TW201817440A - 蘆筍萃取物、其製備方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種蘆筍萃取物、其製備方法及其用途；蘆筍葉與蘆筍老莖經由水萃或酒精萃取，對於抑制黃嘌呤氧化酶具有顯著之效果；另，其抑制黃嘌呤氧化酶之效果可進一步用於降低動物體內血液之尿酸濃度，以及用於治療痛風等疾病。

Description

蘆筍萃取物、其製備方法及其用途

本發明提供一種蘆筍萃取物、其製備方法及其用於降低血液尿酸濃度之用途。

尿酸(uric acid)為嘌呤在人體內之最終代謝物，相對於鳥類與爬蟲類將代謝物轉換為尿酸於排泄物中直接排出，哺乳類則是將尿酸在肝臟轉換成尿素而排出。由於尿酸為一種強抗氧化劑，有些靈長類可以尿酸取代維生素C的功能。

血液尿酸濃度過高所引起之高尿酸血症是由於環境因素、遺傳因素或生活習慣所造成，使尿酸排泄降低或尿酸產生過剩，而形成血液中尿酸過高的狀態。高尿酸血症可能有多種直接原因，係由腎機能不全、尿路結石、動脈硬化症等嚴重合併症所引起。高尿酸血症之代表性合併症為痛風，其主症狀顯現為伴隨劇痛的急性關節炎。近年來，由於飲食生活變化而有年年增加病例的傾向，因此大眾也高度關切高尿酸血症之預防或治療法。

嘌呤在生物體內的衍生物有四種分別為鳥糞嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、和腺嘌呤(Adenine)，主要由核苷酸分解而來，最後則被黃嘌呤氧化酶成尿酸，同時產生超氧自由基和過氧化氫，造成發炎反應和組織 傷害。

高尿酸血症及痛風之當前治療包括利用降尿酸鹽劑來降低血液中之尿酸濃度，該等降尿酸鹽劑諸如有：1)黃嘌呤氧化酶抑制劑，諸如異嘌呤醇(allopurinol)及非布索坦(febuxostat)；2)排尿酸劑，諸如苯磺唑酮(sulphinpyrazone)、苯溴馬隆(benzbromarone)及丙磺舒(probenecid)；3)尿酸鹽氧化酶，諸如聚乙二醇重組尿酸酶(pegloticase)、普瑞凱希(puricase)、拉布立酶(rasburicase)及聚乙二醇化尿酸酶(pegylated uricase)；及4)非諾貝特(fenofibrate)。此外，急性痛風之症狀可用抗發炎劑來控制，該等抗發炎劑諸如有：1)非類固醇抗發炎藥(NSAID)，諸如吲哚美辛(indomethacin)及布洛芬(ibuprofen)；2)皮質類固醇(corticosteroid)；及3)秋水仙鹼(colchicine)。使血尿酸含量回到正常範圍可降低復發性急性痛風之發病率及防止其他與高尿酸血症有關之新陳代謝疾病。

然而，痛風或高尿酸血症之許多目前可用之治療會引起多種不良副作用。舉例而言，黃嘌呤氧化酶抑制劑(諸如別嘌呤醇)會引起過敏性血管炎、史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、剝脫性皮炎、再生不全性貧血及肝功能不全。排尿酸劑(諸如丙磺舒、布可隆(bucolome)及苯溴馬隆)具有諸如腸胃失調、尿石病及特異性體質患者之爆發性肝衰竭的副作用。

另，有鑑於高尿酸血症患者日益增加，有必要研發有效且低副作用之降低血液尿酸濃度之藥物，先前文件已揭示多種可降低尿酸之醫藥組合物。TW479020揭示一種具有降低血液尿酸值之乳酸菌，具有降解嘌呤之能力；TW366467提供一種經分離截斷哺乳動物尿酸酶，具有尿 酸分解活性，可用於降低血液中之尿酸濃度；TW505827則提供一種用於治療及預防高尿酸血症或相關之新陳代謝疾病之組合物及其用途，包括向有需要之患者投與治療有效量之雙醋瑞因(diacerein)、大黃酸(rhein)或其醫藥學上可接受之鹽、類似物、前藥或活性代謝物。

故，考量前述痛風或高尿酸血症之流行，有必要研發具有降低血液中尿酸之濃度之功效、並且低副作用、以及顯著療效等特性之新穎醫藥組合物。

蘆筍(Asparagus officinalis)係一種多年生之草本植物，具有多種營養，並且已知食用蘆筍具有多種健康功效，例如可用於治療咳嗽、發炎、真菌感染、和癌症(Sun et al.2010 Fitoterapia)，以及蘆筍已被報導具有抗發炎、細胞毒性、抗誘變、和抗真菌感染等功效(Huang and Kong 2006 Steroids)，蘆筍嫩莖係指冒出表土尚未有葉子的莖稱，蘆筍嫩莖的纖維尚未木質化，口感清脆，人們常取蘆筍嫩莖作為蔬菜食用，但因為嘌呤含量高，蘆筍嫩莖被認為會增加體內尿酸值，具有引起痛風的風險，但並無任何報導指出蘆筍其他部位對體內、血液之尿酸含量之影響。

為達成前述之發明目的，本發明提供一種蘆筍萃取物之製備方法，包括磨碎蘆筍並混和水或乙醇，進行熱迴流；以及熱迴流之產物過濾並乾燥後得蘆筍萃取物；該蘆筍包含蘆筍葉或蘆筍老莖。

於特定實施例，進行熱迴流條件為60℃熱迴流萃取6小時。

為達成前述之發明目的，本發明另提供一種降低血液尿酸之醫藥組合物，包括治療有效量之申請專利範圍第1項所述之蘆筍萃取物。

於特定實施例，該醫藥組合物包括藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑。

於特定實施例，該醫藥組合物之劑型係選自溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿、和膠囊所構成之群組。

為達成前述之發明目的，本發明另提供蘆筍萃取物用於製備抑制黃嘌呤氧化酶之醫藥組合物之用途。

為達成前述之發明目的，本發明另提供蘆筍萃取物用於製備降低血液尿酸之醫藥組合物之用途。

於特定實施例，該降低血液尿酸係治療高尿酸血症、痛風、復發性痛風發作、痛風性關節炎、高血壓、心血管疾病、冠心病、勒-奈二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、凱-賽二氏症候群(Kelley-Seegmiller syndrome)、腎病、腎結石、腎衰竭、關節發炎、關節炎、尿石症、鉛中毒、副甲狀腺亢進症、牛皮癬、類肉瘤病、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)缺乏症或其組合。

於特定實施例，該醫藥組合物包括URAT 1抑制劑、黃嘌呤氧化酶抑制劑、黃嘌呤去氫酶、黃嘌呤氧化還原酶抑制劑或前述之任意組合。

於特定實施例，該醫藥組合物包括異嘌呤醇及非布索坦、苯磺唑酮、苯溴馬隆及丙磺舒、聚乙二醇重組尿酸酶、普瑞凱希、拉布立酶、聚乙二醇化尿酸酶、非諾貝特、或前述之任意組合

於特定實施例，該醫藥組合物包括非類固醇抗發炎藥、皮質類固醇、秋水仙鹼、或前述之任意組合。

圖1 降尿酸試驗之高尿酸小鼠的尿酸值，在第0、7、14、21和28天進行測量尿酸值，其組別包括正常組()、高尿酸正控制組()、高尿酸餵食降尿酸藥物負控制組()、高尿酸餵食50mg/kg WEAO之實驗組(、高尿酸餵食100mg/kg WEAO之實驗組)、高尿酸餵食150mg/kg WEAO之實驗組)；結果以平均值±標準差表示(n=5)，並與正控制組比較(^a p<0.05,^b p<0.01,^c p<0.001)；圖2 降尿酸試驗之高尿酸小鼠的尿酸值，在第0、7、14、21和28天進行測量尿酸值，其組別包括正常組()、高尿酸正控制組()、高尿酸餵食降尿酸藥物負控制組()、高尿酸餵食50mg/kg EEAO之實驗組(、高尿酸餵食100mg/kg EEAO之實驗組)、高尿酸餵食150mg/kg EEAO之實驗組)；結果以平均值±標準差表示(n=5)，並與正控制組比較(^a p<0.05,^b p<0.01,^c p<0.001)； 圖3 降尿酸試驗餵食蘆筍水萃取物高尿酸小鼠之體重變化，分別於第0、7、14、21、和28天測量體重值，其分組為第0天()、第7天()、第14天()、第21天()、第28天(　　　)；試驗結果皆以平均±標準差標示(n=5)；圖4 降尿酸試驗餵食蘆筍乙醇萃取物高尿酸小鼠之體重變化，分別於第0、7、14、21、和28天測量體重值，其分組為第0天()、第7天()、第14天()、第21天()、第28天()；試驗結果皆以平均±標準差標示(n=5)；圖5 標準品之鳥糞嘌呤(Guanine)、次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)、和腺嘌呤(Adenine)進行標準曲線測試得到HPLC圖譜；圖6 測定蘆筍之嘌呤含量，分別為(A)蘆筍水萃物、(B)蘆筍乙醇萃取物、(C)新鮮蘆筍莖葉、(D)蘆筍嫩莖。

本發明之新穎技術特徵，包含特定特徵，係揭示於申請專利範圍，針對本發明之技術特徵，較佳之理解茲配合說明書、依據本發明原理之實施例、和圖式將本發明較佳之實施例詳細說明。

特定醫學或藥學用語

本發明說明書及申請專利範圍中所述之所有技術性及科學用語，除非另有所定義，皆依據以下敘述定義之。其中單數用語「一」、「一個」、「該」，除非另有說明，皆可指涉多於一個對象。除非另有說明，實施本發明採用之通常技術可包括核磁共振、高效液相層析法、蛋白 質化學、生物化學、重組DNA技術、藥理學技術。本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

本說明書用語「藥學上可接受」或其近似用語，係指涉不會消除本發明所使用之組合物之生物活性或其性質，且相對無毒之物質，即，可向個體投與該物質而不會導致不良生物反應或不會與組合物中之成分以有害個體健康之方式交互作用。

本說明書用語「載劑(carrier)」、「賦形劑(vehicle)」，係指涉不具毒性之化合物或藥劑，其具有協助細胞或組織吸收藥物之功能。

前述「載劑(carrier)」、「賦形劑(vehicle)」可為芳香劑(aromatics)、緩衝劑、黏著劑(binders)、著色劑(colorants)、崩解劑(disintegrants)、稀釋劑、乳化劑(emulsifiers)、增量劑(extenders)、氣味改善劑(flavor-improving agents)、膠凝劑(gellants)、滑動劑(glidants)、防腐劑、皮膚滲入促進劑(skin-penetration enhancers)、助溶劑(solubilizers)、安定劑(stabilizers)、懸浮劑(suspending agents)、甜味劑(sweeteners)、張力劑(tonicity agents)、黏度增強劑(viscosity-increasing agents)或上述之任意組合。

本說明書用語「合併使用」或近似用語，係指涉給予、施予一服用者至少一種選擇之藥物，且包含一療程，該療程係同時或分別以相同或多種途徑給藥。

本說明書用語「稀釋劑」，係指涉給藥前用以稀釋藥物之化合物。稀釋劑可用於穩定化合物或藥物，因其可提供較穩定之外在環境。本發明用於溶解鹽類之緩衝溶液並調控酸鹼值，包括但不限於磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)。

本說明書用語「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」，係指涉化合物或藥物之一足夠量，可於服用者服藥後減輕一或多項疾病症狀或生理狀況；其結果為降低和/或緩和徵象(sign)、症狀(symptom)、或病因，或為其他生理系統之有意圖之改變。舉例而言，治療之「有效量」係包含一本發明提供化合物之可於臨床上顯著降低疾病症狀之劑量。一適當之有效量，其有效值取決於通常藥學技術，如藥物增量方法(dose escalation methods)。

本說明書用語「代謝物」，係指涉化合物代謝後所產生之衍生化合物。本說明書用語「活性代謝物」，係指涉化合物代謝後所產生具生物活性之衍生物。本說明書用語「經代謝後」，係指涉生物體改變特定物質之過程之總和，包括但不限於水解反應、酵素催化反應。故，酵素可令化合物產生特定結構改變；舉例而言，細胞色素P450催化多種氧化還原反應；而二磷酸尿核苷葡萄醣酸酸基轉移酶催化已活化之葡萄糖醛酸產生芳醇、脂族醇、羧酸、胺、硫氫基。

本說明書用語「組合物」，係指涉一產物，該產物係來自混和或組合多於一種活性成分，並且該產物之活性成分係組合藥或非組合藥之組合物。用語「組合藥」說明其活性成分及其助劑(co-agent)係同時以一藥劑給予服用者；用語「非組合藥」說明其活性成分及其助劑(co-agent)係 以分離之藥劑同時、分別、或依序地施予服用者且無限制其用藥間隔，前述施予提供服用者於體內具有有效量之多種化合物；其中該非組合藥可應用於雞尾酒療法，即施予三種或多種活性成分。

本說明書用語「治療」、「治療中」、「療法」，係包含以治療或預防之方式緩和、減輕、或改善至少一項疾病症狀或生理狀況、預防新增之症狀、抑制疾病或生理狀況、阻止或減緩疾病發展、造成疾病或生理狀況之復原、減緩因疾病造成的生理狀況、停止疾病症狀或生理狀況。

用語「服用者」、「治療主體」或近似用語，係哺乳動物，該哺乳動物包含但不限於屬於哺乳綱之動物，如人類、非人靈長類如黑猩猩、猿、猴，或畜牧動物如牛、馬、綿羊、山羊、豬，或家庭動物如兔、狗、貓，或實驗動物如囓齒動物、大鼠、小鼠、天竺鼠、或近似動物。

藥物給予途徑和劑量

本說明書用語「給予」、「給藥」、「投與」、「投藥」或或其近似用語，係指涉可用於將組合物傳遞至適當之生物部位或器官之方法。

適當之給藥途徑包含但不限於口服、靜脈、直腸、氣霧、腸胃道、眼、肺、黏膜穿透、皮膚穿透、陰道、耳、鼻、局部給藥。

以下治療實施僅為例示，由於個體治療療程之變異極大，而大量的建議值之偏離並非異常。劑量可依據變異而改變，而不限於使用之化合物之活性、治療疾病或生理狀態、給藥方式、個體需求、疾病嚴重性、及醫師判斷。

治療療程之毒性和療效可藉由細胞培養或動物實驗之標準醫藥程序而判定，包括但不限於判斷半數有效劑量(ED₅₀，治療效果達成試 驗體半數具有療效之劑量)。

本發明所使用之組合物，其劑型包含但不限於溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)以及其他類似或適用本發明之劑形。

本發明所使用之前述組合物，可進一步添加一可食性材料，以製備為一種食品產品或保健產品。其中該可食性材料包含，但不限於：水(water)、流體乳品(fluid milk products)、牛奶(milk)、濃縮牛奶(concentrated milk)；發酵乳品(fermented milk)，諸如優酪乳(yogurt)、酸乳(sour milk)、冷凍優格(frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料(lactic acid bacteria-fermented beverages)、奶粉(milk powder)、冰淇淋(ice cream)、乳酪(cream cheeses)、乾酪(dry cheeses)、豆漿(soybean milk)、發酵豆漿(fermented soybean milk)、蔬果汁(vegetable-fruit juices)、果汁(juices)、運動飲料(sports drinks)、甜點(confectionery)、果凍(jellys)、糖果(candies)、嬰兒食品(infant formulas)、健康食品(health foods)、動物飼料(animal feeds)、中草藥材(herbal formula)、膳食補充品(dietary supplements)等。

本發明所使用之前述組合物可為膳食補充品，可以下列方式給予服用者：與合適的可飲用液體混合，例如水，優酪乳，牛奶或果汁；或可與固體或液體食品進行混合。本說明書中，膳食補充品之形式可為錠劑，丸劑，膠囊，藥錠糖(lozenge)，顆粒，粉劑，懸浮劑，小藥囊，軟錠劑，糖果，棒，糖漿及相應的投予形式，通常為單位劑量的形式，並以製備膳食補充品的常規方法製造。

組合治療(combination treatment)之通常考量

通常而言，關於說明書中說明之組合治療，本說明書所述之組合物以及其他藥劑成分不必以同一醫藥組合物給藥；於實施例中，因不同的物理和化學特性，可經由不同途徑給藥。於本案實施例中，初期給藥係依據已建立之給藥流程，再由依據臨床藥物功效、劑量、給藥模式、給藥次數等而更動。

於本發明實施例中，治療有效劑量依據組合治療而變動。組合治療可進一步包括週期性治療，該週期性治療係指涉多次起始以及停止之治療以助於病患之臨床管理。關於本說明書所述之組合治療，共同給藥之化合物之劑量，依據共同給藥之藥物、主要治療之藥物、疾病、生理異常、生理狀況等因子而變動。

於本發明實施例中，為達成治療、預防、或改善生理狀況以及緩和症狀，給藥療程係依據多項因子而變動或修正；前述因子包含病患之生理異常、年齡、體重、性別、飲食、用藥情況等。因此，於本案另一實施例，劑量療程可廣泛地變動以及偏離起初之給藥療程。

生物材料

本發明實施例之動物實驗，採用國家實驗研究院實驗動物中心之五週齡之雄性小白鼠，品系為BALB/c ByJNarl。所有實驗小鼠飼養於動物房，其生活條件為溫度為20-26℃、濕度為40-70%，光照循環為12小時光照/12小時黑暗之交替；飼料和飲水正常給予飲食。

統計方法

實驗結果以平均值±標準差(Mean±Standard Deviation)來表 示。數據統計分析以軟體Sigma Plot 12.0執行，並以學生t檢驗(Student's T-Test)分析。若有差異則用p值表示，p<0.05即表示具有顯著統計差異、p<0.01則表示具有極顯著統計差異。

實施例1 蘆筍萃取物之製備

取新鮮蘆筍磨碎成粉狀，並取磨碎後之蘆筍200克(g)混和2公升(L)去離子水進行60℃熱迴流萃取6小時，萃取後使用濾布過濾以及一號濾紙進行抽氣過濾，再以真空冷凍乾燥獲得蘆筍水萃物(Water extract of Asparagus officinalis，WEAO)。乾燥水萃物重量為55.51g，抽取率為27.76%，回溶於水後保存於-20℃。

另，磨碎後之蘆筍300g混和3L 95%乙醇進行60℃熱迴流萃取6小時，萃取後使用濾布過濾以及一號濾紙進行抽氣過濾，再以減壓濃縮去除乙醇獲得蘆筍乙醇萃取物(Ethanol extract of Asparagus officinalis，EEAO)。乾燥乙醇萃物重量為39.9g，抽取率為13.3%，回溶於水後保存於-20℃。以上實驗中的蘆筍包含蘆筍葉與蘆筍老莖，其中蘆筍老莖係指已有葉子的莖老莖其纖維已木質化，較堅硬、不作為蔬菜食用，老莖與葉可進行光合作用提供養分供嫩莖生長。

實施例2 測定蘆筍萃取物對於黃嘌呤氧化酶之抑制功效

取實施例1所製備之蘆筍乙醇、水萃物進行稀釋，並測定對於黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)之抑制功效。不同濃度之萃取液取50微升(μl)混和35μl 50毫莫耳體積濃度(mM)之磷酸緩衝液(pH 7.5)、以及30μl 0.1U/毫升(ml)之黃嘌呤氧化酶，於35℃反映15分鐘，再加入60μl 150微莫耳體積濃度(μM)之黃嘌呤反應30分鐘，最後加入25μl 1當量濃度(N)之鹽酸 終止反應。反應後，使用分光光度計測定尿酸吸收波長295奈米(nm)之吸收值，再將尿酸變化量換算為黃嘌呤氧化酶抑制率(%)(Liu et al.,2014 Food Chem Toxicol，Umamaheswari et al.,2007 J Ethnopharmacol)；另，控制組則以50mM磷酸緩衝液作為空白之負控制組，以及異嘌呤醇(Allopurinol)作為正控制組(Filha et al.,2006 J Ethnopharmacol)。

黃嘌呤氧化酶抑制實驗之結果(表1)顯示，添加異嘌呤醇之正控制組於0.5毫克(mg)/毫升(ml)、1mg/ml、和10mg/ml之異嘌呤醇濃度下，抑制率分別為95.10±0.22%、97.08±2.58%、95.60±0.15%。蘆筍水萃取物(WEAO)對於黃嘌呤氧化酶之抑制功效，於0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml之濃度下，抑制率分別為32.52±0.15%、37.34±0.16%、33.96±0.07%。蘆筍乙醇萃取物(EEAO)對於黃嘌呤氧化酶之抑制功效，於0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml之濃度下，抑制率分別為22.29±0.07%、43.94±0.08%、25.27±0.08%。綜上實驗結果，WEAO和EEAO在0.05-0.25mg/ml均有黃嘌呤氧化酶抑制作用，且其抑制能力隨濃度上升，但於0.1mg/ml之濃度抑制效果最佳，而0.25mg/ml之濃度效果較差。以上實驗中的蘆筍包含蘆筍葉與蘆筍老莖。

實施例3 測定蘆筍萃取物降低尿酸之功效

用於測定蘆筍萃取物對於降低尿酸之功效之實驗小鼠分為9組，包括控制組和實驗組且每組各5隻小鼠(N=5)，實驗進行四週28天，每日管餵特定劑量之蘆筍萃取物和腹腔注射藥物，前述各組別分別為無餵食任何藥物之正常組、誘導小鼠高尿酸血液之正控制組、餵食降尿酸藥(10毫克(mg)/公斤(kg)異嘌呤醇)之負控制組、餵食蘆筍水萃取物和餵食蘆筍乙醇萃取物之實驗組各三組(50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg)；各小鼠每週測量體重，並採集尾巴血液測量尿酸值以進行餵食後第0、7、14、21、28天之降尿酸評估，於第28天犧牲小鼠採集血液。

實驗小鼠餵食誘導藥物氧嗪酸(Oxonic acid，OA)，可阻斷動物體內尿酸代謝之途徑，使體內累積高濃度尿酸。實驗組小鼠每日餵食蘆筍乙醇或水萃取物1小時後，於腹腔內(intraperitoneal)注射OA(280毫克(mg)/小鼠公斤重(kg)溶於0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na))並持續28天；採血則是於腹腔注射後2小時採集尾巴血液，測定血液中尿酸值。

血液尿酸測定方法係使用儀器Automated biochemical analyzer和SPOTCHEM Ⅱ Uric Acid Reagent來測試血清中尿酸濃度，測定吸收波長550nm之吸光值。

降尿酸實驗結果，即餵食蘆筍萃取物之高尿酸小鼠之尿酸值，揭示於表2-3、圖1-2；第0天係各組別未經誘導之起始尿酸值，正常組為1.30±0.33mg/公合(dl)、高尿酸小鼠之正控制組為1.70±0.64mg/dl、高尿酸小鼠餵食降尿酸藥之負控制組為1.24±0.38mg/dl、高尿酸餵食50mg/kg WEAO之實驗組為1.78±0.37mg/dl、高尿酸餵食100mg/kg WEAO之實驗組 為1.28±0.36mg/dl、高尿酸餵食150mg/kg WEAO之實驗組為1.40±0.37mg/dl、高尿酸餵食50mg/kg EEAO之實驗組為1.36±0.65mg/dl、高尿酸餵食100mg/kg EEAO之實驗組為1.58±0.65mg/dl、高尿酸餵食150mg/kg EEAO之實驗組為1.42±0.43mg/dl。第7天尿酸值，正常組為1.64±0.44mg/dl、高尿酸組之正控制組為2.48±0.69mg/dl、高尿酸餵食降尿酸藥之負控制組為1.48±0.33mg/dl、高尿酸餵食50mg/kg WEAO之實驗組為1.98±0.71mg/dl、高尿酸餵食100mg/kg WEAO之實驗組為1.56±0.61mg/dl、高尿酸餵食150mg/kg WEAO之實驗組為1.84±0.42mg/dl、高尿酸餵食50mg/kg EEAO之實驗組為2.16±0.67mg/dl、高尿酸餵食100mg/kg EEAO之實驗組為1.90±0.71mg/dl、高尿酸餵食150mg/kg EEAO為1.52±0.20mg/dl；高尿酸組明顯上升的比較高。持續到第28天尿酸值之結果，正常組為1.80±0.32mg/dl、高尿酸之正控制組為4.00±0.84mg/dl、高尿酸餵食降尿酸藥之負控制組為1.14±0.31、高尿酸餵食50mg/kg WEAO之實驗組為2.02±0.33mg/dl、高尿酸餵食100mg/kg WEAO之實驗組為1.42±0.36mg/dl、高尿酸餵食150mg/kg WEAO之實驗組為1.40±0.37mg/dl、高尿酸餵食50mg/kg EEAO之實驗組為1.50±0.41mg/dl、高尿酸餵食100mg/kg EEAO之實驗組為1.52±0.33mg/dl、高尿酸餵食150mg/kg EEAO之實驗組為1.68±0.27mg/dl。

結果以平均值±標準差標示(n=5)

和高尿酸組比較，a：p<0.05，b：p<0.01，c：p<0.001

結果以平均值±標準差標示(n=5)

和高尿酸組比較，a：p<0.05，b：p<0.01，c：p<0.001

實驗結果顯示高尿酸之正控制組尿酸值於第0天1.70±0.64mg/dl，持續升高至第28天尿酸值為4.00±0.84mg/dl；餵食WEAO和EEAO的尿酸值有稍微增加，經餵食7天結果低於高尿酸組，推斷蘆筍萃取物可控 制血液中尿酸含量。餵食100mg/kg WEAO之組別於第7天尿酸值為1.56±0.61mg/dl，持續至第28天尿酸值為1.42±0.36mg/dl，於三實驗組中穩定降尿酸效果較好；餵食150mg/ml EEAO之組別於第28天尿酸值雖提升一些，仍維持降尿酸效果；餵食50mg/kg EEAO之組別於第7天尿酸值為2.16±0.67mg/dl，並且持續至第28天尿酸值為1.50±0.41mg/dl，顯示低劑量之蘆筍萃取物即具有降尿酸效果。

另，進行降尿酸實驗中各組別之小鼠體重變化，體重隨實驗進行日數增加，無明顯變化，經誘導和餵食後體重無受到影響。

測量餵食蘆筍水萃取物之小鼠體重(圖3)之結果顯示，第0天的正常組體重為22.49±1.12g、高尿酸正控制組之體重為23.09±1.01g、高尿酸餵食降尿酸藥之負控制組為23.55±1.24g、高尿酸餵食50mg/kg WEAO之實驗組體重為23.53±1.27g、高尿酸餵食100mg/kg WEAO之實驗組體重為22.47±2.36g、高尿酸餵食150mg/kg WEAO之實驗組體重為23.24±1.78g。持續記錄第7、14、21天小鼠之體重，體重隨實驗日數增加，第28天正常組體重為25.16±0.70g、高尿酸正控制組體重為24.30±1.15g、高尿酸餵食降尿酸藥之負控制組體重為25.95±1.81g、高尿酸餵食50mg/kg WEAO之實驗組體重為25.19±0.59g、高尿酸餵食100mg/kg WEAO之實驗組體重為24.69±1.49g、高尿酸餵食150mg/kg WEAO之實驗組體重為25.77±0.88g。

測量餵食蘆筍水萃取物之小鼠體重(圖4)之結果顯示，第0天的正常組體重為22.49±1.12g、高尿酸之正控制組體重為23.09±1.01g、高尿酸餵食降尿酸藥之負控制組體重為23.55±1.24g、高尿酸餵食50mg/kg EEAO之實驗組體重為19.94±1.69g、高尿酸餵食100mg/kg EEAO之實驗組體重為21.72±0.59g、高尿酸餵食150mg/kg EEAO之實驗組體重為21.82±1.26g。持續記錄第7、14、21天小鼠之體重，體重隨實驗日數增加，第28天為正常組體重為25.16±0.70g、高尿酸正控制組體重為24.30±1.15g、高尿酸餵食降尿酸藥之負控制組體重為25.95±1.81g、高尿酸餵食50mg/kg EEAO之實驗組體重為24.72±0.84g、高尿酸餵食100mg/kg EEAO之實驗組體重為24.95±0.72g、高尿酸餵食150mg/kg EEAO之實驗組體重為24.69±1.35g。以上實驗中的蘆筍包含蘆筍葉與蘆筍老莖。

實施例4 蘆筍萃取物嘌呤含量之測定

測定蘆筍萃取物含有之嘌呤，先使用標準品製作標準曲線，包括鳥糞嘌呤(Guanine)、次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)和腺嘌呤(Adenine)，各取10mg混和0.3M磷酸二氫鉀溶液(KH₂PO₄)(pH4.0)至50ml，PH值4.0，濃度為200μg/ml再進行稀釋所需要的濃度。

另，秤取乾燥的WEAO、EEAO、新鮮蘆筍莖葉和蘆筍嫩莖各200mg混和2ml 6%過氯酸，震盪40秒後放置於100℃水浴槽加熱1小時，並於加熱後30分鐘、40分鐘、50分鐘進行震盪40秒，加熱1小時後放置於冰上快速冷卻，利用2M氫氧化鉀和5%甲酸調整pH值至3.6後，加入10M甲酸氨10ml，再以2M氫氧化鉀和5%甲酸調整pH值至3.6，而後使用0.22微米(μm)膜過濾，過濾後進行高效能液相層析(HPLC)分析。

測定嘌呤含量之HPLC實驗條件如下：HPLC幫浦：HITACHIL-7100

管柱名稱：HITACHI LaChrom C18

管柱大小：250×4.6mm I.D.

管柱溫度：40℃

樣品注射量：10μl

移動相：0.3M KH₂PO₄(pH4.0)。

測量波長：254nm

梯度設為A移動相100% 0-8分鐘流速為1.000，8-15分鐘流速為1.200。

清洗管柱條件為50%乙腈(Acetonitrile)水溶液，流速為0.1000 overnight。

標準品之鳥糞嘌呤(Guanine)、次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)、和腺嘌呤(Adenine)進行標準曲線測試得到HPLC圖譜(圖5)及其線性範圍(表5)。

將樣品和樣品加200μg/ml標準品(鳥糞嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤)分別注入HPLC儀器，可得到之結果為蘆筍萃取物、與加入標準品嘌呤含量之HPLC圖譜之比較(圖6A-D)，各嘌呤(G：Guanine、H：Hypoxanthine、X：Xanthine、A：Adenine)析出之時間則揭示於表6。嘌呤總含量於新鮮濕重100g蘆筍莖葉為601.23mg/ml、濕重100g蘆筍嫩莖955.25mg/ml、乾重0.2g蘆筍水萃取物為9.45mg/ml、乾重0.2g蘆筍乙醇萃取物 2.62mg/ml。結果顯示出蘆筍嫩莖的嘌呤量是新鮮蘆筍莖葉的4.35倍，蘆筍水萃取物的嘌呤含量是乙醇萃取物的3.62倍，於體內動物降尿酸實驗及體外黃嘌呤氧化酶的抑制率的結果得知蘆筍水萃取物的降尿酸效果比乙醇萃取物為差，由此可知嘌呤含量高者降尿酸效果越差。

於本說明書較佳實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示；具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，而不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。

Claims (11)

1. 一種蘆筍萃取物之製備方法，包括磨碎蘆筍並混和水或乙醇，進行熱迴流；以及熱迴流之產物過濾並乾燥後得蘆筍萃取物；其中該蘆筍包含蘆筍葉或蘆筍老莖。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，進行熱迴流條件為60℃熱迴流萃取6小時。
3. 一種降低血液尿酸之醫藥組合物，包括治療有效量之申請專利範圍第1項所述之蘆筍萃取物。
4. 如申請專利範圍第3項之醫藥組合物，該醫藥組合物包括藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑。
5. 如申請專利範圍第3項之醫藥組合物，該醫藥組合物之劑型係選自溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿、和膠囊所構成之群組。
6. 蘆筍萃取物用於製備抑制黃嘌呤氧化酶之醫藥組合物之用途。
7. 蘆筍萃取物用於製備降低血液尿酸之醫藥組合物之用途。
8. 如申請專利範圍第7項之用途，該降低血液尿酸係治療高尿酸血症、痛風、復發性痛風發作、痛風性關節炎、高血壓、心血管疾病、冠心病、勒-奈二氏症候群、凱-賽二氏症候群、腎病、腎結石、腎衰竭、關節發炎、關節炎、尿石症、鉛中毒、副甲狀腺亢進症、牛皮癬、類肉瘤病、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏症或其組合。
9. 如申請專利範圍第7項之用途，該醫藥組合物包括URAT 1抑制劑、黃嘌呤氧化酶抑制劑、黃嘌呤去氫酶、黃嘌呤氧化還原酶抑制劑或前述 之任意組合。
10. 如申請專利範圍第7項之用途，該醫藥組合物包括異嘌呤醇及非布索坦、苯磺唑酮、苯溴馬隆及丙磺舒、聚乙二醇重組尿酸酶、普瑞凱希、拉布立酶、聚乙二醇化尿酸酶、非諾貝特、或前述之任意組合
11. 如申請專利範圍第7項之用途，該醫藥組合物包括非類固醇抗發炎藥、皮質類固醇、秋水仙鹼、或前述之任意組合。