TW201934573A - 轉鐵蛋白受體結合性多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明總體上係關於如下Fc多肽二聚體，其含有非天然轉鐵蛋白受體(TfR)結合位點，不實質上消耗活體內網狀紅血球，但保持結合於Fcγ受體(FcγR)。本發明亦係關於一種如下Fc多肽二聚體，其含有該等Fc多肽中之一者上之特異性結合TfR的非天然位點；對含有該TfR結合位點之該Fc多肽之當結合於TfR時減少FcγR結合的一個修飾或多個修飾，其中另一Fc多肽不含TfR結合位點，但保持FcγR結合。
Description
本發明係關於經修飾之Fc多肽二聚體，其結合轉鐵蛋白受體(TfR)，可誘導至少一種效應功能活性(例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC))，但不引起網狀紅血球之實質性消耗。
已提出TfR為受體介導之將治療劑胞吞轉送穿過血腦障壁(BBB)的靶標。雖然TfR在形成BBB之內皮細胞上表現，但TfR亦在其他細胞類型上表現，包括網狀紅血球。先前之工作已表明抗TfR抗體可自循環中消耗網狀紅血球。
因為網狀紅血球消耗係由效應功能活性介導的，故可藉由形成降低或消除效應功能之修飾來克服此毒性。然而，此方法阻礙想要或需要效應功能之治療劑的使用。
因此，將效應功能陽性治療劑遞送至腦部且不引起網狀紅血球消耗之手段將為有利的。
吾人已研發經修飾以結合於TfR之Fc多肽。此等Fc多肽能夠藉由通過在BBB處結合於TfR來進行受體介導之胞吞轉送而主動轉運至腦中。因為Fc多肽能夠通過結合於免疫細胞上之Fcγ受體(FcγR)誘導效應功能活性，包括ADCC，且因為TfR在網狀紅血球上表現，故此等多肽同時結合於網狀紅血球與
FcγR可導致網狀紅血球消耗。雖然可藉由將突變引入Fc多肽中來降低或消除效應功能，但在一些治療應用中此為不想要的。
本發明係基於經修飾之Fc多肽二聚體的研發，該等經修飾之Fc多肽二聚體結合TfR，穿過BBB，且保留效應功能活性但不引起實質性TfR依賴性毒性，包括網狀紅血球之消耗。此類二聚體可如本文所描述經工程改造。
在一個態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，或其二聚體片段，其：(a)包含特異性結合TfR之TfR結合位點；(b)能夠結合Fcγ受體(FcγR)；且(c)不實質上消耗活體內網狀紅血球。
在一個態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，或其二聚體片段，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含(i)TfR結合位點及(ii)一或多個胺基酸修飾，該一或多個胺基酸修飾例如當結合於TfR時減少FcγR結合(例如但當不結合於TfR時具有有限的或不具有FcγR結合減少)；以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在此態樣之一些實施例中，TfR結合位點包含經修飾之CH3結構域。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域衍生自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域。在特定實施例中，經修飾之CH3結構域包含在包含384、386、387、388、389、390、413、416及421之根據EU編號之胺基酸位置集合中的五個、六個、七個、八個或九個取代。在特定實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在包含414、424及426之位置的一個、兩個或三個取代。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽二聚體結合於TfR之頂端結構域。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽二聚體結合於TfR，而不抑制轉鐵蛋白
與TfR之結合。在特定實施例中，經修飾之Fc多肽二聚體結合於包含TfR之胺基酸208的抗原決定基。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含在位置388之Trp。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含在位置421之芳族胺基酸。在特定實施例中，在位置421之芳族胺基酸為Trp或Phe。
在此態樣之一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：位置384為Leu、Tyr、Met或Val；位置386為Leu、Thr、His或Pro；位置387為Val、Pro或酸性胺基酸；位置388為Trp；位置389為Val、Ser或Ala；位置413為Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；位置416為Thr或酸性胺基酸；及位置421為Trp、Tyr、His或Phe。
在此態樣之一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個位置：位置384為Leu、Tyr、Met或Val；位置386為Leu、Thr、His或Pro；位置387為Val、Pro或酸性胺基酸；位置388為Trp；位置389為Val、Ser或Ala；位置413為Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；位置416為Thr或酸性胺基酸；及位置421為Trp、Tyr、His或Phe。
在此態樣之一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含在位置384之Leu或Met；在位置386之Leu、His或Pro；在位置387之Val；在位置388之Trp；在位置389之Val或Ala；在位置413之Pro；在位置416之Thr；及/或在位置421之Trp。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置391之Ser、Thr、Gln或Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置392之Gln、Phe或His。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp及/或在位置392之Gln。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含選自以下之一個、兩個或三個位置：位置414為Lys、Arg、Gly或Pro；位置424為Ser、Thr、Glu或Lys；及位置426為Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含在位置384之Tyr、在位置386之Thr、在位置387之Glu或Val、在位置388之Trp、在位置389之Ser、在位置413之Ser或Thr、在位置416之Glu及/或在位置421之Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置415之Glu。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp及/或在位置415之Glu。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含在位置390之Asn。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含以下取代中之一或多者：在位置380之Trp；在位置386之Thr；在位置388之Trp；在位置389之Val；在位置413之Ser或Thr；在位置415之Glu；及/或在位置421之Phe。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：4-29及64-127中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在特定實施例中，經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸111-217具有至少85%一致性，前提條件為該一致性百分比不包括根據EU編號之位置384、386、387、388、389、390、413、416及421之集合。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含SEQ ID NO：4-29及125-127中之任一者的胺基酸154-160及/或183-191。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含選自以下之2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或11個位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含如下11個位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：4-29及64-127中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在特定實施例中，經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，在對應於根據EU編號方案之位置380、384、386、384、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426之位置中之至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者處的殘基未發生缺失或取代。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含SEQ ID NO：38-61及131-173中之任一者的序列。
在此態樣之一些實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含根據EU編號方案(i)在位置366之Trp或者(ii)在位置366之Ser、在位置368之Ala及在位置407之Val。
在此態樣之一些實施例中，對應未經修飾CH3結構域為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域。
在此態樣之一些實施例中，例如當結合於TfR時減少FcγR結合之胺基酸修飾包含根據EU編號方案在位置234及在位置235之Ala。在一些實施例中，例如當結合於TfR時減少FcγR結合之胺基酸修飾進一步包含根據EU編號方案在位置329之Gly。
在此態樣之一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含增加血清穩定性(例如血清半衰期)之胺基酸修飾。在一些實施例中，增加血清穩定性(例如血清半衰期)之胺基酸修飾包含根據EU編號方案在位置252之Tyr、在位置254之Thr及在位置256之Glu。在一些實施例中，增加血清穩定性(例如血清半衰期)之胺基酸修飾包含根據EU編號方案(i)在位置428之Leu及在位置434之Ser，或者(ii)在位置434之Ser或Ala。
在此態樣之一些實施例中，經修飾之Fc多肽二聚體進一步融合至Fab。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽進一步融合至Fab。
在一些實施例中，根據EU編號方案，第一Fc多肽包含杵突變T366W且第二Fc多肽包含臼突變T366S、L368A及Y407V。在一些實施例中，根據EU編號方案，第一Fc多肽包含臼突變T366S、L368A及Y407V且第二Fc多肽包含杵突變T366W。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：178、190、202、214、226、238、238、252、286、298及310中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：179、191、203、215、227、239、275、287、299及311中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：181、193、205、217、229、241、277、289、301及313中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：323、330、337、344、351、358、365、372、379及386中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：182、194、206、218、230、242、278、290、302及314中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：324、331、338、345、352、359、366、373、380及387中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：178、190、202、214、226、238、252、286、298及310中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：400之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：178、190、202、214、226、238、252、286、298及310中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：407之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：179、191、203、215、227、239、275、287、299及311中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：400之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：179、191、203、215、227、239、275、287、299及311中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：407之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：181、193、205、217、229、241、277、289、301及313中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：400之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：323、330、337、344、351、358、365、372、379
及386中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：407之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：182、194、206、218、230、242、278、290、302及314中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：400之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：324、331、338、345、352、359、366、373、380及387中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：407之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，
且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：184、196、208、220、232、244、280、292、304及316中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：185、197、209、221、233、245、281、293、305及317中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：187、199、211、223、235、247、283、295、307及319中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結
合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：326、333、340、347、354、361、368、375、382及389中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：188、200、212、224、236、248、284、296、308及320中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：327、334、341、348、355、362、369、376、383及390中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合
之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：184、196、208、220、232、244、280、292、304及316中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：394之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：184、196、208、220、232、244、280、292、304及316中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：404之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：185、197、209、221、233、245、281、293、305及317中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：394之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或
減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：185、197、209、221、233、245、281、293、305及317中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：404之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：187、199、211、223、235、247、283、295、307及319中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：394之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：326、333、340、347、354、361、368、375、382及389中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：404之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第
二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：188、200、212、224、236、248、284、296、308及320中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：394之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：327、334、341、348、355、362、369、376、383及390中之任一者的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含SEQ ID NO：404之序列。
在本文所描述之經修飾之Fc多肽二聚體的任何態樣中，經修飾之Fc多肽二聚體不實質上消耗網狀紅血球(例如循環網狀紅血球)。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後消耗的網狀紅血球之量。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後消耗的網狀紅血球之量的50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後剩餘的網狀紅血球之量大於在投與對照之後剩餘的網狀紅血球之量。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後剩餘的網狀紅血球之量比在投與對照之後剩餘的網狀紅血球之量大至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。
在本文所描述之經修飾之Fc多肽二聚體的任何態樣中，經修飾之Fc多肽二聚體不實質上消耗骨髓中之網狀紅血球。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後骨髓中消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後骨髓中消耗的網狀紅血球之量。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後骨髓中消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後骨髓中消耗的網狀紅血球之量的50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後骨髓中剩餘的網狀紅血球之量大於在投與對照之後骨髓中剩餘的網狀紅血球之量。在一些實施例中，在投與經修飾之Fc多肽二聚體之後骨髓中剩餘的網狀紅血球之量比在投與對照之後骨髓中剩餘的網狀紅血球之量大至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。
在一些實施例中，對照為具有完全效應功能且/或不含減少FcγR結合之突變的對應TfR結合性Fc二聚體(亦即，具有與上文所描述之經修飾之Fc多肽二聚體相同的引起TfR結合的突變)。
在另一態樣中，本發明提供一種Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其能夠主動轉運穿過BBB，該Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白包含：(a)抗體可變區，其能夠結合抗原，或其抗原結合片段；以及(b)經修飾之Fc多肽二聚體，其包含(i)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點及例如當結合於TfR時減少FcγR結合(例如但當不結合於TfR時具有有限的或不具有FcγR結合減少)的一或多個胺基酸修飾，以及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在此態樣之一些實施例中，例如當結合於TfR時減少FcγR結合之胺基酸修飾包含根據EU編號方案在位置234及在位置235之Ala。在特定實施例
中，例如當結合於TfR時減少FcγR結合之胺基酸修飾進一步包含根據EU編號方案在位置329之Gly。
在此態樣之一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含增加血清穩定性(例如血清半衰期)之胺基酸修飾。在一些實施例中，增加血清穩定性(例如血清半衰期)之胺基酸修飾包含根據EU編號方案在位置252之Tyr、在位置254之Thr及在位置256之Glu。在一些實施例中，增加血清穩定性(例如血清半衰期)之胺基酸修飾包含根據EU編號方案(i)在位置428之Leu及在位置434之Ser，或者(ii)在位置434之Ser或Ala。
在此態樣之一些實施例中，抗體可變區序列包含Fab結構域。在一些實施例中，抗體可變區序列包含兩條抗體可變區重鏈及兩條抗體可變區輕鏈或其各別片段。
在一些實施例中，Fc多肽或Fc多肽二聚體為岩藻糖缺陷型或非岩藻糖基化的(例如如本文所描述)。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之經修飾之Fc多肽二聚體及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種將組合物胞吞轉送穿過內皮之方法，該方法包括使內皮與包含本文所描述之經修飾之Fc多肽二聚體的組合物接觸。在一些實施例中，內皮為BBB。
在另一態樣中，本發明提供一種將組合物胞吞轉送穿過內皮之方法，該方法包括使內皮與包含本文所描述之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白的組合物接觸。在一些實施例中，內皮為BBB。
圖1A及1B為表明如下情況之圖：在人類TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠中融合至抗BACE1 Fab之TfR結合性Fc多肽二聚體不消耗血液(圖1A)或骨髓(圖1B)中之網狀紅血球，其中TfR結合性Fc多肽二聚體在二聚體之兩個Fc多肽上經修飾具有L234A及L235A(LALA)突變(參考EU編號方案編號)以減少FcγR結合。
圖2A-2D為表明如下情況之圖：在人類TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠中融合至抗BACE1 Fab之經修飾之Fc多肽二聚體(其中TfR結合性Fc多肽二聚體具有相對於TfR結合位點呈順式組態的LALA突變(「順-LALA」))不消耗血液(圖2A：在25mg/kg下；圖2C：在50mg/kg下)或骨髓(圖2B：在25mg/kg下；圖2D：在50mg/kg下)中的網狀紅血球，而融合至抗BACE1 Fab之經類似修飾之Fc多肽二聚體(其中Fc多肽二聚體具有相對於TfR結合位點反式的LALA突變)消耗血液與骨髓中的網狀紅血球。
圖3A及3B為表明如下情況之圖：融合至抗BACE1 Fab之順-LALA修飾之Fc多肽二聚體(圖3A：CH3C.35.21；圖3B：CH3C.35.23)以及融合至抗BACE1 Fab之在兩個Fc多肽上具有LALA突變的經修飾之Fc多肽不誘導TfR介導的ADCC，而具有TfR結合位點但不具有LALA突變之hIgG1在表現內源性TfR之拉莫斯細胞(Ramos cell)上誘導ADCC。
圖4為表明如下情況之圖：TfR結合性Fc多肽二聚體(CH3C.35.21)對TfR介導之補體依賴性細胞毒性(CDC)活性沒有影響，而抗TfR對照抗體Ab204在CHO-hTfR細胞中誘導CDC。
圖5為表明如下情況之圖：在原代人類小膠質細胞中融合至抗BACE1 Fab之順-LALA修飾之Fc多肽二聚體誘導類似於在野生型hIgG1情況下之TfR結合性多肽中所觀察到之的pSyk蛋白質含量，而融合至抗BACE1 Fab之在兩個Fc多肽上具有LALA突變的經修飾之Fc多肽二聚體不誘導pSyk。
圖6A及6B為表明如下情況之圖：具有順-LALA Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點之hIgG1引發類似於抗mCD20抗體以及具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1的ADCC(圖6A)。類似地，具有順-LALA Fc多肽二聚體及hCD20 Fab結合位點之hIgG1所引發的Fab介導之CDC達到的程度與抗hCD20以及具有TfR結合位點及hCD20 Fab結合位點之hIgG1相同(圖6B)。
圖7A及7B為表明如下情況之圖：具有順-LALA Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點之hIgG1引發類似於抗mCD20抗體以及具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1的穩健B細胞消耗(圖7A及7B)。此等結果證實順-LALA修飾之Fc多肽二聚體保留其Fc功能且具有Fab介導之活體內效應功能。
圖8A、8B及8C為表明如下情況之圖：用具有順-LALA Fc多肽二聚體情況下之TfR結合位點(CH3C.35.23.4)的抗Aβ處理之小鼠引起穩健的小膠質細胞朝向Aβ斑塊之募集(圖8A：小膠質細胞重疊情況下之斑塊面積%；圖8B：針對對照IgG校正之相同數據)且使尺寸為30-125μm2之的斑塊減少(圖8C)。此等結果表明具有順-LALA Fc多肽二聚體之抗Aβ保留了針對小膠質募集之穩健效應功能及類似於抗Aβ之減少一些Aβ斑塊之能力。
本申請案主張於2018年1月10日申請之美國臨時專利申請案第62/615,914號、於2018年2月15日申請之美國臨時專利申請案第62/631,281號、於2018年6月8日申請之美國臨時專利申請案第62/682,639號及於2018年8月22日申請之美國臨時專利申請案第62/721,275號之優先權，該等臨時專利申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
包括TfR結合位點之經修飾之Fc多肽二聚體能夠穿過BBB，並且將治療劑轉運穿過BBB。如本文所描述，此等Fc多肽二聚體若未經工程改造以降低效應功能，則亦可消耗活體內網狀紅血球，因為網狀紅血球亦表現TfR。網狀紅血球消耗可藉由在Fc多肽二聚體之Fc多肽中引入移除效應功能之修飾，亦即，移除或減少Fcγ受體(FcγR)結合之修飾(例如參考EU編號方案編號為L234A及L235A(LALA)取代)而避免。然而，在當分子之Fab部分結合於其靶標(例如治療劑目標蛋白質)時需要效應功能之情況下，此方法為不利的。
本發明提供保留效應功能但不引起實質性網狀紅血球消耗之經修飾之Fc多肽二聚體。此等經修飾之Fc多肽二聚體在本文中亦稱為「效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體」。在一些實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體之兩個Fc多肽中僅一者(而非兩個Fc多肽)經修飾以降低效應功能且結合TfR。經修飾之Fc多肽二聚體之另一Fc多肽不含TfR結合位點或降低效應功能之任何修飾，但其可含有增強效應功能之突變。兩個Fc多肽中僅一者含有TfR結合位點與當結合於TfR時減少FcγR結合之修飾而另一Fc多肽不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾的效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體稱為具有順式組態。如本文所描述，測試了此等具有順式組態之經修飾之Fc多肽二聚體對網狀紅血球之影響。此等實驗證實，藉由向形成經修飾之Fc多肽二聚體之兩個多肽中之僅一者中引入TfR結合位點與當結合於TfR時減少FcγR結合之突變兩者，可使TfR結合後之效應功能降低，從而引起TfR結合而無實質性網狀紅血球消耗。
如本文中詳細描述，使具有不同組態之經修飾之Fc多肽二聚體融合至針對治療劑靶標(例如CD20)之Fab，以確定當Fab結合其靶標而非TfR時是否可保留效應功能(例如ADCC及CDC)。如下文詳細描述，當Fc多肽二聚體融
合至Fab時，在經修飾之Fc多肽二聚體中(a)例如當結合於TfR時減少FcγR結合之修飾及(b)引起TfR結合之修飾的特定組態可產生Fc多肽二聚體-Fab融合物，其仍保留效應功能(例如ADCC或CDC)，但不消耗網狀紅血球。此方法允許在保留效應功能之同時使用TfR介導之轉運穿過BBB。
因此，本發明部分係關於經修飾之Fc多肽二聚體，其已經工程改造以結合TfR，當結合於TfR時具有降低之效應功能(例如ADCC或CDC)，但當Fc多肽二聚體融合至治療劑Fab且結合於Fab之目標抗原時仍保留效應功能(例如ADCC或CDC)。
如本文所用，除非內容另有清楚指示，否則單數形式「一個(種)(a/an)」及「該」包括複數指示物。因此，舉例而言，提及「一種多肽」可包括兩種或更多種此類分子及類似物。
如本文所用，術語「約」及「大約」，當用於修飾數值或範圍中指定之量時，表明該數值以及熟習此項技術者已知之與該值之合理偏差(例如±20%、±10%或±5%)在所敍述值之預期含義內。
如本文所用，術語「Fc多肽」係指天然存在之免疫球蛋白重鏈多肽之C端區，其以作為結構性結構域之Ig摺疊為特徵。Fc多肽含有至少包括CH2結構域及/或CH3結構域之恆定區序列且可含有至少部分之鉸鏈區。一般而言，Fc多肽不含可變區。
「經修飾之Fc多肽」係指與野生型免疫球蛋白重鏈Fc多肽序列相比具有至少一個突變，例如取代、缺失或插入，但保留天然Fc多肽之總體Ig摺疊或結構的Fc多肽。
如本文所用，術語「Fc多肽二聚體」係指兩個Fc多肽之二聚體。在一些實施例中，Fc多肽二聚體能夠結合Fc受體(例如FcγR)。在Fc多肽二聚體
中，兩個Fc多肽藉由兩個CH3抗體恆定域之間的相互作用發生二聚化。在一些實施例中，兩個Fc多肽亦可經由兩個二聚化Fc結構域單體之鉸鏈結構域之間形成的一或多個二硫鍵發生二聚化。Fc多肽二聚體可為野生型Fc多肽二聚體或經修飾之Fc多肽二聚體。野生型Fc多肽二聚體係藉由兩個野生型Fc多肽之二聚化而形成。Fc多肽二聚體可為異二聚體或均二聚體。
如本文所用，術語「經修飾之Fc多肽二聚體」係指含有至少一個經修飾之Fc多肽的Fc多肽二聚體。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽二聚體含有兩個經修飾之Fc多肽。經修飾之Fc多肽二聚體可為均二聚體(亦即，含有兩個相同的經修飾之Fc多肽)或異二聚體(亦即，含有兩個不同的Fc多肽，其中兩個Fc多肽中之至少一者為經修飾之Fc多肽)。
如本文所用之「轉鐵蛋白受體」或「TfR」係指轉鐵蛋白受體蛋白1。人類轉鐵蛋白受體1多肽序列闡述於SEQ ID NO：63中。其他物種之轉鐵蛋白受體蛋白1序列亦為已知的(例如黑猩猩，登錄號XP_003310238.1；恆河猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；及雞，NP_990587.1)。術語「轉鐵蛋白受體」亦涵蓋示例性參考序列(例如人類序列)之對偶變異體，其由在轉鐵蛋白受體蛋白1染色體基因座處之基因編碼。全長TfR蛋白包括短N端細胞內區、跨膜區及大細胞外結構域。細胞外結構域之特徵為三個結構域：蛋白酶樣結構域、螺旋狀結構域及頂端結構域。人類轉鐵蛋白受體1之頂端結構域序列闡述於SEQ ID NO：31中。
如本文所用，術語「Fcγ受體」或「FcγR」係指一種類型之Fc受體，其係基於其識別之抗體類型來歸類。FcγR包括若干成員：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)及FcγRIIIB(CD16b)，其抗體親和力歸因於不同分子結構而不同。FcγR結合於IgG類別之抗體的Fc部分且對於誘
導經調理微生物之噬菌作用為重要的。FcγR存在於免疫系統中之細胞的細胞表面。FcγR負責引發免疫系統效應功能且在抗體之Fc部分結合至受體後活化。FcγR介導免疫功能，例如結合於附著於感染細胞或入侵病原體之抗體，從而藉由抗體介導之噬菌作用或ADCC刺激吞噬細胞或細胞毒性細胞破壞微生物或感染之細胞。
如本文所用，術語「減少FcγR結合」係指經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體在經修飾之Fc多肽之CH3結構域中含有突變，其中該等突變使經修飾之Fc多肽對FcγR之親和力與不含減少FcγR結合之突變的Fc多肽(例如野生型Fc多肽二聚體)之親和力相比降低0.01%至90%(例如0.1%、0.5%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%)。FcγR結合可使用例如表面電漿子共振(SPR)法(例如BiacoreTM系統)來量測。或者，FcγR結合可使用功能分析來量測，例如ADCC分析，諸如本文所描述之ADCC分析(例如細胞殺傷作用之活體內或活體外分析)。當經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體結合於TfR時可量測FcγR結合之減少。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體可當結合於TfR時具有減少之FcγR結合，但當不結合於TfR時具有有限的減少(例如減少不到25%、20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%)或不減少。
如本文進一步描述，經修飾之Fc多肽二聚體可含有：第一Fc多肽，該第一Fc多肽具有TfR結合位點與當結合於TfR時減少FcγR結合之突變兩者；及第二Fc多肽，該第二Fc多肽既不具有TfR結合位點，亦不具有減少FcγR結合之突變。因此，在TfR參與後，具有第一及第二Fc多肽之所得不對稱Fc多肽二聚體可具有總體降低之FcγR親和力。相比之下，當不結合於TfR時FcγR結合可存在有限的減少(例如如上文所描述)或不減少。
術語「FcRn」係指新生兒Fc受體。Fc多肽結合於FcRn降低Fc多肽之清除率且增加血清半衰期。人類FcRn蛋白為由尺寸為約50kDa且類似於主要組織相容性(MHC)I類蛋白之蛋白質及尺寸為約15kDa之β2-微球蛋白組成之異二聚體。
如本文所用，「FcRn結合位點」係指Fc多肽中結合於FcRn之區域。在人類IgG中，如使用EU編號方案編號，FcRn結合位點包括L251、M252、I253、S254、R255、T256、M428、H433、N434、H435及Y436。此等位置對應於位置SEQ ID NO：1之21至26、198及203至206。
如本文所用，「天然FcRn結合位點」係指Fc多肽中結合於FcRn且具有與天然存在之Fc多肽中結合於FcRn之區域相同的胺基酸序列的區域。
如本文所用，術語「不實質上消耗活體內網狀紅血球」意謂由本文所描述之效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體或本文所描述之含有效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體的Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白引起的網狀紅血球減少(例如骨髓網狀紅血球或循環網狀紅血球減少)比由對照(例如具有完全效應功能且/或不含減少FcγR結合之突變的對應TfR結合性Fc二聚體或含有具有完全效應功能且/或不含減少FcγR結合之突變之對應TfR結合性Fc二聚體的抗體)引起的網狀紅血球減少(例如骨髓網狀紅血球或循環網狀紅血球減少)小(例如不到其80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%)。
術語「不實質上消耗活體內網狀紅血球」亦可意謂在給予本文所描述之效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體或本文所描述之含有效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體的Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白之後剩餘的網狀紅血球之量或百分比(例如骨髓中或循環中剩餘的網狀紅血球)比在給予對照(例如具有完全效應功能且/或不含減少FcγR結合之突變的對應TfR結合性Fc二聚
體，或含有具有完全效應功能且/或不含減少FcγR結合之突變之對應TfR結合性Fc二聚體的抗體)之後剩餘的網狀紅血球(例如骨髓中或循環中剩餘的網狀紅血球)之量或百分比多(例如多至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%)。
網狀紅血球消耗(例如骨髓中或循環中之網狀紅血球消耗)之量或百分比或剩餘之網狀紅血球(例如骨髓中或循環中剩餘之網狀紅血球)的量或百分比可在人類TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠(例如人類TfR頂端結構域敲入小鼠(「hTfR頂端敲入小鼠」))中量測，該等人類TfR敲入小鼠經工程改造以用人類頂端結構域/小鼠嵌合TfR蛋白置換小鼠TfR；或在非人類靈長類動物(諸如食蟹猴)中量測。如本文所描述，該量測可藉由給予經修飾之Fc二聚體或對照(例如25至50mg/kg，靜脈內)(例如向TfRms/hu KI小鼠)來進行，且循環網狀紅血球可在給藥後24h時使用Advia 120血液學系統藉由細胞化學反應來量測。如本文所描述，骨髓網狀紅血球可使用用於確定以下群體之FACS分選來量測：Ter119+、hCD71hi及FSC低群體。
如本文所用之術語「CH3結構域」及「CH2結構域」係指免疫球蛋白恆定區結構域多肽。在IgG抗體之情形中，CH3結構域多肽係指如根據EU編號方案編號之約位置341至約位置447之胺基酸區段，且CH2結構域多肽係指如根據EU編號方案編號之約位置231至約位置340之胺基酸區段。CH2及CH3結構域多肽亦可根據IMGT(ImMunoGeneTics)編號方案進行編號，其中根據IMGT科學圖表編號(IMGT網站)，CH2結構域編號為1-110且CH3結構域編號為1-107。CH2及CH3結構域為免疫球蛋白Fc區之一部分。在IgG抗體之情形中，Fc區係指如根據EU編號方案編號之約位置231至約位置447之胺基酸區段。如本文所用，術語「Fc區」亦可包括抗體鉸鏈區之至少一部分。說明性鉸鏈區序列闡述於SEQ ID NO：62中。
術語「可變區」係指抗體重鏈或輕鏈中之結構域，其衍生自生殖系可變(V)基因、多樣性(D)基因或連接(J)基因(且不衍生自恆定(Cμ及Cδ)基因區段)，且給予抗體結合於抗原之特異性。典型地，抗體可變區包含穿插有三個高變「互補決定區」之四個保守「構架」區。
關於CH3或CH2結構域之術語「野生型」、「天然」及「天然存在」在本文中用於指結構域具有自然界中存在之序列。
如本文所用，關於突變體多肽或突變體聚核苷酸之術語「突變體」與「變異體」可互換使用。關於給定野生型CH3或CH2結構域參考序列之變異體可包括天然存在之對偶變異體。「非天然」存在之CH3或CH2結構域係指在自然界中不存在於細胞中且藉由例如使用基因工程改造技術或誘變技術對天然CH3結構域或CH2結構域聚核苷酸或多肽進行基因修飾所產生之變異體或突變體結構域。「變異體」包括相對於野生型包含至少一個胺基酸突變之任何結構域。突變可包括取代、插入及缺失。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸，以及以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。
天然存在之胺基酸為彼等由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構(亦即結合於氫、羧基、胺基及R基團之α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。「胺基酸模擬物」係指結構不同於胺基酸之一般化學結構，但以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的化合物。
天然存在之α-胺基酸包括但不限於丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸之立體異構體包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
在本文中可藉由通常已知之三字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)建議之一字母符號提及胺基酸。
術語「多肽」及「肽」在本文中可互換地用於指單一鏈中之胺基酸殘基的聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸聚合物可包含完全L-胺基酸、完全D-胺基酸或L及D胺基酸之混合物。
如本文所用之術語「蛋白質」係指多肽或單鏈多肽之二聚體(亦即，兩者)或多聚體(亦即，三者或更多者)。蛋白質之單鏈多肽可藉由共價鍵(例如二硫鍵)或非共價相互作用而連接。
術語「保守取代」、「保守突變」或「經保守修飾之變異體」係指使得胺基酸經可歸類為具有類似特徵之另一胺基酸取代的改變。以此方式定義之保守胺基酸組類別之實例可包括：「帶電荷/極性組」，包括Glu(麩胺酸或
E)、Asp(天冬胺酸或D)、Asn(天冬醯胺或N)、Gln(麩醯胺或Q)、Lys(離胺酸或K)、Arg(精胺酸或R)及His(組胺酸或H)；「芳族組」，包括Phe(苯丙胺酸或F)、Tyr(酪胺酸或Y)、Trp(色胺酸或W)及(組胺酸或H)；及「脂族組」，包括Gly(甘胺酸或G)、Ala(丙胺酸或A)、Val(纈胺酸或V)、Leu(白胺酸或L)、Ile(異白胺酸或I)、Met(甲硫胺酸或M)、Ser(絲胺酸或S)、Thr(蘇胺酸或T)及Cys(半胱胺酸或C)。在各組內，亦可鑑定出亞組。舉例而言，帶電荷或極性胺基酸組可再劃分成包括以下之亞組：「帶正電荷之亞組」，包含Lys、Arg及His；「帶負電荷之亞組」，包含Glu及Asp；及「極性亞組」，包含Asn及Gln。在另一實例中，芳族或環狀組可再劃分成包括以下之亞組：「氮環亞組」，包含Pro、His及Trp；及「苯基亞組」，包含Phe及Tyr。在另一實例中，脂族組可再劃分成例如以下之亞組：「脂族非極性亞組」，包含Val、Leu、Gly及Ala；及「脂族略帶極性之亞組」，包含Met、Ser、Thr及Cys。保守突變類別之實例包括以上亞組內胺基酸之胺基酸取代，諸如但不限於：Lys取代Arg或反之亦然，使得正電荷可維持；Glu取代Asp或反之亦然，使得負電荷可維持；Ser取代Thr或反之亦然，使得游離-OH可維持；及Gln取代Asn或反之亦然，使得游離-NH2可維持。在一些實施例中，疏水性胺基酸取代例如活性位點中之天然存在之疏水性胺基酸以保留疏水性。
在兩個或更多個多肽序列之背景下，術語「一致」或「一致性」百分比係指如使用一種序列比較算法或藉由手動比對及視覺檢查所量測，當在比較窗或指定區域上比較及比對以獲得最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比之在指定區域上一致的胺基酸殘基，例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更大的一致性。
對於多肽之序列比較，典型地一個胺基酸序列充當參考序列，將候選序列與其比較。可使用熟習此項技術者可獲得之各種方法(例如視覺比對)或使用公共可獲得之軟體使用已知算法以達成最佳比對來進行比對。此類程式包括BLAST程式、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用於比對以達成最佳比對之參數可由熟習此項技術者確定。對於用於本申請案之目的的多肽序列之序列比較，使用用於比對兩個蛋白質序列之BLASTP算法標準蛋白質BLAST，且使用預設參數。
當在鑑定多肽序列中之給定胺基酸殘基的背景中使用術語「對應於」、「參考......確定」或「參考......編號」時，係指當將給定胺基酸序列與參考序列最佳比對及比較時指定參考序列之殘基位置。因此，舉例而言，當將多肽中之胺基酸殘基在與SEQ ID NO：1最佳比對時其與SEQ ID NO：1中之胺基酸對齊時，該殘基「對應於」SEQ ID NO：1之區域中之胺基酸。與參考序列比對之多肽不需要與參考序列長度相同。
如本文所用，當提及如本文所描述包含經修飾之CH3結構域之多肽時，術語「特異性結合」或「選擇性結合」於靶標(例如TfR或FcγR)係指使多肽與其結合於結構上不同靶標相比以更大親和力、更大親合力及/或更長持續時間結合於靶標的結合反應。在典型實施例中，當在相同親和力分析條件下分析時，多肽對特定靶標(例如TfR或FcγR)具有與不相關靶標相比至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大的親和力。如本文所用，術語「特異性結合特定靶標(例如TfR或FcγR)」、「特異性結合於特定靶標(例如TfR或FcγR)」或「對特定靶標(例如TfR或FcγR)具特異性」可為例如由對所結合之靶標的平衡解離常數KD為例如10-4M或更小(例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M)的分子展現。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽特異性結合於TfR上在物
種間保守(例如在物種間在結構上保守)(例如在非人類靈長類動物與人類物種之間保守(例如在非人類靈長類動物與人類物種之間在結構上保守))之抗原決定基。在一些實施例中，多肽可排他地結合於人類TfR。
如本文所用之術語「結合親和力」係指兩個分子(例如多肽上之單一結合位點與其所結合之靶標(例如TfR))之間的非共價相互作用之強度。因此，舉例而言，除非另外指出或由上下文來看為清楚的，否則該術語可指多肽與其靶標之間的1：1相互作用。結合親和力可藉由量測平衡解離常數(KD)來定量，平衡解離常數係指解離速率常數(kd，時間-1)除以締合速率常數(ka，時間-1M-1)。KD可藉由量測複合物形成及解離之動力學來測定，例如使用表面電漿子共振(SPR)法，例如BiacoreTM系統；動力學排除分析，諸如KinExA®；及BioLayer干涉術(例如使用ForteBio® Octet®平台)。如本文所用，「結合親和力」不僅包括形式結合親和力，諸如反映多肽與其靶標之間的1：1相互作用的彼等形式結合親和力，而且包括可反映親合結合之計算KD’要獲得之表觀親和力。
本部分描述結合於TfR且能夠轉運穿過血腦障壁(BBB)之經修飾之Fc多肽的產生。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有經修飾之人類Ig CH3結構域，諸如IgG CH3結構域。CH3結構域可屬於任何IgG亞型，亦即，來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗體之情形中，CH3結構域係指如根據EU編號方案編號之約位置341至約位置447之胺基酸區段。除非另外指明，否則CH3結構域中用於鑑定用於TfR結合之對應胺基酸位置集合之目的的位置係參考EU編號方案、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：1之胺基酸111-217來確定。取代亦參考
EU編號方案或SEQ ID NO：1來確定，亦即，將胺基酸視為相對於EU編號方案或SEQ ID NO：1中之對應胺基酸位置的取代。
如上文所指出，CH3結構域中可經修飾之殘基的集合在本文中係參考EU編號方案或SEQ ID NO：1來編號。任何CH3結構域(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域)均可在對應於EU編號方案或SEQ ID NO：1中所指出位置之殘基的一或多個殘基集合中具有修飾，例如胺基酸取代。IgG1、IgG2、IgG3及IgG4序列中之每一者中對應於EU編號方案或SEQ ID NO：1之任何給定位置的位置可容易地確定。
熟習此項技術者理解其他免疫球蛋白同型(例如IgM、IgA、IgE、IgD等)之CH3結構域可藉由鑑定彼等結構域中對應於本文所描述之胺基酸位置之胺基酸來進行類似修飾。亦可對其他物種(例如非人類靈長類動物、猴、小鼠、大鼠、兔、狗、豬、雞及類似物種)之免疫球蛋白之對應結構域進行修飾。
在一個實施例中，特異性結合TfR之經修飾之CH3結構域多肽在包含全長人類TfR序列(SEQ ID NO：63)之位置208的抗原決定基處結合於TfR之頂端結構域，該位置對應於SEQ ID NO：31中所闡述之人類TfR頂端結構域序列之位置11。SEQ ID NO：31對應於人類TfR-1統一蛋白質(uniprotein)序列P02786(SEQ ID NO：63)之胺基酸198-378。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽在包含全長人類TfR序列(SEQ ID NO：63)之位置158、188、199、207、208、209、210、211、212、213、214、215及/或294之抗原決定基處結合於TfR之頂端結構域。經修飾之CH3結構域多肽可結合於TfR，而不阻斷或以其他方式抑制轉鐵蛋白與受體之結合。在一些實施例中，轉鐵蛋白與TfR之結合不實質上受抑制。在一些實施例中，轉鐵蛋白與TfR之結合被抑制不到約50%(例如不到約45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%)。在一些實施例中，轉鐵蛋白與TfR之結合被抑制不到約20%(例如不到約19%、18%、17%、16%、
15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。展現此結合特異性之說明性CH3結構域多肽包括根據EU編號方案在位置380、384、386、387、388、389、390、413、415、416及421具有胺基酸取代之多肽。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含在包含根據EU編號方案之380、384、386、387、388、389、390、413、415、416及421之胺基酸位置的集合(集合CH3C)中之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或十一個取代。可在此等位置引入之說明性取代顯示於表3中。其他取代顯示於表4中。在一些實施例中，在位置388及/或421之胺基酸為芳族胺基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些實施例中，在位置388之胺基酸為Trp。在一些實施例中，在位置388之胺基酸為Gly。在一些實施例中，在位置421之芳族胺基酸為Trp或Phe。
在某些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含選自以下之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或十一個位置：在位置380之Glu、Leu、Ser、Val、Trp、Tyr或Gln；在位置384之Leu、Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val；在位置386之Leu、Thr、His、Pro、Asn、Val或Phe；在位置387之Val、Pro、Ile或酸性胺基酸；在位置388之Trp；在位置389之脂族胺基酸、Gly、Ser、Thr或Asn；在位置390之Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala、Asp、Glu、Asn、Arg或Thr；在位置413之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr、Pro、Ile或His；在位置415之Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在位置416之Thr、Arg、Asn或酸性胺基酸；及/或在位置421之芳族胺基酸、His或Lys。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之CH3結構域多肽包含如下至少一個具有取代之位置(根據EU編號方案)：在位置384之Leu、Tyr、Met或Val；在位置386之Leu、Thr、His或Pro；在位置387之Val、Pro或酸性胺基酸；在位置388之芳族胺基酸(例如Trp或Gly)(例如Trp)；在位置389之Val、Ser或Ala；在位置413之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置416之Thr或酸性胺基酸；或者在位置421之Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置處之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。因此，舉例而言，Ile可存在於位置384、386及/或位置413。在一些實施例中，在位置387、413及416中之一者、兩者或每一者之位置之酸性胺基酸為Glu。在其他實施例中，在位置387、413及416中之一者、兩者或每一者處之酸性胺基酸為Asp。在一些實施例中，位置384、386、387、388、389、413、416及421中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者或所有八者處具有如此段落中所指定之胺基酸取代。
在一些實施例中，具有集合CH3C中之修飾之CH3結構域多肽包含在位置390之天然Asn。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含在位置390之Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala或Asp。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽進一步在包含380、391、392及415之位置包含一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，Trp、Tyr、Leu或Gln可存在於位置380。在一些實施例中，Ser、Thr、Gln或Phe可存在於位置391。在一些實施例中，Gln、Phe或His可存在於位置392。在一些實施例中，Glu可存在於位置415。
在某些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個位置：在位置380之Trp、
Leu或Glu；在位置384之Tyr或Phe；在位置386之Thr；在位置387之Glu；在位置388之Trp；在位置389之Ser、Ala、Val或Asn；在位置390之Ser或Asn；在位置413之Thr或Ser；在位置415之Glu或Ser；在位置416之Glu；及/或在位置421之Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含如下所有十一個位置：在位置380之Trp、Leu或Glu；在位置384之Tyr或Phe；在位置386之Thr；在位置387之Glu；在位置388之Trp；在位置389之Ser、Ala、Val或Asn；在位置390之Ser或Asn；在位置413之Thr或Ser；在位置415之Glu或Ser；在位置416之Glu；及或在位置421之Phe。
在某些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含在位置384之Leu或Met；在位置386之Leu、His或Pro；在位置387之Val；在位置388之Trp；在位置389之Val或Ala；在位置413之Pro；在位置416之Thr；及/或在位置421之Trp。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽進一步包含在位置391之Ser、Thr、Gln或Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln及/或在位置392之Gln、Phe或His。在一些實施例中，Trp存在於位置380且/或Gln存在於位置392。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽不具有在位置380之Trp。
在其他實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含在位置384之Tyr；在位置386之Thr；在位置387之Glu或Val；在位置388之Trp；在位置389之Ser；在位置413之Ser或Thr；在位置416之Glu；及/或在位置421之Phe。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含在位置390之天然Asn。在某些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln；及/或在位置415之Glu。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽進一步包含在位置380之Trp及/或在位置415之Glu。
在其他實施例中，經修飾之CH3結構域進一步包含選自以下之一個、兩個或三個位置：位置414為Lys、Arg、Gly或Pro；位置424為Ser、Thr、Glu或Lys；及位置426為Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域包含以下取代中之一或多者：在位置380之Trp；在位置386之Thr；在位置388之Trp；在位置389之Val；在位置413之Ser或Thr；在位置415之Glu；及/或在位置421之Phe。
在一些實施例中，特異性結合TfR之經修飾之CH3結構域多肽與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸111-217具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，此類經修飾之CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸154-160及/或183-191。在一些實施例中，此類經修飾之CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸150-160及/或183-191。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸150-160及/或183-196。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸111-217具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，前提條件為該一致性百分比不包括SEQ ID NO：1之位置154、156、157、158、159、160、183、186及191(根據EU編號方案，位置384、386、387、388、389、390、413、416及421)的集合。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽包含如SEQ ID NO：4-29、64-127及
268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者中所闡述之胺基酸154-160及/或胺基酸183-191。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，前提條件為對應於SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的位置150、154、156、157、158、159、160、161、162、183、184、185、186、191、194及196(根據EU編號方案，位置380、384、386、384、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426)之位置中的至少五者、六者、七者、八者、九者、十者、十一者、十二者、十三者、十四者、十五者或十六者未發生缺失或取代。
在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性且亦包含如下位置中之至少五者、六者、七者、八者、九者、十者、十一者、十二者、十三者、十四者、十五者或十六者：在位置380之Trp、Tyr、Leu、Gln或Glu；在位置384之Leu、Tyr、Met或Val；在位置386之Leu、Thr、His或Pro；在位置387之Val、Pro或酸性胺基酸；在位置388之芳族胺基酸(例如Trp)；在位置389之Val、Ser或Ala；在位置390之Ser或Asn；在位置391之Ser、Thr、Gln或Phe；在位置392之Gln、Phe或His；在位置413之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置414之Lys、Arg、Gly或Pro；在位置415之Glu或Ser；在位置416之Thr或酸性胺基酸；在位置421之Trp、
Tyr、His或Phe；在位置424之Ser、Thr、Glu或Lys；及在位置426之Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：38-52中之任一者的胺基酸序列。在其他實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：38-52中之任一者的胺基酸序列，但其中一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：38-52中之任一者的胺基酸序列，但其中三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：53-61中之任一者的胺基酸序列。在其他實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：53-61中之任一者的胺基酸序列，但其中一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：53-61中之任一者的胺基酸序列，但其中三個或四個胺基酸經取代。
在一些實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：131-167中之任一者的胺基酸序列。在其他實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：131-167中之任一者的胺基酸序列，但其中一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：131-167中之任一者的胺基酸序列，但其中三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：58、60及168-173中之任一者的胺基酸序列。在其他實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：58、60及168-173中之任一者的胺基酸序列，但其中一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：58、60及168-173中之任一者的胺基酸序列，但其中三個或四個胺基酸經取代。
在其他實施例中，TfR結合性多肽包含SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸157-194、胺基酸153-194或胺基酸153-199。在其他實施例中，多肽包
含與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸157-194，或與胺基酸153-194，或與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的胺基酸153-199具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者。在其他實施例中，多肽可與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
本文所描述之可轉運穿過BBB之多肽另外可包含FcRn結合位點。在一些實施例中，FcRn結合位點在經修飾之Fc多肽或其片段內。
在一些實施例中，FcRn結合位點包含天然FcRn結合位點。在一些實施例中，FcRn結合位點相對於天然FcRn結合位點之胺基酸序列不包含胺基酸變化。在一些實施例中，天然FcRn結合位點為IgG結合位點，例如人類IgG結合位點。在一些實施例中，FcRn結合位點包含改變FcRn結合之修飾。
在一些實施例中，FcRn結合位點具有發生突變(例如取代)之一或多個胺基酸殘基，其中該或該等突變增加血清半衰期或不實質上減少血清半衰期(亦即，當在相同條件下分析時與在突變位置具有野生型殘基之對應蛋白質相比使血清半衰期縮減不超過25%)。在一些實施例中，FcRn結合位點在位置21至26、198及203至206具有發生取代之一或多個胺基酸殘基，其中該等位置係參考SEQ ID NO：1確定。
在一些實施例中，FcRn結合位點相對於天然人類IgG序列包含一或多個突變，該一或多個突變延長經修飾之多肽的血清半衰期。在一些實施例中，在如參考SEQ ID NO：1確定之位置14-27、49-54、77-87、153-160及198-205(該等位置對應於使用EU編號之位置244-257、279-284、307-317、383-390及428-435)中之一或多者處引入突變(例如取代)。在一些實施例中，在如參考SEQ ID NO：1確定之位置21、22、24、25、26、77、78、79、81、82、84、155、156、157、159、198、203、204或206(該等位置對應於使用EU編號之位置251、252、254、255、256、307、308、309、311、312、314、385、386、387、389、428、433、434或436)處引入一或多個突變。在一些實施例中，將突變引入如參考SEQ ID NO：1確定之位置22、24及25(其對應於使用EU編號之位置252、254及256)中之一者、兩者或三者中。在一些實施例中，突變為如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E。在一些實施例中，本文所描述之經修飾之Fc多肽進一步包含突變M22Y、S24T及T26E。在一些實施例中，將突變引入如參考SEQ ID NO：1確定之位置198及204(其對應於使用EU編號之位置428及434)中之一者或兩者中。在一些實施例中，突變為如參考SEQ ID NO：1編號之M198L及N204S。在一些實施例中，本文所描述之經修飾之Fc多肽進一步包含突變N204S加上或不加上M198L。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在根據EU編號之位置T307、E380及N434(其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之T77、E150及N204)中之一者、兩者或所有三者處之取代。在一些實施例中，突變為T307Q及N434A(SEQ ID NO：1，T77Q及N204A)。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含突變T307A、E380A及N434A(SEQ ID NO：1，T77A、E150A及N204A)。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置T250及M428(其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之T20及M198)之取代。在一些實施例中，Fc多肽包含突變T250Q及/或M428L(SEQ ID NO：1，T20Q及M198L)。在一些實施例中，經修飾
之Fc多肽包含在位置M428及N434(其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之M198及N204)之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含取代M428L及N434S(其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之M198L及N204S)。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含N434S或N434A取代(其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之N204S或N204A)。
如本文所提供之經修飾以結合TfR且起始轉運穿過BBB之Fc多肽亦可包含其他突變以降低效應功能。如本文所描述，藉由將TfR結合位點與減少FcγR結合之突變兩者引入Fc多肽二聚體之同一Fc多肽中，可使TfR結合後之效應功能降低，從而引起TfR結合而無實質性網狀紅血球消耗，但當Fc多肽二聚體融合至治療劑Fab且結合於Fab之目標抗原時仍保留效應功能(例如ADCC或CDC)。
在一些實施例中，包含經修飾之CH3結構域之Fc多肽具有效應功能，亦即，在結合於在介導效應功能之效應細胞上所表現之Fc受體後誘導某些生物功能的能力。效應細胞包括但不限於單核細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突細胞、嗜伊紅白血球、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、郎格罕氏細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK)細胞及細胞毒性T細胞。
效應功能之實例包括但不限於C1q結合及CDC、Fc受體結合、ADCC、抗體依賴性細胞介導之噬菌作用(ADCP)、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。效應功能可隨抗體類別而變化。舉例而言，天然人類IgG1及IgG3抗體可在結合於免疫系統細胞上存在之適當Fc受體後引發ADCC及CDC活性；且天然人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4可在結合於免疫細胞上存在之適當Fc受體後引發ADCP功能。
TfR結合位點之Fc多肽可包括降低效應功能(亦即，使TfR結合後之效應功能降低)之其他修飾。Fc多肽二聚體在TfR結合後具有降低之效應功能為想要的，因為其使得因網狀紅血球在細胞表面上亦具有TfR而引起之網狀紅血球消耗降低。如本文中詳細描述，具有順式組態之Fc多肽二聚體(亦即，在Fc多肽二聚體之同一Fc多肽上具有TfR結合位點與降低效應功能之突變兩者的Fc多肽二聚體)展現TfR結合而無實質性網狀紅血球消耗，但當Fc多肽二聚體融合至治療劑Fab且結合於Fab之目標抗原時仍保留效應功能(例如ADCC或CDC)。當Fc多肽二聚體融合至結合於Fab之目標抗原的治療劑Fab時具有效應功能為例如癌症治療劑(例如腦癌治療劑)中想要的。
調節效應功能之說明性Fc多肽突變包括但不限於CH2結構域中例如在對應於SEQ ID NO：1之位置4及5(根據EU編號方案之位置234及235)的位置之取代。在一些實施例中，經修飾之CH2結構域中之取代包含在SEQ ID NO：1之位置4及5之Ala。在一些實施例中，經修飾之CH2結構域中之取代包含在SEQ ID NO：1之位置4及5之Ala以及在位置99之Gly。
調節效應功能之其他Fc多肽突變包括但不限於在位置238、265、269、270、297、327及329(EU編號方案，其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之位置8、35、39、40、67、97及99)之一或多個取代。說明性取代(如用EU編號方案編號)包括以下情況：位置329可具有如下突變，其中脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或足夠大以破壞在Fc之脯胺酸329與FcγRIII之色胺酸殘基Trp 87及Trp 110之間形成的Fc/Fcγ受體界面的胺基酸殘基取代。其他說明性取代包括S228P、E233P、L235E、N297A、N297D及P331S。亦可存在多重取代，例如人類IgG1 Fc區之L234A及L235A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及P329G；人類IgG4 Fc區之S228P及L235E；人類IgG1 Fc區之L234A及G237A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及G237A；人類IgG2 Fc區之V234A及G237A；
人類IgG4 Fc區之L235A、G237A及E318A；以及人類IgG4 Fc區之S228P及L236E。在一些實施例中，Fc多肽可具有調節ADCC之一或多個胺基酸取代，例如根據EU編號方案在Fc區之位置298、333及/或334之取代。
在一些實施例中，如本文所描述之多肽可具有增加或減小ADCC之一或多個胺基酸取代或可具有改變C1q結合及/或CDC之突變。
在特定實施例中，具有TfR結合位點之Fc多肽可經修飾以降低效應功能，亦即，減少FcγR結合。在一些實施例中，具有TfR結合位點之Fc多肽可包括突變L234A及L235A(EU編號方案，其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之位置4及5)。在其他實施例中，具有TfR結合位點之Fc多肽可包括突變L234A、L235A及P329G(EU編號方案，其對應於如參考SEQ ID NO：1編號之位置4、5及99)。
在某些態樣中，本發明提供效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體，其經修飾以結合於TfR且當結合於TfR時具有減少之FcγR結合，但當不結合於TfR時具有有限的或不具有FcγR結合減少。此等經修飾之Fc多肽二聚體可融合至治療劑Fab以將其轉運穿過BBB。此等經修飾之Fc多肽二聚體經證實在TfR結合後具有降低之效應功能。當經修飾之Fc多肽二聚體融合至Fab時，當Fab結合於其靶標(例如癌細胞上之靶標)時Fc多肽二聚體保留效應功能。以此方式，本文所描述之效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體能夠將Fab轉運穿過BBB而無實質性網狀紅血球(其亦在細胞表面上含有TfR)消耗，且藉由展現可在Fab結合於其靶標時靶向細胞外聚集物(例如斑塊)或腦中之某些患病細胞(例如癌細胞)進行破壞的效應功能亦服務於其治療目的。
本文所描述之效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體具有順式組態，此意謂在Fc多肽二聚體中僅一個(並非兩個)Fc多肽經修飾以具有TfR結合
位點及當結合於TfR時減少FcγR結合之修飾。Fc多肽二聚體中之另一Fc多肽不含TfR結合位點或實質上減少FcγR結合之修飾。經修飾之Fc多肽二聚體之反式組態係指Fc多肽二聚體中兩個Fc多肽中之一者含有TfR結合位點，而另一Fc多肽含有例如當結合於TfR時減少FcγR結合之修飾。如本文所證實，具有順式組態而非反式組態之經修飾之Fc多肽二聚體能夠降低血液及骨髓中之網狀紅血球消耗(參見例如圖2A-2D)。
在一個實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點以及根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在一個實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多
肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據
EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及
Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據
EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；杵突變T366W；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W以及胺基酸修飾M252Y、S254T及T256E，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
在另一實施例中，效應功能陽性之TfR結合性Fc多肽二聚體包含：(a)第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含特異性結合TfR之TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A、L235A及P329G；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，該第二Fc多肽包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
用於分析Fc多肽二聚體與FcγR之間的結合親和力、結合動力學及交叉反應性之方法為此項技術中已知的。此等方法包括但不限於固相結合分析(例如ELISA分析)、免疫沈澱、表面電漿子共振(例如BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、動力學排除分析(例如KinExA®)、流式細胞術、螢光激活細胞分選(FACS)、BioLayer干涉術(例如Octet®(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))及西
方墨點分析(Western blot analysis)。在一些實施例中，使用ELISA來測定結合親和力及/或交叉反應性。用於進行ELISA分析之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，使用表面電漿子共振(SPR)來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用動力學排除分析來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用BioLayer干涉術分析來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。
ADCC為一種類型之免疫反應，其中抗體結合於病原或致瘤目標細胞表面之抗原且藉由效應細胞(例如外周血單核細胞，例如自然殺手(NK)細胞、T細胞及B細胞)對其進行鑑定以便進行破壞。帶有FcγR之效應細胞識別且結合與目標細胞結合之抗體的Fc區。抗體因此賦予目標細胞殺傷之特異性。當經典補體路徑之起始組分C1q結合於與靶標結合之抗體的Fc區時起始CDC。ADCC及CDC活性可在細胞殺傷作用之標準活體內或活體外分析中測定。用於測定ADCC及CDC活性之方法為此項技術中可獲得的。在一些實施例中，該等方法可涉及用放射性物質(諸如51Cr)或螢光染料(諸如鈣黃綠素-AM)標記目標細胞。可將經標記之細胞與抗體及效應細胞一起孵育，且由ADCC或CDC產生之對目標細胞之殺傷作用可藉由放射性或螢光之釋放來偵測。
用於量測ADCC及CDC活性之其他分析包括例如乳酸脫氫酶(LDH)釋放分析。當以任何方式損害或損壞細胞膜時，細胞質中可溶而又穩定之酶LDH釋放至周圍的細胞間隙中。培養基中此酶之存在可用作細胞死亡標記物。接著可藉由使用比色或螢光LDH細胞毒性分析量測所釋放之LDH的量來定量培養基內活細胞及死細胞之相對量。
如本文所提供之經修飾以結合TfR且起始轉運穿過BBB之Fc多肽亦可包含其他突變，例如以增加血清穩定性或血清半衰期，調節效應功能，影響糖基化，降低人類中之免疫原性及/或提供Fc多肽之杵及臼異二聚化。
在一些實施例中，本文所描述之經修飾之Fc多肽與對應野生型Fc多肽(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之胺基酸序列一致性。
本文所描述之經修飾之Fc多肽亦可具有在指定胺基酸集合外部引入之其他突變，例如以影響糖基化，增加血清半衰期，或者對於CH3結構域，提供包含經修飾之CH3結構域之多肽的杵及臼異二聚化。通常，該方法涉及在第一多肽之界面處引入突起(「杵」)且在第二多肽之界面中引入對應空腔(「臼」)，使得突起可安置於空腔中以便促進異二聚體形成且因此阻止均二聚體形成。藉由將第一多肽界面之小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來構築突起。藉由將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換在第二多肽之界面中形成尺寸與突起一致或類似之補償性空腔。此類其他突變係位於多肽中不對經修飾之CH3結構域與TfR之結合有負面影響的位置。
在杵及臼二聚化方法之一個說明性實施例中，要二聚化之第一Fc多肽次單元中對應於SEQ ID NO：1之位置136的位置具有色胺酸替代天然蘇胺酸，且二聚體之第二Fc多肽次單元在對應於SEQ ID NO：1之位置177的位置具有纈胺酸替代天然酪胺酸。Fc多肽之第二次單元可進一步包含取代，其中在對應於SEQ ID NO：1之位置136的位置之天然蘇胺酸經絲胺酸取代，且在對應於SEQ ID NO：1之位置138的位置之天然白胺酸經丙胺酸取代。
如本文所描述之經修飾之Fc多肽亦可經工程改造以含有用於異二聚化之其他修飾，例如對CH3-CH3界面內天然帶電荷之接觸殘基之靜電工程改造或疏水補丁修飾(hydrophobic patch modifications)。
在一些實施例中，可引入用於增強血清半衰期之修飾。舉例而言，在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽包含含有以下各項的CH2結構域：在對應於SEQ ID NO：1之位置22的位置之Tyr、在對應於SEQ ID NO：1之24的位置之Thr及在對應於SEQ ID NO：1之位置26的位置之Glu。或者，如本文所描述之經修飾之Fc多肽可包含如參考SEQ ID NO：1編號之M198L及N204S取代。或者，如本文所描述之經修飾之Fc多肽可包含如參考SEQ ID NO：1編號之N204S或N204A取代。
如本文所描述經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可包含其他突變，包括杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))及/或增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E，或者(ii)如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)，且與SEQ
ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有杵突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有杵突變及調節效應功能之突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E，或者(ii)如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ
ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E，或者(ii)如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有臼突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有臼突變及調節效應功能之突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E，或者(ii)如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之Fc多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一者)可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E，或者(ii)如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者的序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-29、64-127及268-274(例如SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270)中之任一者之序列的經修飾之Fc多肽可經修飾以具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：177之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：177之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：178或179之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：178或179之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：180之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：180之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：322之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：322之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：181或182之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：181或182之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：323或324之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致
性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：323或324之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：183之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：183之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：184或185之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：184或185之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：186之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：186之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：325之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：325之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：187或188之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：187或188之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：326或327之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：326或327之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：189之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：189之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：190或191之序列
具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：190或191之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：192之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：192之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：329之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：329之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：193或194之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：193或194之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之
L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：330或331之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：330或331之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：195之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：195之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：196或197之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：196或197之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：198之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：198之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID
NO：332之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：332之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：199或200之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：199或200之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：333或334之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：333或334之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：201之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：201之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：202或203之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：202或203之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：204之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：204之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：336之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：336之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：205或206之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一
些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：205或206之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：337或338之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：337或338之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：207之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：207之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：208或209之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：208或209之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：210之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施
例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：210之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：339之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：339之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：211或212之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：211或212之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：340或341之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：340或341之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：213之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：213之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：214或215之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：214或215之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：216之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：216之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：343之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：343之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：217或218之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：217或218之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：344或345之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：344或345之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：219之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：219之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：220或221之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：220或221之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：222之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：222之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：346之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：346之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：223或224之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：223或224之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上
M198L)，且與SEQ ID NO：347或348之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：347或348之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：225之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：225之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：226或227之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：226或227之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：228之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：228之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：350之序列
具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：350之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：229或230之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：229或230之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：351或352之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：351或352之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：231之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：231之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參
考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：232或233之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：232或233之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：234之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：234之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：353之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：353之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：235或236之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：235或236之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：354或355之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：354或355之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：237之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：237之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：238或239之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：238或239之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：240之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突
變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：240之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：357之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：357之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：241或242之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：241或242之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：358或359之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：358或359之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：243之序列具有至少
85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：243之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：244或245之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：244或245之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：246之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：246之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：360之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：360之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且
與SEQ ID NO：247或248之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：247或248之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：361或362之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：361或362之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：250之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：250之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：252或275之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：252或275之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ
ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：276之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：276之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：364之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：364之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：277或278之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：277或278之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：365或366之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：365或366之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：279.之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：279之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：280或281之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：280或281之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：282之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：282之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：367之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：367之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ
ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：283或284之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：283或284之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：368或369之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：368或369之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：285之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：285之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：286或287之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：286或287之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：288之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：288之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：371之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：371之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：289或290之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：289或290之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：372或373之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%
一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：372或373之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：291之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：291之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：292或293之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：292或293之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：294之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：294之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：374之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：374之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：295或296之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：295或296之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：375或376之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：375或376之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：297之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：297之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：298或299之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：298或299之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：300之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：300之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：378之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：378之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：301或302之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致
性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：301或302之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：379或380之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：379或380之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：303之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：303之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：304或305之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：304或305之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：306之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一
些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：306之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：381之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：381之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：307或308之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：307或308之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：382或383之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：382或383之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)且與SEQ ID NO：309之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變之純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：309之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：310或311之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：310或311之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：312之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：312之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：385之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：385之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：313或314之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：313或314之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有杵突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136W)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：386或387之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：386或387之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)且與SEQ ID NO：315之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變之純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：315之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))，且與SEQ ID NO：316或317之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致
性。在一些實施例中，具有臼突變及調節效應功能之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：316或317之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：318之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：318之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：388之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：388之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之M22Y、S24T及T26E)，且與SEQ ID NO：319或320之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：319或320之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可具有臼突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之T136S、L138A及Y177V)、調節效應功能之突變(例如如參
考SEQ ID NO：1編號之L4A、L5A及/或P99G(例如L4A及L5A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如如參考SEQ ID NO：1編號之N204S加上或不加上M198L)，且與SEQ ID NO：389或390之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：389或390之序列。
在一些實施例中，如本文所描述之經修飾之TfR結合性多肽為蛋白質二聚體之次單元。在一些實施例中，二聚體為異二聚體。在一些實施例中，二聚體為均二聚體。在一些實施例中，二聚體包含結合於TfR受體之單一Fc多肽，亦即，對於TfR受體結合為單價的。在一些實施例中，二聚體包含結合於TfR受體之第二多肽。第二多肽可包含相同的經修飾之Fc多肽以提供二價均二聚體蛋白質，或第二本文所描述之經修飾之Fc多肽可提供第二TfR受體結合位點。
本文所描述之TfR結合性多肽及包含多肽之二聚或多聚蛋白質可例如基於多肽之形式具有廣泛範圍之結合親和力。舉例而言，在一些實施例中，包含如本文所描述之經修飾之Fc多肽的多肽對TfR之親和力為1pM至10μM範圍內之任一值。在一些實施例中，親和力可以單價形式量測。在其他實施例中，親和力可以二價形式量測，例如以包含經修飾之Fc多肽之蛋白質二聚體的形式量測。
用於分析結合親和力、結合動力學及交叉反應性以分析與TfR之結合的方法為此項技術中已知的。此等方法包括但不限於固相結合分析(例如ELISA分析)、免疫沈澱、表面電漿子共振(例如BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、動力學排除分析(例如KinExA®)、流式細胞術、螢光激活細胞
分選(FACS)、BioLayer干涉術(例如Octet®(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))及西方墨點分析。在一些實施例中，使用ELISA來測定結合親和力及/或交叉反應性。進行ELISA分析之方法為此項技術中已知的且亦描述於以下實例部分中。在一些實施例中，使用表面電漿子共振(SPR)來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用動力學排除分析來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用BioLayer干涉術分析來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。TfR結合性多肽之FcRn結合亦可使用此等類型之分析來評估。FcRn結合係典型地在酸性條件下分析，例如在約5至約6之pH值下分析。
在一些實施例中，結合TfR且起始轉運穿過BBB之經修飾之多肽包含如本文所描述的經修飾之Fc多肽且進一步包含部分或全部鉸鏈區。鉸鏈區可來自任何免疫球蛋白亞類或同型。說明性免疫球蛋白鉸鏈為IgG鉸鏈區，諸如IgG1鉸鏈區，例如人類IgG1鉸鏈胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：62)。在其他實施例中，可包含鉸鏈或部分鉸鏈區之多肽進一步融合至另一部分，例如免疫球蛋白可變區，由此產生TfR結合性多肽-可變區融合多肽。可變區可結合於任何相關抗原，例如治療性神經靶標，或診斷性神經靶標。
在一些實施例中，TfR結合性多肽(例如經修飾之Fc多肽)經由連接子融合至可變區。如前一段落中所指出，TfR結合性多肽(例如經修飾之Fc多肽)可藉由鉸鏈區融合至可變區。在一些實施例中，TfR結合性多肽(例如經修飾之Fc多肽)可藉由肽連接子融合至可變區。肽連接子可經組態使得其允許可變區及TfR結合性多肽相對於彼此轉動；及/或對由蛋白酶消化具抗性。在一些實施例中，連接子可為可撓性連接子，例如含有諸如以下之胺基酸：Gly、Asn、Ser、
Thr、Ala及類似胺基酸。此類連接子係使用已知參數設計。舉例而言，連接子可具有重複，諸如Gly-Ser重複。
可變區可呈任何抗體形式，例如Fab或scFv形式。在一些實施例中，抗體可變區序列包含兩條抗體可變區重鏈及兩條抗體可變區輕鏈或其各別片段。
TfR結合性多肽(例如經修飾之Fc多肽)亦可融合至不為靶向相關抗原之免疫球蛋白可變區的多肽。在一些實施例中，此類多肽使用肽連接子(例如如上文所描述之可撓性連接子)融合至TfR結合性多肽。
在一些實施例中，TfR結合性多肽可融合至需要靶向表現TfR結合性多肽之細胞的多肽，例如治療性多肽。在一些實施例中，TfR結合性多肽融合至用於轉運穿過BBB之生物活性多肽，例如可溶性蛋白質，例如受體之細胞外結構域或生長因子、細胞因子或酶。
在其他實施例中，TfR結合性多肽可融合至適用於蛋白質純化之肽或蛋白質，例如聚組胺酸、抗原決定基標籤(例如FLAG、c-Myc、血球凝集素標籤及類似物)、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G或麥芽糖結合蛋白(MBP)。在一些情況下，與TfR結合性多肽融合之肽或蛋白質可包含蛋白酶裂解位點，諸如因子Xa或凝血酶之裂解位點。在某些實施例中，鍵聯可由存在於中樞神經系統中之酶裂解。
非多肽藥劑亦可連接至TfR結合性多肽。此類藥劑包括細胞毒性劑、顯像劑、DNA或RNA分子或化合物。在一些實施例中，藥劑可為治療劑或顯像化合物。在一些實施例中，藥劑為小分子，例如小於1000Da、小於750Da或小於500Da。
多肽或非多肽藥劑可連接至TfR結合性多肽之N端或C端區，或連接至多肽之任何區域，只要藥劑不妨礙TfR結合性多肽與TfR之結合即可。
在各個實施例中，可使用熟知化學交聯試劑及方案來產生結合物。舉例而言，存在大量熟習此項技術者已知且適用於交聯多肽與相關藥劑之化學交聯劑。舉例而言，交聯劑為異雙官能交聯劑，其可用於逐步鍵聯分子。異雙官能交聯劑提供設計用於結合蛋白質之更具特異性之偶合方法的能力，由此減少不希望之副反應(諸如同源蛋白質聚合物)的發生。
相關藥劑可為治療劑，包括細胞毒性劑及類似物，或化學部分。在一些實施例中，藥劑可為肽或小分子治療劑或顯像劑。
對於一些應用，需要將修飾引入本文所描述之經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體中，從而增加效應功能(例如ADCC)。一種用於增加效應功能之方法涉及製備非岩藻糖基化或岩藻糖缺陷型經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體。
一種用於產生岩藻糖缺陷型經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體的方法為使用岩藻糖類似物，諸如2-氟代岩藻糖(2-FF)。岩藻糖類似物可消耗或降低GDP-岩藻糖之可獲得性，GDP-岩藻糖為岩藻糖基轉移酶將岩藻糖併入蛋白質中所需之受質。
大規模生產常用之產生岩藻糖缺陷型經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體的替代方法為使用α-1,6岩藻糖基轉移酶(FUT8)敲出細胞株來表現經修飾之Fc多肽或經修飾之Fc多肽二聚體。適合之FUT8敲出細胞株之非限制性實例為可購自Lonza Biologics之中國倉鼠卵巢(CHO)FUT8敲出細胞株。此外，如Mori等人(Biotechnol.Bioeng.(2004)88：901-908；以全文引用之方式併入本文中)中所描述，FUT8小干擾RNA(siRNA)可用於轉化CHO細胞株(例如藉由FUT8 siRNA之組成性表現)來製備岩藻糖缺陷型蛋白質。
如本文所描述之經修飾之TfR結合性多肽係典型地使用重組方法來製備。因此，分離之核酸，其所包含之核酸序列編碼包含如本文所描述之經修飾之Fc多肽的多肽中之任一者，及將該等核酸引入其中之宿主細胞，其用於複製編碼多肽之核酸及/或表現多肽。在一些實施例中，宿主細胞為真核的，例如人類細胞。
在另一態樣中，提供包含編碼本文所描述之多肽的核苷酸序列之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股或雙股的。在一些實施例中，聚核苷酸為DNA。在特定實施例中，聚核苷酸為cDNA。在一些實施例中，聚核苷酸為RNA。
在一些實施例中，聚核苷酸包括於核酸構築體內。在一些實施例中，構築體為可複製載體。在一些實施例中，載體係選自質粒、病毒載體、噬菌粒、酵母染色體載體及非附加型哺乳動物載體。
在一些實施例中，聚核苷酸可操作地連接至表現構築體中之一或多個調控核苷酸序列。在一系列實施例中，核酸表現構築體適合於用作表面表現文庫。在一些實施例中，該文庫適合於在酵母中之表面表現。在一些實施例中，該文庫適合於在噬菌體中之表面表現。在另一系列實施例中，核酸表現構築體適合於使多肽在容許以毫克或公克量分離多肽之系統中表現。在一些實施例中，系統為哺乳動物細胞表現系統。在一些實施例中，系統為酵母細胞表現系統。
用於製備重組多肽之表現媒劑包括質粒及其他載體。舉例而言，適合之載體包括以下類型之質粒：pBR322衍生之質粒、pEMBL衍生之質粒、pEX衍生之質粒、pBTac衍生之質粒及pUC衍生之質粒，其係用於在諸如大腸桿菌(E.coli)之原核細胞中表現。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及pHyg衍生之載體為適合於轉染真核細胞之哺乳動物表現載體的實例。或者，諸如牛乳頭
瘤病毒(BPV-1)或愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生型及p205)之病毒衍生物可用於多肽在真核細胞中之瞬時表現。在一些實施例中，可能需要藉由使用桿狀病毒表現系統來表現重組多肽。此類桿狀病毒表現系統之實例包括pVL衍生之載體(諸如pVL1392、pVL1393及pVL941)、pAcUW衍生之載體(諸如pAcUW1)及pBlueBac衍生之載體。其他表現系統包括腺病毒、腺相關病毒及其他病毒表現系統。
載體可轉型至任何適合之宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞(例如細菌或酵母細胞)可適合於用作表面表現文庫。在一些細胞中，使載體在宿主細胞中表現以表現相對大量之多肽。此類宿主細胞包括哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及原核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、NS0細胞、Y0細胞、HEK293細胞、COS細胞、維洛細胞(Vero cell)或海拉細胞(HeLa cell)。
可將用編碼TfR結合性多肽之表現載體轉染的宿主細胞在適當條件下培養以允許發生多肽之表現。多肽可為分泌的及自細胞混合物及含有多肽之培養基分離的。或者，多肽可保留在細胞質中或膜級分中且收穫細胞，溶解，且使用所需方法分離多肽。
包括以下實例以展示本發明之特定實施例。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術代表在本發明之實踐中良好起作用之技術，且因此可被視為構成用於其實踐之特定模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解，可在不背離本發明之精神及範疇的情況下在所揭示之特定實施例中作出許多改變且仍獲得同樣或類似之結果。
在CH3區中之特定位置使用組合文庫對結合於TfR之Fc多肽進行工程改造，且選擇此等文庫中結合於人類TfR者。初始TfR結合序列之親和力成熟使得鑑定出特定TfR結合性Fc多肽，例如具有SEQ ID NO：66之序列的Fc多肽。藉由使以下三個多肽以分別1：1：2之比率共表現來構築含有異二聚Fc多肽二聚體之Fc多肽二聚體-Fab融合物。所得四聚Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白稱為BACE1-3C.35.21。
(1)含有Fab區、鉸鏈區及經修飾之Fc多肽(以此順序串聯地彼此融合)之重鏈。Fab區含有BACE1結合抗體之重鏈可變區。鉸鏈區具有SEQ ID NO：62之序列。Fc多肽具有SEQ ID NO：250之序列且含有「杵」突變(根據EU編號方案為T366W)及TfR結合性突變。
(2)含有Fab區、鉸鏈區及經修飾之Fc多肽(以此順序串聯地彼此融合)之重鏈。Fab區含有BACE1結合抗體之重鏈可變區。鉸鏈區具有SEQ ID NO：62之序列。Fc多肽具有SEQ ID NO：251之序列且含有「臼」突變(根據EU編號方案為T366S、L368A及Y407V)。
(3)含有BACE1結合抗體之輕鏈可變區的輕鏈。
將編碼用於表現以上三個多肽之基因的DNA選殖至表現載體中且以分別1：1：2之比率轉染至ExpiCHO細胞(Thermo Fisher Scientific)中。在5-7天之後，收穫細胞，且將所得多肽使用熟習此項技術者熟悉之方法依次藉由蛋白質A及HIC純化。藉由質譜法分析所得多肽以證實在純化之後不存在具有均二聚Fc多肽二聚體之融合蛋白(亦即，兩個Fc多肽均具有「杵」突變之Fc多肽二聚體，或兩個Fc多肽均具有「臼」突變之Fc多肽二聚體)。類似地產生其他四聚體多肽。
產生敲入/敲出小鼠之方法已公佈於文獻中且為熟習此項技術者熟知的。概括地說，使用CRISPR/Cas9技術產生TfRms/hu KI小鼠以表現鼠Tfrc基因內之人類Tfrc頂端結構域；使所得嵌合TfR在內源性啟動子之控制下在活體內表現。如以全文引用之方式併入本文中之國際專利申請案第PCT/US2018/018302號中所描述，使用C57Bl6小鼠經由原核微量注射至單細胞胚胎中，隨後胚胎移植至假妊娠雌性中來產生人類頂端TfR小鼠品系之敲入。特定而言，將Cas9、具有SEQ ID NO：264及265之序列的單一嚮導RNA及具有SEQ ID NO：267之序列的供體DNA引入胚胎中。供體DNA包含人類頂端結構域編碼序列(SEQ ID NO：266，其已針對在小鼠中表現經密碼子優化)。頂端結構域編碼序列側接左側同源臂(SEQ ID NO：267之核苷酸1-817)及右側同源臂(SEQ ID NO：267之核苷酸1523-2329)。以使得頂端結構域插入第四小鼠外顯子之後，且在3'端緊密側接第九小鼠外顯子之方式來設計供體序列。可使來自接受胚胎之雌性的子代的首建雄性(founder male)與野生型雌性繁殖以產生F1雜合子小鼠。隨後由培育F1代雜合子小鼠產生純合子小鼠。
當向小鼠投與時結合於TfR之抗體已顯示消耗循環網狀紅血球與骨髓網狀紅血球兩者(參見例如Couch等人，Sci Transl Med,5：183ra57,1-12,2013)。產生了類似於實例1中描述之BACE1-3C.35.21的Fc多肽二聚體-Fab融合物。該Fc多肽二聚體-Fab融合物稱為「BACE1-3C.35.212XLALA」，其含有以下各項：(1)含有具有BACE1結合性抗體之重鏈可變區之Fab區、鉸鏈區及經修飾之Fc多肽的重鏈，該經修飾之Fc多肽具有「杵」突變(根據EU編號方案為T366W)、降低效應功能之突變(根據EU編號方案為L234A及L235A)及TfR結合性突變(抗BACE1 Fab區融合至鉸鏈區(SEQ ID NO：62)及SEQ ID NO：252(具有杵及LALA
突變之純系CH3C.35.21))；(2)含有具有BACE1結合性抗體之重鏈可變區之Fab區、鉸鏈區及經修飾之Fc多肽的重鏈，該經修飾之Fc多肽具有「臼」突變(根據EU編號方案之T366S、L368A及Y407V)及降低效應功能之突變(根據EU編號方案之L234A及L235A)(抗BACE1 Fab區融合至鉸鏈區(SEQ ID NO：62)及SEQ ID NO：253(具有臼突變及LALA突變之人類Fc序列))；以及(3)兩條輕鏈，其各自包含BACE1結合性抗體之輕鏈可變區。
產生純合子人類TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠以在活體內評估Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白。簡單來說，對此等小鼠進行工程改造以用人類頂端結構域/小鼠嵌合TfR蛋白置換小鼠TfR(參見實例2)。以25mg/kg給予此等小鼠BACE1-Fc二聚體2XLALAPG(融合至在兩個Fc多肽中具有LALA突變及P329G突變(根據EU編號方案)之Fc二聚體的抗BACE1 Fab)或BACE1-3C.35.212XLALA。在給藥後24小時時分別藉由CBC及FACS分析評估循環及骨髓網狀紅血球。將骨髓網狀紅血球鑑定為Ter119+、hCD71hi及FSC低群體。與先前之研究一致，稱為「BACE1-3C.35.212XLALA」之Fc多肽二聚體-Fab融合物不誘導活體內網狀紅血球消耗(圖1A及1B)，此類似於非TfR結合性Fc多肽二聚體。
TfR在網狀紅血球上高度表現，網狀紅血球為存在於骨髓與循環中之不成熟紅血球。先前已證實具有完全效應功能之TfR抗體可快速消耗血液與骨髓中之網狀紅血球。因此，對於基於TfR之抗體治療劑，網狀紅血球之消耗負主要安全責任。然而，完全移除基於TfR之抗體中之效應功能並非妥善解決方案，因為在一些情況下，在經工程改造之TfR結合性Fc區融合至治療劑Fab之情況下將需要在Fab結合後觸發效應功能，而在TfR結合後不觸發效應功能。因為諸如根據EU編號方案之L234A及L235A(LALA)之Fc突變使FcγR結合於Fc多肽二聚體減少，故在Fc多肽二聚體之兩個Fc多肽上含有此類突變之融合
至Fab的經工程改造之TfR結合性Fc多肽二聚體在TfR結合或Fab結合於靶標之情況下不能引發任何效應功能。
需要當Fab結合於其靶標時可引發效應功能，但當TfR結合位點結合於TfR時不引發效應功能之融合至治療劑Fab的經工程改造之TfR結合性Fc多肽二聚體。為此目的，研發了兩個Fc多肽中之一者含有(而另一者不含)當結合於TfR時減少FcγR結合之突變的Fc多肽二聚體。如以下表1及2中所描述產生了融合至結合於BACE1、人類CD20(hCD20)或小鼠CD20(mCD20)之抗原結合Fab區的在一個Fc多肽中含有LALA突變、在兩個Fc多肽中含有LALA突變或兩個Fc多肽中均不含LALA突變之一系列TfR結合性Fc多肽二聚體。表1描述兩條重鏈中之每一者之Fc區中的突變。在表1中所描述之所有變異體中，重鏈1在Fc區中含有TfR結合位點及杵突變T366W(根據EU編號方案)，且重鏈2在Fc區中含有臼突變T366S、L368A及Y407V(根據EU編號方案)。變異體zz-3C.35.21在Fc區中不含任何其他突變；變異體zz-3C.35.212xLALA在重鏈1與2之兩個Fc區中均含有LALA突變；變異體zz-3C.35.21順LALA在一個Fc區中含有LALA突變，該Fc區與亦含有TfR結合位點之Fc區相同(順LALA或順式組態)；變異體zz-3C.35.21反LALA在一個Fc區中含有LALA突變，該Fc區不含TfR結合位點(反LALA或反式組態)。同樣之情況適用於變異體zz-3C.35.23、變異體zz-3C.35.232xLALA、變異體zz-3C.35.23順LALA及變異體zz-3C.35.23反LALA。
表2列舉了各Fc多肽二聚體-Fab融合物之各重鏈及輕鏈的SEQ ID NO。舉例而言，BACE1-3C.35.212xLALA含有表1中描述之變異體zz-3C.35.212xLALA及靶向BACE1之Fab區。
為確定是具有順式組態還是具有反式組態之Fc多肽二聚體可減輕網狀紅血球消耗，吾人用此等Fc多肽二聚體以及野生型人類IgG(hIgG)對應物對
純合子人類TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠進行處理，且分析了此等動物中來自外周血與骨髓之網狀紅血球。使用Advia 120血液學系統自外周血定量循環網狀紅血球。簡單來說，將細胞用ADVIA autoRETIC試劑染色且基於RNA含量及差異光吸收對網狀紅血球進行鑑定。對於骨髓網狀紅血球，自各動物之股骨收穫骨髓細胞，用Fc阻斷劑(抗小鼠CD16/CD32)阻斷，用抗mTer119及抗hCD71染色，且藉由螢光激活細胞分選(FACS)進行分析。使用FlowJo分析軟體將網狀紅血球門控為mTer119+、hCD71hi及FSC低群體。在分析後，具有順式組態(亦即，僅一個Fc多肽含有TfR結合位點與LALA突變兩者，而另一Fc多肽既不含TfR結合位點亦不含LALA突變)之Fc多肽二聚體緩和血液與骨髓中之網狀紅血球損失，血液與骨髓中之網狀紅血球損失以其他方式可見於野生型hIgG對照及具有反式組態(亦即，一個Fc多肽含有TfR結合位點，而另一Fc多肽含有LALA突變)之Fc多肽二聚體中。顯著地，具有順式組態之Fc多肽二聚體在25mg/kg下不具有主要安全責任，主要安全責任一般見於具有效應功能之TfR結合性多肽中(圖2A及2B)。此外，使用具有較低TfR親和力之TfR結合性多肽用在50mg/kg下之較高劑量對系統施加壓力。雖然順式組態部分減輕血液網狀紅血球損失，但更反應臨床安全性之骨髓網狀紅血球損失未受影響(圖2C及2D)。另一方面，具有反式組態之Fc多肽二聚體以與野生型IgG對照類似之量值消耗血液及骨髓網狀紅血球。此等結果證實具有順式組態之Fc多肽二聚體能夠緩和活體內網狀紅血球損失。
經確定由具有順式組態之Fc多肽二聚體引起之沒有活體內網狀紅血球損失係歸因於其不能引發TfR介導之ADCC。使用表現高含量之人類TfR之拉莫斯細胞作為活體外ADCC分析中之目標細胞。將目標細胞以10,000個細胞/孔進行塗鋪且用以下各項調理30分鐘：(1)具有TfR結合位點之hIgG1，(2)具
有TfR結合位點且在兩個Fc多肽中具有LALA突變之hIgG1，以及(3)具有含有順式組態之Fc多肽二聚體的hIgG1。自人類外周血分離效應自然殺手(NK)細胞，在IL-21(20ng/mL)存在下孵育隔夜，且以25：1之效應細胞：目標細胞比率與目標細胞一起(250,000個細胞/孔)孵育4h。藉由LDH表現評估細胞毒性，針對不具有任何多肽之對照進行校正，且計算為在目標細胞中之最大溶解百分比。因為效應免疫細胞(在此情況下為自然殺手細胞)表現FcγR，故野生型IgG1之Fc部分將結合於FcγR且觸發ADCC反應。實際上，具有TfR結合位點之hIgG1引發穩健ADCC反應，而在兩個Fc多肽中具有LALA突變之hIgG1與具有含有順式組態之Fc多肽二聚體的hIgG1兩者均不引發穩健ADCC反應。此數據與活體內網狀紅血球數據一致：具有順式組態之Fc多肽二聚體及在兩個Fc多肽上(以兩種不同TfR親和力：圖3A：CH3C.35.21；圖3B：CH3C.35.23)具有TfR結合位點及LALA突變的Fc多肽二聚體阻止TfR介導之ADCC且因此緩和網狀紅血球消耗。
由結合於TfR之抗體引起之活體內網狀紅血球損失亦可來源於TfR介導之CDC。有趣的是，結合於TfR之Fc多肽二聚體不能引發CDC，此可能歸因於其不能在空間上形成多肽六聚物以觸發補體反應。將經工程改造以過表現TfR之CHO細胞(CHO-hTfR)以200,000個細胞/孔塗鋪於不含血清之培養基中。將細胞用以下各項調理30分鐘：(1)對照hIgG，(2)Ab204(抗TfR陽性對照抗體)，以及(3)具有TfR結合位點之hIgG1。將50μL之稀幼兔血清添加至各孔中且將細胞孵育4h。藉由LDH表現評估細胞毒性，針對不具有任何多肽之對照進行校正，且計算為在目標細胞中之最大溶解百分比。實際上，雖然抗TfR Ab204能夠在CHO-hTfR細胞中誘導CDC，但在Fc區具有TfR結合位點之hIgG1對CDC沒有影響(圖4)。
使用原代人類小膠質細胞，證實了經修飾之Fc多肽二聚體如藉由FcγR誘導之磷酸化脾臟酪胺酸激酶(pSYK)活性所確定具有功能性Fc。效應免疫細胞上之FcγR一般結合於抗體之Fc區以觸發許多對先天免疫重要的反應。彼等反應中之一者包括Syk酪胺酸激酶信號傳導路徑，其在免疫細胞活化中發揮重要作用，諸如噬菌作用、細胞因子釋放及ADCC(DeFranco等人，J.of Exp Med.,1997,186(7)：1027-39)。當免疫細胞之FcγR結合於免疫複合物時，基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)使Syk激酶能夠被募集且由Src家族激酶磷酸化，此引起下游信號傳導路徑，從而觸發免疫細胞活化(Hirose等人，J of Biol Chem,2004,279：32308-15)。因此，使用pSyk作為FcγR誘導之免疫細胞活化之讀出。收穫來自衍生自人類胎兒組織之混合神經膠質細胞培養物的小膠質細胞且用於評估在結合於TfR結合性多肽後人類小膠質細胞中之pSyk活性。接著將小神經膠質細胞添加至TfR結合性多肽塗佈之96孔板上，在37℃下孵育10min，溶解，且使用pSyk夾心免疫分析定量pSyk之含量。儘管順-LALA突變不引發TfR介導之ADCC，但其類似於野生型IgG肽能夠在人類小膠質細胞中引發pSyk反應(相較於LALA突變對照增加約3倍，圖5)。此結果證實，具有順式組態之經修飾之Fc多肽二聚體保留其Fc功能且可具有效應功能。
除pSYK活性誘導之外，亦評估了具有順式組態之TfR結合性多肽引發Fab介導之ADCC及CDC的能力。使用表現小鼠CD20之目標細胞(A20細胞株)來評估Fab介導之ADCC。類似於實例8中描述之TfR介導之ADCC，將目標細胞以10,000個細胞/孔進行塗鋪，調理，以25：1之效應細胞：目標細胞
比率與NK細胞一起孵育，且藉由LDH表現評估細胞毒性。將目標細胞用以下各項進行調理：(1)對照hIgG，(2)抗mCD20抗體，(3)具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-mCD20(WT))，以及(4)具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點的hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-mCD20(順-LALA))。該分析經設計僅用於評估Fab結合，因為目標細胞不表現人類TfR。與pSYK活性誘導一致，具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點的hIgG1引發類似於抗mCD20抗體以及具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1的ADCC(圖6A)。
除ADCC之外，亦評估CDC。拉吉細胞(Raji cell)先前已顯示在抗hCD20介導之CDC中為敏感的；因此，使用其作為目標細胞來評估具有TfR結合位點及hCD20 Fab結合位點之hIgG1。將拉吉細胞以200,000個細胞/孔塗鋪於不含血清之培養基中且用以下各項調理30分鐘：(1)對照hIgG，(2)抗hCD20抗體，(3)具有TfR結合位點及hCD20 Fab結合位點之hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-hCD20(WT))，以及(4)具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及hCD20 Fab結合位點的hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-hCD20(順-LALA))。將50μL之稀幼兔血清添加至各孔中且將細胞孵育4h。藉由LDH表現評估細胞毒性，針對不具有任何多肽之對照進行校正，且計算為在目標細胞中之最大溶解百分比。類似於Fab介導之ADCC，具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及hCD20 Fab結合位點的hIgG1引發之CDC所達到的程度與抗hCD20以及具有TfR結合位點及hCD20 Fab結合位點之hIgG1相同(圖6B)。總的來說，此等功能性活體外細胞毒性分析證實具有含有順式組態之Fc多肽二聚體的hIgG1不妨礙其引發Fab介導之效應功能的能力。
如活體內安全分析中所證實，具有含有順式組態之Fc多肽二聚體的hIgG1緩和結合於TfR後之網狀紅血球損失。吾人接著測試了此組態是否會引發Fab介導之活體內效應功能，Fab介導之活體內效應功能對誘導治療反應來說必不可少。先前已證實針對mCD20之抗體嚴重消耗活體內外周及脾B細胞且因此已用於評估Fab介導之效應功能。在WT小鼠中評估了具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點的hIgG1消耗血液及脾B細胞的能力，且與在抗mCD20抗體以及具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1中所觀測到的反應相比較。用以下各項以25mg/kg對WT小鼠進行處理：(1)對照IgG，(2)抗mCD20抗體，(3)具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-mCD20(WT))，(4)具有TfR結合位點且在兩個Fc多肽中具有LALA突變且具有mCD20 Fab結合位點之hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-mCD20(LALA))，以及(5)具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點的hIgG1(CH3C.35.21 hIgG1：α-mCD20(順-LALA))。分別在第1天及第5天評估成熟外周B細胞及脾B細胞。簡單來說，收穫外周血及脾臟。將來自外周血及脾細胞之細胞用ACK溶解緩衝液處理，與Fc阻斷劑一起孵育，且用抗B220及抗IgM染色。在FACS分析後將成熟B細胞鑑定為B220高IgM高群體。與Fab介導之活體外ADCC及CDC分析一致，具有含有順式組態之Fc多肽二聚體及mCD20 Fab結合位點的hIgG1引發類似於抗mCD20抗體以及具有TfR結合位點及mCD20 Fab結合位點之hIgG1的穩健B細胞消耗(圖7A及7B)。此等結果證實具有順式組態之經修飾之Fc多肽二聚體保留其Fc功能且具有Fab介導之活體內效應功能。
此實例描述了為賦予TfR結合且轉運穿過BBB而對Fc多肽之修飾。
除非另外指出，否則本部分中胺基酸殘基之位置係基於對人類IgG1野生型Fc區之EU索引編號來編號。
如下文所描述產生含有Fc區之酵母文庫，該等Fc區具有引入包括胺基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416及421之位置中的修飾。結合於TfR之說明性純系顯示於表3及4中。
在再兩輪分選之後，對單一純系進行測序且鑑定出四個獨特序列。此等序列具有在位置388之保守Trp，且全部具有在位置421之芳族殘基(亦即，Trp、Tyr或His)。在其他位置存在極大之多樣性。
使選自該文庫之四個純系以在CHO或293細胞中表現為Fc與Fab片段之融合物，且藉由蛋白質A及尺寸排阻層析純化，且接著在存在或不存在全鐵Tf(holo-Tf)之情況下藉由ELISA針對與人類TfR結合進行篩檢。該等純系全部結合於人類TfR且結合不因添加過量(5μM)全鐵Tf而受影響。亦針對與內源性表現人類TfR之293F細胞之結合對純系進行測試。純系結合於293F細胞，不過總體結合實質上弱於高親和力陽性對照。
接著，使用純系CH3C.3作為測試純系來測試純系是否可內化於TfR表現細胞中。使附著之HEK 293細胞在96孔板中生長至約80%匯合，移除培養基，且以1μM之濃度添加樣品：純系CH3C.3、抗TfR基準陽性對照抗體(Ab204)、抗BACE1基準陰性對照抗體(Ab107)及人類IgG同型對照(獲自Jackson Immunoresearch)。將細胞在37℃及8% CO2濃度下孵育30分鐘，接著洗滌，用0.1% TritonTM X-100透性化，且用抗人類-IgG-Alexa Fluor® 488二級抗體染色。在再洗滌之後，使細胞在高通量螢光顯微鏡(亦即，Opera PhenixTM系統)下成像，且
定量每一細胞之斑點數目。在1μM下，純系CH3C.3顯示與陽性抗TfR對照類似之內化傾向，而陰性對照未顯示內化。
使用軟隨機化法(soft randomization approach)產生其他文庫以改良初始命中物(hit)對人類TfR之親和力，其中基於原始四個命中物中之每一者產生DNA寡核苷酸以引入軟誘變(soft mutagenesis)。鑑定結合TfR之其他純系且加以選擇。所選純系屬於兩個一般序列組。組1純系(亦即，純系CH3C.18、CH3C.21、CH3C.25及CH3C.34)具有在位置384之半保守Leu、在位置386之Leu或His、分別在位置387及389之保守及半保守Val以及分別在位置413、416及421之半保守P-T-W基元。組2純系具有在位置384之保守Tyr、在位置386-390之基元TXWSX以及分別在位置413、416及421之保守基元S/T-E-F。將純系CH3C.18及CH3C.35用於其他研究中作為各序列組之代表性成員。
為確定經工程改造之Fc區是否結合於TfR之頂端結構域，使TfR頂端結構域在噬菌體之表面表現。為適當摺疊且展示頂端結構域，必須將環中之一者截短且需要將序列環形排列。將純系CH3C.18及CH3C.35塗佈於ELISA板上且進行噬菌體ELISA方案。簡單來說，在洗滌且用1% PBSA阻斷之後，添加噬菌體展示物之稀釋液且在室溫下孵育1小時。隨後將板洗滌且添加抗M13-HRP，且在再洗滌之後用TMB受質使板顯色且用2N H2SO4中止反應。在此分析中純系CH3C.18與CH3C.35兩者均結合於頂端結構域。
為理解Fc結構域中哪些殘基對TfR結合而言最重要，形成一系列突變體純系CH3C.18及純系CH3C.35 Fc區，其中各突變體在TfR結合登記者中有單一位置突變回野生型。使所得變異體重組表現為Fab-Fc融合物且針對與人類
或犬TfR結合進行測試。對於純系CH3C.35，位置388及421對結合而言為重要的；此等位置中之任一者恢復為野生型均完全消除與人類TfR的結合。
如上文所描述，在存在塗佈於板上之人類或犬TfR之情況下用經純化之Fab-Fc融合變異體進行結合ELISA。來自純系CH3C.18成熟文庫之變異體純系CH3C.3.2-1、純系CH3C.3.2-5及純系CH3C.3.2-19以大致相等之EC50值結合人類及犬TfR，而親本純系CH3C.18及CH3C.35相較於犬TfR與人類TfR具有大於10倍之更佳結合。
接著，測試經修飾之Fc多肽是否內化於人類及猴細胞中。使用上文所描述之方案，測試在人類HEK 293細胞及恆河猴LLC-MK2細胞中之內化。與純系CH3C.35相比，類似地結合人類及犬TfR之變異體純系CH3C.3.2-5及CH3C.3.2-19在LLC-MK2細胞中具有顯著改良之內化。
對其他親和力成熟純系CH3C.18及CH3C.35之其他工程改造涉及向通過直接相互作用、第二殼相互作用(second-shell interaction)或結構穩定化增強結合之位置添加其他突變。此係經由產生「NNK行走(NNK walk)」或「NNK補丁(NNK patch)」文庫及由其選擇來達成。NNK行走文庫涉及形成靠近互補位之殘基的逐個NNK突變。藉由查看Fc結合於FcγRI之結構(PDB ID：4W4O)，將靠近原始修飾位置之44個殘基鑑定為詢問候選殘基。特定而言，靶向以下殘基進行NNK誘變：K248、R255、Q342、R344、E345、Q347、T359、K360、N361、Q362、S364、K370、E380、E382、S383、G385、Y391、K392、T393、D399、S400、D401、S403、K409、L410、T411、V412、K414、S415、Q418、Q419、G420、V422、F423、S424、S426、Q438、S440、S442、L443、S444、P4458、
G446及K447。使用孔克爾誘變(Kunkel mutagenesis)產生44單點NNK文庫，且將產物彙集且如上文關於其他酵母文庫所描述經由電穿孔引入酵母。
此等迷你文庫(其中之每一者具有一個突變位置，從而產生20個變異體)之組合產生小文庫，針對引起較高親和力結合之任何位置使用酵母表面展示對該小文庫加以選擇。使用TfR頂端結構域蛋白質如上文所描述進行選擇。在三輪分選之後，對來自富集酵母文庫之純系進行測序，且鑑定出若干「熱點」位置，在該等位置中某些點突變顯著改良與頂端結構域蛋白質之結合。對於純系CH3C.35，此等突變包括E380(突變為Trp、Tyr、Leu或Gln)及S415(突變為Glu)。純系CH3C.35單一及組合突變體之序列闡述於SEQ ID NO：21-23、64-69及125-127中。對於純系CH3C.18，此等突變包括E380(突變為Trp、Tyr或Leu)及K392(突變為Gln、Phe或His)。純系CH3C.18單一突變體之序列闡述於SEQ ID NO：70-75中。
如關於先前之酵母文庫所描述產生用於鑑定來自NNK行走文庫之突變組合，同時添加在此等位置周邊之若干其他位置的另一文庫。在此文庫中，YxTEWSS(SEQ ID NO：414)及TxxExxxxF(SEQ ID NO：415)基元保持恆定，且六個位置為完全隨機化的：E380、K392、K414、S415、S424及S426。包括位置E380及S415，因為其為NNK行走文庫中之「熱點」。包括位置K392、S424及S426，因為其構成可定位結合區之核心的一部分，同時選擇K414，此係歸因於其鄰近位置415。
僅使用犬TfR頂端結構域如先前所描述對此文庫進行分選。在五輪之後對富集彙集物進行測序，且所鑑定之獨特純系之經修飾區域的序列闡述於SEQ ID NO：76-93中。
設計接下來之文庫以進一步探索在主要結合互補位中可接受之多樣性。用NNK密碼子將原始位置(384、386、387、388、389、390、413、416及421)中之每一者加上兩個熱點(380及415)個別地隨機化以產生一系列基於酵母之單位置飽和誘變文庫。此外，將各位置個別地恢復為野生型殘基，且使此等個別純系展示於酵母上。應注意，位置380、389、390及415為僅有的在恢復為野生型殘基後保留與TfR之實質性結合的位置(對於413恢復為野生型，觀測到一定程度殘留但極大程度減弱之結合)。
將單位置NNK文庫針對人類TfR頂端結構域分選三輪以收集最前之約5%之結合者，且接著自各文庫對至少16個純系進行測序。結果指示在純系CH3C.35之背景下，在各位置在不顯著降低與人類TfR之結合的情況下可忍受什麼胺基酸。概述如下：位置380：Trp、Leu或Glu；位置384：Tyr或Phe；位置386：僅Thr；位置387：僅Glu；位置388：僅Trp；位置389：Ser、Ala或Val(雖然野生型Asn殘基似乎保留一些結合，但其在文庫分選之後不出現)；位置390：Ser或Asn；位置413：Thr或Ser；位置415：Glu或Ser；位置416：僅Glu；及位置421：僅Phe。
以上殘基當作為單一變化或以組合形式取代至純系CH3C.35中時呈現保留與TfR頂端結構域結合之互補位多樣性。在此等位置具有突變之純系包括表4中所示之彼等純系，且此等純系之CH3結構域的序列闡述於SEQ ID NO：65-69、92、94-124及268-274中。
合成編碼野生型人類Fc序列之DNA模板且併入噬菌粒載體中。噬菌粒載體含有ompA或pelB前導序列、融合至c-Myc及6xHis(SEQ ID NO：421)抗原決定基標籤之Fc插入物以及在M13外殼蛋白pIII之後的琥珀(amber)終止密碼子。
產生在用於修飾之所需位置含有「NNK」三密碼子的引物，其中N為任何DNA鹼基(亦即，A、C、G或T)且K為G或T。或者，使用用於「軟」隨機化之引物，其中將對應於70%野生型鹼基及10%其他三種鹼基中之每一者之鹼基的混合物用於各隨機化位置。藉由進行對應於隨機化區域之Fc區片段的PCR擴增來產生文庫，且接著使用含有SfiI限制位點之末端引物進行組裝，接著用SfiI消化且連結至噬菌粒載體中。或者，使用引物來進行孔克爾誘變。將連結產物或孔克爾產物轉型至菌株TG1(獲自Lucigen®)之電轉感受態大腸桿菌細胞中。在回收之後使大腸桿菌細胞感染M13K07輔助噬菌體且生長隔夜，此後將文庫噬菌體用5% PEG/NaCl沈澱，再懸浮於含15%甘油之PBS中，且冷凍直至使用。典型文庫尺寸在約109至約1011個轉型體範圍內。經由pIII融合之Fc與不附著於pIII之可溶性Fc(後者係因pIII前之琥珀終止密碼子而產生)之間的配對使Fc-二聚體展示於噬菌體上。
合成編碼野生型人類Fc序列之DNA模板且併入酵母展示載體中。對於CH2及CH3文庫，使Fc多肽展示於Aga2p細胞壁蛋白質上。兩種載體均含有具有Kex2裂解序列之前原前導肽前體(prepro leader peptide)，且c-Myc抗原決定基標籤融合至Fc末端。
使用類似於關於噬菌體文庫所描述之彼等方法的方法來組裝酵母展示文庫，除了使用含有對載體同源之末端的引物來進行片段擴增。用經線性化之載體及經組裝之文庫插入物對新製備之電轉感受態酵母(亦即，菌株EBY100)進行電穿孔。電穿孔方法將為熟習此項技術者已知的。在選擇性SD-CAA培養基中回收之後，使酵母生長至匯合且分裂兩次，接著藉由轉移至SG-CAA培養基誘導蛋白質表現。典型文庫尺寸在約107至約109個轉型體範圍內。藉由鄰近展示之Fc單體之配對形成Fc-二聚體。
噬菌體方法係由Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas,2001)改編而來。自此參考文獻可獲得其他方案細節。
在4℃下將人類TfR靶標塗佈於MaxiSorp®微量滴定板上(典型地200μL，於PBS中1-10μg/mL)隔夜。除非另有規定，否則所有結合均在室溫下進行。將噬菌體文庫添加至各孔中且孵育隔夜以便結合。將微量滴定孔用含有0.05% Tween® 20(PBST)之PBS澈底洗滌且藉由將孔在酸(典型地為50mM HCl加上500mM KCl，或100mM甘胺酸，pH 2.7)存在下孵育30分鐘將結合之噬菌體溶離。將溶離之噬菌體用1M Tris(pH 8)中和且使用TG1細胞及M13/KO7輔助噬菌體擴增，且在37℃下在含有50μg/mL羧苄西林(carbenacillin)及50μg/mL卡那黴素(Kanamycin)之2YT培養基中生長隔夜。將自含有靶標之孔溶離的噬菌體之
效價與自不含靶標之孔中回收的噬菌體之效價相比較以評估富集。藉由隨後減少結合期間之孵育時間及增加洗滌時間及洗滌次數來增加選擇嚴格性。
NHS-PEG4-生物素(獲自PierceTM)通過游離胺將抗原生物素化。對於生物素化反應，在PBS中使用3倍至5倍莫耳過量之生物素試劑。用Tris中止反應，隨後在PBS中澈底滲析。將經生物素化之抗原固定於鏈黴親和素塗佈之磁性珠粒(亦即，獲自Thermo Fisher之M280-鏈黴親和素珠粒)上。將噬菌體展示文庫與抗原塗佈之珠粒在室溫下一起孵育1小時。接著移除未結合之噬菌體且用PBST洗滌珠粒。藉由在存在含有500mM KCl之50mM HCl(或0.1M甘胺酸，pH 2.7)之情況下孵育30分鐘將結合之噬菌體溶離，且接著如上文關於板分選所描述進行中和及增殖。
在三至五輪淘選之後，藉由使Fc在噬菌體上表現或在大腸桿菌周質中可溶性表現來篩選單一純系。此類表現方法將為熟習此項技術者已知的。使個別噬菌體上清液或周質萃取物暴露於塗有抗原或陰性對照之經阻斷之ELISA板，且隨後對於周質萃取物使用HRP結合之山羊抗Fc(獲自Jackson Immunoresearch)或對於噬菌體使用抗M13(GE Healthcare)進行偵測，且接著用TMB試劑(獲自Thermo Fisher)顯色。將OD450值大於約5倍於背景之孔視為陽性純系且測序，此後使一些純系作為可溶性Fc片段或以融合至Fab片段之形式表現。
類似於Ackerman等人，2009 Biotechnol.Prog.,25(3),774中所描述進行MACS及FACS選擇。將鏈黴親和素磁性珠粒(例如來自Thermo Fisher之M-280鏈黴親和素珠粒)用經生物素化之抗原標記且與酵母一起孵育(典型地
5-10x文庫多樣性)。移除未結合之酵母，洗滌珠粒，且使結合之酵母在選擇性培養基中生長且誘導後續各輪選擇。
將酵母用抗c-Myc抗體標記以監測表現及生物素化之抗原(濃度視各輪分選而變化)。在一些實驗中，將抗原與鏈黴親和素-Alexa Fluor® 647預混合以增強相互作用之親合力。在其他實驗中，在結合且用鏈黴親和素-Alexa Fluor® 647洗滌之後偵測到生物素化之抗原。使用FACS Aria III細胞分選器對結合情況下之單線態酵母進行分選。使分選之酵母在選擇性培養基中生長，接著誘導後續各輪選擇。
在達成富集酵母群體之後，將酵母塗鋪於SD-CAA瓊脂板上且使單一菌落生長且誘導表現，接著如上文所描述進行標記以測定其結合於靶標之傾向。隨後針對結合抗原對陽性單一純系進行測序，此後一些純系作為可溶性Fc片段或以融合至Fab片段之形式表現。
自淘選輸出端選擇純系且使其在96孔深孔板之個別孔中生長。使用自動誘導培養基(獲自EMD Millipore)誘導純系之周質表現或使其感染輔助噬菌體以使個別Fc變異體於噬菌體上發生噬菌體展示。使培養物生長隔夜且離心以使大腸桿菌集結成粒。對於噬菌體ELISA，直接使用含有噬菌體之上清液。對於周質表現，將球粒再懸浮於20%蔗糖中，隨後用水以4：1稀釋，且在4℃下振盪1小時。將板離心以使固體集結成粒且將上清液用於ELISA中。
典型地以0.5mg/mL用抗原塗佈ELISA板隔夜，接著用1% BSA阻斷，然後添加噬菌體或周質萃取物。在1小時孵育及洗去未結合之蛋白質之後，添加HRP結合之二級抗體(亦即，對於可溶性Fc或噬菌體展示之Fc分別為抗
Fc或抗M13)且孵育30分鐘。再次將板洗滌，且接著用TMB試劑顯色且用2N硫酸中止反應。使用讀板儀(BioTek®)定量在450nm下之吸光度且在適當時使用Prism軟體繪製結合曲線。將所測試純系之吸光度信號與陰性對照(缺乏Fc之噬菌體或周質(paraplasmic)萃取物)相比較。在一些分析中，在結合步驟期間典型地以顯著莫耳過量添加可溶性轉鐵蛋白或其他競爭物(大於10倍過量)。
將Fc變異體多肽(表現於噬菌體上、周質萃取物中或作為與Fab片段之融合物可溶性表現)添加至96孔V形底板中之孔中(在PBS+1%BSA(PBSA)中每孔約100,000個細胞)，且在4℃下孵育1小時。隨後將板離心且移除培養基，且接著將細胞用PBSA洗滌一次。將細胞再懸浮於含有二級抗體(典型地為山羊抗人類-IgG-Alexa Fluor® 647(獲自Thermo Fisher))之PBSA中。在30分鐘之後，將板離心且移除培養基，將細胞用PBSA洗滌1-2次，且接著將板在流式細胞儀(亦即，FACSCantoTM II流式細胞儀)上讀取。使用FlowJo軟體計算各條件下之中值螢光值且用Prism軟體繪製結合曲線。
此實例描述了CH3C.18變異體之文庫的構築。
分離單一純系，且在補充有0.2%葡萄糖之SG-CAA培養基中生長隔夜以誘導CH3C.18變異體之表面表現。對於各純系，將兩百萬個細胞在PBS+0.5% BSA(pH 7.4)中洗滌三次。在4℃下在振盪之同時，將細胞用生物素化靶標250nM人類TfR、250nM犬TfR或250nM之不相關生物素化蛋白質染色1小時，接著用相同緩衝液洗滌兩次。在4℃下，將細胞用中性親和素(nuetravidin)-Alexafluor647(AF647)染色30分鐘，接著再洗滌兩次。使用抗c-myc抗體加上抗雞-Alexfluor488(AF488)二級抗體量測表現。將細胞再懸浮，且在BD
FACS CantoII上量測AF647及AF488之中值螢光強度(MFI)。計算各群體之TfR結合群體之MFI且在人類TfR、犬TfR或對照結合情況下繪製曲線。
表5顯示CH3C.18變異體之文庫。各列表示在各位置含有所指示之胺基酸取代的變異體且其餘位置之胺基酸與CH3C.18中相同。表5中所示之位置係根據EU編號方案編號。
為提供具有順式組態之TfR結合性多肽可用於治療相關疾病模型中的其他證據，吾人在Aβ斑塊沈澱小鼠模型中評估了具有結合Aβ之Fab的具有順式組態之TfR結合性Fc多肽。特定而言，評估了此等多肽將小神經膠質細胞
募集至Aβ斑塊之能力。簡單來說，在第0天、第3天、第6天及第9天按以下組以50mg/kg對動物(3.5月齡)進行腹膜內處理：1)用對照IgG處理TfRms/hu KI小鼠(n=6)，2)用對照IgG處理5XFAD x TfRms/hu KI小鼠(n=11)，3)用抗Aβ(α-Aβ)處理5XFAD x TfRms/hu KI小鼠(n=12)，4)用具有順式組態及Aβ Fab結合位點之TfR結合性Fc多肽處理5XFAD x TfRms/hu KI小鼠(n=12)，以及5)用在兩個Fc多肽上具有LALA突變之TfR結合性Fc多肽處理5XFAD x TfRms/hu KI小鼠(n=12)。表6列舉了各Fc多肽二聚體-Fab融合物之各重鏈及輕鏈的SEQ ID NO。
在第12天，對小鼠進行灌注；收集腦且以40μm進行矢狀面切片用於免疫組織化學分析。每個動物選擇兩個腦切片(切片1：外側至中線約3mm，切片2：在中線處)用於IHC分析。將自由浮動切片在阻斷溶液(含0.3% triton X-100之5%驢血清之PBS溶液)中在室溫下孵育兩小時，接著與一級抗體(抗CD68，抗人類Aβ)一起在4℃下孵育隔夜。接著將切片洗滌3次持續15分鐘，與螢光標記之二級抗體一起在室溫下孵育2h，與DAPI溶液一起孵育20分鐘，且接著在含0.3% triton X-100之PBS中洗滌3次。將切片安裝至載玻片上且使
用延時玻璃抗螢光衰減封片劑(Prolong Glass Antifade mounting medium)加蓋玻片。使用Zeiss Axioscan.Z1載玻片掃描儀以20X放大倍數使載玻片成像且使用Zeiss ZEN軟體中之定製宏及圖像處理宏進行處理。特定而言，分析圖像以測定擴大之斑塊面積(根據尺寸)、斑塊/CD68小神經膠質細胞重疊之面積、擴大之CD68+小神經膠質細胞面積、計數及像素強度總和(根據尺寸：9-14μm2、14-33μm2、33-75μm2及75-3,333μm2)以及斑塊形態、面積、計數及像素強度總和(使用緊密度將圓形與不規則斑塊分開，<0.7為不規則而>0.7為圓形；根據尺寸分開：30-125μm2、125-250μm2、250-500μm2及500-3,300μm2)。
由此等實驗，用具有順-LALAFc多肽二聚體情況下之TfR結合位點之抗Aβ處理的5XFAD x TfRms/hu KI小鼠以類似於抗Aβ之方式引發穩健的小膠質細胞朝向Aβ斑塊之募集(如藉由小膠質細胞標記物CD68及Aβ標記物之共定位所量測)且使尺寸為30-125μm2之較小斑塊減少(圖8A-8C)。重要地，在兩個Fc多肽上具有TfR結合位點且具有LALA突變之抗Aβ的情況下未觀測到此等影響，此與此等疾病模式中效應功能之必要性相符合。總的說來，此等數據與本文中之其他活體外及活體內數據一起提供如下強有力的證據，具有順-LALA組態之TfR結合性Fc多肽之平台主鏈及相關Fab結合位點可緩和網狀紅血球安全性，並且在相關疾病模型中引發靶標介導之效應功能(亦即，腦中之小膠質細胞參與)。
應瞭解，本文所描述之實例及實施例僅用於說明性目的，且將向熟習此項技術者建議根據其進行之各種修改或變化，且該等修改或變化應包括在本申請案之精神及權限以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文引用之序列登錄號之序列以引用之方式併入本文中。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。
可在不存在本文中未特定揭示之任何一種元件或多種元件、一種限制或多種限制之情況下適當地實踐本文中說明性地描述之發明。因此，舉例而言，術語「包含」、「包括」、「含有」等應可擴展地加以閱讀且不限於此。另外，本文所使用之術語及表述係用作描述術語而非限制術語，且在使用此類術語及表述時不意在排除所顯示及描述之特徵的任何等效物或其部分，但應認識到，在本發明所主張之範疇內各種修改均為可能的。
在有差異之情況下，表格(例如表3及4)中所描述之各純系之胺基酸取代指示該純系在登記位置對存在於序列表中所闡述之序列中之胺基酸的胺基酸取代。
本文提及之所有出版物、專利申請案、專利以及其他參考文獻以全文引用之方式明確併入本文中，其程度與各自以引用之方式個別地併入相同。在矛盾之情況下，將以本說明書，包括定義為準。
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<210> 372
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 372
<210> 373
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 374
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 375
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 375
<210> 376
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 378
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 392
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 392
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 396
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 398
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 399
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 400
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 403
<210> 404
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 404
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<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 405
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<211> 217
<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 406
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<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 407
<210> 408
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 409
<211> 217
<212> PRT
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 409
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<211> 451
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 410
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 411
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<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<210> 413
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 413
<210> 414
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何胺基酸
<400> 414
<210> 415
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(3)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(8)
<223> 任何胺基酸
<400> 415
<210> 416
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 416
<210> 417
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 417
<210> 418
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 418
<210> 419
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 419
<210> 420
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 420
<210> 421
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6xHis標籤
<400> 421f
Claims (92)
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，或其二聚體片段，其：(a)特異性結合TfR；(b)能夠結合Fcγ受體(FcγR)；且(c)不實質上消耗活體內網狀紅血球。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，或其二聚體片段，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含(i)TfR結合位點以及(ii)當結合於TfR時減少FcγR結合之一或多個胺基酸修飾；以及(b)第二Fc多肽，其不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該TfR結合位點包含經修飾之CH3結構域。
- 如申請專利範圍第3項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域衍生自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域。
- 如申請專利範圍第3項或第4項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含在包含384、386、387、388、389、390、413、416及421之根據EU編號的胺基酸位置集合中的五個、六個、七個、八個或九個取代。
- 如申請專利範圍第5項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。
- 如申請專利範圍第5項或第6項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在包含414、424及426之位置的一個、兩個或三個取代。
- 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚 體，其中該經修飾之Fc多肽二聚體結合於TfR之頂端結構域。
- 如申請專利範圍第8項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之Fc多肽二聚體結合於TfR，而不抑制轉鐵蛋白與TfR之結合。
- 如申請專利範圍第8項或第9項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之Fc多肽二聚體結合於包含TfR之胺基酸208的抗原決定基。
- 如申請專利範圍第5項至第10項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含在位置388之Trp。
- 如申請專利範圍第5項至第11項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含在位置421之芳族胺基酸。
- 如申請專利範圍第12項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在位置421之該芳族胺基酸為Trp或Phe。
- 如申請專利範圍第5項至第10項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：位置384為Leu、Tyr、Met或Val；位置386為Leu、Thr、His或Pro；位置387為Val、Pro或酸性胺基酸；位置388為Trp；位置389為Val、Ser或Ala；位置413為Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；位置416為Thr或酸性胺基酸；及位置421為Trp、Tyr、His或Phe。
- 如申請專利範圍第14項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個位置：位置384為Leu、Tyr、Met或Val；位置386為Leu、Thr、His或Pro；位置387為Val、Pro或酸性胺基酸；位置388為Trp；位置389為Val、Ser或Ala；位置413為Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；位置416為Thr或酸性胺基酸；及位置421為Trp、Tyr、His或Phe。
- 如申請專利範圍第5項至第15項中任一項之經修飾之Fc多肽二 聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含在位置384之Leu或Met；在位置386之Leu、His或Pro；在位置387之Val；在位置388之Trp；在位置389之Val或Ala；在位置413之Pro；在位置416之Thr；及/或在位置421之Trp。
- 如申請專利範圍第16項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置391之Ser、Thr、Gln或Phe。
- 如申請專利範圍第16項或第17項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln。
- 如申請專利範圍第16項至第18項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置392之Gln、Phe或His。
- 如申請專利範圍第16項或第17項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp及/或在位置392之Gln。
- 如申請專利範圍第14項至第20項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含選自以下之一個、兩個或三個位置：位置414為Lys、Arg、Gly或Pro；位置424為Ser、Thr、Glu或Lys；及位置426為Ser、Trp或Gly。
- 如申請專利範圍第5項至第15項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含在位置384之Tyr、在位置386之Thr、在位置387之Glu或Val、在位置388之Trp、在位置389之Ser、在位置413之Ser或Thr、在位置416之Glu及/或在位置421之Phe。
- 如申請專利範圍第22項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln。
- 如申請專利範圍第22項或第23項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置415之Glu。
- 如申請專利範圍第22項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含在位置380之Trp及/或在位置415之Glu。
- 如申請專利範圍第22項至第25項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含在位置390之Asn。
- 如申請專利範圍第6項至第10項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含以下取代中之一或多者：在位置380之Trp；在位置386之Thr；在位置388之Trp；在位置389之Val；在位置413之Ser或Thr；在位置415之Glu；及/或在位置421之Phe。
- 如申請專利範圍第5項至第27項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：4-29及64-127中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
- 如申請專利範圍第28項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
- 如申請專利範圍第5項至第27項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸111-217具有至少85%一致性，前提條件為該一致性百分比不包括根據EU編號之位置384、386、387、388、389、390、413、416及421之集合。
- 如申請專利範圍第5項至第30項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含SEQ ID NO：4-29及125-127中之任一者的胺基酸154-160及/或183-191。
- 如申請專利範圍第6項至第10項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
- 如申請專利範圍第32項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含選自以下之2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或11個位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
- 如申請專利範圍第33項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含如下11個位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
- 如申請專利範圍第33項或第34項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：4-29及64-127中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
- 如申請專利範圍第35項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域與SEQ ID NO：66、68、94、107-109、119及268-270中之任一者的胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
- 如申請專利範圍第35項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在根據EU編號方案對應於位置380、384、386、384、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426之位置中之至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者處的殘基未發生缺失或取代。
- 如申請專利範圍第3項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域包含SEQ ID NO：38-61及131-173中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第5項至第37項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之CH3結構域進一步包含根據EU編號方案(i)在位置366之Trp或者(ii)在位置366之Ser、在位置368之Ala及在位置407之Val。
- 如申請專利範圍第5項至第39項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中對應未經修飾之CH3結構域為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域。
- 如申請專利範圍第2項至第40項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該等當結合於TfR時減少FcγR結合之胺基酸修飾包含根據EU編號方案在位置234及在位置235之Ala。
- 如申請專利範圍第2項至第41項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含增加血清半衰期之胺基酸修飾。
- 如申請專利範圍第42項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該等增加血清半衰期之胺基酸修飾包含根據EU編號方案(i)在位置428之Leu及在位置434之Ser，或者(ii)在位置434之Ser或Ala。
- 如申請專利範圍第1項至第43項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽進一步融合至Fab。
- 如申請專利範圍第2項至第44項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中根據EU編號方案，該第一Fc多肽包含杵突變T366W且該第二Fc多肽包含臼突變T366S、L368A及Y407V。
- 如申請專利範圍第2項至第44項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中根據EU編號方案，該第一Fc多肽包含臼突變T366S、L368A及Y407V且該第二Fc多肽包含杵突變T366W。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第47項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：178、190、202、214、226、238、252、286、298及310中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第47項或第48項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第50項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：323、330、337、344、351、358、365、372、379 及386中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第50項或第51項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：397之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及杵突變T366W，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第53項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：178、190、202、214、226、238、252、286、298及310中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第53項或第54項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：407之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A、杵突變T366W以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之臼突變T366S、L368A及Y407V以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第56項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：323、330、337、344、351、358、365、372、379及386中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第56項或第57項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：407之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第59項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：184、196、208、220、232、244、280、292、304及316中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第59項或第60項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之杵突變T366W，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第62項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：326、333、340、347、354、361、368、375、382及389中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第62項或第63項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：391之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點、根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A以及臼突變T366S、L368A及Y407V，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第65項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：184、196、208、220、232、244、280、292、304及316中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第65項或第66項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：404之序列。
- 一種經修飾之Fc多肽二聚體，其包含：(a)特異性結合TfR之第一Fc多肽，其包含TfR結合位點；根據EU編號方案之胺基酸修飾L234A及L235A；臼突變T366S、L368A及Y407V；以及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，以及(b)第二Fc多肽，其包含根據EU編號方案之杵突變T366W及胺基酸修飾N434S加上或不加上M428L，且不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第68項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：326、333、340、347、354、361、368、375、382及389中之任一者的序列。
- 如申請專利範圍第68項或第69項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：404之序列。
- 如申請專利範圍第1項至第70項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之Fc多肽二聚體不實質上消耗網狀紅血球。
- 如申請專利範圍第71項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後消耗的網狀紅血球之量。
- 如申請專利範圍第72項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後消耗的網狀紅血球之量的50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%。
- 如申請專利範圍第71項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後剩餘的網狀紅血球之量大於在投與對照之後剩餘的網狀紅血球之量。
- 如申請專利範圍第74項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後剩餘的網狀紅血球之量比在投與對照之後剩餘的網狀紅血球之量大至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。
- 如申請專利範圍第1項至第70項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該經修飾之Fc多肽二聚體不實質上消耗骨髓中之網狀紅血球。
- 如申請專利範圍第76項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後該骨髓中消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後該骨髓中消耗的網狀紅血球之量。
- 如申請專利範圍第77項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後該骨髓中消耗的網狀紅血球之量小於在投與對照之後該骨髓中消耗的網狀紅血球之量的50%、45%、40%、35%、30%、 25%、20%、15%、10%、8%、5%、3%、2%或1%。
- 如申請專利範圍第76項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後該骨髓中剩餘的網狀紅血球之量大於在投與對照之後該骨髓中剩餘的網狀紅血球之量。
- 如申請專利範圍第79項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中在投與該經修飾之Fc多肽二聚體之後該骨髓中剩餘的網狀紅血球之量比在投與對照之後該骨髓中剩餘的網狀紅血球之量大至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。
- 如申請專利範圍第72項至第75項及第77項至第80項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體，其中該對照為具有完全效應功能且/或不含減少FcγR結合之突變的對應TfR結合性Fc二聚體。
- 一種Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其能夠主動轉運穿過BBB，該Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白包含：(a)抗體可變區，其能夠結合抗原，或其抗原結合片段；以及(b)經修飾之Fc多肽二聚體，其包含(i)特異性結合TfR之第一Fc多肽，該第一Fc多肽包含TfR結合位點及當結合於TfR時減少FcγR結合之一或多個胺基酸修飾，以及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽不含TfR結合位點或減少FcγR結合之任何修飾。
- 如申請專利範圍第82項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其中該等當結合於TfR時減少FcγR結合之胺基酸修飾包含根據EU編號方案在位置234及在位置235之Ala。
- 如申請專利範圍第82項或第83項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含增加血清半衰期之胺基酸修飾。
- 如申請專利範圍第84項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其中該等增加血清半衰期之胺基酸修飾包含根據EU編號方案(i)在位置428之Leu及在位置434之Ser，或者(ii)在位置434之Ser或Ala。
- 如申請專利範圍第82項至第85項中任一項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其中抗體可變區序列包含Fab結構域。
- 如申請專利範圍第82項至第86項中任一項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白，其中該抗體可變區序列包含兩條抗體可變區重鏈及兩條抗體可變區輕鏈，或其各別片段。
- 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第81項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第82項至第87項中任一項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種將組合物胞吞轉送穿過內皮之方法，其包括使該內皮與包含如申請專利範圍第1項至第81項中任一項之經修飾之Fc多肽二聚體的組合物接觸。
- 一種將組合物胞吞轉送穿過內皮之方法，其包括使該內皮與包含如申請專利範圍第82項至第87項中任一項之Fc多肽二聚體-Fab融合蛋白的組合物接觸。
- 如申請專利範圍第90項或第91項之方法，其中該內皮為BBB。
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