitório sobre o sistema nervoso simpático, bem como um efeito regulatório complexo sobre o barorreflexo (Woods et al., Clin Exp Pharmacol Physiol. novembro de 2004; 31 (11): 791-4). Quanto ao ANP, bem como BNP e CNP, efeitos anti-inflamatórios, anti-hipertróficos e anti-fibróticos foram demonstrados em modelos animais para diferentes doenças (por exemplo, Knowles et al., 2001, J. Clin. Invest. 107: 975-984; Dahrouj et al., J Pharmacol Exp Ther. janeiro de 2013; 344 (1): 96-102; Baliga et al., Br J Pharmacol. julho de 2014; 171 (14): 3463-75; Mitaka et al. Intensive Care Med Exp. dezembro de 2014; 2 (1): 28; Werner et al., Basic Res Cardiol. março de 2016; 111 (2): 22; Kimura et al., Respir

Res. 19 de Fevereiro de 2016; 17: 19). A ativação de NPR-B por CNP desempenha um papel significante no crescimento ósseo (Yasoda et al., Clin. Calcium. julho de 2009; 19 (7): 1003-8) e integridade do endotélio vascular (Moyes et al., J Clin Invest. Setembro de 2014; 124 (9): 4039- 51).

[007] O amplo espectro dos efeitos fisiológicos de peptídeos natriuréticos e seus receptores tornam-os alvos atrativos na descoberta de fármaco (Lumsden et al., Curr Pharm. Dezembro de 2010; 16 (37): 4080-8; Buglioni et al., Annu Rev Med. 2016; 67: 229-43). Por exemplo, o sistema de cGMP natriurético pode ser suprimido sob várias condições fisiopatológicas, que podem resultar em hipertensão, proliferação de célula aumentada, fibrose, inflamação, disfunção endotelial, diabetes, síndrome metabólica, aterosclerose, insuficiência cardíaca, infarto do miocárdio, hipertensão pulmonar, doenças oculares e renais, distúrbios ósseos, acidente vascular cerebral e/ou disfunção sexual.

[008] Um grande obstáculo para o uso terapêutico dos peptídeos natriuréticos é sua meia-vida plasmática muito curta, de apenas alguns minutos no organismo. (Hunt et al., J Clin Endocrinol Metab. junho de 1994; 78 (6): 1428-35; Kimura et al., Eur J Clin Pharmacol. julho de 2007; 63 (7): 699-702). Além da endocitose pelo receptor de NPR-C, os peptídeos natriuréticos são eficientemente degradados proteoliticamente pelas enzimas neprilisina (NEP) e enzima degradante de insulina (IDE). Os efeitos biológicos de curto prazo associados aos peptídeos natriuréticos administrados restringiram seu uso terapêutico principalmente às indicações agudas. Por exemplo, infusões de carperitida recombinante (ANP) e nesiritida (BNP) são aprovadas para o tratamento de insuficiência cardíaca descompensada aguda em diferentes países.

[009] O tratamento de doenças crônicas seria muito facilitado pelo fornecimento de agonistas NPR-A e NPR-B com meia-vidas plasmáticas aumentadas, maior estabilidade proteolítica e duração prolongada de ação.

[0010] Nos últimos anos, diversos derivados e variantes de peptídeo natriurético foram descritos, por exemplo, CD-NP (McKie et al., Curr Heart Fail Rep. setembro de 2010; 7 (3): 93-9), ZD100/MANP (McKie et al., Hypertension. dezembro de 2010; 56 (6): 1152-9), PL- 3994 (Edelson et al., Pulm Pharmacol Ther. abril de 2013; 26 (2): 229- 38), Ularitide (Anker et al., Eur Heart J. 21 de março de 2015; 36 (12): 715-2), ANX-042 (Pan et al., Proc Natl Acad Sci USA. 7 de julho de 2009; 106 (27): 11282-7) e BMN-111 (Wendt et al., J. Pharmacol Exp Ther. abril de 2015; 353 (1): 132-49). A meia-vida de CD-NP é de cerca de 18,5 min (Lee et al., BMC Pharmacology 2007, 7 (Suppl I): P38). Além disso, derivados de ANP e CNP são descritos no US 9.193.777 e EP 2 432 489 A, respectivamente.

[0011] Além disso, as fusões de peptídeo natriurético incluindo fusões de Fc, fusão de albumina e peptídeos natriuréticos PEGuilados foram descritas. Fusões de peptídeo natriurético-Fc são, por exemplo, descritos no US 2010/0310561, WO 2008/154226, WO 2010/117760, WO 2006/107124, WO 2008/136611 e WO 2008/079995. Fusões de peptídeo natriurético-albumina são descritas no US 7.521.424 e US 2014/0148390 e peptídeos natriuréticos PEGuilados são descritos no US 2014/0148390.

[0012] O WO 2005/060642 descreve a geração de bibliotecas de anticorpo enxertado com peptídeo ANP e BNP obtidas por inserção de ANP ou BNP com dois aminoácidos flangeados randomizados em ambas as extremidades na região CDRH3 de um anticorpo específico para o toxoide tetânico humano. Similarmente, o WO 2005/082004 descreve a geração de uma biblioteca de anticorpos enxertados com miméticos de ANP obtida pela substituição de toda a região CDRH3 original de um anticorpo 2G12 por um peptídeo mimético de ANP flanqueado por dois resíduos de aminoácidos aleatórios em cada lado. Nenhum dos documentos WO 2005/060642 e WO 2005/082004 descreve quaisquer anticorpos específicos enxertados com peptídeo natriurético, muito menos caracteriza funcionalmente tais anticorpos. Objetivos da Invenção

[0013] Em vista da técnica anterior, é um objetivo da presente invenção fornecer novos antagonistas de receptor de peptídeo natriurético com estabilidade aumentada em soro em comparação aos peptídeos natriuréticos do tipo selvagem, de ocorrência natural. Sumário da Invenção

[0014] O objetivo estabelecido acima é obtido pelo ensinamento das reivindicações independentes objeto. Os presentes inventores surpreendentemente descobriram que as variantes de peptídeo natriurético biologicamente ativo com estabilidade significantemente aumentada em soro, em comparação com peptídeos natriuréticos do tipo selvagem, de ocorrência natural, podem ser obtidas incorporando uma sequência de aminoácido de peptídeo natriurético em uma das regiões CDR de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento da mesma, apesar do curto comprimento e alta conservação de sequência das regiões CDR de imunoglobulina, que impõem restrições conformacionais consideráveis à incorporação de peptídeos biologicamente ativos. Entretanto, a atividade de peptídeos natriuréticos incorporados dentro de uma região CDR de imunoglobulina foi mostrada variar consideravelmente. Os presentes inventores descobriram que o fator decisivo para uma incorporação bem-sucedida que produz uma variante de peptídeo natriurético biologicamente ativo é o número de resíduos de aminoácido entre o peptídeo natriurético incorporado e as junções de estrutura de CDR vizinhas mais próximas, N-terminal e C- terminal, do peptídeo natriurético incorporado. Abaixo de um certo número de resíduos de aminoácido que flanqueiam o N-terminal e C- terminal entre peptídeo natriurético e junções de estrutura de CDR vizinhas, apenas construções de fusão de imunoglobulina de peptídeo natriurético sem nenhuma ou com atividade biológica drasticamente reduzida foram obtidas. Sequências ligantes específicas que flanqueiam o peptídeo natriurético incorporado foram constatadas ser especificamente vantajosas para obtenção de atividade de peptídeo elevada, bons níveis de expressão e/ou baixos níveis de fragmentação de proteína.

[0015] Desse modo, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo que compreende pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma região de CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo, em que a referida pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido compreende uma sequência de ligante N- terminal (Ntls), a peptídeo natriurético e uma sequência de ligante C- terminal (Ctls), em que opcionalmente pelo menos uma porção da referida pelo menos uma região de CDR é substituída pela referida sequência heteróloga de aminoácido incorporada na mesma, e em que a) pelo menos 12 resíduos de aminoácido estão presentes entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res S25) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res I51) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido de HC res92 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res C96) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res S25) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res Y51) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res C90) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3; e em que b) pelo menos 9 resíduos de aminoácido estão presentes entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético e i) resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res M34) no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res T58) no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res G111) no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res D34) no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com

Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res G59) no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res F102) no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3.

[0016] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a such anticorpo ou fragmento do mesmo para uso em um método para tratamento, uma composição que compreende tal anticorpo ou fragmento do mesmo, um ácido nucleico ou uma mistura de ácidos nucleicos que codificam tal anticorpo ou fragmento do mesmo, uma célula hospedeira que compreende tal ácido nucleico ou tal mistura de ácidos nucleicos e a um processo para a produção de tal anticorpo ou fragmento do mesmo. Descrição Detalhada da Invenção

[0017] A presente invenção pode ser entendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada da invenção e aos exemplos incluídos na mesma.

[0018] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo ou um fragmento do mesmo que compreende pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma região de CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo, em que a referida pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido compreende uma sequência de ligante N-terminal (Ntls), a peptídeo natriurético e uma sequência de ligante C-terminal (Ctls), em que opcionalmente pelo menos uma porção da referida pelo menos uma região de CDR é substituída pela referida sequência heteróloga de aminoácido incorporada na mesma.

[0019] Os presentes inventores descobriram que variantes de peptídeo natriurético biologicamente ativo com estabilidade significantemente aumentada em soro como comparado com os peptídeos natriuréticos do tipo selvagem, de ocorrência natural podem ser obtidas incorporando uma sequência de aminoácido de peptídeo natriurético em uma das regiões CDR de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento da mesma. Esta descoberta foi inteiramente inesperada. Como é bem conhecido na técnica, o curto comprimento e alta conservação de sequência de regiões CDR de imunoglobulina, que são especificamente pronunciadas em CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 e CDRH2, impõem restrições conformacionais consideráveis à incorporação de peptídeos biologicamente ativos, e as sequências de imunoglobulinas circundantes podem afetar negativamente a expressão, dobra e/ou atividade biológica do peptídeo incorporado. De fato, os presentes inventores descobriram que a atividade de peptídeos natriuréticos incorporados dentro de uma região CDR de imunoglobulina variou consideravelmente dependendo do modo exato como o anticorpo enxertado com peptídeo natriurético foi construído. O fator decisivo para uma incorporação bem-sucedida produzindo um funcional, isto é, variante de peptídeo natriurético biologicamente ativo foi mostrado ser o número de resíduos de aminoácido entre o peptídeo natriurético incorporado e as junções de estrutura de CDR vizinhas mais próximas, N-terminal e C-terminal, do peptídeo natriurético incorporado. Abaixo de um certo número de resíduos de aminoácido que flanqueiam o N-terminal e C-terminal entre peptídeo natriurético e as junções de estrutura de CDR vizinhas nas construções de fusão de imunoglobulina de peptídeo natriurético biologicamente ativo foram obtidas.

[0020] Os termos "incorporado", "inserido", "integrado", "enxertado" e "embutido" bem como "incorporação", "inserção", "integração", "enxerto" e "embutimento" são usados alternadamente aqui. Dentro do contexto da presente invenção, estes termos referem-se à geração de ácidos polinucleicos híbridos ou polipeptídeos híbridos pela introdução de uma sequência heteróloga na sequência original de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Tal incorporação pode ser feita por qualquer método. Tipicamente, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo um peptídeo natriurético flaqueado por uma sequência de ligante C-terminal e N-terminal é gerada por expressão e tecnologia de DNA recombinante como descrito aqui.

[0021] A incorporação do peptídeo natriurético flaqueado por uma sequência de ligante C-terminal e N-terminal em uma região CDR da sequência de anticorpo original ou fragmento de anticorpo pode resultar na deleção de pelo menos uma porção da referida região CDR. Por exemplo, a clonagem de uma sequência de ácido nucleico que codifica a referida sequência heteróloga de aminoácido compreendendo uma sequência de ligante N-terminal, um peptídeo natriurético e uma sequência de ligante C-terminal pode ser realizada de modo que a parte da sequência que codifica a CDR seja substituída pela sequência heteróloga de ácido nucleico incorporada. Em outras modalidades particulares, a incorporação da sequência heteróloga de aminoácido compreendendo o peptídeo natriurético não resulta na deleção de resíduos de aminoácido da região CDR, na qual a sequência heteróloga de aminoácido é inserida.

[0022] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "sequência heteróloga de aminoácido" refere-se a uma sequência de aminoácido que não se origina do anticorpo "vazio" inicial ou fragmento do mesmo, no qual ela é incorporada. O enxerto da sequência heteróloga de aminoácido em um anticorpo ou fragmento do mesmo,

desse modo produz uma molécula de anticorpo recombinada, projetada, composta de sequências de aminoácido de diferente origem.

[0023] O termo "peptídeo natriurético" refere-se aos peptídeos que podem induzir à natriurese, a excreção de sódio pelos rins. O peptídeos natriuréticos incluem Peptídeo Natriurético Atrial (ANP), Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP), Peptídeo Natriurético do Tipo C (CNP), Peptídeo Natriurético Dendroaspis (DNP) e Urodilatina. Peptídeos natriuréticos no significado da presente invenção podem ser de qualquer origem. Peptídeos natriuréticos incluem peptídeos natriuréticos naturais, tais como peptídeos natriuréticos do tipo selvagem e versões mutantes dos mesmos bem como peptídeo natriurético homólogos de uma diferente espécie. O termo, entretanto, também abrange peptídeos natriuréticos projetados, tais como variantes quiméricas projetadas de peptídeos natriuréticos distintos. Sabe-se que o uso de códons é diferente entre as espécies. Desse modo, quando expressando uma proteína heteróloga em uma célula-alvo, pode ser necessária, ou pelo menos útil, para adaptar a sequência de ácido nucleico ao uso do códon da célula-alvo. Métodos para designação e construção de derivados de uma determinada proteína são bem conhecidos por qualquer um versado na técnica.

[0024] Em modalidades particulares, o peptídeo natriurético é selecionado de um peptídeo natriurético do tipo selvagem de qualquer espécie e uma variante funcional de qualquer tal peptídeo natriurético do tipo selvagem. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "variante funcional de um peptídeo natriurético" ou "variante de peptídeo natriurético funcional" refere-se a um peptídeo natriurético de qualquer origem, incluindo peptídeos naturais e projetados, que difere na sequência de aminoácido e/ou na sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido de um determinado peptídeo natriurético, tal como um peptídeo natriurético do tipo selvagem de uma determinada espécie, porém ainda é funcionalmente ativo. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "funcionalmente ativo" refere- se à capacidade de uma variante de peptídeo natriurético para realizar as funções biológicas de um peptídeo natriurético de ocorrência natural, em particular, um peptídeo natriurético do tipo selvagem. Em particular, "funcionalmente ativo" significa que a variante de peptídeo natriurético é capaz de ligar-se a seu respectivo receptor. No caso de ligantes de NPR-A e NPR-B, "funcionalmente ativo" particularmente significa a capacidade de mediar um aumento no monofosfato de guanosina cíclico (intracelular) (cGMP) ligando-se a um ou ambos destes receptores.

[0025] Em modalidades particulares, a variante de peptídeo natriurético funcional é capaz de realizar uma ou mais funções biológicas de um determinado peptídeo natriurético, tal como um peptídeo natriurético do tipo selvagem de qualquer espécie em pelo menos cerca de 50%, particularmente em pelo menos cerca de 60%, em pelo menos cerca de 70%, em pelo menos cerca de 80%, e mais particularmente em pelo menos cerca de 90%, em que a uma ou mais funções biológicas incluem, porém não estão limitadas à, ligação do peptídeo natriurético ao seu respectivo receptor e/ou indução de um aumento em cGMP intracelular.

[0026] A atividade funcional de peptídeos natriuréticos pode ser medida por quaisquer métodos incluindo métodos in vitro que torna possível medir o aumento de monofosfato cíclico de guanosina (intracelular) (cGMP), ou medir as mudanças nos processos celulares regulados por cGMP, incluindo os métodos descritos nos Exemplos 3 e

5. Em modalidades particulares, uma variante de peptídeo natriurético (não enxertada) é considerada funcionalmente ativa, se seu valor EC50, como determinado pelo ensaio de fluorescência descrito no Exemplo 3, for abaixo de 500 nM, mais particularmente abaixo de 250 nM, mais particularmente abaixo de 150 nM, mais particularmente abaixo de 100 nM, mais particularmente abaixo de 50 nM, mais particularmente abaixo de 25 nM.

[0027] Uma incorporação de tal variante de peptídeo natriurético funcional em uma das regiões CDR de uma molécula de imunoglobulina ou um fragmento da mesma como descrito aqui produz uma imunoglobulina enxertada com peptídeo natriurético com atividade de peptídeo natriurético funcional e estabilidade significantemente aumentada em soro como comparado com a variante de peptídeo natriurético funcional não enxertado como mostrado nos Exemplos. Uma imunoglobulina enxertada com peptídeo natriurético é considerada biologicamente ativa (isto é, funcional), se ela fornecer um sinal positivo significante em qualquer método que mede o aumento de monofosfato cíclico de guanosina (intracelular) (cGMP), direta ou indiretamente avaliando as mudanças nos processos celulares regulados por cGMP. Em particular, a atividade funcional de uma imunoglobulina enxertada com peptídeo natriurético pode ser avaliada pelos métodos descritos nos Exemplos 3 e 5. No caso de imunoglobulinas enxertadas com peptídeo natriurético, significância é tipicamente avaliada com base em i) comparação com uma amostra negativa tal como uma estrutura de imunoglobulina vazia, por exemplo, construção #209, um anticorpo compreendendo SEQ ID Nº 65 e SEQ ID Nº 66, TPP-5657, ii) comparação com uma amostra positiva, por exemplo, construção #117, um anticorpo compreendendo SEQ ID Nº 67 e SEQ ID Nº 66, TPP-5661, e iii) dependência de dose.

[0028] Mesmo que a variante de peptídeo natriurético funcional de acordo com a presente invenção possa conter qualquer número de mutações compreendendo adições, deleções e/ou substituições de um ou mais aminoácidos em comparação com o peptídeo natriurético de referência, uma variante de peptídeo natriurético funcional tipicamente manterá as características chaves do peptídeo natriurético correspondente, tal como resíduos chave dentro do domínio de anel central. Resíduos conservados de peptídeos natriuréticos são, por exemplo, descrito em Lincoln R. Potter et al. (Handb Exp Pharmacol. 2009; (191): 341–366). Desse modo, em modalidades particulares, a variante de peptídeo natriurético funcional compartilha pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência mostrada abaixo: X1CFGX2X3X4DRIX5X6X7SX8LGC

[0029] em que X1 e X5 são G ou S; X3 é R ou K; X6 é A ou S; e X2, X4, X7 e X8 podem ser qualquer aminoácido.

[0030] Em princípio, peptídeos natriuréticos de qualquer tipo podem ser incorporados dentro de uma região CDR de uma imunoglobulina ou fragmento da mesma, como descrito aqui. Em particular, os presentes inventores descobriram que as descobertas para um tipo de peptídeo natriurético quanto aos requisitos mínimos para uma atividade biológica satisfatória do peptídeo natriurético enxertado e especificamente sequências de aminoácido N-terminal e C-terminal adequadas podem ser conferidas a outros tipos de peptídeos natriuréticos. Sem desejar estar ligado à teoria, supõe-se que estes requisitos similares para o embutimento bem-sucedido de um peptídeo natriurético dentro de uma molécula de imunoglobulina entre os diferentes tipos de peptídeo natriurético podem ser devido às similaridades estruturais e/ou mecanismos de ação dentro da família de peptídeo natriurético.

[0031] Em modalidades particulares, o peptídeo natriurético é selecionado do grupo que consiste em ANP humano tendo a sequência de SEQ ID Nº 23, BNP humano tendo a sequência de SEQ ID Nº 24, CNP humano tendo a sequência de SEQ ID Nº 25 e um peptídeo tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 23 a 25. Novamente, o peptídeo natriurético tendo uma sequência que desvia dos peptídeos natriuréticos humanos do tipo selvagem, ANP, BNP e CNP, podem ser de qualquer origem natural, por exemplo, uma versão mutante de um peptídeo natrurético humano do tipo selvagem, ou um homólogo de diferentes espécies, ou um peptídeo natriurético projetado. Métodos para designação e construção de variantes de peptídeo são bem conhecidos por qualquer um versado na técnica.

[0032] Em tais modalidades particulares, o peptídeo natriurético tendo pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 23 a 25 é uma variante de peptídeo natriurético funcional.

[0033] A "Percentagem (%) de identidade de sequência" com respeito a uma sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente, é definida como a porcentagem de resíduos de ácido nucleico ou aminoácido, respectivamente, em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de ácido nucleico ou aminoácido, respectivamente, na sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente, após alinhar as sequências e opcionalmente introduzir espaços, se necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de sequência. Substituições conservativas não são consideradas como parte da identidade de sequência. Em modalidades particulares, quaisquer espaços introduzidos na sequência candidata e/ou a sequência de referência não podem no total ultrapassar mais do que 50%, mais do que 40%, mais do que 30%, mais do que 25%, mais do que 20%, mais do que 15% ou mais do que 10% da quantidade total de resíduos da sequência de referência. Em modalidades particulares, a porcentagem de identidade de sequência é determinada sem a introdução de quaisquer espaços na sequência candidata ou de referência (isto é, usando um alinhamento sem lacunas). O alinhamento para os propósitos de determinação de porcentagem de identidade de sequência de aminoácido pode ser obtido de várias maneiras, que estão bem dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador publicamente disponível tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento das sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo sobre o comprimento total das sequências sendo comparadas.

[0034] O peptídeo natriurético que compartilha uma determinada porcentagem de identidade de sequência com um determinado peptídeo natriurético de referência, por exemplo, BNP humano tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 24, pode conter uma ou mais mutações compreendendo uma adição, uma deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em comparação com o peptídeo natriurético de referência. De acordo com o ensinamento da presente invenção, os referidos aminoácidos deletados, adicionados e/ou substituídos podem ser aminoácidos consecutivos ou podem ser intercalados ao longo do comprimento da sequência de aminoácido do peptídeo natriurético que compartilha uma determinada porcentagem de identidade de sequência com um peptídeo natriurético de referência, por exemplo, BNP humano tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 24. No nível de DNA, as sequências de ácido nucleico que codificam o peptídeo natriurético que compartilha uma determinada porcentagem de identidade de sequência com um determinado peptídeo natriurético podem diferir-se em maior extensão devido à degenerescência do código genético.

[0035] De acordo com o ensinamento da presente invenção, qualquer número de aminoácidos pode ser adicionado, deletado e/ou substituído, contanto que identidade de sequência de aminoácido estipulada com o peptídeo natriurético de referência seja aderida. Em modalidades particulares, a identidade de sequência de aminoácido estipulada é aderida e a variante de peptídeo natriurético é biologicamente ativa, isto é, é uma variante de peptídeo natriurético funcional. Preferivelmente, a atividade biológica do peptídeo natriurético que compartilha uma determinada porcentagem de identidade de sequência com um determinado peptídeo natriurético, por exemplo, BNP humano tendo a sequência de aminoácido como encontrada na SEQ ID Nº 24, é reduzida em menos do que 90%, menos do que 80%, menos do que 70%, menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 25% ou menos do que 10% em comparação com o referido peptídeo natriurético de referência como medido no ensaio descrito acima.

[0036] O termo "anticorpo", como usado aqui, destina-se a referir- se às moléculas de imunoglobulina, moléculas de imunoglobulina particularmente diméricas compreendidas de quatro cadeias de polipeptídeo – duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) que são tipicamente interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada pode compreender, por exemplo, três domínios CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser também subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs dispostas a partir do amino-terminal para o carbóxi-terminal, por exemplo, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0037] Como usado aqui, o termo "Regiões Determinantes de Complementaridade" (CDRs; por exemplo, CDR1, CDR2, e CDR3) refere-se aos resíduos de aminoácido de um domínio variável de anticorpo, a presença dos quais é necessária para ligação de antígeno. Cada domínio variável tipicamente tem três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região determinante de complementaridade pode compreender resíduos de aminoácido de uma "região determinante de complementaridade" como definido por Kabat (por exemplo, sobre os resíduos 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) e 89- 97 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (CDRH1), 50- 65 (CDRH2) e 95-102 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada; (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immulological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "alça hipervariável" (por exemplo, sobre os resíduos 26-32 (CDRL1), 50-52 (CDRL2) e 91-96 (CDRL3) no domínio variável de cadeia leve e 26- 32 (CDRH1), 53-55 (CDRH2) e 96-101 (CDRH3) no domínio variável de cadeia pesada (Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos tanto de uma região CDR definida de acordo com Kabat quanto uma alça hipervariável.

[0038] Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos à diferentes "classes". Existem cinco principais classes de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversos destes podem também ser divididos em "subclasses" (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina de qualquer classe primária - incluindo IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY - e qualquer subclasse - incluindo, IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e Ig A2 – isolados da natureza ou preparados por métodos recombinantes e incluem todos os anticorpos convencionalmente conhecidos. Uma classe preferida de imunoglobulinas para uso na presente invenção é a IgG. O termo "anticorpo" também se estende às outras estruturas de proteína que são capazes de orientar as inserções de CDR de anticorpo na mesma conformação de ligação ativa como aquela encontrada nos anticorpos naturais, de modo que a ligação do antígeno-alvo observado com estas proteínas quiméricas seja mantida relativa à atividade de ligação do anticorpo natural a partir do qual as CDRs foram derivadas.

[0039] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "fragmento" de um anticorpo/imunoglobulina refere-se a qualquer parte de um anticorpo/imunoglobulina que compreende pelo menos uma região de CDR. Particularmente, o fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção retém a capacidade de aumentar a meia-vida sérica de um peptídeo biologicamente ativo, preferivelmente, um peptídeo natriurético, incorporado nele. Fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção incluem fragmentos de Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos de domínio simples (Dabs); anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (scFv); e fragmentos de anticorpo de Fv estabilizados por dissulfeto (dsFv); bem como anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo e fragmentos compreendendo um domínio de VL ou VH, que são preparados a partir de imunoglobulinas intactas ou preparados por métodos recombinantes.

[0040] O F(ab')2 ou Fab pode ser criado para minimizer ou remover completamente as interações de dissulfeto intermoleculares que ocorrem entre os domínios de CH1 e CL. Fragmentos de anticorpo de acordo com a presente invenção podem compreender a(s) região(ões)

variável(s) sozinha(s) ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 e CL. São também incluídos fragmentos de anticorpo compreendendo qualquer combinação de regiões variáveis com uma região dobradiça, domínio CH1, CH2, CH3 e CL.

[0041] O anticorpo ou fragmento do mesmo constitui uma estrutura que confere estabilidade ao peptídeo natriurético incorporado nela. Por exemplo, a meia-vida sérica de um peptídeo natriurético incorporado dentro da região CDR de um anticorpo como descrito aqui pode ser aumentada em comparação com aquela de um peptídeo natriurético de ocorrência natural.

[0042] Principalmente, a sequência heteróloga de aminoácido compreendendo o peptídeo natriurético pode ser incorporada dentro de qualquer molécula de imunoglobulina ou fragmento da mesma. Em particular, imunoglobulinas de qualquer espécie (incluindo, porém não limitada à humana, bovina, murina, de rato, porco, cachorro, tubarão, alpaca e camelo) e qualquer classe e subclasse primária pode ser usada de acordo com a presente invenção. Para uso terapêutico, um anticorpo humano ou humanizado pode, entretanto, ser preferível. Dentro do contexto da presente invenção, o termo "anticorpo humano" refere-se aos anticorpos tendo a sequência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e inclui anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana, de células B humanas, ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas, bem como anticorpos humanos sintéticos. Em modalidades particulares, as sequências de aminoácido de cadeia leve e cadeia pesada do domínio variável derivam de sequências de linhagem germinativa humana LV 1-40 e HV 3-23, respectivamente (para maiores informações, veja o Exemplo 1).

[0043] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "anticorpo humanizado" ou "fragmento de anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo ou fragmento do mesmo que é (i) derivado de uma fonte não humana (por exemplo, um camundongo transgênico que transporta um sistema imunológico heterólogo), cujo anticorpo é baseado em uma sequência da linhagem germinativa humana; ou (ii) quimérico, em que o domínio variável é derivado de uma origem não humana e o domínio constante é derivado de uma origem humana ou (iii) enxertado com CDR, em que as CDRs do domínio variável são de uma origem não humana, enquanto uma ou mais estruturas do domínio variável são de origem humana e o domínio constante (se houver) é de origem humana.

[0044] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser monoespecífico, biespecífico, triespecífico ou de maior multiespecificidade.

[0045] No contexto da presente invenção, o termo "compreende" ou "compreendendo" significa "incluindo, porém não limitado a". O termo destinar-se a ser aberto, para especificar a presença de quaisquer características estabelecidas, elementos, números inteiros, etapas ou componentes, porém não para impedir a presença ou adição de uma ou mais outras características, elementos, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. O termo "compreendendo" inclui, portanto, os termos mais restritivos "consistindo em" e "consistindo essencialmente em". Em uma modalidade, o termo "compreendendo" como usado ao longo do pedido e em particular nas reivindicações pode ser substituído pelo termo "consistindo em".

[0046] No contexto da presente invenção, o termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro de 80% a 120%, alternadamente dentro de 90% a 110%, incluindo dentro de 95% a 105% de um determinado valor.

[0047] No anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a invenção, a) pelo menos 12 resíduos de aminoácido estão presentes entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res S25) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res I51) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res C96) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res S25) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res Y51) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res C90) e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3; e b) pelo menos 9 resíduos de aminoácido estão presentes entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético e i) resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res M34) no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res T58) no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat (na cadeia pesada tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 65 este corresponde ao res G111) no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res D34) no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res G59) no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat (na cadeia leve tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 este corresponde ao res F102) no caso de uma incorporação da sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3.

[0048] A denominação dos resíduos de aminoácido listados acima refere-se à posição de aminoácido na molécula de imunoglobulina original antes da incorporação da sequência heteróloga de aminoácido. Dentro do contexto da presente invenção, os resíduos de aminoácido listados acima são referidos como "aminoácidos de referência" ou "aa de referência". Estes resíduos de aminoácido de referência situam-se na ou próximos às junções de estrutura de CDR, porém não necessariamente correspondem às definições mais amplas de CDR padrão CDR (as definições mais amplas de CDR padrão são resíduos de aminoácido S25 e W36 para CDRH1; S49 e R67 para CDRH2; K98 e W108 para CDRH3; C22 e W37 para CDRL1; Y51 e G59 para CDRL2; C90 e F102 para CDRL3. Jarasch e Skerra, Proteins, Janeiro de 2017; 85 (1): 65-71).

[0049] O aa N-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais a extensão de aminoácido presente entre o referido aa de referência e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido são aqui referidos como "sequência N- terminal". A sequência N-terminal compreende a Ntls. Em modalidades particulares, a sequência N-terminal consiste na Ntls mais o aa de referência N-terminal vizinho.

[0050] A extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o aa C-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais e o referido aa de referência são aqui referidos como "sequência C-terminal". A sequência C-terminal compreende a Ctls. Em modalidades particulares, a sequência C-terminal consiste na Ctls mais o aa de referência C-terminal vizinho.

[0051] Em modalidades particulares, a Ntls compreende uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4, ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 ou 21; ou uma sequência que compartilha pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nº 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 ou 21. A Ntls pode também compreender qualquer combinação das sequências de aminoácido listadas acima.

[0052] Em tais modalidades particulares, a Ntls compreende uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4, ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 7, 9, 11, 13, 15 ou 21; uma sequência que compartilha pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nº 6, 7, 9, 11, 13, 15, ou 21; ou quaisquer combinações das mesmas.

[0053] Em modalidades particulares, a Ctls compreende uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5, ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ou 22; ou uma sequência que compartilha pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ou 22. A Ctls pode também compreender qualquer combinação das sequências de aminoácido listadas acima.

[0054] Em modalidades particulares, a Ctls compreende uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5, ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 20 ou 22; uma sequência que compartilha pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 20 ou 22; ou quaisquer combinações das mesmas.

[0055] Em modalidades particulares a identidade de sequência entre a sequência compreendida na Ntls e/ou na Ctls e qualquer uma das SEQ ID Nºs 1 a 22 é de pelo menos 60%, particularmente pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%.

[0056] Dentro do contexto da presente invenção o termo "a sequência de ligante de GS" refere-se a um ligante de peptídeo compreendendo principalmente resíduos de glicina e serina. Particularmente, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% dos resíduos de aminoácido da sequência de ligante de GS de acordo com a presente invenção são selecionados de resíduos de glicina e serina. A sequência de ligante de GS de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, compreender de 1 a 30 resíduos de aminoácido no total. Particularmente, a sequência de ligante de GS de acordo com a presente invenção não compreende mais do que 3, 2 ou 1 resíduo(s) de aminoácido diferente(s) de glicina ou serina.

[0057] Dentro do contexto da presente invenção o termo "sequência de ligante de PN" refere-se a um ligante de peptídeo compreendendo principalmente resíduos de prolina e asparagina. Particularmente, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% dos resíduos de aminoácido da sequência de ligante de PN de acordo com a presente invenção são selecionados de resíduos de prolina e asparagina. A sequência de ligante de PN de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, compreender de 1 a 30 resíduos de aminoácido no total. Particularmente, a sequência de ligante de PN de acordo com a presente invenção não compreende mais do que 3, 2 ou 1 resíduo(s) de aminoácido diferente(s) de prolina ou asparagina. Outros resíduos de aminoácido que podem estar presentes em uma sequência de ligante de PN de acordo com a presente invenção são, por exemplo, resíduos de lisina ou ácido glutâmico.

[0058] Em modalidades particulares, a sequência de ligante compreendida na Ntls e/ou na Ctls e selecionada de uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; de uma estrutura de anticorpo de sequência de ligante de IgG humana; uma sequência de estrutura de domínio de Fab de IgG humana; uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de ligante de estrutura de anticorpo de IgG humana, a sequência de estrutura de domínio de IgG humana ou a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1 a 5; e uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6 a 22, compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido. A sequência de ligante compreendida na Ntls e/ou na Ctls pode, por exemplo, compreender até 30, 28, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 resíduos de aminoácido.

[0059] No caso de ligantes compreendendo uma sequência de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, pode ser particularmente vantajoso usar uma sequência de uma região estrutural que é adjacente à CDR na qual a sequência heteróloga de aminoácido é incorporada. Por exemplo, a Ntls e/ou a Ctls podem compreender um ligante compreendendo uma sequência de aminoácido que é parte da região estrutural FRH2 ou FRH3 no caso a sequência heteróloga de aminoácido é incorporada dentro do domínio de CDRH2. Similarmente, a Ntls e/ou a Ctls podem compreender um ligante compreendendo uma sequência de aminoácido que é parte de uma região estrutural FRL2 ou FRL3, no caso a sequência heteróloga de aminoácido é incorporada dentro da região CDRL2.

[0060] Em modalidades particulares, a Ntls consiste em uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 ou 21; uma sequência que compartilha pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 ou 21; ou quaisquer combinações das mesmas.

[0061] Em modalidades particulares, a Ctls consiste em uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5 uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ou 22; uma sequência que compartilha pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ou 22; ou quaisquer combinações das mesmas.

[0062] Em modalidades particulares, tanto a Ntls quanto a Ctls compreendem pelo menos uma das sequências de ligante listadas acima ou quaisquer combinações das mesmas. A princípio, qualquer uma das sequências de ligante de Ntls listadas cima pode ser combinada com as sequências de ligante de Ctls listadas acima. Em particular, qualquer sequência de ligante pode ser combinada com um ligante de GS. Como um exemplo não limitante, um ligante de Ctls de GS pode ser combinado com um ligante de Ntls compreendendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 9 ou 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 9 ou 15. Um outro exemplo não limitante é um ligante de Ntls de GS combinado com um ligante de Ctls compreendendo a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela.

[0063] As sequências de ligante listadas acima se provaram particularmente vantajosas para a obtenção de boas atividades de peptídeo natriurético, forneceram um comprimento total suficiente das sequências que flanqueiam o N-terminal e C-terminal. Sem desejar estar ligado à teoria, acredita-se que as extensões do peptídeo ligante listados acima resultem em uma conformação/dobramento que contribui para um estado favorável do sistema na apresentação de um peptídeo natriurético biologicamente ativo ao seu respectivo receptor com mínimo impedimento estérico.

[0064] Em modalidades particulares, i) a Ntls compreende uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; a sequência de SEQ ID Nºs 2, 4, 9, 11, 13 ou 15; uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID Nºs 2, 4, 9, 11, 13 ou 15; ou quaisquer combinações das mesmas e ii) a Ctls compreende uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; a sequência de SEQ ID Nºs 3, 5, 12, 14, 15 ou 20; uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID Nºs 3, 5, 12, 14, 15 ou 20; ou quaisquer combinações das mesmas. Estas sequências de ligante provaram-se particularmente úteis, visto que apenas obtêm atividades elevadas de peptídeo natriurético, porém também bons níveis de expressão na recombinante e não são propensas à fragmentação de proteínas após a expressão (veja Tabela 9).

[0065] Em modalidades particulares, a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de ligante de GS; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de ligante de PN; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a Ntls compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 e a Ctls compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende a sequência de SEQ ID Nº 6 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 7 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 8 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 10 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 11 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 12 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 13 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 14 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 16 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 17 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 17 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 18 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende a sequência de SEQ ID Nº 19 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 20 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ou a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 21 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 22 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela.

[0066] Em tais modalidades particulares, a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de ligante de GS; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de ligante de PN; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a Ntls compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 e a Ctls compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende a sequência de SEQ ID Nº 6 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 7 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 8 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 10 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 11 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 12 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 13 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 14 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 20 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ou a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 21 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 22 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela .

[0067] Em tais modalidades particulares, a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de ligante de GS; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende uma sequência de ligante de PN; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 2 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 3 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 5 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 11 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 12 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 13 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 14 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; a Ntls e a Ctls, cada qual compreende a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ou a Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 20 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela. Estas combinações de ligante provaram-se particularmente úteis para obtenção de atividades elevadas de peptídeo natriurético, bons níveis de expressão na expressão recombinante e fragmentação de proteína mínima ou nenhuma, como mostrado na Tabela 9.

[0068] Em modalidades particulares, a Ntls também compreende um elemento de ancoragem A1 em sua extremidade C terminal e/ou a Ctls também compreende um elemento de ancoragem A2 em sua extremidade N terminal, em que A1 e A2 predominantemente compreende os resíduos de glicina e serina. Em modalidades particulares, A1 e/ou A2 compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos de aminoácido. A1 e/ou A2 pode compreender até 10, 9, 8, 7, 6 ou 5 resíduos de aminoácido no total. Em modalidades particulares, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou 100% dos resíduos de aminoácido de A1 e/ou A2 são selecionados de resíduos de glicina e serina. Particularmente A1 e/ou A2 compreende/não compreende mais do que 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido diferente de glicina ou serina.

[0069] Em modalidades particulares a Ntls consiste em i) um elemento de ancoragem A1 em sua extremidade C terminal e ii) uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 ou 21; uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nº 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19 ou 21; ou quaisquer combinações das mesmas.

[0070] Em modalidades particulares, a Ctls consiste em i) um elemento de ancoragem A2 em sua extremidade N terminal e ii) uma sequência de ligante de GS; uma sequência de ligante de PN; uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5 uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5; a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ou 22; uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 6, 8, 10, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 20 ou 22; ou quaisquer combinações das mesmas.

[0071] Em modalidades particulares, a Ntls e/ou a Ctls compreende(m) pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 resíduos de aminoácido no total. A Ntls e/ou a Ctls pode, por exemplo, compreender até 30, 28, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 resíduos de aminoácido no total.

[0072] Em modalidades particulares, a extensão de aminoácido presente entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3

[0073] compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 26 a 38 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 26 a 38.

[0074] Em modalidades particulares, a extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético e i) resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3

[0075] compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 39 a 51 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 39 a 51.

[0076] Em modalidades particulares, a sequência heteróloga de aminoácido consiste na Ntls, no peptídeo natriurético e na Ctls.

[0077] Em modalidades particulares, a extensão de aminoácido presente entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3

[0078] compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 52 a 64 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou pelo menos 98% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 52 a 64.

[0079] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos dois peptídeos natriuréticos. Em modalidades particulares, ambos os peptídeos natriuréticos são compreendidos na sequência heteróloga de aminoácido também compreendendo uma Ntls e uma Ctls e incorporados dentro de uma região CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo, como descrito aqui. Os pelo menos dois peptídeos natriuréticos podem ser incorporados dentro das duas regiões CDR correspondentes de duas cadeias leves ou duas cadeias pesadas ou os pelo menos dois peptídeos natriuréticos podem ser incorporados dentro das duas regiões CDR separadas. Os pelo menos dois peptídeos natriuréticos podem ser iguais ou diferentes. Em tais modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos dois peptídeos natriuréticos diferentes que são incorporados dentro de pelo menos duas regiões CDR.

[0080] Devido à estrutura dimérica das moléculas de anticorpos, a inserção de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência heteróloga de aminoácido (Ntls-peptídeo natriurético-Ctls) no ácido nucléico que codifica a cadeia leve ou pesada de uma molécula de imunoglobulina primária produz um anticorpo de proteína contendo dois peptídeos natriuréticos localizados nas regiões CDR correspondentes das duas cadeias leves idênticas ou duas cadeias pesadas idênticas. Entretanto, é também previsto inserir dois peptídeo natriurético codificando ácidos nucleicos em duas regiões que codificam a CDR diferentes das sequências de ácido nucleico que codificam a cadeia leve e/ou pesada, desse modo produzindo uma molécula de anticorpo com quatro peptídeos natriuréticos localizados em dois pares de CDR correspondentes do anticorpo dimérico. São também abrangidas moléculas de imunoglobulina dimérica, cujos níveis de cadeias leves e/ou cadeias pesadas não são idênticos, por exemplo, incluindo anticorpos diméricos transportando um único peptídeo natriurético, bem como anticorpos diméricos transportando dois peptídeos natriuréticos diferentes nas duas regiões CDR correspondentes das duas cadeias leves ou duas cadeias pesadas.

[0081] Em modalidades particulares, peptídeos natriuréticos são inseridos na CDRH1 e CDRH2, CDRH1 e CDRH3, CDRH2 e CDRH3, CDRH1 e CDRL1, CDRH1 e CDRL2, CDRH1 e CDRL3, CDRH2 e CDRL1, ou CDRH2 e CDRL2. Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma molécula de ANP e BNP; uma molécula de ANP e CNP; ou uma molécula de BNP e CNP.

[0082] Em modalidades particulares, o peptídeo natriurético compreendido na pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma região de CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo é um BNP e o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende pelo menos um outro peptídeo natriurético. Em modalidades particulares, o pelo menos um outro peptídeo natriurético é também compreendido na sequência heteróloga de aminoácido também compreendendo uma Ntls e uma Ctls e incorporadas dentro de uma região CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo. Em modalidades particulares, o BNP e o pelo menos um outro peptídeo natriurético são incorporados dentro de duas regiões CDR correspondentes ou das duas cadeias leves ou das duas cadeias pesadas do anticorpo ou fragmento do mesmo. Em outras modalidades particulares, o BNP e o pelo menos um outro peptídeo natriurético são incorporados dentro de pelo menos duas regiões CDR separadas. Particularmente, o referido pelo menos um outro peptídeo natriurético é selecionado de ANP, BNP e CNP, mais particularmente de ANP e CNP.

[0083] A molécula de anticorpo "vazia" não aloja a sequência heteróloga de aminoácido compreendendo um peptídeo natriurético que é composto de duas cadeias pesadas tendo a sequência de SEQ ID Nº 65 e duas cadeias leves tendo a sequência de SEQ ID Nº 66 é chamada TPP-5657. Em modalidades particulares, um anticorpo molecule composto de duas cadeias pesadas tendo a sequência de SEQ ID Nº 65 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com ela e duas cadeias leves tendo a sequência de SEQ ID Nº 66 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com ela funciona como o anticorpo inicial ou parental, no qual a sequência heterólogo de aminoácido compreendendo o peptídeo natriurético é incorporada. Em tais modalidades particulares, a sequência heteróloga de aminoácido compreendendo o peptídeo natriurético é incorporada dentro de uma região CDR de uma ou ambas as cadeias pesadas de tal molécula de anticorpo.

[0084] Em tais modalidades particulares, a(s) cadeia(s) pesada(s) compreendendo a pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma de suas regiões CDR tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 67 a 79 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 67 a 79. Em modalidades particulares, o anticorpo de acordo com a presente invenção é composto de duas cadeias pesadas idênticas tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 67 a 79 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 67 a 79 e duas cadeias leves idênticas tendo a sequência de SEQ ID Nº 66 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com ela.

[0085] Em outras modalidades particulares, a sequência heteróloga de aminoácido compreendendo o peptídeo natriurético é incorporada dentro de uma região CDR de uma ou ambas as cadeias leves de tal molécula de anticorpo. Em tais modalidades particulares, a(s) cadeia(s) leve(s) compreendendo a pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma de suas regiões CDR tem(têm) a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 80 ou 81 uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 80 ou 81. Em modalidades particulares, o anticorpo de acordo com a presente invenção é composto de duas cadeias leves idênticas tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 80 ou 81 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 80 ou 81 e duas cadeias pesadas idênticas tendo a sequência de SEQ ID Nº 65 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com ela.

[0086] A tabela abaixo descreve a composição de cadeia pesada e leve de anticorpos exemplares de acordo com a presente invenção. Tabela 1: Construções de anticorpo enxertadas com peptídeo natriurético exemplar Número de TPP Cadeia pesada Cadeia leve TPP-5661 SEQ ID Nº 67 SEQ ID Nº 66 TPP-10274 SEQ ID Nº 68 SEQ ID Nº 66 TPP-10282 SEQ ID Nº 69 SEQ ID Nº 66 TPP-10283 SEQ ID Nº 70 SEQ ID Nº 66 TPP-10290 SEQ ID Nº 71 SEQ ID Nº 66 TPP-10294 SEQ ID Nº 72 SEQ ID Nº 66 TPP-10765 SEQ ID Nº 73 SEQ ID Nº 66 TPP-10845 SEQ ID Nº 74 SEQ ID Nº 66 TPP-10847 SEQ ID Nº 75 SEQ ID Nº 66 TPP-10992 SEQ ID Nº 76 SEQ ID Nº 66 TPP-13054 SEQ ID Nº 77 SEQ ID Nº 66 TPP-13061 SEQ ID Nº 78 SEQ ID Nº 66 TPP-13230 SEQ ID Nº 79 SEQ ID Nº 66 TPP-10355 SEQ ID Nº 65 SEQ ID Nº 80 TPP-10361 SEQ ID Nº 65 SEQ ID Nº 81 TPP-9902 SEQ ID Nº 442 SEQ ID Nº 66 TPP-11156 SEQ ID Nº 443 SEQ ID Nº 66 TPP-18034 SEQ ID Nº 444 SEQ ID Nº 66 TPP-12897 SEQ ID Nº 445 SEQ ID Nº 447 TPP-12377 SEQ ID Nº 445 SEQ ID Nº 66 TPP-9465 SEQ ID Nº 446 SEQ ID Nº 66

[0087] Os anticorpos da presente invenção ou fragmentos dos mesmos incluem produtos purificados de ocorrência natural, produtos de procedimentos químicos sintéticos e produtos produzidos por técnicas recombinantes. Dependendo de sua origem, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser glicosilado ou não glicosilado.

[0088] Por exemplo, metodologias de DNA recombinante padrão podem ser usadas para preparar e/ou obter ácidos nucleicos que codificam as cadeias leves e pesadas, incorporar estes ácidos nucleicos em vetores de expressão e introduzir os vetores em células hospedeiras para expressão recombinante (veja, por exemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989); Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989); Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990); e US 4,816,397 por Boss et al.).

[0089] Desse modo, em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um ácido nucleico ou uma mistura de ácidos nucleicos que codificam o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção. Estas sequências de ácido nucleico podem ser otimizadas em certos casos para expressão em mamíferos. As moléculas de DNA da invenção são não limitadas às sequências descritas aqui, porém também incluem variantes das mesmas.

[0090] A presente invenção também fornece construções de ácido nucleico recombinante compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. A construção de ácido nucleico recombinante de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, compreender um vetor de ácido nucleico, tal como um plasmídeo, no qual uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção foi inserida. Entende-se que o design do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias é afetado por fatores tais como a escolha da célula hospedeira, o nível de expressão da proteína desejada e se expressão constitutiva ou induzível é desejada.

[0091] Vetores de expressão úteis para uso bacteriano podem ser construídos inserindo uma ou mais sequências de ácido nucleico de acordo com a presente invenção juntamente com sinais de iniciação e terminação da tradução adequados na fase de leitura operável com um promotor funcional. Os vetores de expressão bacteriana contêm um ou mais marcadores fenotípicos selecionáveis e uma origem de replicação para assegurar a manutenção do vetor e, se desejável, para fornecer amplificação dentro do hospedeiro bacteriano. Os vetores de expressão bacteriana podem compreender elementos derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis, tal como o vetor de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017). Diversos vetores de expressão bacteriana podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido no anticorpo expresso ou fragmento do mesmo. Por exemplo, se uma grande quantidade de tal anticorpo for desejada, vetores que mediam alto nível de expressão de proteínas de fusão de anticorpo que são prontamente purificadas podem ser desejáveis.

[0092] Construções de ácido nucleico recombinante destinados para expressão de anticorpo em uma célula hospedeira eucariótica podem compreender sequências regulatórias que são capazes de controlar a expressão de uma estrutura de leitura aberta em uma célula eucariótica, preferivelmente um promotor e um sinal poliadenilação. Promotores e sinais de poliadenilação são preferivelmente selecionados para serem funcionais dentro do tipo celular específico para expressão de anticorpo. Exemplos de promotores adequados incluem, porém não estão limitados aos promotores de Citomegalovírus (CMV), tais como o forte promotor precoce imediato do CMV, vírus Simian 40 (SV40), vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), vírus da imunodeficiência humana (HIV), tal como o promotor de repetição de terminal longo (LTR) do HIV, vírus Moloney, vírus Epstein Barr (EBV) , adenovírus (por exemplo, o principal promotor tardio de adenovírus (AdMLP)), polioma e de Rous Sarcoma Vírus (RSV), o promotor CAG sintético composto do elemento relçador precoce de CMV, o promotor, o primeiro éxon e o primeiro íntron de gene beta-actina de frango e o aceitador de splice do gene da beta globina de coelho, bem como promotores dos genes de mamíferos, tais como actina, miosina, hemoglobina, creatina muscular e metalotioneína. Em uma modalidade particular, o cassete de expressão eucariótica contém o promotor de CMV. No contexto da presente invenção, o termo "promotor de CMV" se refere a um forte promotor de citomegalovírus precoce imediato.

[0093] Exemplos de sinais de poliadenilação adequados incluem, porém não estão limitados ao sítio de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (BGH), sinais de poliadenilação de SV40 e sinais de poliadenilação de LTR.

[0094] Além disso, a sequência de ácido nucleico recombinante pode compreender uma ou mais sequências potenciadoras. O potenciador pode ser, por exemplo, um potenciador de actina mamífera, miosina, hemoglobina, creatina muscular ou um potenciador viral, por exemplo, um potenciador de CMV, RSV, SV40 ou EBV. Para uma descrição mais detalhada dos elementos reguladores virais, e sequências dos mesmos, veja, por exemplo, US 5.168.062 por Stinski, US 4.510.245 por Bell et al. e US 4.968.615 por Schaffner et al.

[0095] Sequências regulatórias e códons são geralmente dependentes de espécie, portanto, para maximizar a produção de proteínas, as sequências regulatórias e códons são preferivelmente selecionados para serem eficazes na espécie tipo de célula pretendida para a expressão de anticorpos. A pessoa versada na técnica pode produzir moléculas de DNA recombinante que são funcionais em uma determinada espécie objeto.

[0096] Os vetores de expressão recombinantes mamíferos podem também incluir origens de replicação e marcadores selecionáveis (e veja, por exemplo, US 4.399.216, US 4.634.665 e US 5.179.017). Marcadores selecionáveis adequados incluem genes que conferem resistência aos fármacos, tais como G418, puromicina, higromicina, blasticidina, zeocina/bleomicina ou metotrexato ou marcador selecionável que explora auxotróficos tal como Glutamina Sintetase em uma célula hospedeira na qual um vetor foi introduzido. Por exemplo, o gene di-hidrofolato redutase (DHFR) confere resistência ao metotrexato, o gene neo confere resistência ao G418, o gene bsd de Aspergillus terreus confere resistência à blasticidina, puromicina N-acetil- transferase confere resistência à puromicina, o produto do gene Sh ble confere resistência à zeocina, e resistência à higromicina é conferida pelo gene de resistência à higromicina de E. coli (hig ou hph). Marcadores selecionáveis como DHFR ou Glutamina Sintetase também são úteis para técnicas de amplificação em conjunto com MTX e MSX.

[0097] Em algumas modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam as cadeias pesadas e cadeias leves são inseridas em vetores separados. Em outras modalidades, as sequências de ácido nucleico que codificam as cadeias pesadas e cadeias leves são inseridas no mesmo vetor. Além disso, as sequências de ácido nucleico que codificam regiões variáveis das cadeias pesadas e/ou leves podem ser convertidas, por exemplo, em sequências de ácido nucleico que codificam as cadeias de anticorpo de comprimento total, fragmentos de Fab, ou em scFv. O fragmento de DNA que codificam VL ou VH pode ser operativamente ligado, (de modo que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA estejam in-frame) a outro fragmento de DNA codificando, por exemplo, uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. Como um exemplo, para criar uma sequência de polinucleotídeo que codifica um scFv, os ácidos nucleicos que codificam VH e VL podem ser operavelmente ligados a outro fragmento que codifica um ligante flexível de modo que as sequências de VH e VL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões VL e VH ligadas pelo ligante flexível (veja, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554). As sequências de regiões constantes humanas de cadeia pesada e cadeia leve são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação de NIH Nº. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidas por amplificação de PCR padrão.

[0098] Em modalidades particulares, as sequências de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada na qual a sequência heteróloga de aminoácido compreendendo o peptídeo natriurético é incorporada compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 82 ou 83 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 82 ou 83. Em tais modalidades particulares, a sequência de ácido nucleico que codifica cadeia leve compreende a sequência de SEQ ID Nº 84 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com ela.

[0099] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico ou a mistura de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Dentro do contexto da presente invenção, os termos "células hospedeiras", "linhagem de célula hospedeira", e "cultura de célula hospedeira" são usados alternadamente e referem-se às células nas quais um ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. Células hospedeiras incluem "transformantes", "células transformadas",

"transfectantes", "células transfectadas", e "células transduzidas", que incluem as células primárias transformadas/transfectadas/transduzidas e progênie derivada delas, independentemente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica em teor de ácido nucleico a uma célula-mãe, e o ácido nucleico exógeno compreendido pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como analisada ou selecionada na célula originalmente transformada é incluída aqui.

[00100] A transfecção do vetor de expressão em uma célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas padrão, tais como eletroporação, nucleofecção, precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, transfecção com base em policátion tal como transfecção com base em polietilenimina (PEI) e transfecção de DEAE-dextrano.

[00101] Células hospedeiras adequadas incluem células procarióticas e eucarióticas. Exemplos de células hospedeiras procarióticas são, por exemplo, bactérias e incluem, porém não estão limitadas à Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus.

[00102] Exemplos não limitantes de células hospedeiras eucarióticas incluem leveduras, insetos e células de insetos, plantas e células de plantas, animais transgênicos e células de mamíferos. As células hospedeiras de mamífero adequadas para a expressão de anticorpos incluem Ovário de Hamster Chinês (células CHO) tais como CHO-K1, CHO-S, CHO-K1SV (incluindo células dhfr-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 e Urlaub et al., Cell. Junho de 1983; 33(2):405-12, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621; e outras células de nocaute exemplificadas em Fan et al., Biotechnol Bioeng. Abril de 2012;

109(4):1007-15), células de mieloma NS0, células COS, células HEK293, células HKB11, células BHK21, células CAP, células EB66, e células SP2.

[00103] A expressão pode também ser trnasitória ou semiestável em sistemas de expressão, tais como células HEK293, HEK293T, HEK293- EBNA, HEK293E, HEK293-6E, HEK293-Freestyle, HKB11, Expi293F, 293EBNALT75, CHO Freestyle, CHO-S, CHO-K1, CHO-K1SV, CHOEBNALT85, CHOS-XE, CHO-3E7 ou CAP-T (por exemplo Durocher et al., Nucleic acids Res. 15 de Janeiro de 2002;30(2):E9).

[00104] Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para produção de um anticorpo ou fragmento do mesmo, compreendendo cultivar a célula hospedeira de acordo com a presente invenção. Particularmente, a célula hospedeira de acordo com a presente invenção é cultivada sob condições adequadas para expressão do anticorpo ou fragmento do mesmo.

[00105] A expressão do anticorpo pode ser constitutiva ou regulada (por exemplo, induzível). Para a expressão de anticorpo induzível, uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção é tipicamente cultivada em uma densidade celular apropriada seguida por desrepressão/indução do promotor selecionado por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química tal como adição ou remoção de indutores de pequenas moléculas tal como tetraciclina em conjunto com o sistema Tet) e cultivo de uma célula hospedeira durante um período adicional.

[00106] Em modalidades particulares, o processo para a produção de um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção também compreende a etapa de recuperação do anticorpo ou fragmento do mesmo da cultura de célula hospedeira. As células, podem, por exemplo, ser colhidas por centrifugação, interrompidas por meios físicos ou químicos, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser posteriormente purificado a partir do extrato bruto resultante. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é projetado de modo que o anticorpo expresso ou fragmento do mesmo seja secretado no meio de cultura, no qual as células hospedeiras são cultivadas. Em tal caso, o anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser recuperado diretamente do meio de cultura usando métodos de purificação de proteínas padrão.

[00107] Em modalidades particulares, o processo de acordo com a presente invenção também compreende a etapa de purificação do anticorpo recuperado ou fragmento do mesmo. Particularmente, o anticorpo é purificado (1) para mais do que 90% como determinado, por exemplo, por cromatografia analítica ou por eletroforese em gel SDS- Capilar (por exemplo, em um dispositivo Caliper LabChip GXII, GX 90 ou Biorad Bioanalyzer), e, mais particularmente, a purificação produz uma homogeneidade de anticorpo de pelo menos cerca de 92,5%, 95%, 98% ou 99%; alternativamente, o anticorpo é purificado (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N-terminal ou interna, ou (3) para homogeneidade por SDS- PAGE sob condições de redução ou não redução usando Coomassie blue ou, preferivelmente, mancha prateada.

[00108] Anticorpos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a presente invenção podem ser recuperados e purificados das culturas de célula recombinante por métodos bem conhecidos incluindo, porém não limitados à precipitação de sulfato de amônio ou etanol, extração de ácido, cromatografia de proteína A, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de permuta de ânion ou cátion, cromatografia de fosfo-celulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. Cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") pode também ser empregada para purificação (veja, por exemplo, Colligan, Current

Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10).

[00109] Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção. Particularmente, a composição de acordo com a presente invenção é uma composição farmacêutica adequada para uso em um método para tratamento, em que o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é contida em uma quantidade eficaz para obter o propósito pretendido, isto é, prevenção ou tratamento de um estado de doença particular.

[00110] A composição opcionalmente também compreende pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. No contexto da presente invenção, o termo "excipiente" refere-se a uma substância natural ou sintética formulada juntamente com o ingrediente ativo de um medicamento. Os excipientes adequados incluem antiaderentes, aglutinantes, revestimentos, desintegrantes, aromatizantes, corantes, lubrificantes, deslizantes, sorventes, conservantes e adoçantes. Exemplos específicos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não estão limitados à solução salina, solução salina tamponada, dextrose, e água. No contexto da presente invenção, o termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se às entidades moleculares e outros ingredientes de composições farmacêuticas que são fisiologicamente toleráveis e não produzem tipicamente reações indesejáveis quando administradas a um mamífero (por exemplo, humano). O termo "farmaceuticamente aceitáveis" pode também significar aprovado por uma agência regulatória de um governo Federal ou Estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em mamíferos, e, mais particularmente, em humanos.

[00111] A composição de acordo com a presente invenção pode também compreender um ou mais agentes terapeuticamente ativos.

[00112] A composição farmacêutica pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, uma cápsula revestida entérica, um pó liofilizado ou qualquer forma adequada para uso pretendido.

[00113] Composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas usando excipientes farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagems adequadas para administração oral. Tais excipientes permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas na forma de comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares, para ingestão pelo paciente.

[00114] As preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através da combinação de compostos ativos com excipiente sólido, opcionalmente moendo uma mistura resultante, e processando uma mistura de grânulos, após a adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são carbo-hidratos ou proteínas, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata, ou outras plantas; celulose tal como metil-celulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou carboximetilcelulose sódica; e gomas incluindo arábica e tragacanto; e proteínas tais como gelatina e colágeno. Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes ou solubilizantes, tais como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico, ou um sal do mesmo, tal como alginato de sódio.

[00115] Núcleos de drágeas podem ser fornecidas com revestimentos adequados tais como soluções concentradas de açúcar, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, carbopol gel, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Podem ser adicionados corantes ou pigmentos aos comprimidos ou revestimentos de drágeas para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto ativo, isto é, dosagem.

[00116] As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cápsulas push-fit feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas feitas de gelatina e um revestimento tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas push-fit podem conter ingredientes ativos misturados com enchimento ou aglutinantes, tais como lactose ou amidos, lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio, e opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizantes.

[00117] As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas de um agente terapeuticamente ativo. Para injeção, as composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou salina tamponada. As suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose sódica, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente,

[00118] As suspensões do agente ativo podem ser preparadas como suspensões oleosas para injeção apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tal como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como oleato ou triglicerídeos, ou lipossomas. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes que aumentam a solubilidade do agente terapeuticamente ativo para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00119] Para administração tópica ou nasal, penetrantes apropriados para barreira particular a serem permeados são usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[00120] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas de uma maneira conhecida na técnica, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofilização.

[00121] A composição farmacêutica pode ser fornecida como um sal e pode ser formada com ácidos, incluindo, porém não limitados a clorídrico, sulfúrico, acético, lático, tartárico, málico, succínico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros protônicos que são as formas de base livre correspondentes. Em outros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofilizado em histidina a 1 mM - 50 mM, sacarose a 0,1% a 2%, manitol a 2% a 7% em uma faixa de pH de 4,5 a 7,5 que é combinada com tampão antes do uso.

[00122] Outros detalhes sobre técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.).

[00123] Após preparação de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção, ela pode ser colocada em um recipiente apropriado e rotulado para o tratamento de uma condição indicada. Para administração do anticorpo ou fragmento de acordo com a presente invenção, tal rotulagem incluiria quantidade, frequência e método de administração.

[00124] A presente invenção também fornece embalagens farmacêuticas e kits compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das referidas composições de acordo com a presente invenção. Associado com tal(is) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por um órgão governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de fármacos ou produtos biológicos, refletindo a aprovação do órgão de fabricação, uso ou venda do produto para administração humana.

[00125] Em um sexto aspecto, a presente invenção refere-se ao anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção ou a composição de acordo com a presente invenção para uso em um método para tratamento.

[00126] Particularmente, tal método para o tratamento envolve a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção. O indivíduo pode ser um animal humano ou não humano (por exemplo, coelho, rato, camundongo, cachorro, macaco ou outro primata de ordem inferior).

[00127] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é definido como a quantidade de um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção que é suficiente para prevenir ou aliviar os sintomas de doença de qualquer um dos distúrbios e doenças mencionados aqui – ou como uma única dose ou de acordo com um regime de múltiplas doses, sozinho ou em combinação com outros agentes. Em modalidades particulares, a referida "quantidade terapeuticamente eficaz" é toxicologicamente tolerável. A determinação de uma dose eficaz está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico geralmente depende muito das características particulares do paciente tais como idade, peso, gênero e estado da doença, tempo e frequência e rotina de administração, combinação(ões) de fármaco, e a natureza dos distúrbios sendo tratados. Quantidades de dosagem comum para anticorpos variam de 0,1 a 100.000 microgramas, até uma dose total de cerca de 10 g, dependendo da rotina de administração.

[00128] A orientação geral para a sua determinação pode ser encontrada, por exemplo, nas publicações da International Conference on Harmonization e em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, capítulos 27 e 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990). Mais especificamente, a determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz dependerá de tais fatores como toxicidade e a eficácia do medicamento que pode ser determinada usando métodos bem conhecidos na técnica e encontrados nas referências anteriores. Em resumo, eficácia terapêutica e toxicidade de agentes terapêuticos podem ser determinadas em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, por exemplo, como ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população), respectivamente. A relação da dose entre ED50 e LD50 é o índice terapêutico.

[00129] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é adequado para tratamento e/ou profilaxia de doenças e distúrbios cardiovasculares, renais, pulmonares, esqueletais, oculares, tromboembólicos e fibróticos, nanismo, acondroplasia, bem como outros distúrbios responsivos ao peptídeo natriuréticos e/ou relacionados com cGMP. Desse modo, em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo é para uso no tratamento e/ou profilaxia de qualquer um dos distúrbios e doenças ou quaisquer combinações dos mesmos.

[00130] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode, portanto, ser usado em medicamentos para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios cardiovasculares, por exemplo arterial e hipertensão pulmonar, hipertensão resistente e refratária, insuficiência cardíaca aguda e crônica, doença cardíaca coronária, síndrome de bronquiolite obliterante (BOS), tumor relacionado e doenças oncológicas, doença do enxerto contra hospedeiro, doença falciforme, angina pectoris estável e instável, distúrbios vasculares periféricos e cardíacos, arritmias, arritmias atriais e ventriculares e condução prejudicada, por exemplo, bloqueios atrioventriculares graus I-III (bloqueio AB I-III), taquiarritmia supraventricular, fibrilação atrial, flutter atrial, fibrilação ventricular, flutter ventricular, taquiarritmia ventricular, taquicardia Torsade de pointes, extra-sístoles atriais e ventriculares, extrassístoles juncionais AV, síndrome do seio sinusal, síncopes, taquicardia de reentrada nodal AV, síndrome de Wolff- Parkinson-White, de síndrome coronariana aguda (SCA), distúrbios cardíacos autoimunes (pericardite, endocardite, valvolite, aortite, cardiomiopatias), choque tal como choque cardiogênico, choque séptico e choque anafilático, aneurismas, cardiomiopatia boxer (contração ventricular prematura (PVC)), para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios tromboembólicos e isquemias tal como isquemia miocárdica, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, hipertrofia cardíaca, ataques transitórios e isquêmicos, pré-eclâmpsia, distúrbios cardiovasculares inflamatórios, espasmos das artérias coronárias e artérias periféricas, formação de edema, por exemplo, edema pulmonar, edema cerebral, edema renal ou edema renal por insuficiência cardíaca, distúrbios circulatórios periféricos, danos de reperfusão, trombose arterial e venosa, microalbuminúria, insuficiência miocárdica, disfunção endotelial, para prevenir reestenose, por exemplo, após terapias de trombólise, angioplastias transluminais percutâneas (PTA), angioplastias coronárias transluminais (PTCA), transplantes cardíacos e operações de bypass, e também danos micro- e macrovasculares (vasculite), aumento dos níveis de fibrinogênio e de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e concentrações aumentadas de inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), e também para tratamento e/ou profilaxia de disfunção erétil e disfunção sexual feminina.

[00131] No contexto da presente invenção, o termo "insuficiência cardíaca" abrange tanto formas agudas quanto crônicas de insuficiência cardíaca, e também tipos mais específicos ou relacionados de doença, tais como insuficiência cardíaca descompensada aguda, insuficiência cardíaca direita, insuficiência cardíaca esquerda, insuficiência global, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia idiopática, defeitos cardíacos congênitos, insuficiência cardíaca associada a defeitos da válvula cardíaca, estenose da válvula mitral, insuficiência da válvula mitral, estenose da válvula aórtica, insuficiência da válvula aórtica, estenose da válvula tricúspide, insuficiência da válvula tricúspide, estenose da válvula pulmonar, insuficiência da válvula pulmonar, defeitos combinados das válvulas cardíacas, inflamação do miocárdio (miocardite), miocardite crônica, miocardite aguda, miocardite viral, insuficiência cardíaca diabética, cardiomiopatia alcoólica, distúrbios de armazenamento cardíaco, insuficiência cardíaca diastólica e insuficiência cardíaca sistólica, insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF) e fases agudas de agravamento da insuficiência cardíaca crônica existente (agravamento da insuficiência cardíaca).

[00132] Além disso, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode também ser usado para tratamento e/ou profilaxia de arteriosclerose, doença da artéria periférica (PAD), metabolismo lipídico prejudicado, hipolipoproteinemias, dislipidemias, hipertrigliceridemias, hiperlipidemias, hipercolesterolemias, abetalipoproteinemia, sitosterolemia, xantomatose, doença de Tangier, adiposidade, obesidade e de hiperlipidemias combinadas e síndrome metabólica.

[00133] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode adicionalmente ser usado para tratamento e/ou profilaxia de fenômeno de Raynaud primário e secundário, de deficiências da microcirculação, claudicação, neuropatias periféricas e autonômicas, microangiopatias diabéticas, retinopatia diabética, úlceras diabéticas nas extremidades, gangrena, síndrome CREST, eritematose, onicomicose, distúrbios reumáticos e para promoção da cicatrização.

[00134] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é também adequada para tratamento de distúrbios urológicos, por exemplo, síndrome benigna da próstata (BPS), hiperplasia benigna da próstata (BPH), aumento benigno da próstata (BPE), obstrução da saída da bexiga (BOO), síndromes do trato urinário inferior (LUTS, incluindo Síndrome Urológica Felina (FUS)), distúrbios do sistema urogenital incluindo bexiga hiperativa neurogênica (OAB) e (IC), incontinência (IU), por exemplo, incontinência urinária mista, incontinência urinária de urgência, incontinência urinária de esforço ou incontinência urinária de transbordamento (MUI, UUI, SUI, OUI), dor pélvica, distúrbios benignos e malignos dos órgãos do sistema urogenital masculino e feminino.

[00135] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é também adequada para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios renais, em particular de insuficiência renal aguda e crônica e falha renal crônica ou aguda. No contexto da presente invenção, o termo "insuficiência renal" abrange tanto manifestações crônicas quanto a agudas de insuficiência renal, e também subjacentes ou relacionados aos distúrbios renais como hipoperfusão renal, hipotensão intradialítica, uropatia obstrutiva, glomerulopatias, glomerulonefrite, glomerulonefrite aguda, glomeruloesclerose, doenças túbulo-intersticiais, distúrbios nefropáticos, tais como doença renal primária e congênita, nefrite, distúrbios renais imunológicos, tais como rejeição de transplante renal e distúrbios renais induzidos por imunocomplexos, nefropatia induzida por substâncias tóxicas, nefropatia induzida por agentes de contraste,

nefropatia diabética e não diabética, pielonefrite, cistos renais, nefroesclerose, nefroesclerose hipertensiva e síndrome nefrótica que pode ser caracterizada diagnosticamente, por exemplo, por creatinina e/ou excreção de água anormalmente reduzida, concentrações sanguíneas anormalmente elevadas de ureia, nitrogênio, potássio e/ou creatinina, atividade alterada de enzimas renais, por exemplo, glutamil sintetase, osmolaridade urinária ou volume urinário alterados, microalbuminúria elevada, macroalbuminúria, lesões em glomérulas e arteríolas, dilatação tubular, hiperfosfatemia e/ou necessidade de diálise. A presente invenção também abrange o uso do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção para tratamento e/ou profilaxia de sequelas de insuficiência renal, por exemplo, edema pulmonar, insuficiência cardíaca, uremia, anemia, distúrbios eletrolíticos (por exemplo, hipercalemia, hiponatremia) e distúrbios no metabolismo ósseo e de carboidratos.

[00136] Além disso, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é também adequado para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios asmáticos, hipertensão arterial pulmonar (HAP) e outras formas de hipertensão pulmonar (PH) incluindo doença do coração esquerdo, HIV, anemia falciforme, tromboembolismo (CTEPH), sarcoidose, DPOC ou hipertensão pulmonar associada com fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI), deficiência de alfa-1-antitripsina (AATD), fibrose pulmonar, enfisema pulmonar (por exemplo, enfisema pulmonar induzido pela fumaça do cigarro). Síndrome de bronquiolite obliterante (BOS) e fibrose cística (CF).

[00137] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é também adequado para o controle de distúrbios do sistema nervoso central caracterizados por distúrbios do sistema

NO/cGMP. É adequado em particular para melhorar a percepção, concentração, aprendizagem ou memória após deficiências cognitivas, como aquelas que ocorrem em particular em associação com situações/doenças/síndromes, tal como deficiência cognitiva leve, comprometimento de aprendizagem associada à idade e deficiências de memória, perdas de memória associadas à idade, demência vascular, trauma craniocerebral, acidente vascular cerebral, demência que ocorre após acidentes vasculares cerebrais (demência pós-acidente vascular cerebral), trauma craniocerebral pós-traumático, comprometimentos gerais de concentração, deficiências de concentração em crianças com problemas de aprendizagem e memória, doença de Alzheimer, demência do corpo de Lewy, demência com degeneração dos lobos frontais incluindo síndrome de Pick, doença de Parkinson, paralisia nuclear progressiva, demência com degeneração corticobasal, esclerose amiolateral (ELA), doença de Huntington, desmielinização, esclerose múltipla, degeneração talâmica, demência de Creutzfeld- Jacob, demência por HIV, esquizofrenia com demência ou psicose de Korsakoff. É também adequado para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios do sistema nervoso central tais como estados de ansiedade, tensão e depressão, disfunções sexuais e distúrbios do sono relacionados com o SNC, e para controlar distúrbios patológicos da ingestão de alimentos, estimulantes e substâncias aditivas.

[00138] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é adicionalmente também adequado para o controle do fluxo sanguínea cerebral e desse modo representa agentes eficazes para o controle de enxaqueca. É também adequado para profilaxia e controle de sequelas de infarto cerebral (Apoplexia cerebral) tal como acidente vascular cerebral, isquemias cerebrais e traumatismo cranioencefálico. Ele também pode ser usado para controlar estados de dor e zumbido.

[00139] Além disso, o anticorpo ou fragmento de acordo com a presente invenção tem ação anti-inflamatória e pode, portanto, ser usado como agentes anti-inflamatórios para tratamento e/ou profilaxia de sepse (SIRS), falência de múltiplos órgãos (MODS, MOF), distúrbios inflamatórios do rim, inflamações intestinais crônicas (DII, doença de Crohn, UC), pancreatite, peritonite, distúrbios reumatoides, doenças inflamatórias da pele e doenças inflamatórias dos olhos.

[00140] Além disso, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode também ser usado para tratamento e/ou profilaxia de doenças autoimunes.

[00141] O anticorpo ou fragmento do mesmo é também adequado para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios fibróticos dos órgãos internos, por exemplo, o pulmão, o coração, o rim, o aparelho reprodutor, a medula óssea e em particular o fígado, e também fibrose dermatológica e distúrbios fibróticos oculares. No contexto da presente invenção, o termo distúrbios fibróticos inclui, em particular, os seguintes termos: fibrose hepática, cirrose do fígado, fibrose pulmonar, fibrose endomiocárdica, nefropatia, glomerulonefrite, fibrose renal intersticial, dano fibrótico resultante de diabetes, fibroides uterinos, endometriose, fibrose da medula óssea e distúrbios fibróticos similares, esclerodermia, morfeia, queloides, cicatrizes hipertróficas (também após procedimentos cirúrgicos), nevos, retinopatia diabética, vitrorretinopatia proliferativa e distúrbios do tecido conjuntivo (por exemplo, sarcoidose).

[00142] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é também adequado para o controle de cicatrização pós-operatória, por exemplo, tal como resultado de operações de glaucoma.

[00143] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode igualmente ser usado cosmeticamente para envelhecimento e pele queratinizada.

[00144] Além disso, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é adequado para tratamento e/ou profilaxia de hepatite, neoplasmas, osteoporose, glaucoma e gastroparesia.

[00145] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é, além disso, adequado para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios oculares, tais como doenças oftálmicas responsivas aos peptídeos natriuréticos, distúrbios de retina, glaucoma incluindo glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA), glaucoma de ângulo fechado, e glaucoma congênito/de desenvolvimento, retinopatias, trauma ocular, neuropatias óticas, hipertensão ocular, pressão intraocular elevada, retinopatia diabética, degeneração macular (AMD), doenças oculares relacionadas à idade, edema macular, esclerite, uveíte, olho seco, abrasão epitelial da córnea, úlcera da córnea.

[00146] Além disso, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é adequado para o tratamento de distúrbios ósseos ou de cartilagem tais como doenças ósseas e de cartilagem responsivas aos peptídeos natriuréticos, artrite, doenças degenerativas do tecido de cartilagem, osteoartrite, degeneração da cartilagem, fraturas ósseas, displasias esqueléticas, acondroplasia, osteoporose, osteogênese imperfeita, doença óssea de Paget (PDB), doença óssea metabólica, doenças ósseas relacionadas à idade, osteomielite, osteonecrose, raquitismo, osteomalacia, lesões e doenças da placa de crescimento, defeitos associados à substituição óssea e articular, síndrome de Marfan, lesões esportivas, distrofias musculares, distrofia muscular de Duchenne.

[00147] Desse modo, em outro aspecto, a presente invenção refere- se ao uso do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios, em particular os distúrbios mencionados acima.

[00148] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é para uso em um método para tratamento e/ou profilaxia de insuficiência cardíaca, angina pectoris, hipertension, hipertensão pulmonar, isquemias, distúrbios vasculares, insuficiência renal, distúrbios tromboembólicos, distúrbios fibróticos, distúrbios esqueletais e ósseos, distúrbios oculares e arteriosclerose.

[00149] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção para produção de um medicamento para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios, especificamente dos distúrbios anteriormente mencionados.

[00150] Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se ao uso do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção para a produção de um medicamento para tratamento e/ou profilaxia de insuficiência cardíaca, angina pectoris, hipertensão, hipertensão pulmonar, isquemias, distúrbios vasculares, insuficiência renal, distúrbios tromboembólicos, distúrbios fibróticos, doença demencial, arteriosclerose, distúrbios esqueletais e ósseos, distúrbios oculares, nanismo, acondroplasia e disfunção erétil.

[00151] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para tratamento e/ou profilaxia de distúrbios, em particular os distúrbios mencionados acima, usando uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção.

[00152] Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se a um método para tratamento e/ou profilaxia de insuficiência cardíaca, angina pectoris, hipertensão, hipertensão pulmonar, isquemias, distúrbios vasculares, insuficiência renal, distúrbios tromboembólicos, distúrbios fibróticos, tumor e doenças oncológicas, distúrbios esqueletais e ósseos, distúrbios oculares, nanismo, acondroplasia e arteriosclerose usando uma quantidade eficaz de pelo menos um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção.

[00153] Um anticorpo da invenção ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser administrado como o único agente farmacêutico ou em combinação com um ou mais agentes farmacêuticos adicionais, e em alguns casos, o anticorpo pode por si só ser modificado. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser conjugado a uma entidade química por exemplo, para também aumentar a eficácia, estabilidade e/ou meia-vida. Particularmente, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser PEGuilado e/ou HESilado.

[00154] Desse modo, em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é usado em combinação com pelo menos um agente terapêutico adicional em um método de tratamento, em particular para os propósitos citados acima.

[00155] A presente invenção também fornece combinações farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00156] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "combinação farmacêutica" é usado como conhecido pelas pessoas versadas na técnica, sendo possível tal combinação ser uma combinação fixa, uma combinação não fixa ou um kit de partes.

[00157] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "combinação fixa" é usado como conhecido pelas pessoas versadas na técnica e é definida como uma combinação em que, por exemplo, um primeiro ingrediente ativo, tal como um ou mais anticorpos ou fragmentos dos mesmos de acordo com a presente invenção, e um outro ingrediente ativo estão juntamente presentes em uma dosagem unitária ou em uma única entidade, por exemplo, uma única formulação de dosagem. Um exemplo de uma "combinação fixa" é uma composição farmacêutica em que um primeiro ingrediente ativo e um outro ingrediente ativo estão presentes na mistura para administração simultânea, tal como em uma formulação. Outro exemplo de uma "combinação fixa" é uma combinação farmacêutica, em que um primeiro ingrediente ativo e um outro ingrediente ativo estão presentes em uma unidade sem estar em mistura. A presente invenção, desse modo, fornece tais composições farmacêuticas compreendendo pelo menos um anticorpo ou fragmento do mesmo e pelo menos um agente terapêutico adicional, em particular para uso no tratamento e/ou profilaxia dos distúrbios anteriormente mencionados.

[00158] Dentro do contexto da presente invenção, os termos "combinação não fixa" e "kit de partes" são usados como conhecido pelas pessoas versadas na técnica e são definidos como uma combinação, em que um primeiro ingrediente ativo e um outro ingrediente ativo estão presentes em mais do que uma unidade, por exemplo, em formulações de dosagem separada. Um exemplo de uma combinação não fixa ou kit de partes é uma combinação, em que o primeiro ingrediente ativo e o outro ingrediente ativo estão separadamente presentes.

[00159] É possível que os componentes da combinação não fixa ou kit de partes sejam administrados separada, sequencial, simultânea, concorrente ou cronologicamente escalonados.

[00160] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser administrado simultaneamente com, antes de ou após o referido outro agente terapeuticamente ativo. No contexto da presente invenção, o termo "simultaneamente com" significa a administração do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e o pelo menos um outro agente terapeuticamente ativo no mesmo dia, mais particularmente dentro de um período de 12 horas, mais particularmente dentro de um período de duas horas.

[00161] Em modalidades particulares, a administração do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e do pelo menos um outro agente terapeuticamente ativo ocorre dentro de um período de oito semanas consecutivas, mais particularmente dentro de um a seis semanas consecutivas. O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção e pelo menos um outro agente terapeuticamente ativo podem ser administrados por meio da mesma rotina ou por meio de rotinas diferentes.

[00162] O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser combinado com agentes conhecidos do mesmo grupo de tratamento de indicação, tal como agentes usados para o tratamento e/ou profilaxia de doenças e/ou condições associadas com hipertensão, insuficiência cardíaca, hipertensão pulmonar, COPD, asma, fibrose cística, acondroplasia, hiperfosfatemia, doença renal crônica (CKD), calcificação de tecido mole, calcificação associada com doença renal crônica, calcificação associada com doença renal não crônica, calcificações médias incluindo esclerose medial de Moenckeberg, aterosclerose, calcificação íntima, hipertrofia cardíaca associada à DRC, distrofia renal associada à DRC, osteoporose, osteoporose pós-menopausa, diabetes melito II, doença renal crônica, envelhecimento, hipofosfatúria, hiperparatireoidismo, distúrbios de Vitamina D, deficiência de Vitamina K, coagulantes de antagonista de Vitamina K, doença de Kawasaki, ACDC (calcificação arterial devido à deficiência de CD73), GACI (calcificação arterial generalizada da infância), IBGC (calcificação idiopática dos gânglios basais), PXE (pseudoxantoma elástico), artrite reumatoide, síndrome de Singleton-Merten, P-talassemia, calcifilaxia, ossificação heterotrófica, calcificação placentária pré-termo, calcificação do útero, miomas uterinos calcificados, morbus fahr, mircocalcificação e calcificação da válvula aórtica.

[00163] Exemplos preferidos de outros agentes terapêuticos adequados a ser combinados com o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção:

[00164] Nitratos orgânicos e doadores de NO, por exemplo, nitroprussiato de sódio, nitroglicerina, mononitrato de isossorbida, dinitrato de isossorbida, molsidomina ou SIN-1, e NO inalado;

[00165] Compostos que inibem a quebra do monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), por exemplo, ininidores de fosfodiesterases (PDE) 1, 2 e/ou 5, especificamente inibidores de PDE 5 tais como sildenafil, vardenafil, tadalafil, udenafil, desantafil, avanafil, mirodenafil, lodenafil ou PF-00489791;

[00166] Agentes antitrombóticos, por meio de exemplo e com preferência do grupo dos inibidores de agregação de plaqueta, os anticoagulantes ou as substâncias profibrinolíticas;

[00167] Ingredientes ativos hipotensivos, por meio de exemplo e com preferência do grupo dos antagonistas de cálcio, antagonistas da angiotensina AII, inibidores da ACE, inibidores de NEP, inibidores da vasopeptidase, antagonistas da endotelina, inibidores da renina, bloqueadores do receptor alfa, bloqueadores do receptor beta, antagonistas do receptor mineralocorticoide, inibidores da rho-cinase e os diuréticos;

[00168] Agentes antiarrítmicos, por meio de exemplo e com preferência do grupo de bloqueador do canal de sódio, bloqueador do receptor beta, bloqueador do canal de potássio, antagonistas do cálcio, bloqueador do canal If, digitálicos, parassimpatolíticos (vagolíticos), simpaticomiméticos e outros antiarrítmicos como adenosina, agonistas do receptor de adenosina, bem como vernacalante;

[00169] Agentes inotrópicos positivos, por meio de exemplo, glicosídeo cardíaco (dogoxina), beta-adrenérgicos e agonistas dopaminérgicos, tais como isoprenalina, adrenalina, noradrenalina, dopamina ou dobutamina;

[00170] Antagonistas de receptor de vasopressina, por meio de exemplo e com preferência do grupo de conivaptan, tolvaptan, lixivaptan, mozavaptan, satavaptan, SR-121463, RWJ 676070 ou BAY 86-8050, bem como os compostos descritos no WO 2010/105770, WO2011/104322 e WO 2016/071212;

[00171] Ingredientes ativo que alteram o metabolismo lipídico, por exemplo e com preferência do grupo dos agonistas do receptor da tireoide, inibidores de PCSK9, inibidores da síntese de colesterol tal como, por meio de exemplo e preferivelmente, inibidores da HMG-CoA redutase ou inibidores da síntese de esqualeno, de inibidores de ACAT, inibidores de CETP, inibidores de MTP, PPAR-alfa, PPAR-gama e/ou agonistas de PPAR-delta, inibidores da absorção do colesterol, inibidores da lipase, adsorventes do ácido biliar polimérico, inibidores de reabsorção do ácido biliar e antagonistas de lipoproteína(a).

[00172] Agentes anti-inflamatórios, por exemplo, e com preferência do grupo dos glico-corticoides, tais como, por meio de exemplo e preferivelmente, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, triamcinolona, dexametasona, beclometasona, betametasona, flunisolida, budesonida ou fluticasone, bem como os agentes anti- inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), por meio de exemplo e preferivelmente, ácido acetilsalicílico (aspirina), ibuprofeno e naproxeno, derivados do ácido 5-amino salicílico, antagonistas de leucotrieno, inibidores de TNF-alfa e antagonistas de receptor de quimiocina, tal como CCR1, 2 e/ou 5 inibidores;

[00173] agentes que inibem as cascatas de transduções de sinal, por exemplo e com preferência do grupo dos inibidores de cinase, por meio de exemplo e preferivelmente, do grupo dos inibidores de tirosina cinase e/ou serina/treonina cinase;

[00174] agentes, que inibem a degradação e modificação da matriz extracelular, por exemplo, e com preferência do grupo dos inibidores das matriz-metaloproteases (MMPs), por meio de exemplo e preferivelmente, inibidores de quimase, estromelisina, colagenases, gelatinases e agrecanases (com preferência do grupo de MMP-1, MMP- 3, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 e MMP-13), bem como da metalo- elastase (MMP-12) e neutrófilos-elastase (HNE), como, por exemplo sivelestate ou DX-890;

[00175] agentes, que bloqueiam a ligação de serotonina a seu receptor, por exemplo e com preferência aos antagonistas do receptor 5-HT2b;

[00176] agentes antifibróticos, por exemplo, e com preferência, nintedanibe, pirfenidona, antagonistas de receptor de adenosina A2b, antagonistas do receptor de esfingosina-1-fosfato 3 (S1P3), inibidores de autotaxina, antagonistas do receptor do ácido lisofosfatídico 1 (LPA- 1) e do receptor do ácido lisofosfatídico 2 (LPA-2), inibidores da lisiloxidase (LOX), inibidores do tipo lisiloxidase-2, inibidores do CTGF, antagonistas da IL-13, antagonistas da integrina, antagonistas do TGF- beta, inibidores da sinalização wnt, antagonistas de CCR2;

[00177] agentes que agem como broncodilatadores, por exemplo, e com preferência aos antagonistas do receptor 5-HT2b; agonistas β2("beta dois")-adrenérgicos (de curta e longa ação), anticolinérgicos, e teofilina;

[00178] agentes que são antagonistas de citocinas e quimiocinas, por exemplo, e com preferência aos antagonistas de TGF-beta, CTGF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, IL-25, IL-33, TSLP e integrinas;

[00179] nitratos orgânicos e doadores de NO, por exemplo, e com preferência ao nitroprussiato de sódio, nitroglicerina, mononitrato de isossorbida, dinitrato de isossorbida, molsidomina ou SIN-1, bem como NO inalado;

[00180] estimuladores independentes de NO, porém dependentes de heme da guanilato ciclase solúvel, por exemplo, e com preferência aos compostos descritos no WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301, WO 03/095451, WO 2011/147809, WO 2012/004258, WO 2012/028647 e WO 2012/059549;

[00181] ativadores independentes de NO e independents de heme da guanilato cyclase solúvel, por exemplo, e com preferência aos compostos descritos no WO 01/19355, WO 01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 e WO 02/070510;

[00182] agentes que estimulam a síntese de cGMP, por exemplo, moduladores de sGC, por exemplo, e com preferência ao riociguate, cinaciguate, vericiguate;

[00183] análogos de prostaciclina ou agonistas do receptor de IP, por exemplo, e com preferência ao iloproste, beraproste, treprostinil, epoprostenol ou Selexipag;

[00184] antagonistas do receptor de endotelina, por exemplo, e com preferência ao Bosentan, Darusentan, Ambrisentan oder Sitaxsentan;

[00185] agentes, que inibem a epóxi-hidrolase solúvel (sEH), por exemplo, e com preferência à N,N'-Di-ciclo-hexila ureia, ácido 12-(3- adamantan-1-il-ureido)-dodecânico ou 1-Adamantan-1-il-3-{5-[2-(2- etoxietóxi)etóxi]pentil}-ureia;

[00186] agentes que interagem com metabolismo de glicose, por exemplo, e com preferência à insulina, biguanida, tiazolidinadiona, sulfonil ureia, acarbose, inibidores de DPP4, análogos de GLP-1 ou inibidores de SGLT-1;

[00187] peptídeos natriuréticos, por exemplo, e com preferência ao Peptídeo Natriurético Atrial (ANP, Carperitide), Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP, Nesiritide), Peptídeo Natriurético do Tipo C (CNP) ou urodilatina;

[00188] derivados de peptídeo natriurético, por exemplo, e com preferência à vosoritide, cenderitide, PL 3994

[00189] ativadores da miosina cardíaca, por exemplo, e com preferência ao omecamtiv mecarbil (CK-1827452);

[00190] sensibilizantes do cálcio, por exemplo, e com preferência ao levosimendan;

[00191] agentes que afetam o metabolismo energético do coração, por exemplo, e com preferência ao etomoxir, dicloroacetat, ranolazina ou trimetazidina, agonistas totais ou parciais do receptor de adenosina A1, tais como GS-9667 (anteriormente conhecido como CVT-3619), capadenosona e neladenosona;

[00192] agentes que afetam a frequência cardíaca, por exemplo, e com preferência à ivabradina.

[00193] Agentes antitrombóticos são preferivelmente entendidos significar compostos do grupo dos inibidores de agregação de plaqueta, os anticoagulantes ou substâncias profibrinolíticas.

[00194] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de agregação de plaqueta, por meio de exemplo e com preferência à aspirina, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, ticlopidina ou dipiridamol.

[00195] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de trombina, por meio de exemplo e com preferência ao ximelagatran, dabigatran, melagatran, bivalirudina ou clexano.

[00196] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista de GPIIb/IIIa tal como, por meio de exemplo e com preferência, tirofiban ou abciximabe.

[00197] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de fator Xa, por meio de exemplo e com preferência ao rivaroxaban, DU-176b, apixaban, betrixaban,

otamixaban, fidexaban, razaxaban, letaxaban, eribaxaban, fondaparinux, idraparinux, PMD-3112, darexaban (YM-150), KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 ou SSR-128428.

[00198] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com heparina ou com um derivado de heparina de baixo peso molecular (LMW).

[00199] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista de vitamina K, por meio de exemplo e com preferência à cumarina.

[00200] Agentes hipotensivos são preferivelmente entendidos significar compostos do grupo dos antagonistas de cálcio, antagonistas da angiotensina AII, inibidores de ACE, antagonistas da endotelina, inibidores da renina, bloqueadores do alfa-receptor, bloqueadores do beta-receptora, antagonistas do receptor de mineralocorticoide, inibidores da rho-cinase e os diuréticos.

[00201] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista do cálcio, por meio de exemplo e com preferência à nifedipina, amlodipina, verapamil ou diltiazem.

[00202] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um bloqueador do alfa-1-receptor, por meio de exemplo e com preferência à prazosina.

[00203] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um bloqueador de beta-receptor, por meio de exemplo e com preferência ao propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol,

oxprenolol, penbutolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepindolol, carazalol, sotalol, metoprolol, betaxolol, celiprolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, labetalol, carvedilol, adaprolol, landiolol, nebivolol, epanolol ou bucindolol.

[00204] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista da angiotensina AII, por meio de exemplo e com preferência ao losartan, candesartan, valsartan, telmisartan ou embusartan ou um inibidor do antagonista da angiotensina AII dual/neprilisina, por meio de exemplo e com preferência ao LCZ696 (valsartan/sacubitril).

[00205] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de ACE, por meio de exemplo e com preferência ao enalapril, captopril, lisinopril, ramipril, delapril, fosinopril, quinopril, perindopril ou trandopril.

[00206] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista da endotelina, por meio de exemplo e com preferência ao bosentan, darusentan, ambrisentan ou sitaxsentan.

[00207] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor da renina, por meio de exemplo e com preferência ao aliscireno, SPP-600 ou SPP-800.

[00208] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista do receptor de mineralocorticoide, por meio de exemplo e com preferência à finerenona, espironolactona ou eplerenona.

[00209] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um diurético da alça, por exemplo, furosemida, torasemida, bumetanida e piretanida, com diuréticos poupadores de potássio, por exemplo, amilorida e triantereno, com antagonistas de aldosterona, por exemplo, espironolactona, canrenoato de potássio e eplerenona, e também diuréticos tiazídicos, por exemplo, hidroclorotiazida, clortalidona, xipamida e indapamida.

[00210] Modificadores do metabolismo lipídico são preferivelmente entendidos significar compostos do grupo dos inibidores de CETP, antagonistas do receptor da tiroide, inibidores da síntese de colesteraol, tais como inibidores da HMG-CoA reductase ou inibidores da síntese de esqualeno, os inibidores de ACAT, inibidores de MTP, agonistas de PPAR-alfa, PPAR-gama e/ou PPAR-delta, inibidores de absorção de colesterol, adsorventes de ácido biliar poliméricos, inibidores da reabsorção de ácido biliar, inibidores da lipase e os antagonistas da lipoproteína(a).

[00211] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de CETP, por meio de exemplo e com preferência ao dalcetrapib, anacetrapib, torcetrapib (CP-529 414), JJT- 705 ou vacina CETP (Avant).

[00212] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um agonista do receptor da tiroide, por meio de exemplo e com preferência à D-tiroxina, 3,5,3'-tri-iodotironina (T3), CGS 23425 ou axitiroma (CGS 26214).

[00213] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor da HMG-CoA reductase da classe das estatinas, por meio de exemplo e com preferência à lovastatina, sinvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatina ou pitavastatina.

[00214] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor da síntese de esqualeno, por meio de exemplo e com preferência à BMS-188494 ou TAK-475.

[00215] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de ACAT, por meio de exemplo e com preferência à avasimibe, melinamida, pactimibe, eflucimibe ou SMP-

797.

[00216] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de MTP, por meio de exemplo e com preferência à implitapida, BMS-201038, R-103757 ou JTT-130.

[00217] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um agonista de PPAR-gama, por meio de exemplo e com preferência à pioglitazona ou rosiglitazona.

[00218] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com a PPAR-delta agonist, por meio de exemplo e com preferência à GW 501516 ou BAY 68-5042.

[00219] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de absorção de colesterol, por meio de exemplo e com preferência à ezetimibe, tiquesida ou pamaquesida.

[00220] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor da lipase, um exemplo preferido sendo orlistate.

[00221] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um adsorvente de ácido biliar polimérico, por meio de exemplo e com preferência à colestiramina, colestipol, colesolvam, ColestaGel ou colestimida.

[00222] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de reabsorção de ácido biliar, por meio de exemplo e com preferência aos inibidores de ASBT (= IBAT), por exemplo, AZD-7806, S-8921, AK-105, BARI-1741, SC-435 ou SC-635.

[00223] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista da lipoproteína(a), por meio de exemplo e com preferência, gencabeno cálcico (CI-1027) ou ácido nicotínico.

[00224] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista da lipoproteína(a), por meio de exemplo e com preferência, gencabeno cálcico (CI-1027) ou ácido nicotínico.

[00225] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com sGC modulatores, por meio de exemplo e com preferência, riociguat, cinaciguat ou vericiguat.

[00226] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um agente que afeta o metabolismo de glicose, por meio de exemplo e com preferência, insulina, uma sulfonil ureia,

acarbose, inibidores DPP4, análogos GLP-1 ou inibidores SGLT-1.

[00227] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista de TGFbeta, por meio de exemplo e com preferência à pirfenidona, nintedanibe ou fresolimumabe.

[00228] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista de CCR2, por meio de exemplo e com preferência ao CCX-140.

[00229] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um antagonista de TNFalfa, por meio de exemplo e com preferência ao adalimumabe.

[00230] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de galectina-3, por meio de exemplo e com preferência ao GCS-100.

[00231] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de Nrf-2, por meio de exemplo e com preferência à bardoxolona.

[00232] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um agonista do BMP-7, por meio de exemplo e com preferência ao THR-184.

[00233] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de NOX1/4, por meio de exemplo e com preferência ao GKT-137831.

[00234] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um medicamento que afeta o metabolismo de vitamina D, por meio de exemplo e com preferência ao calcitriol, alfacalcidol, doxercalciferol, maxacalcitol, paricalcitol, colecalciferol ou paracalcitol.

[00235] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um agente citostático, por meio de exemplo e com preferência à ciclofosfamida.

[00236] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um agente imunossupressor, por meio de exemplo e com preferência à ciclosporina.

[00237] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um aglutinante de fosfato, por meio de exemplo e com preferência ao colestilan, cloridrato de sevelamer e carbonato de sevelamer, Lantânio e carbonato de lantânio.

[00238] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com cotransportador de fosfato de sódio de túbulo proximal renal, por meio de exemplo e com preferência, niacina ou nicotinamida.

[00239] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um calcimimético para terapia de hiper-paratiroidismo.

[00240] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com agentes para terapia de déficit de ferro, por meio de exemplo e com preferência aos produtos de ferro.

[00241] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com agentes para a terapia de hiperuricemia, por meio de exemplo e com preferência ao alopurinol ou rasburicase.

[00242] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com hormônio de glicoproteína para a terapia de anemia, por meio de exemplo e com preferência à eritropoietina.

[00243] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com biológicos para terapia imune, por meio de exemplo e com preferência ao abatacept, rituximabe, eculizumabe ou belimumabe.

[00244] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com antagonistas da vasopressina (grupo dos vaptanos) for o tratamento de insuficiência cardíaca, por meio de exemplo e com preferência à tolvaptan, conivaptan, lixivaptan, mozavaptan, satavaptan ou relcovaptan.

[00245] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com inibidores de Jak, por meio de exemplo e com preferência ao ruxolitinibe, tofacitinibe, baricitinibe, CYT387, GSK2586184, lestaurtinibe, pacritinibe (SB1518) ou TG101348.

[00246] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com análogos de prostaciclina para terapia de microtrombos.

[00247] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com uma terapia alcalina, por meio de exemplo e com preferência ao bicarbonato de sódio.

[00248] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de mTOR, por meio de exemplo e com preferência ao everolimo ou rapamicina.

[00249] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de NHE3, por meio de exemplo e com preferência ao AZD1722 ou tenapanor.

[00250] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um modulador de eNOS, por meio de exemplo e com preferência à sapropterina.

[00251] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção é administrado em combinação com um inibidor de CTGF, por meio de exemplo e com preferência ao FG-3019.

[00252] O anticorpo ou fragmento do mesmo para uso em um método para tratamento de acordo com a presente invenção pode ser formulado de qualquer maneira convencional usando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser administrado por quaisquer meios adequados, que podem variar, dependendo do tipo de distúrbio a ser tratado. Possíveis rotinas de administração incluem administração enteral (por exemplo, oral), parenteral (por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intracardíaca, intraventricular, intratecal, intramedular, intralesional), intrapulmonar e intranasal. Além disso, um anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode ser administrado por infusão de pulso, com, por exemplo, doses decrescentes do anticorpo ou fragmento do mesmo. Preferivelmente, a dosagem é fornecida por meio de injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a condição é aguda ou crônica. A quantidade a ser administrada dependerá de uma variedade de fatores, tais como sintomas clínicos, sexo, idade, e/ou peso do indivíduo, se outros fármacos são administrados, e outros. O técnico versado na técnica reconhecerá que a rotina de administração irá variar dependendo do distúrbio ou condição a ser tratada.

[00253] Métodos de liberação parenteral incluem administração tópica, intra-arterial, intratumoral, intramuscular, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, ou intranasal.

[00254] Em modalidades particulares, o método para tratamento compreende uma única administração ou múltiplas administrações do anticorpo ou fragmento do mesmo ou a composição farmacêutica compreendendo o mesmo. A dose única das administrações pode ser igual ou diferente. Em particular, o método para tratamento compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 administrações do anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção, preferivelmente em que as múltiplas administrações ocorrem dentro de um período de um a seis meses consecutivos. O anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, ser administrado a cada 3 a 4 dias, todas as semanas, uma vez a cada duas semanas, ou uma vez a cada três semanas, dependendo da sua meia-vida e taxa de depuração. Breve Descrição das Figuras

[00255] Figura 1: Concentrações plasmáticas médias de TPP-10992 e TPP-5661 após administração intravenosa de 5 mg/kg em rato.

[00256] Figura 2: Concentrações plasmáticas médias de TPP-12897 após administração intraperitoneal de 5 mg/kg em camundongos.

[00257] Figura 3: Estabilidade de ANP (A-C), TPP-10992 (D-F) e

TPP-5661 (G-I) contra degradação proteolítica. A atividade de ANP, TPP-10992 e TPP-5661 foi testada em linhagem de célula de receptor de ANP de rato estáveis diretamente (A, D, G), ou após incubação de 4 h a 37°C com 0,6 µg/ml NEP (B, E, H) ou 0,6 µg/ml IDE (C, F, I).

[00258] Figura 4: Estabilidade de BNP (A-C) e TPP-11155 (D-F) contra a degradação proteolítica. A atividade de BNP e TPP-11155 foi testada sobre a linhagem celular de receptor de BNP de rato, diretamente (A, D), ou após incubação de 4h a 37°C com 0,6 µg/ml NEP (B, E) ou 0,6 µg/ml de IDE (C, F).

[00259] Figura 5: Estabilidade de CNP (A-C) e TPP-12897 (D-F) contra a degradação proteolítica. A atividade de CNP e TPP-11155 foi testada sobre a linhagem de célula de receptor de CNP de rato estável, diretamente (A, D), ou após incubação de 4h a 37°C com 0,6 µg/ml de NEP (B, E) ou 0,6 µg/ml de IDE (C, F).

[00260] Figura 6: Peptídeo de ANP e TPP-10992 induziram às curvas de resposta à dose de vasodilatação em anéis aórticos contraídos por PE. Curvas de resposta à dose (0,0001-10 μM; n = 3 Ratos) para o peptídeo ANP (círculos abertos) e TPP-10992 (círculos fechados) em anéis aórticos de rato com endotélio intacto contraídos por fenilefrina (1 μM). Valores experimentais foram calculados com relação às mudanças máximas a partir da contração produzida por fenilefrina em cada tecido, que foi considerada como 100%. A potência de peptídeo ANP e TPP-10992 foi de -7,4 e -6,7, respectivamente (valores logEC50). Os dados representam a média ± S.E.M. de 2 experimentos.

[00261] Figura 7: O peptídeo ANP e TPP-5661 induziram às curvas de resposta à dose de vasodilatação em anéis aórticos contraídos por PE. Curvas de resposta à dose (0,0001-10 μM; n = 3 Ratos) para o peptídeo ANP (círculos abertos) e TPP-5661 (círculos fechados) em anéis aórticos de rato com endotélio intacto contraídos por fenilefrina (1 μM). Valores experimentais foram calculados com relação às mudanças máximas a partir da contração produzida por fenilefrina em cada tecido, que foi considerada como 100%. A potência de peptídeo ANP e TPP- 5661 foi de -7,4 e -6,5, respectivamente (valores logEC50). Os dados representam a média ± S.E.M. de 2 experimentos.

[00262] Figura 8: Efeito hemodinâmico de ANP em ratos conscientes. ANP de rato foi administrado intraperitonealmente em 0 hora. Uma dose de 500 µg de ANP resultou em uma queda de aproximadamente 25% na pressão sanguínea arterial média (MAP) com uma duração de efeito em torno de 6 a 8 horas.

[00263] Figura 9: Efeito hemodinâmico de TPP-5661 em ratos conscientes. TPP-5661 foi administrado intraperitonealmente em 0 hora. Uma dose de 15 mg/kg resultou em uma redução de aproximadamente 20% na pressão sanguínea arterial média (MAP) com efeito máximo em 24 a 48 horas após aplicação e uma duração de efeito maior do que 6 dias.

[00264] Figura 10: Efeito hemodinâmico de TPP-10992 em ratos conscientes. TPP-10992 foi administrado intraperitonealmente em 0 hora. Uma dose de 30 mg/kg resultou em uma redução de aproximadamente 20% na pressão sanguínea arterial média (MAP) com efeito máximo de 48 horas após aplicação e uma duração de efeito maior do que 6 dias.

[00265] Figura 11: Atividade de construções de anticorpo enxertadas com BNP em células hNPRA. A atividade de amostras de composto purificado em células hNPRA-CHO k1 estáveis foi avaliada em comparação com amostra de referência de TPP-5661 e TPP-5657. As amostras foram testadas em séries de diluição em quádruplos.

[00266] Figura 12: Diferentes isotipos de IgG humana fornecem estruturas de anticorpo igualmente adequadas. Determinação de atividade exemplar de compostos 9, 33, 65, 91, 127 e 191 IgG1 (TPP-

10294, TPP-10277, TPP-10279, TPP-10282, TPP-10269 e TPP-10355, respectivamente), isotipos de IgG2 e IgG4. A atividade de amostras de composto purificado sobre as células hNPRA-CHO k1 estáveis foi avaliada por comparação com as amostras de referência de composto 117, IgG1 humana, TPP-5661, e composto 209, IgG1 humana TPP-

5657. As amostras foram testadas em séries de diluição em quádruplos.

[00267] Figura 13: Estruturas de anticorpo de IgG igualmente adequadas originadas de diferentes espécies. Determinação de atividade exemplar de composto 117, IgG1 humana (TPP-5661) e composto 9, IgG1 humana (TPP-10294) e suas contrapartes de IgG1 não humana. A atividade de amostras de composto purificado em células hNPRA-CHO k1 estáveis foi avaliada em comparação com amostra de referência de composto 209, IgG1 humana (TPP-5657). Amosras foram testadas em séries de diluição em quádruplos.

[00268] Figura 14: Estruturas de anticorpo de IgG humana igualmente originadas de diferentes sequências de linhagem germinativa. A atividade de amostras de composto purificado sobre células hNPRA-CHO k1 estáveis foi avaliada por comparação com amostra de referência de TPP-10992. As amostras foram testadas em séries de diluição em quádruplos.

[00269] Figura 15: Efeitos protetores de TPP-12899 contra permeabilidade de barreira endotelial induzida por LPS, IL-1ß e trombina como avaliado por medição de impedância em tempo real.

[00270] Figura 16: efeitos terapêuticos de TPP-13992 sobre a sobrevivência (A), ganho de peso corporal (B), relação de proteína urinária/creatinina (C) e peso do átrio esquerdo (D); (n=8-12 (controle saudável n=5), média ±SEM, ANOVA unidirecional vs TPP-10155 (anticorpo de controle específico de isotipo).

[00271] Figura 17: Avaliação hemodinâmica após Placebo, 0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg de TPP-10992. TPP-10992 mostra uma redução dependente de dose e de longa ação (>5d) na pressão sanguínea. **p<0,01, ****p<0,0001 em comparação com o grupo placebo usando um teste ANOVA unidirecional para avaliações repetidas por teste de comparação múltipla de Tukey. Exemplos Exemplo 1: Construção de TPP-5661 candidato

[00272] O candidato TPP-5661 foi projetado por fusão de uma sequência heteróloga de aminoácido compreendendo a Ntls, ANP de rato de tipo selvagem e a Ctls ao C-terminal de HV 3-23 (SEQ ID Nº 85) substituindo os dois resíduos C-terminais de HV 3-23 pelos dois resíduos N-terminal da sequência heteróloga de aminoácido e ao N- terminal de IGHJ1 (SEQ ID Nº 86) substituindo os noves resíduos N- terminal IGHJ1 pelos 9 resíduos C-terminal da sequência heteróloga de aminoácido. A sequência de cadeia pesada de comprimento total correspondente de SEQ ID Nº 67 também compreende a sequência de aminoácido Constante-H (SEQ ID Nº 87).

[00273] O pareamento de uma sequência pesada de cadeia de comprimento total de SEQ ID Nº 67 alojando o ANP inserido de rato (rANP) com a sequência de cadeia leve de comprimento total de SEQ ID Nº 66 construída pela combinação das sequências LV 1-40 (SEQ ID Nº 88), IGLJ2 (SEQ ID Nº 89) e Constante-L (SEQ ID Nº 90) produz o TPP-5661 candidato de IgG total (veja, Tabela 1).

[00274] É mostrada abaixo a sequência pesada de cadeia pesada de comprimento total (SEQ ID Nº 67); a sequência heteróloga de aminoácido incorporada (Ntls-rANP-Ctls) é sublinhada; as sequências derivadas de HV 3-23 e IGHJ1 são mostradas em negrito:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL EWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT AVYYCTSVHQETKKYQSSPDGGSGGSLRRSSCFGGRIDRIGAQSGL GCNSFRYGSYSYTYNYEWHVDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

[00275] A construção de anticorpo sintetizada e projetada foi clonada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e confirmada por sequenciamento de DNA usando oligonucleotídeos específicos de plasmídeo. Exemplo 2: Inserção de NPs dentro das CDRs de anticorpo resulta em uma meia-vida sérica aumentada Determinação de Parâmetros Farmacocinéticos In Vivo

[00276] Os parâmetros farmacocinéticos de TPP-10992 (SEQ ID Nº 76 e SEQ ID Nº 66) e TPP-5661 (SEQ ID Nº 67 e SEQ ID Nº 66) foram determinados após administração intravenosa de 5 mg/kg aos ratos Wistar machos (n=3). TPP-10992 e TPP-5661 foram administrados como uma injeção em bolo por meio da veia caudal. Amostras de sangue foram coletadas a partir da veia jugular por meio de cateteres anteriormente implantados em intervalos de tempo de até 14 dias (336 horas). Plasma de EDTA Gerado foi armazenado a -20°C até outra análise.

[00277] A quantificação de TPP-10992 e TPP-5661 em amostras plasmáticas foi realizada empregando um formato ELISA de IgG anti- humana (ensaio de imunoabsorção enzimática). Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir dos perfis de tempo de concentração plasmática usando análise de dados não compartimentais.

[00278] Concentrações plasmáticas médias de TPP-10992 e TPP-

5661 após administração intravenosa ao longo do tempo são graficamente descritas na Figura 1.

[00279] A depuração média e a meia-vida terminal de TPP-10992 e TPP-5661 são sumariadas na tabela 2, abaixo. Tabela 2: Depuração média (CL) e meia-vida terminal (t1/2) de TPP- 10992 e TPP-5661 após administração intravenosa de 5 mg/kg em rato.

Analito TPP-5661 TPP-10992 CL [mL/h/kg] 0,62 0,27 t1/2 [h] 297 184 Determinação de Parâmetros Farmacocinéticos In Vivo

[00280] Os parâmetros farmacocinéticos de TPP-12897 foram determinados após administração intraperitoneal aos camundongos Balb/c fêmeas (n=3). As amostras sanguíneas foram coletadas de 15 minutos até 72 horas após aplicação. O plasma de EDTA gerado foi armazenado a -20°C até outra análise. A quantificação de TPP-12897 em amostras plasmáticas foi realizada por um formato ELISA de IgG anti-humana (Imunoglobulina G).

[00281] Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir de perfis de tempo de concentração plasmática usando análise de dados não compartimentais.

[00282] As concentrações plasmáticas médias de TPP-12897 após administração intraperitoneal ao longo do tempo são graficamente descritas na Figura 2.

[00283] A área média sob a curva (AUC) e a meia-vida terminal de TPP-12897 são sumariadas na Tabela 3, abaixo.

Tabela 3: Área média sob a curva (AUC) e meia-vida terminal (t1/2) de TPP-12897 após administração intraperitoneal de 5 mg/kg em camundongos. Analito TPP-12897 AUC [mg·h/L] 7705 t1/2 [h] 194 Exemplo 3: Potência in vitro, ex vivo e in vivo de anticorpos enxertados de NP Dados de atividade de anticorpos enxertados com ANP em linhagem de célula de receptor de NPR-A

[00284] Uma linhagem de célula de receptor de ANP de rato (NPR- A) com base na luminescência foi gerada como anteriormente descrito (Wunder et al. (2013), Eur J Pharmacol. 698: 131). Consequentemente, uma linhagem de célula de receptor de ANP de rato (NPR-A) com base em fluorescência foi gerada cotransfectando uma linhagem de célula CHO, estavelmente expressando a proteína de sensor de cálcio fluorescente GCaMP6, com construções de plasmídeo codificando CNGA2 (biossensor de cGMP) e NPR-A de rato.

[00285] Células GCaMP6 de receptor de ANP foram cultivadas durante um dia, em placas de microtítulo pretas de 384 cavidades, de fundo claro (2500 células/cavidade). Após remoção do meio de cultura celular, as células repórter foram carregadas durante 20 minutos com Tyrode (NaCl a 130 mM, KCl a 5 mM, CaCl2 a 2 mM, HEPES a 20 mM, MgCl2 a 1 mM, NaHCO3 a 4,8 mM em pH 7,4) contendo uma tintura preta de mascaramento a 37°C e CO2 a 5%. IBMX (0,2 mM) foi usado para impedir a degradação de cGMP por fosfodiesterases endógenas.

[00286] Medições de fluorescência (3 minutos, modo cinético) foram diretamente iniciada sob adição de agonista. Ligantes de receptor foram adicionados em Tyrode contendo uma tintura preta de mascaramento e 0,1% de BSA. As medições foram feitas em FLIPR Tetra®.

[00287] ANP (Bachem, H-2100) estimulou os sinais de fluorescência dependente de concentração sobre a linhagem de célula NPR-A com um valor EC50 de 0,22 nM. TPP-5661 e TPP-10992 estimularam a linhagem de célula repórter de receptor de ANP de rato com valores EC50 de 17 nM e 180 nM, respectivamente. A construção de anticorpo de controle TPP-5657 não estimulou significativamente a linhagem de célula NPR-A (testada até a concentração máxima de 460 nM).

[00288] Para determinar a sensibilidade à degradação proteolítica, uma atividade de ligantes do receptor também foi caracterizada após 4 horas de incubação com 0,6 µg/ml de endopeptidase neutra (NEP, R&D Systems, 1182-ZNC) ou 0,6 µg/ml de enzima degradante de insulina (IDE, Merck, 407241-50UG) a 37°C.

[00289] A Figura 3 graficamente descreve a estabilidade de ANP (A- C), TPP-10992 (D-F) e TPP-5661 (G-I) contra a degradação proteolítica. Como mostrado na Figura 3, o peptídeo natriurético ANP (Bachem, H- 2100) mostrou alta sensibilidade à degradação por NEP e IDE. Ao contrário, TPP-5661 e TPP-10992 mostrou alta resistência à degradação proteolítica por NEP e IDE. Dados de atividade de anticorpos enxertados com BNP em linhagem de célula de receptor de NPR-A

[00290] Uma linhagem de célula de receptor de BNP de rato com base em luminescência (NPR-A) foi gerada como descrito anteriormente (Wunder et al. (2013), Eur J Pharmacol. 698: 131). Consequentemente, uma linhagem de células de receptor de BNP de rato com base em fluorescência (NPR-A) foi gerada cotransfectando uma linhagem de célula CHO, estavelmente expressando a proteína do sensor de cálcio fluorescente GCaMP6, com construções de plasmídeo codificando CNGA2 (biossensor de cGMP) e NPR-A de rato.

[00291] As células GCaMP6 de receptor de BNP foram cultivadas durante um dia em placas pretas de microtítulo de 384 cavidades, de fundo claro (2500 células/cavidade). Após remoção do meio de cultura celular, células repórter foram carregadas durante 20 minutos com Tyrode (NaCl a 130 mM, KCl a 5 mM, CaCl2 a 2 mM, HEPES a 20 mM, MgCl2 a 1 mM, NaHCO3 a 4,8 mM em pH 7,4) contendo uma tintura preta de mascaramento a 37°C e CO2 a 5%. IBMX (0,2 mM) foi usado para impedir a degradação de cGMP por fosfodiesterases endógenas.

[00292] Medições de fluorescência (3 minutos, modo cinético) foram diretamente iniciadas na adição de agonista. Ligantes de receptor foram adicionados em Tyrode contendo uma tintura preta de mascaramento e 0,1% de BSA. As medições foram feitas em um FLIPR Tetra®.

[00293] O BNP (Bachem, H-5968) estimulou os sinais de fluorescência dependentes de concentração na linhagem de célula NPR-A com um valor EC50 de 2,9 nM. TPP-9902, TPP-11153, TPP- 1154, TPP-11155, TPP-11156 e TPP-11157 estimularam a linhagem de célula repórter de receptor de BNP de rato com valores EC50 de 2,3 µM, >1,9 µM, 7 nM, 12 nM, 1.2 µM e 11 nM, respectivamente. A construção de anticorpo de controle TPP-5657 não estimulou significantemente a linhagem de célula NPR-A (testada até a concentração máxima de 460 nM).

[00294] Para determinar a sensibilidade à degradação proteolítica, a atividade de ligantes de receptor foi também caracterizada após 4 horas de incubação com 0,6 µg/ml de endopeptidase neutra (NEP, R&D Systems, 1182-ZNC) ou 0,6 µg/ml de enzima degradante de sinsulina (IDE, Merck, 407241-50UG) a 37°C. O peptídeo natriurético BNP (Bachem, H-5968) mostrou sensibilidade elevada à degradação por NEP e IDE. Ao contrário, TPP-11155 e TPP-11157 mostrou resistência elevada à degradação proteolítica por NEP e IDE.

[00295] A Figura 4 descreve graficamente a estabilidade de atividade de BNP (A-C) e TPP-11155 (D-F) contra a degradação proteolítica.

Dados de atividade de anticorpos enxertados com CNP em linhagem de célula de receptor de NPR-B

[00296] Uma linhagem de célula repórter (NPR-B) de receptor de CNP foi gerada e medições de luminescência foram realizadas como descrito anteriormente (Wunder et al. (2013), Eur J Pharmacol. 698: 131).

[00297] Células de receptor de CNP (2500 células/cavidade) foram cultivadas durante 1 dia em placas de microtítulos de 384 cavidades opacas. Após remoção do meio de cultura celular, as células foram carregadas durante 3 horas com 2,5 µg/ml de coelenterazina em Tyrode Ca2+ (NaCl a 130 mM, KCl a 5 mM, HEPES a 20 mM, MgCl2 a 1 mM, NaHCO3 a 4,8 mM a pH 7,4) a 37°C e CO2 a 5%. Ligantes de receptor foram adicionados durante 10 min em Tyrode livre de Ca2+ contendo BSA a 0,1%. IBMX (0,2 mM) foi usado para impedir a degradação de cGMP por fosfodiesterases endógenas. Imediatamente antes de adicionar os íons de cálcio (concentração final de 3 mM), as medições de luminescência foram iniciadas usando uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) em uma caixa à prova de luz. A luminescência foi continuamente monitorada durante 50 s.

[00298] CNP (Bachem, H-1296) estimulou os sinais de luminescência dependentes de concentração sobre a linhagem de célula de NPR-B com um valor EC50 de 0,024 nM. TPP-9465, TPP- 12377, TPP-12378, TPP-12897 e TPP-12899 estimularam a linhagem de célula repórter de receptor de CNP de rato com valores EC50 de 5,2 nM, 4,1 nM, 25 nM, 10 nM e 3,2 nM, respectivamente. TPP-12374 estimulou a linhagem de célula repórter de receptor de CNP de rato com valores EC50 de 150 nM, e TPP-12375, TPP-12376 mostraram apenas fraca indicação de atividade.

[00299] Para determinar a sensibilidade à degradação proteolítica, uma atividade de ligantes do receptor também foi caracterizada após 4 horas de incubação com 0,6 µg/ml de endopeptidase neutra (NEP, R&D Systems, 1182-ZNC) ou 0,6 µg/ml de enzima degradante de insulina (IDE, Merck, 407241-50UG) a 37°C.

[00300] Ao contrário do peptídeo natriurético CNP (Bachem, H- 1296), TPP-12377, TPP-12897 e TPP-12899 mostraram resistência elevada à degradação proteolítica por NEP e IDE.

[00301] A Figura 5 descreve graficamente a estabilidade de atividade de CNP (A-C) e TPP-12897 (D-F) contra a degradação proteolítica. Dados de atividade de anticorpos enxertados com ANP determinados com anéis aórticos de rato isolados

[00302] Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com diretrizes institucionais e aprovadas pelo comitê local sobre experimentos com animais. Ratos Sprague-Dawley machos (pesando 250 a 300 g) foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg i.p.), mortos por decapitação e sangramento. A aorta torácica foi extirpada e colocada em tampão de Krebs gelado com a seguinte composição: NaCl a 130 mM, NaHCO3 a 14,9 mM, dextrose a 5,5 mM, KCl a 4,7 mM, KH2PO4 a 1,18 mM, MgSO47H2O a 1,17 mM, e CaCl22H2O a 1,6 mM. O vaso foi fixado em uma placa de Petri Sylgard preenchida com solução de Krebs resfriada, limpa de gordura e tecido conjuntivo, e cortada em segmentos de anel de aproximadamente 3 a 4 mm de comprimento. Os anéis aórticos foram montados verticalmente em câmaras de 50 ml (instrumentos ADI) contendo solução de Krebs a 37°C borbulhada continuamente com uma mistura de O2 a 95% e CO2 a 5%. Mudanças na força isométrica foram registradas usando um sistema de aquisição de dados PowerLab (software Lab Chart 7.0)

[00303] Após o período de equilíbrio, os anéis aórticos foram desafiados com KCl a 80 mM para verificar a viabilidade do tecido. Depois, a integridade endotelial das preparações foi determinada pela verificação da responsividade à acetilcolina (ACh, 1 μM) em vasos pré-

contraídos com fenilefrina (PE, 1 μM). Após wash-out e um período de equilíbrio, a fenilefrina (PE, 1 μM) foi usada para induzir a contração, em seguida os peptídeos natriuréticos e IgGs enxertadas com peptídeos natriuréticos foram avaliados quanto ao vasorrelaxamento. O peptídeo ANP de rato (ADH-GM-10057T, Santai Labs) foi usado como referência.

[00304] Como mostrado na Figura 6, tanto o peptídeo ANP quanto o TPP-10992 induziram vasodilatação dependente da dose em anéis aórticos contraídos por PE.

[00305] Como mostrado na Figura 7, tanto o peptídeo ANP quanto o TPP-5661 induziram vasodilatação dependente da dose em anéis aórticos contraídos por PE. Dados de atividade dos anticorpos enxertados com ANP obtidos em ratos conscientes

[00306] A pressão arterial e a frequência cardíaca foram monitoradas em animais conscientes em movimento livre por radiotelemetria (Data Sciences International). Ratos fêmeas espontaneamente hipertensos (SHR/N Crl BR, Charles River) com um peso corporal de 210 a 300 g foram usados para estes estudos. Todos os animais foram alojados em gaiolas individuais a 22-24°C temperatura ambiente e mantidos em ciclo luz/escuro de 12 horas com livre acesso à ração padrão de laboratório para ratos e água ad libitum. O implante do telemetro (HD-10, DSI) foi realizado no mínimo 14 dias antes dos animais serem usados para medidas de pressão arterial. A cirurgia foi realizada em condições assépticas. Após estender a parede abdominal, foi feita uma incisão abdominal na linha média, e o cateter sensor cheio de líquido foi inserido a montante na aorta descendente exposta entre a bifurcação ilíaca e as artérias renais. De acordo com as orientações DSI, a ponta do cateter telemétrico foi localizada caudal às artérias renais e fixada por adesivo de tecido. O corpo do transmissor foi afixado à parede peritoneal interna antes do fechamento do abdômen. Para proteção pós-cirúrgica contra infecções e dor, uma única dosagem de um antibiótico (Oxytetracyclin® 10%, 60 mg/kg s.c., 0,06 ml/ 100g de peso corporalt, Beta-Pharma GmbH & Co, Alemanha) e analgésicos foram injetados (Rimadyl®, 4 mg/kg s.c., Pfizer, Alemanha). A aquisição de dados telemétricos foi realizada pelo software DSI, foi predefinida para amostrar dados hemodinâmicos durante 10 segundos, repetida a cada 5 minutos. A coleta de dados foi iniciada pelo menos duas horas antes da administração do fármaco e finalizada após a conclusão dos ciclos de medição. Os dados são expressos como % dos valores basais ± SEM de pelo menos 4 animais por grupo. O valor basal para cada animal foi calculado como a média dos valores medidos nas duas horas anteriores à aplicação da substância (7:00 – 9:00 AM). Os dados são então expressos como médias a cada meia hora, começando 15 minutos após a aplicação. Todos os animais foram tratados com uma única aplicação intraperitoneal (ip) de substâncias teste dissolvidas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A administração do medicamento ocorreu às 9h00 da manhã (0 hora).

[00307] O efeito hemodinâmico de peptídeo ANP é graficamente descrito na Figura 8. O efeito hemodinâmico de TPP-5661 é graficamente descrito na Figura 9. O efeito hemodinâmico de TPP- 10992 é graficamente descrito na Figura 10. Exemplo 4: Generação de diferentes construções de anticorpo enxertadas com NP

[00308] Para construções com uma incorporação de peptídeo natriurético em uma região CDR diferente de CDRH3, uma CDRH3 de forma pesumível funcionalmente neutra CDRH3 foi projetada por fusão da extensão dos três resíduos Leu Thr Gly (IGHD7-27*01) ao C- terminus de HV 3-23 e ao N-terminus de IGHJ1 (comparer o Exemplo 1). A sequência de cadeia pesada de comprimento total correspondente de SEQ ID Nº 65 também compreende sequência de aminoácido Constante-H (SEQ ID Nº 87).

[00309] O pareamento da sequência de cadeia pesada de comprimento total de SEQ ID Nº 65 sem qualquer inserção de peptídeo natriurético com a sequência de cadeia leve de comprimento total de SEQ ID Nº 66 descrita no Exemplo 1 produz o controle negativo de IgG sintética presumivelmente neutra TPP-5657.

[00310] A construção de anticorpo projetada e sintetizada foi clonada de acordo com métodos bem conhecidos a técnica e confirmados por sequenciamento de DNA usando oligonucleotídeos específicos de plasmídeo.

[00311] Partindo desta estrutura de anticorpo, as seguintes construções de anticorpo enxertadas com ANP foram geradas. Tabela 4: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com

ANP SEQ ID Nº SEQ ID Nº Com- Sítio de compreendida compreendida # aa # aa posto TPP inserção em Ntls em Ctls N-term1 C-term2 1 TPP-13057 CDRH1 6 2 2 TPP-13056 CDRH1 9 5 3 TPP-13055 CDRH1 12 8 4 TPP-13054 CDRH1 15 11 5 TPP-12545 CDRH1 18 10 6 TPP-10454 CDRH1 19 17 7 TPP-10453 CDRH1 19 17 8 TPP-11172 CDRH1 6 20 17 9 TPP-10294 CDRH1 23 14 10 TPP-12547 CDRH1 23 14 11 TPP-11171 CDRH1 6 24 13 12 TPP-10841 CDRH2 3 3 13 TPP-10842 CDRH2 7 7 14 TPP-11009 CDRH2 8 9 15 TPP-11008 CDRH2 10 11 16 TPP-11018 CDRH2 11 14 17 TPP-10775 CDRH2 12 8 18 TPP-10767 CDRH2 13 12 19 TPP-11012 CDRH2 9 14 9

20 TPP-10774 CDRH2 13 14 14 10 21 TPP-11007 CDRH2 14 11 22 TPP-11179 CDRH2 14 14 23 TPP-10773 CDRH2 13 14 15 10 24 TPP-10770 CDRH2 1 1 15 12 25 TPP-10766 CDRH2 15 14 26 TPP-10772 CDRH2 13 14 16 11 27 TPP-11005 CDRH2 16 11 28 TPP-11006 CDRH2 16 11 29 TPP-11017 CDRH2 16 14 30 TPP-11169 CDRH2 9 10 16 15 31 TPP-11181 CDRH2 16 15 32 TPP-11182 CDRH2 16 17 33 TPP-10277 CDRH2 9 10 17 11 34 TPP-12553 CDRH2 9 10 17 11 35 TPP-12554 CDRH2 9 10 17 11 36 TPP-12555 CDRH2 9 10 17 11 37 TPP-12542 CDRH2 9 10 17 11 38 TPP-12543 CDRH2 9 10 17 11 39 TPP-12544 CDRH2 9 10 17 11 40 TPP-13058 CDRH2 9 10 17 11 41 TPP-13059 CDRH2 9 10 17 11 42 TPP-13060 CDRH2 9 20 17 11 43 TPP-13061 CDRH2 9 20 17 11 44 TPP-13062 CDRH2 9 10 17 11 45 TPP-13063 CDRH2 9 10 17 11 46 TPP-13064 CDRH2 9 10 17 11 47 TPP-13065 CDRH2 9 10 17 11 48 TPP-13066 CDRH2 9 10 17 11 49 TPP-12546 CDRH2 9 10 17 11 50 TPP-10452 CDRH2 13 14 17 12 51 TPP-10846 CDRH2 4 5 17 12 52 TPP-10852 CDRH2 17 12 53 TPP-10851 CDRH2 6 17 13 54 TPP-10769 CDRH2 1 1 17 14 55 TPP-10765 CDRH2 17 14 56 TPP-11180 CDRH2 17 15 57 TPP-11177 CDRH2 17 17

58 TPP-11178 CDRH2 17 17 59 TPP-11176 CDRH2 17 18 17 17 60 TPP-10278 CDRH2 9 10 18 12 61 TPP-10847 CDRH2 4 5 18 13 62 TPP-11004 CDRH2 18 13 63 TPP-10844 CDRH2 2 3 18 13 64 TPP-10853 CDRH2 18 13 65 TPP-10279 CDRH2 9 10 18 13 66 TPP-11170 CDRH2 9 10 18 13 67 TPP-11010 CDRH2 9 18 13 68 TPP-11011 CDRH2 9 18 13 69 TPP-10764 CDRH2 18 14 70 TPP-11183 CDRH2 18 17 71 TPP-11175 CDRH2 16 17 18 17 72 TPP-11016 CDRH2 15 19 12 73 TPP-11015 CDRH2 15 19 14 74 TPP-10451 CDRH2 13 14 19 14 75 TPP-10768 CDRH2 1 1 19 14 76 TPP-10848 CDRH2 4 5 19 14 77 TPP-11003 CDRH2 19 14 78 TPP-11002 CDRH2 19 14 79 TPP-10843 CDRH2 2 3 19 14 80 TPP-10845 CDRH2 2 3 19 14 81 TPP-10284 CDRH2 19 14 82 TPP-10446 CDRH2 11 12 19 14 83 TPP-10447 CDRH2 19 14 84 TPP-10854 CDRH2 19 14 85 TPP-11014 CDRH2 15 19 15 86 TPP-10849 CDRH2 6 6 19 15 87 TPP-10850 CDRH2 6 19 15 88 TPP-11013 CDRH2 20 14 89 TPP-10771 CDRH2 1 1 20 15 90 TPP-10287 CDRH2 1 1 20 15 91 TPP-10282 CDRH2 20 15 92 TPP-10285 CDRH2 20 15 93 TPP-10286 CDRH2 20 15 94 TPP-10283 CDRH2 20 15 95 TPP-11168 CDRH2 9 10 20 15

96 TPP-10857 CDRH2 20 15 97 TPP-10856 CDRH2 20 15 98 TPP-10855 CDRH2 20 15 99 TPP-10281 CDRH3 10 3 100 TPP-10280 CDRH3 10 8 101 TPP-10583 CDRH3 12 10 102 TPP-10582 CDRH3 7 14 12 103 TPP-10270 CDRH3 7 8 15 18 104 TPP-10264 CDRH3 7 8 16 14 105 TPP-10581 CDRH3 16 14 106 TPP-10263 CDRH3 7 8 17 15 107 TPP-10271 CDRH3 7 8 17 18 108 TPP-10262 CDRH3 7 8 18 16 109 TPP-10272 CDRH3 7 8 18 18 110 TPP-10261 CDRH3 7 8 19 17 111 TPP-10289 CDRH3 19 17 112 TPP-10273 CDRH3 7 8 19 18 113 TPP-10260 CDRH3 7 8 20 17 114 TPP-10275 CDRH3 9 10 20 17 115 TPP-10580 CDRH3 20 18 116 TPP-10274 CDRH3 7 8 20 18 117 TPP-5661 CDRH3 7 8 20 18 118 TPP-13226 CDRH3 7 8 18 16 119 TPP-13227 CDRH3 7 8 18 16 120 TPP-13228 CDRH3 7 22 20 18 121 TPP-13229 CDRH3 7 22 20 18 122 TPP-13230 CDRH3 21 22 20 18 123 TPP-13231 CDRH3 21 22 20 18 124 TPP-10276 CDRH3 9 10 20 18 125 TPP-10290 CDRH3 20 18 126 TPP-10445 CDRH3 11 12 20 18 127 TPP-10269 CDRH3 7 8 20 18 128 TPP-10288 CDRH3 2 3 20 18 129 TPP-10265 CDRH3 7 8 20 19 130 TPP-10268 CDRH3 7 8 21 19 131 TPP-10593 CDRH3 19 22 20 132 TPP-11174 CDRH3 6 12 22 20 133 TPP-10266 CDRH3 7 8 22 20

134 TPP-11173 CDRH3 6 12 22 20 135 TPP-10444 CDRH3 11 12 22 20 136 TPP-10267 CDRH3 7 8 24 22 137 TPP-10443 CDRH3 11 12 24 22 138 TPP-11163 CDRL1 6 16 14 139 TPP-10360 CDRL1 19 13 140 TPP-10462 CDRL1 20 18 141 TPP-10460 CDRL1 21 19 142 TPP-10461 CDRL1 21 19 143 TPP-11161 CDRL1 6 6 21 19 144 TPP-11162 CDRL1 6 21 19 145 TPP-10359 CDRL1 23 14 146 TPP-10824 CDRL2 1 6 147 TPP-10825 CDRL2 5 10 148 TPP-11019 CDRL2 12 16 149 TPP-11021 CDRL2 13 17 150 TPP-11020 CDRL2 13 17 151 TPP-10789 CDRL2 14 14 152 TPP-11022 CDRL2 15 19 153 TPP-10829 CDRL2 4 5 16 15 154 TPP-10835 CDRL2 16 15 155 TPP-10788 CDRL2 16 16 156 TPP-10571 CDRL2 15 15 17 16 157 TPP-10830 CDRL2 4 5 17 16 158 TPP-10790 CDRL2 17 16 159 TPP-10573 CDRL2 19 17 16 160 TPP-10827 CDRL2 2 3 17 16 161 TPP-10572 CDRL2 19 17 16 162 TPP-10836 CDRL2 17 16 163 TPP-10834 CDRL2 6 17 17 164 TPP-10787 CDRL2 18 16 165 TPP-10831 CDRL2 4 5 18 17 166 TPP-10828 CDRL2 2 3 18 17 167 TPP-10826 CDRL2 2 3 18 17 168 TPP-10837 CDRL2 18 17 169 TPP-10361 CDRL2 19 17 170 TPP-11023 CDRL2 11 12 19 18 171 TPP-10838 CDRL2 19 18

172 TPP-10840 CDRL2 19 18 173 TPP-10839 CDRL2 19 18 174 TPP-10832 CDRL2 6 19 19 175 TPP-10833 CDRL2 6 19 19 176 TPP-11024 CDRL2 11 12 20 19 177 TPP-10353 CDRL3 2 2 178 TPP-10780 CDRL3 14 9 179 TPP-10786 CDRL3 16 10 180 TPP-10779 CDRL3 16 11 181 TPP-10778 CDRL3 16 13 182 TPP-10783 CDRL3 11 12 17 11 183 TPP-10785 CDRL3 18 12 184 TPP-10776 CDRL3 18 13 185 TPP-10777 CDRL3 18 13 186 TPP-10784 CDRL3 18 14 187 TPP-10782 CDRL3 11 12 19 13 188 TPP-10352 CDRL3 7 8 19 14 189 TPP-10356 CDRL3 19 14 190 TPP-10354 CDRL3 19 14 191 TPP-10355 CDRL3 19 14 192 TPP-10781 CDRL3 11 12 19 15 193 TPP-10436 CDRL3 7 8 20 14 194 TPP-10440 CDRL3 11 12 20 14 195 TPP-10442 CDRL3 20 14 196 TPP-10351 CDRL3 7 8 20 15 197 TPP-10348 CDRL3 7 8 20 15 198 TPP-10358 CDRL3 20 15 199 TPP-11167 CDRL3 6 12 21 15 200 TPP-10438 CDRL3 11 12 21 15 201 TPP-10439 CDRL3 11 12 21 15 202 TPP-10441 CDRL3 21 15 203 TPP-10349 CDRL3 7 8 21 16 204 TPP-10350 CDRL3 7 8 22 17 205 TPP-10437 CDRL3 11 12 23 17 206 TPP-11166 CDRL3 6 12 24 18 207 TPP-10362 CDRL3 6 6 24 20 208 TPP-10363 CDRL3 6 6 24 20 209 TPP-5657 no na na

O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal Tabela 4 continução: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com ANP Cmpd TPP Sequência N-terminal3 Sequência C-terminal4 1 TPP-13057 SGFTFSS YAM 2 TPP-13056 SGFTFGSGSG GSGSGM 3 TPP-13055 SGFTFGSGSGSGS SGSGSGSGM 4 TPP-13054 SGFTFGSGSGSGGSGG GGSGGSGSGSGM 5 TPP-12545 SGFTFGSGSGSGSGGGSGG GSGSGGSGSGM 6 TPP-10454 SPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFVVAM 7 TPP-10453 SGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFVVAM 8 TPP-11172 SSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSGREVPISNGSGFVVAM 9 TPP-10294 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM 10 TPP-12547 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM 11 TPP-11171 SGFTFSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSGSGSGSGSGSGM 12 TPP-10841 ISGS GGST 13 TPP-10842 ISGSGSGS GSGSGGST 14 TPP-11009 ISGSGSGSG GSSGSGSGST 15 TPP-11008 ISGSGSGSGSG GSSGSGSGSGST 16 TPP-11018 ISGSGSGSGSGG GEKEKEKVSTAVGST 17 TPP-10775 ISGSAVVNGGSGG GKIAIGGST 18 TPP-10767 ISGPNPNKNPNPGG GSNENPNPNPGST 19 TPP-11012 ISGSVVVTSHGGSGG GGSGSGSGST 20 TPP-10774 ISGSAVVNVRGGSGG GGDKIAIGGST 21 TPP-11007 ISGSGSGSGSGSSGG GSSGSGSGSGST 22 TPP-11179 ISGLAVQIRRGGSGG GGSGRETLTLYVGST 23 TPP-10773 ISGSAVVNVRAGGSGG GGDKIAIGGST 24 TPP-10770 ISGSYAMSWVRGGSGG GSYAMSWVRQGST 25 TPP-10766 ISGPNPNKNPNPNPGG GSNPNENPNPNPGST 26 TPP-10772 ISGSAVVNVRADGGSGG GSGDKIAIGGST 27 TPP-11005 ISGSGSGSGSPDGGSGG GSSGSGSGSGST 28 TPP-11006 ISGSGSGSGSGSGGSGG GSSGSGSGSGST 29 TPP-11017 ISGSGSGSGSGSGGSGG GEKEKEKVSTAVGST 30 TPP-11169 ISGSVVVTSHQAPGSGG GSGEKKKLKSLAYGST

31 TPP-11181 ISGRYNILKIQKVGSGG GGSGEYLITYQIMGST 32 TPP-11182 ISGRQLLFCRVTLGSGG GGSGEQAYPEYLITYGST 33 TPP-10277 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 34 TPP-12553 ISGVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 35 TPP-12554 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLGST 36 TPP-12555 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSGGST 37 TPP-12542 ISGVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSGGST 38 TPP-12543 ISGSVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSGGST 39 TPP-12544 ISGSVTSHQAPGEGGSGG GEKKKGKSGGST 40 TPP-13058 ISVVVTSHQAPGSGGSGG GEKKKLKSLAST 41 TPP-13059 ISVVVTSHQAPTSGGSGG GEKKKLKSLAST 42 TPP-13060 ISVVVTSHQSPTPGGSGG GGSTPLKSLAST 43 TPP-13061 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GGSTPLKSLAST 44 TPP-13062 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GSTPKLKSLAST 45 TPP-13063 ISVVVTSHQSPTPGGSGG GEKKKLKSLAST 46 TPP-13064 ISVVVTSHPTPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 47 TPP-13065 ISVVVTSHQAPSPGSTGG GEKKKLKSLAST 48 TPP-13066 ISVVVTSHQANGSGGSGG GEKKKLKSLAST 49 TPP-12546 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 50 TPP-10452 ISGSAVVNVRAPDGGSGG GSKGDKIAIGGST 51 TPP-10846 ISTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGST 52 TPP-10852 ISGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFST 53 TPP-10851 ISSALLKSKLRALLTAPG GGSGSGSGSGSGST 54 TPP-10769 ISGSYAMSWVRQAGGSGG GSSSYAMSWVRQGST 55 TPP-10765 ISGPNPNKNPNPNPGSGG GSNPNENPNPNPGST 56 TPP-11180 IHPLQNRWALWFFKGSGG GGSGNLRLISKFDTVT 57 TPP-11177 ISGSVTIFSLATNEGSGG GGSGKTTWHRISVFGGST 58 TPP-11178 IYLEGKIDYGEYMDGSGG GGSNVRRQATTIIADNIT 59 TPP-11176 ISGSVQGIINFEQKGSGG GGSGPVKVWGSIKGGGST 60 TPP-10278 ISGVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAGST 61 TPP-10847 ISGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGST 62 TPP-11004 ISGSGSGSGSGSPDGGSGG GSSGSGSGSGSGST 63 TPP-10844 ISGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGST 64 TPP-10853 ISGGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGST 65 TPP-10279 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYGST 66 TPP-11170 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKPKPKPLAYGST 67 TPP-11010 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GSSGSGSGSGSGST 68 TPP-11011 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GSGSGSGSGSGGST 69 TPP-10764 ISGPNPNKNPNPNPGGSGG GSNPNENPNPNPGST 70 TPP-11183 ISGDIYLAINITNGEGSGG GGSGDIYLAINITNGEST 71 TPP-11175 ISGSATKAVSVLKGDGSGG GGSGVQGIINFEQKGGST 72 TPP-11016 ISGSVPKEKEKEKVSTAVGG GSGSGSGSGSGST

73 TPP-11015 ISGSVPKEKEKEKVSTAVGG GSGSGSGSGSGSGST 74 TPP-10451 ISGSSGAVVNVRAPDGGSGG GSKGDKIAIWTTGST 75 TPP-10768 ISGSYAMSWVRQAPDGGSGG GSSSYAMSWVRQGST 76 TPP-10848 ISGSTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGGST 77 TPP-11003 ISGSGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGSGSGST 78 TPP-11002 ISGSGSGSGSGSSPDGGSGG GSYSGSGSGSGSGST 79 TPP-10843 ISTQTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEPKST 80 TPP-10845 ISGSTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGGST 81 TPP-10284 ISGPNPNPNPNPNPDGGSGG GSNPNPNPNPNPGST 82 TPP-10446 ISAVQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTFNST 83 TPP-10447 ISGFILPIEVYFKPDGGSGG GSPRKVRFDYDLFST 84 TPP-10854 ISGSGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGGST 85 TPP-11014 ISGSVPKEKEKEKVSTAVGG GSYGSGSGSGSGSGST 86 TPP-10849 ISDRSALLKSKLRALLTAPR GSDRSALLKSKLRAST 87 TPP-10850 ISDRSALLKSKLRALLTAPG GGSGSGSGSGSGSGST 88 TPP-11013 ISGSSDKTHTSPPSPDGGSGG GSKTHTSPPSPGGST 89 TPP-10771 ISGSYAMSWVRQASPDGGSGG GSYSSYAMSWVRGGST 90 TPP-10287 ISGSYAMSWVRQASPDGGSGG GSYSSYAMSWVRQGST 91 TPP-10282 ISGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGST 92 TPP-10285 ISGSPNPNPNPNPSPDGGSGG GSYPNPNPNPNPSGST 93 TPP-10286 ISGPNPNKNPNPNSPDGGSGG GSYNPNENPNPNPGST 94 TPP-10283 ISGPNPNPNPNPNSPDGGSGG GSYNPNPNPNPNPGST 95 TPP-11168 ISGSVVVTSHQAPGGSGGSGG GSGEKKKLKSLAYGST 96 TPP-10857 ISGSVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGST 97 TPP-10856 ISGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGST 98 TPP-10855 ISPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFST 99 TPP-10281 CAKSPDGGSGG GSYG 100 TPP-10280 CAKSPDGGSGG GSYQHWGQG 101 TPP-10583 CAKVHQETGGSGG GSWHVQHWGQG 102 TPP-10582 CAKVHQETPDGGSGG GSYEWHVQHWGQG 103 TPP-10270 CTSVHQETKKYQSSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 104 TPP-10264 CTSVHQETSSPDGGSGG GSYSYEWHVDVWGQG 105 TPP-10581 CAKTHTSPPSPDGGSGG GSSPPSPYFQHWGQG 106 TPP-10263 CTSVHQETKSSPDGGSGG GSYSNYEWHVDVWGQG 107 TPP-10271 CTSVHQETKKYQSSPDGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 108 TPP-10262 CTSVHQETKKSSPDGGSGG GSYSYNYEWHVDVWGQG 109 TPP-10272 CTSVHQETKKYQSSGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 110 TPP-10261 CTSVHQETKKQSSPDGGSGG GSYSYYNYEWHVDVWGQG 111 TPP-10289 CAKVHPNPNPNPNPDGGSGG GSNPNPNPNPHVDVWGQG 112 TPP-10273 CTSVHQETKKYQSSPDGGSG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 113 TPP-10260 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYYNYEWHVDVWGQG 114 TPP-10275 CAKLTVVVTSHQAPGEGGSGG GEKKKLKSLAYFQHWGQG

115 TPP-10580 CAKSSDKTHTSPPSPDGGSGG GSKTHTSPPSPYFQHWGQG 116 TPP-10274 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 117 TPP-5661 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG 118 TPP-13226 CAKVETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEVQHWGQG 119 TPP-13227 CAKVHTKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYHVQHWGQG 120 TPP-13228 CAKLTVETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVQHWGQG 121 TPP-13229 CAKLTAETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYENYFQHWGQG 122 TPP-13230 CAKGITGTKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYAEYFQHWGQG 123 TPP-13231 CAKGITGTKKYQSSPDGGSGG GSYDYVWGSYAYFQHWGQG 124 TPP-10276 CAKLTSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYYFQHWGQG 125 TPP-10290 CAKVHPNPNPNPNSPDGGSGG GSYNPNPNPNPHVDVWGQG 126 TPP-10445 CAKLTQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTYFQHWGQG 127 TPP-10269 CAKVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVQHWGQG 128 TPP-10288 CAKTQTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKAEYFQHWGQG 129 TPP-10265 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTTYNYEWHVDVWGQG 130 TPP-10268 CATSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVHWGQG 131 TPP-10593 CAKLTAEEWKKKYEKEKEKNKGS GGSGGSGGSGGAEYFQHWGQG 132 TPP-11174 CADSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 133 TPP-10266 CTSVHQETKKYQYQSSPDGGSGG GSYSYTYTYNYEWHVDVWGQG 134 TPP-11173 CAKLTDRSALLKSKLRALLTAPR GSNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 135 TPP-10444 CAKLTAVQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 136 TPP-10267 CTSVHQETKKYQSSYQSSPDGGSGG GSYSYTYSYTYNYEWHVDVWGQG 137 TPP-10443 CAKLTAVQVKLELGHRAQPDGGSGG GSPVNHLRSEKLTFNYFQHWGQG 138 TPP-11163 SSSNIGSKLRALLTAPR GSGSGGSGGSGSGYD 139 TPP-10360 SGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGGSGSGSGD 140 TPP-10462 SSLGQIQLTIRHSSPDGGSGG GSNKLIVVVHASRNLIGYD 141 TPP-10460 SPLGQIQLTIRHSSQPDGGSGG GSRNKLIVVVHASRNLIAYD 142 TPP-10461 SSLGQIQLTIRHSSQPDGGSGG GSRNKLIVVVHASRNLIGYD 143 TPP-11161 SSSNIGSALLKSKLRALLTAPR GSSDRSALLKSKLRALLTAD 144 TPP-11162 SSSNIGSALLKSKLRALLTAPR GSGSGGSGGSGGSGSGSGYD 145 TPP-10359 SSSNIGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGGSGSGSGYD 146 TPP-10824 YG NSNRPSG 147 TPP-10825 YGGSGS GSGSNSNRPSG 148 TPP-11019 YGKTHTSPPSPGG GGKTHTSPPSPGNRPSG 149 TPP-11021 YGSGSGSGSGSGGG GGKTHTSPPSPSGNRPSG 150 TPP-11020 YGSKTHTSPPSPGG GGKTHTSPPSPSGNRPSG 151 TPP-10789 YGSGSGSGSGGGSGG GSGGSGSGSGNRPSG 152 TPP-11022 YGSSDKTHTSPPSPGG GGSGSGSGGSGSGSGNRPSG 153 TPP-10829 YTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGNRPSG 154 TPP-10835 YGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFNRPSG 155 TPP-10788 YGSGSGSGSGSGGGSGG GSGSGGSGSGSGNRPSG 156 TPP-10571 YGVPKEKEKEKVSTAVGG GSAPLEVPKEKEKEKVG

157 TPP-10830 YGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGNRPSG 158 TPP-10790 YGGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGGSGSGSGNRPSG 159 TPP-10573 YGSGSGSGSGSGSGSGGG GSYEKEKEKNKTLKNVG 160 TPP-10827 YGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGNRPSG 161 TPP-10572 YGAEEWKKKYEKEKEKGG GSGSGSGSGSGSGSGSG 162 TPP-10836 YGGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGNRPSG 163 TPP-10834 YGSALLKSKLRALLTAPG GSDGSGGSGSGSGNRPSG 164 TPP-10787 YGSGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGGSGSGSGNRPSG 165 TPP-10831 YGGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGGGNRPSG 166 TPP-10828 YGGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGGNRPSG 167 TPP-10826 YTQTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEPKNRPSG 168 TPP-10837 YGGGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGGNRPSG 169 TPP-10361 YGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGGSGSGSGNRPSG 170 TPP-11023 YGSQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTSGNRPSG 171 TPP-10838 YPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGFNRPSG 172 TPP-10840 YGGVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGNRPSG 173 TPP-10839 YGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGSGGNRPSG 174 TPP-10832 YGSRSALLKSKLRALLTAPR GSDGSGSGGSGSGSGNRPSG 175 TPP-10833 YGSRSALLKSKLRALLTAPG GSDGSGSGGSGSGSGNRPSG 176 TPP-11024 YGSAVQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTFNSGNRPSG 177 TPP-10353 CQS VVF 178 TPP-10780 CGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGF 179 TPP-10786 CQSYDILPIEPDGGSGG GSRFDYDGVVF 180 TPP-10779 CGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGSGF 181 TPP-10778 CGSGSGSGSGSGGGSGG GSGSGSGSGSGSGF 182 TPP-10783 CQSYDKLELGHPDGGSGG GSHLRSEKGVVF 183 TPP-10785 CQSYDILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDGVVF 184 TPP-10776 CGSGSGSGSGSGPDGGSGG GSGSGSGSGSGSGF 185 TPP-10777 CGSGSGSGSGSGSDGGSGG GSGSGSGSGSGSGF 186 TPP-10784 CQSYDGFILPIEVYGGSGG GSKVRFDYDLFGVVF 187 TPP-10782 CQSYDKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKGVVF 188 TPP-10352 CQVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVVF 189 TPP-10356 CGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGF 190 TPP-10354 CQSYDPNPNPNPNPDGGSGG GSNPNPNPNPSGVVF 191 TPP-10355 CAAWNPNPNPNPNPNGGSGG GSNPNPNPNPNPNVF 192 TPP-10781 CQSYDQVKLELGHRAGGSGG GSVNHLRSEKLTGVVF 193 TPP-10436 CQSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVVF 194 TPP-10440 CQSYDQVKLELGHRPDGGSGG GSNHLRSEKLTGVVF 195 TPP-10442 CQSYDGFILPIEVYPDGGSGG GSKVRFDYDLFGVVF 196 TPP-10351 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVF 197 TPP-10348 CQSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVVVF 198 TPP-10358 CGGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGGF

199 TPP-11167 CQSYDSSALLKSKLRALLTAPR GSVNHLRSEKLTGVVF 200 TPP-10438 CQSAVQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTFNVF 201 TPP-10439 CQSYDQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTGVVF 202 TPP-10441 CQSYDGFILPIEVYFPDGGSGG GSRKVRFDYDLFGVVF 203 TPP-10349 CQSYVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVGVVF 204 TPP-10350 CQSYDVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVSGVVF 205 TPP-10437 CQSYDAVQVKLELGHRAPDGGSGG GSVNHLRSEKLTFNGVVF 206 TPP-11166 CQSYDSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSGGSVNHLRSEKLTGVVF 207 TPP-10362 CQSYDSSDRSALLKSKLRALLTAPR GSDRSALLKSKLRALLTAVVF 208 TPP-10363 CQSYDSSDRSALLKSKLRALLTAPE GSDRSALLKSKLRALLTAVVF 209 TPP-5657 3 A sequência N-terminal corresponde ao aa N-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais a extensão de aminoácido presente entre o referido aa de referência e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido 4 A sequência C terminal corresponde à extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o aa C-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais e o referido aa de referência

[00312] Além disso, as seguintes construções de anticorpo de IgG1 humana enxertadas com BNP foram geradas iniando da escrutura de anticorpo TPP-5657.

Tabela 5: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com

BNP Composto de Com- # aa # aa ANP posto TPP Sítio de inserção N-term1 C-term2 BNP correspondente3 B1 TPP-9902 CDRH3 20 18 Hum28aa #117 B2 TPP-11153 CDRH3 22 19 Hum25aa B3 TPP-11154 CDRH3 20 18 Rat28aa #117 B4 TPP-11155 CDRH3 17 17 Rat32aa B5 TPP-11156 CDRH2 18 13 Hum28aa #65 B6 TPP-11157 CDRH2 18 13 Rat28aa #65 B7 TPP-18029 CDRH1 23 14 Hum28aa #9 B8 TPP-18031 CDRH2 3 3 Hum28aa #12 B9 TPP-18032 CDRH2 7 7 Hum28aa #13 B10 TPP-18033 CDRH2 19 14 Hum28aa #80 B11 TPP-18028 CDRH2 20 15 Hum28aa #94 B12 TPP-18034 CDRH3 20 18 Hum28aa #122 B13 TPP-18030 CDRL3 19 14 Hum28aa #191 1 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal 3 Composto de ANP correspondente refere-se a uma construção de anticorpo enxertada com ANP com o mesmo local de integração e compreendendo a mesma sequência N-terminal e C-terminal

Tabela 5 continuação: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com BNP Cmpd TPP Sequência N-terminal3 Sequência C-terminal4 B1 TPP-9902 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG B2 TPP-11153 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGGSG GGSYSYTYNYEWHVDVWGQG B3 TPP-11154 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYEWHVDVWGQG B4 TPP-11155 CTSVHQETKKYQSSPDGG SYSYTYNYEWHVDVWGQG B5 TPP-11156 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYGST B6 TPP-11157 ISGSVVVTSHQAPGGGSGG GEKKKLKSLAYGST B7 TPP-18029 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM B8 TPP-18031 ISGS GGST B9 TPP-18032 ISGSGSGS GSGSGGST B10 TPP-18033 ISGSTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEGGST B11 TPP-18028 ISGPNPNPNPNPNSPDGGSGG GSYNPNPNPNPNPGST B12 TPP-18034 CAKGITGTKKYQSSPDGGSGG GSYSYTYNYAEYFQHWGQG B13 TPP-18030 CAAWNPNPNPNPNPNGGSGG GSNPNPNPNPNPNVF 3 A sequência N-terminal corresponde ao aa N-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais a extensão de aminoácido presente entre o referido aa de referência e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido 4 A sequência C terminal corresponde à extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o aa C-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais e o referido aa de referência

[00313] Além disso, as seguintes construções de anticorpo de IgG1 humana enxertadas com CNP foram geradas.

Tabela 6: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com

CNP SEQ ID Nº SEQ ID Nº Comp. de % de compreen- compre- # aa µg/ml ANP pureza de Sítio de dida em Ntls endida em # aa C- de pcs corres- pcs Comp. TPP Inserção Ctls N-term1 term2 pondente3 C1 TPP-9465 CDRH3 7 8 21 23 69-242 97 C2 TPP-12374 CDRL3 11 12 20 20 212 C3 TPP-12375 CDRH3 7 8 21 23 6 C4 TPP-12376 CDRH3 7 8 20 22 7 C5 TPP-12377 CDRH3 8 21 23 7 C6 TPP-12378 CDRH2 9 10 19 18 3 C13 TPP-18036 CDRH1 23 14 259 100 #9 C14 TPP-18038 CDRH2 3 3 0 #12 C15 TPP-18039 CDRH2 7 7 301 100 #13 C16 TPP-18040 CDRH2 2 3 19 14 300 100 #80 C17 TPP-18035 CDRH2 20 15 243 100 #94 C18 TPP-18041 CDRH3 21 22 20 18 287 100 #122 C19 TPP-18037 CDRL3 19 14 246 100 #191 Compostos com base em Diferença vs. TPP-12377 TPP-12377: C7 TPP-12895 LC_G99E C8 TPP-12896 LC_G99L 101-131 C9 TPP-12897 LC_S98D 198-304 C10 TPP-12898 LC_S98G 147-258 C11 TPP-12899 LC_A33Y 165-197 82 C12 TPP-12900 LC_A33E 109-195 1 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal 3 Composto de ANP correspondente refere-se a uma construção de anticorpo enxertada com ANP com o mesmo local de integração e compreendendo a mesma sequência N-terminal e C-terminal

Tabela 6 continuação: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com CNP Cmpd TPP Sequência N-terminal3 Sequência C-terminal4 C1 TPP-9465 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGGS GSGGYGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C2 TPP-12374 CQSYDQVKLELGHRAGGSGGS GSGGSGSVNHLRSEKLTGVVF C3 TPP-12375 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGGS GSGGSGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C4 TPP-12376 CTSVHQETKKYQSSPDGGSGG GGGSGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C5 TPP-12377 CTSVHQETKKYQSSPYKGANKK GSGGSGSYSYTYNYEWHVDVWGQG C6 TPP-12378 ISGSVVVTSHQAPGGGSGGS GSGGSGEKKKLKSLAYGST 3 A sequência N-terminal corresponde ao aa N-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais a extensão de aminoácido presente entre o referido aa de referência e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido 4 A sequência C terminal corresponde à extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o aa C-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais e o referido aa de referência Exemplo 5: Atividades in vitro em construções geradas

[00314] Todas as construções foram transitoriamente expressas em células HEK293 de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, alvejando uma densidade cellular de cerca de 2x10^6 células/ml, uma concentração de DNA total de cerca de 1µg/ml para os dois plasmídeos que codificam a cadeia leve e pesada e uma incubação de 5 dias para expressão.

[00315] Amostras de composto bruto (rcs) foram expressas em um volume de cultura de 0,4 ml, e o sobrenadante separado por centrifugação foi diretamente usado para o teste. A concentração de composto foi medida por um ELISA de quantificação de IgG-Fc de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Resumidamente, sobrenadante diluído em 1:1500 e uma série de diluição de duas vezes de Soro de Referência Humano (Betila, RS-110-4) iniciando com 400ng/ml foram imobilizados em placas de microtítulo pretas Maxisorp

384 (MTP) revestidas com Fc anti-humano [Sigma I2136] em uma diluição de 1:440 em1x tampão de revestimento (Candor, 121125) durante uma hora, 37°C. Após bloqueio com bloco SMART a 100% (Candor, 113125), Fc-HRP anti-humano [Sigma, A0170] foi aplicado em uma diluição de 1:10000 para a detecção de anticorpos em rcs e amostras de referência. As curvas de dose da amostra de referência foram usadas para avaliação quantitativa das concentrações de composto mostradas nas Tabelas 7 e 8, coluna "µg/ml de rcs". Todas as amostras foram aplicadas em quádruplos.

[00316] As amostras de composto isolado (ics) foram geradas por purificação de 1 etapa por meio de proteína-A de 6 ml de cultura de expressão e de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Eluatos de ácido foram neutralizados por adição de 8% (v/v) de Tris a 1M/HCl pH 9,0, quantificados por meio de absorção em 280 nm e normalizados para uma concentração de 125 nM.

[00317] Amostras de composto purificado (pcs) foram geradas por purificação de duas etapas por meio de proteína-A e SEC subsequente em tampão de PBS de cultura de expressão de pelo menos 35 ml. Os valores mostrados nas Tabelas 7 e 8, coluna "µg/ml de pcs", referem-se à concentração de composto no sobrenadante de cultura de expressão determinada por cromatografia de Proteína A analítica.

[00318] Todas as atividades mostradas nas tabelas 7 e 8 foram medidas em células com heterólogo sobre a expressão de NPRA humano (hNPRA) pelo uso de um ensaio de quantificação cGMP conduzido de acordo com as instruções do fabricante (cisbio; 62GM2PEH). Em resumo, o ensaio quantifica o cGMP em solução tamponada ou sobrenadantes de cultura celular com base na competição entre cGMP produzido pela célula como resultado da estimulação de NPRA através da amostra (peptídeo natriurético) e cGMP rotulado com d2 para ligação a um anticorpo rotulado com

Criptato. A amostra de cGMP e cGMP rotulado com d2 competem pela ligação em um número limitado de sítios em anticorpos anti-cGMP rotulados com Cryptate e, consequentemente, o sinal fluorescente específico de HTRF® (isto é, transferência de energia) é inversamente proporcional à concentração de cGMP na amostra.

[00319] Os dados de resposta à dose foram analisados com GraphPad Prism (versão 7.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA) e EC50 foram ajustados de acordo com Y=Base + (Topo-Base)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope)) aplicação de restrições para a base, topo e inclinação (valor compartilhado para todos os conjuntos de dados do respectivo experimento).

[00320] A atividade da amostra de composto cru sobre células hNPRA-CHO k1 estáveis foi primeiro avaliada por comparação com o controle negativo TPP-5657 e com uma amostra positiva, em particular TPP-5661. Controles e rcs foram testados em quádruplos em duas concentrações com um fator de diluição relativa de 5, visando um sinal fluorescente (s) na faixa dinâmica do ensaio. A janela de ensaio foi definida como a diferença no sinal de amostras inativas (sinal máx., S_max) e altamente ativas (sinal mín., S_min), e para ambas as concentrações de composto a atividade em % foi calculada como 100*(s_max – s)/(s_max – s_min). Os valores listados na Tabela 7, colunas "atividade de rcs" e "stdev de atividade de rcs", representam a média dos resultados para as duas concentrações e o respectivo desvio padrão. Sinais de Rcs menores do que metade do sinal do composto de referência TPP-5661 (36%) foram avaliados como não ativos (n.a.).

[00321] A atividade de diversas amostras de composto bruto nas células hNPRA-CHO k1 estáveis foi reavaliada por comparação com amostra de referência TPP-5661 em series de diluição de 2,5 vezes (8 concentrações) iniciando com uma diluição de 5 vezes. O valor de ajuste "logEC50" como medida de atividade da rcs foi definido com relação ao valor correspondente da rcs de referência TPP-5661 ajustando o delta "logEC50"_composto – "logEC50"_TPP-5661; valores resultants são listados na Tabela 7, coluna "atividade relativa de rcs". Notavelmente, as concentrações do composto na rcs não foram consideradas, e consequentemente os valores fornecidos são influenciados pela atividade do composto e concentração em medida igual. Todas as amostras foram aplicadas em quádruplos.

[00322] A atividade das amostras de composto isolado em células hNPRA-CHO k1 estáveis foi avaliada por determinação de EC50 e comparação com amostra de referência TPP-5661. As amostras foram testadas em séries de diluição de 2,5 vezes de 80 nM a 0,13 nM. Os valores de ajuste logEC50 como medida de atividade do ics foram estabelecidos em relação ao valor correspondente do ics de referência TPP-5661 (-8,8) calculando o delta logEC50_composto – logEC50_TPP-5661; os valores resultants são listados na Tabela 7, coluna "ics de logEC50 relativo". Todas as amostras foram aplicadas em quádruplos.

[00323] A atividade de amostras de composto purificado em células hNPRA-CHO k1 estáveis foi avaliada em múltiplos experimentos por determinação de EC50 e comparação com a amostra de referência TPP-5661. As amostras foram testadas em séries de diluição pelo menos em quádruplos. Os valores listados na Tabela 7, colunas "logEC50 relativo pcs 1, 3 e 4" resultam de séries de diluições de 5 vezes (≥4 concentrações) iniciando com 20 ou 25nM. Os valores listados na tabela 7, coluna "logEC50 relativo pcs 2" resultam de séries de diluição de 10 vezes (4 concentrações) iniciando com 25 nM. Os valores listados na tabela 7, colunas "logEC50 relativo pcs 5, 6, 7, 8 e 9" resultam das séries de diluição de 2,5 vezes, com 8 ou 12 concentrações iniciando com 40 a 200 nM, respectivamente. O valor de ajuste logEC50 como medida de atividade das pcs foi estabelecido com relação ao valor correspondente do TPP-5661 de referência no respectivo experimento (em média -9,2, desvio padrão 0,5) calculando o delta logEC50_composto – logEC50_TPP-5661.

[00324] A atividade de amostras de composto purificado em células hNPRA-HEK293 transitórias foi avaliada em três experimentos por determinação de EC50 e comparação com a amostra de referência TPP-5661. As amostras foram testadas em séries de diluição de 5 vezes de 1000 nM a 0,013 nM. O valor de ajuste logEC50 como medida de atividade da pcs foi estabelecido com relação ao valor correspondente do TPP-5661 de referência no respectivo experimento (média de três experimentos -9,0, desvio padrão 0.4) calculando o delta logEC50_composto – logEC50_TPP-5661; os valores resultantes são listados na tabela 7, colunas "logEC50* relativo pcs". Todas as asmostras foram aplicadas em duplicatas.

[00325] Uma avaliação qualitativa sumariada da atividade de compostos é fornecida na coluna "atividade qualitativa", valores listados na coluna "logEC50 relativo médio" foram calculados como a média dos valores logEC50 relativos. Compostos mostrando um valor EC50 >50 vezes do composto de referência TPP-5661, significando o logEC50 relativo médio > 1.7, foram qualitativamente avaliados como não ativos (" - "), compostos mostrando um logEC50 relativo entre 0,7 e 1,7 foram avaliados como ativos (" + "), compostos mostrando um logEC50 relativo < 0,7 foram avaliados como muito ativos (" ++ "); atividades mais elevadas foram observadas em logEC50 relativo abaixo de -0,7 (" +++ "). Compostos mostrando uma atividade em rcs sem confirmação com ics ou pcs são marcados como indefinidos "y", e compostos avaliados como não ativos ("n.a." na coluna "atividade de rcs") provavelmente devido ao seu baixo nível de expressão (≤1 µg/ml, "n.e." na coluna "µg/ml de rcs") são consequentemente marcados.

Tabela 7: Níveis de expressão e atividades de construções de anticorpo enxertadas com peptídeo natriurético atrial Não determinado (n.d.), não ativo (n.a.), não expresso (n.e.), não aplicável (na)

Stdev de Atividade relativa de logEC50 de relativo médio logEC50 de pcs 1 relativo logEC50 de pcs 2 relativo logEC50 de pcs 3 relativo logEC50 de pcs 4 relativo logEC50 de pcs 5 relativo logEC50 de pcs 6 relativo logEC50 de pcs 7 relativo logEC50 de pcs 8 relativo logEC50 de pcs 9 relativo logEC50* de pcs relativo logEC50* de pcs relativo logEC50* de pcs relativo atividade relativa de rcs logEC50 de ics relativo

Atividade qualitativa % de pureza de pcs

Atividade de rcs µg/ml de pcs µg/ml de rcs # aa N-term1

# aa C-term2 Composto rcs

#1 6 2 n.d. 225 93 n.d. n.a. n.a. n.a. - n.a. #2 9 5 n.d. 179 96 n.d. n.a. n.a. n.a. - n.a. #3 12 8 n.d. 196 97 n.d. 0,2 0,0 0,0 ++ 0,1 #4 15 10 n.d. 214 96 n.d. -0,7 -0,8 -0,8 ++ -0,8 #5 18 10 n.d. 229 93 n.d. -0,7 -0,4 -0,4 -0,5 ++ -0,5 #6 19 17 1,6 150 76 33% 18% y #7 19 17 n.e 117 70 22% 20% y #9 23 14 4,8 226 97 41% 27% -0,2 0,0 -0,5 -0,6 -0,4 ++ -0,3 #10 23 14 n.d. 265 96 n.d. 0,9 0,2 0,1 0,0 ++ 0,3 #12 3 3 42,0 n.d. n.d. n.a. - #13 7 7 12,0 n.d. n.d. n.a. n.a. - n.a. #14 8 9 14,0 n.d. n.d. n.a. n.a. - n.a. #15 10 11 6,6 n.d. n.d. n.a. n.a. - n.a. #16 11 14 9,8 n.d. n.d. n.a. - #17 12 8 7,2 n.d. n.d. 53% 3% y #18 13 12 12,0 290 98 n.a. -0,2 0,9 + 0,9 #19 14 9 9,5 n.d. n.d. 48% 11% y #20 14 10 9,9 n.d. n.d. 64% 3% y #21 14 11 5,8 n.d. n.d. 38% 18% 0,7 ++ 0,7 #22 14 14 23,0 n.d. n.d. 75% 9% y #23 15 10 2,6 n.d. n.d. 60% 35% y #24 15 12 n.e 83 52 26% 22% 0,6 ++ 0,6 #25 15 14 14,0 n.d. n.d. 25% 5% -1,0 0,8 + 0,8 #26 16 11 2,0 181 98 n.a. 1,9 - #27 16 11 17,0 n.d. n.d. 37% 23% 1,4 + 1,4 #28 16 11 9,1 n.d. n.d. 50% 9% -0,9 0,5 ++ 0,5 #29 16 14 7,0 n.d. n.d. n.a. - #30 16 15 35,0 n.d. n.d. 88% 13% y #33 17 11 2,3 229 79 73% 32% -0,9 -0,1 -1,1 -0,7 -0,9 -0,5 -0,8 ++ -0,7 #34 17 11 n.d. 226 87 n.d. -0,2 ++ -0,2 #35 17 11 n.d. 215 86 n.d. -0,6 ++ -0,6 #36 17 11 n.d. 217 86 n.d. -0,1 ++ -0,1 #37 17 11 n.d. 244 86 n.d. -0,8 +++ -0,8 #38 17 11 n.d. 233 88 n.d. -0,5 ++ -0,5 #39 17 11 n.d. 208 86 n.d. -0,6 ++ -0,6

#40 17 11 n.d. 154 85 n.d. -0,5 -0,3 -0,6 ++ -0,5 #41 17 11 n.d. 106 79 n.d. n.d. #42 17 11 n.d. 112 97 n.d. -0,6 -0,7 -0,7 ++ -0,7 #43 17 11 n.d. 141 96 n.d. -0,6 -0,8 -0,6 ++ -0,7 #44 17 11 n.d. 166 93 n.d. -0,7 -0,8 -0,8 +++ -0,8 #45 17 11 n.d. 135 90 n.d. -0,4 -0,2 -0,5 ++ -0,4 #46 17 11 n.d. 166 92 n.d. -0,5 -0,4 -0,6 ++ -0,5 #47 17 11 n.d. 123 83 n.d. -0,3 -0,3 -0,7 ++ -0,4 #49 17 11 n.d. 203 84 n.d. -0,6 -0,2 -0,1 -0,6 ++ -0,4 #50 17 12 9,0 87 97 66% 21% -1,0 0,0 -0,4 ++ -0,2 #51 17 12 6,4 n.d. n.d. 44% 39% y #52 17 12 7,6 n.d. n.d. 26% 20% y #53 17 13 n.d. n.d. n.d. 69% 5% y #54 17 14 n.e 75 n.d. n.a. n.e #55 17 14 8,8 271 95 72% 40% -0,9 -0,9 -0,4 0,2 ++ -0,4 #57 17 17 13,0 n.d. n.d. 48% 1% y #58 17 17 33,0 n.d. n.d. 45% 9% y #59 17 17 31,0 n.d. n.d. 87% 4% -1,1 0,0 ++ 0,0 #60 18 12 4,1 367 90 53% 31% 0,0 -0,5 ++ -0,3 #61 18 13 n.e 334 97 n.a. 0,0 -0,9 ++ -0,5 #62 18 13 11,0 n.d. n.d. 36% 14% 1,5 + 1,5 #63 18 13 9,5 239 96 70% 22% -0,1 ++ -0,1 #64 18 13 5,3 n.d. n.d. 51% 18% y #65 18 13 1,2 253 86 69% 17% -0,5 -0,3 -1,2 -0,9 +++ -0,7 #66 18 13 38,0 n.d. n.d. 87% 4% -0,5 0,2 ++ 0,2 #67 18 13 4,8 n.d. n.d. 35% 17% -1,1 0,7 ++ 0,7 #68 18 13 9,2 n.d. n.d. 48% 13% y #69 18 14 7,1 n.d. n.d. 66% 11% -1,0 0,3 ++ 0,3 #70 18 17 n.e n.d. n.d. 30% 2% y #71 18 17 27,0 n.d. n.d. 89% 2% -0,5 -0,6 ++ -0,6 #72 19 12 11,0 n.d. n.d. 82% 0% -1,5 0,1 ++ 0,1 #73 19 14 9,4 n.d. n.d. 71% 0% -1,4 -0,2 ++ -0,2 #74 19 14 3,8 142 97 67% 7% -1,0 0,0 0,3 ++ 0,2 #75 19 14 4,4 50 49 95% 8% -0,4 ++ -0,4 #76 19 14 11,0 299 97 56% 2% 0,2 -0,8 ++ -0,3 #77 19 14 13,0 n.d. n.d. 38% 6% 1,1 + 1,1 #78 19 14 14,0 n.d. n.d. 55% 38% 1,0 + 1,0 #79 19 14 5,5 n.d. n.d. 67% 26% y #80 19 14 5,4 214 95 67% 19% -0,4 -0,8 ++ -0,6 #81 19 14 6,2 n.d. n.d. 64% 10% y #82 19 14 1,6 n.d. n.d. 57% 9% y #83 19 14 n.e n.d. n.d. 22% 40% y #84 19 14 11,0 n.d. n.d. 45% 30% y #85 19 15 4,5 n.d. n.d. 74% 27% -1,2 -0,9 +++ -0,9 #87 19 15 42,0 n.d. n.d. 90% 13% y #89 20 15 n.e 85 n.d. n.a. n.e #90 20 15 n.e 68 50 52% 18% 0,9 0,5 0,4 ++ 0,6 #91 20 15 3,4 275 99 30% 26% 0,3 0,3 -0,2 0,1 0,2 ++ 0,1

#92 20 15 2,3 n.d. n.d. n.a. -0,3 0,6 ++ 0,6 #93 20 15 4,1 286 98 70% 4% -0,8 -0,8 +++ -0,8 #94 20 15 12,0 318 98 83% 17% -0,8 -0,8 +++ -0,8 #95 20 15 38,0 n.d. n.d. 81% 16% y #96 20 15 7,3 n.d. n.d. n.a. - #97 20 15 8,3 n.d. n.d. 26% 17% y #98 20 15 7,7 n.d. n.d. 40% 14% y #99 10 3 44,0 257 100 n.a. n.a. n.a. - n.a. #100 10 8 88,0 188 99 n.a. n.a. n.a. - n.a. #101 12 10 83,0 n.d. n.d. n.a. - #102 14 12 16,0 n.d. n.d. 20% 7% y #103 15 18 7,7 101 85 50% 8% 0,7 -0,1 ++ 0,3 #104 16 14 15,0 137 98 n.a. 1,0 2,3 ? 1,7 #106 17 15 30,0 n.d. n.d. 20% 2% y #107 17 18 8,8 n.d. n.d. 50% 19% y #108 18 16 37,0 n.d. n.d. 68% 7% y #109 18 18 4,6 n.d. n.d. 62% 20% y #110 19 17 34,0 238 100 45% 25% -0,4 1,1 ++ 0,4 #111 19 17 41,0 296 98 80% 3% -0,4 0,2 ++ -0,1 #112 19 18 3,9 n.d. n.d. 31% 30% y #113 20 17 44,0 n.d. n.d. 52% 2% y #114 20 17 26,0 219 76 94% 4% 0,5 0,1 ++ 0,3 #116 20 18 9,4 247 84 71% 11% -0,3 -0,2 0,0 -0,2 0,0 -0,1 ++ -0,1 #117 20 18 12,9 238 92 36% 30% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 ++ 0,0 #118 18 16 n.d. 191 n.d. n.d. -0,1 ++ -0,1 #119 18 16 n.d. 171 n.d. n.d. -0,2 ++ -0,2 #120 20 18 n.d. 200 n.d. n.d. -0,3 ++ -0,3 #121 20 18 n.d. 253 n.d. n.d. -0,2 ++ -0,2 #122 20 18 n.d. 115 n.d. n.d. -0,3 ++ -0,3 #123 20 18 n.d. 153 n.d. n.d. -0,1 ++ -0,1 #124 20 18 41,0 n.d. n.d. 77% 23% y #125 20 18 18,0 320 99 84% 16% -0,8 -0,1 ++ -0,5 #126 20 18 17,0 203 90 80% 2% y #127 20 18 35,0 119 92 95% 2% 0,5 -0,7 -0,5 -0,5 -0,5 ++ -0,3 #128 20 18 64,0 291 96 93% 9% y #129 20 19 28,0 n.d. n.d. 78% 12% y #130 21 19 33,0 n.d. n.d. 89% 5% y #132 22 20 7,5 n.d. n.d. 68% 20% y #133 22 20 20,0 n.d. n.d. 75% 14% y #134 22 20 9,7 n.d. n.d. 75% 3% y #135 22 20 30,0 158 88 67% 9% 0,1 3,5 ? 1,8 #136 24 22 15,0 n.d. n.d. 65% 13% y #137 24 22 61,0 n.d. n.d. 81% 23% y #139 19 13 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #145 23 14 35,0 n.d. n.d. 73% 11% y #146 1 6 29,0 n.d. n.d. n.a. - #147 5 10 6,7 n.d. n.d. n.a. 0,8 + #151 14 14 13,0 n.d. n.d. 64% 23% -1,3 -0,4 ++ -0,4

#153 16 15 1,5 n.d. n.d. 40% 24% y #154 16 15 n.e n.d. n.d. 22% 21% y #155 16 16 7,8 n.d. n.d. 57% 17% -1,3 -0,7 ++ -0,7 #156 17 16 2,0 64 98 57% 33% -1,3 ++ #157 17 16 2,4 n.d. n.d. 23% 11% y #158 17 16 10,0 n.d. n.d. n.a. -0,6 ++ #159 17 16 4,9 n.d. n.d. 55% 22% -1,3 ++ #160 17 16 2,8 n.d. n.d. 34% 22% y #161 17 16 4,9 n.d. n.d. 34% 9% -0,7 ++ #162 17 16 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #163 17 17 n.d. 84 85 n.d. 0,6 ++ 0,6 #164 18 16 3,0 n.d. n.d. n.a. -0,8 -0,1 ++ -0,1 #165 18 17 3,5 n.d. n.d. 53% 28% y #166 18 17 4,1 n.d. n.d. 20% 34% y #167 18 17 n.e 48 n.d. 44% 13% y #168 18 17 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #169 19 17 2,8 78 99 20% 16% -0,1 -0,1 ++ -0,1 #170 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #171 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #172 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #173 19 18 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #174 19 19 n.d. 73 n.d. n.d. 1,3 + 1,3 #175 19 19 n.d. 105 82 n.d. 0,3 0,1 ++ 0,2 #176 20 19 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #177 2 2 41,0 262 100 n.a. n.a. n.a. - n.a. #178 14 9 16,0 n.d. n.d. 67% 33% y #179 16 10 51,0 n.d. n.d. n.a. - #180 16 11 18,0 n.d. n.d. 37% 6% y #181 16 13 21,0 n.d. n.d. 79% 7% y #182 17 11 2,5 n.d. n.d. 73% 19% y #183 18 12 36,0 n.d. n.d. 21% 16% y #184 18 13 10,0 100 100 50% 3% y #185 18 13 17,0 81 100 72% 1% y #186 18 14 20,0 77 96 45% 22% y #187 19 13 35,0 217 95 85% 10% -1,1 +++ -1,1 #188 19 14 15,0 n.d. n.d. 77% 8% y #189 19 14 16,0 102 99 59% 4% y #190 19 14 41,0 n.d. n.d. 64% 13% y #191 19 14 29,0 248 99 94% 8% 0,1 -0,6 0,2 -0,3 ++ -0,2 #192 19 15 70,0 n.d. n.d. 90% 14% -1,0 -1,0 +++ -1,0 #193 20 14 2,7 n.d. n.d. 33% 37% y #194 20 14 32,0 98 97 75% 3% y #195 20 14 20,0 43 97 34% 12% y #196 20 15 n.e n.d. n.d. n.a. n.e #197 20 15 5,5 18 n.d. 54% 20% y #198 20 15 14,0 57 100 52% 21% y #199 21 15 7,3 n.d. n.d. 29% 12% y #200 21 15 33,0 97 n.d. 78% 7% y

#201 21 15 51,0 134 97 87% 6% -0,3 0,1 -0,3 ++ -0,1 #202 21 15 16,0 29 n.d. 58% 3% y #203 21 16 3,1 17 n.d. 33% 2% y #204 22 17 5,7 20 n.d. 45% 17% y #205 23 17 34,0 n.d. n.d. 84% 19% y #206 24 18 11,0 n.d. n.d. 47% 33% y #207 24 20 12,0 115 95 59% 17% n.a. n.a. - n.a. #208 24 20 9,5 182 92 74% 11% 0,6 0,3 ++ 0,5 #209 na Na 18,3 402 100 n.a. - 1 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal

[00326] Nenhum dado conclusivo para os compostos #104 e #135 foi obtido. 12 compostos (#54, #61, #89, #139, #162, #168, #170, #171, #172, #173, #176,#196) mostraram níveis de expressão muito baixos (≤ 1µg/ml em rcs) e consequentemente nenhuma atividade; atividade de #61 foi mostrada após preparação do composto (pcs). 7 compostos (#7, #24, #70, #83, #90, #154, #167) mostraram, na maioria dos casos, baixa atividade como rcs, embora seu nível de expressão fosse muito baixo; a atividade de #24 e #90 foi confirmada pela preparação de composto (pcs). Nenhuma atividade foi observada em rcs dos compostos #18, #26, #29, #92, #96, #101, #104, #158, #164, #179; entretanto, a atividade de compostos #18, #92, #158, #164 foi mostradas usando altas concentrações (atividade rel. rcs); a ausência de atividade de #26 foi desse modo confirmada.

Tabela 8: Níveis de Expressão e atividades de construções de anticorpo enxertadas com Peptídeo Natriurético Cerebral Não aplicável (na) atividade qualitativa sobre Atividade qualitativa de

ANP correspondente.3 % de pureza pcs de µg/ml de pcs # aa N-term1 # aa C-term2 Composto HnPRA

TPP Cpd B1 TPP-9902 20 18 304 96 ++ ++ B2 TPP-11153 22 19 202 99 + B3 TPP-11154 20 18 205 100 - ++ B4 TPP-11155 17 17 226 97 - B5 TPP-11156 18 13 115 75 ++ +++ B6 TPP-11157 18 13 125 93 - +++ B7 TPP-18029 23 14 265 99 + ++ B8 TPP-18031 3 3 260 99 - - B9 TPP-18032 7 7 262 99 - - B10 TPP-18033 19 14 310 98 + ++ B11 TPP-18028 20 15 74 99 + +++ B12 TPP-18034 20 18 315 97 ++ ++ B13 TPP-18030 19 14 304 100 + ++ #209 TPP-5657 na na 402 100 - - 1 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal 3 Cpd. de ANP correspondente refere-se a uma construção de anticorpo enxertada com ANP com o mesmo local de integração e compreendendo a mesma sequência N-terminal e C-terminal

[00327] Amostras de composto purificado foram testadas como descrito no Exemplo 3 em quáduplos em séries de diluição em células hNPRA-CHO k1 estáveis. As atividades de construções de anticorpo enxertadas com BNP são graficamente descritas na Figura 11.

[00328] TPP-11156, TPP-9902 e TPP-11153 mostraram atividade significante em células hNPRA ao contrário de TPP-1154, TPP-11155, e TPP-11157. Resultados opostos foram observados em rNPRA com EC50 < 20nM para TPP-1154, TPP-11155, e TPP-11157, e EC50 >1µM para TPP-9902, TPP-11153, e TPP-11156 (veja, Exemplo 3). Isto pode ser explicado pela presença de uma sequência de BNP humano em TPP-11156, TPP-9902 e TPP-11153, enquanto TPP-1154, TPP-11155, e TPP-11157 compreendem uma sequência de BNP de rato (veja, Tabela 5). Ao contrário de todas as outras construções de anticorpo enxertadas com BNP humano, TPP-18031 e TPP-18032 com baixos números de aminoácidos N- e C-terminal adicionais para BNP não mostraram atividade em hNPRA. Exemplo 6: Sequências ligantes específicas são particularmente vantajosas para obtenção de homogeneidade e níveis de expressão

[00329] A pureza de amostras de composto purificado (Exemplo 5, Tabela 7, coluna "% de pureza pcs") foi determinada por Eletroforese em gel capilar de acordo com instruções do fabricante (LabChip GX, Caliper Life Sciences) sob condições reduzidas. A pureza em % foi calculada como a soma de áreas de pico correspondentes a cadeia leve e pesada intacta com relação à soma de todos os picos observados.

[00330] Sequências de Ntls compreendendo uma sequência de ligante de GS, uma sequência de ligante de PN ou a sequência de SEQ ID Nºs 2, 4, 9, 11, 13 ou 15 e sequências de Ctls compreendendo uma sequência de ligante de GS, uma sequência de ligante de PN ou a sequência de SEQ ID Nºs 3, 5, 12, 14, 15 ou 20 se provaram particularmente úteis, visto que elas não apenas obtêm atividades elevadas de peptídeo natriurético (contanto que pelo menos 12 resíduos de aminoácido estejam presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido), porém também bons níveis de expressão (ao contrário, por exemplo, das sequências usadas nos compostos #186, #195 e #202) e (ao contrário, por exemplo, das sequências usadas nos compostos 6 e 7) um baixo grau de não homogeneidade (veja, Tabela 9). Com sequências de ligante compreendendo uma sequência de ligante de GS, bem como sequências de ligante compreendendo uma sequência de ligante de PN, purezas muito boas de 98% em média foram observadas. Similarmente, bons valores foram observados para os compostos com ligantes compreendendo sequências de SEQ ID Nºs 2, 3, 4, 5, 9, 11, 12, 13, 14, 15 e 20. Notavelmente, a Ntls tendo a sequência de SEQ ID Nº 9 resultou apenas em combinação com a Ctls tendo a sequência de SEQ ID Nº 20 nos compostos com pureza muito boa; compostos com uma combinação da Ntls tendo a sequência de SEQ ID Nº 11 e a Ctls tendo a sequência de SEQ ID Nº 12 mostrou apenas pureza muito boa quando a SEQ ID Nº 11 foi flaqueada por Asp (D) no lado N-terminal e não por Thr (T) ou Val (V) e quando a SEQ ID Nº 12 VNHLRSEKLT foi flaqueada por Gly (G) no lado C-terminal, porém não por Tyr (Y) ou Phe (F) como nos compostos #126 e #135. Tabela 9: Efeitos de Ntls e Ctls sobre a pureza do anticorpo (excerto de Tabela 7) SEQ ID Nº compreendida em Ntls SEQ ID Nº compreendida em Ctls Atividade quantit. % pureza de pcs Sítio de µg/ml de pcs # aa N-term1 # aa C-term2 inser- Sequência C- Comp. TPP ção Sequência N-terminal3 terminal4 2 TPP-13056 CDRH1 GS GS 9 5 SGFTFGSGSG GSGSGM 179 96 - 3 TPP-13055 CDRH1 GS GS 12 8 SGFTFGSGSGSGS SGSGSGSGM 196 97 ++ 4 TPP-13054 CDRH1 GS GS 15 10 SGFTFGSGSGSGGSGG GGSGGSGSGSG 214 96 ++ 5 TPP-12545 CDRH1 GS GS 18 10 SGFTFGSGSGSGSGGGSG GSGSGGSGSGM 229 93 ++

G 9 TPP-10294 CDRH1 GS GS 23 14 SGFTFGSGSGSGSGSGSP GSYGSGSGSGS 226 97 ++

DGGSGG GSGM

10 TPP-12547 CDRH1 GS GS 23 14 SGFTFGSGSGSGSGSGSP GSYGSGSGSGS 265 96 ++

DGGSGG GSGM 91 TPP-10282 CDRH2 GS GS 20 15 ISGSGSGSGSGSGSPDGGS GSYGSGSGSGS 275 99 ++

GG GSGST 99 TPP-10281 CDRH3 GS GS 10 3 CAKSPDGGSGG GSYG 257 100 - 100 TPP-10280 CDRH3 GS GS 10 8 CAKSPDGGSGG GSYQHWGQG 188 99 - 169 TPP-10361 CDRL2 GS GS 19 17 YGSGSGSGSGSGSPDGGS GSYGSGGSGSG 78 99 ++

GG SGNRPSG 184 TPP-10776 CDRL3 GS GS 18 13 CGSGSGSGSGSGPDGGSG GSGSGSGSGSG 100 100 y

G SGF 185 TPP-10777 CDRL3 GS GS 18 13 CGSGSGSGSGSGSDGGSG GSGSGSGSGSG 81 100 y

G SGF 189 TPP-10356 CDRL3 GS GS 19 14 CGSGSGSGSGSGSPDGGS GSYGSGSGSGS 102 99 y

GG GSGF 198 TPP-10358 CDRL3 GS GS 20 15 CGGSGSGSGSGSGSPDGG GSYGSGSGSGS 57 100 y

SGG GSGGF 18 TPP-10767 CDRH2 PN PN 13 12 ISGPNPNKNPNPGG GSNENPNPNPGS 290 98 +

T 55 TPP-10765 CDRH2 PN PN 17 14 ISGPNPNKNPNPNPGSGG GSNPNENPNPNP 271 95 ++

GST 93 TPP-10286 CDRH2 PN PN 20 15 ISGPNPNKNPNPNSPDGGS GSYNPNENPNPN 286 98 ++ GG PGST + 94 TPP-10283 CDRH2 PN PN 20 15 ISGPNPNPNPNPNSPDGGS GSYNPNPNPNPN 318 98 ++ GG PGST + 111 TPP-10289 CDRH3 PN PN 19 17 CAKVHPNPNPNPNPDGGS GSNPNPNPNPHV 296 98 ++

GG DVWGQG 125 TPP-10290 CDRH3 PN PN 20 18 CAKVHPNPNPNPNSPDGG GSYNPNPNPNPH 320 99 ++

SGG VDVWGQG 191 TPP-10355 CDRL3 PN PN 19 14 CAAWNPNPNPNPNPNGGS GSNPNPNPNPNP 248 99 ++

GG NVF 63 TPP-10844 CDRH2 2 3 18 13 ISGTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEG 239 96 ++

ST 80 TPP-10845 CDRH2 2 3 19 14 ISGSTYISNVNHKPDGGSGG GSNTKVDKKVEG 214 95 ++

GST 128 TPP-10288 CDRH3 2 3 20 18 CAKTQTYISNVNHKPDGGS GSNTKVDKKAEY 291 96 y

GG FQHWGQG 61 TPP-10847 CDRH2 4 5 18 13 ISGTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGG 334 97 ++

ST 76 TPP-10848 CDRH2 4 5 19 14 ISGSTSASLAITGPDGGSGG GSDRFSGSKSGG 299 97 ++

GST 156 TPP-10571 CDRL2 15 15 17 16 YGVPKEKEKEKVSTAVGG GSAPLEVPKEKEK 64 98 ++

EKVG 42 TPP-13060 CDRH2 9 20 17 11 ISVVVTSHQSPTPGGSGG GGSTPLKSLAST 112 97 ++ 43 TPP-13061 CDRH2 9 20 17 11 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GGSTPLKSLAST 141 96 ++ 44 TPP-13062 CDRH2 9 20 17 11 ISVVVTSHQAPGEGGSGG GSTPKLKSLAST 166 93 ++ + 46 TPP-13064 CDRH2 9 10 17 11 ISVVVTSHPTPGEGGSGG GEKKKLKSLAST 166 92 ++ 45 TPP-13063 CDRH2 9 10 17 11 ISVVVTSHQSPTPGGSGG GEKKKLKSLAST 135 90 ++

40 TPP-13058 CDRH2 9 10 17 11 ISVVVTSHQAPGSGGSGG GEKKKLKSLAST 154 85 ++ 47 TPP-13065 CDRH2 9 10 17 11 ISVVVTSHQAPSPGSTGG GEKKKLKSLAST 123 83 ++ 41 TPP-13059 CDRH2 9 10 17 11 ISVVVTSHQAPTSGGSGG GEKKKLKSLAST 106 79 n.d. 201 TPP-10439 CDRL3 11 12 21 15 CQSYDQVKLELGHRAPDG GSVNHLRSEKLT 134 97 ++

GSGG GVVF 194 TPP-10440 CDRL3 11 12 20 14 CQSYDQVKLELGHRPDGG GSNHLRSEKLTG 98 97 y

SGG VVF 187 TPP-10782 CDRL3 11 12 19 13 CQSYDKLELGHRAPDGGS GSVNHLRSEKGV 217 95 ++ GG VF + 126 TPP-10445 CDRH3 11 12 20 18 CAKLTQVKLELGHRPDGGS GSNHLRSEKLTYF 203 90 y

GG QHWGQG 135 TPP-10444 CDRH3 11 12 22 20 CAKLTAVQVKLELGHRPDG GSNHLRSEKLTFN 158 88 ?

GSGG YFQHWGQG 50 TPP-10452 CDRH2 13 14 17 12 ISGSAVVNVRAPDGGSGG GSKGDKIAIGGST 87 97 ++ 74 TPP-10451 CDRH2 13 14 19 14 ISGSSGAVVNVRAPDGGSG GSKGDKIAIWTTG 142 97 ++

G ST 26 TPP-10772 CDRH2 13 14 16 11 ISGSAVVNVRADGGSGG GSGDKIAIGGST 181 98 - 6 TPP-10454 CDRH1 19 17 SPAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGS 150 76 y

GFVVAM 7 TPP-10453 CDRH1 19 17 SGAVVYIEILDRHPDGGSGG GSGREVPISNGS 117 70 y

GFVVAM 186 TPP-10784 CDRL3 18 14 CQSYDGFILPIEVYGGSGG GSKVRFDYDLFG 77 96 y

VVF 195 TPP-10442 CDRL3 20 14 CQSYDGFILPIEVYPDGGSG GSKVRFDYDLFG 43 97 y

G VVF 202 TPP-10441 CDRL3 21 15 CQSYDGFILPIEVYFPDGGS GSRKVRFDYDLF 29 n.d. y

GG GVVF 1 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal 3 A sequência N-terminal corresponde ao aa N-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais a extensão de aminoácido presente entre o referido aa de referência e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido 4 A sequência C terminal corresponde à extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o aa C-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais e o referido aa de referência

Exemplo 7: Isotipos IgG1, IgG2 e IgG4 fornecem estruturas de anticorpo igualmente adequadas

[00331] Os compostos 9, 33, 65, 91, 127 e 191 (IgG1 humana TPP- 10294, TPP-10277, TPP-10279, TPP-10282, TPP-10269 e TPP-10355, respectivamente) foram gerados como diferentes isotipos de IgG. Amostras de composto purificado foram testadas como descrito no Exemplo 3, em quáduplos em séries de diluição em células hNPRA- CHO k1 estáveis. As atividades de construções de isotipo IgG2 e IgG4 humana enxertadas com ANP (por exemplo, composto 9, IgG4 TPP- 10992) são similares ao seu isotipo IgG1 correspondente como graficamente descrito na Figura 12. Exemplo 8: IgGs humanas e não humanas fornecem estruturas de anticorpo igualmente adequadas

[00332] O Composto 9 (IgG1 humana TPP-10294 e IgG4 TPP- 10992) e o composto 117 (IgG1 humana TPP-5665) foram gerados como isótopos de IgG não humana. Amostras de composto purificado foram testadas como descrito no Exemplo 3 em quáduplos em séries de diluição em células hNPRA-CHO k1 estáveis. Construções de isotipo de rato e camundongo enxertadas com ANP, por exemplo, o composto 9, IgG1 TPP-13992 de rato, mostrou atividades similares a seu isótopo de IgG humana correspondente (Figura 13). Exemplo 9: IgGs humanas compreendendo sequências de linhagem germinativa variáveis fornecem estruturas de anticorpo igualmente adequados

[00333] 22 anticorpos de IgG4 enxertada com ANP adicional (compostos A a S) foram construídos. Em cada caso, o ANP foi incorporado dentro de CDRH1. As cadeias pesadas destas construções compreendem sequências variáveis de HV e CDRH3 e foram pareadas com cadeias leves variáveis lambda ou kappa. A estrutura de compostos A a S é sumariado nas Tabelas 10 e 11.

Tabela 10: Projeto de construções de anticorpo enxertadas com ANP A a S

# aa N-term1

# aa C-term2 Sítio de Sequência C- Comp. inserção Sequência N-terminal3 terminal4 A–P CDRH1 23 14 SGFTFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGM

Q-S CDRH1 23 14 SGYSFGSGSGSGSGSGSPDGGSGG GSYGSGSGSGSGSGI 1 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o respectivo resíduo de aminoácido de referência N-terminal e o primeiro aminoácido do peptídeo natriurético inserido; 2 O número de resíduos de aminoácido presentes entre o último aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o respectivo resíduo de aminoácido de referência C-terminal 3 A sequência N-terminal corresponde ao aa N-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais a extensão de aminoácido presente entre o referido aa de referência e o primeiro resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido 4 A sequência C terminal corresponde à extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do peptídeo natriurético inserido e o aa C-terminal vizinho mais próximo de referência do peptídeo natriurético inserido mais o referido aa de referência

Tabela 11: Projeto de construções de anticorpo enxertadas em ANP AaS Cmpd TPP HV CDRH3 LV/KV Pureza 9 TPP-10992 HV3-23 KLTGAEYFQHW LV1-40 99 A TPP-13944 HV3-23 KLTGAEYFQHW LV2-14 98 B TPP-13945 HV3-23 KLTGAEYFQHW LV3-21 93 C TPP-13941 HV3-23 KDYGDYAEYFQHW LV1-40 100 D TPP-13956 HV3-23 KLTGAEYFQHW KV1-5 99 E TPP-13955 HV3-23 KLTGAEYFQHW KV3-20 99 F TPP-13940 HV3-23 KVLRFLEWLLYAEYFQHW LV1-40 98 G TPP-13939 HV3-23 KVQLERAEYFQHW LV1-40 100 H TPP-13943 HV3-23 KYNRNHAEYFQHW LV1-40 54 I TPP-13942 HV3-23 KYNWNDAEYFQHW LV1-40 99 J TPP-14684 HV3-23 RGATFALDW KV3-20 97 K TPP-13958 HV3-23 RGRLPDVW KV1-5 99 L TPP-13957 HV3-23 RGRLPDVW KV3-20 97 M TPP-13948 HV3-23 RGRLPDVW LV1-40 98 N TPP-14289 HV3-23 RGRLPDVW LV1-47 O TPP-13946 HV3-23 RGRLPDVW LV2-14 97 P TPP-13947 HV3-23 RGRLPDVW LV3-21 96 Q TPP-13952 HV5-51 RGRLPDVW LV2-14 99 R TPP-13953 HV5-51 RGRLPDVW LV3-21 98 S TPP-13962 HV5-51 RGRLPDVW KV1-5 99

[00334] Amostras de composto purificado de construções de estrutura de IgG a S compreendendo sequências de linhagem germinativa variáveis foram testadas como descrito no Exemplo 3 em quádruplos em séries de diluição em células hNPRA-CHO k1 estáveis. Os dados de atividade exemplares são representados graficamente na Figura 14. Exemplo 10: IgG enxertada com CNP protege contra permeabilidade de barreira endotelial induzida

[00335] A permeabilidade da monocamada endotelial foi avaliada por medição de impedância em tempo real com um sistema xCELLigence RTCA utilizando placas de microtitulação revestidas com microeletrodos

(E-Plates). As mudanças de impedância relativa são expressas como valores de Índice Celular (CI) sem unidade.

[00336] As células endoteliais da artéria pulmonar humana primária (HPAECs) foram semeadas em passagens baixas em placas E pré- revestidas com colágeno. Após a formação de monocamada e barreira celular estreita com valores de CI constantes, HPAECs foram pré- tratados com as concentrações indicadas do composto TPP-12899 ou da respectiva construção de anticorpo de controle negativo TPP-5657, seguido pelo comprometimento da barreira EC com os agonistas disruptivos LPS (200 ng/ml), IL-1β (0,5 ng/ml), ou trombina (2 U/ml). Os CIs foram registrados a cada 10 min para monitorar os efeitos sobre o crescimento celular e permeabilidade de monocamada. Todos os índices celulares foram normalizados no último ponto de registro antes da aplicação da substância teste (=CI normalizado).

[00337] Os experimentos foram realizados com n=4 com 3 triplicatas técnicas cada. Os resultados foram expressos como a média ± SEM. Os dados foram estatisticamente analisados usando ANOVA unidirecional seguido por pós-teste múltiplo de Sidak; valores p < 0,05 foram considerados como significantes.

[00338] A Figura 15 descreve graficamente os efeitos na permeabilidade da monocamada endotelial expressa como valores de índice celular. Como mostrado na Figura 15, o pré-tratamento de culturas de monocamada endotelial humana com TPP-12899 protegeu contra a permeabilidade de barreira endotelial induzida de uma maneira dependente de dose. Isto foi dependente do agente de ruptura de barreira aplicado; tanto trombina de ação rápida e forte, bem como com estímulos pró-inflamatórios de longa duração LPS e efeitos significantes de IL-1β foram observados. O respectivo controle negativo não mostrou nenhum efeito.

Exemplo 11: Efeitos de longo prazo de IgG enxertada com ANP em um modelo de rato com insuficiência cardíaca crônica (TGR(mRenR2)27

[00339] O modelo de rato TGR(mRenR2)27 mostra hipertensão e disfunção endotelial, bem como lesão de órgão-alvo. Ratos transgênicos-renina machos (Ganten D., Nature. 1990; 344 (6266): 541- 4) com 8 semanas de idade foram usados. O inibidor não seletivo das sintetases de óxido nítrico L-NAME (metil éster de Nω-Nitro-L-arginina) foi administrado cronicamente por meio água potável (20 mg/l) em todos os grupos de estudo para induzir disfunção endotelial. TPP-13992, a contraparte IgG1 de rato de TPP-10294 usada no Exemplo 8 e TPP- 10155, um anticorpo de controle de isotipo IgG1 de rato foi administrado uma vez por semana intraperitonealmente. O peso corporal e sobrevivência foram avaliados. O grupo placebo foi tratado com veículo (PBS) e o grupo controle saudável foi tratado com alimento com captopril desde o desmame. Comida e água foram fornecidos ad libitum. Observação diária do comportamento e estado geral de saúde dos animais foi realizada. No final do experimento (semana 14), os ratos foram anestesiados. Os ratos foram então exsanguinados e o coração foi retirado da cavidade torácica para análise. A urina foi coletada no final do estudo para determinar diferentes parâmetros urinários, por exemplo, relação de creatinina proteica urinária. A Figura 16 descreve graficamente os efeitos terapêuticos de TPP-13992 na sobrevivência, ganho de peso corporal, relação proteína/creatinina urinária e peso do átrio esquerdo. Exemplo 12: Efeitos hemodinâmicos de IgG enxertada em ANP em cachorros beagles saudáveis

[00340] Os efeitos do TPP-10992 nos parâmetros cardiovasculares e de ECG após única administração subcutânea foram avaliados em um estudo farmacodinâmico primário em cachorros beagle conscientes por telemetria.

[00341] Dispositivos de telemetria (DSI™, USA) foram cirurgicamente implantados para medir a pressão sanguínea, bem como frequência cardíaca, seguido por um período de recuperação para permitir o fechamento da ferida. No dia do estudo, sensores de telemetria foram ativados para medições hemodinâmicas contínuas. Os sinais transmitidos foram coletados por receptores de telemetria localizados no biotério. Todos os dados coletados foram processados por um programa de aquisição de dados e calculados em média durante um período predefinido de 12 horas. Como veículo para TPP-10992, NaCl (0,9%) foi usado e doses de 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg e 1,0 mg/kg de peso corporal foram aplicadas por meio de injeção subcutânea.

[00342] Os resultados são descritos graficamente na Figura 17. Em cachorros saudáveis, TPP-10992 mostrou uma redução da pressão arterial dependente de dose e de longa duração (> 5d) que foi significante a 1,0 mg/kg s.c. (em comparação com o placebo). Nenhum efeito na frequência cardíaca foi observado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou um fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido incorporada dentro de pelo menos uma região de CDR do referido anticorpo ou fragmento do mesmo, em que a referida pelo menos uma sequência heteróloga de aminoácido compreende uma sequência de ligante N-terminal (Ntls), um Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP) e uma sequência de ligante C-terminal (Ctls), em que opcionalmente pelo menos uma porção da referida pelo menos uma região de CDR é substituída pela referida sequência heteróloga de aminoácido incorporada na mesma, e em que a) pelo menos 12 resíduos de aminoácido estão presentes entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do referido BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do referido BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do referido BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do referido BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com

Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do referido BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do referido BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3; e em que b) pelo menos 9 resíduos de aminoácido estão presentes entre o último resíduo de aminoácido do referido BNP e i) resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3.

2. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido BNP é selecionado do grupo que consiste em BNP humano tendo a sequência de SEQ ID Nº 24 e um peptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com ela.

3. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a) a referida Ntls compreende i) uma sequência de ligante de GS; ii) uma sequência de ligante de PN; iii) uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 iv) a sequência de SEQ ID Nº 6 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela;

v) a sequência de SEQ ID Nº 7 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; vi) a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; vii) a sequência de SEQ ID Nº 11 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; viii) a sequência de SEQ ID Nº 13 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ix) a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; x) a sequência de SEQ ID Nº 21 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ou xi) quaisquer combinações das mesmas, e em que b) a referida Ctls compreende i) uma sequência de ligante de GS; ii) uma sequência de ligante de PN; iii) uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela,

mais particularmente a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5; iv) a sequência de SEQ ID Nº 6 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; v) a sequência de SEQ ID Nº 8 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; vi) a sequência de SEQ ID Nº 10 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; vii) a sequência de SEQ ID Nº 12 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; viii) a sequência de SEQ ID Nº 14 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ix) a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; x) a sequência de SEQ ID Nº 20 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; xi) a sequência de SEQ ID Nº 22 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ou xii) quaisquer combinações das mesmas.

4. Anticorpo ou fragmento do mesmo como definido na reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que i) cada uma da referida Ntls e da referida Ctls compreende uma sequência de ligante de GS; ii) cada uma da referida Ntls e da referida Ctls compreende uma sequência de ligante de PN; iii) cada uma da referida Ntls e da referida Ctls compreende uma sequência de aminoácido que é parte de uma estrutura de anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, particularmente uma sequência de aminoácido que é parte da estrutura de domínio de fab de um anticorpo de IgG humana ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com ela, mais particularmente a referida Ntls compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 2 ou 4 e a referida Ctls compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5 ou uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 1, 3 ou 5; iv) cada uma da referida Ntls e da referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 6 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; v) a referida Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 7 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60%

de identidade de sequência com ela e a referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 8 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; vi) a referida Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 10 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; vii) a referida Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 11 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 12 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; viii) a referida Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 13 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 14 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ix) cada uma da referida Ntls e da referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 15 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; x) a referida Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 9 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 20 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela; ou xi) a referida Ntls compreende a sequência de SEQ ID Nº 21 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela e a referida Ctls compreende a sequência de SEQ ID Nº 22 ou uma sequência que compartilha pelo menos 60% de identidade de sequência com ela.

5. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida Ntls também compreende um elemento de ancoragem A1 em sua extremidade C terminal e/ou em que a referida Ctls também compreende um elemento de ancoragem A2 em sua extremidade N terminal, em que A1 e/ou A2 predominantemente compreende os resíduos de glicina e serina, particularmente em que pelo menos 60% dos resíduos de aminoácido de A1 e/ou A2 são selecionados dos resíduos de glicina e serina.

6. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a extensão de aminoácido presente entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2;

iii) resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat e o primeiro resíduo de aminoácido do BNP no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3 compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 26 a 38 ou uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 26 a 38; e em que a extensão de aminoácido presente entre o último resíduo de aminoácido do referido BNP e i) resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com

Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3 compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 39 a 51 ou uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 39 a 51.

7. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizado pelo fato de que a referida Ntls e/ou a referida Ctls compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e até 30, 28, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou 10 resíduos de aminoácido no total.

8. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizado pelo fato de que a extensão de aminoácido presente entre i) resíduo de aminoácido HC res25 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido HC res35a de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH1; ii) resíduo de aminoácido HC res51 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido HC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH2; iii) resíduo de aminoácido HC res92 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido HC res106 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRH3; iv) resíduo de aminoácido de LC res26 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido de LC res 32 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL1; v) resíduo de aminoácido de LC res49 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido de LC res57 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL2; e/ou vi) resíduo de aminoácido de LC res88 de acordo com Kabat e resíduo de aminoácido de LC res98 de acordo com Kabat no caso de uma incorporação da referida sequência heteróloga de aminoácido dentro de CDRL3 compreende a sequência de qualquer uma das SEQ ID Nºs 52 a 64 ou uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID Nºs 52 a 64.

9. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um outro peptídeo natriurético, particularmente em que o referido BNP e o referido pelo menos um outro peptídeo natriurético são incorporados dentro de pelo menos duas regiões CDR separadas, mais particularmente em que o referido pelo menos um outro peptídeo natriurético é selecionado de ANP, BNP e CNP, mais particularmente de ANP e CNP.

10. Anticorpo ou fragmento do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo humano ou humanizado ou fragmento do mesmo, particularmente em que o referido anticorpo ou fragmento do mesmo é da classe IgG.

11. Anticorpo ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve compreende ou consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID Nº 66 e a cadeia pesada compreende ou consiste na sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID Nºs 442 a 444.

12. Fragmento de anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações, caracterizado pelo fato de que o referido fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em fragmentos de Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos de domínio simples (Dabs); anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (scFv); e fragmentos de anticorpo de Fv estabilizados por dissulfeto (dsFv).

13. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Ácido nucleico ou uma mistura de ácidos nucleicos caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

15. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico ou a mistura de ácidos nucleicos como definido na reivindicação 14.

16. Processo para a produção de anticorpo ou fragmento do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 15, sob condições adequadas para expressão do anticorpo ou fragmento do mesmo.

17. Anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para uso em um método para tratamento.

18. Anticorpo ou fragmento do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de doenças ou distúrbios cardiovasculares, renais, pulmonares, esqueletais, oculares, tromboembólicos ou fibróticos, nanismo, acondroplasia ou outros distúrbios responsivos ao peptídeo natriuréticos e/ou relacionados com cGMP.