TW201726169A - Pd-1訊息抑制劑之併用療法 - Google Patents

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Tasuku Honjo
Kenji Chamoto
Sidonia Fagarasan
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Abstract

本發明提供一種抗PD-1抗體治療之新穎治療戰略。一種醫藥組合物，其包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期進行投予：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。

Description

PD-1訊息抑制劑之併用療法
本發明係關於一種PD-1(Programmed Cell Death-1，計劃性細胞死亡-1)訊息抑制劑之併用療法。
由近年來之臨床試驗之結果已明確，抗PD-1抗體治療對於各種癌症較先前之標準治療更有效[非專利文獻1~3]。晚期肺癌患者之PD-1抗體治療之奏效率與先前之抗癌劑相比顯著地提高而達到20~30%。然而，事實上仍有約半數左右之患者顯示出無應答性。目前幾乎尚未知曉緣何該等患者對PD-1抗體治療無應答。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
非專利文獻1：Bramer J, Reckamp K, et al: Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 373: 1627-1639, 2015.
非專利文獻2：Hamanishi J, Mandai M, Ikeda T, et al: Safety and Antitumor Activity of Anti-PD-1 Antibody, Nivolumab, in Patients With Platinum-Resistant Ovarian Cancer. J Clin Oncol, 33: 4015-4022, 2015.
非專利文獻3：Motzer RJ, Escudier B, McDermott DF, et al: Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med, 373: 1803-1813, 2015.
本發明之目的在於提供一種抗PD-1抗體治療之新穎治療戰略。
抗PD-1抗體治療不同於先前之具有直接之癌細胞殺死作用之抗癌劑，係藉由使抗腫瘤免疫活化而抑制癌增殖。若存在如支持抗腫瘤免疫之試劑，則藉由併用可提高抗腫瘤效果，而期待亦可適用於無應答患者。
本發明者等人發現，若將PD-1訊息抑制抗體與ROS(Reactive Oxygen Species，活性氧)產生劑或線粒體膜電位控制劑(解偶聯劑)併用，則抗腫瘤效果協同性地提高。若單獨使用ROS產生劑、或線粒體膜電位控制劑，則於活體內未發揮出抗腫瘤效果。根據以上之結果認為，ROS產生劑、或線粒體膜電位控制劑具有藉由與PD-1訊息抑制抗體併用，支持抗腫瘤免疫，而協同性地抑制癌增殖之效果。
本發明之主旨如下所述。
(1)一種醫藥組合物，其包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期進行投予。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
(2)如(1)中所記載之醫藥組合物，其中PD-1訊息抑制劑為抗體。
(3)如(1)或(2)中所記載之醫藥組合物，其中抗體係選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種抗體。
(4)如(1)至(3)中任一項所記載之醫藥組合物，其中ROS產生劑係選自由第三丁基過氧化氫、羰基氰對三氟甲氧基苯腙、2,4-二硝基苯酚、2,3-二甲氧基-1,4-萘醌及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(5)如(1)至(3)中任一項所記載之醫藥組合物，其中顯示出解偶聯作用之物質為選自由羰基氰對三氟甲氧基苯腙、2,4-二硝基苯酚、羰基氰化物間氯苯腙、水楊酸、4,4'-[戊烷-1,5-二基雙(氧基)]二苯甲脒)、2-(2-(2,6-二氯苯基胺基)苯基)乙酸、4-羥基-2-甲基-N-(2-吡啶基)-2H-1,2-苯并噻-3-甲醯胺-1,1-二氧化物、2-{1-[(4-氯苯基)羰基]-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基}乙酸、N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺醯胺、4-羥基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1,2-苯并噻-3-甲醯胺-1,1-二氧化物、氯硝柳胺乙醇胺鹽、4-甲氧基-8-(3-甲基丁-2-烯氧基)喹啉-2-羧酸3-甲基丁-2-烯酯及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(6)如(1)至(3)中任一項所記載之醫藥組合物，其中ROS產生劑或控制顯示出解偶聯作用之物質之下游訊息的物質係控制mTOR(mammalian target of rapamycin，哺乳動物雷帕黴素靶蛋白)、AMPK(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase，腺苷酸活化蛋白激酶)、SIRT(Sirtuin，去乙醯化酶)1、PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α，過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔助活化因子-1α)/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)及Foxo1中之任一種或其以上之物質。
(7)如(6)中所記載之醫藥組合物，其中控制mTOR之物質為選自由4,6-二(4-嗎啉基)-N-(4-硝基苯基)-1,3,5-三-2-胺、磷脂酸及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(8)如(6)中所記載之醫藥組合物，其中控制AMPK之物質為選自由6,7-二氫-4-羥基-3-(2'-羥基[1,1'-聯苯]-4-基)-6-側氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-5-甲腈、5-胺基咪唑-4-甲醯胺1-β,-D-呋喃核糖苷、N,N-二甲基雙胍、6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(9)如(6)中所記載之醫藥組合物，其中控制SIRT1之物質為選自由反式-3,5,4'-三羥基芪、N-(2-(3-(哌-1-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)喹啉-2-甲醯胺、N-苄基-3,5-二乙氧羰基-4-苯基-1,4-二氫吡啶、2-胺基-N-環戊基-1-(3-甲氧基丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]喹啉-3-甲醯胺、菸醯胺單核苷酸及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(10)如(6)中所記載之醫藥組合物，其中控制PGC-1α/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)之物質為選自由2-(4-{2-[(4-氯苯甲醯基)胺基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸、9-順式,12-順式-十八碳二烯酸)、2-[4-(4-氯苯甲醯基)苯氧基]-2-甲基丙酸-d6 1-甲基乙酯、十一烷硫基乙酸、4-甲基-5-(2-吡基)-3-二硫雜環戊烯硫酮、N,N-二甲基甲醯胺、3-[4-(2,4-雙(三氟甲基)苄氧基)-3-甲氧基苯基]-2-氰基-N-(5-三氟甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙烯醯胺及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(11)如(6)中所記載之醫藥組合物，其中控制Foxo1之物質為選自由5-胺基-7-(環己基胺基)-1-乙基-6-氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸、2-環戊基-N-{2,4-二氯-3-[(異喹啉-5-基氧基)甲基]苯基}-N-甲基乙醯胺及其類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(12)如(1)至(3)中任一項所記載之醫藥組合物，其中胺基酸為選自由 色胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、組胺酸、離胺酸(Ricin)、甲硫胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
(13)如(1)至(12)中任一項所記載之醫藥組合物，其係用作抗癌劑、感染症治療劑或該等之組合。
(14)如(1)至(13)中任一項所記載之醫藥組合物，其分別投予PD-1訊息抑制劑與選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
(15)如(1)至(13)中任一項所記載之醫藥組合物，其係包含PD-1訊息抑制劑與選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質的調配劑。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
(16)一種PD-1訊息抑制活性增強劑，其包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
(17)一種癌症、感染症或該等之組合之治療方法，其包括如下步驟：於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，以醫藥上有效之 量對受驗者或受驗動物投予選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
(18)一種選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之用途，其係用於治療癌症、感染症或該等之組合，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，投予選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
(19)一種選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之用途，其係用於治療癌症、感染症或該等之組合之方法，且投予選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
藉由將ROS產生劑或控制其下游訊息之物質及/或顯示出解偶聯作用之物質或控制其下游訊息之物質與PD-1訊息抑制劑併用，抗腫瘤效果協同性地提高。
本說明書包含作為本申請之優先權基礎的日本專利申請、日本專利 特願2015-238511及日本專利特願2016-119695之說明書及/或圖式中所記載之內容。
圖1係由PD-1抑制與化學試劑所引起之線粒體活化之假設圖。(a)PD-1抑制將腫瘤反應性T細胞之線粒體活化。(b)ROS誘導劑或解偶聯劑使細胞之ROS增加。(c)細胞之ROS將AMPK與mTOR活化，結果除了T-bet之表現以外，PGC-1a亦被活化。(d)與PGC-1a結合之NRF(Neutrophil Releasing Factor，中性粒細胞釋放因子)或PPARs(Peroxisome Proliferator Activated Receptors，過氧化物酶體增殖物活化受體)之活化引起線粒體中之正反饋活化。Friederich-Persson,M.,et al.Kidney hypoxia,attributable to increased oxygen consumption,induces nephropathy independently of hyperglycemia and oxidative stress.Hypertension 62,914-919(2013).Kenwood,B.M.,et al.dentification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.Mol Metab 3,114-123(2014).Berrien-Elliott,M.M.,et al.Checkpoint blockade immunotherapy relies on T-bet but not Eomes to induce effector function in tumor-infiltrating CD8+ T cells.Cancer immunology research 3,116-124(2015).
圖2係由PD-1抑制所引起之TR(Tumor-Reactive，腫瘤反應性)CTL(Cytotoxic T Lymphocyte，細胞毒性T淋巴細胞)之活體內檢測與其線粒體之活性。α~d)為實驗步驟之概要圖。將以CellTrace標記之CD45.1+ CD8+ T細胞移植至CD45.2+ CD8-/-小鼠。對小鼠接種MC38，並利用PD-L1抗體進行治療。對所屬淋巴結之CD8+ CD45.1+ T細胞設門並 進行分析(a)。揭示該門內之細胞之CD62L與CellTrace之強度(b)(左)。對高分裂細胞之頻度進行群間比較。資料係揭示4至5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，單因子變異數分析(one-way analysis of variance)(右)(b)。於(a)中所示之門內之細胞中，對CellTrace及擔載有mLama4肽或者無關之肽之MHC(Major Histocompatibility Complex，主要組織相容性複合體)四聚物之陽性率以進行了PD-L1抗體治療之群進行分析(c)。利用與線粒體之活性相關之試劑將進行了PD-L1抗體治療之所屬淋巴結細胞進行染色。揭示(a)之門中之代表性FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting，螢光活化細胞分選)資料(上圖)(d)。對各線粒體染色試劑之螢光強度之中央值分析為高分裂(高)與低分裂(低)並加以比較。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * * * p<0.0001，單因子變異數分析(下圖)(d)。資料係揭示三個獨立之實驗中之代表性者(α~d)。e、f)向MC38帶癌野生型小鼠每4天投予3次PD-L1抗體。利用XFe96分析器對自治療或者未治療小鼠單離之所屬淋巴結之CD8+ T細胞之氧消耗量(OCR)進行計測。於第二次治療之2天後混合3隻小鼠之細胞並進行分析(e)。對定義為(寡黴素(oligomycin)投予後之最終計測值)-(寡黴素投予後之最低計測值)之ATP(Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷)轉化率進行計測(f)。資料係揭示3孔之平均值±標準誤差。* * * * p<0.0001，2標本之學生t檢驗分佈。資料係揭示兩個獨立之實驗中之代表性資料。
圖3為PD-L1抗體治療與活性氧產生劑Luperox之協同效應。a)對小鼠接種MC38 3週，每7天投予第三丁基過氧化氫溶液(Luperox)。揭示腫瘤之體積。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。b)為併用治療之步驟 之概要圖。c)對小鼠接種MC387天後投予PD-L1抗體與Luperox。揭示腫瘤之體積與存活曲線。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01，2標本之t檢驗分佈(抗PD-L1相對於抗PD-L1+Luperox)。資料係揭示兩個獨立之實驗中之代表性者。
圖4中解偶聯劑之協同效應係與ROS相關。a)如圖3b般於相同之步驟中向MC38帶癌小鼠投予FCCP(Carbonyl cyanide-p-(trifluoromethoxy)，羰基氰對三氟甲氧基苯腙)或者DNP(Dinitrophenol，二硝基苯酚)與PD-L1抗體。揭示腫瘤之體積與存活曲線。資料係揭示5至6隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01，2標本之t檢驗分佈(抗PD-L1相對於抗PD-L1+FCCP或者DNP)。b)於與(a)相同之步驟中向MC38帶癌小鼠僅投予FCCP或者DNP。揭示腫瘤之體積。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。c)向MC38帶癌小鼠投予ROS清除劑(MnTBAP)、PD-L1抗體及FCCP(左)或者DNP(右)。資料係揭示4至5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01，2標本之t檢驗分佈(併用治療相對於併用治療+MnTBAP)。DNP併用治療中之對照IgG群之小鼠(右)係與圖4b共用。資料係揭示兩個獨立之實驗中之代表性者。
圖5係藉由同時併用DNP與Luperox而增進抗腫瘤效果。於與圖3b相同之步驟中，向MC38帶癌小鼠投予DNP或者Luperox、或其兩者與抗PD-L1抗體。揭示腫瘤之體積。資料係揭示5至6隻小鼠之平均值±標準誤差。資料係揭示兩個獨立之實驗中之代表性資料。
圖6係由FCCP投予所引起之效應CD8+ T細胞之增加。a)如圖3b所示般於相同之步驟中向MC38帶癌小鼠投予PD-L1抗體與FCCP。於第14天利用抗CD8、CD62L、CD44抗體將所屬淋巴結之細胞進行染色，對CD8+ T細胞設門。基於CD62L與CD44之強度，對P1至P3之細胞群進行定義(上圖)。計算各群中之P1至P3之細胞之絕對數。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，單因子變異數分析(下圖)。b)利用各線粒體染料將投予了PD-L1抗體與FCCP之小鼠之所屬淋巴結CD8+T細胞進行染色。P1~P3之代表性FACS輪廓(上段圖)。各群中之利用各線粒體染料進行染色之P3細胞群之代表性FACS輪廓(中段圖)。將利用各染料進行染色之P1~P3之MFI(Mean Fluorescence Intensity，平均螢光強度)於投予群間進行比較。顏色係與P1~P3細胞群對應。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差(下段圖)。* p<0.05，* * p<0.01，單因子變異數分析。c)於腫瘤投予後第11天將經酶處理之癌組織之細胞利用抗CD8、CD45、CD62L、CD44抗體進行染色。對CD45+ CD8+ T細胞設門，並對該CD62L與CD44之表現型進行分析(左圖)。對CD45+ T細胞中之CD8+ T細胞之頻度與CD45+ CD8+ T細胞之絕對數進行群間比較(右圖)。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01，單因子變異數分析。FACS資料係揭示各群之5隻小鼠資料中之代表性者。資料係揭示兩個獨立之實驗中之代表性者。
圖7中由解偶聯劑與PD-L1抗體之併用所引起之協同效應係與mTOR及AMPK之途徑相關。a)於DNP或者FCCP之併用治療時，混合5隻小鼠之所屬淋巴結細胞，將CD8+ T細胞單離。藉由西方墨點法對p-AMPK與ACC(Acetyl-CoA Carboxylase，乙醯輔酶A羧化酶)、mTOR、S6K之磷酸化及SIRT1與4EBP1(4E-binding protein 1，4E結合蛋白1)之表現進行分析。b)於與圖3b相同之步驟中向MC38帶癌小鼠將AMPK活性劑(A76966)與mTOR活性劑(MHY1485)、或者其兩者與PD-L1小鼠抗體一 併投予。揭示腫瘤之體積與存活曲線。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01，2標本之t檢驗分佈(抗PD-L1抗體相對於併用治療)。星號之各顏色係與相同之顏色所示之群一致。c)向MC38帶癌小鼠投予SIRT1活性劑(白藜蘆醇)與PD-L1抗體。揭示腫瘤之體積與存活曲線。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01，2標本之t檢驗分佈(抗PD-L1抗體相對於併用治療)。
圖8中mTOR與AMPK之不同活化狀態係與CD8+ T細胞之分化階段相對應。向MC38帶癌小鼠投予DNP與抗PD-L1抗體。於第1次之治療之次日，將所屬淋巴結之細胞利用針對CD8、CD62L、CD44、p-mTOR及p-AMPK之抗體進行染色。如圖6a所示，對P1至P3設門，並對p-AMPK與p-mTOR之螢光強度進行比較。資料係揭示兩個獨立之實驗中之代表性者。
圖9為PD-L1抗體治療與AMPK抑制劑之協同效應。於與圖3b相同之步驟中，向MC38帶癌小鼠投予化合物C與抗PD-L1抗體。揭示腫瘤之體積。
圖10為PD-L1抗體治療與AMPK抑制劑之協同效應。於與圖3b相同之步驟中，向RENCA(renal cancer，腎癌)帶癌小鼠投予化合物C與抗PD-L1抗體。揭示腫瘤之體積。
圖11為PD-L1抗體治療與PGC-1α/轉錄因子複合體活性劑之協同效應。於與圖3b相同之步驟中，向MC38帶癌小鼠投予NRF2活化劑(奧替普拉)或PPARs活化劑(苯紮貝特)與抗PD-L1抗體。揭示腫瘤之體積。資料係揭示5隻小鼠之平均值±標準誤差。* p<0.05，雙尾學生T檢驗(PD-L1抗體相對於各併用療法)。
圖12中Luperox及FCCP幾乎不影響活體內之腫瘤細胞。a)腫瘤組織 係自第2次之FCCP或Luperox單獨投予起1天後回收。於酶消化後，腫瘤細胞係藉由可去除腫瘤細胞以外之細胞的細胞分離套組而加以篩選。所分離之腫瘤細胞進而藉由Aria進行精製，併用於以下之實驗。b)腫瘤細胞係利用將PD-L1、I型MHC、CD155(TIGIT之配體)與VISTA作為標靶之抗體或線粒體質量、膜電位或將超氧化物染色之色素進行染色。c)線粒體能量代謝或凋亡相關基因之表現量係使用RT2 profiler PCR套組進行調查。所顯示之基因名係於82個基因中與未處理之腫瘤細胞相比顯著地增加2倍以上者。
圖13為線粒體活化相關試劑之抗腫瘤協同效應。a)為併用治療時間表之模式圖。b)對小鼠進行PD-L1抗體與巴拉刈(Paraquat)之併用治療。資料係揭示5-6隻鼠之值之平均值±標準誤差。資料為2次獨立之實驗之代表。
圖14中線粒體活化相關試劑於不同之腫瘤或小鼠之系統中亦發揮功能。向移植了纖維肉瘤MethA之BALB/c小鼠，依據圖3之時間表投予PD-L1抗體與FCCP、Luperox、Parawuat或奧替普拉。揭示腫瘤尺寸。資料係揭示5隻鼠之值之平均值±標準誤差。* p<0.05，雙尾學生t檢驗(PD-L1抗體相對於各自之併用治療)。
圖15中T-bet與IFN-γ(Interferon gamma，干擾素-γ)產生係於FCCP或苯紮貝特與PD-L1抗體之併用治群中增加。a)利用流式細胞儀，對源自利用PD-L1抗體與FCCP進行併用治療之小鼠之所屬淋巴結之CD8陽性細胞中之T-bet與Eomes表現進行分析。揭示代表性FACS資料(上圖)。算出源自利用PD-L1抗體與FCCP或苯紮貝特進行併用治療之小鼠之所屬淋巴結中之T-bet與Eomes陽性T細胞之頻度與數量(下圖)。b)將進行了酶消化 之腫瘤組織於37℃下培養6小時，並進行源自利用PD-L1抗體與FCCP或苯紮貝特進行併用治療之小鼠之CD8陽性細胞中之IFN-γ之細胞內染色。揭示代表性FACS資料(左圖)與CD8陽性細胞內之IFN-γ之頻度(右圖)。資料係揭示5隻鼠之值之平均值±標準誤差。* p<0.05，* * p<0.01係利用單因子變異數分析所獲得者。
圖16為PD-L1抗體治療與Foxo1抑制劑：AS1842856之協同效應。對BALB/c小鼠接種5×105之MethA，於7天後投予抗PD-L1抗體(80μg)與Foxo1抑制劑(2mg/kg)。投予時間表係依據圖3。揭示腫瘤之體積。
圖17係血中代謝物(胺基酸)之變化。藉由GC-MS(Gas Chromatograph Mass Spectrometry，氣相層析質譜分析法)分析，對5隻PD-1-/-小鼠與野生型小鼠之血清中所含之胺基酸之量進行鑑定。圖表示將野生型之值設為1時之PD-1-/-小鼠之值。N=5，* p<0.05，* * p<0.01，* * * p<0.001，* * * * p<0.0001，t-檢驗(t-test).
圖18為Aminoleban之組成。
圖19為PD-L1抗體治療與Aminoleban之協同效應。於對BALB/c小鼠接種5×105之纖維肉瘤MethA 7天後，投予抗PD-L1抗體(60μg)與Aminoleban(400μl/mouse)。投予時間表係依據圖3。
以下，對本發明詳細地進行說明。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期進行投予。
(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、 (ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
作為ROS產生劑，可例示：第三丁基過氧化氫(Luperox)、羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)、2,3-二甲氧基-1,4-萘醌(DMNQ)、2-甲基萘-1,4-二酮(甲萘醌)、1,1'-二甲基-4,4'-聯吡啶鎓二氯化物(巴拉刈)及該等之類似物。
於ROS產生劑之下游存在mTOR、ATM(ataxia telangiectasia mutated protein，共濟失調毛細血管擴張症變異蛋白)、AMPK(AMP-activated protein kinase，腺苷酸活化蛋白激酶)等訊息傳遞(圖1)，本發明之醫藥組合物可含有控制該等中之任一種的物質。控制係包括活化與非活性化之概念。
ROS下游訊息之mTOR將細胞之糖酵解進行活化，引起細胞分裂所需之蛋白質、脂質、核酸之擴增(同化作用之促進)。藉此，認為進而強化藉由PD-1訊息抑制而增強之T細胞受體訊息。若利用解偶聯物質之下游訊息使AMPK活化，則引起線粒體之生物合成，能量之產生所需之氧化磷酸化於線粒體內進行活化。藉此，認為進而強化藉由PD-1訊息抑制而增強之T細胞受體訊息。
作為控制mTOR之物質，可例示：4,6-二嗎啉基-N-(4-硝基苯基)-1,3,5-三-2-胺、4,6-二(4-嗎啉基)-N-(4-硝基苯基)-1,3,5-三-2-胺(MHY1485)、磷脂酸(PA)及該等之類似物，該等物質係將mTOR活化。
AMPK亦稱為能量感測器，因能量消耗而ATP量減少，若AMP之量增加則進行活化。AMPK之作用係抑制能量之消耗，向積蓄能量之方向控制代謝。因此，若AMPK進行活化，則會抑制生物合成(同化作用之抑 制)，自線粒體之ATP產生變得活躍(異化作用之促進)1、2、3。於AMPK訊息之下游存在PGC-1a與轉錄因子之複合體，藉此線粒體之生物合成或氧化磷酸化代謝進行活化4。若將AMPK活化，則可見糖尿病之改善，因此一部分之AMPK活化劑被用作糖尿病治療藥。作為控制AMPK之物質，可例示：6,7-二氫-4-羥基-3-(2'-羥基[1,1'-聯苯]-4-基)-6-側氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-5-甲腈(A769662)、5-胺基咪唑-4-甲醯胺1-β,-D-呋喃核糖苷(AICAR)、N,N-二甲基雙肌(Metformin)及該等之類似物，該等物質係將AMPK活化。作為將AMPK非活性化之物質(AMPK之抑制劑)，可例示：6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(化合物C)及該等之類似物。
SIRT1為脫乙醯化酶，將PGC-1α或Foxo1等轉錄相關因子進行活化。若SIRT1進行活化，則形成對於ROS或應激之耐性。SIRT-1亦經AMPK活化，藉由PGC-1a之活化而促進線粒體之生物合成或氧化磷酸化。藉由SIRT1之活化而變得耐受外部、內部應激，故而亦認為與長壽相關5、6。作為控制SIRT1之物質，可例示：反式-3,5,4'-三羥基芪(白藜蘆醇)、N-(2-(3-(哌-1-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)喹啉-2-甲醯胺、N-苄基-3,5-二乙氧羰基-4-苯基-1,4-二氫吡啶、2-胺基-N-環戊基-1-(3-甲氧基丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]喹啉-3-甲醯胺、菸醯胺單核苷酸及該等之類似物，該等物質將SIRT1活化。
PGC-1α稱為轉錄因子共活化劑，與和各種線粒體活性相關之轉錄因子形成複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)。例如PGC-1α與轉錄因子TRβ1、NRFs、ERRs(Estrogen receptor-related receptors，雌激素受體相關受體)、PPARα/β/TM等形成複合體，促進線粒體之活化、脂質代謝之促 進、活性氧無毒化。將與PGC-1α結合之轉錄因子作為靶之藥劑係用作糖尿病治療藥、中性脂肪降低藥4、7、8。作為控制PGC-1α/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)之物質，可例示：2-(4-{2-[(4-氯苯甲醯基)胺基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸(苯紮貝特)、9-順式,12-順式-十八碳二烯酸)、2-[4-(4-氯苯甲醯基)苯氧基]-2-甲基丙酸-d6 1-甲基乙酯、十一烷硫基乙酸、4-甲基-5-(2-吡基)-3-二硫雜環戊烯硫酮(奧替普拉)、N,N-二甲基甲醯胺、3-[4-(2,4-雙(三氟甲基)苄氧基)-3-甲氧基苯基]-2-氰基-N-(5-三氟甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙烯醯胺及該等之類似物，該等物質控制PGC-1α/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)。
作為顯示出解偶聯作用之物質，可例示：羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)、羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)、水楊酸、4,4'-[戊烷-1,5-二基雙(氧基)]二苯甲脒)(戊烷脒)、2-(2-(2,6-二氯苯基胺基)苯基)乙酸(雙氯芬酸)、4-羥基-2-甲基-N-(2-吡啶基)-2H-1,2-苯并噻-3-甲醯胺-1,1-二氧化物(吡羅昔康)、2-{1-[(4-氯苯基)羰基]-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚-3-基}乙酸(吲哚美辛)、(N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺醯胺(尼美舒利)、4-羥基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1,2-苯并噻-3-甲醯胺-1,1-二氧化物(美洛昔康)、氯硝柳胺乙醇胺鹽(NEN)、4-甲氧基-8-(3-甲基丁-2-烯氧基)喹啉-2-羧酸3-甲基丁-2-烯酯及該等之類似物。
解偶聯劑之下游有mTOR、AMPK(AMP-activated protein kinase，AMP活化蛋白激酶)、SIRT1、PGC-1α/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)等訊息傳遞(圖1)，本發明之醫藥組合物亦可含有控制該等中之任一種之物質。控制係包含活化與非活性化之概念。
以上，對mTOR、AMPK、SIRT1及控制PGC-1α/轉錄因子複合體(包 含PGC-1α之轉錄因子複合體)之物質進行了說明。
Foxo1係位於mTOR之下游之轉錄因子。若因mTOR之活化進行磷酸化，則其會自核內移動至細胞質，而不引起轉錄開始。藉此，抑制EOMES，CTL之活化所需之T-bet之表現增強。(Staron MM et al.Immunity.41：802-14,2014.Rao RR et al.36：374-87,2012.)
又，Foxo1進行PGC-1a結合，使促進糖新生之基因表現活化。糖新生由於係基於三羧酸循環(TCA cycle，tricarboxylic acid cycle)之代謝產物而合成糖，故而氧化磷酸化向受到抑制之方向變化。又，根據報告，於2型糖尿病之模型中，若抑制Foxo1則線粒體功能不全康復。由此亦認為，若抑制Foxo1，則線粒體活化。(Coppari R et al.Nat Clin Pract Endocrinol Metab.3：160-6,2009.Puigserver P et al.Nature.423：550-5,2003.
作為控制Foxo1之物質，可例示：5-胺基-7-(環己基胺基)-1-乙基-6-氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸、2-環戊基-N-{2,4-二氯-3-[(異喹啉-5-基氧基)甲基]苯基}-N-甲基乙醯胺及該等之類似物。
作為胺基酸，可例示：色胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸及該等之類似物。胺基酸可為1種亦可為2種以上之組合。胺基酸可為L-胺基酸、D-胺基酸或DL-胺基酸中之任一者。若抑制PD-1，則胺基酸等代謝物之同化作用(細胞增殖)變得劇烈而被消耗。若向其中導入成為細胞等之骨架之胺基酸，則認為細胞增殖進一步發展。若補充胺基酸而細胞增殖變快，則mTOR向活化之方向進行。例如有作為胺基 酸製劑之Aminoleban將mTOR活化之報告(Tamanna N,Mahmood N.Int Sch Res Notices.2014：235619,2014)。於下述實施例中，由於Aminoleban可見與PD-L1抗體治療之協同效應，故而認為較佳為Aminoleban中所含之胺基酸中之1種或2種以上之組合。
上述(i)至(iii)之物質亦可為鹽之形態。鹽只要為醫藥上容許者即可，作為此種鹽，可列舉：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之類的鹼金屬鹽、鈣鹽、鎂鹽之類的鹼土金屬鹽、鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽之類的無機鹽、第三辛基胺鹽、二苄基胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N'-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽之類的有機鹽等胺鹽；氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之類的氫鹵酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之類的低級烷烴磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之類的芳基磺酸鹽、乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等有機酸鹽；甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之類的胺基酸鹽等。該等鹽可藉由公知之方法而製造。
又，上述(i)至(iii)之物質及其鹽亦可與水、甲醇、乙醇、乙腈等溶劑而生成溶劑合物。又，溶劑合物可為單獨者，亦可為複數種之混合物。
於本說明書中，所謂「類似物」係指無需較大之結構變化，顯示出略微追加變更側鏈等所得之同等之效果之物質，係包含醫藥品中之先導化合物之衍生物、針對活性代謝物之前驅藥、針對前驅藥之活性代謝物等之 概念。作為前驅藥，可例示：活性之化合物之胺基經醯化、烷基化、磷酸化之化合物(例如活性之化合物之胺基經二十烷醯化、丙胺醯化、戊基胺基羰基化、(5-甲基-2-側氧基-1,3-二氧雜環戊烷-4-基)甲氧基羰基化、四氫呋喃化、吡咯啶基甲基化、特戊醯氧基甲基化、第三丁基化之化合物等)、活性之化合物之羥基經醯化、烷基化、磷酸化、硼酸化之化合物(例如活性之化合物之羥基經乙醯化、棕櫚醯化、丙醯化、特戊醯化、琥珀醯化、反丁烯二醯化、丙胺醯化、二甲基胺基甲基羰基化之化合物等)、活性之化合物之羧基經酯化、醯胺化之化合物(例如活性之化合物之羧基經乙酯化、苯酯化、羧基甲酯化、二甲基胺基甲酯化、特戊醯氧基甲酯化、乙氧基羰氧基乙酯化、酞酯化、(5-甲基-2-側氧基-1,3-二氧雜環戊烷-4-基)甲酯化、環己氧基羰基乙酯化、甲基醯胺化之化合物等)等。
於本說明書中，所謂「PD-1訊息」係指PD-1所承擔之資訊傳遞機制，作為其一，可例示PD-1與作為其配體之PD-L1、PD-L2共同抑制T細胞之活化之資訊傳遞機制。PD-1(Programmed cell death-1)係於活化之T細胞或B細胞中表現之膜蛋白質，作為其配體之PD-L1與PD-L2係於單核球或樹狀細胞等抗原呈現細胞、癌等各種細胞中表現。PD-1、PD-L1及PD-L2係作為抑制T細胞之活化之抑制因子而發揮作用。某種癌細胞或病毒感染細胞藉由表現PD-1之配體，而抑制T細胞之活化，逃避宿主之免疫監視。
作為PD-1訊息抑制劑，可列舉與PD-1、PD-L1或PD-L2特異性地結合之物質，作為此種物質，可為蛋白質、多肽、寡肽、核酸(包含天然型核酸、人工核酸)、低分子有機化合物、無機化合物、細胞提取物、源自動植物或土壤等之提取物等。物質可為天然物亦可為合成物。較佳之PD- 1訊息抑制劑為抗體，更佳為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體等抗體。抗體只要為可抑制PD-1訊息者即可，可為多株抗體、單株抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、人類型抗體中之任一種。該等抗體之製造方法為公知方法。抗體可為源自人類、小鼠、大鼠、兔、山羊、豚鼠等任一種生物者。又，於本說明書中，所謂抗體係亦包含Fab、F(ab)'2、ScFv、雙功能抗體、VH、VL、Sc(Fv)2、雙特異性sc(Fv)2、微型抗體、scFv-Fc單體、scFv-Fc二聚物等低分子化者之概念。
本發明之醫藥組合物可用作抗癌劑、感染症治療劑或該等之組合。
於投予本發明之醫藥組合物作為抗癌劑之情形時，作為成為對象之癌或腫瘤，可例示：白血病、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤等)、多發性骨髓瘤、腦腫瘤、乳癌、子宮內膜癌(endometrial cancer)、子宮頸癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、闌尾癌、大腸癌、肝癌、膽嚢癌、膽管癌、胰臟癌、腎上腺癌、消化道間質腫瘤、間皮瘤、頭頸癌(喉頭癌等)、口腔癌(口底癌等)、牙齦癌、舌癌、頰黏膜癌、唾液腺癌、鼻竇癌(上頜竇癌、前頭洞癌、篩竇癌、蝶竇癌等)、甲狀腺癌、腎癌、肺癌、骨肉瘤、攝護腺癌、睾丸腫瘤(睾丸癌)、腎細胞癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌(基底細胞癌、鱗狀細胞癌(Squamous Cell carcinoma)、惡性黑色素瘤(黑色素瘤)、日光性角化症、博文氏病(Bowen's disease)、佩吉特氏病(Paget's disease)等)、肛門癌等，但並不限定於該等。
於投予本發明之醫藥組合物作為感染症治療劑之情形時，作為成為對象之感染症，可例示：細菌感染症(鏈球菌(A群β鏈球菌、肺炎球菌等)、由金黃色葡萄球菌(MSSA(Methicillin Susceptible Staphylococcus Aureus，二甲氧苯青黴素敏感金黃色葡萄球菌)、MRSA(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus，抗二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌))、表皮葡萄球菌、腸球菌、李氏菌、腦脊髓膜炎球菌、淋菌、病原性大腸桿菌(0157：H7等)、克雷伯氏菌(肺炎桿菌)、變形桿菌、百日咳菌、綠膿桿菌、沙雷氏菌、檸檬酸桿菌屬、不動菌屬、腸桿菌、黴漿菌、芽胞梭菌屬等所引起之各種感染症、結核、霍亂、鼠疫、白喉、痢疾、猩紅熱、碳疽、梅毒、破傷風、麻瘋病、嗜肺性退伍軍人桿菌肺炎(退伍軍人病)、鉤端螺旋體症、萊姆病、兔熱病、昆斯蘭熱等、立克次體感染症(流行性斑疹傷寒(epidemic typhus)、叢林斑疹傷寒(Scrub typhus)、日本紅斑熱等)、披衣菌感染症(沙眼、衣原體泌尿生殖道感染症、鸚鵡病等)、真菌感染症(麴菌病、念珠菌病、隱球菌病、發癬菌病、組織漿菌病、肺孢子菌肺炎等)、寄生性原蟲感染症(阿米巴痢疾、瘧疾、弓蟲病、利什曼體病、隱孢子蟲屬等)、寄生性蠕蟲感染症(棘球蚴病、日本血吸蟲病、絲蟲病、蛔蟲病、裂頭絛蟲病等)、病毒感染症(流行性感冒、病毒性肝炎、病毒性髓膜炎、後天性免疫缺乏症候群(AIDS，Acquired Immune Deficiency Syndrome)、成人T細胞性白血病、埃博拉出血熱、黃熱病、感冒症候群、狂犬病、巨細胞病毒感染症、嚴重急性呼吸系統症候群(SARS，Severe Acute Respiratory Syndrome)、進行性多灶性白質腦病、水痘、帶狀疱疹、手足口病、登革熱、傳染性紅斑、傳染性單核球症、天花、風疹、急性脊髓灰白質炎(小兒麻痹症)、麻疹、咽結膜熱(游泳池性結膜炎)、馬爾堡出血熱、漢坦病毒腎出血熱、賴薩熱、流行性腮腺炎、西尼羅河熱、疱疹性咽峽炎、基孔肯亞熱等)等，但並不限定於該等。
本發明之醫藥組合物包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1 種物質，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期進行投予，(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸
於本發明之醫藥組合物中，可將PD-1訊息抑制劑與選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質進行併用或合劑化。
於將PD-1訊息抑制劑與選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質併用之情形時，可分別投予選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
於將PD-1訊息抑制劑與選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質進行合劑化之情形時，可製成包含PD-1訊息抑制劑與選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質的調配劑。
本發明之醫藥組合物係全身或局部地以經口或非經口方式對受驗者或受驗動物進行投予。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)係溶解於PBS(Phosphate Buffer Solution，磷酸鹽緩衝液)等緩衝液、生理鹽水、殺菌水等中，可視需要利用過濾器等進行過濾殺菌，然後藉由注射或點滴對受驗者或受驗動物進行投予。又，亦可向該溶液中添加添加劑(例如著色劑、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、溶解助劑、穩定劑、保存劑、抗氧化劑、緩衝劑、等張劑等)等。作為投予途徑，可進行靜脈、肌肉、腹腔、皮下、皮內投予等。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體) 於製劑中之含量根據製劑之種類而有所不同，通常為1~100重量%，較佳為50~100重量%。製劑可製劑化為單位投予製劑。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)之投予量、投予之次數及頻度根據受驗者或受驗動物之症狀、年齡、體重、投予方法、投予形態等而有所不同，例如通常可至少1次向成人每人以可確認所需之效果之頻度投予換算成有效成分之量為0.1~100mg/kg體重、較佳為1~10mg/kg體重。
選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質可含有於包含PD-1訊息抑制劑之製劑中，亦可單獨或與賦形劑或載體混合，並製劑化為錠劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、液劑、漿液、氣溶膠、栓劑、注射劑等。賦形劑或載體只要為該領域中常規地使用且醫藥上容許者即可，其種類及組成可適當加以變更。例如，作為液狀載體，可使用水、植物油等。作為固體載體，使用乳糖、白糖、葡萄糖等糖類、馬鈴薯澱粉、玉米澱粉等澱粉、結晶纖維素等纖維素衍生物等。亦可添加硬脂酸鎂等潤滑劑、明膠、羥丙基纖維素等結合劑、羧甲基纖維素等崩解劑等。除此以外，亦可添加抗氧化劑、著色劑、矯味劑、保存劑等。
選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質可藉由經口、經鼻、直腸、經皮、皮下、靜脈內、肌內等各種途徑進行投予。
選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質於製劑中之含量根據製劑之種類而有所不同，通常為1~100重量%，較佳為50~100重量%。例如，於液劑之情形時，選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質於製劑中之含量較佳為1~100重量%。於膠囊劑、錠劑、顆粒劑、散劑之情形時，選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質於製劑 中之含量通常為約10~100重量%，較佳為50~100重量%，其餘部分為載體。製劑可製劑化為單位投予製劑。
選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之投予量、投予之次數及頻度根據受驗者或受驗動物之症狀、年齡、體重、投予方法、投予形態等而有所不同，例如，通常可向每個成人以至少1次、可確認到所需之效果之頻度投予換算成有效成分之量之0.005μg(或ml)~25000mg(或ml)/kg體重左右。關於各藥劑(物質)之投予量，將適當之範圍、較佳之範圍及更佳之範圍示於下述表，但並不限定於該等值。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)與ROS產生劑或控制其下游訊息之物質之比率(質量)適當為1：0.1~1：100，較佳為1：1~1：50。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)與顯示出解偶聯作用之物質或控制其下游訊息之物質之比率(質量)適當為1：0.01~1：10，較佳為1：0.1~1：1。
PD-1訊息抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體)與胺基酸之比率(質量)較適當為1：0.001~1：100，較佳為1：0.01~1：10。
又，本發明亦提供一種癌症、感染症或該等之組合之治療方法，其包括如下步驟：於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，以醫藥上有效之量對受驗者或受驗動物投予選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。進而，本發明提供一種選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之用途，其係用於治療癌症、感染症或該等之組合，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，投予選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。進而，本發明亦提供一種選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之用途，其係用於治療癌症、感染症或該等之組合之方法，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，投予選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
又，本發明提供一種增強PD-1訊息抑制活性之藥劑，其包含選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質。
本發明之藥劑可用作與PD-1訊息抑制劑之併用藥或調配劑。關於PD-1訊息抑制劑與選自由上述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之併用及合劑化，已於上文中進行了說明。本發明之藥劑除了作為醫藥之用途以外，亦可用作實驗試劑。
於調查某種物質是否為ROS產生劑時，可於試管內對細胞(例如小鼠脾臟細胞)添加該物質，並對細胞內之ROS之濃度進行測定。於調查某種物質是否具有解偶聯作用或控制其下游訊息之作用時，可於試管內對細胞(例如小鼠脾臟細胞)添加該物質，於細胞內染色後利用流式細胞儀(Flow Cytometer)測定細胞內之線粒體之質子梯度，或者使用Seahorse直接進行測定。
[實施例]
以下，藉由實施例更詳細地說明本發明。
[實施例1]
[主旨]
藉由利用PD-1抑制之癌免疫治療，癌症患者之存活率顯著地提高。但是，對於某些患者無應答。認為PD-1抑制與其他併用劑之併用療法會改善免疫治療效果。本發明者等人使用小鼠癌症治療模型，發現所屬淋巴結中所出現之癌反應性細胞毒性T細胞(TR CTLs，tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes)具有較大之線粒體體積與較高之膜電位，並且具有較高之活性氧(ROS)產生。又，證明藉由ROS產生劑或者利用解偶聯劑之源自線粒體之ROS，CD8+ CD44+ CD62L- T細胞於所屬淋巴結與腫瘤內增加，由PD-1抑制所引起之抗腫瘤效果增強。進而明確，包含白藜蘆醇，直接使mTOR、AMPK、SIRT等新陳代謝感測器活化之試劑會增強PD-1抑制治療效果，而長期抑制腫瘤。重要的是該等併用治療藥單獨使用時未顯示出抗腫瘤效果。
[緒言]
藉由PD-1抑制之免疫療法給癌症治療帶來革命性衝擊。作為其特 徵，可列舉對各種癌腫瘤具有較高之效果、長期持續抗腫瘤效果、並且副作用較少9、10、11。作為活化T細胞之表面受體而表現之PD-1於免疫應答中係作為抑制因子而發揮作用。PD-1與2個作為配體之PD-L1或PD-L2結合，將ITSM(Immunoreceptor Tyrosine-Based Switchi Motif，免疫受體酪胺酸轉換基序)中之酪胺酸殘基磷酸化，而補充作為酪胺酸磷酸酶之SHP-2。利用SHP-2，使藉由T細胞受體之活化而磷酸化之Zap70等活化訊息傳遞分子經脫磷酸化，從而抑制T細胞之活化12、13。於動物實驗中PD-1缺損小鼠患上自身免疫疾病，由此確認藉由PD-1之免疫抑制功能14、15、16。如此得知，PD-1係作為免疫檢測點而發揮作用，產生自身免疫耐受性。
本發明等人查明PD-1之基本作用，明確利用PD-1之特性可輔助針對癌症或感染症之免疫應答17、18。實際上於2010年發表針對惡性黑色素瘤之臨床試驗之結果後19，迄今為止已進行了針對各種癌腫瘤之藉由PD-1抑制療法之臨床試驗，其大部分顯示出了令人驚訝之效果20。目前，對於PD-1抑制療法，日本正下達應用於惡性黑色素瘤或非小細胞肺癌、腎細胞癌之醫療保險之許可。PD-1抑制療法不僅與迄今為止之免疫療法相比顯著地提高癌症患者之存活率，而且與實際上所使用之標準之化學療法相比亦顯著地提高癌症患者之存活率。然而，令人遺憾的是，30~50%左右之患者仍對PD-1抑制療法無應答。為了克服該無應答例，業界將PD-1抑制療法與作為其他免疫檢測點因子之Lag3或Tim3、癌症疫苗、放射線治療、低用量之化學療法等加以併用21。但是，迄今為止尚無藉由併用療法確認到顯著之協同效應之報告。
本發明等人已於2002年於動物模型中確立了PD-1抑制療法之癌症治 療效果17，但尚未查明藉由PD-1抑制療法之殺腫瘤效果或免疫耐受性狀態之解除係因何種機理而產生。例如，於利用檢測點抑制劑所進行之免疫療法中，主要是癌定點突變抗原成為靶22、23，但尚不明確效應T細胞被活化之部位為腫瘤部位抑或所屬淋巴結。又，於藉由PD-1抗體治療而根除腫瘤時，亦不明確何種訊息使效應T細胞向腫瘤部位移行。又，亦幾乎未知識別腫瘤反應性細胞毒殺性T細胞與腫瘤非反應性T細胞之方法、或PD-1訊息之阻斷如何影響腫瘤反應性細胞毒殺性T細胞之活化、分化狀態。進而，對於藉由PD-1抑制療法進行治療之癌症患者而言，藉由PD-1訊息之阻斷而活化之免疫監視機制為何持續數年仍為謎團24、25。
為了確立使PD-1抑制療法更有效之新穎治療戰略，必須解答出上述若干問題。因此，業界著眼於效應功能所需之代謝再程式化，並對腫瘤反應性細胞毒殺性T細胞進行分析1、2、3、26、27。頗有意味的是，於PD-1抑制療法下自所屬淋巴結提取之腫瘤特異性細胞毒殺性效應T細胞顯示出更大之線粒體之質量、更高之膜電位、及更高之線粒體之活性氧種(ROS)。該等結果顯示藉由阻斷PD-1訊息而增加線粒體之活性，與迄今為止所報告之活體中之報告一致28、29。
基於該等結果，本發明等人建立了效應T細胞中之線粒體之功能刺激使PD-1阻斷療法中之抗腫瘤效果之增強之假說。實際上將作為能量代謝感測器之腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)或SIRT1、雷帕黴素機制性靶蛋白(mTOR)活化之藥劑顯示出與PD-1阻斷療法之協同性抗腫瘤效果。該等見解或許會開闢用以開發針對對於PD-1抑制療法之效果較弱之患者之併用療法的道路。
[結果]
由PD-1阻斷所引起之DLN(Draining Lymph Node，引流淋巴結)中之腫瘤反應性CD8陽性T細胞之線粒體活性之增大。
隨著T細胞之活化，必須迅速地供給急劇之細胞增殖所需之因子。因此，本發明等人決定於所屬淋巴結中研究藉由PD-1抑制誘導之腫瘤反應性CD8陽性T細胞之代謝變化。作為PD-1抑制療法之機制查明中之1個問題，可列舉如下方面：藉由PD-1阻斷產生具有與各種腫瘤抗原反應之多樣化之T細胞受體庫之CTL，故而難以進行腫瘤反應性細胞毒殺性T細胞(TR CTLs)之全面鑑定30、31。為了解決該問題，將經CellTrace標記之CD45.1陽性CD8陽性T細胞移植至CD45.2陽性CD8KO小鼠。推測其後腫瘤反應性CD8陽性T細胞會選擇性地活躍地增殖，並對所屬淋巴結中之經標記之T細胞之增殖進行研究(圖2a)。於MC38帶癌小鼠中，所移植之CD45.1陽性CD8陽性T細胞分成活躍地分裂之細胞群(高分裂群)與分裂較少之細胞群(低分裂群)(圖2b)。帶癌小鼠中之CD45.1陽性CD8陽性T細胞之高分裂群之絕對數或比率與投予對照抗體IgG之群相比，於利用PD-L1抗體進行治療之群中增加(圖2b)。值得指出的是，PD-L1抗體於非帶癌小鼠中於上述增殖方面未見差異。由此表明，劇烈地產生分裂之CD8陽性T細胞實際上因腫瘤抗原而活化可能性較高(圖2b)。進而，於所屬淋巴結中之CD45.1陽性CD8陽性T細胞中，於因PD-L1抑制而造成之高分裂群之組分中，檢測到作為MC38之變異抗原決定基之mLama4肽/MHC四聚物陽性細胞群(圖2c)22。因此，認為於活躍地增殖之細胞群中包含大量TR CTLs。
其次，本發明等人對在所屬淋巴結中較強地增殖之TR CTL之代謝功能進行了調查。認為線粒體之代謝不僅對T細胞之活化較重要，而且對持 續之T細胞之增殖或記憶T細胞之形成亦重要，因此本發明等人著眼於TRCTLs中之線粒體之功能26、32。CD8陽性T細胞中之高分裂群與低分裂群相比，線粒體之質量較大，膜電位較高，線粒體之活性氧種(ROS)之產生較多33，由此表明藉由PD-1阻斷於TR CTLs中線粒體不斷活化(圖2d)。與上述結果一致，作為線粒體之呼吸之指標之OCR(Oxygen Consumption Rate，氧消耗速度)與ATP之基本使用量於利用PD-L1抗體進行治療之小鼠之所屬淋巴結中之CD8陽性T細胞中顯著地較高(圖2e-f)34。由該等結果證明，於PD-1阻斷治療中伴隨TR CTLs之增殖，線粒體之代謝速度上升。
ROS係為了藉由PD-1阻斷增強抗腫瘤活性而必需。
如上述所示，ROS因PD-L1抗體治療而顯著地增加。ROS係於線粒體之電氣傳遞系統(ETC)之複合體I、複合體II、複合體III中產生35。並且，線粒體之ROS亦作為用於T細胞之抗原性之擴張之訊息傳遞因子而發揮功能26、32。另一方面，已知外因性之ROS或其產生源會直接損傷腫瘤細胞，考慮作為癌症治療藥候補36。考慮該等兩者，本發明等人決定首先試驗ROS產生劑單獨是否具有殺腫瘤效果。雖然向MC38帶癌小鼠投予作為ROS之前驅物之第三丁基過氧化氫溶液(Luperox)，但未確認到抗腫瘤效果(圖3a)。進而，確認到無藉由Luperox單獨進行活體內處理之腫瘤細胞之免疫控制表面標記物及轉錄輪廓之顯著之變化(圖12)。然而，若與PD-L1抗體併用，則顯著地強化抗腫瘤效果，帶癌小鼠之存活率延長(圖3b、c)。根據該等資料提示，Luperox係藉由T細胞之活化而提高PD-L1抗體之抗腫瘤效果，而並非藉由向腫瘤細胞之直接作用而提高PD-L1抗體之抗腫瘤效果。作為直接之線粒體ROS產生劑之巴拉刈亦增強PD-1抑制之效果(圖13a、b)。作為對照，投予作為使線粒體不穩定、抑制ATP合成之藥劑 之寡黴素與羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、2,4-二硝基苯酚(DNP)37。於是出乎意料的是，作為線粒體之解偶聯劑之FCCP與DNP增強PD-L1抗體治療之效果，與PD-L1單獨投予群相比顯著地提高小鼠模型之存活率(圖4a)。重要的是得知，與Leuperox同樣地，FCCP與DNP均若為單劑投予則未顯示出抗腫瘤效果，且不具有對腫瘤細胞之直接之作用而提高PD-L1抗體之抗腫瘤效果(圖4b)。進而，於自單獨投予FCCP之小鼠採集之腫瘤細胞之表面型分析、轉錄輪廓分析中未顯示出有意義差，該情況顯示，解偶聯劑增強殺傷腫瘤之殺傷性T細胞之功能而非直接殺傷腫瘤(圖12)。由於認為線粒體之解偶聯(Uncoupling)有藉由在降低線粒體膜電位時減少ROS，而進行保護免受氧化性損傷之作用，故而FCCP與DNP之抗腫瘤效果中之協同效應出乎意料37。起初有解偶聯劑會減少或者增加線粒體之ROS產生之相反之報告38、39。本發明等人確認到PD-L1抗體與解偶聯劑之併用療法之效果因MnTBAP(具有ROS消除效果之合成金屬卟啉)之投予而受到抑制(圖4c)。由此表明，解偶聯劑之協同效應係經由ROS訊息者。不可思議的是，藉由PD-L1抗體與DNP、Luperox之3劑併用確認到較強之抗腫瘤效果(圖5)。此提示解偶聯劑於ROS以外之任一途徑中均提高PD-1抑制之效果之可能性。
解偶聯劑促進DLN中之CD62L陰性CD44陽性效應T細胞之生成，增強於腫瘤部位之該等之聚集。
那麼，解偶聯劑如何藉由ROS而提高PD-L1抗體之抗腫瘤免疫？為了解答該疑問，本發明等人首先對所屬淋巴結與腫瘤部位之兩者中之CD8陽性T細胞之組分進行調查。如圖6a所示，於所屬淋巴結中，關於效應CD8陽性T細胞(CD62L陰性CD44陽性：P3門)之絕對數或比率，PD-L1抗 體與FCCP之併用療法群與PD-L1抗體單獨群相比顯著地增加。作為對照，初始T細胞(CD62L陽性CD44陰性：P1門)與中心記憶T細胞(CD62L陽性CD44陽性：P2門)雖然於單獨使用PD-L1抗體時增加，但即便添加FCCP亦無更多之增加(圖6a)。重要之要點為任何治療群中之P3細胞群與P1或P2細胞群相比，每個細胞之線粒體之質量、膜電位均較高，ROS均較多；及關於膜電位與ROS產生，於與FCCP之併用療法中顯著地增加(圖6b)。由該等現象提示，a)關於所使用之FCCP之用量，並無線粒體之質量之降低或膜電位之下落，無毒性(若為更高之用量則預測到毒性)；b)由於增加之P3細胞群中確認到較高之線粒體ROS產生，故而利用解偶聯劑之協同效應係經由ROS；c)適度之線粒體損傷之反饋反而有可能增強線粒體活性(圖6b)。
值得指出的是，隨著所屬淋巴結中之此種變化，即使對於浸潤於腫瘤內之CD8陽性T細胞而言，P3細胞群亦顯著地增加(圖6c)。由該等結果表明如下效果，PD-L1抗體與解偶聯劑之併用療法於所屬淋巴結與作為其目標之腫瘤部位之兩者中增強效應CD8陽性T細胞之尺寸或功能性。
能量代謝感測器之AMPK及mTOR係與解偶聯劑之免疫增強效果相關。
AMPK與mTOR雖然為相反之能量代謝感測器，但認為磷酸化AMPK與mTOR之均衡性控制CD8陽性T細胞之分化1、40、41、42、43、44。可知由解偶聯劑所引起之AMP(Adenosine Monophosphate，單磷酸腺苷)/ATP比之增加將AMPK活化45，故而本發明等人對藉由PD-L1抗體與解偶聯劑之併用療法進行治療之帶癌小鼠之所屬淋巴結中之CD8陽性T細胞之AMPK與mTOR之磷酸化狀態進行調查。於自藉由PD-L1抗體與DNP或者FCCP之 併用療法進行治療之小鼠採集之CD8陽性T細胞中，AMPK與作為與其相關之蛋白的ACC與SIRT1於併用療法後之複數個時刻進行活化(圖7a)。但是，意料以外的是，mTOR與作為其相關蛋白之S6K與4EBP1亦於併用療法後進行活化(圖7a)。
然而，該無法理解之結果係藉由所屬淋巴結中之CD8陽性T細胞之中不均勻地混合存在有AMPK/mTOR均衡性不同之細胞而說明。實際上於P2細胞群中p-AMPK雖然較p-mTOR上升，但於P3細胞群中p-mTOR高於p-AMPK(圖8)。基於該等結果，其次研究若直接使mTOR與AMPK之任一者活化，是否可增強PD-1抑制療法之效果。如圖7b所示，mTOR活性劑與AMPK活性劑均於早期(20天以前)略微增強PD-1抑制療法之效果，相對於此，若為mTOR活性劑與AMPK活性劑之3劑併用，則會增強PD-L1抗體之效果，改善存活率。該等結果顯示，mTOR與AMPK之兩者之活化係與PD-L1抗體與解偶聯劑之協同性殺腫瘤活性相關。
根據PD-L1抗體與解偶聯劑之併用療法使SIRT1增加之情況(圖7a)，調查作為NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，菸醯胺腺嘌呤二核苷酸)依賴性蛋白脫乙醯化酶之SIRT1之活化是否對PD-L1抗體治療之效果有影響。報告有於利用被報告可能有腫瘤抑制效果之多酚之1種、白藜蘆醇時，SIRT1進行活化6、46。進而報告有，低用量之白藜蘆醇SIRT1依賴性地引起AMPK活化與線粒體之生物合成6，進而報告有於特定之條件下輔助mTOR途徑47、48、49。實際上於PD-L1抗體與白藜蘆醇之併用療法中，與PD-L1單獨治療相比，顯著地確認到腫瘤尺寸之減少與存活率之延長(圖7c)。根據該結果表明，PD-L1抗體與作為能量代謝感測器之AMPK或mTOR、SIRT1之活化之併用會增強活體內之TR CTL之增殖或功能性。
PGC-1α活性劑增強PD-1抗體之治療效果
PGC-1α係藉由AMPK或mTOR進行調節之轉錄輔因子，係使線粒體之生物合成或氧化磷酸化增強之因子45、46。於FCCP、或mTOR活性劑、AMPK活性劑與PD-L1抗體之併用治療中，蛋白質與mRNA(Messenger Ribonucleic Acid，信使核糖核酸)中之PGC-1α之表現不斷增加，係與迄今為止之報告並不矛盾之結果(圖11a)37、45、46。於僅投予PD-L1抗體之情形時，蛋白質中之PGC-1α之表現雖然增加，但mRNA中之PGC-1α之表現減少。認為其原因在於：PGC-1α之調節係與轉錄、轉譯及蛋白質穩定性等較多階段相關46、47。PGC-1α係藉由與NRFs或PPARs等轉錄因子相關而發揮功能46。本發明等人對作為PGC-1α/NRF2之活性劑之奧替普拉與作為PGC-1α/PPARs活性劑之苯紮貝特是否會增強PD-L1抗體之抗腫瘤效果進行實驗48、29。結果奧替普拉與苯紮貝特均增強PD-L1抗體之腫瘤成長抑制效果，改善帶癌小鼠之存活率(圖11b)。
為了調查MC38以外之腫瘤中之PD-1抗體之併用治療效果，將作為小鼠之皮膚肉瘤細胞株之MethA移植至BALB/c小鼠之皮內，對使用FCCP或巴拉刈、奧替普拉之併用療法進行試驗。結果所有藥劑均顯示出PD-L1抗體之抗腫瘤效果之增強(圖14)。此顯示線粒體活性劑與PD-1抑制抗體之併用治療對具有不同之基因背景之各種腫瘤存在效果。
與FCCP或者苯紮貝特之併用治療增強CTL之T-bet表現。
已知對於由PD-1抑制所引起之細胞激素分泌或腫瘤反應性CTL之活化重要之轉錄因子T-bet係利用mTOR並經由FOXO1抑制而進行活化。因此，本發明等人對PD-L1抗體與FCCP之併用治療是否會影響T-bet與Eomes之表現進行了研究。與PD-L1抗體及FCCP之併用療法使mTOR活 化之上述發現一致，FCCP於CD8陽性細胞中雖然會使T-bet之表現增加，但不會使Eomes之表現增加(圖15a)。非常有趣的是，與FOXO1逆向地控制T-bet與Eomes之報告一致，使mTOR之下游之轉錄因子活化之苯紮貝特亦會使T-bet增加，反而使Eomes減少(圖15a)。進而於併用治療中作為殺傷性T細胞功能之一之干擾素(IFN)-γ產生於腫瘤內增強(圖15b)。此與對於Th1型免疫重要之T-bet之表現增強一致。該等結果提示苯紮貝特或許將線粒體活化，進而產生正反饋，而使mTOR活化。對以上之結果進行總結，解偶聯劑與PD-1抑制之協同效應之分子機制係經由包含AMPK或mTOR與其下游之NRF2或PPARs之轉錄因子或PGC-1a等偶聯因子之活化(圖1)。
[考察]
本發明等人揭示利用PD-L1抗體進行活化之TR CTL等使線粒體活化，增強ROS之產生，進而產生ROS之藥劑增強PD-1抑制之抗腫瘤效果。意料以外的是判明，2個有名之作為線粒體之解偶聯劑的FCCP與DNP亦增強PD-L1抗體之抗腫瘤效果。根據ROS清除劑會抵消其協同效應之情況表明，解偶聯劑之協同效應係取決於ROS之產生。由於線粒體之解偶聯劑存在抑制ROS之產生之作用，故而認為對缺血性損傷或心衰竭、胰島素抗性、肥胖、老化等與氧化應激相關之疾病之治療有用，故而此次之結果為意料以外50。根據解偶聯劑之單獨投予不會對T細胞之增殖及腫瘤增生造成影響之情況得知，本研究中使用之最低劑量下之解偶聯劑反而具有彌補因PD-1阻斷而誘發之免疫學現象或免疫反應之作用。
雖然作為天然多酚之白藜蘆醇因心血管改善作用或抗衰老效果、抗腫瘤效果而為人所知，但此顯示出白藜蘆醇誘導線粒體生物合成，而誘導 保護不生病之代謝功能之可能性。本發明等人查明低用量之白藜蘆醇會增強PD-1抑制治療之效果。與解偶聯劑同樣地，白藜蘆醇本身與腫瘤增殖無關，或反而會使腫瘤增大。然而，藉由與PD-L1抗體併用，顯著地顯示出腫瘤之抑制效果，使動物模型中之存活率提高。
且說，該等藥劑如何同樣地產生與PD-1抑制療法之協同效應？線粒體之能量代謝係與經由mTOR或AMPK之細胞內代謝密切相關5、6、49、51。本發明等人確認到AMPK及其相關蛋白係藉由PD-L1抗體與解偶聯劑之併用療法而進行活化。重要的是，AMPK或SIRT1之直接活性劑均增強PD-L1抗體之抗腫瘤效果。
本發明等人證明瞭解偶聯劑與PD-1抑制之併用療法不僅將AMPK途徑活化，亦將mTOR途徑活化，mTOR之直接活性劑亦增強PD-L1抗體之效果。迄今為止認為mTOR途徑之活化與AMPK之磷酸化進行競爭，故而該等結果為意料以外1、41、42、43、52。但是，於認為所單離之CD8陽性T細胞由不僅根據不同之活化功能狀態，亦根據生物化學反應或動態之變動而有所不同的不均勻細胞所構成之情形時，能夠說明本發明等人之結果與迄今為止之報告並不矛盾。本發明等人認為mTOR途徑之活化產生由PD-L1抑制以及FCCP或苯紮貝特刺激所得之DLN CTL中之T-bet之表現。T-bet於對於腫瘤消退所需之成為終末分化效應CTL之供給源的記憶前驅物之分化方面重要，關於CTL之抗腫瘤效果亦認為重要55、56。另一方面，認為高效表現EOMES之終末分化CTL因慢性之抗原識別而為免疫耐受性之狀態56、57。於本發明等人之實驗結果中，藉由FCCP或苯紮貝特與PD-1抗體治療之併用，T-bet與IFN-γ之表現上升，EOMES之表現反而降低。此結果與藉由併用療法伴有線粒體之活化之效應記憶細胞群(P3細胞群)增加之本發 明等人之結論並不矛盾。
PGC-1α係調節與線粒體之生物合成或線粒體之氧化磷酸化相關之一系列轉錄因子的分子。AMPK或mTOR之活化係使PGC-1α之表現增加，並經由磷酸化進行活化。本發明等人揭示藉由解偶聯劑與PD-1抗體之併用療法PGC-1α之表現增加，或於腫瘤之治療模型中PGC-1α活性劑(苯紮貝特、奧替普拉)亦與PD-L1抗體具有協同性增強效果。由該結果表明，PGC-1α係引起線粒體之活化或擴大之重要分子，且係誘導AMPK或mTOR活化之正反饋訊息傳遞之重要分子。進而，解偶聯劑或苯紮貝特藉由與PD-L1抗體併用，而將位於mTOR下游之作為重要之細胞激素調節因子的T-bet加以活化。
將迄今為止之與機理相關之假說之整體情況彙總於圖1。
a)藉由PD-1阻斷，引起活化CD8陽性T細胞中之線粒體之擴大或增殖。
b)解偶聯劑或ROS產生劑使線粒體之體積增加，導致ROS之增加。認為或許ROS藉由某種途徑將AMPK與mTOR進行活化36。
c)AMPK與mTOR之活化係使PGC-1α之表現增加並使之活化。
d)最終，PGC-1α與作為其結合轉錄因子之NRFs與PPARs增加使脂肪酸之氧化與氧化磷酸化活化之一系列轉錄因子之表現，又，引起產生CTL之活化或分化的線粒體之擴大。
最近，雖然有報告稱PD-1途徑會抑制線粒體之活化與PGC-1α之表現，但該等報告與本發明等人之假說亦不矛盾63、64。ROS或解偶聯劑、AMPK活性劑、mTOR活性劑、PGC-1α活性劑等本發明等人於本研究中所使用之所有藥劑於與PD-1抗體併用之情形時，雖然藉由線粒體之活化 或擴大而產生CD8+T細胞之活化或分化，但於以單劑投予之情形時並無相同效果。
本發明等人藉由至此為止之結果而揭示了可應用於對PD-1抗體治療無應答性之癌症患者之革新性併用療法之有效性。自移植了對PD-1治療無應答性之腫瘤的小鼠所提取之CTL未產生線粒體之活化，由此認為本發明等人之研究亦有助於與判定PD-1抗體治療之有效性之生物標記物之研究。今後，重要的是調查根據線粒體之代謝變化而發生變化之血清中代謝物量、或於PD-1抗體治療前後收集之樣品中之CD8+ T細胞之OCR活性、與線粒體之活化訊息相關之RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)之表現是否能夠成為與PD-1抗體治療之應答性相關之生物標記物。又，利用併用藥所產生之PD-1抗體治療之協同性增強效果有助於減少被爭論會危及社會保障制度之昂貴之PD-1抗體之投予量。
目前，藉由PD-1/PD-L1阻斷之癌症治療大致有2個問題。第1個問題如上所述係PD-1抑制治療不會對所有患者有效果。因此，進行增強PD-1抑制療法之抗腫瘤效果之可能性較高且可臨床應用之藥物之開發。本發明等人之結果針對對PD-1抑制療法無效果之患者，提供一種新穎併用療法之選項。另一個問題係與由PD-1抑制療法單獨或者併用療法所產生之副作用相關，尤其可列舉由藥劑所特有之毒性或過度之免疫應答所誘發之自身免疫性疾病57。伴隨此種增強免疫治療之治療介入，副作用亦被增強之可能性很大。於PD-L1抗體與此次之研究中所使用之藥劑之併用治療中，雖然未見特別明顯之自身免疫反應，但若考慮臨床應用，則需要使用本發明等人於以前所確立之自身免疫疾病模型小鼠而評價該風險14、15、16。DNP於1930年代係用作營養補充品或提高代謝速度之藥劑58。但是，由於 因質子驅動力之崩解所產生之效果，故而DNP會產生嚴重之健康傷害，而被禁止使用59。FCCP被廣泛地用於線粒體之活體能量學之研究，但FCCP亦存在細胞毒性與某程度之電漿膜去極化作用，故而未進行臨床應用50。於本研究中，5種藥劑雖然顯示出增強由PD-1抑制所引起之抗腫瘤效果，但若考慮於代謝性疾病之治療中較多地嘗試或作為日常之補充品服用，則作為SIRT1活性劑的天然多酚之白藜蘆醇較為理想5、51。雖然報告有白藜蘆醇單獨之抗腫瘤效果，但亦存在其劑量依賴性，於抗腫瘤效果方面存在異議60。本試驗中所使用之劑量為最低劑量，至少於本發明等人所進行之試驗中，並無腫瘤增生抑制效果(反而呈現其相反)。本發明等人所鑑定之其他併用療法為解偶聯劑或ROS之下游之訊息之活性劑。若考慮脫靶之減少，則以mTOR與AMPK、SIRT1之下游作為標靶之治療法有增強抗腫瘤效果並且弱化不期望之副作用之可能性。
若對以上進行彙總，則本發明等人對控制線粒體之能量代謝檢測點，並增強PD-1抑制治療之效果之藥劑進行鑑定。對於藉由PD-1之T細胞之控制、或針對PD-1抑制療法抗性之癌症患者、或者感染疾病之併用療法，本研究之結果可謂開闢出了新穎道路。值得關注的是，由於奧替普拉及苯紮貝特已用作臨床醫藥，故而可應用於與PD-1抗體之併用療法之臨床研究。
[步驟與材料]
小鼠與細胞
所有小鼠均於京都大學研究生院醫學部動物實驗設施中，於無病原體之特別之SPF(specific-pathogen free，無特殊病原體)環境下飼養，並於適當之實驗計劃下使用。C57BL/6及BALB/c(5-6週齡)係自日本查爾斯 河實驗室(Charles River Laboratories Japan)(橫濱)獲取。小鼠結腸腺癌MC38細胞係由Dr.Jim Allison(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center,New York,NY)提供。纖維肉瘤MethA係自生物醫學研究細胞資源中心(Cell Resource Center for Biomedical Research)(仙台、日本)獲得。該等細胞係於包含10%熱滅活FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)及1%抗真菌性抗生素(Invitrogen)之DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium，杜貝可改良伊格爾營養基)(Invitrogen)中進行培養。該細胞系統於分枝桿菌屬中不會被感染。
小鼠治療模型
MC38(5×105)及MethA(5×105)係注入至右側面皮內。MC38係對C57BL/6小鼠接種，MethA係對BALB/c小鼠接種。為了單獨治療，於腫瘤接種5天後，將PD-L1小鼠抗體(1-111A)(本研究室製作)150μg接種至小鼠腹腔內。PD-L1抗體單獨治療係每隔4天重複3次。PD-L1抗體與化學藥品之併用治療係於腫瘤接種7天後開始。化學藥品係每隔2天投予，PD-L1抗體係每隔5天投予(圖3b)。腫瘤係每隔1天進行測定，腫瘤之體積係依據橢圓體之公式π×(長度×寬度×高度/6)而進行計算。
CD8缺損小鼠模型
於CD8缺損小鼠模型中，使用autoMACS Pro Separator(Miltenyi Biotec)自CD45.1+小鼠單離CD8+ T細胞。所單離之CD45.1+ CD8+細胞係於利用PBS稀釋之CellTrace Violet(Thermo Fisher Scientific)中培養20分鐘並進行染色。洗淨後，向CD45.2+ CD8-/-小鼠尾靜脈投予細胞。5天後，向皮內接種MC38(5×105)，於腫瘤接種8天後腹腔內接種PD-L1抗體。
化學試劑
以下述濃度併用以下之試劑，併用於治療。AMPK活性劑：A769662 6mg/kg(Abcam)；mTOR活性劑：MHY1485、3μg/kg(SIGMA-ALDRICH)；解偶聯劑(Uncoupler)：羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)、1.2mg/kg(Abcam)；解偶聯劑：2,4-二硝基苯酚：DNP、1.7mg/kg(ALDRICH)；SIRT1活性劑：白藜蘆醇、0.5mg/kg(Abcam)；ROS補充劑：錳(III)四(4-苯甲酸)卟啉(MnTBAP)、1.25mg/kg(Calbiochem)；ROS產生劑：第三丁基過氧化氫溶液(Luperox TBH70X)、200μl/kg(SIGMA-ALDRICH)。ATP合成抑制劑：寡黴素250μg/kg(SIGMA-ALDRICH)；巴拉刈2mg/kg(Nakalai Tesque)；奧替普拉1.9mg/kg(Sigma)；苯紮貝特1mg/kg(ChemCruz)。
所有試劑係於使用前新製備。各試劑係溶解於說明書中所示之溶劑中。AMPK活化劑、mTOR活化劑、解偶聯劑、SIRT1活化劑係每次於一系列之實驗中，利用新的未使用小玻璃瓶而製備。所溶解之試劑係利用PBS進行稀釋，每隻小鼠各接種200μl。
細胞激素珠陣列分析(CBA)
自治療小鼠採集之血清中之各種細胞激素濃度係藉由利用針對各種小鼠細胞激素(IL-17A、IL-21、MIG、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-12)之抗體進行塗佈之珠粒而定量地測定。依據說明書，利用流式細胞儀FACS Canto II(BD Biosciences)對染色之樣品進行測定。所獲得之資料係使用FCAS陣列軟體v3.0(BD Biosciences)進行分析。
酶結合免疫吸附法(ELISA)
如PD-L1抗體單獨治療中所說明般，對小鼠接種MC38，並利用PD-L1抗體進行治療。血清中之MIG(Monokine Induced by Interferon-gamma，干擾素-γ誘導之單核球激素)係使用MIG ELISA套組(abcam)，並依據說明書而定量地測定。
細胞製備
為了分析所屬淋巴結，自接種有腫瘤之小鼠之右側腋窩、上臂及鼠蹊部之淋巴結採集細胞並加以混合。使用每一個淋巴結之平均細胞數作為絕對細胞數。於腫瘤分析中，利用剪刀將腫瘤組織剪碎成2~3mm片，使用gentleMACS Dissociator(全自動組織處理器)(Miltenyi Biotec)，利用膠原酶IV型(Thermo Fisher Scientific)進行酶處理。使用每毫克之腫瘤細胞數作為絕對數。使用小鼠癌細胞分離套組(Tumor Cell Isolation kit,mouse)(MiltenyiBiotec)自消化之腫瘤組織將腫瘤細胞單離。該套組藉由排除淋巴球、紅血球、纖維母細胞、內皮細胞及腫瘤相關基質細胞，將腫瘤細胞精製。藉由FACSAria(BD BioScience)，進而將腫瘤細胞集團單離、精製而使用。
流式細胞儀分析
使用識別所示之抗原之以下之抗體：來自BioLegend之CD44(1M7)、CD45.2(104)、CD45.1(A20)、CD8(53-6.7)、CD62L(MEL-14)、T-bet(4B/O)及IFN-γ(XMG1.2)、I型MHC(AF6-88.5)、CD155(Tx56)及VISTA(MIH63)；來自Ancam之p-AMPK(EPR5683)；來自eBioscience之p-mTOR(MRRBY)、Eomes(Danllmag)及PD-L1(M1H5)。所有流式細胞儀係利用FACS canto II(BD Biosciences)進行，並利用FlowJo軟體(FLOWJO、LLC)進行分析。於細胞內磷酸化蛋白之評價中， 利用0.5% TritonX對細胞進行透過處理，於染色前利用1.5% PFA(Paraformaldehyde，多聚甲醛)進行固定。線粒體之質量、膜電位、線粒體之超氧化物及細胞之ROS之測定分別使用MitoTracker Green、MitoTracker Deep Red、MitoSOX Red及CellROX Green reagents進行(均為Life technologies製造)。該等色素之各自之最終濃度係設為0.125μM、0.125μM、5.0μM及0.625μM，並於37℃ 5% CO2加濕培養箱中培養30分鐘。
氧消耗率之測定
氧消耗率係利用XF96細胞外流量分析儀(Seahorse Biosciences)進行測定。將4×105之CD8+ T細胞撒於規定之XF96板上。向模組中依序添加XF Cell Mito Stress測試套組(Seahorse Bioscience)隨附之線粒體之氧化磷酸化之4種藥劑。具體而言，基本OCR測定係於依序添加寡黴素、FCCP、魚藤精/抗黴素A後進行。ATP轉化率係定義為(寡黴素添加前之最終值-寡黴素添加後之最小值)34。
即時PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)
使用RNeasy迷你套組(QIAGEN)自CD8陽性T細胞或腫瘤細胞將RNA單離，並藉由逆轉錄合成cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補去氧核糖核酸)。PGC-1a之即時PCR係使用以下之引子而進行：正向ACTCGGATTGCTCCGGCCCT(序列編號1)與反向ACTGACGGCCTAACTCCACCCA(序列編號2)。為了對凋亡與線粒體之能量代謝相關基因之表現量進行分析，使用RT2 Profiler PCR陣列基因表現套組PAMM-012Z或PAMM-008Z(QIAGEN)。本分析中所含之基因表可於如下網址查看 http：//www.sabiosciences.com/Apoptosis.php。
西方墨點(western blotting)
利用小鼠CD8微珠(Milteni Biotec)對CD8+ T細胞進行單離。於進行PBS2次洗淨後，利用包含30mM Tris-HCl(pH值7.4)、150mM NaCl、10%甘油、0.1%SDS(Sodium Dodecyl Sulfonate，十二烷基硫酸鈉)、1% Triton-x-100、0.05%Nα-Doc、5mM EDTA(Ethylenediamine Tetraacetic Acid，四乙酸乙二胺)(pH值8.0)、蛋白酶抑制劑混合物(protease inhibitor mixture)(Roche Molecular Biochemicals)、及磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitors)(Nacalai tesque)之溶解緩衝液使2×106之細胞可溶化。於利用DC蛋白分析套組(Bio-Rad)進行蛋白質濃度測定後，將蛋白質4μg置於4-20%梯度Mini-PROTEAN TGX Gels(Bio-Rad)，向硝基纖維素膜電性地漬墨，其後於在TBS(Tris buffered saline，三羥甲基胺基甲烷緩衝鹽水)中包含1%BSA(Bull Serum Albumin，牛血清蛋白)之封閉緩衝液中進行培養。一次抗體培養係於封閉緩衝液中於4℃下進行一晚。洗淨後，二次抗體培養係於封閉緩衝液中於室溫下進行40小時。漬墨係利用增強化學發光(enhanced chemiluminescence)(Amersham Pharmacia)進行展開。使用識別以下之蛋白質之一次抗體：磷酸基-mTOR(p-mTOR)(Cat#5536)、磷酸基-AMPKα(p-AMPK)(#2535)、磷酸基-p70 S6激酶(P-S6K)(#9205)、4E-BP1(#9644)、磷酸基-乙醯基-CoA羧酶(P-ACC)(#3661)、SIRT1(#9475)。所有一次抗體係自Cell Signaling Technology獲取。識別PGC-1α(SC-13067)之抗體係自Sant Cruz獲得。
統計分析
統計分析係利用Prism 6進行。為了對3個以上之變量進行分析，於 單向ANOVA分析(Analysis of variance，變異數分析)(單因子變異數分析)後進行Sidak之多重比較檢驗。為了對兩個群進行比較而進行學生T檢驗。所有統計分析係假設為參數資料，進行2標本之檢驗。將p值未達0.05者設為有意義。資料之偏差係作為平均值±標準誤差(SEM(Standard Error of Mean，評價標準誤差)進行評價。為了推定本研究中之試樣尺寸，認為5個以上之試樣較為合適。試樣與動物係自集團隨機選擇並進行處理。試樣或動物之處理並非盲檢。
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[實施例2]
對C57BL/6小鼠接種5×105之小鼠大腸癌MC38。7天後腹腔內投予抗PD-L1抗體(1-111A、150μg)與AMPK抑制劑(化合物C：200μg之BBS液，200μl)。抗PD-L1抗體係每隔6天投予3次，化合物C(C.C)係每隔2天投予7次。揭示自接種MC38至第25天之腫瘤之體積(mm3)。
將結果示於圖9。AMPK抑制劑會增強抗PD-L1抗體治療之效果。
[實施例3]
對BALB/c小鼠接種2×106之小鼠腎癌RENCA。7天後腹腔內投予抗PD-L1抗體(1-111A、150μg)與AMPK抑制劑(化合物C：200μg之PBS液、200μl)。抗PD-L1抗體係每隔6天投予3次，化合物C(C.C)係每隔2天投予7次。揭示自RENCA接種至第25天之腫瘤之體積(mm3)。
將結果示於圖10。AMPK抑制劑會增強抗PD-L1抗體治療之效果。
[實施例4]
對C57BL/6小鼠接種5×105之MC38。7天後腹腔內投予抗PD-L1抗體(1-111A、150μg)與PGC-1α/轉錄因子複合體活化劑(2-(4-{2-[(4-氯苯甲醯基)胺基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸(苯紮貝特)：10μg之PBS液、200μl)。抗PD-L1抗體係每隔6天投予3次，苯紮貝特每隔2天投予7次。揭示自接種MC38至第25天之腫瘤之體積(mm3)。
將結果示於圖11。PGC-1α/轉錄因子複合體活化劑會增強抗PD-L1抗體治療之效果。
[實施例5]
對BALB/c小鼠接種5×105之MethA，7天後腹腔內投予抗PD-L1抗體(1-111A、80μg)與Foxo1抑制劑(5-胺基-7-(環己基胺基)-1-乙基-6-氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸、Calbiochem)(2mg/kg)。投予時間表係依據圖3。將自MethA接種至第28天之腫瘤之體積(mm3)示於圖16。Foxo1抑制劑會增強抗PD-L1抗體治療之效果。
[實施例6]
藉由GC-MS分析對5隻PD-1-/-小鼠(Immunity 11,141-151(1999).；Science 291,319-322(2001).；Nat.Med.9,1477-1483(2003).)與野生型 C57BL/6N小鼠(與PD-1-/-小鼠同胎出生之小鼠)之血清中所含之胺基酸之量進行鑑定。將結果示於圖17。圖17係表示將野生型之值設為1時之PD-1-/-小鼠之值。於缺損PD1之小鼠體內進行T細胞之分裂，血中胺基酸進行代謝，其值減少。
對BALB/c小鼠接種5×105之纖維肉瘤MethA(Cell Resource Center for Biomedical Research)，7天後投予抗PD-L1抗體(1-111A、60μg)與Aminoleban(大塚製藥、400μl/mouse)。投予時間表係依據圖3。將Aminoleban之組成示於圖18。
將結果示於圖19。胺基酸會增強抗PD-L1抗體治療之效果。
將本說明書中所引用之所有刊物、日本專利及專利申請直接作為參考而編入至本說明書中。
[產業上之可利用性]
本發明之醫藥組合物可用作抗癌劑、感染症治療劑或該等之組合。
[序列表非關鍵文字]
<序列編號1>
揭示正向引子之鹼基序列。
<序列編號2>
揭示反向引子之鹼基序列。
<110> 國立大學法人京都大學
<120> PD-1訊息抑制劑之併用療法
<130> FP-213PCT
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<151> 2016-06-16
<160> 2
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 2

Claims (19)

  1. 一種醫藥組合物，其包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期進行投予：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中PD-1訊息抑制劑為抗體。
  3. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中抗體係選自由抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體所組成之群中之至少1種抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中ROS產生劑係選自由第三丁基過氧化氫、羰基氰對三氟甲氧基苯腙、2,4-二硝基苯酚、2,3-二甲氧基-1,4-萘醌及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  5. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中顯示出解偶聯作用之物質為選自由羰基氰對三氟甲氧基苯腙、2,4-二硝基苯酚、羰基氰化物間氯苯腙、水楊酸、4,4'-[戊烷-1,5-二基雙(氧基)]二苯甲脒)、2-(2-(2,6-二氯苯基胺基)苯基)乙酸、4-羥基-2-甲基-N-(2-吡啶基)-2H-1,2-苯并噻-3-甲醯胺-1,1-二氧化物、2-{1-[(4-氯苯基)羰基]-5-甲氧基-2-甲基-1H-吲哚- 3-基}乙酸、N-(4-硝基-2-苯氧基苯基)甲磺醯胺、4-羥基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-2H-1,2-苯并噻-3-甲醯胺-1,1-二氧化物、氯硝柳胺乙醇胺鹽、4-甲氧基-8-(3-甲基丁-2-烯氧基)喹啉-2-羧酸3-甲基丁-2-烯酯及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  6. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中ROS產生劑或控制顯示出解偶聯作用之物質之下游訊息的物質係控制mTOR、AMPK、SIRT1、PGC-1α/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)及Foxo1中之任一種或其以上之物質。
  7. 如請求項6之醫藥組合物，其中控制mTOR之物質為選自由4,6-二(4-嗎啉基)-N-(4-硝基苯基)-1,3,5-三-2-胺、磷脂酸及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  8. 如請求項6之醫藥組合物，其中控制AMPK之物質為選自由6,7-二氫-4-羥基-3-(2'-羥基[1,1'-聯苯]-4-基)-6-側氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-5-甲腈、5-胺基咪唑-4-甲醯胺1-β,-D-呋喃核糖苷、N,N-二甲基雙胍、6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  9. 如請求項6之醫藥組合物，其中控制SIRT1之物質為選自由反式-3,5,4'-三羥基芪、N-(2-(3-(哌-1-基甲基)咪唑并[2,1-b]噻唑-6-基)苯基)喹啉-2-甲醯胺、N-苄基-3,5-二乙氧羰基-4-苯基-1,4-二氫吡啶、2-胺基 -N-環戊基-1-(3-甲氧基丙基)-1H-吡咯并[2,3-b]喹啉-3-甲醯胺、菸醯胺單核苷酸及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  10. 如請求項6之醫藥組合物，其中控制PGC-1α/轉錄因子複合體(包含PGC-1α之轉錄因子複合體)之物質為選自由2-(4-{2-[(4-氯苯甲醯基)胺基]乙基}苯氧基)-2-甲基丙酸、9-順式，12-順式-十八碳二烯酸)、2-[4-(4-氯苯甲醯基)苯氧基]-2-甲基丙酸-d6 1-甲基乙酯、十一烷硫基乙酸、4-甲基-5-(2-吡基)-3-二硫雜環戊烯硫酮、N,N-二甲基甲醯胺、3-[4-(2,4-雙(三氟甲基)苄氧基)-3-甲氧基苯基]-2-氰基-N-(5-三氟甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)丙烯醯胺及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  11. 如請求項6之醫藥組合物，其中控制Foxo1之物質為選自由5-胺基-7-(環己基胺基)-1-乙基-6-氟-4-側氧基-1,4-二氫喹啉-3-羧酸、2-環戊基-N-{2,4-二氯-3-[(異喹啉-5-基氧基)甲基]苯基}-N-甲基乙醯胺及其類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  12. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中胺基酸為選自由色胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸及該等之類似物所組成之群中之至少1種化合物。
  13. 如請求項1至12中任一項之醫藥組合物，其係用作抗癌劑、感染症治 療劑或該等之組合。
  14. 如請求項1至13中任一項之醫藥組合物，其分別投予PD-1訊息抑制劑與選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
  15. 如請求項1至13中任一項之醫藥組合物，其係包含PD-1訊息抑制劑與選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質的調配劑：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
  16. 一種PD-1訊息抑制活性增強劑，其包含選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
  17. 一種癌症、感染症或該等之組合之治療方法，其包括如下步驟：於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，以醫藥上有效之量對受驗者或受驗動物投予選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物 質：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
  18. 一種選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之用途，其係用於治療癌症、感染症或該等之組合，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，投予選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
  19. 一種選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質之用途，其係用於治療癌症、感染症或該等之組合之方法，且於投予PD-1訊息抑制劑之前、之後或同時之任一時期，投予選自由下述(i)至(iii)所組成之群中之至少1種物質：(i)ROS產生劑及控制其下游訊息之物質、(ii)顯示出解偶聯作用之物質及控制其下游訊息之物質、以及(iii)胺基酸。
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