KR20180093990A

KR20180093990A - Pd-1 시그널 저해제의 병용 요법

Info

Publication number: KR20180093990A
Application number: KR1020187019345A
Authority: KR
Inventors: 다스쿠 혼조; 겐지 차모토; 시도니아 파가라산
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2018-08-22
Also published as: EP3388084A1; SG10202006032VA; CA3007613A1; MX2018006518A; WO2017099034A1; CN114601930A; TW201726169A; JPWO2017099034A1; EP3388084A4; US20230272077A1; JP6994240B2; EP4218819A3; US20180362650A1; IL259857A; CN114404595A; BR112018011131A2; AU2016366250A1; SG11201804473RA; US20230265193A1; CN108601840A

Abstract

항PD-1 항체 치료의 새로운 치료 전략을 제공한다. 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하고, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에 투여하는, 의약 조성물. (i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, (ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 및 (iii) 아미노산

Description

PD-1 시그널 저해제의 병용 요법

본 발명은, PD-1 시그널 저해제의 병용 요법에 관한 것이다.

근년의 임상 시험 결과로부터, 항PD-1 항체 치료는, 여러 가지 암에서 종래의 표준 치료보다 유효한 것이 밝혀져 왔다[비특허문헌 1-3]. 말기 폐암 환자에서의 PD-1 항체 치료의 성공률은 20-30％로 종래의 항암제에 비하여 극적으로 향상되었다. 그러나, 불응답성을 나타내는 환자가 약 반수 정도 있는 것도 사실이다. 왜 이들 환자는 PD-1 항체 치료에 불응답인지, 아직 거의 알지 못한다.

Bramer J, Reckamp K, et al: Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer. N Engl J Med, 373:1627-1639, 2015. Hamanishi J, Mandai M, Ikeda T, et al: Safety and Antitumor Activity of Anti-PD-1 Antibody, Nivolumab, in Patients With Platinum-Resistant Ovarian Cancer. J Clin Oncol, 33:4015-4022, 2015. Motzer RJ, Escudier B, McDermott DF, et al: Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med, 373:1803-1813, 2015.

본 발명은 항PD-1 항체 치료의 새로운 치료 전략을 제공하는 것을 목적으로 한다.

항PD-1 항체 치료는, 종래의 직접적인 암세포 살상 작용을 갖는 항암제와는 상이하고, 항종양 면역을 활성화시킴으로써, 암 증식을 억제한다. 항종양 면역을 서포트하는 것과 같은 시약이 있으면, 병용함으로써 항종양 효과를 향상시킬 수 있고, 불응답 환자에게도 적응할 수 있는 일이 기대된다.

본 발명자들은, PD-1 시그널 저해 항체와 ROS 발생제나 미토콘드리아 막 전위 제어제(탈공역제)를 병용하면, 상승적으로 항종양 효과가 향상되는 것을 알아내었다. ROS 발생제나, 미토콘드리아 막 전위 제어제 단독으로는, 생체 내에서 항종양 효과를 발휘하지 않았다. 이상의 결과로부터, ROS 발생제나, 미토콘드리아 막 전위 제어제는, PD-1 시그널 저해 항체와 병용함으로써 항종양 면역을 서포트하고, 상승적으로 암 증식을 억제하는 효과를 갖는다고 생각되었다.

본 발명의 요지는, 이하와 같다.

(1) 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하고, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에 투여하는, 의약 조성물.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고

(iii) 아미노산

(2) PD-1 시그널 저해제가 항체인 (1)에 기재된 의약 조성물.

(3) 항체가, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체 및 항PD-L2 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 항체인 (1) 또는 (2)에 기재된 의약 조성물.

(4) ROS 발생제가, tert-부틸히드로페록시드, 카르보닐시아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존, 2,4-디니트로페놀, 2,3-디메톡시-1,4-나프토퀴논 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(5) 탈공역 작용을 나타내는 물질이, 카르보닐시아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존, 2,4-디니트로페놀, 카르보닐시아나이드 m-클로로페닐히드라존, 살리실산, 4,4'-[펜탄-1,5-디일비스(옥시)]디벤젠카르복시미드아미드), 2-(2-(2,6-디클로로페닐아미노)페닐)아세트산, 4-히드록시-2-메틸-N-(2-피리디닐)-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드 1,1-디옥사이드, 2-{1-[(4-클로로페닐)카르보닐]-5-메톡시-2-메틸-1H-인돌-3-일}아세트산, N-(4-니트로-2-페녹시페닐)메탄술폰아미드, 4-히드록시-2-메틸-N-(5-메틸-2-티아졸일)-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드-1,1-디옥시드, 니클로사마이드 에탄올아민염, 3-메틸부트-2-에닐 4-메톡시-8-(3-메틸부트-2-에닐옥시)퀴놀린-2-카르복실레이트 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(6) ROS 발생제 또는 탈공역 작용을 나타내는 물질의 하류 시그널을 제어하는 물질이 mTOR, AMPK, SIRT1, PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체) 및 Foxo1 중 어느 하나 또는 그 이상을 제어하는 물질인 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(7) mTOR을 제어하는 물질이 4,6-di-4-모르폴린일-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민, 포스파티딘산 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (6)에 기재된 의약 조성물.

(8) AMPK를 제어하는 물질이 6,7-디히드로-4-히드록시-3-(2'-히드록시[1,1'-비페닐]-4-일)-6-옥소-티에노[2,3-b]피리딘-5-카르보니트릴, 5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 1-β,-D-리보푸라노사이드, N,N-디메틸이미도디카르보니미딕디아미드, 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (6)에 기재된 의약 조성물.

(9) SIRT1을 제어하는 물질이 trans-3,5,4'-트리히드록시스틸벤, N-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)페닐)퀴녹살린-2-카르복사미드, N-벤질-3,5-디카르브에톡시-4-페닐-1,4-디히드로피리딘, 2-아미노-N-시클로펜틸-1-(3-메톡시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]퀴녹살린-3-카르복사미드, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (6)에 기재된 의약 조성물.

(10) PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체)를 제어하는 물질이 2-(4-{2-[(4-클로로벤조일)아미노]에틸}페녹시)-2-메틸프로판산, 9-시스, 12-시스-옥타데카디엔산), 2-[4-(4-클로로벤조일)페녹시]-2-메틸-프로판산-d6 1-메틸에틸에스테르, (운데실티오)-아세트산, 4-메틸-5-(2-피라지닐)-3-디티올티온, N,N-디메틸포름아미드, 3-[4-(2,4-비스-트리플루오로메틸벤질옥시)-3-메톡시페닐]-2-시아노-n-(5-트리플루오로메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아크릴아미드 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (6)에 기재된 의약 조성물.

(11) Foxo1을 제어하는 물질이 5-아미노-7-(시클로헥실아미노)-1-에틸-6-플루오로-4-옥소-1,4-디히드로퀴놀린-3-카르복실산, 2-시클로펜틸-N-{2,4-디클로로-3-[(이소퀴놀린-5-일옥시)메틸]페닐}-N-메틸아세트아미드 및 그의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (6)에 기재된 의약 조성물.

(12) 아미노산이 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 티로신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 트레오닌, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 오르니틴, 시트룰린 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(13) 항암제, 감염증 치료제 또는 그들의 조합으로서 사용되는 (1) 내지 (12) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(14) PD-1 시그널 저해제와, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 따로따로 투여되는 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

(15) PD-1 시그널 저해제와, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는 배합제인 (1) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

(16) 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는, PD-1 시그널 저해 활성 증강제.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

(17) PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 의약적으로 유효한 양으로 피험자 또는 피검 동물에 투여하는 것을 포함하는, 암, 감염증 또는 그들의 조합의 치료 방법.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

(18) 암, 감염증 또는 그들의 조합의 치료를 위한, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 사용이며, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 투여되는 상기 사용.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

(19) 암, 감염증 또는 그들의 조합을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 사용이며, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 투여되는 상기 사용.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

ROS 발생제 또는 그의 하류 시그널을 제어하는 물질 및/또는 탈공역 작용을 나타내는 물질 또는 그의 하류 시그널을 제어하는 물질을, PD-1 시그널 저해제와 병용함으로써, 상승적으로 항종양 효과가 향상된다.

본 명세서는, 본원의 우선권 기초인 일본 특허 출원, 일본 특허 출원 제2015-238511호 및 일본 특허 출원 제2016-119695호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은, PD-1 저해와 화학 시약에 의한 미토콘드리아 활성화의 가설도. a) PD-1 저해는, 종양 반응성 T세포의 미토콘드리아를 활성화한다. b) ROS 유도제 또는 탈공역제는, 세포의 ROS를 증가시킨다. c) 세포의 ROS는 AMPK와 mTOR을 활성화하고, 그 결과, T-bet의 발현에 추가하여 PGC-1a가 활성화된다. d) PGC-1a와 결합하는 NRF나 PPARs의 활성화는, 미토콘드리아에 있어서의 포지티브 피드백적 활성화를 야기한다. Friederich-Persson, M., et al. Kidney hypoxia, attributable to increased oxygen consumption, induces nephropathy independently of hyperglycemia and oxidative stress. Hypertension 62, 914-919(2013). Kenwood, B.M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Mol Metab 3, 114-123(2014). Berrien-Elliott, M.M., et al. Checkpoint blockade immunotherapy relies on T-bet but not Eomes to induce effector function in tumor-infiltrating CD8+T cells. Cancer immunology research 3, 116-124(2015).
도 2는, PD-1 저해에 의한 TR CTL의 생체 내 검출과 그 미토콘드리아의 활성. a-d) 실험 공정의 개요도. CellTrace로 라벨한 CD45.1⁺CD8⁺T세포를 CD45.2⁺CD8^-/-마우스에 옮겼다. 마우스에 MC38을 접종하고, PD-L1 항체로 치료하였다. 소속 림프절의 CD8⁺ CD45.1⁺ T세포에 게이트를 가하여 해석하였다(a). 그 게이트 내에 있어서의 세포의 CD62L과 CellTrace의 강도를 나타내었다(b)(왼쪽). 고분열 세포의 빈도를 군간 비교하였다. 데이터는 4 내지 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, 1원 배치 분산 분석(우)(b). (a)에서 나타내는 게이트 내의 세포로, CellTrace 및 mLama4 펩티드 또는 무관계의 펩티드를 로드한 MHC 4량체의 양성률을 PD-L1 항체 치료한 군에서 해석하였다(c). PD-L1 항체 치료를 행한 소속 림프절 세포를 미토콘드리아의 활성에 관계하는 시약으로 염색하였다. (a)의 게이트 중의 대표적인 FACS 데이터를 나타내었다(상기 도면)(d). 각 미토콘드리아 염색 시약의 형광 강도의 중앙값을 고분열(고)과 저분 분열(저)마다 해석하여 비교하였다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, ****p<0.0001, 일원 배치 분산 분석(하기 도면)(d). 데이터는 3개의 독립된 실험 중 대표적인 것을 나타내고 있다(a-d). e, f) MC38 담암 야생형 마우스에 PD-L1 항체를 4일마다 3회 투여하였다. 치료 또는 미치료 마우스로부터 단리된 소속 림프절의 CD8⁺ T세포의 산소 소비량(OCR)을 XF^e96 해석기로 계측하였다. 두번째 치료의 2일 후에 3마리의 마우스의 세포를 혼합하여 해석하였다(e). (올리고마이신 투여 후의 최종 계측값)-(올리고마이신 투여 후의 최저 계측값)으로 정의한 ATP 회전율을 계측하였다(f). 데이터는 3 well의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. ****p<0.0001, 2표본의 student-t 검정 분포. 데이터는 2개의 독립된 실험 중, 대표적 데이터를 나타내고 있다.
도 3은, PD-L1 항체 치료와 활성 산소 발생제 Luperox(루페록스)의 상승 효과. a) 마우스에 MC38을 접종하여 3주일, 7일마다 tert-부틸히드로페록시드 용액(Luperox)을 투여하였다. 종양의 체적을 나타내었다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. b) 병용 치료의 공정 개요도. c) 마우스에 MC38을 접종한 7일 후에 PD-L1 항체와 Luperox를 투여하였다. 종양의 체적과 생존 곡선을 나타내었다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, **p<0.01, 2표본의 t 검정 분포(항PD-L1 대 항PD-L1+Luperox). 데이터는 2개의 독립된 실험 중, 대표적인 것을 나타내고 있다.
도 4는, 탈공역제의 상승 효과는 ROS가 관여한다. a) 도 3의 b와 같이 동일한 공정에서 MC38 담암 마우스에 FCCP 또는 DNP와 PD-L1 항체를 투여하였다. 종양의 체적과 생존 곡선을 나타내었다. 데이터는 5 내지 6마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, **p<0.01, 2표본의 t 검정 분포(항PD-L1 대 항PD-L1+FCCP 또는 DNP). b) (a)와 동일한 공정에서 MC38 담암 마우스에 FCCP 또는 DNP만을 투여하였다. 종양의 체적을 나타내었다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. c) MC38 담암 마우스에 ROS 소거제(MnTBAP)와 PD-L1 항체와 FCCP(왼쪽) 또는 DNP(우측)를 투여하였다. 데이터는 4 내지 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, **p<0.01, 2표본의 t 검정 분포(병용 치료 대 병용 치료+MnTBAP). DNP 병용 치료에 있어서의 컨트롤 IgG군의 마우스(우측)는 도 4의 b와 공유하였다. 데이터는 2개의 독립된 실험 중, 대표적인 것을 나타내고 있다.
도 5는, DNP와 Luperox를 모두 병용함으로써 항종양 효과가 증진된다. MC38 담암 마우스에 도 3의 b와 동일한 공정으로, DNP 또는 Luperox, 또는 그 양쪽과 항PD-L1 항체를 투여하였다. 종양의 체적을 나타내었다. 데이터는 5 내지 6마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. 데이터는 2개의 독립된 실험 중 대표적인 데이터를 나타내고 있다.
도 6은, FCCP 투여에 의한 이펙터 CD8⁺ T세포의 증가. a) 도 3의 b에서 나타낸 바와 같이 동일한 공정으로 MC38 담암 마우스에 PD-L1 항체와 FCCP를 투여하였다. 14일째에 소속 림프절의 세포를 항CD8, CD62L, CD44 항체로 염색하고, CD8⁺ T세포에 게이트하였다. P1 내지 P3의 세포군을 CD62L과 CD44의 강도를 기초로 정의하였다(상기 도면). 각 군에 있어서의 P1 내지 P3의 세포 절대 수를 계산하였다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, 일원 배치 분산 분석(하기 도면). b) PD-L1 항체와 FCCP를 투여한 마우스의 소속 림프절 CD8⁺ T세포를 각 미토콘드리아 염료로 염색하였다. P1-P3의 대표적인 FACS 프로필(상단 도면). 각 그룹에 있어서의 각 미토콘드리아 염료로 염색한 P3 세포군의 대표적인 FACS 프로필(중단 도면). 각 염료로 염색한 P1-P3의 MFI를 투여군 간에서 비교하였다. 색은 P1-P3 세포군에 대응한다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다(하단 도면). *p<0.05, **p<0.01, 일원 배치 분산 분석. c) 종양 투여 후 11일째에 효소 처리한 암 조직의 세포를 항CD8, CD45, CD62L, CD44 항체로 염색하였다. CD45⁺ CD8⁺ T세포에 게이트를 가하여, 그 CD62L과 CD44의 표현형을 해석하였다(좌측 도면). CD45⁺ T세포 중의 CD8⁺ T세포의 빈도와 CD45⁺CD8⁺ T세포의 절대 수를 군간 비교하였다(우측 도면). 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, **p<0.01, 일원 배치 분산 분석. FACS 데이터는 각 군의 5마리의 마우스 데이터 중, 대표적인 것을 나타내고 있다. 데이터는 2개의 독립된 실험 내, 대표적인 것을 나타내고 있다.
도 7은, 탈공역제와 PD-L1 항체의 병용에 의한 상승 효과에는, mTOR와 AMPK의 경로가 관여한다. a) DNP 또는 FCCP의 병용 치료 시에, 5마리의 마우스의 소속 림프절 세포를 혼합하고, CD8⁺ T세포를 단리하였다. AMPK와 ACC, mTOR, S6K의 인산화 및 SIRT1과 4EBP1의 발현을 웨스턴 블로팅법에 의해 해석하였다. b) 도 3의 b와 동일한 공정으로 MC38 담암 마우스에 AMPK 활성제(A76966)와 mTOR 활성제(MHY1485), 또는 그 양쪽을 PD-L1 마우스 항체와 함께 투여하였다. 종양의 체적과 생존 곡선을 나타내었다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, **p<0.01, 2표본의 t 검정 분포(항PD-L1 항체 대 병용 치료). 애스테리스크의 각 색은 같은 색으로 나타난 군과 일치하고 있다. c) MC38 담암 마우스에 SIRT1 활성제(레스베라트롤)와 PD-L1 항체를 투여하였다. 종양의 체적과 생존 곡선을 나타내었다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, **p<0.01, 2표본의 t 검정 분포(항PD-L1 항체 대 병용 치료).
도 8은, mTOR과 AMPK가 상이한 활성화 상태는 CD8⁺T세포의 분화 단계에 대응한다. MC38 담암 마우스에 DNP와 항PD-L1 항체를 투여하였다. 1회째의 치료의 다음날에, 소속 림프절의 세포를 CD8, CD62L, CD44, p-mTOR 및 p-AMPK에 대한 항체로 염색하였다. 도 6의 a에 도시하는 바와 같이 P1 내지 P3에 게이트를 가하여, p-AMPK와 p-mTOR의 형광 강도를 비교하였다. 데이터는 2개의 독립된 실험 중, 대표적인 것을 나타내고 있다.
도 9는, PD-L1 항체 치료와 AMPK 저해제의 상승 효과. MC38 담암 마우스에 도 3의 b와 동일한 공정으로, compound C와 항PD-L1 항체를 투여하였다. 종양의 체적을 나타내었다.
도 10은, PD-L1 항체 치료와 AMPK 저해제의 상승 효과. RENCA 담암 마우스에 도 3의 b와 동일한 공정으로, compound C와 항PD-L1 항체를 투여하였다. 종양의 체적을 나타내었다.
도 11은, PD-L1 항체 치료와 PGC-1α/전사 인자 복합체 활성제의 상승 효과. MC38 담암 마우스에 도 3의 b와 동일한 공정으로, NRF2 활성화제(Oltipraz(올티프라즈)) 또는 PPARs 활성화제(Bezafibrate(벤자피브레이트))와 항PD-L1 항체를 투여하였다. 종양의 체적을 나타내었다. 데이터는 5마리의 마우스의 평균값±표준 오차를 나타내고 있다. *p<0.05, two-tailed student-T 검정(PD-L1 항체 vs 각 병용 요법).
도 12는, Luperox 및 FCCP는 생체 내의 종양 세포에 거의 영향을 미치지 않는다. a) 종양 조직은, 2회째의 FCCP 또는 Luperox 단독 투여로부터 1일 후에 회수하였다. 효소 소화 후, 종양 세포는, 종양 세포 이외의 세포를 취제거할 수 있는 세포 분리 키트에 의해 선별되었다. 분리된 종양 세포는, 추가로 Aria에 의해 정제되어, 다음 실험에 사용되었다. b) 종양 세포는 PD-L1, MHC class I, CD155(TIGIT의 리간드)와 VISTA를 표적으로 한 항체 또는 미토콘드리아 질량, 막 전위나 슈퍼옥시드를 물들이는 색소로 염색하였다. c) 미토콘드리아 에너지 대사나 아포토시스 관련 유전자의 발현 레벨은, RT² profiler PCR 키트를 사용하여 조사하였다. 표시되어 있는 유전자명은, 82 유전자 중, 무처리의 종양 세포와 비교하여 2배 이상, 유위하게 증가한 것이다.
도 13은, 미토콘드리아 활성화 관련 시약의 항종양 상승 효과. a) 병용 치료 스케줄의 모식도. b) 마우스에 PD-L1 항체와 Paraquat(파라콰트)의 병용 치료를 행하였다. 데이터는, 5-6마리의 쥐의 값 평균값±표준 오차를 나타낸다. 데이터는 2회의 독립된 실험의 대표이다.
도 14는, 미토콘드리아 활성화 관련 시약은 다른 종양이나 마우스의 계통에 있어서도 기능한다. 섬유육종 MethA를 이식한 BALB/c 마우스에 PD-L1 항체와 FCCP, Luperox, Parawuat 또는 Oltipraz를 도 3의 스케줄을 따라 투여하였다. 종양 사이즈를 나타낸다. 데이터는, 5마리의 쥐의 값의 평균값±표준 오차를 나타낸다. *p<0.05, 양측 student-t 검정(PD-L1 항체 vs 각각의 병용 치료).
도 15는, T-bet와 IFN-γ 산생은, FCCP 또는 Bezafibrate와 PD-L1 항체의 병용치군에 있어서 증가한다. a) PD-L1 항체와 FCCP로 병용 치료한 마우스 유래의 소속 림프절의 CD8 양성 세포에 있어서의 T-bet와 Eomes 발현을 플로우 사이토메트리에 의해 해석하였다. 대표적인 FACS 데이터를 나타낸다(상기 도면). PD-L1 항체와 FCCP 또는 Bezafibrate로 병용 치료한 마우스 유래의 소속 림프절에 있어서의 T-bet와 Eomes 양성 T세포의 빈도와 수를 산출하였다(하기 도면). b) 효소 소화한 종양 조직을 37℃에서 6시간 배양하고, PD-L1 항체와 FCCP 또는 Bezafibrate로 병용 치료한 마우스 유래의 CD8 양성 세포에 있어서의 IFN-γ의 세포 내 염색을 행하였다. 대표적인 FACS 데이터(좌측 도면)와 CD8 양성 세포 내에 있어서의 IFN-γ의 빈도(우측 도면)를 나타내고 있다. 데이터는, 5마리의 쥐의 값 평균값±표준 오차를 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01은 일원 배치 분산 분석에 의한 것이다.
도 16은, PD-L1 항체 치료와 Foxo1 저해제: AS1842856의 상승 효과. MethA를 BALB/c 마우스에 5x10⁵ 접종하고, 7일 후에 항PD-L1 항체(80 ug)와 Foxo1 저해제(2mg/kg)를 투여하였다. 투여 스케줄은 도 3을 따른다. 종양의 체적을 나타내었다.
도 17은, 혈중 메타보라이트(아미노산)의 변화. 5마리의 PD-1^-/-마우스와 야생형 마우스의 혈청 중에 포함되는 아미노산의 양을 GC-MS 해석으로 동정하였다. 도면은 야생형의 값을 1로 했을 때의 PD-1^-/-마우스의 값을 나타낸다. N=5, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, t-test.
도 18은, Aminoleban(아미놀에반)의 조성.
도 19는, PD-L1 항체 치료와 Aminoleban의 상승 효과. Fibrosarcoma MethA를 BALB/c 마우스에 5x10⁵접종 7일 후에 항PD-L1 항체(60ug)와 Aminoleban(400 ul/마우스)을 투여하였다. 투여 스케줄은 도 3을 따른다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하고, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에 투여하는, 의약 조성물을 제공한다.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

ROS 발생제로서는, tert-부틸히드로페록시드(Luperox), 카르보닐시아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP), 2,4-디니트로페놀(DNP), 2,3-디메톡시-1,4-나프토퀴논(DMNQ), 2-메틸나프탈렌-1,4-디온(Menadione(메나디온)), 1,1'-디메틸-4,4'-비피리디늄디클로라이드(Paraquat) 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있다.

ROS 발생제의 하류에는 mTOR, ATM(ataxia telangiectasia mutated protein: 혈관 확장성 실조증 변이 단백질), AMPK(AMP-activated protein kinase) 등의 시그널 전달이 있고(도 1), 본 발명의 의약 조성물은, 이들 중 어느 하나를 제어하는 물질을 포함해도 된다. 제어는, 활력화와 불활성화를 포함하는 개념이다.

ROS 하류 시그널의 mTOR는, 세포의 해당계를 활성화하고, 세포 분열에 필요한 단백질·지질·핵산의 증폭을 야기한다(동화 작용의 촉진). 그것에 의하여, PD-1 시그널 저해에 의해 증강된 T세포 리셉터 시그널을 더욱 보강한다고 생각된다. 탈공역 물질의 하류 시그널에 의해, AMPK가 활성화되면 미토콘드리아의 생합성이 일어나고, 에너지의 산생에 필요한 산화적 인산화가 미토콘드리아 내에서 활성화한다. 그것에 의하여, PD-1 시그널 저해에 의해 증강된 T세포 리셉터 시그널을 더욱 보강한다고 생각된다.

mTOR을 제어하는 물질로서는, 4,6-디모르폴리노-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민; 4,6-Di-4-모르폴린일-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민(MHY1485), 포스파티딘산(PA) 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있고, 이들의 물질은, mTOR을 부활화한다.

AMPK는, 에너지 센서로도 말해지고, 에너지 소비에 의해 ATP량이 줄어들고, AMP의 양이 증가하면 활성화한다. AMPK의 역할은, 에너지의 소비를 억제하고, 에너지를 축적하는 방향으로 대사를 제어하는 것이다. 그로 인해, AMPK가 활성화하면 생합성이 억제되어(동화 작용의 억제) 미토콘드리아로부터의 ATP 산생이 왕성해진다(이화 작용의 촉진)^{1, 2,} ³. AMPK 시그널의 하류에는 PGC-1a와 전사 인자의 복합체가 있고, 그것에 의해 미토콘드리아의 생합성이나 산화적 인산화 대사가 활성화한다⁴. AMPK를 활성화하면 당뇨병의 개선이 보이는 것으로부터, 일부의 AMPK 활성화제는 당뇨병 치료약으로서 사용되고 있다. AMPK를 제어하는 물질로서는 6,7-디히드로-4-히드록시-3-(2'-히드록시[1,1'-비페닐]-4-일)-6-옥소-티에노[2,3-b]피리딘-5-카르보니트릴(A769662), 5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 1-β,-D-리보푸라노사이드(AICAR), N,N-디메틸이미도디카르보니미딕디아미드(Metformin(메트포르민)) 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있고, 이들의 물질은, AMPK를 부활화한다. AMPK를 불활성화하는 물질(AMPK의 저해제)로서는, 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘(compound C) 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있다.

SIRT1은, 탈아세틸화 효소이고, PGC-1α나 Foxo1 등의 전사 관련 인자 활성화한다. SIRT1이 활성화하면, ROS나 스트레스에 대한 내성을 형성한다. SIRT-1은 AMPK에 의해서도 활성화되고, PGC-1a의 활성화에 의해 미토콘드리아의 생합성이나 산화적 인산화를 촉진한다. SIRT1의 활성화에 의해 외적·내적 스트레스에 내성이 되기 때문에, 장수에 관련한다고도 말해지고 있다⁵ ^, ⁶. SIRT1을 제어하는 물질로서는, trans-3,5,4'-트리히드록시스틸벤(resveratrol(레스베라트롤)), N-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)페닐)퀴녹살린-2-카르복사미드, N-벤질-3,5-디카르브에톡시-4-페닐-1,4-디히드로피리딘, 2-아미노-N-시클로펜틸-1-(3-메톡시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]퀴녹살린-3-카르복사미드, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있고, 이들의 물질은 SIRT1을 활성화한다.

PGC-1α는 전사 인자 보조활성자라고 불리고 있고, 여러 가지 미토콘드리아 활성에 관련하는 전사 인자와 복합체를 형성한다(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체). 예를 들어 PGC-1α는, 전사 인자 TRβ1, NRFs, ERRs, PPARα/β/^TM 등과 복합체를 형성하고, 미토콘드리아의 활성화, 지질 대사의 촉진, 활성 산소 무독화를 촉진한다. PGC-1α에 결합하는 전사 원인을 타깃으로 한 약제는, 당뇨병 치료약, 중성 지방 강하 약으로서 사용되고 있다⁴ ^,7, ⁸. PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체)를 제어하는 물질로서는, 2-(4-{2-[(4-클로로벤조일)아미노]에틸}페녹시)-2-메틸프로판산(bezafibrate), 9-시스, 12-시스-옥타데카디엔산), 2-[4-(4-클로로벤조일)페녹시]-2-메틸-프로판산-d6 1-메틸에틸에스테르, (운데실티오)-아세트산, 4-메틸-5-(2-피라지닐)-3-디티올티온(Oltipraz), N,N-디메틸포름아미드, 3-[4-(2,4-비스-트리플루오로메틸벤질옥시)-3-메톡시페닐]-2-시아노-n-(5-트리플루오로메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아크릴아미드 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있고, 이들의 물질은, PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체)를 제어한다.

탈공역 작용을 나타내는 물질로서는, 카르보닐시아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP), 2,4-디니트로페놀(DNP), 카르보닐시아나이드 m-클로로페닐히드라존(CCCP), 살리실산, 4,4'-[펜탄-1,5-디일비스(옥시)]디벤젠카르복시미드아미드)(펜타미딘), 2-(2-(2,6-디클로로페닐아미노)페닐)아세트산(디클로페낙), 4-히드록시-2-메틸-N-(2-피리딜)-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드 1,1-디옥사이드(피록시캄), 2-{1-[(4-클로로페닐)카르보닐]-5-메톡시-2-메틸-1H-인돌-3-일}아세트산(인도메타신), (N-(4-니트로-2-페녹시페닐)메탄술폰아미드(니메술리드), 4-히드록시-2-메틸-N-(5-메틸-2-티아졸일)-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드 1,1-디옥사이드(멜록시캄), 니클로사마이드 에탄올아민염(NEN), 3-메틸부트-2-에닐 4-메톡시-8-(3-메틸부트-2-에닐옥시)퀴놀린-2-카르복실레이트 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있다.

탈공역제의 하류에는 mTOR, AMPK(AMP-activated protein kinase), SIRT1, PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체) 등의 시그널 전달이 있고(도 1), 본 발명의 의약 조성물은, 이들 중 어느 하나를 제어하는 물질을 포함해도 된다. 제어는, 활력화와 불활성화를 포함하는 개념이다.

mTOR, AMPK, SIRT1 및 PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체)를 제어하는 물질에 대해서는 상술하였다.

Foxo1은 mTOR의 하류에 있는 전사 인자이다. mTOR의 활성화에 의해, 인산화되면 핵 내에서 세포질로 이동하고, 전사 개시가 일어나지 않는다. 이에 의해 EOMES가 억제되고, CTL의 활성화에 필요한 T-bet의 발현이 증강된다. (Staron MM et al. Immunity. 41:802-14, 2014. Rao RR et al. 36:374-87, 2012.)

또한, Foxo1은 PGC-1a 결합하고, 당 신생을 촉진하는 유전자 발현을 활성화시킨다. 당 신생은, TCA cycle의 대사 산물을 바탕으로 당이 합성되므로, 산화적 인산화는 억제되는 방향으로 움직인다. 또한, 보고에 의하면, 2형 당뇨병의 모델에서 Foxo1을 억제하면 미토콘드리아 기능 부전이 회복한다. 이것으로부터도 Foxo1을 억제하면 미토콘드리아는 활성화한다고 생각된다. (Coppari R et al. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 3:160-6, 2009. Puigserver P et al. Nature. 423:550-5, 2003.

Foxo1을 제어하는 물질로서는, 5-아미노-7-(시클로헥실아미노)-1-에틸-6-플루오로-4-옥소-1,4-디히드로퀴놀린-3-카르복실산, 2-시클로펜틸-N-{2,4-디클로로-3-[(이소퀴놀린-5-일옥시)메틸]페닐}-N-메틸아세트아미드 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있다.

아미노산으로서는 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 티로신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 트레오닌, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 오르니틴, 시트룰린 및 그것들의 유사체를 예시할 수 있다. 아미노산은 1종이라도, 2종류 이상의 조합이어도 된다. 아미노산은 L-아미노산, D-아미노산 또는 DL-아미노산 중 어느 것이어도 된다. PD-1을 저해하면, 아미노산 등의 메타보라이트는 동화 작용(세포 증식)이 심해지고, 소비된다. 거기에, 세포 등의 골격이 되는 아미노산을 넣으면, 추가로 세포 증식이 진행한다고 생각된다. 아미노산이 보급되어서 세포 증식이 빨라지면, mTOR는 활성화하는 방향으로 간다. 예를 들어, 아미노산 제재인 아미노레반(Aminoleban)은 mTOR를 활성화한다는 보고가 있다(Tamanna N, Mahmood N. Int Sch Res Notices. 2014:235619, 2014). 후술하는 실시예에 있어서, 아미노레반에 PD-L1 항체 치료와의 상승 효과가 보였으므로, 아미노레반에 포함되는 아미노산 중 1종 또는 2종 이상의 조합이 바람직하다고 생각된다.

상술한 (i) 내지 (iii)의 물질은, 염의 형태여도 된다. 염은, 의약적으로 허용되는 것이면 되고, 그러한 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염; 암모늄염과 같은 무기염, t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기 염 등의 아민염; 불화수소산염, 염산염, 브롬화수소산염, 옥화수소산염과 같은 할로겐 원자화 수소산염, 질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염; 메탄술폰산염, 트리플루오로메탄술폰산염, 에탄술폰산염과 같은 저급 알칸술폰산염, 벤젠술폰산염, p-톨루엔술폰산염과 같은 아릴술폰산염, 아세트산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 시트르산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염; 글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루탐산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있다. 이들의 염은, 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

또한, 상술한 (i) 내지 (iii)의 물질 및 그의 염은 물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등의 용매와 용매화물을 생성해도 된다. 또한, 용매화물은, 단독의 것이어도, 복수종의 혼합물이어도 된다.

본 명세서에 있어서, 「유사체」란, 큰 구조 변화를 필요로 하지 않고, 조금 측쇄 등을 추가 변경한 동등한 효과를 나타내는 물질을 말하고, 의약품에 있어서의 리드 화합물의 유도체, 활성 대사물에 대한 프로드러그, 프로드러그에 대한 활성 대사물 등을 포함하는 개념이다. 프로드러그로서는, 활성인 화합물의 아미노기가 아실화, 알킬화, 인산화된 화합물(예를 들어, 활성인 화합물의 아미노기가 에이코사노일화, 알라닐화, 펜틸아미노카르보닐화, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메톡시카르보닐화, 테트라히드로푸라닐화, 피롤리딜메틸화, 피발로일옥시메틸화, t-부틸화된 화합물 등), 활성인 화합물의 히드록실기가 아실화, 알킬화, 인산화, 붕산화된 화합물(예를 들어, 활성인 화합물의 히드록실기가 아세틸화, 파르미트일화, 프로파노일화, 피발로일화, 스크시닐화, 푸마릴화, 알라닐화, 디메틸아미노메틸카르보닐화된 화합물 등), 활성인 화합물의 카르복시기가 에스테르화, 아미드화된 화합물(예를 들어, 활성인 화합물의 카르복시기가 에틸에스테르화, 페닐에스테르화, 카르복시메틸에스테르화, 디메틸아미노메틸에스테르화, 피발로일옥시메틸에스테르화, 에톡시카르보닐옥시에틸에스테르화, 프탈리딜에스테르화, (5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸에스테르화, 시클로헥실옥시카르보닐에틸에스테르화, 메틸아미드화된 화합물 등) 등을 예시할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 「PD-1 시그널」이란, PD-1이 담당하는 정보 전달 기구를 말하고, 그 하나로서, PD-1이 그 리간드인 PD-L1, PD-L2와 공동하여, T세포의 활성화를 억제하는 정보 전달 기구를 예시할 수 있다. PD-1(Programmed cell death-1)은, 활성화한 T세포나 B세포에 발현하는 막 단백질이고, 그 리간드인 PD-L1과 PD-L2는, 단구나 수상 세포 등의 항원 제시 세포, 암 등 여러 가지 세포에 발현한다. PD-1, PD-L1 및 PD-L2는, T세포의 활성화를 억제하는 억제 인자로서 작용한다. 어느 종류의 암세포나 바이러스 감염 세포는, PD-1의 리간드를 발현함으로써, T세포의 활성화를 억제하고, 숙주의 면역 감시로부터 도피하고 있다.

PD-1 시그널 저해제로서는, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 특이적으로 결합하는 물질을 들 수 있고, 그러한 물질로서는, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 핵산(천연형 핵산, 인공 핵산을 포함함), 저분자 유기 화합물, 무기 화합물, 세포 추출물, 동식물이나 토양 등으로부터의 추출물 등이 있을 수 있다. 물질은, 천연물이어도, 합성물이어도 된다. 바람직한 PD-1 시그널 저해제는 항체이고, 보다 바람직하게는, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체 등의 항체이다. 항체는, PD-1 시그널을 저해할 수 있는 것이면 되고, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, 인간화 항체, 인간형 항체 중 어느 것이어도 된다. 그것들의 항체의 제조 방법은 공지이다. 항체는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 모르모트 등, 어느 쪽의 생물에서 유래되는 것이어도 된다. 또한, 본 명세서에 있어서, 항체란, Fab, F(ab)'₂, ScFv, Diabody, VH, VL, Sc(Fv)₂, Bispecific sc(Fv)₂, Minibody, scFv-Fc monomer, scFv-Fc dimer 등의 저분자화된 것도 포함하는 개념이다.

본 발명의 의약 조성물은, 항암제, 감염증 치료제 또는 그들의 조합으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물을 항암제로서 투여하는 경우, 대상으로 되는 암 또는 종양으로서는, 백혈병, 림프종(호지킨병, 비호지킨 림프종 등), 다발성 골수종, 뇌종양, 유방암, 자궁체암, 자궁경암, 난소암, 식도암, 위암, 충수암, 대장암, 간암, 담낭암, 담관암, 취장암, 부신암, 소화관간질종양, 중피종, 머리경부암(후두암 등), 구강암(구강저암 등), 치은암, 설암, 볼 점막암, 타액선암, 부비강암(상악동암, 전두동암, 사골동암, 접형 골동암 등), 갑상선암, 신장암, 폐암, 골육종, 전립선암, 정소 종양(고환암), 신장 세포암, 방광암, 횡문근육종, 피부암(기저세포암, 유극세포암, 악성흑색종(멜라노마), 일광각화증, 보웬병, 파제트병 등), 항문암 등이 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물을 감염증 치료제로서 투여하는 경우, 대상으로 되는 감염증으로서는, 세균 감염증(연쇄 구균(A군 β용련균, 폐렴구균 등), 황색 포도상구균(MSSA, MRSA), 표피 포도상구균, 장구균, 리스테리아, 수막염구균, 임균, 병원성 대장균(0157: H7 등), 클렙시엘라(폐렴간균), 프로테우스균, 백일해균, 녹농균, 세라티아균, 시트로박터, 아시네토박터, 엔테로박터, 마이코플라즈마, 클로스트리디움 등에 의한 각종 감염증, 결핵, 콜레라, 페스트, 디프테리아, 이질, 성홍열, 탄저, 매독, 파상풍, 한센병, 레지오넬라 폐렴(재향군인병), 렙토스피라, 관절염, 급성 열성 질환, Q열 등), 리케차 감염증(발진티푸스, 트트감시병, 일본 붉은반점 열 등), 클라미디아 감염증(트라코마, 성기 클라미디아 감염증, 오움병 등), 진균 감염증(아스페르길루스증, 칸디다증, 클립트코카스증, 백선균증, 히스토플라즈마증, 뉴모시스티스 폐렴 등), 기생성 원충 감염증(아메바이질, 말라리아, 톡소플라스마증, 리슈마니아증, 크립토스포리디움 등), 기생성 연충 감염증(에키노코쿠스증, 일본주혈흡충증, 필라리아증, 회충증, 광절열두조충증 등), 바이러스 감염증(인플루엔자, 바이러스성 간염, 바이러스성 수막염, 후천성 면역 부전 증후군(AIDS), 성인 T세포성 백혈병, 에볼라 출혈열, 황열, 감기 증후군, 광견병, 사이토메갈로바이러스 감염증, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS), 진행성 다소성 백질뇌증, 수두, 대상포진, 바이러스에 의한 유아 전염병, 뎅기열, 전염성 붉은반점, 전염성 단핵구증, 천연두, 풍진, 급성 회백 골수염(폴리오), 홍역, 인두 결막열(풀열), 마르부르크 출혈열, 한타위르스 신장 출혈열, 라사열, 유행성 이하선염, 웨스트 나일열, 헤르팡지나, 치쿤구니야열 등) 등이 예시되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물은, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하고, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에 투여된다.

(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,

(iii) 아미노산

본 발명의 의약 조성물에 있어서, PD-1 시그널 저해제와, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 병용 또는 합제화할 수 있다.

PD-1 시그널 저해제와, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 병용하는 경우, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 따로따로 투여되면 된다.

PD-1 시그널 저해제와, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 합제화하는 경우, PD-1 시그널 저해제와, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는 배합제로 하면 된다.

본 발명의 의약 조성물은, 전신 또는 국소적으로, 경구 또는 비경구로 피험자 또는 피검 동물에 투여된다.

PD-1 시그널 저해제(예를 들어, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체)는 PBS 등의 완충액, 생리 식염수, 멸균수 등에 용해하고, 필요에 따라 필터 등으로 여과 멸균한 후, 주사 또는 점적에 의해 피험자 또는 피검 동물에 투여하면 된다. 또한, 이 용액에는, 첨가제(예를 들어, 착색제, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 용해 보조제, 안정화제, 보존제, 산화 방지제, 완충제, 등장화제 등) 등을 첨가해도 된다. 투여 경로로서는 정맥, 근육, 복강, 피하, 피내 투여 등이 가능하다.

PD-1 시그널 저해제(예를 들어, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체)의 제제 중에 있어서의 함량은, 제제의 종류에 따라 상이하지만, 통상 1 내지 100중량％, 바람직하게는 50 내지 100중량％이다. 제제는, 단위 투여 제제에 제제화하면 된다.

PD-1 시그널 저해제(예를 들어, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체)의 투여량, 투여의 횟수 및 빈도는, 피험자 또는 피검 동물의 증상, 연령, 체중, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 상이하지만, 예를 들어 통상, 성인 한 사람당, 유효 성분의 양에 환산하여, 0.1 내지 100mg/kg 체중, 바람직하게는 1 내지 10mg/kg 체중을 적어도 1회, 원하는 효과를 확인할 수 있는 빈도로 투여하면 된다.

상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질은, PD-1 시그널 저해제를 포함하는 제제에 함유시켜도 되지만, 단독으로, 또는 부형제 또는 담체와 혼합하여, 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 액제, 시럽, 에어로졸, 좌제, 주사제 등에 제제화해도 된다. 부형제 또는 담체는, 당 분야에서 상투적으로 사용되고, 의약적으로 허용되는 것이면 되고, 그 종류 및 조성은 적절히 변경된다. 예를 들어, 액상 담체로서는 물, 식물성 기름 등이 사용된다. 고체 담체로서는 유당, 백당, 포도당 등의 당류, 바레이쇼 전분, 옥수수 전분 등의 전분, 결정 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체 등이 사용된다. 스테아르산 마그네슘 등의 활택제, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 결합제, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 붕괴제 등을 첨가해도 된다. 기타, 항산화제, 착색제, 교미제, 보존제 등을 첨가해도 된다.

상기의 (i) 내지 (iii)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질은, 경구, 경비, 직장, 경피, 피하, 정맥 내, 근육 내 등의 다양한 경로에 의해 투여할 수 있다.

상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 제제 중에 있어서의 함량은, 제제의 종류에 따라 상이하지만, 통상 1 내지 100중량％, 바람직하게는 50 내지 100중량％이다. 예를 들어, 액제의 경우에는, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 제제 중에 있어서의 함량은, 1 내지 100중량％가 바람직하다. 캡슐제, 정제, 과립제, 산제의 경우에는, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 제제 중에 있어서의 함량은, 통상 약 10 내지 100중량％, 바람직하게는 50 내지 100중량％이고, 잔부는 담체이다. 제제는, 단위 투여 제제에 제제화하면 된다.

상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 투여량, 투여의 횟수 및 빈도는, 피험자 또는 피검 동물의 증상, 연령, 체중, 투여 방법, 투여 형태 등에 따라 상이하지만, 예를 들어 통상, 성인 한 사람당, 유효 성분의 양에 환산하여, 0.005μg(또는 ml) 내지 25000mg(또는 ml)/kg 체중 정도를 적어도 1회, 원하는 효과를 확인할 수 있는 빈도로 투여하면 된다. 각 약제(물질)의 투여량에 대해서, 적당한 범위, 바람직한 범위, 및 보다 바람직한 범위를 하기의 표에 나타내지만, 이들 값에 한정되는 것은 아니다.

(표)

PD-1 시그널 저해제(예를 들어, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체)와 ROS 발생제 또는 그의 하류 시그널을 제어하는 물질의 비율(질량)은 1:0.1 내지 1:100이 적당하고, 바람직하게는 1:1 내지 1:50이다.

PD-1 시그널 저해제(예를 들어, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체)와 탈공역 작용을 나타내는 물질 또는 그의 하류 시그널을 제어하는 물질의 비율(질량)은 1:0.01 내지 1:10이 적당하고, 바람직하게는 1:0.1 내지 1:1이다.

PD-1 시그널 저해제(예를 들어, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 항PD-L2 항체)와 아미노산의 비율(질량)은 1:0.001 내지 1:100이 적당하고, 바람직하게는 1:0.01 내지 1:10이다.

본 발명은 또한, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 의약적으로 유효한 양으로 피험자 또는 피검 동물에 투여하는 것을 포함하는 암, 감염증 또는 그들의 조합의 치료 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 암, 감염증 또는 그들의 조합의 치료를 위한, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 사용이며, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 투여되는 상기 사용을 제공한다. 또한, 본 발명은 암, 감염증 또는 그들의 조합을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 사용이며, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 투여되는 상기 사용도 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는, PD-1 시그널 저해 활성을 증강하는 약제를 제공한다.

본 발명의 약제는, PD-1 시그널 저해제와의 병용약 또는 배합제로서 사용할 수 있다. PD-1 시그널 저해제와, 상기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질과의 병용 및 합제화에 대해서는, 상술하였다. 본 발명의 약제는, 의약으로서의 용도 외에, 실험 시약으로서도 이용할 수 있다.

어떤 물질이 ROS 발생제인지의 여부를 조사하기 위해서는, 세포(예를 들어, 마우스 비장 세포)에 그 물질을 시험관 내에서 첨가하고, 세포 내의 ROS의 농도를 측정하면 된다. 어떤 물질이 탈공역 작용 또는 그의 하류 시그널을 제어하는 작용을 갖는지의 여부를 조사하기 위해서는, 세포(예를 들어, 마우스 비장 세포)에 그 물질을 시험관 내에서 첨가하고, 세포 내의 미토콘드리아의 프로톤 구배를 세포 내 염색 후 플로우 사이토미터로 측정하거나, 또는 Seahorse를 사용하여 직접 측정하면 된다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

〔실시예 1〕

[요지]

PD-1 저해에 의한 암 면역 치료에 의해, 암 환자의 생존율은 극적으로 향상되었다. 그러나, 어느 일정한 환자에게는 불응답이다. PD-1 저해와 다른 병용제와의 병용 요법은 면역 치료 효과를 개선한다고 생각된다. 본 발명자들은, 마우스 암 치료 모델을 사용하여, 소속 림프절에 출현하는 암 반응성 세포 장애성 T세포(tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes: TR CTLs)가 큰 미토콘드리아 체적과, 높은 막 전위, 그리고 높은 활성 산소(ROS) 산생을 갖고 있는 것을 알아내었다. 또한 ROS 발생제 또는, 탈공역제에 의한 미토콘드리아 유래 ROS에 의해, CD8⁺CD44⁺CD62L^- T세포가 소속 림프절과 종양 내에서 증가하고, PD-1 저해에 의한 항종양 효과가 증강되는 것을 실증하였다. 또한, 레스베라트롤을 포함하고, mTOR, AMPK, SIRT 등의 메타볼릭 센서를 직접 활성화시키는 시약이 PD-1 저해 치료 효과를 증강하여, 장기에 걸쳐 종양을 억제하는 것을 밝혔다. 중요하게도 이들 병용 치료약 단독으로는 항종양 효과를 나타내지 않았다.

[서언]

PD-1 저해에 의한 면역 요법은 암 치료에 혁신적인 임팩트를 초래하였다. 그 특징으로서, 여러 가지 암종에 높은 효과가 있는 것, 장기적으로 항종양 효과가 이어지는 것, 그리고 부작용이 적은 것을 들 수 있다⁹ ^{, 10,} ¹¹. 활성화 T세포의 표면 수용체로서 발현하는 PD-1은 면역 응답에 있어서, 억제 인자로서 작용한다. PD-1은 2개의 리간드인 PD-L1 또는 PD-L2와 결합하여, ITSM 중의 티로신 잔기를 인산화하고, 티로신호스파타제인 SHP-2가 리크루트 된다. SHP-2에 의해, T세포 수용체의 활성화에 의해 인산화하고 있었던 Zap70 등의 활성화 시그널 전달 분자가 탈인산화되어, T세포의 활성화가 억제된다¹² ^, ¹³. 동물 실험에서 PD-1 결손 마우스가 자기 면역 질환을 발병한 것으로부터, PD-1에 의한 면역 제어 기능이 확인된다¹⁴ ^{, 15,} ¹⁶. 이와 같이 PD-1은 면역 체크 포인트로서 작용하고, 자기 면역 관용을 일으키는 것을 알 수 있었다.

본 발명자들은, PD-1의 기본적인 역할을 해명하고, PD-1의 특성을 이용하여 암이나 감염증에 대한 면역 응답을 보조할 수 있는 것을 밝혀왔다¹⁷ ^, ¹⁸. 실제로, 악성 흑색종에 대한 임상 시험의 결과가 2010년에 발표되고 나서¹⁹, 지금까지 여러 가지 암종에 대한 PD-1 저해 요법에 의한 임상 시험이 행해져 왔지만, 그 대부분 모두에 있어서 놀라울 정도의 효과를 나타내고 있다²⁰. 현재, PD-1 저해 요법은 악성 흑색종이나 비소 세포 폐암, 신장 세포암으로 보험 적응의 인가가 내려져 있다. PD-1 저해 요법은 지금까지의 면역 요법뿐만 아니라 실제로 사용되고 있는 표준적인 화학 요법과 비교해도, 극적으로 암 환자의 생존율을 들고 있다. 그러나 유감스럽게도, 30-50％ 정도의 환자는 아직 PD-1 저해 요법에 불응답이다. 이 불응례를 극복하기 위해서, PD-1 저해 요법과 다른 면역 체크 포인트 인자인 Lag3이나 Tim3, 암 백신, 방사선 치료, 저용량의 화학 요법 등이 병용되어 왔다²¹. 그러나, 지금까지 병용 요법에 의해 유의한 상승 효과가 인정되었다는 보고는 아직 없다.

본 발명자들은, 2002년에 동물 모델에서 PD-1 저해 요법의 암 치료 효과를 확립했지만¹⁷, PD-1 저해 요법에 의한 살종양 효과나 면역 관용 상태의 해제가 어떤 기서로 일어나고 있는지 아직 해명되어 있지 않다. 예를 들어, 체크 포인트 저해제에 의한 면역 요법에 있어서는 주로 암 특이적 변이 항원이 타깃이 되고 있지만²² ^{, 23}, 이펙터 T세포가 활성화되는 부위는, 종양 부위인지 소속 림프절인지 불분명하다. 또한 PD-1 항체 치료에 의해 종양이 근절될 때, 어떤 시그널이 종양 부위에 이펙터 T세포를 유주시키고 있는 것인지 불분명하다. 또한, 종양 반응성 세포 상해성 T세포와 종양 비반응성 T세포를 식별하는 방법이나, PD-1 시그널의 차단이 어떻게 종양 반응성 세포 상해성 T세포의 활성화·분화 상태에 영향을 미칠지에 있어도 대부분 알고 있지 않다. 나아가, PD-1 저해 요법으로 치료된 암 환자에 있어서, PD-1 시그널의 차단에 의해 활성화된 면역 감시 기구가 왜 수년에 걸쳐 계속되는 것인지도 수수께끼인 채이다²⁴ ^{, 25}.

PD-1 저해 요법을 더 효과적으로 하는 새로운 치료 전략을 확립하기 위해서는, 상기의 몇 가지의 문제에 대답을 내지 않으면 안된다. 그래서, 이펙터 기능에 필요한 대사 리프로그래밍에 주목하여, 종양 반응성 세포 상해성 T세포를 해석하였다^{1, 2, 3, 26,} ²⁷. 흥미롭게도, PD-1 저해 요법 하에서 소속 림프절로부터 추출한 종양 특이적 세포 상해성 이펙터 T세포는, 보다 큰 미토콘드리아의 질량, 더 높은 막 전위 및 높은 미토콘드리아의 활성 산소종(ROS)을 나타내었다. 이들의 결과는, PD-1 시그널을 차단함으로써 미토콘드리아의 활성이 증가하는 것을 나타내고 있고, 지금까지 보고된 in vitro에서의 보고와 일치한다²⁸ ^{, 29}.

이들의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 이펙터 T세포에 있어서의 미토콘드리아의 기능 자극이 PD-1 차단 요법에 있어서의 항종양 효과의 증강을 초래한다는 가설을 세웠다. 실제로, 에너지 대사 센서인 AMP-activated Protein Kinase(AMPK)나 SIRT1, Mechanistic Target Of Rapamycin(mTOR)을 활성화하는 약제가 PD-1 차단 요법과의 상승적인 항종양 효과를 나타내었다. 이들의 지견은, PD-1 저해 요법에 대한 효과가 약한 환자에 대한 병용 요법의 개발 위한 길을 개방할지도 모른다.

[결과]

PD-1 차단에 의한 DLN에 있어서의 종양 반응성 CD8 양성 T세포의 미토콘드리아 활성의 증대.

T세포의 활성화에 수반하여, 급격한 세포 증식에 필요한 인자가 신속히 공급될 필요가 있다. 그래서 본 발명자들은 PD-1 저해에 의해 유도되는 종양 반응성 CD8 양성 T세포의 대사 변화를 소속 림프절에 있어서 검토하기로 하였다. PD-1 저해 요법의 메커니즘 해명에 있어서의 하나의 문제로서, PD-1 차단에 의해 여러 가지 종양 항원에 반응하는 다양한 T세포 수용체 레파토리를 가진 CTL이 발생하기 때문에, 종양 반응성 세포 상해성 T세포(TR CTLs)의 포괄적 동정이 곤란하다는 점을 들 수 있다^30, ³¹. 이 문제를 해결하기 위해서, CellTrace로 표지한 CD45.1 양성 CD8 양성 T세포를 CD45.2 양성 CD8KO 마우스에 이식하였다. 그 후, 종양 반응성 CD8 양성 T세포가 선택적으로 활발하게 증식한다고 추측하고, 소속 림프절에 있어서의 표지한 T세포의 증식을 검토하였다(도 2의 a). MC38 담암 마우스에 있어서, 이식된 CD45.1 양성 CD8 양성 T세포는, 활발하게 분열하는 세포군(고분열군)과 분열이 적은 세포군(저분열군)으로 나뉘였다(도 2의 b). 담암 마우스에 있어서의 CD45.1 양성 CD8 양성 T세포의 고분열군의 절대 수나 비율은, 컨트롤 항체 IgG를 투여한 군과 비교하여 PD-L1 항체로 치료된 군에서 증가하고 있었다(도 2의 b). 특필해야 하는 것으로 PD-L1 항체는 비담암 마우스에서는 상기의 증식에 차가 보이지 않았다. 이에 의해 격렬하게 분열을 일으킨 CD8 양성 T세포는 실제로 종양 항원에 의해 활성화 가능성이 높은 것이 나타났다(도 2의 b). 또한, 소속 림프절에 있어서의 CD45.1 양성 CD8 양성 T세포 중에서, PD-L1 저해에 의해 초래된 고분열군의 분획에, MC38의 변이 에피토프인 mLama4 펩티드/MHC 사량체 양성 세포군이 검출되었다(도 2의 c). 따라서, 활발하게 증식하고 있는 세포군에는 TR CTLs가 많이 포함되어 있다고 생각되었다.

이어서, 본 발명자들은 소속 림프절에 있어서 강하게 증식하고 있는 TR CTL의 대사 기능을 조사하였다. 미토콘드리아의 대사는 T세포의 활성화뿐만 아니라 계속적인 T세포의 증식이나 기억 T세포의 형성에도 중요하다고 여겨지고 있기 때문에, 본 발명자들은 TR CTLs에 있어서의 미토콘드리아의 기능에 대하여 착안하였다²⁶ ^, ³². CD8 양성 T세포 중 고분열군은 저분열군에 비하여, 미토콘드리아의 질량이 크고, 막 전위가 높고, 미토콘드리아의 활성 산소종(ROS)의 산생이 많았던 점에서³³, PD-1 차단에 의해 TR CTLs에서 미토콘드리아가 활성화하고 있는 것이 밝혀졌다(도 2의 d). 상기의 결과와 일치하고, 미토콘드리아의 호흡 지표인 OCR(산소 소비 속도)과 ATP의 기본적 사용량은, PD-L1 항체로 치료된 마우스의 소속 림프절에 있어서의 CD8 양성 T세포로 현저하게 높았다(도 2의 e-f)³⁴. 이들의 결과로부터, PD-1 차단 치료에서는 TR CTLs의 증식에 따라 미토콘드리아의 대사 속도가 오르는 것이 증명되었다.

ROS는 PD-1 차단에 의한 항종양 활성을 증강하기 위하여 필요하다.

상기에 나타낸 바와 같이, ROS는 PD-L1 항체 치료에 의해 현저하게 증가한다. ROS는 미토콘드리아의 전기 전달계(ETC)의 복합체 I, 복합체 II, 복합체 III에 있어서 발생한다³⁵. 그리고 미토콘드리아의 ROS는 T세포의 항원성 확장을 위한 시그널 전달 인자로서도 기능한다²⁶ ^, ³². 한편으로, 외인성의 ROS나 그 발생원은, 종양 세포를 직접 손상하는 것이 알려져 있고, 암 치료약 후보로서 생각되어 왔다³⁶. 이들의 2개를 고려하여, 본 발명자들은 먼저 ROS 발생제가 단독으로 살종양 효과를 가지는지 시도하기로 하였다. ROS의 전구체인 tert-부틸히드로페록시드 용액(Luperox)을 MC38 항암 마우스에 투여했지만, 항종양 효과는 인정되지 않았다(도 3의 a). 또한, Luperox 단독으로 in vivo 처리한 종양 세포의 면역 제어 표면 마커 및 전사 프로필의 유의한 변화가 없는 것을 확인하였다(도 12). 그러나, PD-L1 항체와 병용하면 항종양 효과를 현저하게 강화하고, 항암 마우스의 생존율이 연장되었다(도 3의 b, c). 이들의 데이터로부터, Luperox는 종양 세포로의 직접적인 작용이 아닌 T세포의 활성화를 개재하여, PD-L1 항체의 항종양 효과를 높이고 있는 것이 시사되었다. 직접적인 미토콘드리아 ROS 발생제인 Paraquat도 PD-1 저해의 효과를 증강하였다(도 13의 a, b). 컨트롤로서 미토콘드리아를 불안정화시켜 ATP 합성을 저해하는 약제인 올리고마이신과 카르보닐시아니드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP), 2,4-디니트로페놀(DNP)을 투여하였다³⁷. 그러자 예상 외로, 미토콘드리아의 탈공역제인 FCCP과 DNP는 PD-L1 항체 치료의 효과를 증강시켜, PD-L1 단독 투여군과 비교하여 마우스 모델의 생존율을 현저하게 올렸다(도 4의 a). 중요하게도, Leuperox와 마찬가지로, FCCP와 DNP도 단제 투여에서는 항종양 효과를 나타내지 않고, 종양 세포로의 직접적인 작용을 갖지 않고 PD-L1 항체의 항종양 효과를 높이고 있는 것을 알 수 있었다(도 4의 b). 또한, FCCP을 단독 투여한 마우스로부터 채취한 종양 세포의 표면형 분석, 전사 프로파일 해석에서는 유의 차가 나타나지 않고, 이것은, 탈공역제는 종양을 직접 살상하는 것은 아니고, 종양을 살상하는 킬러 T세포의 기능을 증강하고 있는 것을 나타낸다(도 12). 미토콘드리아의 탈공역(언커플링)은 미토콘드리아 막 전위를 저하시킬 때에 ROS를 감소시킴으로써, 산화적 손상으로부터 보호하는 역할이 있다고 생각되고 있었기 때문에, FCCP와 DNP의 항종양 효과에 있어서의 상승 효과는 예상 외였다³⁷. 애당초, 탈공역제는 미토콘드리아의 ROS 산생을 감소 또는, 증가시킨다는 상반되는 보고가 있다³⁸ ^, ³⁹. 본 발명자들은 PD-L1 항체와 탈공역제의 병용 요법의 효과가 MnTBAP(ROS 소거 효과를 갖는 합성 메탈로포르피린)의 투여에 의해 억제되는 것을 확인하였다(도 4의 c). 이에 의해 탈공역제의 상승 효과는 ROS 시그널을 개재하는 것인 것이 밝혀졌다. 이상하게도 PD-L1 항체와 DNP, Luperox의 3제 병용에서는 강한 항종양 효과를 인정하였다(도 5). 이것은 탈공역제가 ROS 이외의 어떤 경로에서도 PD-1 저해의 효과를 높이고 있을 가능성을 시사하고 있다.

탈공역제는 , DLN에 있어서의 CD62L 음성 CD44 양성 이펙터 T세포의 생성을 촉진하고, 종양 부위에서의 그것들의 집적을 증강한다.

그럼, 어떻게 언커플러는 ROS를 개재하여 PD-L1 항체의 항종양 면역을 높이고 있는 것일까? 이 의문에 대답하기 위해, 본 발명자들은 먼저 소속 림프절과 종양 부위의 양쪽에서의 CD8 양성 T세포의 구획을 조사하였다. 도 6의 a에 도시하는 바와 같이 소속 림프절에 있어서는, 이펙터 CD8 양성 T세포(CD62L 음성 CD44 양성: P3 게이트)의 절대 수나 비율은, PD-L1 항체와 FCCP의 병용 요법군 쪽이 PD-L1 항체 단독군보다 현저하게 증가하고 있었다. 대조적으로, 나이브 T세포(CD62L 양성 CD44 음성: P1 게이트)와 센트럴 기억 T세포(CD62L 양성 CD44 양성: P2 게이트)는, PD-L1 항체 단독으로는 증가했지만, FCCP을 첨가해도 그 이상의 증가는 없었다(도 6의 a). 중요한 포인트는, 어느 치료군에서의 P3 세포군에서도 P1이나 P2 세포군에 비하여, 세포당의 미토콘드리아의 질량, 막 전위가 높고, ROS가 많았던 것과, 막 전위와 ROS 산생에 대해서는 FCCP와의 병용 요법에서 유의하게 증가하고 있었던 것이다(도 6의 b). 이들 현상으로부터, a) 사용한 FCCP의 용량에서는 미토콘드리아의 질량 저하나 막 전위의 하락은 없고, 독성은 없었던(보다 높은 용량에서는 독성이 예상된다) 것, b) 증가하고 있었던 P3 세포군에서 높은 미토콘드리아 ROS 산생을 인정하는 점에서, 탈공역제에 의한 상승 효과는 ROS를 개재하고 있는 것, c) 마일드한 미토콘드리아 손상의 피드백이 오히려 미토콘드리아 활성을 증강할 가능성이 있는 것이 시사되었다(도 6의 b).

특필해야 하는 것으로, 소속 림프절에서의 이러한 변화에 수반하여, 종양 내에 침윤하고 있는 CD8 양성 T세포에서도 P3 세포군은 현저하게 증가하고 있었다(도 6의 c). 이들 결과로부터 PD-L1 항체와 탈공역제의 병용 요법은, 소속 림프절과 그 타깃인 종양 부위의 양쪽에 있어서, 이펙터 CD8 양성 T세포의 사이즈나 기능성을 증강시키는 효과가 밝혀졌다.

에너지 대사 센서의 AMPK와 mTOR는 탈공역제의 면역 증강 효과에 관여하고 있다.

AMPK와 mTOR는 상반하는 에너지 대사 센서인데, 인산화 AMPK와 mTOR의 밸런스가 CD8 양성 T세포의 분화를 제어하고 있다고 여겨지고 있다¹ ^{, 40, 41, 42, 43,} ⁴⁴. 탈공역제에 의한 AMP/ATP비의 증가가, AMPK를 활성화하는 것을 알 수 있는 점에서⁴⁵, 본 발명자들은 PD-L1 항체와 탈공역제의 병용 요법으로 치료한 항암 마우스의 소속 림프절에 있어서의 CD8 양성 T세포의 AMPK와 mTOR의 인산화 상태를 조사하였다. PD-L1 항체와 DNP 또는 FCCP의 병용 요법으로 치료된 마우스로부터 채취한 CD8 양성 T세포에서는, AMPK와 그것에 관련한 단백인 ACC와 SIRT1이 병용 요법 후의 복수의 시점에서 활성화되고 있었다(도 7의 a). 그러나, 예상 외로, mTOR와 그 관련 단백인 S6K와 4EBP1도 또한 병용 요법 후에 활성화되고 있었던 것이다(도 7의 a).

그러나, 이 불가해한 결과는, 소속 림프절에 있어서의 CD8 양성 T세포 중에 AMPK/mTOR 밸런스가 다른 세포가 불균일하게 혼재하고 있음으로써 설명된다. 실제로, P2 세포군에서는 p-AMPK가 p-mTOR보다 상승하고 있었지만, P3 세포군에서는 p-mTOR쪽이 p-AMPK보다 높았다(도 8). 이들의 결과에 기초하여, 다음으로 mTOR과 AMPK 어느 쪽을 직접적으로 활성화시키면 PD-1 저해 요법의 효과를 증강할 수 있는지 검토하였다. 도 7의 b에 도시하는 바와 같이, mTOR 활성제도 AMPK 활성제도 조기(day20 이전)에서는 PD-1 저해 요법의 효과를 약간 증강한 것에 대해, mTOR 활성제와 AMPK 활성제의 3제 병용에서는 PD-L1 항체의 효과를 증강하여 생존율을 개선시켰다. 이들의 결과는, mTOR와 AMPK의 양쪽의 활성화가, PD-L1 항체와 탈공역제의 상승적인 살종양 활성에 관여하는 것을 나타내고 있다.

PD-L1 항체와 탈공역제의 병용 요법은 SIRT1을 증가시킴으로써(도 7의 a), NAD 의존성 단백 탈아세틸화 효소인 SIRT1의 활성화가 PD-L1 항체 치료의 효과에 영향이 있는지 조사하였다. 종양 억제 효과를 가질 가능성이 있는 것이 보고되어 있는 폴리페놀의 1종, 레스베라트롤에서 SIRT1은 활성화하는 것이 보고되어 있다⁶ ^, ⁴⁶. 또한 저용량의 레스베라트롤은, SIRT1 의존성적으로 AMPK 활성화와 미토콘드리아의 생합성을 야기하는 것이 보고되어 있고⁶, 또한 특정한 조건 하에서는 mTOR 경로를 보조하는 것도 보고되어 있다⁴⁷ ^{, 48,} ⁴⁹. 실제로, PD-L1 항체와 레스베라트롤의 병용 요법에서는 PD-L1 단독 치료에 비해, 현저하게 종양 사이즈의 감소와 생존율의 연장을 인정했다(도 7의 c). 이 결과로부터 PD-L1 항체와 에너지 대사 센서인 AMPK나 mTOR, SIRT1의 활성화 병용은, 생체 내에서의 TR CTL의 증식이나 기능성을 증강시키는 것이 밝혀졌다.

PGC - 1α 활성제는 PD-1 항체의 치료 효과를 증강한다

PGC-1α는, AMPK나 mTOR에 의해 조절되는 전사 보인자이고, 미토콘드리아의 생합성이나 산화적 인산화를 증강시키는 인자이다⁴⁵ ^, ⁴⁶. FCCP이나, mTOR 활성제, AMPK 활성제와 PD-L1 항체의 병용 치료에서는, 단백질과 mRNA에 있어서의 PGC-1α의 발현이 증가하고 있고, 지금까지의 보고와 모순되지 않는 결과였다(도 11의 a)³⁷ ^{, 45,} ⁴⁶. PD-L1 항체만 투여한 경우, 단백질에서의 PGC-1α의 발현은 증가했지만, mRNA에서의 PGC-1α의 발현이 감소하고 있었다. 이것은 PGC-1α의 조절에는 전사, 번역 및 단백질 안정성 등의 많은 단계가 관계되어 있기 때문이라고 생각된다⁴⁶ ^, ⁴⁷. PGC-1α는, NRFs나 PPARs 등의 전사 인자와 상관함으로써 기능한다⁴⁶. 본 발명자들은 PGC-1α/NRF2의 활성제인 Oltipraz와 PGC-1α/PPARs 활성제인 Bezafibrate가, PD-L1 항체의 항종양 효과를 증강하는지 실험하였다⁴⁸ ^, ²⁹. 결과, Oltipraz와 Bezafibrate는 어느 쪽도 PD-L1 항체의 종양 성장 억제 효과를 증강하고, 항암 마우스의 생존율을 개선하였다(도 11의 b).

MC38 이외의 종양에 있어서의 PD-1 항체의 병용 치료 효과를 조사하기 위해서, 마우스의 피부육종 세포주인 MethA를 BALB/c 마우스의 가죽 내에 이식하고, FCCP나 Paraquat, Oltipraz를 사용한 병용 요법을 시도하였다. 결과, 모든 약제가 PD-L1 항체의 항종양 효과의 증강을 나타내었다(도 14). 이것은, 미토콘드리아 활성제와 PD-1 저해 항체의 병용 치료가 다른 유전자 배경을 갖는 여러 가지 종양에 대하여 효과가 있는 것을 나타내고 있다.

FCCP 또는 Bezafibrate와의 병용 치료는 CTL의 T-bet 발현을 증강한다.

PD-1 저해에 의한 사이토카인 분비나 종양 반응성 CTL의 활성화에 중요한 전사 인자 T-bet는, mTOR에 의해 FOXO1 저해를 개재하여 활성화되는 것이 알려져 있다. 그래서 본 발명자들은, PD-L1 항체와 FCCP의 병용 치료가, T-bet와 Eomes의 발현에 영향을 미치는 것인지 여부를 검토하였다. PD-L1 항체와 FCCP의 병용 요법이 mTOR을 활성화시킨다는 상기의 알아냄과 일치하고, FCCP는 CD8 양성 세포에 있어서 T-bet의 발현을 증가시켰지만, Eomes의 발현은 증가시키지 않았다(도 15의 a). 흥미롭게도, FOXO1이 T-bet와 Eomes를 역방향으로 제어한다는 보고와 일치하여, mTOR의 하류의 전사 인자를 활성화시키는 Bezafibrate도 또한, T-bet를 증가시켜, Eomes를 오히려 감소시켰다(도 15의 a). 또한 병용 치료에서는 킬러 T세포 기능의 하나인 IFN-γ 산생이 종양 내에서 증강하고 있었다(도 15의 b). 이것은 Th1형 면역에 중요한 T-bet의 발현 증강과 일치한다. 이들의 결과는, Bezafibrate가, 아마 미토콘드리아를 활성화하고, 또한 포지티브 피드백이 일어나서, mTOR을 활성화시키는 것을 시사하고 있다. 이상의 결과를 통합하면, 탈공역제와 PD-1 저해와의 상승 효과의 분자 기구는, AMPK나 mTOR과 그 하류의 NRF2나 PPARs를 포함하는 전사 인자나 PGC-1a 등의 공역 인자의 활성화를 개재하고 있다(도 1).

[고찰]

본 발명자들은 PD-L1 항체에 의해 활성화한 TR CTL 등이 미토콘드리아를 활성화시켜 ROS의 산생을 증강하고, 추가로 ROS를 발생시키는 약제가 PD-1 저해의 항종양 효과를 증강시키는 것을 나타내었다. 예상 외로, 2개의 유명한 미토콘드리아의 탈공역제인 FCCP과 DNP도 또한 PD-L1 항체의 항종양 효과를 증강시키는 것이 판명되었다. ROS 스캐빈저가 그 상승 효과를 제거함으로써, 탈공역제의 상승 효과는 ROS의 발생에 의존하고 있는 것은 명확하다. 미토콘드리아의 탈공역제는 ROS의 산생을 누르는 작용이 있기 때문에, 허혈성 손상이나 심부전, 인슐린 저항성, 비만, 노화 등의 산화 스트레스에 관한 질환으로의 치료에 유용하지 않은 것인가라고 생각되고 있었기 때문에, 금회의 결과는 예상 외였다⁵⁰. 탈공역제의 단독 투여는 T 세포의 증식에도 종양 증성에도 영향을 미치지 않은 점에서, 본 연구에서 사용한 최저 용량에서의 탈공역제는 오히려 PD-1 차단에 의해 유발되는 면역학적 사상이나 면역 반응을 보충하는 작용을 가진다는 것을 알 수 있었다.

천연의 폴리페놀인 레스베라트롤은 심혈관 개선 작용이나 안티에이징 효과, 항종양 효과에서 알려져 있지만, 그것은 레스베라트롤이 미토콘드리아 생합성을 유도하고, 병으로부터 보호하는 대사 기능을 유도할 가능성을 나타내고 있다. 본 발명자들은 저용량의 레스베라트롤이 PD-1 저해 치료의 효과를 증강하는 것을 밝혔다. 탈공역제와 마찬가지로, 레스베라트롤은 그것 자신에서는 종양 증식에 관여하지 않거나, 오히려 종양을 증대시켰다. 그러나, PD-L1 항체와 병용함으로써 현저하게 종양의 억제 효과를 나타내고, 동물 모델에서의 생존율을 향상시켰다.

그런데, 어떻게 하여 이들의 약제는 똑같이 PD-1 저해 요법과의 상승 효과를 일으키는 것일까? 미토콘드리아의 에너지 대사는 mTOR나 AMPK를 개재한 세포 내 대사와 밀접하게 관여하고 있다⁵ ^{, 6, 49,} ⁵¹. 본 발명자들은 AMPK 및 그 관련 단백이, PD-L1 항체와 탈공역제의 병용 요법에서 활성화되는 것을 확인하였다. 중요하게도 AMPK 또는 SIRT1의 직접적 활성제의 모두가 PD- L1 항체의 항종양 효과를 증강하였다.

본 발명자들은, 탈공역제와 PD-1 저해의 병용 요법이 AMPK 경로뿐만 아니라 mTOR 경로도 활성화하고, mTOR의 직접적 활성제도 PD-L1 항체의 효과를 증강하는 것을 증명하였다. 지금까지 mTOR 경로의 활성화는 AMPK의 인산화와 경합한다고 여겨지고 있었기 때문에, 이들의 결과는 의외였다¹ ^{, 41, 42, 43,} ⁵². 그러나, 단리한 CD8 양성 T세포가, 다른 활성화 기능 상태뿐만 아니라, 생화학적 반응이나 동적인 변동에 따라 상이한 불균일한 세포로 구성되어 있다고 생각하는 경우, 본 발명자들의 결과는 지금까지의 보고와는 모순되지 않고, 설명할 수 있다. 본 발명자들은 mTOR 경로의 활성화가 PD-L1 저해와 함께 FCCP 또는 Bezafibrate에 의해 자극받은 DLN CTL에서 있어서의 T-bet의 발현을 일으킨다고 생각하고 있다. T-bet는, 종양 퇴치 또는 축소를 위하여 필요한 종말 분화 이펙터 CTL의 공급원이 되는 메모리 프리커서의 분화에 있어서 중요하고, CTL의 항종양 효과에 대해서도 중요하다고 여겨지고 있다⁵⁵ ^, ⁵⁶. 한편으로 EOMES를 강발현하는 종말 분화 CTL은 만성적인 항원 인식에 의해 면역 관용의 상태로 여겨지고 있다⁵⁶ ^, ⁵⁷. 본 발명자들의 실험 결과에서는, FCCP이나 베자피브레이트와 PD-1 항체 치료의 병용에 의해, T-bet와 IFN-γ의 발현이 올라가고, EOMES의 발현은 오히려 저하되었다. 이것은 병용 요법에 의해 미토콘드리아의 활성화를 수반하는 이펙터·메모리 세포군(P3 세포군)이 증가한다는 본 발명자들의 결론과 모순되지 않는 결과이다.

PGC-1α는, 미토콘드리아의 생합성이나 미토콘드리아의 산화적 인산화에 관한 일련의 전사 인자를 조절하는 분자이다. AMPK나 mTOR의 활성화는, PGC-1α의 발현을 증가시켜, 인산화를 개재하여 활성화시킨다. 본 발명자들은 탈공역제와 PD-1 항체의 병용 요법으로 PGC-1α의 발현이 증가하는 것이나, 종양의 치료 모델에서 PGC-1α 활성제(Bezafibrate, Oltipraz)도 또한 PD-L1 항체와 상승적 증강 효과를 갖는 것을 나타내었다. 이 결과에 의해, PGC-1α는 미토콘드리아의 활성화나 확대를 일으키는 중요한 분자이고, 또한 AMPK나 mTOR 활성화의 positive feedback 시그널 전달을 유도하는 중요한 분자인 것을 밝혔다. 또한 탈공역제나 Bezafibrate는 PD-L1 항체와 병용함으로써, mTOR 하류에 위치하는 중요한 사이토카인 조절 인자인 T-bet를 활성화하였다.

지금까지의 기서에 관한 가설의 전체 형상을 도 1에 통합하였다.

a) PD-1 차단에 의해, 활성화 CD8 양성 T세포에 있어서의 미토콘드리아의 확대나 증식이 야기된다.

b) 탈공역제나 ROS 발생제는 미토콘드리아의 체적을 증가시켜, ROS의 증가를 초래한다. 아마 ROS는 무엇인가의 경로에 의해 AMPK와 mTOR를 활성화한다고 여겨지고 있다³⁶.

c) AMPK와 mTOR의 활성화는 PGC-1α의 발현을 증가시켜, 활성화시킨다.

d) 최종적으로, PGC-1α와 그 결합 전사 인자인 NRFs와 PPARs는, 지방산의 산화와 산화적 인산화를 활성화시키는 일련의 전사 인자의 발현을 증가시키고, 또한 CTL의 활성화나 분화를 초래하는 미토콘드리아의 확대를 야기한다.

지극히 최근 들어, PD-1 경로가 미토콘드리아의 활성화와 PGC-1α의 발현을 저해하는 것이 보고되었지만, 이들의 보고도 본 발명자들의 가설과 모순되지 않는다⁶³ ^, ⁶⁴. ROS나 탈공역제, AMPK 활성제, mTOR 활성제, PGC-1α 활성제 등의 본 발명자들이 본 연구에서 사용한 모든 약제는 PD-1 항체와의 병용한 경우에는 미토콘드리아의 활성화나 확대를 개재하여 CD8⁺T세포의 활성화나 분화를 초래했지만, 단제로 투여한 경우에는 동일한 효과는 없었다.

본 발명자들은, PD-1 항체 치료에 불응성의 암 환자에게 응용할 수 있는 혁신적인 병용 요법의 유효성을 지금까지의 결과에 의해 나타내었다. PD-1 치료에 불응성의 종양을 이식한 마우스로부터 추출한 CTL에서는 미토콘드리아의 활성화가 일어나지 않았던 점에서, 본 발명자들의 연구는 PD-1 항체 치료의 유효성을 판정하는 바이오 마커의 연구에도 연결될 수 있다고 생각한다. 금후에는 미토콘드리아의 대사 변화에 따라서 변화하는 혈청 중 메타보라이트량이나, PD-1 항체 치료 전후에서 수집한 샘플에 있어서의 CD8⁺ T세포의 OCR 활성, 미토콘드리아의 활성화 시그널에 관한 RNA의 발현이, PD-1 항체 치료의 응답성에 관한 바이오 마커가 될 수 있는 것인지 조사하는 것이 중요할 것이다. 또한 병용 약에 의한 PD-1 항체 치료의 상승적 증강 효과는, 사회 보장 제도를 협박하면 논의되고 있는 고가의 PD-1 항체의 투여량을 저감시키는 것에 연결될 것이다.

현재, PD-1/PD-L1 차단에 의한 암 치료에는 크게 2개의 문제가 있다. 첫번째 문제는 상술한 바와 같이, PD-1 저해 치료가 모든 환자에 대하여 효과가 있는 것이 아니라고 하는 것이다. 따라서, PD-1 저해 요법의 항종양 효과를 증강할 가능성이 높고 임상 응용 가능한 약의 개발이 행해지고 있다. 본 발명자들의 결과는, PD-1 저해 요법에 효과가 없는 환자에 대하여, 새로운 병용 요법의 선택지를 제공한다. 다른 한쪽의 문제는 PD-1 저해 요법 단독 또는 병용 요법에 의한 부작용에 관한 것으로, 특히 약제 특유의 독성이나 과도한 면역 응답에 의해 유발되는 자기 면역성 질환을 들 수 있다⁵⁷. 이러한 면역 치료를 증강하는 치료 개입에 따라 부작용도 증강될 가능성은 충분히 있을 수 있다. PD-L1 항체와 금회의 검토에서 사용한 약제와의 병용 치료에서는, 특히 두드러진 자기 면역 반응이 보이지 않았지만, 임상 응용을 생각하면, 본 발명자들이 이전에 확립한 자기 면역 질환 모델 마우스를 사용하여 이 리스크를 평가하는 것이 필요하다¹⁴ ^{, 15,} ¹⁶. DNP는 1930년대에 다이어트 서플리먼트나 대사 속도를 올리는 약제로서 사용되고 있었다⁵⁸. 그러나, 프로톤 동기력의 붕괴에 의한 효과 때문에, DNP는 위독한 건강 상해를 일으키고, 사용이 금지되어 왔다⁵⁹. FCCP는 미토콘드리아의 생체 에너지학의 연구에 널리 사용되어 왔지만, FCCP도 세포 독성과, 어느 정도의 플라스마 막 감극 작용이 있기 때문에 임상 응용에 이르지 않는다⁵⁰. 본 연구에서는, 5종의 약제가 PD-1 저해에 의한 항종양 효과를 증강하는 것을 나타내 왔지만, 대사성 질환의 치료에 많이 시도되고 있는 것이나 일상에서의 서플리먼트로서 복용되고 있는 것을 가미하면, SIRT1 활성제인 천연의 폴리페놀 레스베라트롤이 이상적이다⁵ ^, ⁵¹. 레스베라트롤 단독의 항종양 효과가 보고되어 있지만, 그 용량 의존성도 있고, 항종양 효과에는 이론이 있다⁶⁰. 본 시험에서 사용한 용량은 최저 용량이고, 본 발명자들이 시도한 것만으로서는 종양 증성 억제 효과는 없었다(오히려 그 역을 나타냈다). 본 발명자들이 동정한 기타의 병용 요법은 탈공역제나 ROS의 하류 시그널의 활성제이다. 오프 타깃의 감소를 생각하면, mTOR와 AMPK, SIRT1의 하류를 표적으로 한 치료법은, 항종양 효과를 증강하면서 바람직하지 않은 부작용을 약화시킬 가능성이 있다.

이상을 통합하면, 본 발명자들은 미토콘드리아의 에너지 대사 체크 포인트를 제어하고, PD-1 저해 치료의 효과를 증강하는 약제를 동정하였다. PD-1을 개재한 T세포의 제어나, PD-1 저해 요법 저항성의 암 환자, 또는 감염 질환에 대한 병용요법에 대하여, 본 연구의 결과는 새로운 길을 개방했다고 할 수 있을 것이다. 주목해야 할 것으로, Oltipraz 및 Bezafibrate는 이미 임상 의약으로서 사용되어 오고 있으므로, PD-1 항체와의 병용 요법의 임상 연구에 적용할 수 있다.

[수순과 재료]

마우스와 세포

모든 마우스는 교토대학 대학원 의학부 동물 실험 시설에 있어서, 병원체가 없는 특별한 SPF 환경 하에서 사육되어, 적절한 실험 계획하에 사용되었다. C57BL/6 및 BALB/c(5-6주령)는 Charles River Laboratories Japan(요코하마)으로부터 입수하였다. 마우스 결장선암 MC38 세포는, Dr. Jim Allison(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY)의 후의에 의해 제공받았다. 섬유육종 MethA는, Cell Resource Center for Biomedical Research(센다이, 일본)로부터 얻었다. 이들의 세포는 10％ 열 불활성화 FBS 및 1％ 항진균성 항생 물질(인비트로젠)을 포함하는 DMEM(인비트로젠) 중에서 배양을 행하였다. 이 세포계는 마이코박테리아에서는 감염되지 않는다.

마우스 치료 모델

MC38(5×10⁵) 및 MethA(5×10⁵)은 우측 면피 내에 주입하였다. MC38은 C57BL/6 마우스에 접종하고, MethA는 BALB/c 마우스에 접종하였다. 단독 치료를 위해서, 종양 접종 5일 후, PD-L1 마우스 항체(1-111A)(당연구실 제작) 150ug을 마우스 복강 내에 접종하였다. PD-L1 항체 단독 치료는 4일 간격으로 3회 반복하였다. PD-L1 항체와 화학 약품의 병용 치료는, 종양 접종 7일 후에 개시하였다. 화학 약품은 2일 간격, PD-L1 항체는 5일 간격으로 투여하였다(도 3의 b). 종양은 1일 간격으로 측정하고, 종양의 체적은 타원체의 공식 π×(세로×가로×높이/6)을 따라서 계산하였다.

CD8 결손 마우스 모델

CD8 결손 마우스 모델에서는, CD 45.1⁺ 마우스로부터 CD8⁺ T세포를 autoMACS Pro Separator(Miltenyi Biotec)를 사용하여 단리하였다. 단리한 CD 45.1+CD8+세포는, PBS에서 희석한 CellTrace Violet (Thermo Fisher Scientific)에서 20분 인큐베이션 해 염색하였다. 세정 후, 세포를 CD 45.2+CD8-/-마우스에 미정맥 투여하였다. 5일 후, MC38(5×10⁵)을 가죽 내에 접종, 종양 접종 8일 후에 PD-L1 항체를 복강 내 접종하였다.

화학 시약

이하의 시약을 하기의 농도로 병용하여 치료에 사용하였다. AMPK 활성제: A769662 6mg/kg(Abcam); mTOR 활성제: MHY1485, 3μg/kg(SIGMA-ALDRICH); Uncoupler: 카르보닐시아나이드-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP), 1.2mg/kg(Abcam); Uncoupler: 2,4-디니트로페놀: DNP, 1.7mg/kg(ALDRICH); SIRT1 활성제: Resveratrol, 0.5mg/kg(Abcam); ROS 보충제: Mn(III)테트라키스(4-벤조산)포르피린(MnTBAP), 1.25mg/kg(Calbiochem); ROS 발생제: tert-부틸히드로페록시드 용액(Luperox TBH70X), 200μl/kg(SIGMA-ALDRICH). ATP 합성 저해제: olygomicin(올리고마이신) 250μg/kg(SIGMA-ALDRICH); Paraquat 2mg/kg(Nakalai Tesque); Oltipraz 1.9mg/kg(Sigma); Bezafibrate 1mg/kg(ChemCruz).

모든 시약은 사용 전에 새롭게 제조하였다. 각각의 시약은 설명서에 나타낸 용매에 녹였다. AMPK activator, mTOR activator, uncouplers, SIRT1 activator는 매회 일련의 실험에 있어서, 새로운 미사용의 바이알로부터 제조하였다. 녹인 시약은 PBS로 희석하고, 마우스 한마리당 200μl씩 접종하였다.

사이토카인 비즈 어레이 어세이 ( CBA )

치료 마우스로부터 채취한 혈청 중의 다양한 사이토카인 농도는, 여러 가지 마우스 사이토카인(IL-17A, IL-21, MIG, TNF-α, IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IL-12)에 대한 항체로 코팅된 비즈로 정량적으로 측정하였다. 염색한 샘플을 설명서에 따라 플로우 사이토메트리 FACS Canto II(BD Biosciences)로 측정하였다. 얻어진 데이터는 FCAS Array software v3.0(BD Biosciences)을 사용하여 해석하였다.

효소 결합 면역 흡착법(ELISA)

PD-L1 항체 단독 치료에서 설명한 것 같이 MC38을 마우스에 접종하고, PD-L1 항체로 치료하였다. 혈청 중의 MIG는 MIG ELISA kit(abcam)를 사용하여 설명서를 따라 정량적으로 측정하였다.

세포 제조

소속 림프절의 해석을 위해, 종양을 접종한 마우스의 우측 겨두랑이, 상완 및 서경부의 림프절로부터 세포를 채취하고, 혼합하였다. 하나의 림프절당의 평균 세포수를 절대로 세포수로서 사용하였다. 종양 해석에서는, 종양 조직을 가위로 2-3mm편으로 잘라, gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotec)를 사용하여, 콜라게나아제 타입 IV(Thermo Fisher Scientific)로 효소 처리하였다. 밀리그램당의 종양 세포수를 절대수로서 사용하였다. 소화한 종양 조직으로부터, Tumor Cell Isolation kit, mouse(MiltenyiBiotec)를 사용하여 종양 세포를 단리하였다. 이 키트는, 림프구(임파구), 적혈구, 섬유아세포, 내피세포 및 종양 관련 스트로마 세포를 배제함으로써, 종양 세포를 정제한다. FACSAria(BD BioScience)에 의해, 종양 세포 집단을 추가로 단리·정제하여 사용하였다.

플로우 사이토메트리 해석

나타낸 항원을 인식하는 이하의 항체를 사용하였다: CD44(1M7), CD45.2(104), CD45.1(A20), CD8(53-6.7), CD62L(MEL-14), T-bet(4B/O) 및 IFN-γ(XMG1.2), MHC class I(AF6-88.5), CD155(Tx56) 및 VISTA(MIH63) BioLegend사제; p-AMPK(EPR5683) Ancam사제; p-mTOR(MRRBY), Eomes(Danllmag) 및 PD-L1(M1H5) eBioscience사제. 모든 플로우 사이토메트리는 FACS canto II(BD Biosciences)에서 행하고, FlowJo software(FLOWJO, LLC)에서 해석하였다. 세포 내 인산화 단백의 평가에는, 세포를 0.5％ TritonX로 투과 처리하고, 염색 전에 1.5％ PFA로 고정하였다. 미토콘드리아의 질량, 막 전위, 미토콘드리아의 슈퍼옥시드 및 세포의 ROS의 측정은, 각각 MitoTracker Green, MitoTracker Deep Red, MitoSOX Red 및 CellROX Green 시약을 사용하여 행하였다(모두 Life technologies). 이들 색소의 각각의 최종 농도는 0.125μM, 0.125μM, 5.0μM and 0.625μM로 하고, 37℃ 5％ CO₂ 가습 인큐베이터로 30분 인큐베이트하였다.

산소 소비율의 측정

산소 소비율은 XF96 Extracellular Flux analyzer(Seahorse Biosciences)로 측정하였다. 4x10⁵의 CD8⁺ T세포를 결정된 XF96 플레이트에 뿌렸다. XF Cell Mito Stress Test Kit(Seahorse Bioscience) 부속의 미토콘드리아 산화적 인산화의 4개의 약제를 모듈에 순차 가하였다. 구체적으로는, 기본적인 OCR 측정은 올리고마이신, FCCP, 로테논/안티마이신 A의 순차 첨가 후 이루어졌다. ATP 회전률은 (올리고마이신 첨가 전의 최종값-올리고마이신 첨가 후의 최솟값)으로서 정의하였다³⁴.

Real-time PCR

CD8 양성 T세포 또는 종양 세포로 RNeasy mini kit(QIAGEN)를 사용하여 RNA를 단리하고, 역전사에 의해 cDNA를 합성하였다. PGC-1a의 Real-time PCR은, 이하의 프라이머를 사용하여 행하였다: Forward ACTCGGATTGCTCCGGCCCT(서열 번호 1)와 Reverse ACTGACGGCCTAACTCCACCCA(서열 번호 2). 아포토시스와 미토콘드리아의 에너지 대사 관련 유전자의 발현 레벨을 해석하기 위해서, RT2 Profiler PCR Array Gene Expression kit PAMM-012Z 또는 PAMM-008Z(QIAGEN)를 사용하였다. 본 어세이에 포함되는 유전자 리스트는,

http://www.sabiosciences.com/Apoptosis.php

에서 볼 수 있다.

웨스턴 블로팅

CD8⁺ T세포를 마우스 CD8 마이크로비즈(Milteni Biotec)로 단리하였다. PBS 2회 세정 후, 2x10⁶의 세포를 30mM Tris-Hcl(pH.7.4), 150mM Nacl, 10％ 글리세롤, 0.1％ SDS, 1％ Triton-x-100, 0.05％ Na-Doc, 5mM EDTA(pH.8.0), protease inhibitor mixture(Roche Molecular Biochemicals) 그리고 phosphatase inhibitors(Nacalai tesque)를 포함하는 용해 버퍼에서 가용화하였다. DC protein assay(Bio-Rad)에 의한 단백질 농도 측정 후, 단백질 4ug를 4-20％ gradient Mini-PROTEAN TGX Gels(Bio-Rad)에 싣고, 니트로셀룰로오스막에 전기적으로 블롯하고, 그 후, TBS 중에 1％ BSA를 포함하는 블로킹 버퍼에서 인큐베이트하였다. 1차 항체 인큐베이션은 블로킹 버퍼에서 4℃에서 밤새 행하였다. 세정 후, 2차 항체 인큐베이션을 블로킹 버퍼에서 실온, 40분간 행하였다. 블롯은 enhanced chemiluminescence(Amersham Pharmacia)에서 전개하였다. 이하의 단백질을 인식하는 1차 항체를 사용하였다: Phospho-mTOR(P-mTOR)(Cat#5536), Phospho-AMPKα(P-AMPK)(#2535), Phospho-p70 S6 Kinase(P-S6K)(#9205), 4E-BP1(#9644), Phospho-Acetyl-CoA Carboxylase(P-ACC)(#3661), SIRT1(#9475). 모든 1차 항체는 Cell Signaling Technology로부터 입수하였다. PGC-1α(SC-13067)를 인식하는 항체는, Sant Cruz로부터 얻었다.

통계 분석

통계 분석은 Prism 6에서 행하였다. 3개 이상의 변수를 분석하기 위해서, 일방향 ANOVA 분석(일원 배치 분산 분석) 후에 시닥의 다중 비교 검정을 행하였다. 2개의 군을 비교하기 위하여 student-T 검정을 행하였다. 모든 통계 해석은 파라메트릭 데이터로 가정하고, 2표본 검정을 행하였다. p값이 0.05 미만인 것을 유의로 하였다. 데이터의 변동은 평균값±표준 오차(SEM)로서 평가하였다. 5개 이상의 시료가 본 연구에 있어서의 시료 사이즈의 추정을 위해 적절하다고 생각된다. 시료와 동물은 집단으로부터 무작위로 선정하여, 처리를 행하였다. 시료나 동물의 처리는 맹검은 아니다.

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〔실시예 2〕

C57BL/6 마우스에 마우스 대장암 MC38을 5x10⁵ 접종하였다. 7일 후에 항PD-L1 항체(1-111A, 150ug)와 AMPK 저해제(Compound C: BBS 중 200ug, 200 ul) 복강 내 투여하였다. 항PD-L1 항체는 6일 간격으로 3회 투여하고, Compound C(C. C)는 2일 간격으로 7회 투여하였다. MC38 접종으로부터 25일째까지의 종양의 체적(㎣)을 나타내었다.

결과를 도 9에 나타내었다. AMPK 저해제는 항PD-L1 항체 치료의 효과를 증강한다.

〔실시예 3〕

BALB/c 마우스에 마우스 신장암 RENCA를 2x10⁶ 접종하였다. 7일 후에 항PD-L1 항체(1-111A, 150ug)와 AMPK 저해제(Compound C: PBS 중 200ug, 200ul) 복강 내 투여하였다. 항PD-L1 항체는 6일 간격으로 3회 투여하고, Compound C(C. C)는 2일 간격으로 7회 투여하였다. RENCA 접종으로부터 25일째까지의 종양의 체적(㎣)을 나타내었다.

결과를 도 10에 나타내었다. AMPK 저해제는 항PD-L1 항체 치료의 효과를 증강한다.

〔실시예 4〕

C57BL/6 마우스에 MC38을 5x10⁵ 접종하였다. 7일 후에 항PD-L1 항체(1-111A, 150ug)와 PGC-1α/전사 인자 복합체 활성화제(2-(4-{2-[(4-클로로벤조일)아미노]에틸}페녹시)-2-메틸프로판산(Bezafibrate): PBS 중 10ug, 200ul) 복강 내 투여하였다. 항PD-L1 항체는 6일 간격으로 3회 투여하고, Bezafibrate는 2일 간격으로 7회 투여하였다. MC38 접종으로부터 25일째까지의 종양의 체적(㎣)을 나타내었다.

결과를 도 11에 도시한다. PGC-1α/전사 인자 복합체 활성화제는 항PD-L1 항체 치료의 효과를 증강한다.

〔실시예 5〕

MethA를 BALB/c 마우스에 5x10⁵ 접종하고, 7일 후에 항PD-L1 항체(1-111A, 80ug)와 Foxo1 저해제(5-아미노-7-(시클로헥실아미노)-1-에틸-6-플루오로-4-옥소-1,4-디히드로퀴놀린-3-카르복실산, Calbiochem)(2mg/kg)을 복강 내 투여하였다. 투여 스케줄은 도 3을 따른다. MethA 접종으로부터 28일째까지의 종양의 체적(㎣)을 도 16에 나타내었다. Foxo1 저해제는 항PD-L1 항체 치료의 효과를 증강한다.

〔실시예 6〕

5마리의 PD-1^-/- 마우스(Immunity 11, 141-151(1999).; Science 291, 319-322(2001).; Nat. Med. 9, 1477-1483(2003).)와 야생형 C57BL/6N 마우스(PD-1^-/-마우스와 같은 부모의 마우스)의 혈청 중에 포함되는 아미노산의 양을 GC-MS 해석으로 동정하였다. 결과를 도 17에 나타내었다. 도 17은 야생형의 값을 1로 했을 때의 PD-1^-/-마우스의 값을 나타낸다. PD1을 결손한 마우스에서는 T세포의 분열이 진행하여 혈중 아미노산이 대사되고, 그 값이 감소한다.

Fibrosarcoma MethA(Cell Resource Center for Biomedical Research)를 BALB/c 마우스에 5x10⁵ 접종하고, 7일 후에 항PD-L1 항체(1-111A, 60ug)와 Aminoleban(오츠카 세이야쿠, 400ul/mouse)을 투여하였다. 투여 스케줄은 도 3을 따른다. Aminoleban의 조성을 도 18에 나타내었다.

결과를 도 19에 나타내었다. 아미노산은 항PD-L1 항체 치료의 효과를 증강한다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

본 발명의 의약 조성물은, 항암제, 감염증 치료제 또는 그들의 조합으로서 이용할 수 있다.

<서열 번호 1>

정방향 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.

<서열 번호 2>

역방향 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University <120> Combinatorial therapies with PD-1 pathway inhibitors <130> FP-213PCT <150> JP 2015-238511 <151> 2015-12-07 <150> JP 2016-119695 <151> 2016-06-16 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 actcggattg ctccggccct 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 actgacggcc taactccacc ca 22

Claims

하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하고, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에 투여하는 의약 조성물.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산
제1항에 있어서, PD-1 시그널 저해제가 항체인 의약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체 및 항PD-L2 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 항체인 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ROS 발생제가 tert-부틸히드로페록시드, 카르보닐시아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존, 2,4-디니트로페놀, 2,3-디메톡시-1,4-나프토퀴논 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 탈공역 작용을 나타내는 물질이 카르보닐시아나이드 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존, 2,4-디니트로페놀, 카르보닐시아나이드 m-클로로페닐히드라존, 살리실산, 4,4'-[펜탄-1,5-디일비스(옥시)]디벤젠카르복시미드아미드), 2-(2-(2,6-디클로로페닐아미노)페닐)아세트산, 4-히드록시-2-메틸-N-(2-피리디닐)-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드 1,1-디옥사이드, 2-{1-[(4-클로로페닐)카르보닐]-5-메톡시-2-메틸-1H-인돌-3-일}아세트산, N-(4-니트로-2-페녹시페닐)메탄술폰아미드, 4-히드록시-2-메틸-N-(5-메틸-2-티아졸일)-2H-1,2-벤조티아진-3-카르복사미드-1,1-디옥사이드, 니클로사마이드 에탄올아민염, 3-메틸부트-2-에닐 4-메톡시-8-(3-메틸부트-2-에닐옥시)퀴놀린-2-카르복실레이트 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ROS 발생제 또는 탈공역 작용을 나타내는 물질의 하류 시그널을 제어하는 물질이 mTOR, AMPK, SIRT1, PGC-1α/전사 인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체) 및 Foxo1 중 어느 하나 또는 그 이상을 제어하는 물질인 의약 조성물.
제6항에 있어서, mTOR을 제어하는 물질이 4,6-di-4-모르폴린일-N-(4-니트로페닐)-1,3,5-트리아진-2-아민, 포스파티딘산 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제6항에 있어서, AMPK를 제어하는 물질이 6,7-디히드로-4-히드록시-3-(2'-히드록시[1,1'-비페닐]-4-일)-6-옥소-티에노[2,3-b]피리딘-5-카르보니트릴, 5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 1-β,-D-리보푸라노사이드, N,N-디메틸이미도디카르보니미딕디아미드, 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제6항에 있어서, SIRT1을 제어하는 물질이 trans-3,5,4'-트리히드록시스틸벤, N-(2-(3-(피페라진-1-일메틸)이미다조[2,1-b]티아졸-6-일)페닐)퀴녹살린-2-카르복사미드, N-벤질-3,5-디카르브에톡시-4-페닐-1,4-디히드로피리딘, 2-아미노-N-시클로펜틸-1-(3-메톡시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]퀴녹살린-3-카르복사미드, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제6항에 있어서, PGC-1α/전사인자 복합체(PGC-1α를 포함하는 전사 인자 복합체)를 제어하는 물질이 2-(4-{2-[(4-클로로벤조일)아미노]에틸}페녹시)-2-메틸프로판산, 9-시스, 12-시스-옥타데카디엔산), 2-[4-(4-클로로벤조일)페녹시]-2-메틸-프로판산-d6 1-메틸에틸에스테르, (운데실티오)-아세트산, 4-메틸-5-(2-피라지닐)-3-디티올티온, N,N-디메틸포름아미드, 3-[4-(2,4-비스-트리플루오로메틸벤질옥시)-3-메톡시페닐]-2-시아노-n-(5-트리플루오로메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일)아크릴아미드 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제6항에 있어서, Foxo1을 제어하는 물질이 5-아미노-7-(시클로헥실아미노)-1-에틸-6-플루오로-4-옥소-1,4-디히드로퀴놀린-3-카르복실산, 2-시클로펜틸-N-{2,4-디클로로-3-[(이소퀴놀린-5-일옥시)메틸]페닐}-N-메틸아세트아미드 및 그의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 트립토판, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 티로신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 트레오닌, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 오르니틴, 시트룰린 및 그것들의 유사체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 의약 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항암제, 감염증 치료제 또는 그들의 조합으로서 사용되는 의약 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 시그널 저해제와, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 따로따로 투여되는 의약 조성물.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PD-1 시그널 저해제와, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는 배합제인 의약 조성물.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산
하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 포함하는, PD-1 시그널 저해 활성 증강제.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산
PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질을 의약적으로 유효한 양으로 피험자 또는 피검 동물에 투여하는 것을 포함하는 암, 감염증 또는 그들의 조합의 치료 방법.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산
암, 감염증 또는 그들의 조합의 치료를 위한, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 사용이며, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 투여되는 상기 사용.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산
암, 감염증 또는 그들의 조합을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질의 사용이며, PD-1 시그널 저해제를 투여하기 전, 후 또는 동시 중 어느 시기에, 하기의 (i) 내지 (iii)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질이 투여되는 상기 사용.
(i) ROS 발생제 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질,
(ii) 탈공역 작용을 나타내는 물질 및 그의 하류 시그널을 제어하는 물질, 그리고
(iii) 아미노산