TW201904595A - 大葉骨碎補精萃物及其製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種萃取大葉骨碎補的方法，其包含以水萃取大葉骨碎補，以得到粗萃物，再分離該粗萃物。其中藉由第一管柱層析粗萃物，得到第一層析產物的四個分部；其第三分部藉由第二管柱層析以得到第二層析產物的四個分部；並藉由第三管柱層析第二層析產物的第二分部，得到第三層析產物的兩個分部；以及取該第三層析甲分部作為一精萃物。

Description

大葉骨碎補精萃物及其製造方法

本發明係關於一種大葉骨碎補的精萃方法，具體而言，係關於一種大葉骨碎補精萃物及其製造方法。

隨著全球逐漸邁入高齡化社會，各種退化性疾病的問題日益明顯，高齡化人口多受各種心血管疾病、腎臟疾病或骨疾病所苦。其中，前兩者即便於發病期間或發病後仍可藉由飲食控制及適當的運動進行改善，然而，一旦骨疾病發作，甚至會對日常生活中的行動或作息造成不便，更遑論相對較為激烈的運動，故須依賴藥物進行治療。

在臺灣，患有骨疾病的人口中，尤以骨質疏鬆最為普遍，其患者會發生骨質流失和骨組織破壞的症狀，從而導致骨質變得脆弱，大大增加骨折的可能性，故有效治療骨質疏鬆的藥物實為必要。除現有的醫療用藥，目前，大葉骨碎補此一植物被認為具有良好的骨質疏鬆療效，被認為是具有極高潛力的藥物原料。習知技術亦以乙醇萃取大葉骨碎補植物原料，試圖提取出其中所含的活性物質用以製備治療骨質疏鬆症的藥物。然而，雖提取出的活性物質確有療效，但在效率及成本方面仍有改進的空間。

鑒於以上問題，本發明改變習知技術利用乙醇萃取的方式，改用水萃取方式，並搭配特定的純化分離步驟，最終可提取出對骨質疏鬆症具有較佳療效的精萃物。

一種萃取大葉骨碎補的方法，其包含：以水萃取一大葉骨碎補，以得到粗萃物；分離粗萃物，其中藉由第一管柱層析該粗萃物，以得到第一層析物，將該第一層析物依收集順序分為第一層析甲分部、第一層析乙分部、第一層析丙分部及第一層析丁分部；藉由第二管柱層析第一層析丙分部，以得到第二層析物，將第二層析物依收集順序分為第二層析甲分部、第二層析乙分部、第二層析丙分部及第二層析丁分部；並藉由第三管柱層析第二層析乙分部以得到第三層析物，將第三層析物依收集順序分為第三層析甲分部及第三層析乙分部；以及取第三層析甲分部作為本發明之大葉骨碎補精粹物。

較佳地，第一管柱、第二管柱及第三管柱所使用之動相係為包含甲醇及水的梯度動相。

較佳地，以水萃取該大葉骨碎補時，該大葉骨碎補相對於水的重量比為1:1~5。

較佳地，該第一層析甲分部、該第一層析乙分部、該第一層析丙分部及該第一層析丁分部具有相同體積。

較佳地，該第二層析甲分部、該第二層析乙分部、該第二層析丙分部及該第二層析丁分部具有相同體積。

較佳地，該第三層析甲分部及該第三層析乙分部具有相同體積。

較佳地，進一步使該第二層析乙分部形成一結晶，再以該第三管柱層析該結晶。

本發明提供上述方法萃取並分離純化出第三層析甲分部作為一種大葉骨碎補的精萃物。

綜上所述，本發明提供一種大葉骨碎補的精萃物，其係藉由本發明提供的萃取方法以水萃取並純化分離。本發明之大葉骨碎補的精萃物相較於習知利用乙醇萃取的萃取物在相同劑量下對於抗骨質流失、促進骨增生、抑制造成骨質疏鬆的相關蛋白質及增強鈣化率等方面具有更佳的效果，且皆於本發明所載之實施例及圖式中以實驗輔以數據加以證實。

為了讓上述目的、技術特徵以及實際實施後之增益性更為明顯易懂，於下文中將係以較佳之實施範例輔佐對應相關之圖式來進行更詳細之說明。

在本發明的一實施例中，大葉骨碎補精萃物係參照第1圖所示之製備流程所製得。首先，在製備流程的製備步驟S11中，前處理原料中草藥以便於進行後續步驟。原料中草藥可選自大葉骨碎補的根部、莖部、葉部、其組合及全株大葉骨碎補。較佳地，原料中草藥的部位可為大葉骨碎補中含有如式(1)所示結構之化合物CP的部位： 式(1)； 。此外，大葉骨碎補可為所使用的唯一藥材，故本發明之用途所製備的藥物可屬單方藥物。

前處理可包含清洗、浸泡、擠壓、切碎、壓碎、壓輾、研磨、及任何物理性及/或化學性前處理方式。較佳地，原料中草藥可僅經由清洗方式前處理後，接續製備步驟S12。

在製備步驟S12中，萃取經過製備步驟S11前處理之原料中草藥，以得到液相萃取液及固相殘渣，亦即粗萃物。其中，萃取方式可包含：蒸餾法、水萃取法、有機溶劑萃取法、超臨界流體萃取法。較佳地，大葉骨碎補可利用水萃取法，亦即，利用水進行萃取以取得粗萃物。

利用水萃取法進行萃取時，可將大葉骨碎補浸泡於水中並靜置，其中大葉骨碎補與水的重量比為1:1~20、較佳地為1:1~5。此外，萃取可搭配任何本領域具通常知識者所習知的物理性萃取手段，例如：攪拌、加熱、或超音波震盪等，且可持續地或間隔地進行，或者依需求重複多次。 在製備步驟S12的最後，可取得大葉骨碎補的液相粗萃液及固態殘渣。

在製備步驟S13中，分離前述取得的液相粗萃液。首先，將固態殘渣由液相粗萃液中移除，移除方式可為任何本領域具通常知識者所習知的物理性移除手段，例如：沉澱、過濾、或離心等。較佳地、移除係藉由沉澱進行。移除的固態殘渣可棄置，或者可重複製備步驟S11~S13再次萃取，以取得具有較低濃度的液相粗萃液。

所得之液相粗萃液係為多種成分的混合物，可直接接續進行製備步驟S14，乾燥或濃縮自製備步驟S13取得的液相粗萃液，以得到粗萃物的粉體或濃縮粗萃液。其中，濃縮及乾燥可為任何本領域具通常知識者所習知的手段，例如：室溫蒸散、加熱、減壓濃縮或凍乾等。

上述產物可經由各種方法保存，例如：在製備步驟S13取得的萃取液可直接封裝保存；或在製備步驟S14中，將萃取液濃縮至特定保存濃度後封裝保存，其中特定保存濃度可為0~1000 μg/mL，較佳地0~100 μg/mL；或者，在製備步驟S14中乾燥後，以粉體型態封裝保存。

此外，亦可保存於室溫、冰箱或烘箱中。較佳地，本發明之粗萃物可密封保存於-20℃冰箱中，避免受潮或變質。

在本發明的實施例中，製備流程可進一步包含製備步驟S15。其中，由製備步驟S13所得的萃取液或製備步驟S14所取得的濃縮粗萃液或粉體，可進一步地經由任何本領域具通常知識者所習知的分離手段進行分離，包含離子交換型管柱層析、粒徑篩析層析、或親和性管柱層析等原理進行粗萃物的分離，但不僅限於此。粗萃物可進行多次相同類型的層析，或者依序進行不同類型層析。較佳地，製備步驟S15係交替使用離子交換型管柱層析及粒徑篩析管柱層析進行分離，以取得本發明的大葉骨碎補精萃物。

較佳地，製備步驟S15中離子交換型管柱層析所使用的靜相可任何習知之適用於分離天然化合物大分子的靜相，較佳地，可為苯乙烯系之吸附/脫附樹脂及聚苯乙烯基的反相樹脂填料。苯乙烯系之吸附/脫附樹脂可為DIAION-HP20、DIAION-HP21、DIAION SP850、DIAION-SP825L、DIAION-SP70、DIAION-SP700 或其他習知的吸附/脫附樹脂。聚苯乙烯基的反相樹脂填料可為MCI-GEL CHP20、MCI-GEL CHP 55、MCI-GEL CHP10或其他習知的離子交換樹脂。

較佳地，製備步驟S15中粒徑篩析管柱層析所使用的靜相可為羥丙基葡聚糖凝膠，例如：Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-200、Sephadex LH-20或其他習知的粒徑篩析用靜相。

層析所使用的動相可為適配於所選用靜相的非梯度動相或梯度動相。較佳地，選用的動相可為極性有機溶劑的梯度動相。更佳地，動相可為包含水及甲醇的梯度動相。

具體而言，如第2圖所示，製備步驟S15包含分離步驟S21~S24。首先將製備步驟S13取得的粗萃物或其經由製備步驟S14取得的濃縮粗萃液或粉體經由離子交換型管柱進行分離步驟S21進行第一次層析。分離步驟S21所收集的分離物可依照體積等分為四個分部，由最先至最後之收集順序分別為分部F101、分部F102、分部F103及分部F104。接著，分部F103可進一步由粒徑篩析管柱層析進行分離步驟S22，即第二次層析。同樣地，分離步驟S22所收集的分離物可依照體積等分為四個分部，由最先至最後之收集順序分別為分部F201、分部F202、分部F203及分部F204。

分部F202經由分離步驟S23結晶，其中將分部F202靜置形成結晶F302後，將上清液F301過濾，而後進一步將結晶F302溶解用於離子交換型管柱以進行分離步驟S24，即第三次層析。分離步驟S24所收集的分離物可依照體積等分為分部F401及分部F402，由最先至最後之收集順序分別為分部F401及分部F402。最後，將收集之分部F401作為本發明之大葉骨碎補精萃物，用於製備治療骨質疏鬆症藥物的用途，然而不僅限於此，上述所有層析收集的分部皆可具有同樣的用途，選用分部F401係因其具有較佳的效果。

較佳地，本發明之大葉骨碎補精萃物可保存直至施予前取出，並配置為適於施予之型態。較佳地，保存直至使用前取出，並配置為適於製備為藥物之型態。

在上述所有實施例中，本發明之大葉骨碎補精萃物所製備的藥物除包含製備流程所得之產物外，可進一步包含醫藥上可接受之載體、賦形劑或其組合。

在一實施例中，施予預定劑量的大葉骨碎補精萃物所製備的藥物至骨細胞或其前體時，例如：成骨細胞、前成骨細胞等，施予劑量可為0.001~0.01 mg/10⁶ cells、較佳地0.011~0.025 mg/10⁶ cells、更佳地0.026 ~0.05 mg/10⁶ cells。

在一實施例中，施予預定劑量的大葉骨碎補精萃物所製備的藥物至哺乳動物，例如：人類、牛、羊、豬、狗、貓、馬、驢等，施予劑量可為 1~20 mg/kg、較佳地21~50 mg/kg、更佳地51~100mg/kg。此外，施予由本發明的大葉骨碎補精萃物製備的藥物至哺乳動物的之途徑可為注射途徑、口服途徑、皮膚外用途徑或任何其他施予藥物的習知途徑。

在上述所有實施例中，本發明之大葉骨碎補精萃物所製備之的藥物的用途可進一步包含治療骨質疏鬆症及骨損傷。

以下，將以實際示例說明施予本發明之大葉骨碎補精萃物至骨質疏鬆症模型所得之結果。其中，實例中所得到之各個樣本皆賦予代號，搭配圖式中的數據進行解釋，若描述中提及具有相同代號之樣本，其製備流程皆相同，於重複提及時不再贅述。

在本發明的一實例中，將大葉骨碎補清洗後，浸入去離子水中萃取。接著，將取得的液相粗萃液及固態殘渣藉由沉澱方式分離後，減壓濃縮，以得到水粗萃物，本文中稱之為萃取物W。將所得到的萃取物W以DIAION-HP20苯乙烯系之吸附/脫附樹脂為靜相，搭配「水~100%甲醇」的梯度動相進行管柱層析，動相流速設定為2.5 mL/分，蒐集共2000 mL的收集液，並依體積等分為四份，根據收集順序由先至後命名為樣本W101、W102、W103及W104。接著，將樣本W103進一步以Sephadex LH-20羥丙基葡聚糖凝膠為靜相，搭配「20%甲醇~100%甲醇」的梯度動相進行管柱層析，動相流速設定為0.25 mL/分，蒐集共60 mL的收集液，並依體積等分為四份，根據收集順序由先至後命名為樣本W201、W202、W203及W204。

靜置樣本W202沉澱並結晶，過濾液體後得到乾燥結晶，其中將過濾所得的液體命名為樣本W301，乾燥結晶命名為樣本W302。接著，進一步將所取得的樣本W302以MCI-GEL CHP20聚苯乙烯基的反相樹脂作為靜相，搭配「20%甲醇~40%甲醇」的梯度動相進行管柱層析，動相流速設定為0.25 mL/分，蒐集共60 mL的的收集液，並依體積等分為兩份，根據收集順序由先至後命名為樣本W401及W402。

最後，將收集之樣本W401作為本發明之大葉骨碎補的水精萃物，用於製備治療骨質疏鬆症藥物的用途，然而不僅限於此，上述所有層析收集的樣本皆可具有同樣的用途，選用樣本W401係因其具有較佳的效果。

將樣本W101~W104及W201~W204以αMEM培養基配置為濃度 0、10、25及50 μg/mL之溶液；將樣本W301~W302以αMEM培養基配置為濃度 0、1、10、25及50 μg/mL之溶液；將樣本W401~W402以αMEM培養基配置為濃度 0、0.01、0.1、1、10、25及50 μg/mL之溶液。上述樣本配置的溶液經過濾後加入培養MC3T3-E1細胞(前成骨細胞)的培養盤中共培養0.5小時，並移除含有大葉骨碎補精萃物的培養基。接著，進行MTT細胞存活率分析，分析結果如第3A至3D圖所示。此外，第3E圖更呈現各層析階段所得到具有較佳療效的樣本施予MC3T3-E1細胞後的染色情形。

為了解本實例製備的大葉骨碎補的水精萃物對生物體內的實際影響，發明人選用12週齡C57BL/6JNarl品系的雌鼠進行體內試驗。C57BL/6JNarl品系的雌性小鼠於購買後飼養7天以適應環境。接著，對小鼠實行卵巢切除術，用作骨質疏鬆症的模型，模擬人類停經後產生的骨質疏鬆症，並施予上述得到的萃取物W至小鼠體內。其中，萃取物W又分別以高劑量及低劑量施予至不同組別：對高劑量萃取物W的組別(WH)施予每日200 mg/kg劑量的萃取物W；對低劑量萃取物W的組別(WL)施予每日50 mg/kg劑量的萃取物W。於第16週時，觀測各組別間小鼠體重變化，並犧牲小鼠採樣血清，分析各組別間腫瘤壞死因子α(tumor necrosis alpha，TNF-α)、白血球介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的含量差異、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性差異。上述分析標的中，TNF-α已被證實會導致骨質流失，進而導致骨質疏鬆症的產生；IL-1β量在骨髓中的升高以及活性增加被認為會刺激骨髓單核細胞向破骨細胞轉化，是雌激素缺乏時骨丟失的重要誘發因素之一；OCN被認為是骨質生成速率的指標，停經時，由於骨質流失速度增快，進而刺激增加OCN的量以彌補流失的骨質，故OCN的量過高代表骨質流失的徵兆；而ALP活性亦為成骨細胞分化的重要生物指標，反映骨基質的成熟程度。分析結果呈現於第4A至4E圖。此外，由體內的左股骨(left femur)採樣的組織切片亦經由H&E染色。染色結果呈現於第4F圖。

此外，由第3D圖得知，雖管柱層析所得的產物樣本W401及W402在特定劑量均有促進細胞增生的功效，但W401的效果尤為突出，故將W401利用¹ H核磁共振(¹ H-NMR)及¹³ C核磁共振(¹³ C-NMR)分析其結構，分析結果如第5A至5B圖所示。

在用於對照上述實施例的一比較例中，將大葉骨碎補清洗後，浸入體積百分濃度95%的乙醇水溶液中萃取。接著，將取得的液相萃取液及固態殘渣藉由沉澱方式分離後減壓濃縮，以得到乙醇粗萃物，本文中稱之為萃取物E。將萃取物E藉由同前述的管柱層析方式進行分離，管柱的靜相、動相及其流速皆與前述相同。以DIAION-HP20管柱分離的產物根據收集順序由先至後命名為樣本E101、E102、E103及E104。接著，將樣本E103進一步以Sephadex LH-20管柱分離，得到的產物根據收集順序由先至後命名為樣本E201、E202、E203及E204

同樣地，將E202沉澱並結晶，過濾液體後得到乾燥結晶，其中將過濾所得的液體命名為樣本E301，乾燥結晶命名為樣本E302。接著，進一步將所取得的樣本E302以MCI-GEL CHP20分離，得到的產物根據收集順序由先至後 命名為樣本E401及E402。

最後，將收集之樣本E401作為乙醇精萃物，用於製備治療骨質疏鬆症藥物的用途，然而不僅限於此，上述所有層析收集的樣本皆可具有同樣的用途，選用樣本E401係因其具有較佳的效果。

在一實例中，將前述的樣本W401及樣本E401分別以αMEM培養基配置為濃度0、10、25、50及100 μg/mL之溶液，經過濾後加入培養MC3T3-E1細胞的培養盤中共培養0.5小時，並移除含有大葉骨碎補精萃物的培養基。接著，進行MTT細胞存活率分析，分析結果如第6圖所示。

施予樣本W401及樣本E401的MC3T3-E1細胞，更經由西方墨點法(western-blot)分析細胞內第一型膠原蛋白(collagen type-I，Col1)、鹼性磷酸酶(ALP)、骨塑型2蛋白(Bone Morphogenetic Protein 2，BMP2)及Runt相關轉錄因子二號(Runt-related transcription factor 2，RUNX-2)的表現量。分析結果如第7A至7F圖所示。

此外，施予樣本W401及樣本E401的MC3T3-E1細胞更藉由茜素红S(Alizarin red S)染色，以顯示細胞分泌的骨基質礦化的情形。染色照片如第8A圖所示，其量化結果如第8B圖所示。

以下，將藉由根據上述實例的測試所得之數據佐證本發明的大葉骨碎補精萃物用於製備促進成骨細胞增生的藥物的用途。

根據第3A圖所示，當施予層析所得的樣本W101~W104至MC3T3-E1細胞時，僅樣本W103的組別細胞存活率高於100%，亦即，樣本W103具有促進細胞生長的效果；根據第3B圖所示，當施予層析所得的樣本W201~W204至MC3T3-E1細胞時，僅樣本W202的組別細胞存活率高於100%，亦即，樣本W202具有促進細胞生長的效果；根據第3C圖所示，當施予結晶過程中的上清液W301及結晶W302至MC3T3-E1細胞時，樣本W301雖在10μg/mL的組別略高出100%，但W302的組別細胞存活率增加得更為明顯；根據第3D圖所示，樣本W401及W402皆顯著高於100%，顯示兩者皆有促進MC3T3-E1細胞生長的效果，其中又屬樣本W401具有更高的效果。此外，可明顯看出當施予過量大葉骨碎補的水精萃物時，細胞的存活率有下降的情形，藉由結果可找出樣本W401及W402較佳的施予劑量約在0.01~0.1μg/mL之間。*代表與控制組比較；#代表與其他組別比較。

根據第3E圖所示，樣本W401的MTT分析結果呈現最深的藍紫色，且樣本W103、W202及W302亦可由目測顏色明顯深於控制組，顯示此四個組別皆具有促進成骨細胞增生的效果。

根據第4A圖所示，16週後，未實行卵巢切除手術亦未施予萃取物的組別為控制組，其體重為25克；相較之下，實行卵巢切除手術但未施予萃取物的組別OVX的體重約為29克，此情形係由於切除卵巢而缺乏雌激素，導致內分泌失調，因而影響了調節脂肪代謝分化及脂肪細胞分布的效果，導致體重過正及肥胖，而此內分泌失調亦為造成骨質疏鬆症的原因之一；然而，施予高劑量(OVX+WH)及低劑量(OVX+WL)萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別，體重上升的情形明顯較為緩和，可見本發明的大葉骨碎補的水精萃物可降低缺乏雌激素所造成的傷害，其中亦可包含骨質疏鬆症的發生。*代表與控制組比較；#代表與其他組別比較。

為佐證降低缺乏雌激素所造成的傷害亦能降低骨質疏鬆症的可能性，第4B至4E圖分析血漿中與骨質疏鬆症相關的蛋白質及相關酵素的活性。第4B圖呈現各組別間骨鈣素的含量，其中實行卵巢切除手術的組別OVX具有的骨鈣素約為控制組的三分之一；然而，施予高劑量(OVX+WH)及低劑量(OVX+WL)萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別，骨鈣素不僅遠比組別OVX高，甚至高於控制組，顯示本發明的大葉骨碎補水精萃物可有效提升骨鈣素的含量；第4C圖呈現TNF-α的含量，由結果可見，實行卵巢切除手術的組別OVX的TNF-α量約為控制組的1.4倍，相較之下，施予高劑量(OVX+WH)及低劑量(OVX+WL)萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別，TNF-α量與控制組並無明顯差異，顯示本發明的大葉骨碎補的水精萃物可減少TNF-α量，進而避免骨質流失；第4D圖呈現IL-1β的含量， 其中實行卵巢切除手術的組別OVX具有的IL-1β約為控制組的四倍，相較之下施予高劑量(OVX+WH)及低劑量(OVX+WL)萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別IL-1β的含量甚至低於控制組，顯示本發明的大葉骨碎補的水精萃物可減少IL-1β量，進而避免破骨細胞大量生成；第4E圖呈現ALP的活性，其實行卵巢切除手術的組別OVX具有的IL-1β約為控制組的百分之六十，低於控制組及施予高劑量(OVX+WH)及低劑量(OVX+WL)萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別，萃取物W可促進骨母細胞於成熟過程(matrix maturation)中可大量合成鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)，其磷酸根離子會與鈣離子結合，沉積於骨細胞上，因此為骨母細胞分化的重要生物指標。*代表與控制組比較；#代表與其他組別比較。

第4F圖則呈現了小鼠體內的左股骨組織切片之H&E染色結果，照片中呈現白色空洞的部分係為骨質流失的結果。由結果可見，實行卵巢切除手術的組別OVX的空洞情形最為嚴重，而施予低劑量萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別(OVX+WL)雖然比控制組的空洞稍微增加，但遠比組別OVX的空洞更少。而施予高劑量萃取物W至實行了卵巢切除手術小鼠的組別(OVX+WH)則可看出空洞明顯少於其他組別，甚至比控制組更少。可見本發明的大葉骨碎補的水精萃物可有效降低骨質流失情形的發生。

第5A圖係為樣本W401的¹ H-NMR （DMSO-d ₆ , 400 MHz）圖譜，訊號包含：δ _H 6.86 （1H, d,J = 2.0 Hz, H-2'）, 6. 67 （1H, m, H-6'）, 6.59 （1H, d,J = 8.4 Hz, H-5'）, 5.87 （1H, d,J = 2.0 Hz, H-6）, 5.73 （1H, d,J = 2.4 Hz, H-8）, 5.13 （1H, d,J = 2.4 Hz, H-2）, 4.57 （1H, d,J = 7.6 Hz, H-1"）, 4.21 （1H, m, H-3）, 3.79-3.09 （6H, m, H-2", H-3", H-4", H-5", H-6"）, 2.68 （1H, dd,J = 16.4, 4.4 Hz, H-4）, 2.32 （1H, dd,J = 16.0, 7.2 Hz, H-4）；第5B圖係為樣本W401的¹³ C-NMR（DMSO-d ₆ , 100 MHz ）圖譜，訊號包含：δ _C 156.0 （C-7）, 156.2 （C-5）, 155.1 （C-8a）, 144.3 （C-4'）, 144.3 （C-3'）, 129.5 （C-1'）, 118.5 （C-6'）, 115.2 （C-2'）, 114.7 （C-5'）, 99.6 （C-1"）, 98.5 （C-4a）, 95.1 （C-8）, 94.0 （C-6）, 76.7 （C-2）, 74.4 （C-5"）, 72.4 （C-3）, 71.5 （C-3"）, 70.6 （C-2"）, 67.6 （C-4"）, 61.6 （C-6"）, 22.9 （C-4）。根據圖譜的解析結果，推斷樣本W401中之物質可為如式(1)所示的化合物CP。

第6圖係為施予樣本W401及樣本E401至MC3T3-E1細胞的MTT分析結果。由結果可見，樣本W401及E401的細胞存活率皆高於控制組，亦即兩者皆有促進細胞增生的功能。其中，樣本W401在濃度為50μg/mL以下的組別效果高於樣本E401，但在100μg/mL可能因作用過強而導致細胞毒性。相較之下，樣本E401可能因為作用較弱，以致於在100μg/mL還未產生細胞毒性，然而，樣本E401在濃度為100μg/mL時的作用仍小於樣本W401在濃度為50μg/mL時的作用。*代表與控制組比較；#代表與其他組別比較。

第7A圖係為施予樣本W401至MC3T3-E1細胞的西方墨點法分析結果，其中由於樣本W401在100μg/mL組別的細胞存活率過低，故未作分析。圖中結果顯示Col-1、ALP、BMP-2、及RUNX-2的表現量在施予不同濃度的樣本W401的組別相較於控制組皆有更強的訊號，且隨濃度而提升；第7B圖係為施予樣本E401至MC3T3-E1細胞的西方墨點法分析結果，雖然Col-1、ALP、BMP-2、及RUNX-2的表現量在施予不同濃度的樣本E401的組別相較於控制組雖亦有提升，但提昇幅度不如樣本W401。

西方墨點法分析的訊號量化結果如第7C至7F圖所示。第7C圖係為Col-1訊號的量化結果，顯示樣本W401的組別Col-1的訊號在50μg/mL組的訊號達到最高，約為控制組的240%，然而樣本E401的組別最高僅達到控制組的約120%；第7D圖係為ALP訊號的量化結果，顯示樣本W401的組別ALP的訊號在50μg/mL組的訊號達到最高，約為控制組的175%，而樣本E401的組別在100μg/mL組的訊號達到最高，約為控制組的150%；第7E圖係為BMP-2訊號的量化結果，顯示樣本W401的組別BMP-2的訊號在50μg/mL組的訊號達到最高，約為控制組的240%，然而樣本E401的組別最高僅達到控制組的約140%；第7F圖係為RUNX-2訊號的量化結果，顯示樣本W401的組別RUNX-2的訊號在50μg/mL組的訊號達到最高，約為控制組的210%，而樣本E401的組別最高僅達到控制組的約120%。由於上述分析的因子皆具有促進成骨細胞增生的效果，根據結果可推知出樣本W401相較於樣本E401具有更佳的促進成骨細胞增生的效果，適合用於製備治療促進成骨細胞增生的藥物的用途。

第8A及8B圖呈現施予樣本W401及樣本E401的MC3T3-E1細胞並藉由茜素红S(Alizarin red S)染色的結果，用以顯示細胞礦化的情形。在第8A圖的顯微鏡照片中，紅色越深的部分代表礦化情形越多。樣本W401及E401的組別皆可觀察到紅色隨施予濃度增加的而變深的情形，代表樣本W401及E401皆有促進鈣化的效果；第8B圖係第8A圖鈣化部分的量化圖，顯示礦化效果確實隨施予的樣本量而上升，且樣本W401的效果於50μg/mL組時遠高於樣本E401的效果，甚至高於樣本E401於100μg/mL組時的效果。

以上實例所得的結果皆證實本發明之大葉骨碎補精萃物具有抑制骨質流失、促進成骨細胞增生、抑制骨質疏鬆相關蛋白質、以及增強鈣化的效果。其中更以比較例證實本發明使用水萃取所得到之水精萃物比習知技術使用之乙醇精萃物具有更佳的效果。

雖然本發明已以上述實施例及實例具體描述本發明的大葉骨碎補精萃物及其製造方法，然而具本發明所屬技術領域之通常知識者應理解，可在不違背本發明之技術原理及精神下，對實施例作修改與變化。因此本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所述。

S11、S12、S13、S14、S15‧‧‧製備步驟

S21、S22、S23、S24‧‧‧分離步驟

W、E‧‧‧萃取物

F101、F102、F103、F104、F201、F202、F203、F204、F401、F402‧‧‧分部

F301‧‧‧上清液

F302‧‧‧結晶

W101、W102、W103、W104、W201、W202、W203、W204、W301、W302、W401、W402、E101、E102、E103、E104、E201、E202、E203、E204、E301、E302、E401、E402‧‧‧樣本

第1圖呈現本發明的一實施例中大葉骨碎補萃取物的製備流程圖。

第2圖呈現本發明的一實施例中大葉骨碎補萃取物的分離流程及流程中各步驟所取得的樣本。

第3A至3D圖呈現本發明的一實例中所取得的樣本施予至MC3T3-E1細胞的存活率；第3E圖係呈現MTT分析結果照片。

第4A圖呈現本發明的一實例中小鼠的體重；第4B圖呈現體內OCN含量；第4C圖呈現體內TNF-α含量；第4D圖呈現體內IL-1β含量；第4E圖呈現體內ALP活性；第4F圖呈現H&E染色結果。

第5A圖呈現本發明的一實例中的樣本之¹ H-NMR圖譜；第5B圖呈現¹³ C-NMR圖譜。

第6圖呈現本發明的一實例中施予樣本至MC3T3-E1細胞中的細胞增生情形。

第7A至7B圖呈現本發明的一實例中施予樣本至MC3T3-E1細胞中後相關蛋白質的表現量經西方墨點法的分析結果；第7C至7F圖呈現其量化結果。

第8A圖呈現本發明的一實例中施予樣本至MC3T3-E1細胞中後經茜素红S染色而呈色的鈣化情形；第8B圖係其量化結果。

Claims (6)

1. 一種萃取大葉骨碎補的方法，其包含： 以水萃取一大葉骨碎補，以得到一粗萃物； 分離該粗萃物，其中： 藉由一第一管柱層析該粗萃物，以得到一第一層析物，該第一層析物依收集順序分為一第一層析甲分部、一第一層析乙分部、一第一層析丙分部及一第一層析丁分部； 藉由一第二管柱層析該第一層析丙分部，以得到一第二層析物，該第二層析物依收集順序分為一第二層析甲分部、一第二層析乙分部、一第二層析丙分部及一第二層析丁分部； 藉由一第三管柱層析該第二層析乙分部，以得到一第三層析物，該第三層析物依收集順序分為一第三層析甲分部及一第三層析乙分部；以及 取該第三層析甲分部作為一精萃物。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第一管柱、該第二管柱及該第三管柱所使用之動相係為包含甲醇及水的一梯度動相。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中以水萃取該大葉骨碎補時，該大葉骨碎補相對於水的重量比為1:1~5。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中： 該第一層析甲分部、該第一層析乙分部、該第一層析丙分部及該第一層析丁分部具有相同體積； 該第二層析甲分部、該第二層析乙分部、該第二層析丙分部及該第二層析丁分部具有相同體積；以及 該第三層析甲分部及該第三層析乙分部具有相同體積。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包括使該第二層析乙分部形成一結晶，再以該第三管柱層析該結晶。
6. 一種大葉骨碎補的精萃物，其包含由申請專利範圍第1至5項中任一項所述之方法所製得之該第三層析甲分部。