TW201843180A

TW201843180A - 具有肌營養不良蛋白聚糖和層黏連結蛋白－２特異性的多特異性結合分子

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Publication number: TW201843180A
Application number: TW107106046A
Authority: TW
Inventors: 克里斯汀比爾; 威廉布榮迪克; 揚德陳; 承興鄭; 堤莫西康諾斯; 凱瑟琳德佛; 迪特馬爾霍夫曼; 克里斯汀朗格; 莫瑞恩馬格內; 特里斯坦馬格內; 凱瑟琳普拉德; 埃爾科萊羅歐; 蕾拉塞維尼; 蓉魏; 趙紅梅; 云祥朱
Original assignee: 法商賽諾菲公司
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2018-02-21
Publication date: 2018-12-16
Also published as: US10626169B2; US20180237511A1; WO2018151841A1; WO2018151841A9; WO2018151841A8

Abstract

本文中提供了多特異性(例如雙特異性)結合分子，其包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域。本文中還提供了製造這種結合分子的方法以及這種結合分子用於治療和/或預防α-肌營養不良蛋白聚糖病的用途。

Description

具有肌營養不良蛋白聚糖和層黏連蛋白-2特異性的多特異性結合分子

相關申請的交叉引用

本申請請求於2017年2月17日申請的美國臨時申請流水號62/460,663和2018年2月16日申請的歐洲申請號EP18305168.9的優先權權益，將其藉由以參考方式完整併入本文。

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本公開涉及多特異性(例如多特異性和三價的，或雙特異性和二價的或四價的)結合分子，其包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域。本公開還涉及製造這種結合分子的方法以及這種結合分子用於治療和/或預防α-肌營養不良蛋白聚糖病的用途。

α-肌營養不良蛋白聚糖病是一種先天性肌營養不良症(CMD)的亞類，其特徵為在α-肌營養不良蛋白聚糖(α-DG)中的黏蛋白樣結構域中的O-糖基化減少或缺乏(Muntoni,F.(2004)Acta.Myol.23(2),79-84；Toda,T.(2005) Rinsho Shinkeigaku 45(11),932-934；Muntoni,F.等人，(2007)Acta.Myol.26(3),129-135；Hewitt,J.E.(2009).Biochim.Biophys.Acta.1792(9),853-861；Godfrey,C.等人，(2011)Curr.Opin.Genet.Dev.21(3),278-285)。α-肌營養不良蛋白聚糖的缺乏或低糖基化導致其配體結合的喪失或減少，所述配體包括骨骼肌中的層黏連蛋白-2、聚集蛋白和基底膜蛋白聚糖，腦中的軸突蛋白和眼中的皮卡丘素。α-肌營養不良蛋白聚糖是所有肌肉和心臟共有的肌營養不良蛋白-糖蛋白複合物(DGC)(圖1A)的外周膜成分(Matsumura,K.等人，(1993)Neuromuscul.Disord.3(5-6),533-535)。在這些組織中，DGC複合物通過肌營養不良蛋白起作用而使肌纖維的絲狀肌動蛋白(F-肌動蛋白)相關細胞骨架經由層黏連蛋白-2與細胞外基質(ECM，也稱為基膜)連接(圖1B)。

在α-肌營養不良蛋白聚糖病中，在迄今為止鑑定的至少18個基因中的突變與α-DG上的O-糖基化的異常加工以及與其配體的結合缺乏相關，從而導致疾病。參見，例如Hara,Y.等人，(2011)N.Engl.J.Med.364(10),939-946；Kim,D.S.等人，(2004)Neurology 62(6),1009-1011；van Reeuwijk,J.等人，(2005)J.Med.Genet.42(12),907-912；Murakami,T.等人，(2009)Brain Dev.31(6),465-468；Yanagisawa,A.等人，(2009)Eur.J.Med.Genet.52(4),201-206；Clement,E.M.等人，(2008)Arch.Neurol.65(1),137-141；Endo,T.等人，(2010)Methods Enzymol.479,343-352；Saredi,S.等人，(2012)J.Neurol.Sci.318(1-2),45-50；Longman,C.等人，(2003)Hum.Mol.Genet.12(21),2853-2861；Lefeber,D.J.等人，(2009)Am.J.Hum.Genet.85(1),76-86；Barone,R.等人，(2012)Ann.Neurol.72(4),550-558；Toda,T.等人，(2003)Congenit.Anom.(Kyoto)43(2),97-104；Toda,T.(2007)Rinsho Shinkeigaku 47(11),743-748；Puckett,R.L.等人，(2009)Neuromuscul. Disord.19(5),352-356；Toda,T.(2009)Rinsho Shinkeigaku 49(11),859-862；Yamamoto,T.等人，(2010)Cent.Nerv.Syst.Agents.Med.Chem.10(2),169-179；Kanagawa,M.等人，(2016)Cell.Rep.14(9),2209-2223；Yoshida-Moriguchi,T.等人，(2013)Science 341(6148),896-899)。這些基因包括例如許多糖基轉移酶，如LARGE，其編碼負責將木糖-葡糖醛酸重複添加至聚糖以促進配體結合的木糖基和葡糖醛酸基-雙轉移酶(Inamori,K.等人，(2012)Science 335(6064),93-96；Longman,C.等人，(2003)Hum.Mol.Genet.12(21),2853-2861)。糖基轉移酶(例如LARGE)在這個途徑中的主要生物學功能是正確裝配在α-DG中的黏蛋白樣結構域中的O-糖基化，其對於緊密結合肌肉基膜中的層黏連蛋白-2、神經肌肉連接子中的聚集蛋白和基底膜蛋白聚糖、中樞神經系統中的軸突蛋白和眼中的皮卡丘素是必需的(Michele,D.E.等人，(2002)Nature 418(6896),417-422；Muntoni,F.等人，(2002)Lancet 360(9343),1419-1421)。在由於上述任何基因的缺陷而缺乏適當的O-糖基化的情況下，α-DG與細胞外基質(ECM)中的層黏連蛋白-2的結合受損或喪失(圖1C)，從而導致肌膜完整性所必需的機械連接的破壞。這使得肌肉容易受到收縮誘導的損傷，導致肌纖維的肌膜損傷和隨之而來的肌營養不良(Barresi,R.和Campbell.K.P.(2006)J.Cell.Sci.119,199-207)。

由於遺傳異質性，α-肌營養不良蛋白聚糖病包括許多疾病亞型，其顯示出從具有中樞神經系統(CNS)和眼睛異常的非常嚴重的肌營養不良到沒有CNS表現或眼睛問題的相對輕微的肌營養不良表型的多樣而重疊的臨床表現。在不同亞型的α-肌營養不良蛋白聚糖病之間沒有嚴格的遺傳和表型相關。一個基因的突變可能引起具有重疊的臨床表現的不同疾病亞型，不同基因的突變可以導致相同或相似的疾病(Godfrey,C.等人，(2007)Brain 130,2725-2735)。由於這種異質性，由個體基因突變引起的個體α-肌營養不良蛋白聚糖病的治療策略對於藥物開發因為成本效益低而不具有吸引力。

α-肌營養不良蛋白聚糖和β-肌營養不良蛋白聚糖由相同的基因DAG1編碼，並從單個mRNA轉譯為完整的1型跨膜蛋白，即肌營養不良蛋白聚糖。在到達細胞表面的途徑中，肌營養不良蛋白聚糖被蛋白水解切割而產生跨膜骨架(stud)β-肌營養不良蛋白聚糖和非共價結合的α-肌營養不良蛋白聚糖(Holt,K.H.等人，(2000)FEBS Lett.468(1),79-83)。理論上已經提出具有適當O-糖基化的重組α-肌營養不良蛋白聚糖作為α-肌營養不良蛋白聚糖病的蛋白替代療法。然而，重組α-肌營養不良蛋白聚糖的全身性遞送表明，這種蛋白未能到達肌間質間隙而後摻入到肌膜上(Han,R.等人，(2009)PNAS 106(31),12573-12579)。因此，使用重組α-肌營養不良蛋白聚糖作為α-肌營養不良蛋白聚糖病的蛋白替代療法在技術上被認為是不切實際的。

因此，對於預防和/或治療α-肌營養不良蛋白聚糖病及其相關病狀的治療分子存在著需要。

本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請案、專利公開案和UniProtKB/Swiss-Prot登錄號在內，均藉由參考方式完整併入本文，如同具體地和單獨地明示將單獨的參考文獻藉由參考方式併入本文一樣。

為了滿足這種及其他需要，本文中特別提供了可以同時與層黏連蛋白-2和肌營養不良蛋白聚糖結合的多特異性和雙特異性結合分子(例如雙特異性抗體)以及雙功能生物製品。當將這種多特異性/雙特異性抗體或雙功能生物製品給予患有α-肌營養不良蛋白聚糖病的患者時，其與基膜中的層黏連蛋白-2和肌膜上的肌營養不良蛋白聚糖(α-或β-)的同時結合可以使喪失的連接恢復(圖1D和1E)。本揭示證明，這種方法可以改善體內動物模型系統中α-肌營養不良蛋白聚糖病的特徵症狀。具體而言，已知抗體由於其與介導抗體再迴圈的新生兒Fc受體的結合而在體內具有延長的迴圈半衰期(長的藥代動力學)。因此，這種多特異性/雙特異性抗體策略(或者雙功能生物製品策略)代表治療α-肌營養不良蛋白聚糖病的新型治療方法。

在一些實施方案中，本揭示提供了包含至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和至少一個結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域的多特異性結合分子。在一些實施方案中，多特異性結合分子是包含一個或多個多肽鏈的多特異性結合蛋白。

在一些實施方案中，多特異性結合分子是包含三個抗原結合位點的多特異性三價結合蛋白。在一些具體實例中，結合蛋白包含四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I]並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [II]並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：V_H3-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [III]並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：V_L3-C_L [IV]其中：V_L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域； C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重鏈恒定結構域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重鏈恒定結構域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C_H1和C_H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L₁、L₂、L₃和L₄是胺基酸連接子；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且其中V_H1和V_L1形成抗原結合位點，其中V_H2和V_L2形成抗原結合位點，並且其中V_H3和V_L3形成抗原結合位點，總共三個抗原結合位點，並且其中所述三個抗原結合位點包括至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點。

在一些具體實例中，多特異性結合分子包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的一個抗原結合位點和結合層黏連蛋白-2的兩個抗原結合位點。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的兩個抗原結合位點結合層黏連蛋白-2的不同表位。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的兩個抗原結合位點結合層黏連蛋白-2的相同表位。在一些具體實例中，V_H1和V_L1形成結合層黏連蛋白-2的第一抗原結合位點，V_H2和V_L2形成結合層黏連蛋白-2的第二抗原結合位點，並且V_H3和V_L3形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第三抗原結合位點。

在一些具體實例中，多特異性結合分子包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的兩個抗原結合位點和結合層黏連蛋白-2的一個抗原結合位點。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的兩個抗原結合位點結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的不同表位。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的兩個抗原結合位點結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的相同表位。在一些具體實例中，V_H1和V_L1形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一抗原結合位點，V_H2和V_L2形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第二抗原結合位點，並且V_H3和V_L3形成結合層黏連蛋白-2的第三抗原結合位點。

在一些具體實例中，當作為多特異性結合蛋白的一部分測定時，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點以低於約1μM的平衡解離常數(K_D)結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點結合β-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點結合α-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。

在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，當作為多特異性結合蛋白的一部分測定時，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點以低於約1μM的平衡解離常數(K_D)結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合小鼠和人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：300)的多肽。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。

在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的序列；並且結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的序列。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：314；並且結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：346；並且結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：362。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含表A2、D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含表A2、D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含表D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9 VH結構域的序列；並且結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含表D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9 VL結構域的序列。

在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含選自SEQ ID NO：51-55和81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60和96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65和111-125的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含選自SEQ ID NO：66-70和126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38、71-75和141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80和155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含選自下組的序列：SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228；並且結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含選自下組的序列：SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的 CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：378；並且結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：394。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：410；並且結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：426。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：442；並且結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VL 結構域包含序列SEQ ID NO：458。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：474；並且結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：490。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含表A2、D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含表A2、D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VH結構域包含表D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21 VH結構域的序列；並且結合層黏連蛋白-2的至少一個抗原結合位元點的VL結構域包含表D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21 VL結構域的序列。

在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：378，V_L1包含序列SEQ ID NO：394；V_H2包含序列SEQ ID NO：378，V_L2包含序列SEQ ID NO：394；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：378，V_L1包含序列SEQ ID NO：394；V_H2包含序列SEQ ID NO：442，V_L2包含序列SEQ ID NO：458；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：428的 CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：410，V_L1包含序列SEQ ID NO：426；V_H2包含序列SEQ ID NO：474，V_L2包含序列SEQ ID NO：490；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：442，V_L1包含序列SEQ ID NO：458；V_H2包含序列SEQ ID NO：410，V_L2包含序列SEQ ID NO：426；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：474，V_L1包含序列SEQ ID NO：490；V_H2包含序列SEQ ID NO：378，V_L2包含序列SEQ ID NO：394；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。

在任何上述具體實例的一些具體實例中，L₁和L₂包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。在一些具體實例中，L₃和L₄包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。在一些具體實例中，L₁、L₂、L₃和L₄包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。

在任何上述具體實例的一些具體實例中，第二多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含胺基酸取代，其中胺基酸取代是S354C和T366W；並且其中第三多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些具體實例中，第二多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人 IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中第三多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含胺基酸取代，其中胺基酸取代是S354C和T366W。在一些具體實例中，第二和第三多肽鏈的C_H3結構域是人IgG1或IgG4 C_H3結構域，並且其中僅一個C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置包含胺基酸取代，其中胺基酸取代是H435R和Y436F。在一些具體實例中，第二和第三多肽鏈的C_H2結構域是人IgG1或IgG4 C_H2結構域，其包含根據EU索引編號的第297位元的天冬醯胺殘基、第298位的天冬醯胺殘基、第299位的丙胺酸殘基和第300位的絲胺酸或蘇胺酸殘基。在一些具體實例中，第二和第三多肽鏈的C_H2結構域是人IgG1或IgG4 C_H2結構域，其包含根據EU索引編號的第252位元的酪胺酸殘基、第254位的蘇胺酸殘基和第256位的谷胺酸殘基。

在一些具體實例中，第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：500，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：498，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：499，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：501。在一些具體實例中，第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：504，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：502，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：503，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：505。在一些具體實例中，第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：508，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：506，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：507，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：509。在一些具體實例中，第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：512，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：510，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：511，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：513。在一些具體實例中，第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：516，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：514，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：515，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：517。在一些具體實例中，如表I2或I4所示，結合蛋白包含triAb 3407、3423、3429、3437或3439的1、2、3或4個多肽。

在一些具體實例中，結合蛋白包含(a)包含第一重鏈可變(VH)結構域和包含第一C_H3區的免疫球蛋白的第一Fc區的第一抗體重鏈、以及包含第一輕鏈可變(VL)結構域的第一抗體輕鏈，其中所述第一VH和VL結構域形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一抗原結合結構域，和(b)包含第二重鏈可變(VH)結構域和包含第二C_H3區的免疫球蛋白的第二Fc區的第二抗體重鏈、以及包含第二輕鏈可變(VL)結構域的第二抗體輕鏈，其中所述第二VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的第二抗原結合結構域；其中所述第一和第二C_H3區的序列是不同的，並且使得所述第一和第二C_H3區之間的異二聚體相互作用比所述第一和第二C_H3區各自的同二聚體相互作用更強，並且其中所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有除了Lys、Leu或Met以外的胺基酸，並且所述第二同二聚體蛋白在選自366、368、370、399、405和407的位置處具有胺基酸取代和/或其中所述第一和第二C_H3區的序列使得所述C_H3區各自的同二聚體相互作用的解離常數在0.01和10微莫耳之間。在一些具體實例中，第一抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：518，其中第二抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：519，其中第一抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO：520，並且其中第二抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO：521。在一些具體實例中，結合蛋白包含AS30_Hu6 x C3_Hu10 Duobody、AS30_Hu6 x C21_Hu11 Duetmab、AS30_Hu6 x C3_Hu10 TBTI、AS30_Hu6 x C21_Hu11 TBTI、AS30_Hu9 x C3_Hu11 CODV或AS30_Hu9 x C21_Hu21 CODV中的1、2、3或4個多肽，如表I3或I4中所示。

本文中進一步提供了分離的核酸分子，其包含編碼上述任一具體實例的多特異性結合分子的核苷酸序列。還提供了包含表G2或I4的核苷酸序列的分離的核酸分子。還提供了包含上述任一具體實例的核酸分子之表現載體。還提供了包含上述任一具體實例的核酸分子或表現載體的宿主細胞(例如分離的宿主細胞)。還提供了載體系統，其包含編碼上述任一具體實例的多特異性結合分子的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一個或多個載體。還提供了包含上述任一具體實例的載體系統的宿主細胞(例如分離的宿主細胞)。還提供了產生多特異性結合分子的方法，所述方法包括：在使得宿主細胞表現多特異性結合分子的條件下培養上述任一具體實例的宿主細胞；並且從宿主細胞分離多特異性結合分子。

本文中進一步提供了用於治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向個體施用上述任一具體實例的多特異性結合分子。本文中還提供了用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的方法，所述方法包括向個體施用上述任一具體實例的多特異性結合分子。本文中還提供了上述任一具體實例的多特異性結合分子用於治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病的用途。本文中還提供了上述任一具體實例的多特異性結合分子在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的用途。本文中還提供了上述任一具體實例的多特異性結合分子在製造用於治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病的藥劑中的用途。本文中還提供了上述任一具體實例的多特異性結合分子在製造用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的藥劑中的用途。

在任何上述具體實例的一些具體實例中，所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。在一些具體實例中，所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。在一些具體實例中，所述個體具有在選自以下組的基因中的突變：肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些具體實例中，通過靜脈內輸注施用多特異性結合分子。在一些具體實例中，通過肌內、腹膜內或皮下注射施用多特異性結合分子。在一些具體實例中，所述個體是人。

本文中進一步提供了包含上述任一具體實例的多特異性結合分子和藥學上可接受的載劑的藥學組合物。還提供了在治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病中使用的包含上述任一具體實例的多特異性結合分子和說明書的套組。在一些具體實例中，所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。在一些具體實例中，所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。在一些具體實例中，所述個體具有在選自以下組的基因中的突變：肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些具體實例中，所述個體是人。

本文中進一步提供了結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗體，其中所述抗體包含：(a)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的胺基酸序列；並且VL結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的胺基酸序列。在一些具體實例中，抗體包含表A2、D2或I4中所示結合結構域的1、2、3、4、5或6個CDR序列，或表D2或I4中所示結合結構域的VH和/或VL結構域序列，或由表G2中所示多核苷酸序列編碼。

本文中進一步提供了結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗體，其中所述抗體包含：(a)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3；和(b)包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：314，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：330；或VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：346，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：362。在一些具體實例中，抗體包含表A2、D2或I4中所示結合結構域的1、2、3、4、5或6個CDR序列，或表D2或I4中所示結合結構域的VH和/或VL結構域序列，或由表G2中所示多核苷酸序列編碼。

本文中進一步提供了結合層黏連蛋白-2的抗體，其中所述抗體包含：(a)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含包含選自SEQ ID NO：51-55和81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60和96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65和111-125的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含選自SEQ ID NO：66-70和126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38、71-75和141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80和155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含選自SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的胺基酸序列；並且VL域包含選自SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的胺基酸序列。在一些具體實例中，抗體包含表A2、D2或I4中所示結合結構域的1、2、3、4、5或6個CDR序列，或表D2或I4中所示結合結構域的VH和/或VL結構域序列，或由表G2中所示多核苷酸序列編碼。

本文中進一步提供了結合層黏連蛋白-2的抗體，其中所述抗體包含： (a1)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；(b)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；(c)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；或(d)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。在一些具體實例中，(a)VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：378，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：394；(b)VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：410，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：426；(c)VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：442，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：458；或 (d)VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：474，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：490。在一些具體實例中，抗體包含表A2、D2或I4中所示結合結構域的1、2、3、4、5或6個CDR序列，或表D2或I4中所示結合結構域的VH和/或VL結構域序列，或由表G2中所示多核苷酸序列編碼。

本文中進一步提供了包含編碼上述任一具體實例的抗體的核苷酸序列之分離的核酸分子。還提供了包含上述任一具體實例的核酸分子的表現載體。還提供了包含上述任一具體實例的核酸分子或表現載體的宿主細胞(例如分離的宿主細胞)。還提供了產生抗體的方法，所述方法包括：在使得宿主細胞表現抗體的條件下培養上述任一具體實例的宿主細胞；並且從宿主細胞分離抗體。

在一個具體實例中，本揭示提供了雙特異性結合分子，其包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域。在一些具體實例中，雙特異性結合分子是包含一個或多個多肽鏈的雙特異性結合蛋白。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子是包含兩個或四個抗原結合位點的雙特異性二價或四價結合蛋白。在一些具體實例中，雙特異性結合蛋白包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域，其中所述第一結合結構域包含第一免疫球蛋白重鏈可變結構域(V_H1)和第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域(V_L1)，其中所述第二結合結構域包含第二免疫球蛋白重鏈可變結構域(V_H2)和第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域(V_L2)。在一些具體實例中，V_H1結構域包含表A中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列和/或V_L1結構域包含表A中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列。在一些具體實例中，V_H2結構域包含表B或表C中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列和/或V_L2結構域包含表B或表C中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含由下式表示的結構：V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L [I]並且兩條多肽鏈包含由下式表示的結構：V_H2-L₃-V_H1-L₄-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [II]其中：V_L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重鏈恒定結構域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重鏈恒定結構域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C_H1和C_H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L₁、L₂、L₃和L₄是胺基酸連接子；其中V_H1和V_L1結構域形成V_H1/V_L1結合對，並且其中V_H2和V_L2結構域形成V_H2/V_L2結合對。

在一些具體實例中，V_H1和V_L1結構域交叉以形成V_H1/V_L1結合對。在一些具體實例中，V_H2和V_L2結構域交叉以形成V_H2/V_L2結合對。在一些具體實例中，L₁、L₂、L₃和L₄的長度各自為0至50個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁、L₂、L₃和L₄的長度各自為0至25個胺基酸殘基。在一些具體實例中， L₁、L₂、L₃和L₄的長度各自為0至14個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁的長度為5個胺基酸殘基；L₂的長度為5個胺基酸殘基；L₃的長度為5個胺基酸殘基；並且L₄的長度為5個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁的長度為14個胺基酸殘基；L₂的長度為2個胺基酸殘基；L₃的長度為14個胺基酸殘基；並且L₄的長度為2個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁和L₃各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：296)，並且其中L₂和L₄各自包含序列GG。在一些具體實例中，L₁的長度為7個胺基酸殘基；L₂的長度為5個胺基酸殘基；L₃的長度為1個胺基酸殘基；並且L₄的長度為2個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：297)；L₂包含序列TKGPS(SEQ ID NO：298)；L₃包含絲胺酸殘基；並且L₄包含序列RT。在一些具體實例中，L₁的長度為10個胺基酸殘基；L₂的長度為10個胺基酸殘基；L₃的長度為0個胺基酸殘基；並且L₄的長度為0個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁和L₂各自包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：299)。在一些具體實例中，式I和/或式II的多肽的兩個可變結構域之一或兩者是人的、人源化的或小鼠的可變結構域。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含兩條包含由下式表示的結構的輕鏈：V_L1-L₅-V_L2-L₆-C_L [III]和兩條包含由下式表示的結構的重鏈：V_H1-L₇-V_H2-L₈-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [IV]其中：V_L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域； V_H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重鏈恒定結構域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重鏈恒定結構域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C_H1和C_H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L₅、L₆、L₇和L₈是胺基酸連接子；其中V_H1和V_L1結構域形成V_H1/V_L1結合對，並且其中V_H2和V_L2結構域形成V_H2/V_L2結合對。

在一些具體實例中，L₅、L₆、L₇和L₈的長度各自為0至50個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₅、L₆、L₇和L₈的長度各自為0至25個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₅、L₆、L₇和L₈的長度各自為0至14個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₅和L₇連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：294)，並且其中L₆和L₈連接子的長度各自為0個胺基酸殘基。在一些具體實例中，式III和/或式IV的多肽的兩個可變結構域之一或兩者是人的、人源化的或小鼠的可變結構域。

在任何上述具體實例的一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且其中V_H2/V_L2結合對結合層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對以小於約1μM的平衡解離常數(K_D)結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合β-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合α-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對以小於約1μM的平衡解離常數(K_D)結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合小鼠和人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：300)的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。

在一些具體實例中，V_H1結構域包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L1結構域包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L1結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H1結構域由選自SEQ ID NO：230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L1結構域由選自SEQ ID NO：231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：51-55和81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60和96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65和111-125的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：66-70和126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38、71-75和141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80和155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列編碼。

在任何上述具體實例的一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合層黏連蛋白-2，並且其中V_H2/V_L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對以小於約1μM的平衡解離常數(K_D)結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合β-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。在一些具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合α-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對以小於約1μM的平衡解離常數(K_D)結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合小鼠和人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含序列 QPVSCPTT(SEQ ID NO：300)的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。

在一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_H1結構域包含包含選自SEQ ID NO：51-55和81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60和96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65和111-125的胺基酸序列的 CDR-H3；和/或其中V_L1結構域包含包含選自SEQ ID NO：66-70和126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38、71-75和141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80和155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列編碼。

在一個具體實例中，本揭示提供了分離的核酸分子，其包含編碼根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子的核苷酸序列。在一個具體實例中，本揭示提供了表現載體，其包含編碼根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子的核苷酸序列。在一個具體實例中，本揭示提供了分離的宿主細胞，其包含編碼根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子的核苷酸序列或包含包含編碼根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子的核苷酸序列的表現載體。在一個具體實例中，本揭示提供了包含編碼根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一個或多個載體的載體系統。在一個具體實例中，本揭示提供了載體系統，其包含編碼根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子的兩條輕鏈和兩條重鏈的一個或多個載體。在一個具體實例中，本揭示提供了包含根據上述任一具體實例的載體系統之分離的宿主細胞。

在一個具體實例中，本揭示提供了產生雙特異性結合分子的方法，所述方法包括：a)在使得宿主細胞表現雙特異性結合分子的條件下培養根據上述任一具體實例的宿主細胞；並且b)從宿主細胞分離雙特異性結合分子。在一個具體實例中，本公開提供了產生雙特異性結合蛋白的方法，所述雙特異性結合蛋白包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域，所述方法包括：a)在這樣的條件下培養包含編碼包含第一結合結構域的第一多肽鏈的核酸分子的第一宿主細胞，使得宿主細胞表現作為具有第一CH3結構域的第一單特異性結合蛋白的一部分的所述第一多肽鏈；b)在這樣的條件下培養包含編碼包含第二結合結構域的第二多肽鏈的核酸分子的第二宿主細胞，使得宿主細胞表現作為具有第二CH3結構域的第二單特異性結合蛋白的一部分的所述第二多肽鏈；c)從第一宿主細胞分離第一單特異性結合蛋白；d)從第二宿主細胞分離第二單特異性結合蛋白；e)在足以使鉸鏈區中的半胱胺酸發生二硫鍵異構化的還原條件下溫育分離的第一和第二單特異性結合蛋白；和f)獲得雙特異性結合蛋白，其中第一和第二CH3結構域是不同的並且使得所述第一和第二CH3結構域之間的異二聚體相互作用比所述第一和第二CH3結構域各自的同二聚體相互作用更強。

在一個具體實例中，本揭示提供了用於治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向個體施用根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子。在一個具體實例中，本揭示提供了用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的方法，所述方法包括向個體施用根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子。在一些具體實例中，所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。在一些具體實例中，所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。在一些具體實例中，所述個體具有在選自以下組的基因中的突變：肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些具體實例中，藉由靜脈內輸注施用雙特異性結合分子。在一些具體實例中，藉由肌內、腹膜內或皮下注射施用雙特異性結合分子。在一些具體實例中，所述個體是人。

在一個具體實例中，本揭示提供了藥學組合物，其包含根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子和藥學上可接受的載劑藥學組合物。在一個具體實例中，本揭示提供了在治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病中使用的包含根據上述任一具體實例的雙特異性結合分子和說明書的套組。在一些具體實例中，所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。在一些具體實例中，所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。在一些具體實例中，所述個體具有在選自以下組的基因中的突變：肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖 β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些具體實例中，所述個體是人。

根據以下對某些具體實例和權利要求的更詳細描述，本發明的具體具體實例將變得明顯。

應該理解，可以組合本文所述的各種具體實例的一個、一些或全部特性以形成本發明的其他具體實例。。本發明的這些和其他方面對於本領域的技術人員將變得顯而易見。

圖1A和1B顯示了肌營養不良蛋白相關糖蛋白複合物的正常蛋白質相互作用和功能。α-肌營養不良蛋白聚糖的黏蛋白樣結構域中的O-連接聚糖用作幾種配體的受體，所述配體包括肌肉中的層黏連蛋白-2。圖1A顯示了肌營養不良蛋白相關糖蛋白複合物，其中肌營養不良蛋白聚糖的O-糖基化正常。圖1B顯示了與O-糖基化的α-肌營養不良蛋白聚糖相互作用的基膜中的層黏連蛋白-2。β-肌營養不良蛋白聚糖與肌營養不良蛋白相互作用，進而與細胞膜內的絲狀肌動蛋白結合。

圖1C顯示了α-肌營養不良蛋白聚糖病的病因學。在α-肌營養不良蛋白聚糖上不存在O-連接糖基化的情況下，層黏連蛋白-2和α-肌營養不良蛋白聚糖的結合喪失，導致基膜從肌肉的肌膜脫離並導致在運動過程中的膜損傷和肌營養不良。

圖1D和1E顯示了採用多特異性或雙特異性抗體治療α-肌營養不良蛋白聚糖病的策略。雙特異性和多特異性抗體以一個或多個臂特異性地識別和結合層黏連蛋白-2並且以一個或多個其他的臂特異性地識別和結合α-肌營養不良蛋白聚糖(圖1D)或β-肌營養不良蛋白聚糖(圖1E)，從而恢復層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖之間的連接，以便治療α-肌營養不良蛋白聚糖病。

圖2A顯示了人和小鼠層黏連蛋白球形(LG)-4/5結構域的序列比對。人和小鼠LG-5的蛋白質序列具有顯著的同源性，具有88%的同一性。人和鼠層黏連蛋白-2的α-2亞基中的加框序列用於蛋白質表現和抗體產生。顯示了SEQ ID NO：305(上)和300(下)。圖2B顯示了人和小鼠β-肌營養不良蛋白聚糖(DG)細胞外結構域的序列比對。人和小鼠β-DG細胞外結構域的蛋白質序列是具有88.4%同一性的同源物。人和鼠β-DG中的加框序列用於蛋白質表現和抗體產生。顯示了SEQ ID NO：303(上)和304(下)。

圖3A和3B顯示了與人(圖3A)和小鼠(圖3B)LG-4/5結合的衍生自融合瘤選殖體C21的抗層黏連蛋白-2抗體的表面等離振子共振(Biacore；GE Healthcare)動力學測定資料。

圖3C顯示了與HEK293細胞上表現的人和小鼠LG-4/5結合的衍生自融合瘤選殖體C21的抗層黏連蛋白-2抗體的螢光啟動細胞分選(FACS)分析。

圖3D顯示了關於將不同量的重組人層黏連蛋白-2、鼠LG-5(mLG5)、人LG-5(hLG5)和人LG-4/5(hLG4/LG5)點到硝酸纖維素上然後用衍生自融合瘤選殖體C21的抗層黏連蛋白-2抗體加以探測的斑點印跡。C2C12細胞裂解物中的層黏連蛋白-2的量低於檢測限。

圖3E和3F顯示了與人(圖3F)和小鼠(圖3G)LG-4/5結合的衍生自融合瘤選殖體C3的抗層黏連蛋白-2抗體的表面等離振子共振(Biacore；GE Healthcare)動力學測定資料。

圖3G顯示了與HEK293細胞上表現的人和小鼠LG-4/5結合的衍生自融合瘤選殖體C3的抗層黏連蛋白-2抗體的螢光啟動細胞分選(FACS)分析。

圖3H顯示了關於將不同量的重組人層黏連蛋白-2(Hu 211)、鼠LG-5(mLG5)、人LG-5(hLG5)和人LG-4/5(hLG4/LG5)點到硝酸纖維素上然後用衍生自融合瘤選殖體C3的抗層黏連蛋白-2抗體加以探測的斑點印跡。C2C12細胞裂解物中的層黏連蛋白-2的量低於檢測限。

圖3I和3J顯示了與人(圖3I)和小鼠(圖3J)β-DG結合的衍生自融合瘤選殖體AS30的抗β-DG抗體的表面等離振子共振(Biacore；GE Healthcare)動力學測定資料。

圖3K顯示了關於將不同量的重組鼠β-DG ECD(m βDG)、人β-DG ECD(Hu βDG)或重組肌營養不良蛋白聚糖(rhDG)點在硝酸纖維素上然後用衍生自融合瘤選殖體AS30的抗β-DG抗體加以探測的斑點印跡。C2C12細胞裂解物和脛骨前肌細胞裂解物(TA裂解物)中的βDG量低於檢測限。法布瑞酶(agalsidase beta,Genzyme)用作陰性對照。

圖3L顯示了使用衍生自融合瘤選殖體AS30的抗β-DG抗體通過來自C2C12細胞裂解物的β-DG的免疫沉澱產生的樣品的Western印跡。第一泳道顯示了陽性對照，第二泳道顯示了用衍生自噬菌體展示選殖體B06(其對βDG具有低親和力並因此對βDG和α-DG的下拉最小)的抗β-DG抗體探測的免疫沉澱樣品，第三泳道顯示了用衍生自融合瘤選殖體AS30(其中豐富的βDG和α-DG被免疫沉澱)的高親和力抗β-DG抗體探測的免疫沉澱樣品。

圖3M和3N顯示了與人(圖3M)和小鼠(圖3N)β-DG結合的衍生自融合瘤選殖體AS19的抗β-DG抗體的表面等離振子共振(Biacore；GE Healthcare)動力學測定資料。

圖3O顯示了關於將不同量的重組鼠β-DG ECD、人β-DG ECD或重組肌營養不良蛋白聚糖點在硝酸纖維素上然後用衍生自融合瘤選殖體AS19的抗β-DG抗體加以探測的斑點印跡。C2C12細胞裂解物，脛骨前肌細胞裂解物(TA裂解物)。法布瑞酶(agalsidase beta,Genzyme)用作陰性對照。

圖3P顯示了使用衍生自融合瘤選殖體AS19的抗β-DG抗體通過來自C2C12細胞裂解物的β-DG的免疫沉澱產生的樣品的Western印跡。第一泳道顯示了陽性對照，第二泳道顯示了用衍生自噬菌體展示選殖體B06(其對βDG具有低親和力並因此對βDG和α-DG的下拉最小)的抗β-DG抗體探測的免疫沉澱樣品，第三泳道顯示了用衍生自融合瘤選殖體AS19的抗β-DG抗體探測的免疫沉澱樣品。

圖4A和4B顯示了未固定的冷凍的人和小鼠肌肉組織切片，所述切片用衍生自融合瘤選殖體C21(圖4A)和C3(圖4B)的抗層黏連蛋白-2抗體染色，然後用螢光標記的抗小鼠IgG二級抗體加以檢測。但二級抗體沒有顯現任何染色(未顯示)。

圖4C和4D顯示了未固定的冷凍的人和小鼠肌肉組織切片，所述切片用衍生自融合瘤選殖體AS30(圖4C)和AS19(圖4D)的抗β-DG抗體染色，然後用螢光標記的抗小鼠IgG二級抗體加以檢測。但僅二級抗體沒有顯現任何染色(未顯示)。

圖5A顯示了根據一些具體實例對於β-DG和層黏連蛋白-2特異的四價雙特異性串聯IgG形式抗體(TBTI抗體)的方案設計。

圖5B顯示了根據一些具體實例對於β-DG和層黏連蛋白-2特異的交叉雙可變結構域IgG形式(CODV)雙特異性抗體的方案設計。

圖6A和6B顯示了針對人LG-4/5和人β-DG(圖6A)或針對鼠LG-4/5和鼠β-DG(圖6B)的親本單株抗體(AS19、C3和C21)和雙特異性抗體(T1T2、C5C6和T5T6)的序貫表面等離振子共振(Biacore；GE Healthcare)結合分析資料。

圖7顯示了LG-4/5和β-DG與雙特異性抗體同時結合的雙層夾心ELISA結果。測定了添加β-DG的親本單株抗體(AS19、C3和C21)以及添加或不添加β-DG的雙特異性抗體(T1T2、C5C6或T5T6)的結合。僅雙特異性抗體T1T2、T5T6和C5C6顯示出同時與LG-4/5和β-DG顯著結合。

圖8A和8B顯示了野生型鼠肌肉組織(圖8A)或LARGE^myd-3J/GrsrJ鼠肌肉組織(圖8B)的未固定的冰凍切片，所述切片用親本單株抗體(AS19、C3和C21)或雙特異性抗體(T1T2、C5C6或T5T6)染色，並用螢光標記的抗小鼠IgG二級抗體檢測。

圖8C概述了用於測試雙特異性抗體對運動誘發的肌肉損傷的影響的雙特異性肌內注射研究計畫。在實驗的第1天和第4天將雙特異性抗體肌內注射到LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的脛骨前(TA)肌中。在第5天注射伊文思藍染料(EB)以追蹤肌纖維損傷。小鼠經歷了強制性跑步機運動，並在第6天被處死。

圖8D顯示了用雙特異性抗體T1T2治療與親本單株抗體混合物(AS19和C3)治療的伊文思藍陽性(即損傷)肌纖維的平均數。用雙特異性抗體治療看到的損傷比用對照親本抗體治療更少。

圖8E顯示了用雙特異性抗體T1T2或親本單株抗體混合物(AS19和C3)治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的染色的肌肉組織。相比於用雙特異性抗體T1T2，在用親本單株抗體治療的組織中的伊文思藍染料染色(箭頭)明顯得多。顯示了使用螢光二級抗體對雙特異性抗體T1T2或親本單株抗體混合物 (AS19和C3)的染色。

圖8F顯示了雙特異性抗體T1T2(通過尾靜脈注射或腹膜內施用)和衍生自融合瘤克隆AS19或C3的親本抗體的全身性遞送之後的藥代動力學和生物分佈。給藥後4天，在血液中仍可檢測到雙特異性抗體。

圖9A至9C顯示了野生型小鼠(指向向下的三角形)、用對照單株親本抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠(指向向上的三角形)和雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠(正方形)的行為測試。圖9A顯示與未治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠相比，雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠顯示出握力測試的改善。圖9B顯示與未治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠相比，雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠顯示出金屬絲懸掛測試的改善。圖9C顯示與未治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠相比，雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠顯示出跑步時間測試的改善。

圖9D顯示與未治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠相比，雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠具有降低的肌酸激酶水準，表明較少的肌肉損傷。

圖10顯示了在來自用雙特異性抗體T1T2(組1 T1T2)與親本單株抗體AS19和C3混合物(組2對照)治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的組織中伊文思藍陽性(即損傷)肌纖維的平均數。將野生型未治療小鼠(組3 WT)用作對照。在LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠中，用雙特異性抗體T1T2治療看到的損傷比用對照親本抗體治療更少。

圖11顯示了在注射雙特異性抗體T1T2、親本單株抗體AS19或C3、或作為陰性對照的PBS之後4天的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠組織的免疫螢光染色。洗滌載玻片並使用具有DAPI(Vector Labs)的Vectashield封片劑加以封固。IV：靜脈注射；IP：腹膜內注射。

圖12A顯示了與抗原人β-DG結合的AS30 Fab的總體結構，其中抗原顯示在重鏈和輕鏈之間。圖12B顯示了AS30Fab的CDR與抗原β-DG之間的相互作用的近視圖。在該相互作用中涉及的殘基顯示為小棍；CDR中的箭頭指示從N端到C端的方向。

圖12C顯示了與抗原人層黏連蛋白-2 LG-5結構域結合的C21 Fab的總體結構，其中抗原顯示在重鏈和輕鏈之間。圖12D顯示了C21Fab的CDR與抗原層黏連蛋白-2 LG-5結構域之間的相互作用的近視圖。在該相互作用中涉及的殘基顯示為小棍；CDR中的箭頭指示從N端到C端的方向。

圖13顯示了根據一些具體實例的包含形成用於結合層黏連蛋白-2或β-DG的三個抗原結合位點的四條多肽鏈的三價結合蛋白(triAb)的示意圖。

圖14A和14B顯示了檢驗triAb與人LG4/5或β-DG結合的雙結合夾心ELISA測定的結果。在圖14A中，用生物素化的N’Avi-HPC4-人LG4/5包被平板，檢測與人β-DG的結合。在圖14B中，用人β-DG-HPC4-Avi-C’包被平板，檢測與人LG4/5的結合。

圖14C顯示了triAb 3407、3437或3439與人LG4/5，然後是與人β-DG的依次結合。相反，單價抗LG4/5抗體C3_Hu11、C21_Hu11、C21_Hu21和C3_Hu10僅結合LG4/5，而單價抗β-DG抗體AS30_Hu6僅結合β-DG，並且陰性對照triAb未顯示結合。

圖15顯示了使用握力測定法用triAb 3407、3437或3439治療對LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的肌肉功能的影響。將指示的triAb給藥與給予鹽水或陰性對照triAb進行比較。還測量了在測定中的野生型小鼠的性能。

圖16顯示了使用金屬絲懸掛測定法用triAb 3407、3437或3439治療對LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的肌肉功能的影響。將指示的triAb給藥與給予鹽水或陰性對照triAb進行比較。還測量了在測定中的野生型小鼠的性能。

圖17顯示了使用平板測定法用triAb 3407、3437或3439治療對 LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的肌肉功能的影響。將指示的triAb給藥與給予鹽水或陰性對照triAb進行比較。還測量了在測定中的野生型小鼠的性能。

發明詳述

本揭示提供了多特異性和雙特異性結合分子，其包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域。在一些具體實例中，結合分子是雙特異性的，並且包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域。在一些具體實例中，結合分子是多特異性的，並且包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域、結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域、和結合一個或多個另外的靶標的一個或多個另外的結合結構域。本揭示提供了多特異性/雙特異性結合分子的多種構型，其能夠在體內模型系統中同時結合肌營養不良蛋白聚糖和層黏連蛋白-2並改善α-肌營養不良蛋白聚糖病的症狀。

以下描述提出了示例性方法、參數等。然而，應該認識到，這樣的描述並非旨在限制本揭示的範圍，而是提供為示例性具體實例的描述。

定義

除非另外指明，正如根據本公開所使用的，以下術語應理解為具有以下含義。除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，其複數術語應包括單數。

如本文中使用的，術語“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶”是指能夠被結合蛋白結合的分子或分子的一部分，並且其還能在動物中用於產生能夠結合該抗原的表位的抗體。靶抗原可具有一個或多個表位。關於被結合蛋白識別的每種靶抗原，結合蛋白能夠與識別靶抗原的完整抗體競爭。本文所述的示例性靶抗原包括肌營養不良蛋白聚糖(例如其細胞外部分)和層黏連蛋白-2。

術語“表位”包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的任何決定簇，例如多肽決定簇。在某些具體實例中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，並且在某些具體實例中，可以具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。表位是被抗體或結合蛋白結合的抗原區域。在某些具體實例中，當結合蛋白優先識別其在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中的靶抗原時，結合蛋白被視為特異性地結合抗原。在一些具體實例中，當平衡解離常數10^-6M時，例如當平衡解離常數10^-9M時，並且例如當解離常數10^-10M時，結合蛋白被視為特異性地結合抗原。

例如，可以通過表面等離振子共振確定結合蛋白的解離常數(K_D)。通常，表面等離振子共振分析使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；Piscataway,NJ)通過表面等離振子共振(SPR)測量配體(生物感測器基質上的靶抗原)與分析物(溶液中的結合蛋白)之間的即時結合相互作用。也可以通過固定分析物(在生物感測器基質上的結合蛋白質)和呈遞配體(靶抗原)進行表面等離振子分析。如本文中使用的，術語“K_D”是指在特定結合蛋白和靶抗原之間相互作用的解離常數。

如本文中使用的，術語“特異性結合”指結合蛋白或其抗原結合片段以至少大約為1 x 10^-6M、1 x 10^-7M、1 x 10^-8M、1 x 10^-9M、1 x 10^-10M、1 x 10^-11M、1 x 10^-12M、或更大的K_D與含有表位的抗原結合和/或以比它與非特異性抗原的親和力至少大兩倍的親和力與表位結合的能力。

如本文中使用的術語“結合蛋白”是指與至少一種靶抗原特異性結合的非天然存在的(或重組的或工程改造的)分子。

術語“單特異性結合蛋白”是指與一個抗原靶特異性結合的結合蛋白。

術語“單價結合蛋白”是指具有一個抗原結合位點的結合蛋白。

術語“雙特異性結合蛋白”是指與兩個不同的抗原靶特異性結合的結合蛋白。雙特異性或雙功能抗體通常是具有兩個不同的重鏈/輕鏈對和兩個不同的結合位點或表位元元的人工雜交抗體。雙特異性抗體可以通過多種方法產生，包括但不限於融合瘤融合或F(ab')片段的連接。

術語“二價結合蛋白”是指具有兩個結合位元點或結構域的結合蛋白。

如本文中使用的術語“多核苷酸”是指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在某些具體實例中，構成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類核苷酸的修飾形式。這樣的修飾包括堿基修飾如溴尿苷，核糖修飾如阿拉伯糖苷和2',3'-雙去氧核糖，以及核苷酸間鍵修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。術語“多核苷酸”具體包括DNA的單鏈和雙鏈形式。

“分離的多核苷酸”是基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸或其某些組合，其：(1)與其中在自然界中發現所述分離的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分不結合，(2)與在自然界中未與其連接的多核苷酸連接，或(3)在自然界中並非作為更大序列的一部分存在。

“分離的多肽”是指：(1)至少不含一些通常與其一起被發現的其他多肽，(2)基本上不含來自相同來源例如來自相同物種的其他多肽，(3)由來自不同物種的細胞表現，(4)與其在自然界中所結合的至少約50%的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分開，(5)不與在自然界中所述“分離的多肽”所結合的多肽部分結合(通過共價或非共價相互作用)，(6)與在自然界中未與其結合的多肽可操作地結合(通過共價或非共價相互作用)，或(7)在自然界中不存在。這種分離的多肽可以由合成來源的基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何組合編碼。在一些具體實例中，分離的多肽基本上不含在其天然環境中發現的將會干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其他)的多肽或其他污染物。

天然存在的抗體一般包括四聚體。每個這樣的四聚體一般由兩對完全相同的多肽鏈組成，每對具有一條全長“輕鏈”(通常具有約25kDa的分子量)和一條全長“重鏈”(通常具有約50-70kDa的分子量)。如本文中使用的術語“重鏈”和“輕鏈”是指具有足以賦予靶抗原特異性的可變結構域序列的任何免疫球蛋白多肽。每條輕鏈和重鏈的氨基末端部分通常包含通常負責抗原識別的約100至110個或更多個胺基酸的可變結構域。每條鏈的羧基末端部分通常定義負責效應器功能的恒定結構域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包括可變結構域(V_H)和三個恒定結構域(C_H1、C_H2和C_H3)，其中V_H結構域位於多肽的氨基末端並且C_H3結構域位於羧基末端，並且全長輕鏈免疫球蛋白多肽包括可變結構域(V_L)和恒定結構域(C_L)，其中V_L結構域位於多肽的氨基末端並且C_L結構域位於羧基末端。

人輕鏈通常分為κ輕鏈和λ輕鏈，人重鏈通常分為μ、δ、γ、α或ε，並將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有幾個亞類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亞類，包括但不限於IgM1和IgM2。類似地，IgA細分為亞類，包括但不限於IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變結構域和恒定結構域通常由約12個或更多個胺基酸的“J”區連接，其中重鏈還包括多於約10個胺基酸的“D”區。參見，例如Fundamental Immunology(Paul,W.編輯，Raven Press，第2版，1989)，出於所有目的通過提述將其完整併入本文。每個輕鏈/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變結構域通常顯示具有相對保守的框架區(FR)的相同的一般結構，所述框架區由三個高變區(也稱為互補決定區或CDR)連接。來自每一對兩條鏈的CDR通常由框架區對齊，這可以使其能夠與特異性表位結合。從氨基末端到羧基末端，輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域兩者通常包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

術語“CDR組”是指存在於能夠結合抗原的單個可變區中的三個CDR的組。根據不同的系統對這些CDR的確切邊界進行了不同的定義。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)and(1991))描述的系統不僅提供了適用於任何抗體可變區的明確的殘基編號系統，而且提供了定義三個CDR的精確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和coworkers(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-17；Chothia等人，1989,Nature 342：877-83)發現，Kabat CDR內的某些子部分採用幾乎相同的肽主鏈構象，儘管在胺基酸序列水準上具有巨大的多樣性。這些子部分被指定為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分別表示輕鏈區和重鏈區。這些區域可以被稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊的邊界。定義與KabatCDR重疊的CDR的其他邊界已經由Padlan,1995,FASEBJ.9：133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5)：732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27：55-77描述。另有其他的CDR邊界定義可能不嚴格遵循本文中的系統之一，但是仍然與Kabat CDR重疊，不過根據預測、或不顯著影響抗原結合的特定殘基或者殘基群或甚至整個CDR的實驗發現，可以將它們縮短或延長。本文中使用的方法可以利用根據任何這些系統定義的CDR，不過某些具體實例使用Kabat或Chothia定義的CDR。使用胺基酸序列鑑定預測的CDR是本領域熟知的，例如引自Martin,A.C."Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," In Antibody Engineering,Vol.2.Kontermann R.,Dübel S.,eds.Springer-Verlag,Berlin,p.33-51(2010)。還可以檢查重鏈和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列，以便通過其他常規方法鑑定CDR的序列，例如藉由與其他重鏈和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行比較來確定序列高變區。可以通過目測將編號的序列對齊，或者通過使用諸如CLUSTAL程式組之一的對齊程式來對齊，正如Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22：4673-80中描述。常規地使用分子模型來正確描繪框架和CDR區，從而糾正基於序列的分配。

本文中使用的術語“Fc”是指包含由抗體消化產生的或通過其他手段產生的非抗原結合片段序列的分子，而不論是單體還是多聚體形式，並且可以含有鉸鏈區。在一些具體實例中，天然Fc的原始免疫球蛋白來源是人來源的並且可以是任何免疫球蛋白，例如IgG1和IgG2。Fc分子由可通過共價(即二硫鍵)和非共價結合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽組成。取決於類別(例如IgG、IgA和IgE)或亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)，在天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數目為1至4。Fc的一個實例是由木瓜蛋白酶消化IgG產生的二硫鍵結合的二聚體。本文中使用的術語“Fc”對於單體、二聚體和多聚體形式是通用的。

F(ab)片段通常包含一條輕鏈和一條重鏈的V_H和C_H1結構域，其中F(ab)片段的V_H-C_H1重鏈部分不能與另一條重鏈多肽形成二硫鍵。如本文中使用的，F(ab)片段還可以包括含有由胺基酸連接子分開的兩個可變結構域的一條輕鏈，和含有由胺基酸連接子和C_H1結構域分開的兩個可變結構域的一條重鏈。

F(ab')片段通常包括一條輕鏈和含有更多恒定區(C_H1和C_H2結構域之間)的一條重鏈的一部分，使得可在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵，從而形成 F(ab')₂分子。

“重組”分子是已經通過重組手段製備、表現、產生或分離的分子。

本揭示的一個具體實例提供了具有針對一個到三個靶抗原的生物學和免疫學特異性的結合蛋白。本揭示的另一個具體實例提供了包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列的核酸分子。本揭示的另一個具體實例提供了表現載體，其包含包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列的核酸分子。本揭示的又另一個具體實例提供了表現此類結合蛋白的宿主細胞(即，包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核酸分子或載體)。

如本文中使用的術語“可交換性”是指結合蛋白形式內可變結構域的可互換性，並且其中保留折疊和最終結合親和力。“完全可交換性”是指在式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中交換V_H1和V_H2結構域的順序以及因此交換V_L1和V_L2結構域的順序的能力(即，顛倒該順序)，同時維持結合蛋白的全部功能性，正如保留結合親和力所證明。此外，應該注意的是，名稱V_H和V_L僅指處於最終形式的特定蛋白質鏈上的結構域的位置。例如，V_H1和V_H2可以衍生自親本抗體中的V_L1和V_L2結構域並被置於結合蛋白中的V_H1和V_H2位置。同樣，V_L1和V_L2可以衍生自親本抗體中的V_H1和V_H2結構域並被置於結合蛋白中的V_H1和V_H2位置。因此，V_H和V_L名稱是指當前位置，而不是親本抗體中的原始位置。V_H和V_L結構域因此是“可交換的”。

“分離的”結合分子或蛋白質是已經從其天然環境的組分中鑑定和分離和/或回收的結合分子或蛋白質。其天然環境的污染組分是將會干擾該結合蛋白的診斷或治療用途的物質，並且可包括酶類、激素類、和其他蛋白性或非蛋白性溶質。在一些具體實例中，結合分子或蛋白質將被純化：(1)達到正如藉由洛瑞法(Lowry Method)確定的按抗體的重量計大於95%，並且在一些具體實例中按重量計大於99%，(2)達到足以藉由使用轉杯測序儀獲得至少N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)達到藉由利用考馬斯亮藍或銀染色在還原或非還原條件下進行的SDS-PAGE的同質性的程度。分離的結合分子或蛋白質包括重組細胞內的原位分子/蛋白質，因為天然環境的至少一種組分將不存在。

如本文中使用的，術語“基本上純的”或“基本上純化的”是指存在的主要種類(即，以莫耳為基礎，其比組合物中任何其他單獨的種類更豐富)的化合物或種類。在一些具體實例中，基本上純化的部分是組合物，其中所述種類構成至少約50%(以莫耳計)的所有存在的大分子種類。在其他具體實例中，基本上純的組合物將構成大於約80%、85%、90%、95%或99%的存在於所述組合物中的所有大分子種類。仍然在其他具體實例中，將所述種類純化至必要的同質性(通過常規檢測方法不能在組合物中檢測到污染物種類)，其中該組合物基本上由單一大分子種類組成。

如本文中使用的術語“載體”是指用於將編碼資訊轉移至宿主細胞的任何分子(例如，核酸、質體或病毒)。術語“載體”包括核酸分子，其能夠運送與其連接的另一個核酸。一種類型的載體是“質體”，其指的是另外的DNA區段可插入其中的環狀雙鏈DNA環分子。另一種類型的載體是病毒載體，其中可以將另外的DNA區段插入病毒基因組中。某些載體(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入到宿主細胞中之後整合到所述宿主細胞的基因組中，由此與宿主基因組一起複製。另外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因的表現。這樣的載體在本文中稱為“重組表現載體”(或者簡單地稱為“表現載體”)。一般而言，用於重組DNA技術中的表現載體常常為質體形式。術語“質體”和“載體”在本文中可互換使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本揭示預期包括具有等同功能的其他形式的表現載體，比如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。

如本文中使用的短語“重組宿主細胞”(或“宿主細胞”)指的是其中已引入重組表現載體的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞不僅意指特定的受試細胞，而且是指這樣的細胞的後代。由於突變或環境影響而在後續世代中可能發生某些修飾，事實上這樣的後代可能與親本細胞不同，但是這樣的細胞仍然被包括在本文中使用的術語“宿主細胞”的範圍內。多種宿主細胞表現系統可用於表現結合蛋白，包括細菌、酵母、杆狀病毒和哺乳動物表現系統(以及噬菌體展示表現系統)。適合的細菌表現載體的實例是pUC19。為了重組表現結合蛋白，用一個或多個攜帶編碼結合蛋白多肽鏈的DNA片段的重組表現載體轉化或轉染宿主細胞，使得多肽鏈在宿主細胞中表現並分泌到培養所述宿主細胞的培養基中，從培養基中可以回收結合蛋白。

如本文中使用的術語“轉化”是指細胞遺傳特徵的變化，並且細胞在其被修飾為含有新的DNA時已經被轉化。例如，在細胞從它的天然狀態經歷基因修飾的情況下，所述細胞被轉化。在轉化後，轉化DNA可以通過物理方式整合到細胞染色體中而與細胞的DNA重組，或者可以作為附加型元件短暫維持而不被複製，或者可以獨立作為質體複製。當DNA隨著細胞分裂複製時，認為細胞已被穩定轉化。如本文中使用的術語“轉染”是指由細胞攝取外來或外源DNA，並且當外源DNA已被引入到細胞膜內時，細胞已被“轉染”。許多轉染技術是本領域熟知的。這樣的技術可用於將一個或多個外源DNA分子引入到適合的宿主細胞中。

如本文中使用並且應用於物件的術語“天然存在”是指這樣的事實，即所述物件可以在自然界中找到但是尚未被人操作。例如，可以從自然界的來源分離但是尚未被人有意修飾的存在於生物(包括病毒)中的多核苷酸或多肽是天然存在的。類似地，本文中使用的“非天然存在”是指在自然界中未發現或已經被人進行結構修飾或合成的物件。

如本文中使用的，二十種常規胺基酸及其縮寫遵循常規用法。二十種常規胺基酸的立體異構體(例如，d-胺基酸)；非天然胺基酸和類似物，比如α-,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其他非常規胺基酸也可以是適合的結合蛋白多肽鏈的組分。非常規胺基酸的實例包括：4-羥脯胺酸、γ-羧基谷胺酸、ε-N,N,N-三甲基賴胺酸、ε-N-乙醯基賴胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥賴胺酸、σ-N-甲基精胺酸和其他相似的胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥脯胺酸)。按照標準用法和慣例，在本文中使用的多肽符號中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。

根據常見的側鏈性質，天然存在的殘基可以分為幾類：(1)疏水的：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；(2)極性親水的：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；(3)脂肪族的：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；(4)脂肪族疏水的：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；(5)中性親水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(6)酸性的：Asp、Glu；(7)鹼性的：His、Lys、Arg；(8)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；(9)芳香族的：His、Trp、Tyr、Phe；以及(10)芳香族疏水的：Phe、Trp、Tyr。

保守胺基酸取代可涉及將這些類別之一的成員與同一類別的另一成員交換。非保守取代可涉及將這些類別之一的成員與另一個類別的成員交換。

熟練技術人員將能夠使用熟知的技術確定適合的結合蛋白多肽鏈的變體。例如，本領域技術人員可以鑑定適合的藉由靶向被認為對於活性不重要的區域在不破壞活性的情況下加以改變的多肽鏈區域。或者，本領域技術人員可以鑑定在相似多肽中保守的分子的殘基和部分。另外，在不破壞生物學活性或不會不利地影響多肽結構的情況下，即使對於生物學活性或結構可能重要的區域，也可以進行保守胺基酸取代。

如本文中使用的術語“患者”(術語“個體”和“受試者”在本文中可互換使用)包括人和動物(例如哺乳動物，包括但不限於狗、貓和其他家養寵物；馬、牛、山羊、兔子、水牛和其他家畜；以及研究動物，比如非人靈長類動物、小鼠等)受試者。

在一些具體實例中，如本文中使用的術語“治療”或“處理”是指治療性處理，例如減輕或緩和一種或多種症狀的嚴重性或存在。

在其他具體實例中，如本文中使用的術語“預防”可以指預防性或防止性措施，例如預防或延遲例如在處於發生本文所述的病理狀況的風險的個體中的一種或多種症狀的發作。

如本文中使用的術語“藥學組合物”或“治療組合物”是指在適當施用於患者時能夠誘導期望的治療效果的化合物或組合物。

如本文中使用的術語“藥學上可接受的載劑”或“生理學上可接受的載體”是指一種或多種適合於實現或增強結合蛋白遞送的製劑材料。

當用來指包含一種或多種結合蛋白的藥學組合物時，術語“有效量”和“治療有效量”是指足以產生期望的治療結果的量或劑量。更具體地說，治療有效量是在一段時間內足以抑制一個或多個與正在治療的與病症相關的臨床定義的病理過程的結合蛋白的量。有效量可以根據所使用的具體結合蛋白而變化，並且還取決於與被治療患者有關的各種因素和狀況以及疾患的嚴重程度。例如，如果將要在體內施用結合蛋白，則諸如患者的年齡、體重和健康等因素以及在臨床前動物工作中獲得的劑量反應曲線和毒性資料將是要考慮的那些因素。給定藥學組合物的有效量或治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力範圍內。

本揭示的一個具體實例提供了藥學組合物，其包含藥學上可接受的載劑和治療有效量的結合分子。

結合分子

本公開的某些方面涉及包含一個或多個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的結合結構域和一個或多個結合層黏連蛋白-2的結合結構域的多特異性結合分子。在一些具體實例中，多特異性結合分子是包含一個或多個多肽鏈的多特異性結合蛋白。在一些具體實例中，多特異性結合分子是包含兩個或四個抗原結合位點的二價或四價雙特異性結合分子。在一些具體實例中，多特異性結合分子是包含三個抗原結合位點的三價多特異性結合分子。術語“結合結構域”和“結合位點”在本文中可互換使用。

多特異性結合蛋白的各種形式和構型是本領域已知的並且適合於如本文所述的用途。下面提供了示例性和非限制性形式的描述。在國際公開號WO2017/180913中描述的任何形式及其任選特徵可在本文所述的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)中使用。

多特異性三價結合蛋白

在一些具體實例中，結合蛋白是多特異性結合蛋白。在一些具體實例中，多特異性結合蛋白是包含三個抗原結合位點並共同靶向兩個或更多個靶抗原的三價結合蛋白。在一些具體實例中，結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：V_L2-L₁-V_L1-L₂-C_L [I] 並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：V_H1-L₃-V_H2-L₄-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [II]並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：V_H3-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [III]並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：V_L3-C_L [IV]其中：V_L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重鏈恒定結構域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重鏈恒定結構域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C_H1和C_H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L₁、L₂、L₃和L₄是胺基酸連接子。

在一些具體實例中，式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。在一些具體實例中，V_H1和V_L1形成抗原結合位點，V_H2和V_L2形成抗原結合位點，並且V_H3和V_L3形成抗原結合位點，總共三個抗原結合位點。在一些具體實例中，三個抗原結合位點包括至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點(例如一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和兩個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點，或者兩個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點)。

在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的兩個抗原結合位點結合層黏連蛋白-2的不同表位。在一些具體實例中，結合層黏連蛋白-2的兩個抗原結合位點結合層黏連蛋白-2的相同表位或重疊表位。在一些具體實例中，V_H1和V_L1形成結合層黏連蛋白-2的第一抗原結合位點，V_H2和V_L2形成結合層黏連蛋白-2的第二抗原結合位點，並且V_H3和V_L3形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第三抗原結合位點。

在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的兩個抗原結合位點結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的不同表位。在一些具體實例中，結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的兩個抗原結合位點結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的相同表位或重疊表位。在一些具體實例中，V_H1和V_L1形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一抗原結合位點，V_H2和V_L2形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第二抗原結合位點，並且V_H3和V_L3形成結合層黏連蛋白-2的第三抗原結合位點。

本文所述的任何抗原結合位點均可用於本文所述的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)，例如包括但不限於包含根據上文所述的式I、II、III和/或IV的多肽的結合蛋白。

在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含：重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列GFTFTDSV(SEQ ID NO：316)的CDR-H1、包含序列IYPGSGNF(SEQ ID NO：318)的CDR-H2和包含序列AMRRSS(SEQ ID NO：320)的CDR-H3；和輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列QTIVHSNSKTY(SEQ ID NO：332)的CDR-LI、包含序列KVS(SEQ ID NO：334)的CDR-L2和包含序列FQGSHVPLT(SEQ ID NO：336)的CDR-L3。在一些具體實例中，VH和VL結構域形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點(例如V_H1和V_L1、V_H2和V_L2或V_H3和V_L3)。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表A2中所示的抗體AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的1、2、3、4、5或6個CDR序列。

在一些具體實例中，VH和/或VL結構域是人源化的。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含與胺基酸序列SEQ ID NO：314具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：330具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含與胺基酸序列SEQ ID NO：346具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：362具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表D2中所示的抗體AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的VH和/或VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：306編碼的VH結構域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO：322編碼的VL結構域。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：338編碼的VH結構域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO：354編碼的VL結構域。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含：重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT(SEQ ID NO：380)的CDR-H1、包含序列ISSSGSNT(SEQ ID NO：382)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO：384)的CDR-H3；和輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列QSISNN(SEQ ID NO：396)的CDR-L1、包含序列YAS(SEQ ID NO：398)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT(SEQ ID NO：400)的CDR-L3。在一些具體實例中，VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點(例如V_H1和V_L1、V_H2和V_L2或V_H3和V_L3)。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表A2中所示的抗體C3_Hu10的1、2、3、4、5或6個CDR序列。

在一些具體實例中，VH和/或VL結構域是人源化的。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含與胺基酸序列SEQ ID NO：378具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：394具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表D2中所示的抗體C3_Hu10的VH和/或VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：370編碼的VH結構域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO：386編碼的VL結構域。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含：重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT(SEQ ID NO：380)的CDR-H1、包含序列ISSSGSNT(SEQ ID NO：382)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO：384)的CDR-H3；和輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列QSIGNN(SEQ ID NO：428)的CDR-L1、包含序列YAS(SEQ ID NO：398)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT(SEQ ID NO：400)的CDR-L3。在一些具體實例中，VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點(例如V_H1和V_L1、V_H2和V_L2或V_H3和V_L3)。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表A2中所示的抗體C3_Hu11的1、2、3、4、5或6個CDR序列。

在一些具體實例中，VH和/或VL結構域是人源化的。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含與胺基酸序列SEQ ID NO：410具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：426具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表D2中所示的抗體C3_Hu11的VH和/或VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：402編碼的VH結構域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO：418編碼的VL結構域。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含：重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT(SEQ ID NO：444)的CDR-H1、包含序列ISSSGSNT(SEQ ID NO：446)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO：448)的CDR-H3；和輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列QSISNY(SEQ ID NO：460)的CDR-L1、包含序列YAS(SEQ ID NO：462)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT(SEQ ID NO：464)的CDR-L3。在一些具體實例中，VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點(例如V_H1和V_L1、V_H2和V_L2或V_H3和V_L3)。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表A2中所示的抗體C21_Hu11 的1、2、3、4、5或6個CDR序列。

在一些具體實例中，VH和/或VL結構域是人源化的。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含與胺基酸序列SEQ ID NO：442具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：458具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表D2中所示的抗體C21_Hu11的VH和/或VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：434編碼的VH結構域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO：450編碼的VL結構域。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含：重鏈可變結構域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT(SEQ ID NO：444)的CDR-H1、包含序列ISSSGDNT(SEQ ID NO：478)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO：448)的CDR-H3；和輕鏈可變結構域(VL)，其包含包含序列QSISNY(SEQ ID NO：460)的CDR-L1、包含序列YAS(SEQ ID NO：462)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT(SEQ ID NO：464)的CDR-L3。在一些具體實例中，VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點(例如V_H1和V_L1、V_H2和V_L2或V_H3和V_L3)。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表A2中所示的抗體C21_Hu21的1、2、3、4、5或6個CDR序列。

在一些具體實例中，VH和/或VL結構域是人源化的。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含與胺基酸序列SEQ ID NO：474具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：490具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表D2中所示的抗體C21_Hu21的VH和/或VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO：466編碼的VH結構域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO：482編碼的VL結構域。

在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：378，V_L1包含序列SEQ ID NO：394；V_H2包含序列SEQ ID NO：378，V_L2包含序列SEQ ID NO：394；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO：500的第一多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：498的第二多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：499的第三多肽鏈和包含序列SEQ ID NO：501的第四多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含triAb 3407的1、2、3或4個多肽鏈，例如，如表I2或I4所示。

在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：378，V_L1包含序列SEQ ID NO：394；V_H2包含序列SEQ ID NO：442，V_L2包含序列SEQ ID NO：458；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO：504的第一多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：502的第二多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：503的第三多肽鏈和包含序列SEQ ID NO：505的第四多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含triAb 3423的1、2、3或4個多肽鏈，例如，如表I2或I4所示。

在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：410，V_L1包含序列SEQ ID NO：426；V_H2包含序列SEQ ID NO：474，V_L2包含序列SEQ ID NO：490；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO：508的第一多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：506的第二多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：507的第三多肽鏈和包含序列SEQ ID NO：509的第四多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含triAb 3429的1、2、3或4個多肽鏈，例如，如表I2或I4所示。

在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：442，V_L1包含序列SEQ ID NO：458；V_H2包含序列SEQ ID NO：410，V_L2包含序列SEQ ID NO：426；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO：512的第一多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：510的第二多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：511的第三多肽鏈和包含序列SEQ ID NO：513的第四多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含triAb 3437的1、2、3或4個多肽鏈，例如，如表I2或I4所示。

在一些具體實例中，V_H1包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V_L1包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；V_H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V_L2包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V_H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V_L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H1包含序列SEQ ID NO：474，V_L1包含序列SEQ ID NO：490；V_H2包含序列SEQ ID NO：378，V_L2包含序列SEQ ID NO：394；並且V_H3包含序列SEQ ID NO：314，V_L3包含序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO：516的第一多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：514的第二多肽鏈、包含序列SEQ ID NO：515的第三多肽鏈和包含序列SEQ ID NO：517的第四多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含triAb 3439的1、2、3或4個多肽鏈，例如，如表I2或I4所示。

雙特異性結合蛋白

在一些具體實例中，結合蛋白是雙特異性結合蛋白。在一些具體實例中，雙特異性結合蛋白是包含兩個抗原結合位點並共同靶向兩個靶抗原的二價結合蛋白。在一些具體實例中，雙特異性結合蛋白是包含四個抗原結合位點並共同靶向兩個靶抗原的四價結合蛋白。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域，其中所述第一結合結構域包含第一免疫球蛋白重鏈可變結構域(V_H1)和第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域(V_L1)，其中所述第二結合結構域包含第二免疫球蛋白重鏈可變結構域(V_H2)和第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域(V_L2)。在一些具體實例中，雙特異性結合分子是雙特異性結合蛋白，比如雙特異性抗體。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含由下式表示的結構：V_L1-L₁-V_L2-L₂-C_L [I]並且兩條多肽鏈包含由下式表示的結構：V_H2-L₃-V_H1-L₄-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [II]其中：V_L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域； C_H1是免疫球蛋白C_H1重鏈恒定結構域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重鏈恒定結構域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C_H1和C_H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L₁、L₂、L₃和L₄是胺基酸連接子；其中V_H1和V_L1結構域形成V_H1/V_L1結合對，並且其中V_H2和V_L2結構域形成V_H2/V_L2結合對。

在一些具體實例中，式I和式II按照從N端到C端的順序描述對應多肽鏈內的結構域的排列。在一些具體實例中，一個或多個多肽鏈可以包含另外的序列，例如在N端或C端。

對於這種形式的示例性描述，參見，例如，國際公開號WO2012/135345、美國專利No.9,221,917和歐洲專利No.EP2691416B1。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含兩條包含序列SEQ ID NO：530的根據式II的多肽鏈和兩條包含序列SEQ ID NO：531的根據式I的多肽鏈。在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含兩條包含序列SEQ ID NO：532的根據式II的多肽鏈和兩條包含序列SEQ ID NO：533的根據式I的多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含兩條針對表I3或I4中的AS30_Hu9xC3_Hu11 CODV或AS30_Hu9xC21_Hu21 CODV所示的多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含包含表A2中所示的1、2、3、4、5或6個CDR序列的可變結構域。在一些具體實例中，結合蛋白包含表D2、I3或I4中所示的1、2、3或4個可變結構域。

在一些具體實例中，V_H1/V_L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且V_H2/V_L2結合對結合層黏連蛋白-2。在其他具體實例中，V_H2/V_L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且V_H1/V_L1結合對結合層黏連蛋白-2。

在上文所述的任何多特異性和/或雙特異性結合分子的一些具體實例中，式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。在一些具體實例中，V_H1和V_L1結構域交叉以形成V_H1/V_L1結合對。在一些具體實例中，V_H2和V_L2結構域交叉以形成V_H2/V_L2結合對。在一些具體實例中，如本文中使用的術語連接子是指一個或多個插入免疫球蛋白結構域之間的胺基酸殘基，從而為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的移動性以折疊成交叉雙可變區免疫球蛋白。在序列水準分別在可變結構域之間或在可變結構域與恒定結構域之間的轉換處插入連接子。可以鑑定結構域之間的轉換，因為已充分瞭解免疫球蛋白結構域的近似大小。正如實驗資料所證明，或者正如可以通過建模或二級結構預測技術所假定，可以通過定位不形成諸如β-片層或α-螺旋等二級結構元件的肽段來確定結構域轉換的精確位置。連接子L₁、L₂、L₃和L₄是獨立的，但它們在某些情況下可能具有相同的序列和/或長度。

在一些具體實例中，本公開的連接子包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。在一些具體實例中，L₁和L₂包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。在一些具體實例中，L₃和L₄包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。在一些具體實例中，L₁、L₂、L₃和L₄包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。在國際公開號WO2017/180913中描述的任何連接子和連接子組合可在本文所述的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)中使用。

在一些具體實例中，L₁、L₂、L₃和L₄各自長度為0至50個胺基酸殘基，長度為0至40個胺基酸殘基，長度為0至30個胺基酸殘基，長度為0至25個胺基酸殘基，長度為0至20個胺基酸殘基，長度為0至18個胺基酸殘基，長度為0至16個胺基酸殘基，或長度為0至14個胺基酸殘基。在一些具體實例中，連接子L₁、L₂、L₃和L₄的長度範圍為從沒有胺基酸(長度=0)至約100個胺基酸，或少於100、50、40、30、20個或15個胺基酸或更少。連接子長度也可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2個或1個胺基酸。在一個結合蛋白中的L₁、L₂、L₃和L₄可以全部都具有相同的胺基酸序列或者可以全部都具有不同的胺基酸序列。

在某些具體實例中，L₁的長度為5個胺基酸殘基，L₂的長度為5個胺基酸殘基，L₃的長度為5個胺基酸殘基，L₄的長度為5個胺基酸殘基。在某些具體實例中，L₁的長度為14個胺基酸殘基，L₂的長度為2個胺基酸殘基，L₃的長度為14個胺基酸殘基，L₄的長度為2個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁和L₃各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：296)，和/或L₂和L₄各自包含序列GG。在某些具體實例中，L₁的長度為7個胺基酸殘基，L₂的長度為5個胺基酸殘基，L₃的長度為1個胺基酸殘基，並且L₄的長度為2個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：297)，L₂包含序列TKGPS(SEQ ID NO：298)，L₃包含絲胺酸殘基(例如序列S)，並且L4包含序列RT。在某些具體實例中，L₁的長度為10個胺基酸殘基，L₂的長度為10個胺基酸殘基，L₃的長度為0個胺基酸殘基，並且L₄的長度為0個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁和L₂各自包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：299)。

在一些具體實例中，式I和/或式II的多肽的兩個可變結構域之一或兩者是人的、人源化的或小鼠的可變結構域。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含兩條包含由下式表示的結構的輕鏈：V_L1-L₅-V_L2-L₆-C_L [III]和兩條包含由下式表示的結構的重鏈：V_H1-L₇-V_H2-L₈-C_H1-鉸鏈-C_H2-C_H3 [IV] 其中：V_L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V_H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V_H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；C_L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C_H1是免疫球蛋白C_H1重鏈恒定結構域；C_H2是免疫球蛋白C_H2重鏈恒定結構域；C_H3是免疫球蛋白C_H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C_H1和C_H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L₅、L₆、L₇和L₈是胺基酸連接子；其中V_H1和V_L1結構域形成V_H1/V_L1結合對，並且其中V_H2和V_L2結構域形成V_H2/V_L2結合對。

在一些具體實例中，式III和式IV按照從N端到C端的順序描述對應多肽鏈內的結構域的排列。在一些具體實例中，一個或多個多肽鏈可以包含另外的序列，例如在N端或C端。

對於這種形式的示例性描述，參見，例如，US PG公開號US20130209469。

在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含兩條包含序列SEQ ID NO：522的重鏈和兩條包含序列SEQ ID NO：523的輕鏈。在一些具體實例中，雙特異性結合分子包含兩條包含序列SEQ ID NO：528的重鏈和兩條包含序列SEQ ID NO：529的輕鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含兩條針對表I3或I4中的AS30_Hu6xC3_Hu10或AS30_Hu6xC21_Hu11所示的多肽鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含包含表A2中所示的1、2、3、4、5或6個 CDR序列的可變結構域。在一些具體實例中，結合蛋白包含表D2、I3或I4中所示的1、2、3或4個可變結構域。

在一些具體實例中，式III和/或式IV的多肽的兩個可變結構域之一或兩者是人的、人源化的或小鼠的可變結構域。

連接子

在一些具體實例中，L₅、L₆、L₇和L₈各自長度為0至50個胺基酸殘基，長度為0至40個胺基酸殘基，長度為0至30個胺基酸殘基，長度為0至25個胺基酸殘基，長度為0至20個胺基酸殘基，長度為0至18個胺基酸殘基，長度為0至16個胺基酸殘基，或長度為0至14個胺基酸殘基。在一些具體實例中，連接子L₅、L₆、L₇和L₈的長度範圍為從沒有胺基酸(長度=0)至約100個胺基酸，或少於100、50、40、30、20個或15個胺基酸或更少。連接子長度也可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2個或1個胺基酸。在一個結合蛋白中的L₅、L₆、L₇和L₈可以全部都具有相同的胺基酸序列或者可以全部都具有不同的胺基酸序列。

在某些具體實例中，L₁的長度為5個胺基酸殘基，L₂的長度為5個胺基酸殘基，L₃的長度為5個胺基酸殘基，L₄的長度為5個胺基酸殘基。在某些具體實例中，L₁的長度為14個胺基酸殘基，L₂的長度為2個胺基酸殘基，L₃的長度為14個胺基酸殘基，L₄的長度為2個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁和L₃各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：296)，和/或L₂和L₄各自包含序列GG。在某些具體實例中，L₁的長度為7個胺基酸殘基，L₂的長度為5個胺基酸殘基，L₃的長度為1個胺基酸殘基，並且L₄的長度為2個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：297)，L₂包含序列TKGPS(SEQ ID NO：298)，L₃包含絲胺酸殘基(例如序列S)，並且L₄包含序列RT。在某些具體實例中，L₁的長度為10個胺基酸殘基，L₂的長度為10個胺基酸殘基，L₃的長度為0個胺基酸殘基，並且L₄的長度為0個胺基酸殘基。在一些具體實例中，L₁和L₂各自包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：299)。

在某些具體實例中，L₅和L₇連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：294)，和/或L₆和L₈連接子的長度各自為0個胺基酸殘基。

上面列舉的實例(例如，對於L_1、L₂、L₃、L₄、L_5、L₆、L₇或L₈)並非意圖以任何方式限制本揭示的範圍，並且包含選自纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、谷胺酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、甘胺酸和脯胺酸的隨機選擇的胺基酸的連接子適用於結合蛋白。

連接子中的胺基酸殘基的身份和序列可以根據連接子中所需的二級結構元件的類型而變化。例如，甘胺酸、絲胺酸和丙胺酸用於柔性連接子。如果需要更具剛性的延長的連接子，那麼甘胺酸、脯胺酸、蘇胺酸和絲胺酸的一些組合是有用的。任何胺基酸殘基可以視為與其他胺基酸殘基組合的連接子，以便在需要時根據期望的性質構建更大的肽連接子。

恒定/Fc區

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含第二多肽鏈上的“節”突變和第三多肽鏈上的“穴”突變。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白包含第三多肽鏈上的“節”突變和第二多肽鏈上的“穴”突變。在一些具體實例中，“節”突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和/或366的位置處的取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是S354C、T366W、T366Y、S354C和T366W或S354C和T366Y。在一些具體實例中，“節”突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是S354C和T366W。在一些具體實例中，“穴”突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置407以及任選地349、366和/或368的位置處的取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是Y407V或Y407T和任選的Y349C、T366S和/或L368A。在一些具體實例中，“穴”突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是 Y349C、T366S、L368A和Y407V。

在一些具體實例中，第二多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含胺基酸取代(例如S354C和T366W)；並且其中第三多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含胺基酸取代(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V)。在一些具體實例中，第二多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含胺基酸取代(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V)；並且第三多肽鏈的C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含胺基酸取代(例如S354C和T366W)。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含一個或多個突變，以便例如通過調變純化試劑的親和力改善純化。例如，已知如果異二聚體形式的兩個Fc區之一含有降低或消除與蛋白A結合的突變，那麼異二聚體結合蛋白可以選擇性地離開它們的同二聚體形式而被純化，因為異二聚體形式相比於任一同二聚體形式對基於蛋白A的純化具有中等親和力並且可以例如藉由使用不同的pH而從蛋白A選擇性地洗脫出來(參見例如，Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5：17943)。在一些具體實例中，第一和/或第二Fc區是人IgG1 Fc區。在一些具體實例中，第一和/或第二Fc區是人IgG4 Fc區。在一些具體實例中，所述突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處的取代，其中胺基酸取代是H435R和Y436F。在一些具體實例中，第二和第三多肽鏈的C_H3結構域是人IgG1或IgG4 C_H3結構域，並且僅一個C_H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置包含胺基酸取代(例如H435R和Y436F)。在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白包含節和穴突變以及一個或多個改善純化的突變。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含一個或多個增加半衰期例如體內半衰期的突變。在一些具體實例中，結合蛋白包含在美國專利No.7,083,784中描述的一個或多個突變。例如，在一些具體實例中，第二和第三多肽鏈的C_H2結構域是人IgGI或IgG4 C_H2結構域，其包含根據EU索引編號的第252位元的酪胺酸殘基、第254位的蘇胺酸殘基和第256位的谷胺酸殘基。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含一個或多個突變，所述突變導致具有改變的糖基化和/或降低的效應器功能的Fc區。在一些具體實例中，結合蛋白包含在美國專利No.9,790,268中描述的一個或多個突變。例如，在一些具體實例中，第二和第三多肽鏈的C_H2結構域是人IgG1或IgG4 C_H2結構域，其包含根據EU索引編號的第297位元的天冬醯胺殘基、第298位的天冬醯胺殘基、第299位的丙胺酸殘基和第300位的絲胺酸或蘇胺酸殘基。

考慮在本文中使用的另一種雙特異性結合蛋白平臺描述於US PG公開號US2013/0039913和Labrijn,A.F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.110：5145-5150中。在這種方法中，每個結合結構域以同二聚體形式產生，然後在體外裝配而形成異二聚體雙特異性結合蛋白。這種方法採用特異性突變(例如，在抗體CH3結構域中)來促進Fab臂交換，從而產生比任一同二聚體形式更穩定的異二聚體結合蛋白。在一些具體實例中，根據Kabat等人所述的EU索引，這些突變發生在例如位置366、368、370、399、405、407和/或409。特異性突變更詳細地描述於US PG公開號US2013/0039913和Labrijn,A.F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.110：5145-5150中。

考慮在本文中使用的另外的雙特異性結合蛋白平臺簡要描述於下文。一個策略由Carter等人提出(Ridgway等人，1996,Protein Eng.9(7)：617-21；Carter,2011,J.Immunol.Methods 248(1-2)：7-15)，以便使用Fc的C_H3結構域中的一組“節入穴”突變產生Fc異二聚體。這些突變導致結構保守的疏水核內C_H3結構域介面之間的殘基堆積互補性改變，從而與同二聚體相比有利於形成異二聚體，從而實現來自哺乳動物細胞培養的良好異二聚體表現。雖然該策略導致異二聚體產率更高，但同二聚體並未完全受到抑制(Merchant等人，1998,Nat.Biotechnol.16(7)：677-81)。

為了提高結合蛋白的產率，在一些具體實例中，可以通過“節入穴”技術來改變C_H3結構域，該技術在若干實例中有詳細描述，例如國際專利號WO 96/027011,Ridgway等人，1996,Protein Eng.9：617-21；和Merchant等人，1998,Nat.Biotechnol.16：677-81。具體地說，改變兩個C_H3結構域的相互作用表面，從而增加包含這兩個C_H3結構域的兩條重鏈的異二聚化。兩個C_H3結構域的每一個(兩條重鏈的)都可以是“節”，而另一個是“穴”。二硫橋的引入進一步穩定了異二聚體(Merchant等人，1998；Atwell等人，1997,J.Mol.Biol.270：26-35)並且增加了產率。在特定具體實例中，節位於一條多肽鏈的CH3結構域上。在其他具體實例中，節位於具有交叉定向的第一對多肽上。仍然在其他具體實例中，C_H3結構域不包含“節入穴”。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白包含在一條多肽鏈上的“節”突變和在另一條多肽鏈上的“穴”突變。在一些具體實例中，“節”突變包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置354和366的位置處的取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是S354C和T366W。在一些具體實例中，“穴”突變包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置349、366、368和407的位置處的取代。在一些具體實例中，胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。

在一些具體實例中，本揭示的結合蛋白包含一個或多個改善血清半衰期的突變(參見例如，Hinton,P.R.等人，(2006)J.Immunol.176(1)：346-56)。在一些具體實例中，所述突變包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置428和434的位置處的取代，其中胺基酸取代是M428L和N434S。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白包含節和穴突變以及一個或多個改善血清半衰期的突變。

考慮在本文中使用的另一種雙特異性結合蛋白平臺是在WO2011131746中描述的含異二聚體的二價抗體Fc的形式。本文所述的任何抗原結合位點可以以這種異二聚體的雙特異性形式組合。在一些具體實例中，本公開的多特異性(例如，雙特異性)結合蛋白包含：包含第一重鏈可變(VH)結構域和包含第一C_H3區的免疫球蛋白的第一Fc區的第一抗體重鏈，和包含第一輕鏈可變(VL)結構域的第一抗體輕鏈，其中所述第一VH和VL結構域形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一抗原結合結構域，以及包含第二重鏈可變(VH)結構域和包含第二C_H3區的免疫球蛋白的第二Fc區的第二抗體重鏈，和包含第二輕鏈可變(VL)結構域的第二抗體輕鏈，其中所述第二VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的第二抗原結合結構域。在一些具體實例中，所述第一和第二C_H3區的序列是不同的，並且使得所述第一和第二C_H3區之間的異二聚相互作用比所述第一和第二C_H3區各自的同二聚相互作用更強。在一些具體實例中，第一同二聚體蛋白在409位具有除了Lys、Leu或Met以外的胺基酸，第二同二聚體蛋白在選自366、368、370、399、405和407的位置處具有胺基酸取代，和/或所述第一和第二C_H3區的序列使得C_H3區各自的同二聚相互作用的解離常數在0.01和10微莫耳之間。在一些具體實例中，第一抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：518，第二抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：519，第一抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO：520，並且第二抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO：521。在一些具體實例中，結合蛋白包含針對表I3中的AS30_Hu6xC3_Hu10雙體顯示的兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈。

考慮在本文中使用的另一種雙特異性結合蛋白平臺是“DuetMab”設計(Mazor,Y.等人，(2015)MAbs 7：377-389)。簡言之，將上述“節入穴”方法與用工程改造的二硫鍵替代CH1-CL介面之一中的天然二硫鍵相結合，以提高同源重鏈和輕鏈配對的效率。在一些具體實例中，根據Kabat編號，一個結合結構域的重鏈具有F126C突變，並且該結合結構域的同源輕鏈具有S121C突變。例如，在一些具體實例中，本揭示的多特異性(例如，雙特異性)結合蛋白包含包含序列SEQ ID NO：524的第一抗體重鏈，包含序列SEQ ID NO：525的第二抗體重鏈，包含序列SEQ ID NO：526的第一抗體輕鏈，和包含序列SEQ ID NO：527的第二抗體輕鏈。在一些具體實例中，結合蛋白包含針對表I3中的AS30_Hu6xC21_Hu11 duetmab顯示的兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈。

Gunasekaran等人探索了在通過改變在C_H3結構域介面處的電荷互補性來驅動Fc異二聚體的形成的同時保持疏水核整體性的可行性(Gunasekaran等人，2010,J.Biol.Chem.285(25)：19637-46)。利用操縱轉向機制，通過兩對週邊定位的帶電殘基的突變，這些構建體顯示有效促進了具有最低同二聚體污染的Fc異二聚體形成。與節入穴設計相反，同二聚體由於靜電排斥機制的性質而受到均勻抑制，但未完全避免。

Davis等人描述了通過使人IgG和IgA C_H3結構域的β鏈段互相交叉而將Fc同二聚體轉變成異二聚體的抗體工程方法，其中無需引入額外的鏈間二硫鍵(Davis等人，2010,Protein Eng.Des.Sei.23(4)：195-202)。藉由哺乳動物細胞表現SEEDbody(Sb)融合蛋白以高產率產生了Sb異二聚體，所述異二聚體易於被純化而消除次要副產物。

美國專利申請公開號US2010/331527A1描述了基於C_H3結構域的異二聚化的雙特異性抗體，在一條重鏈中在C_H3結構域內引入了突變H95R和Y96F。這些胺基酸取代來源於IgG3亞型的C_H3結構域，並將與IgG1主鏈異二聚化。易於與每條重鏈配對的共同輕鏈是基於通過C_H3結構域進行異二聚化的所有形式的先決條件。因此總共產生了三種類型的抗體：50%具有純IgG1主鏈，三分之一具有純H95R和Y96F突變的主鏈，以及三分之一具有兩種不同的重鏈(雙特異性)。期望的異二聚體可以從這種混合物中純化出來，因為它與蛋白A的結合特性與親本抗體不同：IgG3衍生的C_H3結構域不與蛋白A結合，而IgG1與蛋白A結合。因此，異二聚體與蛋白A結合，但相比於純IgG1同二聚體在更高的pH下洗脫，這使得可能選擇性地純化雙特異性異二聚體。

美國專利案號7,612,181描述了一種雙重可變結構域IgG(DVD-IgG)雙特異性抗體，其以美國專利案號5,989,830中描述的雙重Fv形式為基礎。在美國專利申請公開號US2010/0226923A1中也描述了類似的雙特異性形式。將恒定結構域添加至雙重Fv的對應鏈(C_H1-Fc添加至重鏈，並且κ或λ恒定結構域添加至輕鏈)產生功能性雙特異性抗體，無需任何另外的修飾(即，顯而易見地，添加恒定結構域來增強穩定性)。以DVD-Ig/TBTI形式表現的一些抗體顯示出對第二(或最裡面的)抗原結合位置(Fv2)的位置效應。取決於被Fv2位置識別的抗原的序列和性質，這種抗體結構域對其抗原顯示出降低的親和力(即，與親本抗體相比，結合率下降)。該觀察結果的一種可能的解釋是，V_L1和V_L2之間的連接子突入到Fv2的CDR區中，使得Fv2對較大的抗原有點不可接近。

在美國專利案號5,989,830中描述的雙特異性抗體片段的第二種構型為交叉雙頭(CODH)，其在兩條鏈上表現的可變結構域具有以下方向：對於輕鏈的V_L1-連接子-V_L2，和對於重鏈的V_H2-連接子-V_H1。

CDR、VH和VL結構域序列

下文描述的是可以任何數量、組合或構型用於本公開的的任何多特異性或雙特異性結合蛋白中的示例性CDR、VH結構域和VL結構域序列。

在本文所述的任何形式的一些具體實例中，本公開的V_H1/V_L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本公開的V_H2/V_L2結合對結合層黏連蛋白-2。

在一些具體實例中，V_H1結構域包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L1結構域包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H1結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L1結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H1結構域由選自SEQ ID NO：230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L1結構域由選自SEQ ID NO：231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列編碼。

在本文所述的任何形式的一些具體實例中，本揭示的V_H1/V_L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本接示的V_H2/V_L2結合對結合層黏連蛋白-2(例如，層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或LG-5)。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：51-55的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：66-70的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：71-75的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：190、192、194、196和198的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：191、193、195、197和199的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：250、252、254、256和258的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：251、253、255、257和259的核酸序列編碼。

在本文所述的任何形式的一些具體實例中，本揭示的V_H1/V_L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本揭示的V_H2/V_L2結合對結合層黏連蛋白-2(例如，層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和/或5或LG-4/5)。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：111-125的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列編碼。

在本文所述的任何形式的一些具體實例中，本揭示的V_H2/V_L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本揭示的V_H1/V_L1結合對結合層黏連蛋白-2。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列編碼。

在本文所述的任何形式的一些具體實例中，本揭示的V_H2/V_L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本揭示的V_H1/V_L1結合對結合層黏連蛋白-2(例如，層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或LG-5)。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：51-55的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：66-70的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：71-75的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：190、192、194、196和198的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：191、193、195、197和199的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：250、252、254、256和258的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：251、253、255、257和259的核酸序列編碼。

在本文所述的任何形式的一些具體實例中，本揭示的V_H2/V_L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本揭示的V_H1/V_L1結合對結合層黏連蛋白-2(例如，層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和/或5或LG-4/5)。在本文所述的任何形式的一些具體實例中，V_H2結構域包含包含選自SEQ ID NO：81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：111-125的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V_L2結構域包含包含選自SEQ ID NO：126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，V_H2結構域包含選自SEQ ID NO：200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_L2結構域包含選自SEQ ID NO：201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的胺基酸序列。在一些具體實例中，V_H2結構域由選自SEQ ID NO：260、262、264、 266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列編碼。在一些具體實例中，V_L2結構域由選自SEQ ID NO：261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列編碼。

適用於本揭示的結合蛋白的示例性CDR序列提供在以下表A-C中。適用於本揭示的結合蛋白的示例性VH和VL序列(多肽和核酸)提供在以下表D-I中。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的結合結構域，其中所述結合結構域包含VH結構域和/或VL結構域，所述VH結構域包含以下表A中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列，所述VL結構域包含以下表A中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列。在一些具體實例中，本公開的雙特異性結合蛋白包含結合層黏連蛋白-2的結合結構域，其中所述結合結構域包含VH結構域和/或VL結構域，所述VH結構域包含以下表B或表C中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列，所述VL結構域包含以下表B或表C中所示抗體的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或6個CDR序列。在一些具體實例中，本公開的雙特異性結合蛋白包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的結合結構域，其中所述結合結構域包含VH結構域和/或VL結構域，所述VH結構域包含與以下表D中所示的VH序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列，所述VL結構域包含與以下表D中所示的VL序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含結合層黏連蛋白-2的結合結構域，其中所述結合結構域包含VH結構域和/或VL結構域，所述VH結構域包含與以下表E或表F中所示的VH序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列，所述VL結構域包含與以下表E或表F中所示的VL序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的結合結構域，其中所述結合結構域包含VH結構域和/或VL結構域，所述VH結構域包含與由以下表G中所示的多核苷酸序列編碼的VH序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列，所述VL結構域包含與由以下表G中所示的多核苷酸序列編碼的VL序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含結合層黏連蛋白-2的結合結構域，其中所述結合結構域包含VH結構域和/或VL結構域，所述VH結構域包含與由以下表H或表I中所示的多核苷酸序列編碼的VH序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列，所述VL結構域包含與由以下表H或表I中所示的多核苷酸序列編碼的VL序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：9的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：18的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：28的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：38的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：43的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：170具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：171具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：230編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：231編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：10的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：19的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：29的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：38的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：43的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：172具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：173具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：232編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：233編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：2的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：11的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：20的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：30的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：39的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：44的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：174具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：175具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：234編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：235編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：3的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：12的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：21的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：31的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：40的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：45的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：176具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：177具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：236編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：237編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：4的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：13的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：22的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：32的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：41的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：178具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：179具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：238編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：239編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：4的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：13的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：23的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：33的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：41的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：46的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：180具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：181具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：240編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：241編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：5的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：14的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：24的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：34的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：42的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：47的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：182具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：183具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：242編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：243編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：6的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：15的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：25的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：35的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：40的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：48的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：184具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：185具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：244編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：245編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：7的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：16的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：26的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：36的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：40的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：49的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：186具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：187具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：246編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：247編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：8的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：17的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：27的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：37的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：40的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：50的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：188具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：189具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：248編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：249編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：51的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：56的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：61的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：66的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：71的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：76的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：190具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：191具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：250編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：251編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：52的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：57的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：62的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：67的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：72的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：77的CDR-L3。在一些具體實例中，本公開的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：192具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：193具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：252編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：253編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：53的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：58的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：63的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：68的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：73的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：78的CDR-L3。在一些具體實例中，本公開的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：194具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：195具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：254編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：255編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：54的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：59的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：64的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：69的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：74的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：79的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：196具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：197具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：256編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：257編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：55的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：60的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：65的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：70的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：75的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：80的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：198具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：199具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：258編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：259編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：81的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：96的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：111的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：126的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：141的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：155的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：200具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：201具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：260編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：261編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：82的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：97的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：112的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：127的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：142的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：156的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：202具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：203具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：262編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：263編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：83的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：98的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：113的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：128的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：143的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：157的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：204具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：205具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：264編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：265編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：84的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：99的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：114的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：129的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：144的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：158的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：206具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：207具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：266編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：267編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：85的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：100的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：115的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：130的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：145的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：159的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：208具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：209具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：268編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：269編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：86的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：101的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：116的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：131的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：146的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：160的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：210具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：211具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：270編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：271編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：87的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：102的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：117的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：132的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：147的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：161的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：212具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：213具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：272編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：273編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：88的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：103的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：118的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：133的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：148的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：162的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：214具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：215具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：274編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：275編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：89的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：104的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：119的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：134的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：149的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：163的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：216具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：217具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：276編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：277編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：90的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：105的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：120的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：135的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：150的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：164的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：218具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：219具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：278編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：279編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：91的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：106的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：121的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：136的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：1S1的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：165的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：220具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：221具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：280編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：281編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：92的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：107的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：122的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：137的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：152的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：166的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：222具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：223具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：282編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：283編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：93的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO：108的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：123的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：138的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：153的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：167的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：224具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：225具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：284編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：285編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：94的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：109的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：124的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：139的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：38的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：168的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：226具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：227具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：286編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：287編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含(a)VH結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：95的CDR-H1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：110的CDR-H2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：125的CDR-H3；和/或(b)VL結構域，其包含(i)包含胺基酸序列SEQ ID NO：140的CDR-L1、(ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：154的CDR-L2和(iii)包含胺基酸序列SEQ ID NO：169的CDR-L3。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與胺基酸序列SEQ ID NO：228具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與胺基酸序列SEQ ID NO：229具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。在一些具體實例中，本揭示的雙特異性結合蛋白包含與由多核苷酸序列SEQ ID NO：288編碼的VH結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VH結構域序列和/或與由多核苷酸序列SEQ ID NO：289編碼的VL結構域序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的VL結構域序列。

本領域技術人員將會理解，本文所述的任何抗肌營養不良蛋白聚糖抗體的CDR和/或VH/VL結構域可以按照任何組合或構型在雙特異性結合蛋白中與本文所述的任何抗層黏連蛋白-2抗體(例如，結合層黏連蛋白-2的LG-4/5和/或LG-5結構域的抗體)的CDR和/或VH/VL結構域組合(例如，具有對肌營養不良蛋白聚糖的細胞外結構域特異的V_H1/V_L1結合對和對層黏連蛋白-2特異的V_H2/V_L2結合對，或者具有對肌營養不良蛋白聚糖的細胞外結構域特異的V_H2/V_L2結合對和對層黏連蛋白-2特異的V_H1/V_L1結合對)。

本領域技術人員將會理解，本文所述的任何抗肌營養不良蛋白聚糖抗體的CDR和/或VH/VL結構域可以按照任何組合或構型在多特異性結合蛋白中與本文所述的任何抗層黏連蛋白-2抗體(例如，結合層黏連蛋白-2的LG-4/5和/或LG-5結構域的抗體)的CDR和/或VH/VL結構域組合。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表A2中所示的1個、2個、3個、4個、5個、6個或更多個CDR或來自表D2、I2、I3或I4中所示的可變結構域或多肽序列。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表D2、I2、I3或I4中所示的1個、2個、3個、4個、5個或6個可變結構域序列，或由表G2中所示的多核苷酸編碼的1個、2個、3個、4個、5個或6個可變結構域序列(例如1個、2個或3個VH/VL結合對，各自包含VH和VL域)。在一些具體實例中，本公開的結合蛋白(例如，多特異性結合蛋白)包含表I4中所示的1個、2個、3個或4個可變結構域框架序列。

靶蛋白

本文中提供了包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的結合結構域和結合層黏連蛋白-2的結合結構域的多特異性結合分子(例如，結合蛋白)。術語“結合”和“特異性結合”在本文中可互換使用。在一些具體實例中，“結合”抗原(例如，層黏連蛋白-2或肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分)的結合結構域以小於或等於約1 x 10^-6M的K_D與抗原結合。在一些具體實例中，使用單價抗體或其抗原結合片段中的抗原結合結構域來測定抗原結合結構域與抗原(例如，抗原表位)的結合親和力(例如，K_D)。在一些具體實例中，使用本揭示的多特異性形式的抗原結合結構域來測定抗原結合結構域與抗原(例如，抗原表位)的結合親和力(例如，K_D)。

如本文中使用的，肌營養不良蛋白聚糖(DG)是指肌營養不良蛋白相關蛋白，其用作將細胞外基質(ECM，也稱為基膜)與肌纖維的F-肌動蛋白相關細胞骨架連接的肌營養不良蛋白複合物的組分。肌營養不良蛋白聚糖包含兩個亞基：α肌營養不良蛋白聚糖和β肌營養不良蛋白聚糖，它們在轉譯後被切割並且彼此非共價結合。在一些具體實例中，肌營養不良蛋白聚糖是人肌營養不良蛋白聚糖(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.1605中列出的人DAG1基因編碼的蛋白質，或與UniProt Entry Q14118對應的蛋白質)。在一些具體實例中，肌營養不良蛋白聚糖是小鼠肌營養不良蛋白聚糖(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.13138中列出的小鼠Dag1基因編碼的蛋白質，或與UniProt Entry Q62165對應的蛋白質)。

在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合α-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，本公開的結合結構域結合β-肌營養不良蛋白聚糖。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合序列 (SEQ ID NO：290)內的表位元或區域。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合序列 (SEQ ID NO：291)內的表位元或區域。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。

在一些具體實例中，本揭示的結合結構域以低於約1μM、低於約500nM、低於約400nM、低於約300nM、低於約200nM、低於約100nM、低於約50nM、低於約25nM、低於約10nM或低於約1nM的平衡解離常數(KD)結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，當結合結構域處於雙特異性形式而不是作為單特異性結合結構域(如單特異性抗體)時，測量本揭示的結合結構域與人肌營養不良蛋白聚糖的胞外部分之間的結合親和力。在一些具體實例中，當作為多特異性結合蛋白的一部分測定時，本揭示的結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點以低於約1μM、低於約500nM、低於約400nM、低於約300nM、低於約200nM、低於約100nM、低於約50nM、低於約25nM、低於約10nM或低於約1nM的平衡解離常數(K_D)結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。

如本文中使用的，層黏連蛋白-2(也稱為分層蛋白)是指與肌營養不良蛋白聚糖結合的細胞外基底膜蛋白。層黏連蛋白-2由三個亞基組成：α、β和γ。在一些具體實例中，層黏連蛋白-2是人層黏連蛋白亞基α2(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.3908中列出的人LAMA2基因編碼的蛋白質，或與UniProt Entry P24043對應的蛋白質)。在一些具體實例中，層黏連蛋白-2是小鼠層黏連蛋白亞基α2(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.16773中列出的小鼠Lama2基因編碼的蛋白質，或與UniProt Entry Q60675對應的蛋白質)。

在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，本公開的結合結構域結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。在一些具體實例中，本公開的結合結構域結合包含序列 (SEQ ID NO：300)的多肽。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合序列 (SEQ ID NO：300)內的表位元或區域。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。在一些具體實例中，本公開的結合結構域結合序列 (SEQ ID NO：292)內的表位元或區域。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合序列 (SEQ ID NO：301)內的表位元或區域。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合序列 (SEQ ID NO：293)內的表位元或區域。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合小鼠層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，本揭示的結合結構域結合人和小鼠層黏連蛋白-2。

在一些具體實例中，本揭示的結合結構域以低於約1μM、低於約500nM、低於約400nM、低於約300nM、低於約200nM、低於約100nM、低於約50nM、低於約25nM、低於約10nM或低於約1nM的平衡解離常數(K_D)結合人層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，當結合結構域處於雙特異性形式而不是作為單特異性結合結構域(如單特異性抗體)時，測量本揭示的結合結構域與人層黏連蛋白-2之間的結合親和力。在一些具體實例中，當作為多特異性結合蛋白的一部分測定時，本公開的結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點以低於約1μM、低於約500nM、低於約400nM、低於約300nM、低於約200nM、低於約100nM、低於約50nM、低於約25nM、低於約10nM或低於約1nM的平衡解離常數(K_D)結合人層黏連蛋白-2。

在一些具體實例中，本揭示的V_H1/V_L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本揭示的V_H2/V_L2結合對結合層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，本揭示的V_H2/V_L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且本揭示的V_H1/V_L1結合對結合層黏連蛋白-2。

抗體

本揭示還提供了包含表A2、D2或I4中所示結合結構域的1、2、3、4、5或6個CDR序列，或表D2或I4中所示結合結構域的VH和/或VL結構域序列，或由表G2中所示多核苷酸序列編碼的抗體(例如，單價和/或單株抗體)。在一些具體實例中，抗體結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。在一些具體實例中，抗體結合層黏連蛋白-2。在一些具體實例中，抗體包含(a)包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含選自SEQ ID NO：1-8的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：9-17的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：18-27的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含選自SEQ ID NO：28-37的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38-42的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：43-50的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含選自SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的胺基酸序列；並且VL結構域包含選自SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的胺基酸序列。在一些具體實例中，抗體包含(a)包含重鏈可變結構域 (VH)的抗體重鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3；和(b)包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：314，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：330。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：346，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：362。在一些具體實例中，抗體包含(a)抗體重鏈，所述抗體重鏈包含包含選自SEQ ID NO：51-55和81-95的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自SEQ ID NO：56-60和96-110的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自SEQ ID NO：61-65和111-125的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述輕鏈可變結構域包含包含選自SEQ ID NO：66-70和126-140的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自SEQ ID NO：38、71-75和141-154的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自SEQ ID NO：76-80和155-169的胺基酸序列的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含選自SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的胺基酸序列；並且VL域包含選自SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的胺基酸序列。在一些具體實例中，抗體包含包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2 和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3。在一些具體實例中，抗體包含包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3。在一些具體實例中，抗體包含包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。在一些具體實例中，抗體包含包含重鏈可變結構域(VH)的抗體重鏈和包含輕鏈可變結構域(VL)的抗體輕鏈，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：378，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：394。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：410，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：426。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：442，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：458。在一些具體實例中，VH結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：474，並且VL結構域包含胺基酸序列SEQ ID NO：490。

核酸

本文中提供了包含編碼本揭示的任何多特異性(例如，雙特異性)結合分子(例如，雙特異性結合蛋白)的核苷酸序列的分離的核酸分子。

使用標準重組DNA方法來構建編碼形成結合蛋白的多肽的多核苷酸，將這些多核苷酸組入重組表現載體中，並將這樣的載體引入宿主細胞中。參見例如，Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd ed.)。酶促反應和純化技術可以根據製造商的說明書如本領域通常所完成、或如本文所述來進行。除非提供具體的定義，否則所使用的與本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學有關的術語以及實驗室程式和技術是本領域熟知和常用的那些。類似地，常規技術可用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製、遞送和患者的治療。

本揭示的其他方面涉及包含編碼本文所述的任何結合蛋白或其多肽鏈的核苷酸序列的分離的核酸分子。在一些具體實例中，分離的核酸可與異源啟動子可操作連接以指導編碼結合蛋白的核酸序列的轉錄。啟動子可以指的是指導核酸轉錄的核酸控制序列。當第一核酸序列置於與第二核酸序列的功能性關係中時，所述第一核酸序列與所述第二核酸序列可操作連接。例如，如果啟動子影響結合蛋白的編碼序列的轉錄或表現，那麼該啟動子與該編碼序列可操作連接。啟動子的實例可以包括但不限於：從病毒基因組(比如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)獲得的啟動子，來自異源真核啟動子(比如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子，來自熱休克啟動子等)，CAG啟動子(Niwa等人，Gene 108(2)：193-9,1991)，磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子，四環素誘導型啟動子(Masui等人，Nucleic Acids Res.33：e43,2005)，lac系統，trp系統，tac系統，trc系統，λ 噬菌體的主要操縱子和啟動子區域，3-磷酸甘油酸激酶啟動子，酵母酸性磷酸酶啟動子以及酵母α-交配因數啟動子。編碼本公開內容的結合蛋白的多核苷酸可處於組成型啟動子、誘導型啟動子、或本文所述的任何其他適合的啟動子或本領域技術人員將容易認識到的其他適合的啟動子的控制之下。

在一些具體實例中，將分離的核酸組入載體中。在一些具體實例中，載體是表現載體。表現載體可以包括一個或多個與有待表現的多核苷酸可操作連接的調控序列。術語“調控序列”包括啟動子、增強子、和其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。適合的增強子的實例可以包括但不限於來自哺乳動物基因(比如珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白、胰島素等)的增強子序列，以及來自真核細胞病毒的增強子序列(比如在複製起點遲側(late side)(bp 100-270)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在複製起點遲側的多瘤增強子、腺病毒增強子等)。適合的載體的實例可以包括例如質體、黏粒、附加體、轉座子和病毒載體(例如腺病毒、牛痘病毒、辛德畢斯病毒、麻疹病毒、皰疹病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒載體等)。表現載體可用於轉染宿主細胞，例如像細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。能夠在宿主中表現和複製的生物功能性病毒載體和質體DNA載體是本領域已知的，並且可以用於轉染任何感興趣的細胞。

本文中進一步提供了包含多個載體的載體系統，其中多個載體共同編碼本揭示的雙特異性結合蛋白。例如，在一些具體實例中，載體系統包含編碼本揭示的雙特異性結合分子的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一個或多個載體。在一些具體實例中，載體系統包含本公開的雙特異性結合分子的第一、第二、第三和第四多肽鏈。

宿主細胞和產生結合蛋白的方法

本揭示的其他方面涉及包含本文所述的一個或多個分離的多核苷酸、載體和/或載體系統的宿主細胞(例如分離的宿主細胞)。在一些具體實例中，將本公開的分離的宿主細胞在體外培養。在一些具體實例中，宿主細胞是細菌細胞(例如，大腸桿菌細胞)。在一些具體實例中，宿主細胞是酵母細胞(例如，釀酒酵母細胞)。在一些具體實例中，宿主細胞是昆蟲細胞。昆蟲宿主細胞的實例可以包括例如果蠅(Drosophila)細胞(例如，S2細胞)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞(例如，High Five^TM細胞)和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(例如，Sf21或Sf9細胞)。在一些具體實例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物宿主細胞的實例可以包括例如人胚腎細胞(例如，亞克隆用於懸浮培養生長的293或293細胞)、Expi293^TM細胞、CHO細胞、幼倉鼠腎細胞(例如，BHK，ATCC CCL10)、小鼠塞托利(Sertoli)細胞(例如，TM4細胞)、猴腎細胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(例如，VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宮頸癌細胞(例如，HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(例如，MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝細胞(例如，BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺細胞(例如，W138，ATCC CCL 75)、人肝細胞(例如，Hep G2,HB 8065)、小鼠乳腺腫瘤細胞(例如，MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、人肝細胞瘤系(例如，Hep G2)和骨髓瘤細胞(例如，NS0和Sp2/0細胞)。

本揭示的其他方面涉及產生本文所述的任何結合蛋白的方法。在一些具體實例中，所述方法包括：a)將包含分離的核酸、載體和/或載體系統(例如，本文所述的分離的核酸、載體和/或載體系統的任一者)的宿主細胞(例如，本文所述的任何宿主細胞)在使得所述宿主細胞表現結合分子的條件下培養；和b)從所述宿主細胞分離所述結合分子。

在一些具體實例中，可以使用多種宿主細胞產生雙特異性結合分子(例如，蛋白質)的組分，然後將所述組分裝配成雙特異性結合分子。在一些具體實例中，本文中提供了產生雙特異性結合蛋白的方法，所述雙特異性結合蛋白包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域，所述方法包括：a)在這樣的條件下培養包含編碼包含第一結合結構域的第一多肽鏈的核酸分子的第一宿主細胞，使得宿主細胞表現作為具有第一CH3結構域的第一單特異性結合蛋白的一部分的所述第一多肽鏈；b)在這樣的條件下培養包含編碼包含第二結合結構域的第二多肽鏈的核酸分子的第二宿主細胞，使得宿主細胞表現作為具有第二CH3結構域的第二單特異性結合蛋白的一部分的所述第二多肽鏈；c)從第一宿主細胞分離第一單特異性結合蛋白；d)從第二宿主細胞分離第二單特異性結合蛋白；e)在足以使鉸鏈區中的半胱胺酸發生二硫鍵異構化的還原條件下溫育分離的第一和第二單特異性結合蛋白；和f)獲得雙特異性結合蛋白，其中第一和第二CH3結構域是不同的並且使得所述第一和第二CH3結構域之間的異二聚體相互作用比所述第一和第二CH3結構域各自的同二聚體相互作用更強。關於更詳細的描述，參見例如，US PG公開號US2013/0039913和Labrijn,A.F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.110：5145-5150。

在表現蛋白質的條件下培養宿主細胞的方法是本領域普通技術人員熟知的。從培養的宿主細胞中分離蛋白質的方法是本領域普通技術人員熟知的，包括例如親和色譜法(例如，包括蛋白A親和色譜隨後是大小排阻色譜的兩步親和色譜法)。

結合蛋白的用途

本文中進一步提供了用於治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向個體施用本公開的雙特異性結合分子。本文中還提供了用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的方法，所述方法包括向個體施用本公開的雙特異性結合分子。本文中進一步提供了在治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病中使用的包含本公開的雙特異性結合分子和說明書的套組。在一些具體實例中，所述個體是人。

本文中進一步提供了用於治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向個體施用本公開的多特異性結合分子。本文中還提供了用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的方法，所述方法包括向個體施用本公開的多特異性結合分子。本文中進一步提供了在治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病中使用的包含本公開的多特異性結合分子和說明書的套組。在一些具體實例中，所述個體是人。

在一些具體實例中，所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現(例如，與對照個體或缺乏本文所述基因突變的個體中的表現相比)。在一些具體實例中，表現是指在一種或多種組織例如肌肉組織中的表現。

在一些具體實例中，在所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化(例如，與對照個體或缺乏本文所述基因突變的個體中的表現相比)。

在一些具體實例中，所述個體已被診斷為α-肌營養不良蛋白聚糖病或具有發生它的傾向。在一些具體實例中，所述個體具有在選自以下組的基因中的突變：肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖 β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。

在一些具體實例中，藉由靜脈輸注、肌內注射、腹膜內注射或皮下注射施用本公開的雙特異性結合分子。

結合蛋白可以在任何已知的測定方法中使用，比如用於檢測和定量一種或多種靶抗原的競爭性結合測定、直接和間接夾心測定、以及免疫沉澱測定。結合蛋白將以適用於所採用的測定方法的親和力結合一種或多種靶抗原。

本文中還提供了包含本揭示的雙特異性結合分子和任選的藥學上可接受的載劑的藥學組合物。

本文中還提供了包含本揭示的多特異性結合分子和任選的藥學上可接受的載劑的藥學組合物。

所述藥學組合物可以含有用於改變、維持或保留例如組合物的pH、滲透性、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶出或釋放速率、吸附或滲透的製劑材料。適合的製劑材料包括但不限於胺基酸(比如甘胺酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(比如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝劑(比如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、增量劑(比如甘露醇或甘胺酸)、螯合劑(比如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡合劑(比如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填充劑、單糖、二糖和其他碳水化合物(比如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(比如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(比如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽抗衡離子(比如鈉)、防腐劑(比如苯紮氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(比如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(比如甘露醇或山梨糖醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑(如普朗尼克類；PEG；脫水山梨糖醇酯；聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；曲拉通；氨丁三醇；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、穩定性增強劑(比如蔗糖或山梨糖醇)、張度增強劑(比如鹼金屬鹵化物-例如氯化鈉或氯化鉀-或甘露醇山梨糖醇)、遞送載體、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company 1990)及其後續版本，出於任何目的通過提述將其併入本文)。在所採用的劑量和濃度下，可接受的製劑材料對接受者是無毒的。

本領域技術人員將會根據例如預期的給藥途徑、遞送形式和期望劑量來確定最佳藥學組合物。這樣的組合物可能影響結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。

藥學組合物中的主要媒介物或載體在性質上可以是水性或非水性的。例如，用於注射的適合的媒介物或載體可以是水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，其可能補充有用於腸胃外給藥的組合物中常見的其他物質。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是進一步的示例性媒介物。其他示例性藥學組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，其可進一步包含山梨糖醇或適合的替代物。在本公開的一個具體實例中，可以通過將具有期望純度的選定組合物與凍乾餅或水溶液形式的任選的配製劑混合來製備用於儲存的結合蛋白組合物。此外，可以使用適當的賦形劑如蔗糖將結合蛋白配製為凍乾物。

配製組分以給藥部位可接受的濃度存在。例如，使用緩衝劑將組合物保持在生理pH或稍低的pH下，通常在約5至約8的pH範圍內。

當考慮腸胃外給藥時，供使用的治療組合物可以是無熱原的、腸胃外可接受的水溶液的形式，其包含在藥學上可接受的載劑中的期望的結合蛋白。用於腸胃外注射的特別適合的媒介物是無菌蒸餾水，其中結合蛋白被配製為適當保存的無菌等滲溶液。還有另一種製劑可涉及以作用劑配製期望的分子，所述作用劑例如可注射微球、可生物蝕解的顆粒、高分子化合物(比如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂質體，這些作用劑為產品提供控制釋放或持續釋放，然後可以通過積存注射來遞送產品。也可以使用透明質酸，這可以具有促進持久的迴圈持續時間的作用。用於引入期望的分子的其他適合的手段包括可植入藥物遞送裝置。

也考慮到某些製劑可以口服施用。在本揭示的一個具體實例中，以這種方式施用的結合蛋白可以配製有(或沒有)通常用於調配固體劑型(如片劑和膠囊)的那些載體。例如，膠囊可設計成在胃腸道中的一定位置處釋放製劑的活性部分，在所述位置處的生物利用度被最大化並且系統前降解被最小化。可以包括另外的作用劑以促進結合蛋白的吸收。也可以使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和黏合劑。

另一種藥學組合物可以包含有效量的結合蛋白與適合製造片劑的無毒賦形劑的混合物。通過將片劑溶解在無菌水或其他適當的媒介物中，可以以單位劑量形式製備溶液。適合的賦形劑包括但不限於惰性稀釋劑，比如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，比如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或潤滑劑，比如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。

本揭示的另外的藥學組合物對於本領域技術人員將是顯而易見的，包括處於持續或控制遞送製劑形式的包含結合蛋白的配方。用於配製各種其他持續或控制遞送手段(比如脂質體載體、生物可蝕解的微粒或多孔珠和積存注射劑)的技術也是本領域技術人員已知的。另外的持續釋放製劑的實例包括呈成形物品的形式的半透性聚合物基質，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚乳酸、L-谷胺酸和γ-乙基-L-谷胺酸酯的共聚物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羥基丁酸。持續釋放組合物還可以包括脂質體，其可以通過本領域已知的幾種方法中的任何一種來製備。

用於體內施用的藥學組合物通常必須是無菌的。這可以通過無菌過濾膜的過濾來實現。在組合物被凍乾的情況下，可以在凍乾和復原之前或之後使用這種方法進行滅菌。用於腸胃外施用的組合物可以以凍乾形式或溶液形式儲存。另外，通常將腸胃外組合物置於具有無菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。

一旦配製了藥學組合物，其可以作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。這種製劑可以以即用形式或以施用前需要復原的形式(例如，凍乾)儲存。

本揭示還包括用於產生單-劑量施用單位的套組。套組可以各自容納具有乾燥蛋白質的第一容器和具有含水製劑的第二容器這兩者。在本揭示範圍內還包括容納單室和多室預填充注射器(例如液體注射器和凍乾劑注射器)的套組。

例如，在治療上採用的結合蛋白藥學組合物的有效量將取決於治療背景和目標。本領域技術人員將理解，治療的適當劑量水準因此部分地取決於所遞送的分子、正在使用的結合蛋白的適應症、給藥途徑以及患者的大小(體重、體表或器官大小)和狀況(年齡和一般健康狀況)而變化。因此，臨床醫師可以逐步增加劑量並修改給藥途徑以獲得最佳治療效果。

給藥頻率將取決於所用製劑中結合蛋白的藥代動力學參數。通常，臨床醫師將施用組合物直至達到實現預期效果的劑量為止。因此，組合物可以作為單劑量施用，隨著時間的推移作為兩個或更多個劑量(其可以含有或不含相同量的期望的分子)施用，或經由植入裝置或導管連續輸注。常規地由本領域普通技術人員做出適當劑量的進一步改進，並且這在他們常規進行的任務範圍內。通過使用適當的劑量-反應資料可以確定適當的劑量。

通過參考以下實施例將更充分地理解本公開。然而，它們不應被解釋為限制本公開的範圍。可以理解的是，在本文中描述的實施例和具體實例僅用於說明的目的，依照它們的各種修改或改變將對本領域技術人員作出暗示並且將被包括在本申請的精神和許可權以及所附權利要求書的範圍內。

實施例 實施例1：抗β-DG ECD、抗LG-5和抗LG-4/5抗體的鑑定。 方法

蛋白質表現

為了表現鼠β-DG細胞外結構域(mβ-DG ECD)，產生了含有大腸桿菌密碼子優化的盒的構建體，所述盒編碼N端麥芽糖結合蛋白、TEV切割位點、mβ-DG(UniProt Q62165，胺基酸652-746)和C端HPC4標籤，以pET22b作為親本載體骨架。將構建體轉化到化學感受態Origami B(DE3)pLysS細胞(Novagen)中。在37℃進行表現，在OD=0.6時進行ITPG誘導。將細胞沉澱並重懸於含有不含EDTA的蛋白酶抑制劑(Roche)的裂解緩衝液中並通過超聲裂解。通過如下步驟從澄清的細胞裂解物純化mβ-DG-HPC4：在直鏈澱粉樹脂柱(New England Biolabs)上處理細胞裂解物，用Turbo TEV蛋白酶(Eton Biosciences)切割麥芽糖結合蛋白，在直鏈澱粉樹脂和His-Trap FastFlow柱(GE Healthcare)上處理消化物以去除未消化的融合蛋白和切割的麥芽糖結合蛋白，並且處理與小鼠抗HPC4抗體偶聯的NHS活化的Sepharose 4 FastFlow樹脂(GE Healthcare)的流出物。在Superdex 75大小排阻柱(GE Healthcare)上進行進一步純化，收集和合併具有高度純化的mβ-DG-HPC4(如通過在SDS-PAGE凝膠上運行級分樣品和考馬斯染色測定的)的洗脫級分。

為了表現鼠或人層黏連蛋白G樣結構域5(mLG-5或hLG-5)，產生了含有哺乳動物密碼子優化的盒的構建體，所述盒編碼N端Avi和HPC4標籤以及mLG-5(參見UniProt Q60675，胺基酸2932-3118；SEQ ID NO：292)或hLG-5(UniProt P24043，胺基酸2936-3122；SEQ ID NO：293)。將構建體用於使用Expifectamine試劑(Thermo Fisher)轉染Expi293F細胞。表現7天后，用與小鼠抗HPC4抗體偶聯的NHS活化的Sepharose 4 FastFlow樹脂(GE Healthcare)從上清液純化可溶性生物素化蛋白質。

為了表現鼠或人層黏連蛋白G樣4和5結構域5(mLG-4/5或hLG-4/5)，產生了含有哺乳動物密碼子優化的盒的構建體，所述盒編碼N端mIgG2融合配偶體、TEV切割位點、Avi標籤、HPC4標籤以及mLG-4/5(參見UniProt Q60675，胺基酸2725-3118；SEQ ID NO：292)或hLG-4/5(UniProt P24043，胺基酸2729-3122；SEQ ID NO：293)。將構建體用於使用Expifectamine試劑(Thermo Fisher)轉染Expi293F細胞。表現7天后，用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)從上清液中純化可溶性蛋白。使用Turbo TEV蛋白酶 (Nacalai USA)將mIgG2a從mLG-4/5蛋白上切下，通過MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare)和Ni-NTA樹脂(Qiagen)處理消化物以從純化的mLG-4/5中去除mIgG2a和TEV蛋白酶。

噬菌體展示

將純化的mβ-DG、mLG-5或mLG-4/5和hLG-4/5(例如，在使用小鼠和人肽之間交替)與甲苯磺醯基活化的磁珠(Invitrogen)偶聯並用於富集針對mβ-DG、mLG-5或mLG-4/5結合物的噬菌體展示文庫。將抗體噬菌體展示文庫用於mβ-DG選擇，將Dyax FAB 310抗體噬菌體展示文庫用於hLG-4/5和mLG-4/5選擇。首先使用未包被的珠子和帶HPC4-6xHis-Avi標籤的無關蛋白質耗盡文庫的非特異性結合物。然後對耗盡的文庫進行三輪選擇，每輪使用遞減濃度的抗原(從第1輪的500nM抗原至第3輪的1nM抗原)。將富集的文庫接種在平板上，挑取單獨的文庫克隆並以96孔格式培養，產生針對每個克隆的噬菌體單株抗體用於噬菌體ELISA結合測定。

噬菌體ELISA結合測定

將純化的抗原(mβ-DG、mLG-5、hLG-5、mLG-4/5或hLG-4/5)以1μg/ml包被在Nunc MaxiSorp 96-孔ELISA板(Thermo Scientific)上。將來自選定文庫選殖體的噬菌體單株抗體加入到每個孔中，使用抗M13銪標記的二級抗體(GE Healthcare，通過Perkin Elmer定制標記的抗體)檢測陽性或陰性結合。

可變區測序

將陽性結合克隆的細菌原液PCR擴增並測序，鑑定出獨特的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)序列。

結果

鑑定了若干個對β-DG、LG-5和LG-4/5具有特異性結合親和力的噬菌體文庫克隆：10個特異性結合β-DG的選殖體和15個特異性結合LG-4/5的選殖體。這些選殖體的測序顯示，每個選殖體的重鏈可變區和輕鏈可變區是不同的，如上文表D至I所示(參見例如，選殖體B04、B06、CL-40968、CL-40992、CL-41136、CL-41400和CL-41500)。在上文表A至C中鑑定了這些選殖體的互補決定區(CDR)。

實施例2：靶向針對β-DG、LG-5和LG-4/5的融合瘤、單株抗體和嵌合抗體的產生。 方法

細胞系生產

通過將含有N端myc標籤和β-DG(小鼠UniProt Q62165，胺基酸652-893；人UniProt Q14118，胺基酸654-895)的細胞外和內源跨膜結構域的構建體進行密碼子優化，建立具有人或鼠β-DG表面表現的穩定細胞系。使用lipofectamine(Thermo Fisher)轉染貼壁的人胚腎細胞(HEK)和貼壁的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)，並且用遺傳黴素(Gibco)選擇細胞。將存活的細胞連續稀釋以達到單細胞可選殖性，並通過抗myc流式細胞術證實β-DG的表面表現。

通過將含有N端myc標籤、Gly/Ser連接子、LG-5(小鼠UniProt Q60675，胺基酸2932-3118；人UniProt P24043，胺基酸2936-3122)和用於哺乳動物表現的Tfr1跨膜結構域的構建體進行密碼子優化，建立具有人或鼠LG-5表面表現的穩定細胞系。使用lipofectamine(Thermo Fisher)轉染貼壁的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)，並且用遺傳黴素(Gibco)選擇細胞。將存活的細胞連續稀釋以達到單細胞可選殖性，並通過抗myc流式細胞術證實β-DG的表面表現。

通過將含有N端myc標籤、Gly/Ser連接子、LG-4/5(小鼠UniProt Q60675，胺基酸2725-3118；人UniProt P24043，胺基酸2729-3122)和用於哺乳動物表現的Tfr1跨膜結構域的構建體進行密碼子優化，建立具有人或鼠LG-4/5表面表現的穩定細胞系。使用lipofectamine(Thermo Fisher)轉染貼壁的人胚腎細胞(HEK)，並且用遺傳黴素(Gibco)選擇細胞。將存活的細胞連續稀釋以達到單細胞可選殖性，並通過抗myc流式細胞術證實β-DG的表面表現。

小鼠免疫

用hβ-DG、hLG-5或hLG-4/5免疫Balb/c和Trianni小鼠，然後用這些蛋白質加強3-4次，每兩周進行。對於用hLG-4/5免疫的小鼠，另外將小鼠用人分層蛋白加強3次，每2周進行，並且用具有在人和小鼠LG-5之間的相同序列的合成肽(胺基酸序列=GFAKAVGGFKVGLDLLVEFE；SEQ ID NO：295)加強一次。

融合瘤產生

通過將缺乏腺苷磷酸核糖基轉移酶(APRT)的小鼠骨髓瘤細胞(來自Balb/c B淋巴母細胞系，SP2/0，與仙台病毒融合)與來自免疫小鼠的脾細胞融合來製備融合瘤細胞。進行HAT選擇(次黃嘌呤、重氮絲胺酸和胸腺嘧啶)和連續稀釋以實現單細胞可選殖性。

ELISA抗體結合測定

對於ELISA測定，用PBS中的5%胎牛血清阻斷在人β-DG或LG-4/5中包被的平板，並將每個孔用不同的培養上清液溫育。用PBS洗滌平板，用HRP綴合的抗小鼠Fc二級抗體溫育，再次用PBS洗滌，並顯色以進行比色測量。

螢光啟動細胞分選(FACS)抗體結合測定

對於FACS分析，將具有人或鼠β-DG或LG-4/5表面表現的穩定細胞(見上文)與含有抗體的培養物上清液一起溫育，用PBS洗滌，用FITC綴合的抗小鼠Fc二級抗體(Thermo Fisher)溫育，再次用PBS洗滌，並在流式細胞儀上分析。

表面等離振子共振(Biacore)動力學測定

根據製造商的方案(GE Healthcare)，通過Biacore動力學測定法測量抗體/抗原結合親和力和結合/解離速率，進一步表徵融合瘤抗體(包含在培養上清液中)。用於結合的抗原是人或鼠β-DG或LG-4/5。

單株抗體產生

將融合瘤選殖擴增並接種到具有超低IgG胎牛血清補充物的末端燒瓶中。7天后，收穫上清液並使用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)純化單株抗體。通過ELISA、FACS和Biacore動力學測定(GE Healthcare)再次測試所得的抗體以證實抗體的結合特性。

免疫螢光

用未固定的冷凍人和小鼠肌肉組織切片進行免疫螢光染色。用針對β-DG或LG-4/5的純化抗體將肌肉組織切片染色，洗滌，用螢光標記的抗小鼠IgG二級抗體染色，洗滌，封片，並使用螢光顯微鏡成像。

可變區測序

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)從產生高親和力抗體的融合瘤細胞中分離總RNA，使用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech)合成第一鏈cDNA。使用同種型特異性引物通過5' cDNA末端快速擴增(5'-RACE)PCR擴增VH和VL基因區段。將擴增的PCR片段選殖並測序。參見例如，選殖體TDG-2、TDI-11、TDI-23、TDI-38、TLF39、TLF86、TLG3/TLG4、TLG26、TLI-3、TLI-7、TTLK71-4-6、TTLK123-3、TTLK145-6-3、TTLK170-2、WJL10和WJL48。

嵌合抗體生產

將從5'-RACE PCR產生的VH和VL序列針對哺乳動物表現進行密碼子優化和合成。將VH序列亞選殖到具有人IgG1的哺乳動物表現載體中，並將VL序列亞選殖到具有恒定人κ鏈的哺乳動物表現載體中。使用Expifectamine試劑(Thermo Fisher)，用這些構建體共轉染Expi293F細胞以表現嵌合抗體。表現7天后，用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE)從上清液中純化抗體。通過ELISA、FACS和Biacore(GE Healthcare)重新篩選純化的抗體以證實對β-DG、LG-5或LG-4/5的結合親和力。為了證實肌肉組織中與其對應抗原結合的抗體，用未固定的冰凍的人和小鼠肌肉組織切片進行免疫螢光染色。

結果

為了篩選和選擇產生對β-DG、LG-5或LG-4/5特異的抗體的融合瘤，使用ELISA、FACS分析和Biacore動力學測定來評估抗體結合。ELISA測定顯示了抗體與β-DG、LG-5或LG-4/5的一系列結合親和力，其中幾個樣品產生強比色信號(三種抗體的示例性資料提供在下表J中)。

對於產生強比色信號的樣品，使用FACS測定了抗體與細胞表面上表現β-DG或LG-4/5的細胞的結合親和力。FACS分析顯示，衍生自選殖體C21和C3的抗體對鼠和人LG-4/5兩者都具有結合親和力(分別見圖3C和3G)。這些抗體不結合缺乏β-DG或LG-4/5表面表現的對照細胞，正如通過不顯著的螢光檢測所示。

將不同量的重組人層黏連蛋白-2(來自Biolamina)、鼠LG-5、人LG-5、人LG4/5斑點印跡到硝酸纖維素膜上，並用抗層黏連蛋白-2抗體進行探測。結果表明，抗體識別層黏連蛋白-2或其含有LG-5的片段(圖3D，頂部為C21)。為了確定抗體特異性，將具有不同α鏈的不同層黏連蛋白同種型點到印跡上。只有含α-2的mLG-5和人層黏連蛋白-2才被識別，這支援抗體的結合特異性(圖3D，底部為C21；圖3H為C3)。

抗肌營養不良蛋白聚糖抗體選殖體也被定特徵。動力學顯示，所有測試的抗體顯示出針對其對應的抗原的高親和力，其中大多數KD在10^-9M範圍內(納莫耳靈敏度)，正如在表K以及圖3I和3J(選殖體AS30)以及圖3M和3N(選殖體AS19)中所示。另外，除了具有非常高的結合和解離速率的抗β-DG選殖體AS19之外，測試抗體的結合和解離速率對於高親和力抗體相當具有代表性(表K)。

為了將選殖體AS30和AS19定特徵，將不同量的重組小鼠或人β-DG ECD、重組肌營養不良蛋白聚糖(來自R & D Systems)、C2C12細胞裂解物、TA裂解物和作為陰性對照的法布瑞酶點印到硝酸纖維素膜上，並且用抗β-DG抗體進行探測(圖3K為AS30；圖3O為AS19)。結果表明，所有含β-DG的蛋白質均被檢出。對於C2C12或TA裂解物檢測不到信號，原因可能在於這些樣品中的β-DG量很低。正如預期，抗體也未檢出陰性對照法布瑞酶。

利用抗β-DG選殖體AS30或AS19，進行在非變性條件下溶解的來自 C2C12細胞裂解物的β-DG的免疫沉澱。β-DG/抗體複合物被蛋白A珠捕獲並在SDS-PAGE上運行，然後用來自R & D Systems的抗α-DG和抗β-DG再次探測。α-DG和β-DG兩者都被免疫沉澱，表明它們溶解後保留在複合物中，並且抗β-DG抗體選殖體的結合不干擾α-DG與β-DG的結合(圖3L為AS30；圖3P為AS19)。

在擴增融合瘤選殖體並且純化單株抗體之後，通過ELISA、FACS和Biacore重新篩選抗體以證實結合親和力。結果與來自培養物上清液的抗體所產生的結果極為相似，證實擴增後的抗體保留了它們的動力學特徵。

為了確定抗體是否能夠與含有豐富的β-DG和LG-4/5的肌肉組織結合，使用純化抗體對小鼠和人肌肉組織進行免疫螢光染色。使用未固定的組織以保持天然抗原構象。清楚地證明瞭對於人和小鼠組織的特徵性的肌膜染色，表明針對C21(圖4A)和C3(圖4B)的特異性LG-4/5結合以及針對AS30(圖4C)和AS19(圖4D)的特異性β-DG結合。僅用二級抗體染色的切片沒有顯示任何螢光信號。

實施例3：識別β-DG和層黏連蛋白-2 α亞基的LG-4/5結構域的雙特異性抗體的產生 方法

四價雙特異性串聯Ig(TBTI)抗體的產生

將獲自產生的融合瘤細胞的VH和VL序列針對哺乳動物表現進行密碼子優化和合成(Genscript)。為了產生表現輕鏈的構建體，將一個對β-DG特異的VL序列、(G4S)₂連接子、一個對LG-4/5特異的VL序列、和人κ鏈(Genbank Q502W4)或鼠κ鏈(Genbank BAB33404)融合在一起並選殖到附加型暫態表現載體pXL中，所述表現載體為由Durocher等人(Nucl.Acids Res.2002,30(2),E9)描述的pTT載體的類似物。為了產生表現重鏈的構建體，將一個對β-DG特異的VH序列、(G4S)₂連接子、一個對LG-4/5特異的VH序列和人IgG1(Genbank Q569F4)或鼠IgG1(GenBank AAA75163.1)融合在一起(圖4A)並選殖到表現載體pXL中。針對LG-4/5-特異性結合所使用的VH和VL序列獲自選殖體AN01、C3和C21，並且針對β-DG特異性結合的VH和VL序列獲自選殖體B6、AS19和AS30。

將這些構建體共轉染到HEK293 FreeStyle 293-F或Expi293細胞(Thermo Fisher)中。表現7天后，用HiTrap MabSelect^TM SuRe^TM蛋白A柱(GE Healthcare)從上清液中純化抗體。

交叉雙重可變結構域Ig(CODVIg)抗體的產生

將獲自產生的融合瘤細胞的VH和VL序列針對哺乳動物表現進行密碼子優化和合成(Genscript)。為了產生表現輕鏈的構建體，將一個對LG-4/5特異的VL序列、L₁連接子、一個對β-DG特異的VL序列、L₂連接子和人κ鏈(Genbank Q502W4)或鼠κ鏈(Genbank BAB33404)融合在一起並選殖到表現載體pXL中。為了產生表現重鏈的構建體，將一個對β-DG特異的VH序列、L₃連接子、一個對LG-4/5特異的VH序列、L₄連接子和人IgG1(Genbank Q569F4)或鼠IgG1(GenBank AAA75163.1)融合在一起並選殖到表現載體pXL中。所使用的連接子序列的具體組合提供在下文。

連續Biacore結合分析

將親本單株抗體(AS19、C3和C21)和三種雙特異性抗體(TBTI中的AS19 x C3和AS30 x C3以及CODVIg中的的AS30 x C3)各自固定到單獨的CM5系列S Biacore晶片(GE Healthcare)上。使人或鼠LG-4/5，隨後依次為人或鼠β-DG流過每個晶片，然後評估結合。

雙層夾心ELISA

將96孔板用50ng人LG-4/5包被並用PBS中的5%胎牛血清封閉。將每個孔用1μg所產生的雙特異性抗體(鼠IgG主鏈)溫育。2小時後，將孔用PBS洗滌並用每孔16ng至1μg的與人hIgG1 Fc抗體區(hβ-DG-hFc)融合的人β-DG再次溫育。2小時後，將孔用PBS洗滌，用HRP綴合的抗hFc二級抗體溫育45分鐘，再次用PBS洗滌，並顯色以進行比色測量。

結果

如上所述，將抗體工程改造為多種雙特異性形式，包括四價雙特異性串聯IgG形式(TBTI；圖5A)以及交叉雙重可變結構域IgG形式(CODVIg；圖5B)。為了產生這些形式，合成了針對每種構建體的輕鏈和重鏈質體。一個構建體具有來自列舉的單株序列的抗βDG的輕鏈可變區，接著是連接子，然後是來自抗LG4/5單株抗體的輕鏈可變區，接著是另一個連接子，然後是輕鏈恒定結構域。使用相同的原理來開發重鏈質體，然後為了表現，將它們共轉染到哺乳動物細胞中。嘗試了多個連接子組合，並且測試了兩個可變區取向(即，使抗LG4/5遠離恒定區而不是抗βDG可變區，反之亦然)。

以TBTI或CODVIg形式產生識別β-DG(使用選殖體B06、AS19和AS30)和LG-4/5(使用選殖體AN01、C3和C21)的雙特異性抗體(biAb)。

嘗試了多個連接子組合，並且測試了兩個可變區取向(即，使抗LG4/5遠離恒定區而不是抗βDG可變區，反之亦然)。對於TBTI，(T1T2和T5T6)，在輕鏈可變區之間的連接子的組成為甘胺酸或絲胺酸的10個殘基(例如，GGGGSGGGGS；SEQ ID NO：294)，而在第二可變區與恒定區之間不使用連接子。在重鏈可變區之間使用相同的連接子(甘胺酸或絲胺酸的10個殘基)，而在第二重鏈可變區與恒定區之間不使用連接子。對於CODVIg形式，使用兩組連接子長度：10-10-0-0和7-5-1-2(針對L₁-L₂-L₃-L₄的殘基編號)。CODVIg C5C6連接子的組成為輕鏈可變區之間的為甘胺酸或絲胺酸的10個殘基以及第二可變區與輕鏈恒定區之間的為甘胺酸或絲胺酸的10個殘基。在重鏈上沒有使用連接子。這些組合的連接子序列如下(描述為L₁、L₂、L₃、L₄)：GQPKAAP(SEQ ID NO：297)、TKGPS(SEQ ID NO：298)、S、RT；GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：299)、GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：299)、0、0；和EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：296)、GG、EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：296)、GG。建立的雙特異性抗體的清單提供在以下表L中。

為了證實biAb能夠同時結合LG-4/5和β-DG，進行連續Biacore分析(GE Healthcare)和雙層夾心ELISA測定。

將針對LG-4/5或β-DG的親本mAb和抗LG4/5和β-DG的biAb捕獲到biacore晶片上，然後依次與人LG4/5和人β-DG一起流動以確定它們與兩種抗原的同時結合。連續Biacore分析顯示，雙特異性抗體可以首先結合人LG-4/5(第一峰，圖6A)或鼠LG-4/5(第一峰，圖6B)，然後進一步與人β-DG(第二峰，圖6A)或鼠β-DG(第二峰，圖6B)結合。相反，親本單株抗體僅能結合一個靶標，即LG-4/5(圖6A和6B中的C3和C21)或β-DG(圖6A和6B中的AS19)。

雙層夾心ELISA顯示，雙特異性抗體可以同時結合hLG-4/5和hβ-DG。在測定中只有當加入hLG-4/5和hβ-DG-hFc這兩者時才能檢測到比色信號(圖7)。當使用親本單株抗體或當省去hβ-DG-hFc時，沒有檢測到信號。三種雙特異性抗體(biAb)：T1T2、T5T6和C5C6具有預期的信號，表明與兩種靶標的同時結合。在第二步中不含β-DG-hFc的親本抗LG4/5或抗β-DG mAb或biAb在該測定中均為陰性。

實施例4：LARGE ^myd-3J/GrsrJ 小鼠的雙特異性抗體肌內注射. 方法

L ARGE ^myd-3J/GrsrJ 小鼠模型

來自Jackson實驗室的LARGE^myd-3J/GrsrJ(貨號008581)小鼠是由LARGE基因突變引起的α-肌營養不良蛋白聚糖病的小鼠模型。LARGE基因的突變定位在D8Mit65和DMit249之間，其標誌物分別在44.4Mb和83.8Mb；LARGE基因位於75.7Mb處。LARGE純合小鼠通常在2-3個月齡時開始出現肌肉退化的證據，不過一些動物可能早在斷奶期就表現出症狀。在通過尾巴提起時不能向外展開後肢為初始表型，並且這會隨著年齡的增長而進展，包括步態搖擺，然後是拖動後肢。

雙特異性抗體注射

在一組10只LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的左側和右側脛骨前肌(TA)肌肉中給予肌內注射。左側TA接受兩次注射，每次注射50μl鹽水中的0.7μg/μl的biAb(T1T2；鼠Fc骨架)。右側TA接受兩次對照注射，每次注射50μl鹽水中的0.7μg/μl的親本AS19和C3抗體的1：1重量的混合物。兩次注射相隔3天。

運動誘發的組織損傷

最後一次肌內注射後一天，所有小鼠接受10mg/ml的伊文思藍染料(EBD)腹膜內注射(IP)，每10g體重給予50μl。在EBD的IP後一天，所有小鼠通過強制性跑步機運動直到疲憊為止。按照標準IACUC方案用CO₂使動物安樂死。

組織製備和免疫螢光染色

安樂死之後，將TA肌肉移除，切割，並置於最佳切割溫度化合物中。然後通過2-甲基丁烷乾冰浴使組織快速冷凍。將組織在低溫恒溫器中冷凍切片為10微米厚度。將四個不同的層次以100微米的間隔從TA切下(一式三份)。

將載玻片切片迅速浸入冷PBS中，並在冰冷的丙酮中固定15分鐘。將載玻片洗滌並在4℃過夜封閉(PBS中的2% BSA和1%正常山羊血清)過夜。第二天，將載玻片與1：100稀釋的抗mIgG Alexa Fluor 488(Invitrogen)溫育2小時(室溫)。洗滌載玻片並使用具有DAPI(Vector Labs)的Vectashield封片劑加以封固。利用適當的濾光片組用倒置顯微鏡(Olympus IX71)觀察載玻片。

伊文思藍染料(EBD)肌纖維損傷評估

除了沒有免疫螢光染色之外，如上處理組織切片。對左側TA(biAb IM)和右側TA(單株親本抗體IM)手動計數每個切片上的所有EBD陽性纖維。

結果

為了確定biAb是否能夠結合小鼠肌肉組織中的天然抗原，將野生型或LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠(其為α-肌營養不良蛋白聚糖病的鼠模型)的未固定的冷凍切片用biAb(T1T2、T5T6、C5C6)或親本mAb染色。結果表明，biAb也能夠結合野生型(圖8A)和LARGE^myd-3J/GrsrJ(圖8B)小鼠肌肉組織切片二者中的單特異性親本mAb。

然後將雙特異性抗體肌內施用於野生型或LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠(研究概要顯示在圖8C中)。為了評估雙特異性抗體對運動誘導的組織損傷的影響，對來自運動小鼠的組織進行免疫螢光和伊文思藍染料肌纖維染色。免疫螢光顯示，雙特異性抗體與小鼠肌肉組織(左或右脛骨前肌(TA)肌肉)結合良好並且在最後一次抗體注射後2天可檢測到(圖8E)。與右對側對照TA相比，biAb治療的左側TA具有顯著更少的EBD陽性纖維(圖8D)。伊文思藍染料穿透許多用親本抗體混合物治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠組織的肌纖維，表明了運動誘發的損傷，因為染料僅穿透具有膜損傷的肌纖維並使其染色(圖8E)。相比之下，伊文思藍染料穿透顯著更少的用雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠組織的肌纖維(圖8E)。這表明在α-肌營養不良蛋白聚糖病的體內哺乳動物模型中，局部注射雙特異性抗體而非親本單株抗體保護了肌肉免於運動誘發的損傷。

實施例5：LARGE ^myd-3J/GrsrJ 小鼠的雙特異性抗體全身性遞送. 方法

抗體遞送

為了運動誘發的組織損傷測試，將四個不同組的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠通過側尾靜脈(IV)或腹膜內(IP)注射單劑量的親本或雙特異性抗體(具有鼠Fc區)。每組接受下列之一：親本抗LG-4/5(選殖體C3，IV)、親本抗β-DG(選殖體AS19，IV)、biAb(AS19 x C3，IV)和biAb(AS19 x C3，IP)。注射後一天，所有小鼠接受10mg/ml的伊文思藍染料(EBD)腹膜內注射(IP)，每10g體重給予50μl。

為了行為測試、肌酸激酶測量和生物分佈免疫螢光實驗，在治療前將LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠(11-19周齡)隨機分為兩組(n=16)。一組小鼠以30mg biAb(T1T2)/kg小鼠每週兩次給藥7周。第二組小鼠以親本單株抗體混合物(AS19和C3，各自15mg抗體/kg小鼠)每週兩次給藥7周。為了預防過敏反應，在施用抗體前10分鐘腹膜內預先給予5mg/kg的苯海拉明。用鹽水治療的野生型小鼠用作對照。

運動誘發的組織損傷

在腹膜內注射EBD後1天，所有小鼠通過強制性跑步機運動直到疲憊為止。按照標準IACUC方案用CO₂使動物安樂死。

行為測試和肌酸激酶測量

為了握力測試，在測試前使小鼠適應測試室10分鐘。將握力計(Columbia Instruments,Columbus,OH)水準安裝在穩定的表面上。將測試鼠輕輕地放在網格的頂部，使其前爪和後爪能夠緊握在網格上。然後通過動物的尾部將其輕輕向後拉，直到抓握被釋放時為止。在應變計上記錄在釋放點產生的力的量值(克)。該程式對每只動物進行3次，然後將握力值計算為三次測試的平均值。

為了金屬絲懸掛測試，將每只動物放在金屬絲網上，輕輕地左右移動直到動物抓住金屬絲時為止。然後將金屬絲網提升到緩衝墊上方約2英尺並翻轉。記錄動物從金屬絲網上掉落到緩衝墊上的時間(延遲時間)，最大截止時間為60秒。每只動物測試兩次，其中在兩次測試之間的休息時間為至少5分鐘。

在研究開始時(在雙特異性抗體治療之前)和研究結束時(在雙特異性抗體治療7周後在跑步機運動後1小時)通過標準比色測定測量肌酸激酶(CK)水準。

組織製備和免疫螢光染色

為了檢測靶器官中的雙特異性抗體，在最後一次雙特異性抗體肌內注射後4天使動物安樂死。將TA肌肉移除，切割，並置於最佳切割溫度化合物中。然後通過2-甲基丁烷乾冰浴使組織快速冷凍。將組織在低溫恒溫器中冷凍切片為10微米厚度。

對於運動誘發的組織損傷樣品，在運動後將TA肌肉移除，切割，並置於最佳切割溫度化合物中。然後通過2-甲基丁烷乾冰浴使組織快速冷凍。將組織在低溫恒溫器中冷凍切片為10微米厚度。將四個不同的層次以100微米的間隔從TA切下(一式三份)。

對於兩套組織樣品，將載玻片洗滌並在4℃過夜封閉(PBS中的2% BSA和1%正常山羊血清)過夜。第二天，將載玻片與1：100稀釋的抗mIgG Alexa Fluor 488(Invitrogen)溫育2小時(室溫)。洗滌載玻片並使用具有DAPI(Vector Labs)的Vectashield封片劑加以封固。利用適當的濾光片組用倒置顯微鏡(Olympus IX71)觀察載玻片。

伊文思藍染料(EBD)肌纖維損傷評估

結果

將30mg/kg的biAb(T1T2)和作為對照的親本抗體給予LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠，通過尾靜脈注射(IV)或腹膜內(IP)注射進行比較。在給藥後24、48、72和96小時通過眼球放血收集血液樣品，並通過用β-DG(圖8F)或LG4/5(未顯示)包被的ELISA測量抗體水準。biAb具有相似的親本mAb清除率。biAb的IP給藥導致高濃度，但其總體藥代動力學類似於IV給藥。正如預期，當使用β-DG用於包被時，抗LG4/5親本mAb無信號。

接著將雙特異性抗體靜脈內給予野生型或LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠。行為測試顯示，在作為肌肉功能量度的握力測試和金屬絲懸掛測試(圖9A和9B)方面，施用雙特異性抗體的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠比用單株親本抗體治療的小鼠表現得更好(圖9A和9B)。在圖9A和9B中還顯示了用鹽水治療的對照野生型小鼠。這些資料證明，雙特異性抗體改善了肌肉功能。施用雙特異性抗體的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠在跑步機測試方面也保持了行為表現，而用對照抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠表現出行為表現的惡化(圖9C)。

儘管跑步機測試的行為表現不佳，但用對照抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠顯示CK水準增加。血清CK水準的顯著升高表明急性肌肉損傷，是缺乏肌膜保護的結果。在研究結束時，與用單株親本抗體治療的小鼠相比，用雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的肌酸激酶水準顯著較低(圖9D)。用雙特異性抗體治療降低了LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠的肌酸激酶水準，表明雙特異性抗體有助於保護肌肉免受損傷。

為了評估雙特異性抗體對運動誘導的組織損傷的影響，對來自運動小鼠的組織進行伊文思藍染料肌纖維染色。伊文思藍染料穿透許多用親本抗體混合物治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠組織的肌纖維，表明了運動誘發的損傷，因為染料僅穿透具有膜損傷的肌纖維並使其染色。相比之下，與用親本抗體治療的小鼠相比，伊文思藍染料穿透顯著更少的用雙特異性抗體治療的LARGE^myd-3J/GrsrJ小鼠組織的肌纖維(圖10)。這表明，雙特異性抗體而不是親本單株抗體的全身性遞送保護了肌肉免於運動誘發的損傷。

為了檢測靶器官中的雙特異性抗體，在最後一次雙特異性抗體肌內注射後4天使動物安樂死，並進行免疫螢光染色。染色顯示，甚至在4天后，通過IV或腹膜內施用的雙特異性抗體T1T2(AS19xC3)仍然特異性結合四頭肌、TA、膈肌和心臟中的肌肉組織，但對用作陰性對照的腦組織不染色(圖11，第一行和第二行)。親本單株抗體AS19未使肌肉組織良好地染色(圖11，第三行)，這可能是由於抗體的快速解離速率所致(參見表K)。然而，與圖4B一致，親本單株抗體C3使肌肉組織良好地染色(圖11，第四行)。

確定了與抗原人β-DG結合的AS30 Fab的總體結構，其中抗原顯示在重鏈和輕鏈之間(圖12A)。圖12B顯示了CDR區和抗原的近視圖。將AS30 Fab和人βDG以1：1的莫耳比混合並在冰上溫育30分鐘，然後在4℃下進行SEC Superdex 200 10/300 GL柱(GE Healthcare)色譜。使AS30：βDG複合物結晶，並通過分子置換確定其結構，並且精確至2.55Å。在電子密度圖中可見AS30 Fab和βDG序列D⁷³⁸RDPEKSSEDD⁷⁴⁸(SEQ ID NO：302)。晶體結構顯示，AS30抗體識別βDG中的線性肽D⁷³⁸RDPEKSSEDD⁷⁴⁸(SEQ ID NO：302)。

另外，確定了與抗原人層黏連蛋白-2 LG-5結構域結合的C21 Fab的總體結構，其中抗原顯示在重鏈和輕鏈之間(圖12AC)。圖12D顯示了CDR區和抗原的近視圖。以與AS30：βDG類似的方式獲得C21：LG5複合物的結構，並且精確至2.70Å。C21 Fab和人LG5在電子密度中均可見，並且C21識別LG5上的構象表位。

實施例6：識別β-DG和層黏連蛋白-2的三價多特異性抗體的產生 方法

抗體人源化

使用CDR移植和3D建模技術來進行先導融合瘤抗體的人源化。抗體人源化的方法描述於Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)；Sims等人，J Immunol 151：2296(1993)；Chothia和Lesk,J Mol Biol 196：901(1987)；Carter等人，Proc Natl Acad Sci USA 89：4285(1992)；Presta等人，J Immunol 151：2623(1993)；美國專利No.5,589,205；5,565,332；6,180,370；6,632,927；7,241,877；7,244,615；7,244,832；7,262,050；和美國專利公開號2004/0236078(2004年4月30日提交)。

抗體表現和純化

通過產生具有含有節入穴、NNAS、YTE和RF變體的重鏈恒定區以及輕鏈恒定區的哺乳動物表現載體來構建aDG三價抗體。合成具有期望連接子的DNA可變結構域並插入期望的重鏈或輕鏈載體中。每個triAb的構型示於表M中(根據圖13中圖解的抗原結合結構域的編號，即VH1/VL1和VH2/VL2形成CODV臂，並且VH3/VL3形成Fab臂)。表I2中提供了triab的多肽鏈的胺基酸序列。

通過用Expifectamine(Thermo Fisher Scientific,A14635)在Expi293F細胞中暫態共轉染四種質體來產生三價抗體。用MabSelect SuRe柱(GE Healthcare,11003494)純化抗體，然後用HiTrap SP HP柱(GE Healthcare,17115201)進行陽離子交換。然後評估所有蛋白質的濃度、純度和聚集。

抗體與人抗原的雙重結合

通過用2μg/mL生物素化的N’Avi-HPC4-人LG4/5或生物素化的人β-DG-HPC4-Avi-C'包被Thermo Nunc固定化SA 96孔板進行雙重結合夾心ELISA。在4℃過夜溫育後，在室溫下用PBS+1% BSA+0.1% Tween將平板封閉1小時。在用PBS洗滌(BioTek ELx405 Select CW)後，將三價或親本抗體以8μg/mL開始加入平板，並在平板上進行2倍稀釋，將抗體在室溫下溫育1小時。洗滌後，以5μg/mL添加第二抗原β-DG-mFc(圖1A)或LG4/5-mFc。在第二抗原之後，加入1：2000稀釋的驢抗小鼠二級抗體(Jackson ImmunoResearch)，保持30分鐘。將ABTS重懸於ABTS緩衝液(Roche)中並加入孔中進行檢測。使用Perkin Elmer EnVision多模式讀板儀在405nm處讀取所得信號。

對於抗原與三價抗體的連續雙重結合，將系列S感測器蛋白G晶片(GE Healthcare,29179315)與T100 Biacore一起使用。該晶片用於將三價或親本抗體固定到表面(用5μg/mL抗體，60秒)上。捕獲後，使200nM的LG4/5在晶片上流過60秒，隨後使200nM的β-DG流過60秒。通過以相對單位(RU)表示的在晶片上檢測到的品質變化來觀察與三價抗體的結合。

結合動力學測定

通過將抗體(10μg/mL)固定在感測器S蛋白G晶片上，然後使連續稀釋的抗原(LG4/5：80nM-1.25nM,BDG：5nM-0.31nM和4nM-0.25nM)流過該晶片來完成關於三價抗體的表面等離振子共振(“SPR；”T100 Biacore；GE Healthcare)動力學測定資料。使用BIAevaluation軟體以1：1結合模型評估資料。

結果

根據圖13所示的形式產生三價抗體(triAb)。這些triAb具有帶有兩個不同的抗層黏連蛋白-2抗原結合結構域(圖13中的VH-1/VL-1和VH-2/VL-2)的CODV臂和帶有抗-β-DG抗原結合結構域的Fab臂(圖13中的VH-3/VL-3)。

為了顯示triAb與兩種抗原的結合，如上所述使用2μg/mL生物素化的N’Avi-HPC4-人LG4/5(圖14A)或生物素化的人βDG-HPC4-Avi-C’(圖14B)進行雙重結合夾心ELISA。在兩種取向中，所有測試的triAb均顯示出同時的雙重結合。

另外，進行表面等離振子共振來顯示人層黏連蛋白-2和β-DG抗原的依次結合(圖1C)。triAb顯示與兩種抗原都結合，而單株抗體(用於結合層黏連蛋白-2的人源化C3和C21變體以及用於結合β-DG的人源化AS30變體)僅結合它們對應的抗原。

如上所述使用SPR來分析triAb與層黏連蛋白-2(表N)或β-DG(表O)結合的動力學。

表O。triAb與β-DG的結合(SPR)。

如表N中所示，五種triAb能夠以納莫耳親和力結合人β-DG(K_D在1.3-2.1nM之間)，與在單價抗體形式中使用的人源化AS30抗原結合結構域相當(0.8nM)。類似地，表O顯示，相同的triAb也能夠以納莫耳親和力結合人層黏連蛋白-2(K_D在10.2-14.9nM之間)，與在單價抗體形式中使用的人源化C3和C21抗原結合結構域相當(分別為9.8nM和9.0nM)。

這些資料表明，與傳統的單價抗體形式相比，在圖13中展示的三價形式的雙特異性抗層黏連蛋白-2/β-DG抗體能夠以相似的結合親和力同時與其靶標雙重結合。

實施例7：LARGE ^myd-3J/GrsrJ 小鼠在用識別β-DG和層黏連蛋白-2的三價多特異性抗體治療後的行為測試中肌肉功能的改善 方法

抗體施用

將實施例4中描述的LARGE/myd-3j小鼠(8-16周齡)根據它們的後肢展開評分、金屬絲懸掛評分、握力和跑步機隨機分成五個組，以確保這些評分在治療之前的各組(n=11)中相似。然後用TriAb(3407、3437和3439)和識別無關蛋白靶標的對照TriAb以及鹽水組作為對照通過尾靜脈注射以30mg/kg每週兩次對小鼠給藥(星期一和星期四)，共7個劑量達3.5周。另外，還包括野生型小鼠組(n=6)作為行為測試的基準。為了預防過敏反應，在施用抗體前10分鐘腹膜內預先給予5mg/kg的苯海拉明。從第2周開始每週測試握力和金屬絲懸掛。用鹽水處理野生型作為不同行為測試的基準。

行為測試

為了後肢展開測試，通過其尾巴將小鼠提起，記錄後肢相對於身體的位置並進行分級。

通過如下步驟進行金屬絲懸掛測試：將小鼠置於金屬絲網格上並適應1分鐘；然後，將小鼠抓住的金屬絲網格以2秒的限定速度緩慢翻轉，記錄小鼠保持在網格上的時間，截止時間為60秒。每只小鼠重複測試3次，結果取平均值。

通過如下步驟評價握力：將小鼠置於Grip Strength Meter(Columbus Instruments)上，使小鼠緊緊抓住金屬網格，水準拉動尾部直到小鼠放開為止；然後記錄握力。重複測試5次，其間間隔1分鐘。去除每只小鼠的最高讀數和最低讀數，結果為剩餘三個讀數的平均值。

對於在跑步機上的跑步時間，將小鼠放置在裝備有電擊格柵(型號1055SRM Exer-3/6，Columbus Instruments)的跑步機的單獨跑道上。使動物適應跑步機5分鐘，然後以增加的速度用確定的方案測試小鼠。當小鼠在電擊網格上不能跑步超過3秒時，關閉電擊網格並記錄總跑步時間。

所有的行為測試都是在對小鼠身份和治療設盲的情況下進行的，測試後的結果是不設盲的。

結果

測試了在實施例6中產生的triAb在LARGE/myd-3j小鼠中對肌肉功能的作用。

正如先前所述用biAb治療所觀察到的，在用TriAb 3407、3437或3439治療兩周後，Large/myd-3j小鼠表現出在握力(圖15)和金屬絲懸掛(圖16)方面的顯著改善的行為表現(見實施例5)。用TriAb治療維持了或略微改善了在跑步機上的行為表現(圖17)，但與對照相比沒有統計學顯著性，反而證明瞭輕微退化。通常，在跑步機上的跑步時間的統計學顯著改善需要更長時間的治療。

綜上所述，多次功能測定的結果證明，用三價雙特異性抗層黏連蛋白-2/β-DG抗體治療導致α-肌營養不良蛋白聚糖病鼠模型中肌肉功能的改善。

雖然本公開包括不同的具體實例，但應理解的是，本領域技術人員將想到各種變化和修改。因此預期的是，所附權利要求書涵蓋落入本公開範圍內的所有這些等同變化。另外，在本文中使用的部分標題僅僅是出於組織的目的，而不應當解釋為限制所描述的主題。

本文中描述的每個具體實例可以與任何其他具體實例或多個具體實例組合，除非明確地指示相反。具體而言，被指示為優選或有利的任何特徵或具體實例可以與被指示為優選或有利的任何其他一個或多個特徵或一個或多個具體實例組合，除非明確地指示相反。

<110> 賽諾菲(Sanofi) BEIL,Christian BRONDYK,William CHEN,Yangde CHEN,Seng H. CONNORS,Timothy D. DEVAUD,Catherine HOFFMANN,Dietmar LANGE,Christian MAGNAY,Maureen MAGNAY,Tristan PRADES,Catherine RAO,Ercole SEVIGNY,Leila ZHU,Yunxiang WEI,Ronnie ZHAO,Hongmei ZHU,Yunxiang

<120> 具有肌營養不良蛋白聚糖和層粘連蛋白-2特異性的多特異性結合分子

<130> 183952028140

<140> 尚未指定

<141> 同時提交

<150> US 62/460,663

<151> 2017-02-17

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<170> FastSEQ for Windows版本4.0

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<223> 合成構建體

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 50

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 51

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 52

<210> 53

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 53

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 54

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 55

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 56

<210> 57

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 57

<210> 58

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 58

<210> 59

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 59

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 63

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 67

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 68

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 70

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 71

<210> 72

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 72

<210> 73

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 73

<210> 74

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 74

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 75

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 81

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<220>

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<220>

<223> 合成構建體

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

<223> 合成構建體

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<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 114

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 116

<210> 117

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 117

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 120

<210> 121

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 121

<210> 122

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 122

<210> 123

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 123

<210> 124

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 124

<210> 125

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 125

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 126

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 127

<210> 128

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 128

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 129

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 130

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 131

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 132

<210> 133

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 133

<210> 134

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 134

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 135

<210> 136

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 136

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 137

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 138

<210> 139

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 139

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<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 140

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<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 141

<210> 142

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 142

<210> 143

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 143

<210> 144

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 144

<210> 145

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 145

<210> 146

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 146

<210> 147

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 147

<210> 148

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 148

<210> 149

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 149

<210> 150

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 150

<210> 151

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 151

<210> 152

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 152

<210> 153

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 153

<210> 154

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 154

<210> 155

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 155

<210> 156

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 156

<210> 157

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 157

<210> 158

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 158

<210> 159

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 159

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 160

<210> 161

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 161

<210> 162

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 162

<210> 163

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 163

<210> 164

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 164

<210> 165

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 165

<210> 166

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 166

<210> 167

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 167

<210> 168

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 168

<210> 169

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 169

<210> 170

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 170

<210> 171

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

<223> 合成構建體

<400> 284

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

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<211> 345

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<220>

<223> 合成構建體

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<211> 336

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<213> 人工序列

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<223> 合成構建體

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<212> DNA

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<220>

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<213> 人工序列

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<223> 合成構建體

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<220>

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<400> 516

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<220>

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<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成構建體

<400> 519

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<211> 219

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 520

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 521

<210> 522

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 522

<210> 523

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 523

<210> 524

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 524

<210> 525

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 525

<210> 526

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 526

<210> 527

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 527

<210> 528

<211> 566

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 528

<210> 529

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 529

<210> 530

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 530

<210> 531

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 531

<210> 532

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 532

<210> 533

<211> 338

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 533

<210> 534

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構建體

<400> 534

Claims

一種多特異性結合分子，其包含至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和至少一個結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域。
如請求項1的多特異性結合分子，其中所述多特異性結合分子是包含一條或多條多肽鏈的多特異性結合蛋白。
如請求項2的多特異性結合分子，其中所述結合蛋白包含四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：V _L2-L ₁-V _L1-L ₂-C _L [I]並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：V _H1-L ₃-V _H2-L ₄-C _H1-鉸鏈-C _H2-C _H3 [II]並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：V _H3-C _H1-鉸鏈-C _H2-C _H3 [III]並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：V _L3-C _L [IV]其中：V _L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _L3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V _H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；V _H3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C _H1是免疫球蛋白C _H1重鏈恒定結構域； C _H2是免疫球蛋白C _H2重鏈恒定結構域；C _H3是免疫球蛋白C _H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C _H1和C _H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L ₁、L ₂、L ₃和L ₄是胺基酸連接子；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且其中V _H1和V _L1形成抗原結合位點，其中V _H2和V _L2形成抗原結合位點，並且其中V _H3和V _L3形成抗原結合位點，總共三個抗原結合位點，並且其中所述三個抗原結合位點包含至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點。
如請求項3的多特異性結合分子，其包含一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和兩個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點。
如請求項4的多特異性結合分子，其中所述兩個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合層黏連蛋白-2的不同表位。
如請求項4的多特異性結合分子，其中所述兩個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合層黏連蛋白-2的相同表位。
如請求項4-6中任一項的多特異性結合分子，其中V _H1和V _L1形成結合層黏連蛋白-2的第一抗原結合位點，V _H2和V _L2形成結合層黏連蛋白-2的第二抗原結合位點，並且V _H3和V _L3形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第三抗原結合位點。
如請求項3的多特異性結合分子，其包含兩個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點和一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點。
如請求項8的多特異性結合分子，其中所述兩個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的不同表位。
如請求項8的多特異性結合分子，其中所述兩個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的相同表位。
如請求項8-10中任一項的多特異性結合分子，其中V _H1和V _L1形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一抗原結合位點，V _H2和V _L2形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第二抗原結合位點，並且V _H3和V _L3形成結合層黏連蛋白-2的第三抗原結合位點。
如請求項3-11中任一項的多特異性結合分子，其中當作為多特異性結合蛋白的一部分測定時，所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點以低於約1μM的平衡解離常數(K _D)結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項3-12中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項3-13中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合β-肌營養不良蛋白聚糖。
如請求項14的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。
如請求項14或如請求項15的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。
如請求項3-13中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合α-肌營養不良蛋白聚糖。
如請求項17的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點結合包含序列SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO：291)的多肽。
如請求項3-18中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合人層黏連蛋白-2。
如請求項19的多特異性結合分子，其中當作為多特異性結合蛋白的一部分測定時，所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點以低於約1μM的平衡解離常數(K _D)結合人層黏連蛋白-2。
如請求項3-20中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合小鼠和人層黏連蛋白-2。
如請求項3-21中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。
如請求項22的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。
如請求項23的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：300)的多肽。
如請求項23或如請求項24的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。
如請求項22的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。
如請求項26的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。
如請求項26或如請求項27的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。
如請求項3-11中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含選自由SEQ ID NO：1-8組成的組的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自由SEQ ID NO：9-17組成的組的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自由SEQ ID NO：18-27組成的組的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含選自由SEQ ID NO：28-37組成的組的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自由SEQ ID NO：38-42組成的組的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自由SEQ ID NO：43-50組成的組的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項29的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位元點的VH結構域包含選自由SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188組成的組的序列；並且(b)所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位元點的VL結構域包含選自由SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189組成的組的序列。
如請求項3-11中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。
如請求項31的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。
如請求項31或如請求項32的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：314；並且 (b)所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：330。
如請求項31或如請求項32的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：346；並且(b)所述至少一個結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：362。
如請求項3-11和29-34中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含選自由SEQ ID NO：51-55和81-95組成的組的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自由SEQ ID NO：56-60和96-110組成的組的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自由SEQ ID NO：61-65和111-125組成的組的胺基酸序列的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含選自由SEQ ID NO：66-70和126-140組成的組的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自由SEQ ID NO：38、71-75和141-154組成的組的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自由SEQ ID NO：76-80和155-169組成的組的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項35的多特異性結合蛋白，其中：(a)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VH結構域包含選自由SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228組成的組的序列；並且(b)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VL結構域包含選自由SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、 209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229組成的組的序列。
如請求項3-11和29-34中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3。
如請求項37的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。
如請求項37或如請求項38的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：378；並且(b)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：394。
如請求項3-11和29-34中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列 SEQ ID NO：400的CDR-L3。
如請求項40的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。
如請求項40或如請求項41的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：410；並且(b)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：426。
如請求項3-11和29-34中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。
如請求項43的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。
如請求項43或如請求項44的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：442；並且(b)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：458。
如請求項3-11和29-34中任一項的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，所述重鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3；和(b)輕鏈可變結構域(VL)，所述輕鏈可變結構域包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3。
如請求項46的多特異性結合分子，其中所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位點包含人源化VH結構域和人源化VL結構域。
如請求項46或如請求項47的多特異性結合分子，其中：(a)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VH結構域包含序列SEQ ID NO：474；並且(b)所述至少一個結合層黏連蛋白-2的抗原結合位元點的VL結構域包含序列SEQ ID NO：490。
如請求項3的多特異性結合分子，其中：V _H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V _L1包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V _H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V _L2包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V _H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V _L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。
如請求項49的多特異性結合分子，其中：V _H1包含序列SEQ ID NO：378，並且V _L1包含序列SEQ ID NO：394；V _H2包含序列SEQ ID NO：378，並且V _L2包含序列SEQ ID NO：394；並且V _H3包含序列SEQ ID NO：314，並且V _L3包含序列SEQ ID NO：330。
如請求項3的多特異性結合分子，其中：V _H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V _L1包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V _H2包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V _L2包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；並且V _H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V _L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。
如請求項51的多特異性結合分子，其中：V _H1包含序列SEQ ID NO：378，並且V _L1包含序列SEQ ID NO：394；V _H2包含序列SEQ ID NO：442，並且V _L2包含序列SEQ ID NO：458；並且V _H3包含序列SEQ ID NO：314，並且V _L3包含序列SEQ ID NO：330。
如請求項3的多特異性結合分子，其中：V _H1包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V _L1包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；V _H2包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V _L2包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；並且V _H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V _L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。
如請求項53的多特異性結合分子，其中：V _H1包含序列SEQ ID NO：410，並且V _L1包含序列SEQ ID NO：426；V _H2包含序列SEQ ID NO：474，並且V _L2包含序列SEQ ID NO：490；並且V _H3包含序列SEQ ID NO：314，並且V _L3包含序列SEQ ID NO：330。
如請求項3的多特異性結合分子，其中：V _H1包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V _L1包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的 CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；V _H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V _L2包含包含序列SEQ ID NO：428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V _H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V _L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。
如請求項55的多特異性結合分子，其中：V _H1包含序列SEQ ID NO：442，並且V _L1包含序列SEQ ID NO：458；V _H2包含序列SEQ ID NO：410，並且V _L2包含序列SEQ ID NO：426；並且V _H3包含序列SEQ ID NO：314，並且V _L3包含序列SEQ ID NO：330。
如請求項3的多特異性結合分子，其中：V _H1包含包含序列SEQ ID NO：444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：448的CDR-H3，並且V _L1包含包含序列SEQ ID NO：460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：464的CDR-L3；V _H2包含包含序列SEQ ID NO：380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：384的CDR-H3，並且V _L2包含包含序列SEQ ID NO：396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：400的CDR-L3；並且V _H3包含包含序列SEQ ID NO：316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO：318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO：320的CDR-H3，並且V _L3包含包含序列SEQ ID NO：332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO：334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO：336的CDR-L3。
如請求項57的多特異性結合分子，其中：V _H1包含序列SEQ ID NO：474，並且V _L1包含序列SEQ ID NO：490；V _H2包含序列SEQ ID NO：378，並且V _L2包含序列SEQ ID NO：394；並且V _H3包含序列SEQ ID NO：314，並且V _L3包含序列SEQ ID NO：330。
如請求項3-58中任一項的多特異性結合分子，其中L ₁和L ₂包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。
如請求項3-58中任一項的多特異性結合分子，其中L ₃和L ₄包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。
如請求項3-58中任一項的多特異性結合分子，其中L ₁、L ₂、L ₃和L ₄包含序列DKTHT(SEQ ID NO：534)。
如請求項3-61中任一項的多特異性結合分子，其中第二多肽鏈的C _H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；並且其中第三多肽鏈的C _H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
如請求項3-61中任一項的多特異性結合分子，其中第二多肽鏈的C _H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中第三多肽鏈的C _H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1 或IgG4的位置354和366的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
如請求項3-63中任一項的多特異性結合分子，其中第二和第三多肽鏈的C _H3結構域是人IgG1或IgG4 C _H3結構域，並且其中僅一個C _H3結構域在對應於根據EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置包含胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F。
權利要3-64中任一項的多特異性結合分子，其中第二和第三多肽鏈的C _H2結構域是人IgG1或IgG4 C _H2結構域，其包含根據EU索引編號的第297位元的天冬醯胺殘基、第298位的天冬醯胺殘基、第299位的丙胺酸殘基和第300位的絲胺酸或蘇胺酸殘基。
如請求項3-65中任一項的多特異性結合分子，其中第二和第三多肽鏈的C _H2結構域是人IgG1或IgG4 C _H2結構域，其包含根據EU索引編號的第252位元的酪胺酸殘基、第254位的蘇胺酸殘基和第256位的谷胺酸殘基。
如請求項3的多特異性結合分子，其中第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：500，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：498，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：499，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：501。
如請求項3的多特異性結合分子，其中第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：504，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：502，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：503，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：505。
如請求項3的多特異性結合分子，其中第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：508，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：506，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：507，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：509。
如請求項3的多特異性結合分子，其中第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：512，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：510，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：511，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：513。
如請求項3的多特異性結合分子，其中第一多肽鏈包含序列SEQ ID NO：516，第二多肽鏈包含序列SEQ ID NO：514，第三多肽鏈包含序列SEQ ID NO：515，並且第四多肽鏈包含序列SEQ ID NO：517。
如請求項1或如請求項2的多特異性結合分子，其包含：(a)包含第一重鏈可變(VH)結構域和包含第一C _H3區的免疫球蛋白的第一Fc區的第一抗體重鏈、以及包含第一輕鏈可變(VL)結構域的第一抗體輕鏈，其中所述第一VH和VL結構域形成結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一抗原結合結構域，和(b)包含第二重鏈可變(VH)結構域和包含第二C _H3區的免疫球蛋白的第二Fc區的第二抗體重鏈、以及包含第二輕鏈可變(VL)結構域的第二抗體輕鏈，其中所述第二VH和VL結構域形成結合層黏連蛋白-2的第二抗原結合結構域；其中所述第一和第二C _H3區的序列是不同的，並且使得所述第一和第二C _H3區之間的異二聚體相互作用比所述第一和第二C _H3區各自的同二聚體相互作用更強，並且其中所述第一同二聚體蛋白在位置409處具有除了Lys、Leu或Met以外的胺基酸，並且所述第二同二聚體蛋白在選自由366、368、370、399、405和407組成的組的位置處具有胺基酸取代和/或其中所述第一和第二C _H3區的序列使得所述C _H3區各自的同二聚體相互作用的解離常數在0.01和10微莫耳之間。
如請求項72的多特異性結合分子，其中第一抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：518，其中第二抗體重鏈包含序列SEQ ID NO：519，其中第一抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO：520，並且其中第二抗體輕鏈包含序列SEQ ID NO：521。
一種包含編碼如請求項1-73中任一項的多特異性結合分子的核苷酸序列的分離的核酸分子。
一種包含如請求項74的核酸分子的表現載體。
一種包含如請求項74的核酸分子的分離的宿主細胞。
一種包含如請求項75的表現載體之分離的宿主細胞。
一種包含編碼如請求項3的多特異性結合分子的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一個或多個載體的載體系統。
一種包含如請求項78的載體系統之分離的宿主細胞。
一種產生多特異性結合分子的方法，所述方法包括：a)在條件下培養如請求項76、77及79中任一項的宿主細胞，所述條件使得所述宿主細胞表現所述多特異性結合分子；並且b)從所述宿主細胞分離所述多特異性結合分子。
一種用於在個體中治療或預防α-肌營養不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向所述個體施用如請求項1-73中任一項的多特異性結合分子。
一種用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的方法，所述方法包括向所述個體施用如請求項1-73中任一項的多特異性結合分子。
如請求項81或如請求項82的方法，其中所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。
如請求項81或如請求項82的方法，其中所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。
如請求項81或如請求項82的方法，其中所述個體具有在選自由肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)組成的組的基因中的突變。
如請求項81-85中任一項的方法，其中所述多特異性結合分子通過靜脈內輸注施用。
如請求項81-85中任一項的方法，其中所述多特異性結合分子通過肌內、腹膜內或皮下注射施用。
如請求項81-87中任一項的方法，其中所述個體是人。
一種包含如請求項1-73中任一項的多特異性結合分子和藥學上可接受的載劑的藥學組合物。
一種在治療或預防個體中的α-肌營養不良蛋白聚糖病中使用的包含如請求項1-73中任一項的多特異性結合分子和說明書的套組。
如請求項90的套組，其中所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。
如請求項90的套組，其中所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。
如請求項90的套組，其中所述個體具有在選自由肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1 (POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)組成的組的基因中的突變。
如請求項90-93中任一項的套組，其中所述個體是人。
一種包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域的雙特異性結合分子，其中所述雙特異性結合分子是包含一條或多條多肽鏈的雙特異性結合蛋白，並且其中所述雙特異性結合分子包含形成四個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中兩條多肽鏈包含由下式表示的結構：V _L1-L ₁-V _L2-L ₂-C _L [I]並且兩條多肽鏈包含由下式表示的結構：V _H2-L ₃-V _H1-L ₄-C _H1-鉸鏈-C _H2-C _H3 [II]其中：V _L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V _H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域； C _H1是免疫球蛋白C _H1重鏈恒定結構域；C _H2是免疫球蛋白C _H2重鏈恒定結構域；C _H3是免疫球蛋白C _H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C _H1和C _H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L ₁、L ₂、L ₃和L ₄是胺基酸連接子；其中V _H1和V _L1結構域形成V _H1/V _L1結合對，並且其中V _H2和V _L2結構域形成V _H2/V _L2結合對。
如請求項95的雙特異性結合分子，其中V _H1和V _L1結構域交叉以形成V _H1/V _L1結合對。
如請求項95的雙特異性結合分子，其中V _H2和V _L2結構域交叉以形成V _H2/V _L2結合對。
如請求項95-97中任一項的雙特異性結合分子，其中L ₁、L ₂、L ₃和L ₄的長度各自為0到50個胺基酸殘基。
如請求項98的雙特異性結合分子，其中L ₁、L ₂、L ₃和L ₄的長度各自為0到25個胺基酸殘基。
如請求項98或如請求項99的雙特異性結合分子，其中L ₁、L ₂、L ₃和L ₄的長度各自為0到14個胺基酸殘基。
如請求項98-100中任一項的雙特異性結合分子，其中：L ₁的長度為5個胺基酸殘基；L ₂的長度為5個胺基酸殘基；L ₃的長度為5個胺基酸殘基；並且L ₄的長度為5個胺基酸殘基。
如請求項98-100中任一項的雙特異性結合分子，其中：L ₁的長度為14個胺基酸殘基； L ₂的長度為2個胺基酸殘基；L ₃的長度為14個胺基酸殘基；並且L ₄的長度為2個胺基酸殘基。
如請求項102的雙特異性結合分子，其中L ₁和L ₃各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO：296)，並且其中L ₂和L ₄各自包含序列GG。
如請求項98-100中任一項的雙特異性結合分子，其中：L ₁的長度為7個胺基酸殘基；L ₂的長度為5個胺基酸殘基；L ₃的長度為1個胺基酸殘基；並且L ₄的長度為2個胺基酸殘基。
如請求項104的雙特異性結合分子，其中：L ₁包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：297)；L ₂包含序列TKGPS(SEQ ID NO：298)；L ₃包含一個絲胺酸殘基；並且L ₄包含序列RT。
如請求項98-100中任一項的雙特異性結合分子，其中：L ₁的長度為10個胺基酸殘基；L ₂的長度為10個胺基酸殘基；L ₃的長度為0個胺基酸殘基；並且L ₄的長度為0個胺基酸殘基。
如請求項106的雙特異性結合分子，其中L ₁和L ₂各自包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：299)。
如請求項95-107中任一項的雙特異性結合分子，其中式I和/或式II的多肽的兩個可變結構域之一或兩者是人的、人源化的或小鼠的可變結構域。
一種包含結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分的第一結合結構域和結合層黏連蛋白-2的第二結合結構域的雙特異性結合分子，其中所述雙特異性結合分子是包含一條或多條多肽鏈的雙特異性結合蛋白，並且其中所述雙特異性結合分子包含兩條包含由下式表示的結構的輕鏈：V _L1-L ₅-V _L2-L ₆-C _L [III]和兩條包含由下式表示的結構的重鏈：V _H1-L ₇-V _H2-L ₈-C _H1-鉸鏈-C _H2-C _H3 [IV]其中：V _L1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _L2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；V _H1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；V _H2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；C _L是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；C _H1是免疫球蛋白C _H1重鏈恒定結構域；C _H2是免疫球蛋白C _H2重鏈恒定結構域；C _H3是免疫球蛋白C _H3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接C _H1和C _H2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L ₅、L ₆、L ₇和L ₈是胺基酸連接子；其中V _H1和V _L1結構域形成V _H1/V _L1結合對，並且其中V _H2和V _L2結構域形成V _H2/V _L2結合對。
如請求項109的雙特異性結合分子，其中L ₅、L ₆、L ₇和L ₈的長度各自為0到50個胺基酸殘基。
如請求項109或如請求項110的雙特異性結合分子，其中L ₅、L ₆、L ₇和L ₈的長度各自為0到25個胺基酸殘基。
如請求項109-111中任一項的雙特異性結合分子，其中L ₅、L ₆、L ₇和L ₈的長度各自為0到14個胺基酸殘基。
如請求項109-112中任一項的雙特異性結合分子，其中L ₅和L ₇連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：294)，並且其中L ₆和L ₈連接子的長度各自為0個胺基酸殘基。
如請求項109-113中任一項的雙特異性結合分子，其中式III和/或式IV的多肽的兩個可變結構域之一或兩者是人的、人源化的或小鼠的可變結構域。
如請求項95-114中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分，並且其中V _H2/V _L2結合對結合層黏連蛋白-2。
如請求項115的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項116的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對以低於約1μM的平衡解離常數(K _D)結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項115-117中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項115-118中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合β-肌營養不良蛋白聚糖。
如請求項119的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。
如請求項119或如請求項120的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。
如請求項115-118中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合α-肌營養不良蛋白聚糖。
如請求項115-122中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合人層黏連蛋白-2。
如請求項123的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對以低於約1μM的平衡解離常數(K _D)結合人層黏連蛋白-2。
如請求項115-124中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合小鼠和人層黏連蛋白-2。
如請求項115-125中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。
如請求項126的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。
如請求項126的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：300)的多肽。
如請求項127或如請求項128的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。
如請求項126的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。
如請求項130的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。
如請求項130或如請求項131的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。
如請求項115的雙特異性結合分子，其中V _H1結構域包含包含選自由SEQ ID NO：1-8組成的組的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自由SEQ ID NO：9-17組成的組的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自由SEQ ID NO：18-27組成的組的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V _L1結構域包含包含選自由SEQ ID NO：28-37組成的組的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自由SEQ ID NO：38-42組成的組的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自由SEQ ID NO：43-50組成的組的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項133的雙特異性結合分子，其中V _H1結構域包含選自由SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188組成的組的胺基酸序列。
如請求項133或如請求項134的雙特異性結合分子，其中V _L1結構域包含選自由SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189組成的組的胺基酸序列。
如請求項133的雙特異性結合分子，其中V _H1結構域由選自由SEQ ID NO：230、232、234、236、238、240、242、244、246和248組成的組的核酸序列編碼。
如請求項133或如請求項136的雙特異性結合分子，其中V _L1結構域由選自由SEQ ID NO：231、233、235、237、239、241、243、245、247和249組成的組的核酸序列編碼。
如請求項115和如請求項133-137中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域包含包含選自由SEQ ID NO：51-55和81-95組成的組的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自由SEQ ID NO：56-60和96-110組成的組的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自由SEQ ID NO：61-65和111-125組成的組的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V _L2結構域包含包含選自由SEQ ID NO：66-70和126-140組成的組的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自由SEQ ID NO：38、71-75和141-154組成的組的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自由SEQ ID NO：76-80和155-169組成的組的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項138的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域包含選自由SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228組成的組的胺基酸序列。
如請求項138或如請求項139的雙特異性結合分子，其中V _L2結構域包含選自由SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229組成的組的胺基酸序列。
如請求項138的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域由選自由SEQ ID NO：250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288組成的組的核酸序列編碼。
如請求項138或如請求項141的雙特異性結合分子，其中V _L2結構域由選自由SEQ ID NO：251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289組成的組的核酸序列編碼。
如請求項95-114中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合層黏連蛋白-2，並且其中V _H2/V _L2結合對結合肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項143的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項144的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對以低於約1μM的平衡解離常數(K _D)結合人肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項143-145中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合人和小鼠肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分。
如請求項143-146中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合β-肌營養不良蛋白聚糖。
如請求項147的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：290)的多肽。
如請求項147或如請求項148的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：291)的多肽。
如請求項143-146中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H2/V _L2結合對結合α-肌營養不良蛋白聚糖。
如請求項143-150中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合人層黏連蛋白-2。
如請求項151的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對以低於約1μM的平衡解離常數(K _D)結合人層黏連蛋白-2。
如請求項143-152中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合小鼠和人層黏連蛋白-2。
如請求項143-153中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4、層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5或這兩者的多肽。
如請求項154的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域4和層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。
如請求項155的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：300)的多肽。
如請求項155或如請求項156的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：301)的多肽。
如請求項154的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含層黏連蛋白-2的層黏連蛋白G樣(LG)結構域5的多肽。
如請求項158的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：292)的多肽。
如請求項158或如請求項159的雙特異性結合分子，其中V _H1/V _L1結合對結合包含序列 (SEQ ID NO：293)的多肽。
如請求項143的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域包含包含選自由SEQ ID NO：1-8組成的組的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自由SEQ ID NO：9-17組成的組的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自由SEQ ID NO：18-27組成的組的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V _L2結構域包含包含選自由SEQ ID NO：28-37組成的組的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自由SEQ ID NO：38-42組成的組的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自由SEQ ID NO：43-50組成的組的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項161的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域包含選自由SEQ ID NO：170、172、174、176、178、180、182、184、186和188組成的組的胺基酸序列。
如請求項161或如請求項162的雙特異性結合分子，其中V _L2結構域包含選自由SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187和189組成的組的胺基酸序列。
如請求項161的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域由選自由SEQ ID NO：230、232、234、236、238、240、242、244、246和248組成的組的核酸序列編碼。
如請求項161或如請求項164的雙特異性結合分子，其中V _L2結構域由選自由SEQ ID NO：231、233、235、237、239、241、243、245、247和249組成的組的核酸序列編碼。
如請求項143和如請求項161-165中任一項的雙特異性結合分子，其中V _H1結構域包含包含選自由SEQ ID NO：51-55和81-95組成的組的胺基酸序列的CDR-H1、包含選自由SEQ ID NO：56-60和96-110組成的組的胺基酸序列的CDR-H2、和包含選自由SEQ ID NO：61-65和111-125組成的組的胺基酸序列的CDR-H3；和/或其中V _L1結構域包含包含選自由SEQ ID NO：66-70和126-140組成的組的胺基酸序列的CDR-L1、包含選自由SEQ ID NO：38、71-75和141-154組成的組的胺基酸序列的CDR-L2、和包含選自由SEQ ID NO：76-80和155-169組成的組的胺基酸序列的CDR-L3。
如請求項166的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域包含選自由SEQ ID NO：190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、 214、216、218、220、222、224、226和228組成的組的胺基酸序列。
如請求項166或如請求項167的雙特異性結合分子，其中V _L2結構域包含選自由SEQ ID NO：191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229組成的組的胺基酸序列。
如請求項166的雙特異性結合分子，其中V _H2結構域由選自由SEQ ID NO：250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288組成的組的核酸序列編碼。
如請求項166或如請求項169的雙特異性結合分子，其中V _L2結構域由選自由SEQ ID NO：251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289組成的組的核酸序列編碼。
一種分離的核酸分子，其包含編碼如請求項95-170中任一項的雙特異性結合分子的核苷酸序列。
一種包含如請求項171的核酸分子的表現載體。
一種包含如請求項171的核酸分子之分離的宿主細胞。
一種包含如請求項172的表現載體之分離的宿主細胞。
一種載體系統，其包含編碼如請求項95的雙特異性結合分子的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一種或多種載體。
一種載體系統，其包含編碼如請求項109的雙特異性結合分子的兩條輕鏈和兩條重鏈的一種或多種載體。
一種分離的宿主細胞，其包含如請求項175或如請求項176的載體系統。
一種產生雙特異性結合分子的方法，所述方法包括：a)在這樣的條件下培養如請求項173、174和177中任一項的宿主細胞，所述條件使得所述宿主細胞表現所述雙特異性結合分子；並且b)從所述宿主細胞分離所述雙特異性結合分子。
一種用於在個體中治療或預防α-肌營養不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向所述個體施用如請求項95-170中任一項的雙特異性結合分子。
一種用於在個體中提供層黏連蛋白-2與肌營養不良蛋白聚糖的細胞外部分之間的連接的方法，所述方法包括向所述個體施用如請求項95-170中任一項的雙特異性結合分子。
如請求項179或如請求項180的方法，其中所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。
如請求項179或如請求項180的方法，其中所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。
如請求項179或如請求項180的方法，其中所述個體具有在選自由肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)組成的組的基因中的突變。
如請求項179-183中任一項的方法，其中所述雙特異性結合分子通過靜脈內輸注施用。
如請求項179-183中任一項的方法，其中所述雙特異性結合分子通過肌內、腹膜內或皮下注射施用。
如請求項179-185中任一項的方法，其中所述個體是人。
一種藥學組合物，其包含如請求項95-170中任一項的雙特異性結合分子和藥學上可接受的載劑。
一種供在個體中治療或預防α-肌營養不良蛋白聚糖病中使用的包含如請求項95-170中任一項的雙特異性結合分子和說明書的套組。
如請求項188的套組，其中所述個體具有降低的α-肌營養不良蛋白聚糖表現。
如請求項188的套組，其中所述個體中表現的α-肌營養不良蛋白聚糖具有受損或異常的O-糖基化。
如請求項188的套組，其中所述個體具有在選自由肌營養不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-1(POMT1)、蛋白質O-甘露糖基轉移酶-2(POMT2)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,2-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基1(POMGNT1)、蛋白質O-連接的甘露糖β1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶亞基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基轉移酶2(LARGE2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基1(DPM1)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基2(DPM2)、多萜醇磷酸甘露糖基轉移酶亞基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相關蛋白(FKRP)、含類異戊二烯合酶結構域的蛋白(ISPD)、蛋白質O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙醯胺基半乳糖轉移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基轉移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)組成的組的基因中的突變。
如請求項188-191中任一項的套組，其中所述個體是人。