KR20230092962A - 암, 자가면역 장애, 및 염증성 장애의 치료에서의 n-미리스토일 트랜스퍼라제(nmt) 억제제의 용도 - Google Patents

암, 자가면역 장애, 및 염증성 장애의 치료에서의 n-미리스토일 트랜스퍼라제(nmt) 억제제의 용도 Download PDF

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Abstract

암, 자가면역 장애, 및 염증성 장애의 치료에서 N-미리스토일-트랜스퍼라제(NMT) 억제제의 용도가 개시되어 있다. 암과 관련하여, 치료하기에 바람직한 암은 B 세포 림프종이며, 사용되는 NMT는 PCLX-001(DDD86481, CAS RN 1215011-08-7)이다. 자가면역 및 염증성 장애의 치료에 바람직한 NMT 억제제는 전술한 PCLX-001, PCLX-002(DDD85646, CAS RN 1215010-55-10), 및 IMP-1088(CAS RN 2059148-82-0)을 포함하고, 치료되는 장애로는 류마티스 관절염, 천식, 위염, 대장염, 및 기타 소화기 및 호흡기 질환을 포함한다.

Description

암, 자가면역 장애, 및 염증성 장애의 치료에서의 N-미리스토일 트랜스퍼라제(NMT) 억제제의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 202년 10월 20일에 출원된 미국 특허 출원 제63/093,970호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.
분야
B-세포 림프종, 자가면역 장애, 및/또는 염증성 장애의 치료를 위한 N-미리스토일화 표적화.
림프종과 같은 혈액암(hematological cancers)은 전세계적으로 새로운 암 사례 및 암 관련 사망의 대략 9%를 차지하고 있다1,2,3. 버킷 림프종(BL) 및 미만성거대 B-세포 림프종(DLBCL)과 같은 공격적인 비호지킨 림프종이 있는 환자는 현재 치료법으로 초기 관해를 달성하는 경우가 빈번하지만, 이들은 독성이 있으며 상당한 비율의 환자가 질병 재발 및 조기 사망을 경험하게 된다2,3. 국립암센터(National Cancer Institute; NCI)의 SEER(Surveillance, Epidemiology, and End Results)의 최근 데이터에 따르면 비호지킨 림프종 및 DLBCL에 대한 진단 후 5년 생존율은, 연령 일치 대조군 대비, 각각 70% 및 63%에 불과하다2. 따라서 공격적인 림프종에 대한 새로운 약물화가능 표적과 더 나은 내약성 치료법의 식별이 절실히 필요하다.
B-세포 수용체(BCR) 신호전달은 정상적인 B-세포 기능에 필수적이지만, 이는 종종 탈조절되며 BL 및 DLBCL 모두에서 B-세포 림프종형성에 중요한 향-생존(pro-survival) 신호를 제공한다4,5,6,7,8. 실제로, 주요 BCR 이펙터의 자가 항원 및/또는 돌연변이의 존재는 BCR의 독특한 신호전달 방식에 영향을 미친다. 리간드 활성화 BCR 신호 전달 모드 외에도, 이들은 활성화된 B 세포-유사 DLBCL(ABC-DLBCL) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL)에서의 만성 활성 BCR 신호 전달을 비롯하여 BL에서의 강장성(항원 비의존성 구성적 기준선 신호전달) BCR 신호전달을 포함한다4,5,6,7,8. 일반적으로, BCR의 결합은 이 수용체가 미리스토일화된(myristoylated) Src-패밀리 키나제(SFK) Lyn을 포함하는 원형질막 지질 뗏목으로 전위되도록 유도한다9,10,11. 미리스토일화된 Lyn은 BCR 관련 CD79A-CD79B 헤테로이합체의 면역 수용체 티로신 기반 모티프(ITAM)에서 티로신 잔기를 선택하여12,13, 비장 티로신 키나아제(SYK)의 모집을 초래한다. 인간 생식 센터 관련(HGAL; Human Germinal Center-Associated) 단백질은 지질 뗏목에 국재화된 또 다른 미리스토일화된 단백질이며 BCR 활성화 시 인산화된다14,15. 인산화된 HGAL은 Tec 계열 구성원인 브루톤(Bruton)의 티로신 키나아제(BTK)16, 포스포리파제 Cγ, 및 단백질 키나아제 Cβ(PKCβ)13의 티로신 인산화를 촉발하여, 인산화된 ITAM에 대한 SYK의 활성화 및 모집을 증가시켜 BCR 신호를 증강시킨다. 활성화된 포스포리파제 Cγ 활성은 디아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨-트리포스페이트(IP3)를 생성하며, 이들은 각각 PKC를 활성화하고 소포체 저장소에서 칼슘 이온을 동원한다. 이러한 화학적 조절자(mediators)는, 차례로, 다양한 신호 경로를 활성화시킨다17. 이러한 모든 초기 신호전달 이벤트는 NFκB, PI3K, 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK), CREB 및 NF-AT 경로를 통한 전사 활성화를 통해 세포 생존과 증식을 촉진한다4,5,6,18. 림프종형성에서 BCR 신호전달의 중요성은 다양한 SFK(다사티닙), BTK(이브루티닙) 및 PI3Kδ(CAL-101)를 포함하여 BCR의 하류에서 이펙터 단백질을 표적으로 하는 수많은 약리학적 작용제의 개발을 촉진했다4,5,19,20.
인간에서, 단백질 미리스토일화는 2개의 편재적으로 발현되는 N 미리스토일-트랜스퍼라제인 NMT1 및 NMT2에 의해 매개되며, 이들은 수많은 단백질에 탄소 14개의 지방산 미리스테이트를 부가한다21, 22. 미리스토일화는 세포 신호전달에서 근본적인 역할을 하며 단백질과 세포막의 동적인 상호작용을 가능케 한다23,24. 미리스토일화는 개시인자(initiator) 메티오닌 제거 후 동시-번역적으로(co-translationally) 또는 아폽토시스 동안 카스파제-절단 후 후-번역적으로(post-translationally) 단백질의 N-말단 글리신 잔기에서 발생한다23. 인간에서 최대 600개의 프로테오폼25이 미리스토일화되고 이러한 단백질의 적절한 막 표적화 및 기능은 미리스토일화를 필요로 한다23,24,26,27,28. SFKs, Abl, Gα 서브유닛, Arf GTPases, 카스파제 절두된(ct-) Bid 및 ct-PAK2는 세포 성장과 아폽토시스를 결정적으로 조절하는 미리스토일화된 단백질의 예이다23, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35. 최근에, NMT는 또한 Arf6 GTPase의 N 말단에 위치한 리신 잔기의 미리스토일화를 담당하는 것으로 밝혀졌으며, 이에 따라 세포 신호전달에서의 이들의 역할이 추가되었다36, 37. NMT는 기생충의 생존에 필수적이기 때문에, 아프리카 수면병을 치료하기 위한 T. 브루세이(T. brucei) NMT 억제제로 DDD85646과 같은 소분자 억제제가 개발되었다38. DDD85646은 또한 IMP-36639라는 이름으로 인간 NMT의 실제(bona fide) 억제제로 독립적으로 합성 및 검증되었다39. 그 이유는 일부 암에서는 NMT 발현 수준과 활성이 증가하기 때문이다40, 41, 42, 43, 44, 45.
전통적으로, 자가면역 장애는 T 세포 매개 또는 자가항체 매개되는 것으로 분류되었다. 그러나 면역 체계의 복잡성에 대한 향상된 이해는 자가면역 질환과 그 병인을 보는 방식에 상당한 영향을 미쳤다. 적응 면역 반응 동안 B 세포에 대한 T 세포 도움과 CD4+ T 세포 활성화에서의 B 세포 도움의 상호적 역할이 점점 더 인식되고 있다. 전통적으로 자가항체-매개 질병에서 대부분의 자가항체가 IgG 이소형이고 체세포 돌연변이를 수반한다는 관찰은 자가면역 B-세포 반응에서 T 세포가 도움을 준다는 것을 강력하게 시사한다. 마찬가지로 B 세포는 전통적으로 T 세포 매개되는 것으로 간주되는 자가면역 질환에서 중요한 항원 제시 세포로 기능한다. 대부분의 자가면역 질환은 B 세포, T 세포, 및 기타 면역 세포로 구성된 면역 네트워크의 기능 장애로 인해 발생하는 것으로 여겨진다.
BCR을 통한 신호전달은 항체 생성, 자가면역, 및 면역관용 확립에 중요한 역할을 한다.
류마티스성 관절염의 병인 및 치료에서 B 세포의 역할은 문헌[Marston, B. et al (2010) Curr Opin Rheumatol. 2010 May; 22(3):307-315]에 논의되어 있다. 류마티스성 관절염에 대한 치료법으로서 B 세포 억제제의 역할은, 업데이트된, 문헌[Kwan-Morley, J., and Albert, D (2007) Current Rheumatology Reports. 9:401-406]에 논의되어 있다. 류마티스 관절염 환자의 말초 혈액 B 세포에서 Syk의 활성화는 문헌[Iwata, S., et al. (2015) Arthritis & rheumatology. Vol 67. No 1. pp 63-73]에 논의되어 있다. B 세포 억제 수용체 및 자가면역의 역할은 문헌[Pritchard, N. R., & Smith, K. G. C. (2003) Immunology. 108. 263-273]에 논의되어 있다. 류마티스성 관절염에서 B-세포 키나제 억제제의 역할은 문헌[Chu, A. & Chang, BY (2013) OA Arthritis. Oct 27; 1(2):17]에 논의되어 있다. 인간 자가면역에서의 B 세포의 병원성 롤: 클리닉으로부터의 통찰은 문헌[Martin, F., and Chan, A.C. (2004) Immunity. Vol 20, 517-527]에 논의되어 있다. 리간드 인식은 B 세포 항상성 및 자가면역의 조절에서 억제성 B 세포 보조수용체의 역할을 결정하며, 문헌[Tsubata, T (2018) Frontiers in Immunology. Vol 9. Article 2276]에 논의되어 있다. 자가면역 질환에서 B 세포 및 형질 세포를 표적화하는 것은 문헌[Hofmann, K., et al (2018) Frontiers in Immunology. Vol 9. Article 835]에 논의되어 있다. 대식세포-매개 염증 반응에서 Src 키나아제의 역할은 문헌[Byeon, S. E., et al. (2012) Mediators of Inflammation. Volume 2013. 18,pages]에 논의되어 있다. 경구로 이용가능한 비장 티로신 키나아제 억제제인 R406은 Fc 수용체 신호 전달을 차단하고 면역 복합체-매개 염증을 감소시키며, 문헌[Braselmann, S., et al. (2006) JPET. 319:998-1008]에 논의되어 있다. 3상 I 연구에서 단일 및 다중 경구 투약 후 건강한 인간 대상체에서의, 비장 티로신 키나제(SYK) 억제제인 포스타마티닙(Fostamatinib)의 약동학은 문헌[Bluom, M., et al (2012) Br J Clin Pharmacol. 76:1. 78-88]에 기재되어 있다. 인간 질병에서의 조절 T 세포 및 치료 조작에 대한 이들의 잠재력은 문헌[Taams, L. S., et al. (2006) Immunology. 118. 1-9]에 논의되어 있다. γδ T 세포의 역할과 염증성 피부 질환은 문헌[Jee, M.H. et al (2020) Immunological Reviews.2020;00:1-13]에 논의되어 있다.
항-B 세포 수용체(BCR) 복합체 항체는 자가면역, 암, 염증성 질환 및 이식의 치료에 치료적 용도를 갖는다.
T 세포 수용체(TCR) 신호를 억제하는 것은 광범위한 인간 T 세포-매개 자가면역 및 염증 질환을 치료할 가능성이 있다.
자가면역, 암, 염증성 질환, 및/또는 이식의 치료에 사용하기 위한 BCR 및/또는 TCR의 억제제에 대한 필요성이 남아 있다.
한 양태에서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 다음 항목이 제공된다:
1. 치료적 유효량의 PCLX 001을 투여하는 것을 포함하는, 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하는 방법.
2. 항목 1에 있어서, 상기 암이 림프종인, 방법.
3. 항목 2에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종인, 방법.
4. 항목 1 내지 항목 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
5. 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
6. 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
7. 항목 5 또는 항목 6에 있어서, 상기 암이 림프종인, 용도.
8. 항목 7에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종인, 용도.
9. 항목 5 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
10. 치료적 유효량의 PCLX-001을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 림프종에서 세포 사멸을 유도하는 방법.
11. 항목 10에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종인, 방법.
12. 항목 10 또는 항목 11에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
13. 대상체에서 림프종을 유도하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
14. 대상체에서 림프종을 유도하기 위한 약제의 제조에서 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
15. 항목 13 또는 항목 14에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종인, 용도.
16. 항목 13 내지 항목 15항 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
17. 대상체의 세포에서 SFK 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 PCLX-001과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
18. 항목 17에 있어서, 상기 SFK 단백질이 Src 단백질, Lyn 단백질, 또는 Src 단백질 및 Lyn 단백질 둘 다인, 방법.
19. 항목 17 또는 항목 18에 있어서, 상기 세포가 림프종 세포인, 방법.
20. 항목 19에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종 세포인, 방법.
21. 항목 17 내지 항목 20 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
22. 항목 17 내지 항목 21 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
23. 항목 17 내지 항목 22 중 어느 한 항목에 있어서, 다수의 상기 세포를 포함하는, 방법.
24. 대상체의 세포에서 SFK 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와 접촉하도록 제형화되는, 용도.
25. 대상체의 세포에서 SFK 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와 접촉하도록 제형화되는, 용도.
26. 항목 24 또는 항목 25에 있어서, 상기 SFK 단백질이 Src 단백질, Lyn 단백질, 또는 Src 단백질과 Lyn 단백질 둘 다인, 용도.
27. 항목 24 내지 항목 26 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 세포가 림프종 세포인, 용도.
28. 항목 27에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종 세포인, 용도.
29. 항목 24 내지 항목 28 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
30. 항목 24 내지 항목 29 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
31. 항목 24 내지 항목 30 중 어느 한 항목에 있어서, 다수의 상기 세포를 포함하는, 용도.
32. 대상체의 세포에서 Src 단백질, Lyn 단백질, 팬(pan)-P-SFK 단백질, ERK 단백질, P-ERK 단백질, NFκB 단백질, c-Myc 단백질, 또는 CREB 단백질 중 하나 이상의 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 PCLX-001과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
33. 항목 32에 있어서, 상기 세포가 림프종 세포인, 방법.
34. 항목 33에 있어서, 상기 림프종 세포가 B-세포 림프종인, 방법.
35. 항목 32 내지 항목 34 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
36. 항목 32 내지 항목 35 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
37. 항목 32 내지 항목 36 중 어느 한 항목 있어서, 다수의 상기 세포를 포함하는, 방법.
38. 대상체의 세포에서 Src 단백질, Lyn 단백질, 팬-P-SFK 단백질, ERK 단백질, P-ERK 단백질, NFκB 단백질, c-Myc 단백질, 또는 CREB 단백질 중 하나 이상의 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와의 접촉을 위해 제형화된 것인, 용도.
39. 대상체의 세포에서 Src 단백질, Lyn 단백질, 팬-P-SFK 단백질, ERK 단백질, P-ERK 단백질, NFκB 단백질, c-Myc 단백질 또는 CREB 단백질 중 하나 이상의 수준을 감소시키기 위한 약제 제조에서의 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와의 접촉을 위해 제형화된 것인, 용도.
40. 항목 38 또는 항목 39에 있어서, 상기 세포가 림프종 세포인, 용도.
41. 항목 40에 있어서, 상기 림프종이 B-세포 림프종 세포인, 용도.
42. 항목 38 내지 항목 41 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
43. 항목 38 내지 항목 42 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
44. 항목 38 내지 항목 43 중 어느 한 항목에 있어서, 다수의 상기 세포를 포함하는, 용도.
45. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
46. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 DDD85646을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
47. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 IMP1008을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
48. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 NMT 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
49. 항목 45 내지 항목 48 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 자가면역 장애가 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 당뇨병(제1형), 위염, 대장염, 및 인슐린 의존성 자가면역 당뇨병, 이식편 이식/거부 억제, 건선, 쇼그렌 증후군 또는 이식편대숙주병인, 방법.
50. 항목 45 내지 항목 49항 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
51. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
52. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 DDD85646을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
53. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 IMP1008을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
54. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 NMT 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 염증성 장애가 급성, 유착성(adhesive), 위축성(atrophic), 카타르성(catarrhal), 만성(chronic), 간경변성(cirrhotic), 확산성(diffuse), 파종성(disseminated), 삼출성(exudative), 섬유소성(fibrinous), 섬유화성(fibrosing), 국소성(focal), 육아종성(granulomatous), 과형성(hyperplastic), 비대성(hypertrophic), 간질성(interstitial), 전이성(metastatic), 괴사성(necrotic), 폐색성(obliterative), 실질성(parenchymatous), 가소성(plastic), 생산성(productive), 증식성(proliferous), 위막성(pseudomembranous), 화농성(purulent), 경화성(sclerosing), 혈청형성성(seroplastic), 장액성(serous), 단순성(simple), 특이성(specific), 아급성(subacute), 화농성(suppurative), 독성(toxic), 외상성(traumatic), 궤양성(ulcerative) 염증, 위장 장애, 소화성 궤양, 국소 장염, 게실염, 위장관 출혈, 호산구성, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 대장염, 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD 또는 GERD), 염증성 장질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염(diversion colitis), 베체트 증후군, 불확정 대장염, 염증성 장 증후군(IBS), 또는 흉막염, 폐포염, 맥관염, 폐렴, 만성 기관지염, 기관지확장증, 미만성 범세기관지염, 과민성 폐렴, 천식, 특발성 폐 섬유증(IPF) 및 낭포성 섬유증에서 선택되는 폐의 장애인, 방법.
56. 항목 51 내지 항목 55 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
57. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 PCLX-001과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
58. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 DDD85646과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
59. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
60. 항목 57 내지 항목 59 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
61. 항목 57 내지 항목 60 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
62. 항목 57 내지 항목 61 중 어느 한 항목에 있어서, 다수의 상기 세포를 포함하는, 방법.
63. 대상체로부터의 면역 세포의 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 T-세포 및/또는 상기 B-세포를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
64. 대상체로부터의 T-세포 및/또는 B-세포의 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 T-세포 및/또는 상기 B-세포를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
65. 항목 63 또는 항목 64에 있어서, 상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 방법.
66. 항목 63 또는 항목 64에 있어서, 상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 방법.
67. 항목 63 또는 항목 64에 있어서, 상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 방법.
68. 항목 63 내지 항목 67 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
69. 항목 63 내지 항목 68 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
70. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
71. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 DDD85646의 용도.
72. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 IMP1088의 용도.
73. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 NMT 억제제의 용도.
74. 항목 63 내지 제73항 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 자가면역 장애가 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 당뇨병(제1형), 위염, 대장염, 및 인슐린 의존성 자가면역 당뇨병, 이식편 이식/거부 억제, 또는 이식편대숙주병인, 용도.
75. 항목 63 내지 항목 74 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
76. 대상체에서 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
77. 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 DDD85646의 용도.
78. 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 IMP1088의 용도.
79. 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 NMT 억제제의 용도.
80. 항목 76 내지 항목 79 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 염증성 장애가 급성, 유착성, 위축성, 카타르성, 만성, 간경변성, 확산성, 파종성, 삼출성, 섬유소성, 섬유화성, 국소성, 육아종성, 과형성, 비대성, 간질성, 전이성, 괴사성, 폐색성, 실질성, 가소성, 생산성, 증식성, 위막성, 화농성, 경화성, 혈청형, 장액성, 단순성, 특이성, 아급성, 화농성, 독성, 외상성, 궤양성 염증, 위장 장애, 소화성 궤양, 국소 장염, 게실염, 위장관 출혈, 호산구성, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 대장염, 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD 또는 GERD), 염증성 장질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염, 베체트 증후군, 불확정 대장염, 염증성 장 증후군(IBS), 또는 흉막염, 폐포염, 맥관염, 폐렴, 만성 기관지염, 기관지확장증, 미만성 범세기관지염, 과민성 폐렴, 천식, 특발성 폐 섬유증(IPF), 쇼그렌 증후군 및 낭포성 섬유증으로부터 선택되는 폐의 장애인, 용도.
81. 항목 76 내지 항목 80항 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
82. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
83. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 치료적 유효량의 DDD85646의 용도.
84. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 치료적 유효량의 NMT 억제제의 용도.
85. 항목 82 내지 항목 84 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
86. 항목 82 내지 항목 85 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
87. 항목 82 내지 항목 86 중 어느 한 항목에 있어서, 다수의 상기 세포를 포함하는, 용도.
88. 대상체로부터의 면역 세포의 활성을 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
89. 대상체로부터의 T-세포 및/또는 B-세포의 활성을 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
90. 항목 87 또는 항목 89에 있어서, 상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 용도.
91. 항목 87 또는 항목 89에 있어서, 상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 용도.
92. 항목 87 또는 항목 89에 있어서, 상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 용도.
93. 항목 87 내지 항목 89 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
94. 항목 87 내지 항목 93 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
95. 대상체에서 단핵구 세포의 활성을 감소시키거나, 또는 대상체에서 단핵구 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 상기 단핵구를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
96. 항목 95에 있어서, 상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 방법.
97. 항목 95에 있어서, 상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 방법.
98. 항목 95에 있어서, 상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 방법.
99. 항목 95 내지 항목 98 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
100. 항목 95 내지 항목 99 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
101. 대상체에서 단핵구 세포의 활성을 감소시키거나, 또는 대상체에서 단핵구 세포의 수를 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
102. 항목 101에 있어서, 상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 용도.
103. 항목 101에 있어서, 상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 용도.
104. 항목 101에 있어서, 상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 용도.
105. 항목 101 내지 항목 104 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 용도.
106. 항목 101 내지 항목 105 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
107. 대상체의 T-세포에서 사이토카인 분비량을 감소시키는 방법으로서, NMT 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
108. 항목 107에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-6, IL-8 및 IFN-감마. IL-5, IL-10, 또는 IL-13인, 방법.
109. 항목 107 또는 항목 108에 있어서, 상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 방법.
110. 항목 107 또는 항목 108에 있어서, 상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 방법.
111. 항목 107 또는 항목 108에 있어서, 상기 NMT 억제제가 IMP-1088인, 방법.
112. 항목 107 내지 항목 111 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
113. 항목 107 내지 항목 112 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
114. 대상체의 T-세포에서 사이토카인 분비량을 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
115. 항목 114에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-6, IL-8 및 IFN-감마. IL-5, IL-10, 또는 IL-13인, 용도.
116. 항목 114 또는 항목 115에 있어서, 상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 용도.
117. 항목 114 또는 항목 115에 있어서, 상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 용도.
118. 항목 114 또는 항목 115에 있어서, 상기 NMT 억제제가 IMP-1088인, 용도.
119. 항목 114 내지 항목 118 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
120. 항목 114 내지 항목 119 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
본 개시의 실시형태는 이제 첨부된 도면을 참조하여, 단지 예시로서 설명될 것이다.
도 1a-h. PCLX-001은 다른 기원의 암 세포주와 비교하여 혈액암 세포주를 선택적으로 사멸시킨다. Horizon 세포주 스크린(A, B)을 사용하여 측정한 바와 같이 1.2μM PCLX-001로 96시간 처치하거나, 또는 OncolinesTM 세포주 스크린(C, D)을 사용하여 1μM PCLX-001로 72시간 처치한 후 다양한 세포주의 최대 성장 억제 백분율. 세포주는 종양 세포 유형에 따라 배열되어 있다. 빗금친 영역은 세포독성 효과를 나타낸다. 혈액암 세포주는 회색으로 표시되어 있고 다른 모든 유형의 암 세포주는 흰색으로 표시되어 있다. 해당 바이올린 그래프는 Horizon(B) 및 OncolinesTM(D) 세포 스크린에서 계산된 것과 같이 혈액암 세포주에서 평균 PCLX-001 매개 성장 억제를 합쳐진 다른 기원의 암 세포주와 비교한다(독립표본(Unpaired) t-테스트, 양측 P<0.0001). 사분위수는 점선으로 구분된다. 오차 막대는 각 그룹 내의 표준 편차를 나타낸다. 96시간 동안 0.001 - 5μM의 PCLX-001로 처치한 불멸화된 림프구(IM9, VDS), BL(BL2, Ramos, BJAB), 및 DLBCL(DOHH2, WSU-DLCL2, SU DHL-10) 세포주의 정규화된 세포 생존도 곡선을 CellTiter Blue Viability Assay(E)로 결정했다. E에 표시된 세포 생존율 곡선에서 파생된 절대 IC50 값의 해당 히스토그램(F). (***)는 IM9 세포와 테스트한 다른 모든 세포주 사이의 IC50에서 유의한 차이(P ≤ 0.001)를 나타낸다(일반 1원(one-way) 분산분석(Anova), Tukey의 다중 비교 테스트, P<0.0001). 96시간 동안 0 - 5 μM의 PCLX-001로 처리된 IM9(G) 및 BL2(H) 세포의 정규화된 증식을 세포 계수로 결정했다. 값은 3회의 독립적인 실험에 대한 평균 ± s.e.m.이다.
도 2a-g. PCLX-001은 시험관 내에서 미리스토일화를 선택적으로 억제하고 림프종 세포주에서 아폽토시스를 유도한다. 0.01-1.0μM PCLX-001로 1시간 동안 처치한 BL2 세포(A) 및 IM9 세포(B)에서의 전체 단백질 미리스토일화 수준, COS-7 세포에서 발현된 WT-Src-EGFP 구축물의 미리스토일화 수준(C), 및 1.0-10μM의 PCLX-001로 1시간 처치한 후 IM9 세포에서 면역침전된 내인성 pp60-Src의 미리스토일화(D)를 결정하기 위해 알킨-미리스테이트 표지된 세포 용해물에서 클릭 화학을 사용했다. WT-Src-EGFP(왼쪽), 미리스토일화-불가능(non-myristoylatable) G2A-Src-EGFP 돌연변이(가운데), 및 10μM PCLX-001로 24시간 동안 처치한 WT Src EGFP 구축물로 형질감염된 COS-7 세포의 형광 현미경 사진(오른쪽)(E). 눈금 막대는 10μm와 같다. 1μM PCLX-001로 0-5일 처치한 IM9 및 BL2 세포의 내인성 Src 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅(F)으로 측정했다. 0-1,0 μM PCLX-001(복합 겔)과 함께 72시간 배양 후 IM9, BL2 및 Ramos 세포 용해물에서 절단된 PARP-1 및 절단된 카스파제-3의 웨스턴 블롯팅(G). 표시된 모든 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다. GAPDH는 로딩 대조군 역할을 한다.
도 3a,b. PCLX-001 처치는 림프종 세포주에서 프로테아좀에 의한 SFK 불안정 및 분해를 초래한다. 0.1μM 또는 1.0μM PCLX-001로 24-48시간 처치 후 불멸화된 림프구(IM9, VDS), BL(BL2, Ramos, BJAB), 및 DLBCL(DOHH2, WSU-DLCL2, SU DHL 10) 세포주 용해물에서 총 Src 및 Lyn 단백질에 대한 웨스턴 블롯(A). 마지막 6시간 동안 10μM의 프로테아좀 억제제 MG132의 존재 또는 부재 하에 1μM PCLX-001로 24-48시간 동안 BL2 처치한 BL2에서의 총 Src, Lyn, Hck, Lck, Mcl-1, 총 포스포-티로신(PY99) 및 팬(pan) 인산화-SFK(P-SFK) 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯(B). GAPDH는 로딩 대조군 역할을 한다. 표시된 모든 웨스턴 블롯은 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 4a-c. PCLX-001 처치는 BL2 림프종 세포에서 BCR 다운스트림 신호전달 이벤트를 약화시킨다. 총 티로신 인산화(P-Tyr), Lyn, 티로신 396 또는 507에서 인산화된 Lyn, BTK, 및 티로신 223 또는 551에서 인산화된 BTK (A), HGAL, SYK, 인산화 SYK(P-SYK)(B) 또는 ERK, 인산화 ERK(P-ERK), NFκB, c-Myc, CREB, Arf-1, BIP 및 PARP-1(C)를 검출하기 위해 0.1μM 또는 1.0μM의 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 48시간 동안 처치한 BL2 세포의 웨스턴 블롯. 웨스턴 블롯은 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다. GAPDH는 로딩 대조군 역할을 한다. BL2 세포를 25μg/ml F(ab')2 항인간 IgM으로 2분 동안 활성화시키고 웨스턴 블롯팅을 위해 처리했다. 나타낸 모든 웨스턴 블롯은 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 5a,b. B 세포 림프종에서 제안된 PCLX-001 작용 메커니즘을 묘사하는 모델. (A) BCR 활성화 시, 먼저 미리스토일화된 SFK Lyn이 BCR을 포함하는 원형질막의 지질 뗏목 도메인으로 모집되고, Y507에서 탈인산화된 Lyn은 Y396에서 활성화 및 자가인산화를 유도한다. 이것은 Y551 및 Y223에서 BTK의 인산화 및 활성화로 이어진다. 둘째, 미리스토일화된 HGAL도 원형질막으로 모집되고 인산화되어 SYK, BTK 및 이노시톨-3-포스페이트 이온 채널 수용체(IP3R)를 통해 소포체로부터 Ca++ 이온의 방출을 자극함으로써 BCR 신호 전달을 강화한다. 전체적으로 이러한 초기 신호 이벤트는 c-Myc, P-ERK, NFκB 및 CREB에 의한 전사 활성화로 이어진다. (B) NMT 억제제 PCLX-001은 Lyn-SFK(및 이 모델에 나타나지 않은 다른 SFK), HGAL 및 Arf1의 미리스토일화를 방지하여, 이들 단백질의 적절한 막 표적화 및 기능을 방해한다. PCLX-001 처치는 ER에서 BCR 매개 Ca++ 방출을 감소시키고 세포의 기저 Ca++ 수준을 증가시켜 칼슘 항상성을 방해할 뿐 아니라, 미리스토일화된(Lyn, HGAL, Arf1) 단백질과, 놀랍게도 미리스토일화되지 않은 단백질(NFκB, P-ERK, c-Myc 및 CREB) 둘 다의 분해를 촉진하는데 일부는 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 이루어지며, 그로 인해 하류 BCR 신호전달을 더욱 차단하고 ER 스트레스를 증가시켜 아폽토시스 및 세포 사멸을 유도하게 된다.
도 6a-b. PCLX-001은 다사티닙 및 이브루티닙과 비교하여 양성 림프구에 비해 혈액암 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 0.001 - 5μM 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 48시간(A) 또는 96시간(B) 동안 처치한 BL2(실선) 및 IM9 세포(점선)의 세포 생존도 곡선. 48시간(C) 및 96시간(D) 동안 0.1μM 또는 1.0μM의 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 처치한 불멸화된 림프구(IM9, VDS), BL(BL2, Ramos, BJAB), 및 DLBCL(DOHH2, WSU-DLCL2, SU-DHL-10) 세포주의 정규화된 세포 생존도. 모든 실험의 세포 생존도를 칼세인 분석을 이용하여 측정했고, 3회의 독립적인 실험의 평균이다. 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다.
도 7a-g. PCLX-001 처치는 B 세포 림프종 이종이식 모델에서 종양 부피를 줄이고 완전한 종양 퇴행을 유도한다. DOHH2(A) 및 BL2(B) 종양의 크기를 시간의 함수로 측정하는 세포주에서 유래된 뮤린 피하 이종이식편에 대한 용량-반응 곡선. 오차 막대는 평균 종양 부피의 표준 편차를 나타낸다. 표시된 용량에서 PCLX-001, 독소루비신, 또는 비히클 단독으로 처치한 마우스의 BL2 종양 샘플에서 이전에 기술된 바와 같이21 평가된 평균 총 NMT 비활성. 60mg/kg/일로 처치한 마우스로부터 추출된 종양은 비히클과 비교하여 감소된 NMT 비활성을 나타냈다(쌍체표본(paired) t-테스트, P=0.0425). 오류 막대는 s.e.m.을 나타낸다. (C). 환자 DLBCL3에서 유래된 뮤린 이종이식물에 대한 용량-반응 곡선. 데이터 포인트는 모든 생존 동물의 평균 종양 부피를 나타낸다. 오차 막대는 평균 종양 부피(D)의 표준 편차를 나타낸다. (***)은 20mg/kg/일과 50mg/kg/일의 PCLX 001을 투여한 동물 사이의 반응률의 상당한 차이를 나타낸다(P<0.0001). 환자 유래 DLBCL3 이종이식편이 있는 마우스의 대표적인 종양(E). 상기 DLBCL3 환자 이종이식 종양 샘플에서 절단된 카스파제-3(F) 및 Ki-67(G)에 대한 대표적인 IHC 염색. 스케일 바는 100μm와 동일함.
도 8. 합쳐진 Horizon 및 Oncoline 세포주 스크린 데이터는 PCLX-001이 모든 다른 암 유형으로부터 유래된 세포주와 비교하여 혈액암 세포주에 최대 성장 억제를 부여함을 입증한다. 처치 96시간 후 Horizon 및 Oncoline 세포주 스크린 둘 모두에서 혈액성 세포주 대 모든 다른 비-혈액성 세포주에 대한 PCLX-001의 합쳐진 성장 억제 백분율을 나타내는 바이올린 그래프. 사분위수는 점선으로 구분된다. (***)는 성장 억제에서 유의한 차이를 나타낸다(언페어드 t-테스트, 양측 P<0.0001).
도 9a-d. 효능 스크린의 범위는 PCLX-001이 고형 종양에서 유래된 것을 포함하여 다양한 다른 암 세포주에 대해 활성을 나타냄을 입증한다. 0.0005 - 10μM PCLX-001로 3일(A, B) 또는 6일(C, D) 동안 처치한 다양한 세포주의 절대 IC50 값. 세포주는 암 유형에 따라 배열되어 있다. 개별 막대는 B 세포 림프종 및 맨틀 세포 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML), 유방, 소세포 폐암(SCLC), 비-소세포 폐암(NSCLC)에서 유래된 단일 암 세포주를 나타낸다. ChemPartner 로봇 플랫폼은 CellTiter Blue 생존도 분석을 이용하여 세포 생존도를 결정했다. 성장 억제(GI)는 0일에 세포의 생존력이 Chempartner 플랫폼에서 이용가능하지 않았기 때문에 계산되지 않았다. (독립표본 t-테스트, 양측, ** P=0.0038, ns= 유의하지 않음).
도 10a,b. PCLX-001은 불멸화된 림프구와 비교하여 혈액암 세포주를 선택적으로 사멸시킨다. (A) 0.001 - 5μM의 PCLX-001로 96시간 동안 처치한 불멸화된 림프구(IM9, VDS), BL(BL2, Ramos, BJAB), 및 DLBCL(DOHH2, WSU-DLCL2, SU DHL-10) 세포주의 정규화된 세포 생존도 곡선으로, 세포 수에 관계없이 생존 세포의 백분율을 측정하는 Calcein 분석으로 결정된 것임. (B) (A)에 나타낸 세포 생존도 곡선에서 유래된 절대 IC50 값의 상응하는 히스토그램. 값은 3회의 실험의 평균 ± s.e.m.이다. (일반적인 일원 분산분석, Tukey의 다중 비교 검정, *** P<0.0001).
도 11a-c. PCLX-001 처치는 정규화된 림프종 세포주 증식을 감소시킨다. (A) 세포 카운트로 결정된 바와 같이 96시간 동안 0 - 5 μM의 PCLX-001로 처치한 불멸화된 림프구(VDS), BL(Ramos, BJAB) 및 DLBCL(DOHH2, WSU-DLCL2, SU-DHL-10) 세포주의 정규화된 증식. (B) 0.1μM PCLX-001 처리 후 96시간까지 다양한 세포주의 정규화된 증식 억제. (C) 세포 성장 속도의 차이를 설명하기 위해, 본 발명자들의 데이터를 0.1μM PCLX-001 처치 후 최대 96시간까지의 다양한 세포주의 정규화된 증식을 각각의 무처치 세포주의 정규화된 증식으로 나눈 상대적 비율로 변환했다. 값은 3회 실험의 평균 ± s.e.m.이다.
도 12a,b. 새로 분리된 인간 림프구, PBMC 및 1차 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 많은 부분이 PCLX-001에 대해 내성이었다. 0.001 - 10μM PCLX-001로 96시간 동안 처치한 2개의 새로 분리된 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC) 및 림프구 제제의 세포 생존도 곡선. 값은 평균 ± s.e.m.이다. (n=2). HUVEC를 0.001 - 5μM PCLX-001로 96시간 동안 처치하고 잔류 세포 생존도를 Cell-Titer Blue Assay를 이용하여 측정했다. 값은 평균 ± S.D이다. (n=4).
도 13a,b. PCLX-001은 Ras의 팔미토일화를 억제하지 않으며 생리학적 수준에서 유의한 오프-타깃(off-target) 키나아제 억제제 활성을 나타내지 않는다. (A) 48시간 동안 팔미토일화가능한 EGFP-N-Ras 또는 팔미토일화-불가능한(non-palmitoylatable) EGFP-K-Ras를 일시적으로 발현하는 COS-7 세포를 100μM 2-브로모팔미테이트(2-BP), 팔미토일화 억제제 또는 하기 NMT 억제제로 1시간 동안 전처치했다: 10μM PCLX-001, 100μM 2-하이드록시미리스테이트(HMA) 또는 10μM Tris DBA. 억제제로 전처치한 세포를 100μM Alkyne C16으로 4시간 동안 표지화시켰다. EGFP-태깅된 구축물을 설명된 대로 면역침전시켰고 클릭 화학을 이용하여 아지도-비오틴과 반응시켰다. 비오티닐화-팔미토일화된 단백질을 뉴트라비딘(neutravidin)-HRP 컨주게이트와 ECL을 이용하여 검출했다. (B) TREEspot™은 미국 캘리포니아주(CA), DiscoverX Corporation에서 개발한 독점 데이터 시각화 소프트웨어 도구이다. scanMAX KINOMEscan의 468개의 사전-구성된 인간 키나아제를 테스트했다. 돌연변이 및 지질 키나아제는 표시되어 있지 않다. PCLX-001에 결합하는 것으로 밝혀진 가능한 키나아제는 빨간색 원으로 표시되어 있으며, 큰 원은 더 높은 친화성 결합을 나타낸다. BL2 세포에 대한 PCLX-001 EC50보다 ~400배 더 큰 농도에 해당하는 최대 10μM의 PCLX-001과 결합하는 키나아제는 확인되지 않았다. 100μM PCLX-001(BL2에 대한 EC50의 ~4000배)에서, 3개의 키나아제(빨간색으로 표시된 MRCKA, PIP5K2C 및 SRPK1)만이 PCLX-001에 약하게 결합하는 것으로 확인되었다(키나아제 활성 점수 < 대조군의 35%). 나타낸 모든 웨스턴 블롯은 3회 독립적인 실험을 대표한다.
도 14. 최대 5일 동안 PCLX-001로 처리된 BL2 및 IM9 세포에서 Src 단백질 수준 감소의 정량화. 웨스턴 블롯에 의해 검출된 총 내인성 Src 단백질 수준의 정량화(도 2F). 오류 막대는 평균에서 표준 오류를 나타낸다. (*)는 Src 단백질 수준(n=3)에서 유의한 차이(2-원 분산분석(2-way ANOVA) , P=0.0174)를 나타낸다.
도 15a,b. PCLX-001 처치는 다양한 정상 및 악성 B 세포주에서 기저(강장성 또는 만성) 및 항-IgM 활성화 신호전달에서 포스포-티로신 수준을 감소시킨다. (A) 0.01-1μM PCLX 001로 24시간 처치한 후 정상 IM9 및 VDS 세포주, 및 악성 B 세포주 BL2, Ramos, BJAB, DOHH2, WSU-DLCL2 및 SU-DHL-10 세포에서 기저(항원 독립적 강장제 또는 만성) 티로신 인산화 수준(PY99)을 평가한 웨스턴 블롯. (B) 0.1μM 또는 1μM의 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 24시간 동안 처치한 비자극(왼쪽) 및 항-IgM 결찰된 BCR(오른쪽) BL2 세포의 PY99 웨스턴 블롯. BL2 세포를 나타낸 것과 같이 25μg/ml 염소 항-인간 IgM으로 2분 동안 활성화시켰다. 나타낸 웨스턴 블롯은 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 16a-c. PCLX-001 처치는 BL2 세포에서 총 포스포-티로신, 포스포-ERK(P-ERK) 및 NFκB 수준을 크게 감소시킨다. 0.1μM 또는 1.0μM의 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 48시간 동안 처치한 BL2 세포에서 PY99 항체(A), P-ERK(B) 및 NFκB(C)를 이용하여 총 인산화 티로신 수준에 대한 웨스턴 블롯의 정량화(도 4a) (A와 C의 경우 n=4, B의 경우 n=3). BL2 세포를 나타낸 2분 동안 25μg/ml 염소 항-인간 IgM으로 활성화시켰다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. (*)는 형광체 티로신 수준의 유의한 차이(P<0.05)를 나타낸다(일반적인 1원 분산분석, Tukey의 다중 비교 테스트).
도 17a,b. PCLX-001 처치는 다양한 림프종 세포주에서 항-IgM 연결 BCR 신호를 약화시킨다. (A) 0.1μM 또는 1.0μM의 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 48시간 동안 처치한 BL(Ramos, BJAB) 및 (B) DLBCL(DOHH2, WSU DLCL2, SUDHL-10) 세포주의 웨스턴 블롯으로 검출한 총 Src, Lyn, ERK, 인산화된 SFK(P-SFK) 및 인산화된 ERK(PERK) 수준. DOHH2에서는 Src와 Lyn이 검출되지 않았다. 웨스턴 블롯은 적어도 3회의 독립적인 실험을 대표한다. GAPDH는 로딩 대조군 역할을 한다. 세포주를 웨스턴 블롯팅 전에 2분 동안 25μg/mL 염소 항-인간 IgM으로 활성화시켰다. 나타낸 모든 웨스턴 블롯은 3회의 독립적인 실험을 대표한다.
도 18a,b. PCLX-001, 다사티닙, 이브루티닙으로 48시간 처치한 후 BL2 세포에서 다양한 SFK 수준의 비교. 0.1μM 또는 1.0μM의 다사티닙, 이브루티닙 또는 PCLX-001로 48시간 동안 처치한 BL2 세포에서 Lyn, Src, Lck, Hck, Fyn 및 총 인산화된 SFK(P-SFK 염색은 도 4a에 표시됨)의 단백질 수준에 대한 웨스턴 블롯(A) 및 정량화(B). 나타낸 경우 BL2 세포를 25μg/ml 염소 항-인간 IgM으로 2분 동안 활성화시켰다. 오류 막대는 평균에서 표준 편차를 나타낸다. (***)는 유의한 차이를 나타낸다(단백질 또는 인산화 단백질 수준에서 p<0.0001(일반적 일원 ANOVA, Tukey의 다중 비교 검정).
도 19a-c. PCLX-001은 BL2 세포에서 항 IgM 자극에 의해 활성화된 BCR 수용체 의존성 칼슘 방출을 감소시킨다. 소포체 Ca++ 방출은 1μM PCLX-001(A), 다사티닙(B) 또는 이브루티닙(C)으로 24시간 또는 48시간 동안 처치한 BL2 세포에서 측정했다. 형광 Ca++ 표시자를 세포에 로딩한 후, Fura-2 세포를 10μg/ml 염소 F(ab')2 항인간 IgM으로 자극하여 BCR-수용체 의존성 Ca++ 방출을 연결하고 활성화한 다음 타프시가르긴(thapsigargin)(300nM) 처치 후 소포체로부터의 BCR-수용체 독립적인 Ca++ 방출을 확인했다. 나타낸 결과는 실험의 다수의 복제물을 나타낸다(PCLX-001 인큐베이션의 경우 n=6, 다사니팁 및 이브루티닙의 경우 n=3).
도 20a,b. 다사티닙 및 이브루티닙은 IM9 및 BL2 세포에서 PCLX 001의 세포독성 효과를 상승시키지 않는다. IM9(A) 및 BL2(B) 세포를 0.1 및 1μM 다사티닙 또는 이브루티닙과 조합한 0.01, 0.1 및 1μM PCLX-001과 함께 96시간 동안 인큐베이션했다. 다사티닙 또는 이브루티닌을 PCLX-001에 첨가했을 때 부가적 또는 상승적 효과는 관찰되지 않았다. 본 발명자들의 실험을 통해 알 수 있듯이, 악성 BL2 세포는 정상적인 IM9 B 세포보다 PCLX-001에 더 민감하다. 세포 생존도는 칼세인 분석을 이용하여 측정했고, 3회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다.
도 21a-g. PCLX-001 및 독소루비신 치료가 이종이식 모델에서 체중 및 생존율에 미치는 영향. DOHH2(A), BL2(C) 및 (F) DLBCL3 환자 유래 이종이식 모델에서 체중의 백분율 변화. 검은색 화살표는 주사를 나타낸다. 오차 막대는 각 시점에서 마우스당 평균 체중의 표준 편차를 나타낸다. 생존 이벤트가 독성으로 인한 사망, 암으로 인한 사망, 또는 독성으로 인한 안락사를 포함하는, Kaplan-Meier 곡선은 (B) DOHH2, (D) BL2 및 (G) DLBCL3 환자 유래 이종이식 모델에서 시간 경과에 따른 생존율을 나타낸다. (E) 표시된 용량의 PCLX 001 및 독소루비신으로 처치한 후 BL2 이종이식 동물(D)의 Kaplan-Meier 곡선 분석으로부터 도출된 생존 추정치 중앙값.
도 22a-e. NMT 발현은 혈액암 세포주에서 감소한다. NMT1 전사체의 평균 개수는 NMT2 전사체보다 많다. 그러나 NMT2 전사체 수(회색)는 암 세포주(A)에서 NMT1 전사체 수(검은색)보다 더 큰 변동을 나타낸다. NMT2 mRNA 발현은 다른 유형의 암에서 유래한 세포주(Min to Max Box Plot, B)와 비교하여 혈액암 세포주(독립표본 t-테스트; *** P < 0.0001)에서 유의하게 더 낮다. NMT1(C)의 발현은 조사된 1269개 세포주에 걸쳐 상대적으로 일정하며 유방암 및 백혈병 암 세포주에서 발현이 약간 그러나 유의하게 감소하는 반면, NMT2 발현(D)은 다양한 암 사이에서 그리고 주어진 암 유형 내에서도 상당히 다양하다. 데이터는 또한 NMT2의 발현이 CNS, 신장 및 섬유아세포 기원의 암 세포주에서 더 높은 반면, 백혈병, 림프종 및 골수종과 같은 혈액암에서 NMT2 발현의 선택적이고 상당한 감소가 있음을 보여준다. 박스 플롯은 10-90 백분위수를 보여준다(일반적인 1원 분산분석, Dunnett의 다중 비교 테스트, *** P < 0.0001). NMT1 발현은 가능한 보상 메커니즘으로서 최소 NMT2를 발현하는 100개의 세포주에서 증가하지 않았다(E). 모든 데이터를 20Q1 PublicRNA 시퀀싱(Broad Institute, 1269개 세포주)에서 추출했고, 선택된 암에 다라 분류했다.
도 23. PCLX-001 처치는 Jurkat T 세포에서 TCR 의존성 P-ERK 활성화를 약화시킨다. Jurkat T 세포를 최대 60분(2ug/ml) 동안 CD3/CD28 항체로 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석은 24/48h(1μM) 동안 인큐베이션된 PCLX-001이 PERK 활성화를 억제함을 보여준다.
도 24. PCLX-001 처치(24h)는 Jurkat T 세포에서 TCR 의존성 P-ERK 및 P SFK 활성화를 약화시킨다. Jurkat T 세포를 최대 4시간(2ug/ml) 동안 CD3/CD28 항체로 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석은 24시간(0.1 및 1μM) 동안 인큐베이션된 PCLX-001이 P-ERK 활성화 및 Src 계열 키나아제(P-SFK)의 인산화를 보여준다.
도 25. PCLX-001 처치(48h)는 Jurkat T 세포에서 TCR 의존성 P-ERK 및 P SFK 활성화를 약화시킨다. Jurkat T 세포는 최대 4시간(2ug/ml) 동안 CD3/CD28 항체로 활성화되었다. 면역블롯팅 분석은 48시간(0.1 및 1μM) 동안 인큐베이션된 PCLX-001이 PERK 활성화 및 Src 계열 키나아제(P-SFK)의 인산화를 억제함을 보여준다.
도 26. PCLX-001 및 다사티닙 처치는 TCR 하류 신호전달 사건을 약화시키고 일차 배양된 T 세포에서 ER 스트레스를 유도한다. 90% αb 일차 T 세포를 CD3/CD28 항체로 30분(2ug/ml) 동안 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석은 PCLX-001과 다사티닙이 P-티로신 인산화(PY99), P-ERK 활성화, Src 계열 키나아제(P-SFK)의 인산화를 억제함을 보여준다. 또한, PCLX-001은 Src와 Lyn의 단백질 수준을 현저히 감소시켰고 Bip 단백질 함량(ER 스트레스 마커)을 증가시켰다.
도 27a-e. PCLX-001은 PBMC, B 세포 및 단핵구의 생존도를 감소시키지만 T 세포는 감소시키지 않는다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양하였다. 세포 하위집단의 생존도와 풍부도를 유 세포 계측법을 이용하여 테스트했다. PBMC의 생존도는 현저하게 감소했다(A). CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도는 약물 처리에 의해 변화되지 않았다(B 및 C). 그러나, B 세포(D) 및 단핵구 CD14+(E) 수는 PCLX-001 처리 96시간 후에 유의하게 감소했다.
도 28a-d. PCLX-001은 T 세포에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 감소시킨다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. T 세포 하위집단에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 유세포 분석을 통한 세포내 염색을 이용하여 테스트했다. CD4+ T 세포에서 Lyn(A) 및 HGAL(B)의 발현은 둘 다 감소했다. 또한, PCLX-001은 CD8+ T 세포에서 Lyn(C) 및 HGAL(D)의 발현도 모두 감소시켰다.
도 29a-d. PCLX-001은 단핵구에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 감소시키지만 B 세포에서는 감소시키지 않는다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX 001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. B 세포 및 단핵구 하위 집합에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 유세포 분석을 통한 세포내 염색을 이용하여 테스트했다. PCLX-001은 B 세포에서 Lyn(A) 및 HGAL(B)의 발현을 감소시킬 수 없었지만, 단핵구(C 및 D)에서 두 단백질 마커 모두 현저하게 감소했다.
도 30a-e. PCLX-001은 염증성 사이토카인 생성을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 염증성 사이토카인 IL-6(A), TNF-α(B), IL-8(C), IFN-γ(D), 및 IL-17a(E)의 생성을 유도한다.
도 31a-d. PCLX-001은 항염증성 사이토카인 생성을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후, 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PB<C에서 항염증 사이토카인 IL-1RA(A), IL-10(B), IL-13(C) 및 IL-16(D)의 생성을 유도한다.
도 32a-d. PCLX-001은 염증성 케모카인 생성을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후, 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 염증성 케모카인 MIP-1α(A), MCP-2(B), TARC(C), 및 GRO-α(D)의 생성을 유도한다.
도 33a-d. PCLX-001은 염증성 케모카인 생성을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후, 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 염증성 케모카인 RATES(A), MIP-1β(B), MCP-4(C) 및 MDC(D)의 생성을 유도한다.
도 34a-c. PCLX-001은 T 헬퍼 2-매개 케모카인 및 GM-CSF의 생산을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX 001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후, 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자 I-309(A), T 헬퍼 2 매개 케모카인으로서의 에오탁신-2(B) 및 GM-CSF(C)의 생산을 유도한다.
도 35a-d. NMT 억제제(PCLX-001, PCLX-002, IMP-1088)는 전-염증성 사이토카인의 정규화된 분비를 감소시킨다: IL-6(A), IL-8(B), TNF-α(C) 및 IFN-γ(D). T 세포는 NMT 억제제의 농도를 증가시키면서 48시간 동안 배양한 다음, 약물 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS)로 2일 동안 더 유도했다. NMT 억제제는 IL-6, IL-8 및 IFN-감마의 수준을 유의하게 감소시켰다. (2-원 분산분석, 미처리에 대한 P 값: *<0.05-0.01 **<0.01-0.001 ***<0.001-0.0001. 사이토카인 분비의 감소가 PCLX-002에 비해 더 강력한 NMT 억제제인 PCLX-001에서 더 강하가 나타나고, 처치 4일 후 세포의 생존이 무처치 샘플의 10% 이내이었음을 언급하는 것은 주목할 가치가 있다.
도 36a-d. NMT 억제제(PCLX-001, PCLX-002, IMP-1088)는 항염증 사이토카인의 정상화된 분비를 감소시킨다: IL-4(A), IL-5(B), IL-10(C) 및 IL-13(D). T 세포는 NMT 억제제의 농도를 증가시키면서 48시간 동안 배양한 다음, 약물 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS)로 2일 동안 더 유도했다. NMT 억제제는 IL-5, IL-10 및 IL-13의 수준을 유의하게 감소시켰다. (2-원 분산분석, 미처리에 대한 P 값: *<0.05-0.01 **<0.01-0.001 ***<0.001-0.0001. 사이토카인 분비의 감소가 PCLX-002에 비해 더 강력한 NMT 억제제인 PCLX-001에서 더 강하가 나타났고, 처치 4일 후 세포의 생존이 무처치 샘플의 10% 이내이었음을 언급하는 것은 주목할 가치가 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 열거한 목록이 완전하지 않으며 임의의 다른 추가적인 적절한 항목, 예를 들어, 하나 이상의 추가 특징(들), 구성요소(들) 및/또는 요소를 적절하게 포함하거나 포함하지 않을 수 있음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 기재된 한 양태에서, 본 발명자들은 3회의 독립적인 스크린에서 PCLX-001에 의한 NMT 억제에 대한 모든 주요 암 유형을 포함하는 300개의 암 세포주의 민감도를 테스트했다. PCLX-001은 NMT 억제제 DDD85646의 경구 생체이용가능한 유도체이며 인간 NMT에 대해 더 선택적이며 강력하다(표 1)38. 본 발명자들은 PCLX-001이 시험관 내에서(in vitro) 혈액암 세포의 생존력과 성장을 다른 암 세포 유형이나 선별된 정상 세포의 생존력과 성장에 대한 억제에 비해 더 효과적으로 억제함을 입증했다. PCLX-001은 여러 B세포 림프종 세포주에서 초기 BCR-매개 생존 신호를 방해하고 수많은 미리스토일화 및 비-미리스토일화 BCR 이펙터의 분해를 촉진하여 아폽토시스를 촉발한다. 더 중요한 것은 PCLX 001이 3개의 림프종 뮤린 이종이식 모델 중 2개에서 용량 의존적 종양 퇴행 및 완전한 종양 퇴행을 일으킨다는 것이다.
[표 1]
Figure pct00001
DDD86481로도 알려진 PCLX-001의 구조는 다음과 같다.
Figure pct00002
DDD85646(PCLX-002)의 구조는 다음과 같다.
Figure pct00003
본 명세서에 기재된 또 다른 양태에서, PCLX-001은 항-염증제로 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 또 다른 양태에서, PCLX-001은 항-자가면역제로 사용될 수 있다.
한 양태에서, 치료적 유효량의 PCLX 001을 투여하는 것을 포함하는, 암에 걸렸거나, 암을 앓고 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 예에서, 암은 림프종이다. 더 구체적인 예에서, 암은 B 세포 림프종이다.
한 양태에서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질환 또는 장애가 있거나, 염증성 질환 또는 장애가 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 따라서, 일부 예에서 PCLX-001은 항-염증제로 사용될 수 있다.
한 양태에서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환 또는 장애가 있거나, 자가면역 질환 또는 장애가 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 따라서, 일부 예에서, PCLX-001은 항-자가면역제로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암(cancer)"은 비정상적이고 제어되지 않는 세포 성장에 의해 야기되는 다양한 상태를 지칭한다. 암을 유발할 수 있는 세포는 "암 세포(cancer cells)"로 지칭되며, 제어되지 않는 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식 속도, 및/또는 특정한 전형적인 형태학적 특징과 같은 특징적인 특성을 가지고 있다. 암 세포는 종양의 형태일 수 있지만, 이러한 세포는 대상체 내에 단독으로 존재할 수도 있고 비종양형성 암 세포일 수도 있다. 암은 종양 또는 종양들의 존재를 검출(예를 들어, 임상적 또는 방사선학적 수단에 의해), 종양 내 또는 다른 생물학적 샘플(예를 들어, 조직 생검)로부터의 세포를 검사, 암을 나타내는 혈액 마커를 측정, 및 암을 나타내는 유전자형을 검출하는 것을 포함하나, 이로만 제한되는 것은 아닌, 다수의 방법 중 임의의 방법으로 검출될 수 있다. 그러나, 위의 검출 방법 중 하나 이상에서 음성 결과가 반드시 암이 없음을 나타내는 것은 아니며, 예를 들어, 암 치료에 대해 완전한 반응을 보인 환자는 후속 재발에 의해 입증되는 바와 같이 여전히 암을 가지고 있을 수 있다.
일반적으로, 질병의 중증도의 결정은 특정 질병 특징, 예를 들어, 암이 전-전이성인지 아니면 전이성인지 여부, 암의 병기 및/또는 등급 등의 확인을 필요로 한다는 것이 이해될 것이다.
병기(Staging)는 대상체에서 암이 얼마나 진행되었는지를 설명하는 데 사용되는 프로세스이다. 병기는 예후를 결정하고, 치료를 계획하고, 그러한 치료의 결과를 평가하는데 중요할 수 있다. 상이한 유형의 암에 대해 상이한 암 병기 시스템을 사용해야 할 수도 있지만, 대부분의 병기 시스템은 일반적으로 암이 해부학적으로 얼마나 퍼졌는지 설명하고 동일한 병기 그룹에 유사한 예후 및 치료를 가진 대상체를 배치하려고 시도한다.
대부분의 고형 종양, 일부 백혈병 및 림프종에 사용되는 일반적인 병기 결정 시스템의 예는 전체 병기 그룹화 시스템 및 TNM 시스템이다. 전체 병기 그룹화 시스템에서, 암의 4단계를 나타내기 위해 로마 숫자 I 내지 IV를 사용한다. 일반적으로 암이 림프절로 전이되지 않고 원발성 병변 부위에서만 발견되는 경우를 I 기라고 한다. Ⅱ기 및 Ⅲ기 암은 일반적으로 국소적으로 진행되고/되거나 국소 림프절로 전이된다. 예를 들어, 암이 국소적으로 진행되고 가장 가까운 림프절로만 전이된 경우, 이를 Ⅱ기라고 한다. Ⅲ기에서, 암은 국소적으로 진행되고, 일반적으로 원발성 병변 부위에 근접한 림프절로 전이된다. 원발성 종양에서 간, 뼈, 뇌 또는 다른 부위와 같은 신체의 먼 부분으로 전이된 암을 가장 진행된 단계인 Ⅳ기라고 한다. 따라서, I기 암은 일반적으로 치료가능한 작은 국소 암이며, Ⅳ기 암은 일반적으로 수술불가능하거나 또는 전이성 암을 나타낸니다. 다른 병기 결정 시스템과 마찬가지로, 특정 병기 및 치료에 대한 예후는 종종 암 유형에 따라 다르다. 일부 암의 경우, 4개의 예후 그룹으로 분류하는 것은 불충분하며 전체 병기는 하위 그룹으로 더 나뉜다. 대조적으로, 일부 암은 4개 미만의 병기 그룹을 가질 수 있다.
눈에 보이는 종양이 모두 박멸된 후에 재발하는 암을 재발성 질환이라고 하며, 원발성 종양이 있는 위치에서의 국소 재발과 원위 전이를 나타내는 원위 재발이 있다.
병기 시스템에 대한 변형은 암 유형에 따라 달라질 수 있다. 또한 특정 유형의 암. 개별 암에 대한 병기 시스템은 새로운 정보로 수정될 수 있으며, 그에 따른 병기는 특정 암에 대한 예후 및 치료를 변경할 수 있다.
암의 "등급(grade)"은 종양이 동일한 유형의 정상 조직과 얼마나 유사한지를 설명하는 데 사용될 수 있다. 종양의 현미경적 외관을 기반으로, 병리학자는 세포 형태, 세포 조직 및 기타 분화 마커와 같은 매개변수를 기반으로 종양의 등급을 식별한다. 일반적 규칙으로, 종양의 등급은 성장 속도 또는 공격성에 상응하며, 종양은 일반적으로 가장 덜 공격적인 것(등급 I)에서 가장 공격적인 것(등급 IV)까지 분류된다.
따라서 등급이 높을수록 암은 더 공격적이고 빠르게 성장한다. 종양 등급에 대한 정보는 치료 계획 및 예후 예측에 유용하다.
일부 예에서, 림프종의 경우, 단계 Ⅰ은 림프절의 한 그룹에서만 림프종을 의미한다. Ⅱ기는 두 개 이상의 림프절 그룹이 영향을 받지만 모두 횡격막 위 또는 아래에 있거나 모두 가슴에 있거나 모두 복부에 있는 것을 지칭한다. Ⅲ기는 흉부와 복부 모두에서 두 개 이상의 림프절 그룹이 영향을 받는 것을 지칭한다. Ⅳ기는 림프종이 적어도 하나의 기관(예를 들어, 골수, 간 또는 폐)뿐 아니라 림프절에 있는 것을 지칭한다. 위의 단계에 추가 지정이 추가될 수 있다. 예를 들어, "A"는 일반적으로 환자가 임의의 고질적 증상을 경험하지 않았다는 것을 의미한다. "B"는 환자가 B 증상(예를 들어, 발열, 야간 발한, 체중 감소)을 경험했음을 의미한다. X는 환자가 부피가 큰 질병(예를 들어, 크기가 10cm를 초과하는 큰 종양)을 가지고 있음을 의미한다. E는 환자에게 결절외 질환(예를 들어, 림프절 외부 질환)이 있음을 의미한다.
구체적인 예에서, 암은 림프종이다.
용어 "림프종(lymphoma)"은 일반적으로 림프계의 암을 포함하는 림프계의 악성 신생물을 지칭한다. 림프종의 두 가지 주요 유형은 호지킨병(HD 또는 HL)과 비호지킨 림프종(NHL)이다. 비정상 세포는 림프절을 확장시키는 집단(congregations)으로 나타나며, 체내에서 고형 종양을 형성하거나, 더 드물게는 백혈병과 같이 혈액을 순환한다. 호지킨병 림프종은, 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종; 고전적 호치킨 림프종; 결절성 경화증 호지킨 림프종; 림프구가 풍부한 고전적 호치킨 림프종; 혼합 세포성 호치킨 림프종; 림프구 고갈 호치킨 림프종을 포함한다. 비호지킨 림프종에는 소림프구성 NHL, 여포성 NHL; 외투세포 NHL; 점막 관련 림프조직(MALT) NHL; 확산성 거대 세포 B 세포 NHL; 종격동 거대 B 세포 NHL; 전구체 T 림프구성 NHL; 피부 T 세포 NHL; T 세포 및 자연 살해 세포 NHL; 성숙(말초) T-세포 NHL; 버킷 림프종; 균상 식육종; 세자리 증후군(Sezary Syndrome); 전구체 B 림프구성 림프종; B-세포 소림프구성 림프종; 림프형질세포성 림프종; 척추 변연부 B-세포 림프종; 결절 변연부 림프종; 형질 세포 골수종/형질세포종; 혈관내 거대 B 세포 NHL; 원발성 삼출성 림프종; 모세포 자연 살해 세포 림프종; 장질환형 T 세포 림프종; 간비장 감마-델타 T 세포 림프종; 피하 지방층염 유사 T-세포 림프종; 혈관면역모세포성 T세포 림프종; 및 원발성 전신성 역형성 거대 T/무세포 림프종을 포함한다.
특정 예에서, 림프종은 B-세포 림프종이다.
일부 예에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및/또는 조성물(예를 들어, PCLX-001)은 암 발생 및 진행의 다양한 단계 및 등급을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, PCLX-001은, 예를 들어, 질병을 치료하거나 암의 퇴행을 유발하려는 의도로 작고, 느리게 성장하고, 국소화되고/되거나 비공격적일 수 있는 초기 신생물을 포함하는 초기 암의 치료에 사용될 수 있을 뿐 아니라, 진행성 및/또는 전이성 및/또는 공격성 신생물을 포함하는 중기 암의 치료 및 말기 암의 치료에서, 예를 들어, 질병의 진행을 늦추거나, 전이를 감소시키거나, 환자의 생존율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, PCLX-001은 저등급 암, 중간 등급 암 및/또는 고등급 암의 치료에 사용될 수 있다.
일부 예에서, PCLX-001은 무통성(indolent) 암, 국소 재발, 원위 재발 및/또는 불응성 암(즉, 치료에 반응하지 않은 암)을 포함하는 재발성 암, 전이성 암, 국소적으로 진행된 암 및 공격적인 암의 치료에 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 예에서, PCLX-001은 단독으로 또는 1차 요법 또는 보조 요법(adjuvant therapy)의 일부로서 하나 이상의 치료제와 함께 사용될 수 있다. "일차 요법(Primary therapy)" 또는 "1차 요법(first-line therapy)"은 대상체에서 암의 초기 진단 시의 치료를 지칭한다. 예시적인 일차 요법은 수술, 광범위한 화학요법, 면역요법 및/또는 방사선요법을 포함할 수 있다. 1차 또는 일차 요법이 전신 화학 요법 또는 면역 요법이 아닌 경우, 후속 화학 요법 또는 면역 요법은 "1차 전신 요법"으로 간주될 수 있다. 한 예에서, PCLX-001은 1차 전신 요법에 사용될 수 있다.
용어 "보조 요법(adjuvant therapy)"은 일차 요법을 준수하고 재발 위험이 있는 대상체에게 투여되는 요법을 지칭한다. 보조 전신 요법은 전형적으로 재발을 지연시키거나, 생존을 연장시키거나, 대상체를 치료하기 위해 일차 요법 직후에 시작된다. 불응성 암의 치료는 "2차 요법"으로 지칭될 수 있고, 1차 요법에 더하여 본 발명의 고려된 용도이다.
본 명세에서 사용되는 용어 "샘플(sample)"은 유전자 발현 수준, 단백질 수준, 효소 활성 수준 등에 대해 분석될 수 있는 하나 이상의 세포를 포함하는 유체, 세포 또는 조직 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는 대상체로부터의 임의의 샘플을 의미한다. 샘플은, 예를 들어, 혈액 샘플, 분획된 혈액 샘플, 골수 샘플, 생검, 냉동 조직 샘플, 신선한 조직 샘플, 세포 샘플, 및/또는 파라핀 포매된 절편, 상대적인 mRNA 수준을 측정할 수 있도록 충분한 양과 적절한 품질로 RNA를 추출할 수 있는 물질, 또는 상대적인 폴리펩티드 수준을 측정할 수 있도록 충분한 양과 적절한 품질로 폴리펩티드를 추출할 수 있는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 조합물은 초기 단계 암의 치료에 사용된다. 또다른 실시형태에서, 조합물은 초기 암에 대한 1차 전신 요법으로 사용된다.
다른 예에서, PCLX-001은 말기 및/또는 진행성 및/또는 전이성 암의 치료에 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, PCLX-001은 말기 및/또는 진행성 및/또는 전이성 암의 치료를 위한 1차 전신 요법으로서 투여될 수 있다.
구체적인 예에서, PCLX-001은 림프종의 치료에 사용될 수 있다. 보다 구체적인 예에서, PCLX-001은 B 세포 림프종의 치료에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 나타난 바와 같이, PCLX-001은 BCR을 억제하므로, 항-염증제 및/또는 항-자가면역제로 사용될 수 있다.
용어 "면역 세포(immune cell)"는 일반적으로 면역 반응에서 역할을 하는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 상기 용어는 선천적 또는 후천적 면역 시스템 모두의 면역 세포를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급되는 면역 세포는 임의의 분화 단계(예를 들어, 줄기 세포, 전구 세포, 성숙 세포) 또는 임의의 활성화 단계에 있는 백혈구일 수 있다. 면역 세포는 림프구(예를 들어, 자연 살해 세포, T-세포(예를 들어, 흉선 세포, Th 또는 Tc; Th1, Th2, Th17, Τ11αβ, CD4+, CD8+, 이펙터 Th, 기억 Th, 조절 Th, CD4+/CD8+ 흉선 세포, CD4-/CD8- 흉선 세포, γδ T 세포 등) 또는 B-세포(예를 들어, 프로-B 세포, 초기 프로-B 세포, 후기 프로-B 세포, 프리-B 세포, 거대 프리-B 세포, 작은 프리-B 세포, 미성숙 또는 성숙 B 세포, 임의의 이소형의 생성 항체, T1 B-세포, T2, B-세포, 나이브 B 세포, GC B-세포, 형질모세포, 기억 B-세포, 형질 세포, 여포 B-세포, 변연부 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 조절 B 세포 등을 포함), 예컨대, 예를 들어, 다양한 하위유형, 성숙, 분화 또는 활성화 단계를 포함하는, 단핵구(예를 들어, 고전적, 비-고전적, 또는 중간 단핵구 포함), (분절 또는 줄무늬) 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 조직구(histiocytes), 미세아교세포, 예컨대, 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 골수성 전구세포, 림프구 전구세포, 골수모세포, 전골수세포, 골수세포, 후골수세포, 단모세포, 전단핵세포, 림프모세포, 전림프구, 작은 림프구, 대식세포(예를 들어, 쿠퍼 세포, 성상 대식세포, M1 또는 M2 대식세포 포함), (골수성 또는 림프성) 수지상 세포(예를 들어, 랑게르한스 세포, 통상적 또는 골수 수지상 세포, 형질세포 수지상 세포, mDC-1, mDC 2, Mo-DC, HP-DC, 가려진 세포 포함), 과립구, 다형핵세포, 항원제시세포(APC) 등을 포함한다.
"B 세포(B cell)"라는 용어는 적응 면역 시스템의 체액성 면역에 있는 림프구 유형을 지칭한다. B 세포는 주로 항체를 만드는 기능을 하고, 항원 제시 세포 역할을 하며, 사이토카인을 방출하고, 항원 상호작용에 의해 활성화된 후 기억 B 세포를 발달시킨다. B 세포는 세포 표면에 B 세포 수용체가 존재한다는 점에서 T 세포와 같은 다른 림프구와 구별된다.
"T 세포(T cell)"라는 용어는 흉선에서 성숙하는 림프구 유형을 지칭한다. T 세포는 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체가 존재한다는 점에서 B 세포와 같은 다른 림프구와 구별된다.
B 세포 수용체(BCR) 및 BCR 복합체 B 세포는 항체 생성을 담당하는 면역계 세포이다. 항원에 대한 B 세포 반응은 정상적인 면역 체계의 필수 구성 요소이다. B 세포는 특화된 세포 표면 수용체(B 세포 수용체; "BCR")를 보유한다. B 세포가 해당 세포의 BCR에 결합할 수 있는 항원을 만나면 B 세포는 증식하도록 자극되어 결합된 항원에 특이적인 항체를 생성한다. 항원에 대한 효율적인 반응을 생성하려면, BCR 관련 단백질과 T 세포 지원도 필요하다.
BCR을 통한 신호전달은 항체 생성, 자가면역 및 면역학적 내성 확립에 중요한 역할을 한다.
항-BCR 복합 항체는 자가면역, 암, 염증성 질환 및 이식의 치료에 치료 용도를 갖는다.
따라서, 본 명세서에 나타난 바와 같이, PCLX-001은 BCR을 억제하므로 항-염증제 및/또는 항-자가면역제로 사용될 수 있다.
첨부 도면 16-18에 나타낸 바와 같이, PCLX-001은 TCR을 억제하므로 항-염증제 및/또는 항-자가면역제로 사용될 수 있다. 용어 "T 세포 수용체"(TCR)은 α 사슬과 β 사슬 또는 γ 사슬과 δ 사슬을 포함하는 T 세포 표면에서 발견되는 이종이량체를 지칭한다. T 세포 수용체는 MHC 분자와 관련된 처리된 항원을 인식한다.
T 세포 수용체(TCR) 신호를 억제하는 것은 광범위한 인간 T 세포-매개 자가면역 및 염증 질환을 치료할 가능성이 있다.
다른 예에서, NMT 억제제는 BCR 및 TCR을 억제할 수 있다.
또 다른 예에서, DDD85646은 BCR 및 TCR을 억제하는 데 사용될 수 있다.
다른 예에서, 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2010/026365에 기재된 NMT 억제제를 사용하여 BCR 및 TCR을 억제할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "억제하다(inhibit)" 또는 "억제제(inhibitor)"는 단백질 합성, 수준, 활성 또는 기능을 억제하는 임의의 방법 또는 기술 뿐만 아니라 관심 단백질의 합성, 수준, 활성, 또는 기능의 유도 또는 자극을 억제하는 방법을 의미한다. 일부 예에서, 용어는 또한 관심 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능을 조절할 수 있는 임의의 대사 또는 조절 경로를 지칭한다. 이 용어는 다른 분자와의 결합 및 복합체 형성을 포함한다. 따라서, 용어 "억제제"는 그 적용이 단백질 기능 또는 단백질 경로 기능의 억제를 초래하는 작용제 또는 화합물을 지칭한다. 그러나, 이 용어는 이들 기능 중 각각 그리고 모두가 동시에 억제되어야 함을 의미하지는 않는다.
따라서, 일부 예에서, 본 명세서의 화합물 및 조성물은 염증성 장애를 앓거나 앓는 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, PCLX-001은 염증성 질환을 앓거나 앓는 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 일부 예에서 PCLX-001은 항-염증제로 사용될 수 있다.
다른 예에서, DDD85646은 염증성 장애가 있거나 염증성 장애가 있는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, DDD85646은 항-염증제로 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, WO 2010/026365에 기술된 NMT 억제제는 염증성 장애를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, WO 2010/026365에 기재된 NMT 억제제는 항-염증제로 사용될 수 있다.
항염증이라는 용어는 염증을 예방하거나 감소시키는 물질 또는 치료제의 특성을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "장애(disorder)" 및 "질병(disease)"은 대상체의 상태를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 특히, "염증성 질환(inflammatory disease)"이라는 용어는 "염증성 장애(inflammatory disorder)"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "염증(inflammation)", "염증 상태(inflammatory state)" 또는 "염증 반응(inflammatory response)"은 유해한 자극, 예컨대 병원체, 손상된 세포 또는 자극물에 대한 개인의 혈관 조직의 복잡한 생물학적 반응을 나타내고, 사이토카인, 보다 구체적으로는 전 염증성 사이토카인, 즉 미세아교세포와 같은 활성화된 면역 세포에 의해 주로 생성되고 염증 반응의 증폭에 관여하는 사이토카인의 분비를 포함한다. 일부 예에서, 염증은 급성 염증 및 만성 염증을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "급성 염증(acute inflammation)"은 혈장 및 백혈구에 의한 조직 침윤으로 인한 염증의 전형적인 징후(부기, 발적, 통증, 발열, 및 기능 상실)를 특징으로 하는 단기 과정을 나타낸다. 급성 염증은 일반적으로 유해한 자극이 존재하는 한 발생하며, 자극이 제거, 분해 또는 흉터 형성(섬유증)으로 막히면 중단된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "만성 염증(chronic inflammation)"은 동시 활성 염증, 조직 파괴, 및 복구 시도를 특징으로 하는 상태를 나타낸다. 만성 염증은 위에 나열된 급성 염증의 전형적인 징후을 특징으로 하지 않는다. 대신, 만성 염증 조직은 단핵 면역 세포(단핵구, 대식세포, 림프구, 및 형질 세포)의 침윤, 조직 파괴, 및 치유 시도를 특징으로 하며, 여기에는 혈관신생 및 섬유증이 포함된다.
일부 예에서, 염증성 장애는 급성, 유착성, 위축성, 카타르성, 만성, 간경변성, 미만성, 파종성, 삼출성, 섬유소성, 섬유화성, 국소성, 육아종성, 과형성, 비대성, 간질성, 전이성, 괴사성, 폐쇄성, 실질성, 가소성, 생산성, 증식성, 위막성, 화농성, 경화성, 혈청형, 장액성, 단순성, 특이성, 아급성, 화농성, 독성, 외상성, 및/또는 궤양성 염증이다.
일부 예에서, 염증성 장애는 위장 장애(예컨대, 소화성 궤양, 국소 장염, 게실염, 위장 출혈, 호산구성), 위장 장애(예컨대, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 대장염), 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD, 또는 GERD), 염증성 장 질환(IBD)(예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염, 베체트 증후군, 불확정 대장염) 및 염증성 장 증후군(IBS))으로부터의 것이다.
일부 예에서, 염증성 장애는 흉막염, 폐포염, 맥관염, 폐렴, 만성 기관지염, 기관지확장증, 미만성 범세기관지염, 과민성 폐렴, 천식, 특발성 폐 섬유증(IPF) 및 낭포성 섬유증으로부터 선택된 폐의 장애이다.
따라서, 일부 예에서, 본 명세서의 화합물 및 조성물은 자가면역 질환 또는 장애를 앓거나 앓는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, PCLX-001은 자가면역 질환 또는 장애를 앓거나 앓는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 예에서 PCLX-001은 항-자가면역제로 사용될 수 있다.
다른 예에서, DDD85646은 자가면역 장애를 앓거나, 앓는 것으로 의심되는 대상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 예에서 DDD85646은 항자가 면역제로 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, WO 2010/026365에 기재된 NMT 억제제는 자가면역 장애를 앓거나, 앓는 것으로 의심되는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, WO 2010/026365에 기재된 NMT 억제제는 항-자가면역제로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "장애(disorder)" 및 "질환(disease)"은 대상체의 상태를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 특히, "자가면역 질환(autoimmune disease)"이라는 용어는 "자가면역 장애(autoimmune disorder)"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "자가면역 질환(autoimmune disease)"은 항원 항체 복합체를 형성하기 위해 환자 자신의 세포와 반응성인 자가항체의 형성과 관련된 임의의 질병 상태 또는 병태를 지칭한다. 용어 "자가면역 질환"은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 자가면역성 갑상선염 및 자가면역성 용혈성 빈혈을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 특정 외부 요인에 의해 정상적으로 촉발되지 않는 상태를 비롯하여, 외부 요인에 의해 촉발되는 질환, 예를 들어, 급성 류마티스 열을 포함한다.
자가면역 질환의 다른 예에는 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 홍반성 루푸스가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며, 및 인슐린 의존성 당뇨병(1형)은 자가면역 상태의 예인 것으로 여겨진다.
자가면역 질환의 추가 예에는 위염, 대장염, 및 인슐린 의존성 자가면역 당뇨병, 이식편 이식/거부 억제, 이식편 대 숙주 질환이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체(subject)"는 동물을 지칭하고, 예를 들어, 고양이, 개 등과 같은 가축화 동물, 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 실험동물(마우스, 토끼, 랫트, 기니피그 등), 포유류, 비인간 포유류, 영장류, 비인간 영장류, 설치류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및 임의의 다른 동물을 포함할 수 있다.
특정 예에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료(treatment)" 또는 "치료하다(treat)"는 임상 결과를 포함하여 유익한 또는 원하는 결과를 얻는 것을 의미한다. 유익한 또는 원하는 임상 결과에는, 검출가능하던지 검출불가능하던지 관계없이, 하나 이상의 증상 또는 상태의 경감 또는 개선, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병의 확산 방지, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선 또는 완화, 질병 재발의 감소, 및 완화(부분적이든 전체적이든)가 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료하는(Treating)" 및 "치료(Treatment)"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존 기간과 비교하여 생존 기간을 연장하는 것을 의미할 수도 있습니다. 본 명세서에서 사용되는 "치료하는" 및 "치료"는 또한 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 초기 암, 예를 들어 초기 단계 림프종을 앓는 대상체는 진행을 방지하기 위해 치료될 수 있거나 또는 대안적으로 완화된 대상체는 재발을 방지하기 위해 본 명세서에 기재된 화합물 또는 조성물로 치료될 수 있다.
용어 "예방하다(prevent)" 또는 "예방(prevention)"은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 예방하고/하거나 늦추는 예방적 또는 예방적 조치를 지칭한다. 따라서 예방이 필요한 사람은 장애가 발생할 위험이 있거나 발병하기 쉬운 사람을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법을 적용받지 않은 환자에 비해, 환자에서 일시적으로 또는 영구적으로, 예를 들어, 질병 또는 장애와 관련된 더 적거나 덜 심각한 증상, 또는 나중에 발병된 질병 또는 장애와 관련된 증상이 발달하게 되는 경우, 질병 또는 장애는 본 명세서에 제공된 방법에 따라 성공적으로 예방되는 것이다.
일부 예에서, 치료는 대상체에서 질병의 증상의 개시 또는 완화의 예방 또는 지연 또는 원하는 생물학적 결과의 달성을 초래한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단(diagnosis)"은 림프종 또는 다른 유형의 암의 확인과 같은 분자 및/또는 병리학적 상태, 질병 또는 병태의 확인을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "완화하다(alleviates)"는 이상 또는 증상을 포함하는 상태, 질환, 장애 또는 표현형의 감소, 감소 또는 제거를 의미한다.
일부 예에서, 약학적 유효량의 PCLX-001이 사용된다. 일부 예에서, 치료적 유효량의 PCLX-001이 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount)" 또는 "유효량(effective amount)"은 연구자 또는 임상의가 찾고 있는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도할 약물 또는 약제의 양을 지칭한다. 이 양은 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"일 수 있다. 이들 용어는 단일 또는 다중 용량 투여시 질환 또는 상태를 갖는 대상체를 치료하는 본 명세서에 기재된 화합물 및/또는 조성물의 양을 지칭한다. 유효량은 공지 기술을 사용하고 유사한 상황에서 얻은 결과를 관찰함으로써, 당업계 숙련자로서 담당 진단의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 유효량, 용량을 결정할 때, 담당 진단의는 다음을 포함하지만, 이로만 제한되는 것은 아닌 여러 요인을 고려한다: 대상체의 종류; 이의 체구, 연령 및 일반적인 건강; 관련된 특정 상태, 장애 또는 질병; 병태, 장애 또는 질환의 정도 또는 관여 또는 중증도, 개별 대상체의 반응; 투여된 특정 화합물; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특성; 선택된 용량 섭생; 병용 약물 사용; 및 기타 관련 상황.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 원하는 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간 동안 유효한 양을 지칭한다. 유효량은 대상체의 질병 상태, 연령, 성별 및/또는 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 그러한 양에 해당할 수 있는 주어진 화합물 또는 조성물의 양은 주어진 약물 또는 화합물, 약제학적 제형, 투여 경로, 치료되는 대상체의 신원 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으나, 그럼에도 불구하고 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 대상체의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투여 형태(예컨대 단위 투여량)를 포함하며, 합리적인 이익/위험 비율에 상응한다. 각각의 담체, 부형제 등은 또한 제제의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용가능(acceptable)"하다.
용어 "부형제(excipient)"는 희석제, 윤활제, 계면활성제, 담체 등과 같은 약리학적 불활성 성분을 의미한다. 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제는 일반적으로 안전하고 무독성이며 인간의 약제학적 사용에 허용된다. 부형제에 대한 언급은 이러한 부형제를 하나 이상 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 인산염 완충 식염수, 물, 에멀젼(예컨대, 예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼), 및 다양한 유형의 습윤제, 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 라우릴 황산나트륨, 등장성 및 흡수 지연제, 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 안정화제 및 방부제 등를 포함하나, 이로만 제한되는 것은 아닌, 임의의 표준 약제학적 담체를 지칭한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 무독성 약제학적으로 허용가능한 담체, 보조제 및 비히클을 함유하는 투여 단위 제형으로 경구, 국소, 비경구, 흡입 또는 분무에 의해 또는 직장으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
약제학적 조성물은, 예를 들어, 정제, 트로키제, 로젠지제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르와 같은 경구 사용에 적합한 형태일 수 있다. 경구 용도로 의도된 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 대해 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 약학적으로 우아하고 맛있는 제제를 제공하기 위해 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제는, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립화 및 붕해제; 전분, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 및 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제를 포함하는, 적합한 무독성 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 정제는 비코팅될 수 있거나, 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키기 위해 공지된 기술에 의해 코팅되어 보다 장기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다.
경구 용도를 위한 약제학적 조성물은 또한 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 땅콩 기름, 액체 파라핀 또는 올리브 기름과 같은 오일 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.
수성 현탁액은, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아와 같은, 현탁제; 분산제 또는 습윤제, 예를 들어, 레시틴과 같은 자연 발생 인지질, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타-데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨에서 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함하는, 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 함유한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 또는 하나 이상의 감미제, 예를 들어 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
유성 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일에 현탁시키거나, 액체 파라핀과 같은 미네랄 오일에 현탁시켜 제형화할 수 있다. 유성 현탁액은, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 증점제를 함유할 수 있다. 상기한 것과 같은 감미제 및/또는 착향료를 첨가하여 입맛에 맞는 경구 제제를 제공할 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제를 첨가하여 보존할 수 있다.
물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성 화합물을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 상기 이미 언급된 것들에 의해 예시된다. 추가 부형제, 예를 들어, 감미료, 착향료 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 오일 상은, 예를 들어, 올리브 오일 또는 아라키스 오일과 같은 식물성 오일, 또는, 예를 들어, 유동 파라핀과 같은 미네랄 오일이거나, 이들 오일의 혼합물일 수 있다.
적합한 유화제는 천연 검, 예를 들어, 아카시아 검 또는 트래거캔스 검; 자연 발생 인지질, 예를 들어, 대두, 레시틴; 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르, 무수물, 예를 들어, 솔비탄 모노올레이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레이트일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미료 및 착향료를 포함할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 또는 수크로스와 함께 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한 진정제, 방부제, 및/또는 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제, 및 상기 언급된 것과 같은 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 또한, 예를 들어, 1,3-부탄다이올 용액과 같은 비독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매에는 물, 링거액, 젖산 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예는 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용되는 멸균 고정 오일, 및, 예를 들어, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는 다양한 무자극 고정 오일이다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제 제조에 사용된다.
일부 예에서, 치료 방법은 치료적 유효량의 본 명세서에 기술된 화합물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 임의로 단일 투여 또는 적용으로 구성되거나, 대안적으로 일련의 투여 또는 적용을 포함한다.
일부 예에서, 제형(들)은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고 약학 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을 하나 이상의 보조 성분을 구성할 수 있는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시킨 다음, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
화합물 및 조성물은 전신/말초 또는 목적하는 작용 부위에 임의의 편리한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있으며, 여기에는 경구(예를 들어, 섭취에 의한); 국소(예를 들어, 경피, 비강내, 안구, 협측 및 설하 포함); 폐(예를 들어, 입이나 코를 통해, 예를 들어, 에어로졸을 사용하는 흡입 또는 통기 요법에 의해); 직장; 질; 비경구, 예를 들어 피하, 종양내, 피내, 근육내, 정맥내, 동맥내, 심장내, 척수강내, 척수내, 피막내, 피막하, 안와내, 복강내, 기관내, 피하, 관절내, 지주막하, 및 흉골내를 포함하는 주사; 예를 들어, 피하 또는 근육 내 저장소(depot)의 임플란트에 의한 투여가 포함되나, 이로만 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "접촉(contacting)"은, 예를 들어, 화합물이 세포에 전달될 수 있는 과정을 지칭한다. 화합물은 세포로의 직접 도입(즉, 세포내) 및/또는 공동, 간질 공간으로의, 또는 유기체의 순환으로의 세포외 도입을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 방식으로 투여될 수 있다.
따라서, 일부 예에서 접촉은 생체내에서(in vivo) 일어난다. 다른 예에서, 접촉은 시험관내에서(in vitro) 발생할 수 있다.
"세포(cell)"는 개별 세포 또는 세포 배양물을 의미한다. 한 예에서, 세포는 대상체로부터 획득되거나 유래된 세포이다. 세포 및 적합한 배양 배지의 배양은 공지되어 있다.
(예를 들어, 섭취에 의한) 경구 투여에 적합한 제형은 캡슐, 사쉐 또는 정제와 같은, 별개의 단위로, 각각은 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유함; 분말 또는 과립으로; 수성 또는 비수성 액체의 용액 또는 현탁액; 또는 수중유 액체 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼으로서; 볼루스로서; 연약(electuary)으로; 또는 페이스트로 제공될 수 있다.
비경구 투여(예를 들어, 피부, 피하, 근육내, 정맥내 및 피내를 포함하는 주사에 의한)에 적합한 제형은, 항산화제, 완충제, 방부제, 안정제, 정균제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비수성 등장성, 무발열성 멸균 주사 용액; 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액, 및 화합물을 혈액 성분 또는 하나 이상의 기관에 표적화하도록 설계된 리포솜 또는 기타 미립자 시스템을 포함한다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장 비히클의 예는 염화나트륨 주사액, 링거 용액 또는 락티드 링거 주사액을 포함한다. 이러한 제형에 사용하기에 적합한 등장 비히클의 예에는 염화나트륨 주사액, 링거 용액 또는 락티드 링거 주사액이 포함된다.
제형은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기, 예를 들어 앰플 및 바이알에 제공될 수 있고, 멸균 액체 담체, 예를 들어, 사용 직전에 주사를 위한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 및 정제로 준비할 수 있다. 제형은 활성 화합물을 혈액 성분 또는 하나 이상의 기관에 표적화하도록 설계된 리포좀 또는 기타 미립자 시스템의 형태일 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물 및/또는 조성물은 치료할 상태에 따라 동시에(또는 실질적으로 동시에) 또는 순차적으로 투여될 수 있고, 다른 치료제(들)와 함께 투여될 수 있다. 다른 치료제(들)는 동시에(또는 실질적으로 동시에) 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료 또는 투여량 처방(treatment or dosage regimen)"은 제2 약물을 추가하거나 추가하지 않은 투약량, 투여 빈도, 또는 치료 지속기간의 조합을 의미한다.
화합물 또는 조성물은 치료될 상태에 따라 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
대상체를 치료함에 있어서, 치료적 유효량이 대상체에게 투여될 수 있다.
제형은 편리하게 단위 투여량 형태로 제공될 수 있고 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을, 하나 이상의 보조 성분을 구성할 수 있는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 친밀하게 결합시킨 다음, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
본 명세서에 개시된 화합물 및/또는 화합물을 포함하는 조성물은 당업자에게 공지된 바와 같이 표준 치료 요법과 함께 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다.
일부 예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 포함하는 치료 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 화합물 또는 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여, 수용액, 동결건조된 또는 기타 건조된 제형의 형태로 제조할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 인산염, 구연산염, 히스티딘 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 Tween™, Pluronics™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
치료 제형은 또한 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 전형적으로 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 활성 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 적절하게 조합되어 존재한다.
숙련된 작업자는 라벨 상의 지침에 따라 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다. 본 명세서에 기술된 화합물 또는 조성물과 함께 또는 부수적으로 투여되는 상업적으로 이용가능한 제2 치료제 및 기타 화합물의 제조 및 투약 일정은 제조자의 지시에 따라 사용되거나 숙련된 의사에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
적절한 투여량을 결정할 때 고려할 수 있는 요인에는 질병 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 특정 성분의 조합, 반응 민감성, 및 치료에 대한 내성/반응이 포함된다.
본 발명의 방법은 이러한 방법에 사용되는 화합물 및/또는 조성물을 키트 형태로 제공함으로써 편리하게 실시된다. 그러한 키트는 바람직하게는 조성물을 함유한다. 이러한 키트는 바람직하게는 사용 설명서를 포함한다.
본 명세서에 기술된 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해, 하기 실시예를 제시한다. 이러한 예는 단지 설명을 위한 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 이들은 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 한다.
실시예
요약
지방산 미리스테이트에 의한 단백질의 N-말단 변형인 미리스토일화는 막 표적화 및 세포 신호전달에 중요하다. 암 세포는 N-미리스토일트랜스퍼라제(NMT) 발현이 종종 증가하기 때문에, NMT는 항암 표적으로 제안되었다. 이를 체계적으로 조사하기 위해, 본 발명자들은 로봇 암 세포주 스크리닝을 수행하였고, 강력한 범(pan)-NMT 억제제인 PCLX-001에 대한, B 세포 림프종을 포함하는 혈액 암 세포주의 현저한 민감성을 발견했다. PCLX-001 처치는 림프종 세포 단백질의 전반적인 미리스토일화에 영향을 미치고 생존에 중요한 초기 B-세포 수용체(BCR) 신호전달 이벤트를 억제한다. PCLX-001은 Src 계열 키나아제의 미리스토일화를 제거하는 것 외에도 이들의 분해를 촉진하고, 예기치 않게 c-Myc, NFkB 및 P-ERK를 포함한 수많은 비-미리스토일화 BCR 이펙터의 분해를 촉진하여, 시험관 내 및 이종이식 모델에서 암세포 사멸을 유도한다. 일부 치료된 림프종 환자는 재발 및 사망을 경험하기 때문에, NMT 억제제로 B 세포 림프종을 표적으로 삼는 것은 잠재적으로 림프종에 많이 필요한 추가 치료 옵션을 제공한다.
결과
PCLX-001은 시험관 내에서 혈액암 세포를 선택적으로 사멸시킨다.
암에서 NMT 억제의 치료 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 다양한 암 세포주에서 PCLX-001의 백분율 성장 억제(GI)를 측정하기 위해 3개의 독립적인 로봇 스크린을 수행했다. Horizon(St. Louis, MO) 플랫폼에서 68개의 세포주를 사용하여, 본 발명자들은 PCLX-001이 다양한 세포주의 성장을 억제함을 밝혀냈다(도 1A). 그러나, GI는 림프종, 백혈병 및 골수종을 포함한 혈액암 세포에서 다른 암 세포주 유형보다 유의하게 더 높았다(P<0.0001)(도 1b). 이 결과는 101개의 세포주 OncolinesTM(Oss, 네덜란드) 스크린(도 1c, d, P = 0.0001, 도 7)과 131개 암 세포주를 3일 및 6일 동안 PCLX-001에 노출시킨 세 번째 스크린(Chempartner, Shanghai, China)(도 9)을 사용하여 요약되었다. PCLX-001 처치 3일 후 중앙값 IC50은 유방암, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)(도 9a, b)을 포함하는 고형 종양(10 μM, 시험 최고 용량; P=0.0038)에서 유래한 세포주와 비교하여 혈액암 세포주(0.166μM)에서 유의하게 낮았다. 그러나, 6일까지 PCLX-001은 테스트한 거의 모든 유형의 암 세포주를 효과적으로 사멸시켰다(도 9c, d).
스크린을 사용하여 얻은 데이터를 확인하기 위해, 본 발명자들은 BL 세포주 BL2, Ramos 및 BJAB, DLBCL 세포주 DOHH2, WSU-DLCL2, SU-DHL-10, 불멸화 B 세포 IM9 및 대조군으로 VDS46를 포함하는 몇 가지 일반적인 B 세포 림프종 세포주에 대한 PCLX-001 처치의 효과를 테스트했다. 본 발명자들은 이 세포에 대해 다음 3가지 유형의 분석을 수행했다: 1) 총 생존 세포 수를 평가하기 위해 판독값이 증식(총 세포 수) 및 생존도(생존 세포의 백분율) 둘 다에 따라 달라지는 CellTiter Blue 분석, 2) 생존 세포의 백분율만 측정하므로 판독값이 증식률과 무관한, Calcein 분석, 및 3) 생존도와는 독립적으로 시간 경과에 따른 세포의 총 수를 단순히 계수하는 세포 증식 분석. PCLX-001과 함께 악성 세포주를 인큐베이션하면 3가지 분석 모두에서 시간과 농도 의존적 방식으로 이들 세포가 사멸되었다. 또한, PCLX-001 처치는, CellTiter Blue(PCLX-001이 4 내지 111배 더 적게 필요함; 도 1e, f) 및 Calcein(PCLX-001이 2 내지 40배 더 적게 필요함; 도 10) 분석으로 측정한 바와 같이, 양성 IM9 및 VDS B 세포를 사멸시키는 데 필요한 것보다 유의하게 더 낮은 농도에서 악성 세포주를 사멸시켰다. PCLX-001은 또한 양성 IM9 및 VDS B 세포와 비교하여 6개의 악성 B 림프종 세포주의 증식 및 생존 능력을 더 잘 억제했다(도 1e-h, EHH 10 및 11). 이를 설명하기 위해, 본 발명자들은 0.05 및 0.1μM PCLX-001로 악성 BL2 세포를 처치하면 이러한 농도에서 양성 IM9 세포에 거의 영향을 주지 않고 시간 경과에 따라 증식이 완전히 억제됨을 밝혀냈다(도 1g, h). 중요하게도, 새로 분리된 인간 림프구 및 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 96시간 PCLX-001 처치는 림프구 생존에 미미한 영향을 미치는 반면, 0.1μM PCLX-001은 PBMC 생존에서 ~50% 감소를 유발했다(도 12). 그러나 살아남은 PBMC는 시험관 내에서 대부분의 혈액암 세포주에 대한 IC50(~0.050-0.100μM)보다 ~100배 더 높은 용량인 최대 10μM의 PCLX-001 처치를 견뎌냈다. 유사한 경향이 1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC; 도 12b)에서 관찰되었다. 종합하면, 이들 데이터는 PCLX-001 처치가 시간 및 농도 의존적 방식으로 다양한 암 세포주의 증식 및 생존력을 선택적으로 억제하고, 특히 시험관 내에서 악성 혈액암 세포를 사멸시키는 데 특히 효율적이라는 것을 보여준다.
미리스토일화 억제는 림프종 세포 아폽토시스를 유도한다
PCLX-001이 표적에 대해 작용하는 것을 확인하기 위해, 본 발명자들은 악성 BL2 림프종 세포 및 양성 IM9 B-세포에서 내인성 단백질 미리스토일화의 억제를 시각화하기 위해 기술된 바와 같이47 클릭 화학을 사용했다(도 2a, b). PCLX-001은 두 세포주 모두에서 농도 의존적 방식으로 전체 단백질 미리스토일화를 억제했다. 그러나, IM9 세포에서 이 양의 5배에 비해 BL2 미리스토일화를 감소시키는 데 ~0.1μM의 PCLX-001만 필요했다(도 2a, b). 이것은 악성 BL2 세포에서 단백질 미리스토일화 과정이 어떻게든 PCLX 001 억제에 더 민감할 수 있음을 시사한다. PCLX-001(표 1)38은 DDD85646/IMP-366과 밀접하게 관련된 유사체이며 최근에 검증된 NMT 억제제 시리즈의 일부이지만38, 39, 본 발명자들은 팔미토일화와 인산화에 미치는 영향을 추가로 평가했다. PCLX-001은 COS-7 세포에서 발현되는 EGFP-N-Ras 구축물의 팔미토일화를 억제하지 않으며(도 13a), 최대 10μM의 농도에서 사전-구성된 scanMAX KINOMEscan™(Eurofins DiscoverX, San Diego, USA)의 468개 인간 키나아제를 유의하게 억제하지도 않았다(도 13b). 참고로, BL2 세포의 경우 PCLX-001의 EC50보다 ~4000배 더 높은 농도인 100μM PCLX-001에서 3개의 가능한 긍정적 히트만 확인되었다. 따라서, PCLX-001의 세포 기능 및 생존 능력에 대한 시간 및 농도 의존적 효과는 NMT-특이적인 것으로 나타났다.
이어서 본 발명자들은 클릭 화학47 및 형광 현미경에 의해 COS-7 세포에서 발현된 절두된 Src-EGFP48 구축물을 사용하여, 공지된 미리스토일화된 단백질인 Src 단백질 티로신 키나아제의 미리스토일화 및 국재화를 모니터링함으로써 NMT 기능의 PCLX-001 억제를 검증했다. PCLX-001은 각각 COS-7 및 IM9 세포에서 농도 의존적 방식으로 WT-Src-EGFP 구축물 및 내인성 Src 둘 다의 미리스토일화를 억제했다(도 2c, d). 특히, 미리스토일화 억제는 WT-Src-EGFP를 COS-7 세포에서 혈장 및 엔도좀 막에서 세포질로 재국재화하여, 비-미리스토일화 Gly2Ala-Src-EGFP 돌연변이 구축물48의 분포 패턴과 비슷한 분포 패턴을 생성했다(도 2e). 내인성 Src 미리스토일화를 억제하면 최대 5일 동안 PCLX-001로 처리된 BL2 및 IM9 세포에서 Src 단백질 수준의 예기치 못한 시간 의존적 감소가 일어나며(도 2f), 이는 IM9 대조군과 비교하여 악성 BL2 세포에서 가속화되었다(P =0.0174, 도 14). 또한, PCLX-001 처리는 BL 세포주 BL2 및 Ramos에서 선택적으로 아폽토시스를 유도하지만, PARP-1 및 카스파제-3 절단에 의해 측정된 바와 같이 불멸화 IM9 B-세포에서는 그렇지 않았으며(도 2g), 이는 PCLX-001 독성에 대해 더 높은 역치를 나타내는 양성 불멸화 B 세포와 일치했다(도 1e, f, 도 10). 전반적으로, 이들 데이터는 PCLX-001이 선택적 세포 사멸을 유도하는 정상 불멸화 B 세포와 비교하여 악성 림프종 세포에서 미리스토일화를 우선적으로 제거함을 시사한다.
PCLX-001은 SFK 수준 및 BCR 하류 신호전달을 감소시킨다.
BCR 신호전들은 B 세포 림프종에서 중요한 생존 신호를 제공하고 SFK(특히 Lyn)는 정상 B 세포와 림프종 모두에서 BCR 신호전달을 개시하는 데 중요한 역할을 한다5,6,11,49,50. PCLX-001 처치는 양성 IM9 대조군과 비교하여 악성 BL2 세포에서 내인성 Src 단백질 수준을 우선적으로 감소시키기 때문에(도 2f), 본 발명자들은 다양한 림프종 세포주의 다른 SFK에서도 유사한 효과가 관찰될 수 있는지 확인하고자 했다. 본 발명자들은 PCLX 001 처리된 BL2, Ramos, BJAB, DOHH2, WSU-DLCL2 및 SU-DHL-10 림프종 세포가 모두 양성 IM9 및 VDS 대조군과 비교하여 Src 및 Lyn SFK 단백질 수준에서 더 현저한 용량 및 시간 의존적 감소를 나타냄을 발견했다(도 3a). 프로테아좀 분해 기전이 관련되어 있는지 조사하기 위해, PCLX-001을 BL2 세포에 24시간 또는 48시간 동안 첨가한 후, 본 발명자들은 BL2 세포를 프로테아좀 억제제 MG132로 처치하거나, 또는 세포를 수확 및 용해하기 전 6시간 동안 처치하지 않고, Src 및 Lyn SFK뿐만 아니라 조혈 세포 키나아제(Hck) 및 림프구 특이 키나아제(Lck)의 잔여 단백질 수준을 측정했으며, SFK 둘 모두는 림프종 진행과도 관련되어 있다50. PCLX-001 처치는 Hck 및 Lck 단백질 수준을 Src 및 Lyn보다 낮은 정도로 감소시켰다(도 3b). 그러나 PCLX-001 처치한 세포에 MG132를 첨가하면 특히 24시간 시점에서 대조군과 비교하여 4개의 SFK 단백질이 부분적으로 또는 완전히 복원되었다(도 3b). 이는 비미리스토일화된 SFK의 분해가 부분적으로 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 기인할 수 있음을 제시한다. MG132에 의한 프로테아좀 억제의 효능은 프로테아좀51에 의해 능동적으로 분해되는 단백질인 Mcl-1 수준을 모니터링함으로써 확인되었다(도 3b).
항원 독립적 기저 BCR 신호전달은 종종 림프종 세포에서 상승하기 때문에6, 49, 본 발명자들은 항-포스포-티로신(P-Tyr) 항체(PY99)를 사용하여 위의 세포주에서 내인성 티로신 인산화 수준을 모니터링하여 리간드 독립적 BCR 신호전달에 대한 PCLX-001 처치의 영향을 평가했다. PCLX-001로 24시간 처치하면 농도 의존 방식으로 테스트된 모든 세포주에서 항원 독립적인 글로벌 포스포-티로신 수준이 감소했다(도 15a). 또한, 1μM PCLX-001은 항-IgM과의 BCR 결찰 후 BL2 세포에서 거의 모든 리간드 의존성 BCR 매개 포스포-티로신 및 팬-포스포-SFK 수준을 폐기시켰다(도 3b). 프로테아좀 억제는 증가된 단백질 수준에 의해 제안된 것과 같이 SFK의 안정화를 초래하지만, 리간드 독립적인 티로신 인산화, 또는 BL2 세포의 전체 SFK 인산화에 대한 PCLX-001의 영향을 역전시키지 못하며(도 3b), 이는 비-미리스토일화 SFK가 이들의 오국재화(mislocalization)와 기질을 인산화시키지 못하는 무능력으로 인해 더 이상 기능하지 않는다는 기존의 개념을 뒷받침한다. 전체적으로, 이러한 결과는 SFK의 미리스토일화가 활성 및 안정성 모두에 필수적이며, 림프종 세포에서 다운스트림 BCR 신호전달에 필요함을 제시한다.
PCLX-001은 BCR 생존 신호전달 성분을 강력하게 억제한다
PCLX-001이 SFK 단백질 수준 및 리간드 의존성 BCR 매개 티로신 인산화에 영향을 미치기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 2개의 임상적으로 승인된 BCR 신호 억제제를 사용하여 다른 BCR 매개 신호전달 중간체에 대한 효과를 평가했다: 다사티닙(광범위한 스펙트럼 티로신 키나제 억제제) 및 대조군으로 이브루티닙(BTK 억제제)52. BL2 세포가 항-인간 IgM BCR 자극에 가장 잘 반응하는 것으로 밝혀졌기 때문에(도 15b), 이들 세포를 활성화된 BCR 신호전달에 대한 PCLX-001-매개 효과를 연구하기 위한 모델로 선택했다. 0.1 또는 1.0 μM PCLX-001로 처리된 BL2 세포는 항-IgM 자극 BCR 매개 티로신 인산화의 농도 의존적 부분적(24시간, 도 15b) 및 거의 완전한 소멸(48시간)을 나타냈다(도 4a, 도 16의 정량화). 티로신 인산화의 전반적인 감소는 같은 농도의 다사티닙 또는 이브루티닙으로 처치한 세포에 비해 PCLX-001로 처치한 BL2 세포에서 더 두드러졌다. PCLX-001 처치는 또한 BL2 세포에서 총 Lyn, 활성화된 인산화-Lyn(Y396)뿐만 아니라, 총 BTK 및 활성화-인산화-BTK(Y223)의 수준을 감소시키거나 소멸시켰다(도 4A). 이러한 결과는 여러 다른 림프종 세포주(도 17)와 BL2 세포에서 Src, Lck, Hck 및 Fyn을 포함하는 여러 다른 SFK를 비롯하여 활성화된 팬-포스포-SFK에 대해 확인되었다(도 4A, 도 18). 다사티닙과 이브루티닙은 항-P-Lyn, 항-P-SFK 및 항-P-BTK 항체를 사용하여 측정했을 때 각각의 표적을 선택적으로 억제했다(도 4a).
PCLX-001 처치는 또한 BCR 신호전달 인핸서 단백질 HGAL 및 Arf1 GTPase를 포함하는 다른 미리스토일화된 단백질 수준의 감소를 매개하는 반면, 다사티닙 및 이브루티닙은 이들 단백질 중 하나의 수준에 영향을 미치지 않았다(도 4b, c). 중요하게도, HGAL 단백질의 손실은 SFK 및 Arf1 GTPase의 손실보다 훨씬 빨랐으며 HGAL 단백질 수준의 손실은 예상한 바와 같이14, 15, SYK의 인산화 및 활성 형태의 감소와 관련이 있었다(도 4b). 미리스토일화된 HGAL과 미리스토일화된 작은 GTPase Arf1의 수준도 PCLX-001 처치 시 감소하기 때문에, 미리스토일화된 단백질의 분해를 촉진하는 PCLX-001의 활성은 따라서 미리스토일화된 SFK에 제한되지 않는다(도 4).
BCR 신호전달은 궁극적으로 포스포-ERK(P-ERK), NFκB, c-Myc 및 CREB를 포함하는 B-세포 증식 및 생존에 관여하는 전사 인자에 수렴한다4, 5. 따라서, 본 발명자들은 BL2 세포에서 48시간 동안 0.1 및 1.0 μM에서 PCLX-001, 다사티닙 및 이브루티닙이 이러한 이펙터에 미치는 영향을 평가했다. 주목할 점은, 이러한 처치는 48시간에서 PCLX-001의 경우 25% 미만의 세포 사멸을 초래했고, 사용된 농도에서 다사티닙 및 이브루티닙의 경우 5% 미만을 초래했다(도 6a 및 6c). PCLX-001은 BCR 신호전달에서의 장애와 일치하여 농도 의존적 방식으로 P-ERK, NFκB, c Myc 및 CREB의 수준을 감소시키며, 이러한 통계적으로 유의한 감소(P < 0.05)는 포스포-ERK 및 NFκB 수준에서 검출되었다(도 4c, 도 16의 정량화). 다시 말하지만, 이러한 효과는 다사티닙 또는 이브루티닙으로 처치한 세포보다 PCLX-001 처치한 세포에서 더 두드러지는 경향이 나타났다. Src, Lyn, 팬-P-SFK, ERK 및 P-ERK의 감소된 수준을 포함하는 이러한 발견은, 여러 다른 악성 림프종 세포주에서도 관찰되었다(도 17). 본 발명자들은 또한 PCLX-001 처치가 다사티닙 및 이브루티닙 처치보다 ER 스트레스 프로-아폽토시스 마커 Bip의 수준을 증가시켜 카스파제-절단(caspase-cleaved) PARP1에 의해 측정된 바와 같이 전반적인 아폽토시스를 증가시켰음을 밝혀냈다(도 4c). 따라서, 단백질 분해를 촉진하는 PCLX-001의 활성은 SFK, HGAL 및 Arf1과 같은 미리스토일화 단백질에 대한 효과에 국한되지 않고, BCR 다운스트림 신호 전달인 포스포-ERK 및 NFκB와 같은 비-미리스토일화 단백질에 대한 효과도 포함한다.
BCR 신호전달의 초기 이벤트는 또한 포스포리파제 Cγ의 활성화 및 세포질에서의 칼슘 동원에서 절정에 이른다. 본 발명자들은 48시간 동안 BL2 세포의 PCLX-001(1μM) 처치가 형광 비율 측정 Fura-2 Ca++-킬레이터 분석53을 사용하여 세포 내 저장소에서 항-IgM BCR 유도 칼슘 동원을 강력하게 억제함을 입증했다(도 19). PCLX-001은 칼슘 방출 피크의 강도를 대폭 감소시켰을 뿐만 아니라, 다사티닙 처치와 유사하게, 칼슘 방출 과정을 지연시켰다. 전반적으로, PCLX-001은 동일한 농도에서 사용된 다사티닙 및 이브루티닙보다 칼슘 동원을 더 많이 억제했다. 참고로, BL2 세포를 PCLX-001로 48시간 동안 연장 처치하면 칼슘 항상성이 방해되고 세포질 칼슘의 기저 수준 증가가 야기되었으며(도 19), 이는 추정컨대 ER 칼슘 고갈 및 세포 사멸에 기여한다. 전체적으로, 본 발명자들의 데이터는 PCLX-001 처치가 BCR 매개 친(pro)-생존 신호전달을 효과적으로 손상시키고 림프종 세포에서 아폽토시스를 유도한다는 것을 제시한다(도 5).
PCLX-001, 다사티닙 및 이브루티닙은 효능에서 차이가 있고 하류 BCR 신호전달에 차등적으로 영향을 미치기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 위에서 테스트한 림프종 세포주의 전체 생존도에 대한 이들 약물의 효과를 비교했다. 다사티닙 및 이브루티닙 처치는 처치 48시간 및 96시간 후에 BL2(실선) 및 IM9(점선) 세포에 최소한의 영향을 미친 반면, PCLX-001은 양성 IM9 대조군(점선)을 사멸시키는 데 필요한 것보다 유의하게 더 낮은 농도에서 악성 BL2 세포(실선)를 사멸시켰다(도 6a, b). PCLX-001과 다사티닙 둘 다에 똑같이 민감한, SU-DHL-10을 제외한 다른 모든 세포주에서 세포 생존도의 유사한 경향이 관찰되었다(도 6c, d). 중요한 것은 0.01, 0.1 및 1.0 μM에서 PCLX-001에 대한 0.1 및 1.0 μM 농도의 다사티닙 또는 이브루티닙의 조합 처치가 생존도를 추가로 감소시키지 않는다는 것이며, 이는 PCLX-001 효과가 다사티닙 및 이브루티닙 표적의 업스트림에서 매개됨을 시사한다(도 20). 전체적으로, PCLX-001은 다사티닙 및 이브루티닙과 비교하여 48시간 및 96시간 모두에서 악성 림프종 세포주에 대해 가장 광범위한 효능을 나타내며, 양성의 불멸화 IM9 및 VDS B 세포 대조군을 아끼는 데 있어 더 나았으며, 이는 임상적으로 승인된 두 가지 약물보다 더 높은 선택성과 우수한 시험관 내 치료 창을 입증한다.
NMT 발현은 혈액암 세포에서 변경된다
혈액암 세포가 다른 암 세포 유형보다 PCLX-001에 더 취약한 이유를 여전히 알지 못하지만, 본 발명자들은 이것이 혈액암 세포에서 NMT1 또는 NMT2 발현의 변화와 관련이 있을 수 있다고 생각한다. 이 가능성을 입증하기 위해 Cancer Cell Line Encyclopedia의 유전자 발현 데이터에 대한 인 실리코(in silico) 분석을 수행했다54. 본 발명자들은 먼저 NMT1 전사체 수가 평균적으로 모든 세포주에서 NMT2 전사체 수의 약 8배(23)이고, 둘째, 다른 유형의 암 세포주와 비교하여 수많은 혈액암 세포주에서 NMT2 발현이 이질적이지만 현저하게 감소한다는 것을 발견했다(도 22a,b). NMT1의 발현은 조사된 1269개 세포주에 걸쳐 상대적으로 일정하며, 유방암 및 백혈병 암 세포주에서 발현이 약간 그러나 현저하게 감소하는 반면, NMT2 발현은 다양한 암 사이에서 그리고 또한 소정의 암 유형 내에서 상당히 다양했다(도 22c, d). 데이터는 또한 NMT2의 발현이 CNS, 신장 및 섬유아세포 기원의 암 세포주에서 더 높은 반면, 백혈병, 림프종 및 골수종과 같은 혈액암에서 NMT2 발현의 선택적이고 상당한 감소가 있음을 설명한다(도 22d). 흥미롭게도, 림프종, 백혈병 및 기타 세포주에서 관찰되는 낮은 NMT2 발현 수준은 NMT1 발현의 증가에 의해 보상되지 않았다(도 22e). 전체적으로, 본 발명자들은 PCLX-001에 대한 민감도 증가를 설명할 수 있는 혈액암 세포주에서 NMT2 발현의 감소를 발견했다.
PCLX-001 처치는 생체 내에서 강력한 항-종양 활성을 나타낸다
시험관내 NMT 억제에 대한 림프종 세포 민감성에 기초하여, 본 발명자들은 PCLX-001이 2개의 뮤린 림프종 세포주 유래 피하 종양 이종이식편 모델에서 생체내 종양 진행을 완화시킬 수 있는지를 조사하고 임상적으로 승인된 약물 참조로서 독소루비신을 사용했다. DOHH2 종양이 있는 마우스에서, PCLX-001은 매일 20mg/kg 또는 격일로 50mg/kg(P<0.001) 주어졌을 때 상당한 살종양 효과를 나타낸다(도 7A). 매일 50mg/kg에서, PCLX-001은 7일까지 종양 크기를 최대 70%까지 감소시키지만(7일차 평균 종양 크기 = 44.0±8.1 ㎣), 상당한 체중 감소를 동반하여 5일 처치 중단이 필요했다(도 21a). 치료 재개시, 95%의 평균 종양 성장 억제(TGI)가 16일까지 관찰되었다. 이에 비해, 독소루비신 처치는 57% TGI를 유발하고 체중을 최대 8%까지 감소시켰다(도 21a). 중요하게도, PCLX-001 처치는 어떤 용량에서도 사망률을 증가시키지 않았다(도 21b). BL2 이종이식편을 보유한 마우스에서, PCLX-001은 9일까지 42.5% 종양 퇴행에 도달하는 1일 20 mg/kg의 용량에서 부분적인 TGI를 보여주었다(P=0.016)(도 7b). 또한, PCLX-001의 1일 용량 50 또는 60mg/kg은 13일 동안 투여했을 때 생존한 마우스 9마리 중 9마리와 7마리 중 7마리에서 각각 100% 종양 퇴행을 일으켰다. 이 이종이식편 모델의 Kaplan-Meier 생존 분석은 또한 20 - 50mg/kg/일 사이의 PCLX-001 용량이 무처리 비히클 대조군과 비교하여 BL2 종양 보유 마우스의 생존을 연장한다는 것을 보여주었다(도 21d, e). 대조적으로 독소루비신은 BL2 종양 성장에 영향을 미치지 않았으며(도 7b), 부작용으로 인해 처치를 11일째에 종료했다(도 21c). 처치 종료 시, 본 발명자들은 BL2 종양 용해물에서 NMT 활성21을 측정했고 PCLX-001 농도 의존 방식으로 감소되는 것을 발견했으며(P=0.03; 도 7c), 이는 PCLX-001이 생체 내에서 표적에 작용한다는 것을 제시한다.
세포주 유래 이종이식편은 인간 종양의 복잡성이 부족하기 때문에, 본 발명자들은, 암이 CHOP, RICE, 경막내 메토트렉세이트/시타라빈, 및 DHAP(표 2)를 포함하는 여러 라인의 화학 요법에 불응성인 환자 DLBCL3에서 유래된 DLBCL 림프종을 절제하고 증식시켜 NODscid 마우스에서 환자-유래 이종이식 모델을 확립했다. 처치를 각각 8마리 마우스의 그룹에서 평가했다. 21일 동안 PCLX-001 처치의 20 mg/kg 피하 일일 용량은 66% TGI를 초래했다(P<0.001; 도 7d). 그런 다음, 이 용량을 3-일 처치 중단으로 분리된 2개의 9-일 기간 동안 또 다른 마우스 세트에서 매일 50 mg/kg으로 증가시켜 마우스가 ~15% 체중 손실로부터 회복되도록 했다(도 21f). 이러한 고용량 처방에 따라, PCLX-001 투여는 13일에 7마리의 생존 마우스 중 6마리에서 완전한 종양 퇴행을 초래하고(도 7d), 검출가능한 종양이 없는 1마리의 마우스는 11일에 사망했다(도 21g). 비히클-대조군 및 PCLX-001 처치된 마우스로부터 외과적으로 제거된 종양에서 PCLX-001 처치 21일 후 전체 종양 크기의 농도-의존적 감소(도 7e)와 함께 아폽토시스의 증가(증가된 절단된 카스파제-3; 도 7f) 및 세포 증식의 감소(Ki-67 분석에 의해 결정됨; 도 7g)를 확인했다. 따라서, PCLX-001 처치는 환자 유래 림프종 종양에서 용량 특이적인 방식으로 생체 내에서 아폽토시스 및 세포 주기 정지를 유도한다. 독소루비신 처치의 효과는 실험 첫 7일 이내에 대부분의 종양 보유 마우스에서 심각한 약물 독성 및 사망으로 인해 평가할 수 없었다.
[표 2]
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마우스는 유효 용량 수준의 PCLX-001을 견딘다
마우스는 특이적 말단-기관 독성 없이 유효 용량의 PCLX-001을 견뎌냈다.
PCLX-001로 처치된 모든 마우스는 첫 번째 이종이식 연구에서 살아남았고(도 7a), 더 높은 용량 수준에서 PCLX-001로 처치된 일부 마우스는 다른 두 연구에서 사망했다(도 7b, d).
임상 병리학으로도 해부학적 병리학 평가로도 사망 원인을 확인하지 못했다. 두 연구에서 독성을 암시하는 결과가 나타났다. BL2 이종이식편을 갖고 짧은 치료 휴지기와 함께 1일 50mg/kg의 PCLX-001을 투여한 3마리의 마우스에서, 모두 투약 기간 종료 시점에 정상보다 낮은(lower-than-normal) 호중구 및 림프구 수치를 나타냈고, 1마리도 정상보다 낮은 단핵구 및 혈소판 수치를 나타냈다. DLBCL 림프구 이종이식편을 갖고 PCLX-001을 1일 20, 50 또는 60mg/kg으로 투여한 마우스에서, 모든 용량 수준에서 대부분의 마우스에서 건강 상태가 좋지 않은 징후(예를 들어, 거칠고 지저분한 털; 털세움)가 나타났고, 탈수와 체중 감소가 1일 50 및 60mg/kg에서 나타났다(표 3-8).
[표 3]
Figure pct00005
[표 4]
Figure pct00006
DOHH-2 NODscid 이종이식(Charles River)의 독성 요약.
설계: 하기 표에 나타낸 용량 수준 및 용량 요법을 이용하여 한 그룹의 마우스에 비히클을 제공하고 4개의 그룹에 PCLX-001을 제공했다.
Figure pct00007
독성의 임상 징후 및 체중에 대한 영향에 대해 마우스를 매일 관찰했다. 마지막 용량 후, 그룹당 3마리의 마우스를 안락사시키고 부검했다. 안락사 시, 혈액학 분석과 AST 및 CK 활성, 빌리루빈 및 크레아티닌 농도를 측정하기 위해 혈액 샘플을 채취했다. 부검 시, 대퇴골, 양쪽 신장, 간, 소장, 및 주사 부위의 샘플 샘플을 채취하여 고정했다. 이들을 병리학자인 웨이-펭 동(Wei-feng Dong) 박사가 처치하고 현미경으로 검사했다.
결과: PCLX-001과 잠재적으로 관련된 유일한 불리한 결과는 PCLX-001을 50 mg/kg으로 제공받은 그룹(그룹 5 및 6)에서 나타났다. 격일로 PCLX-001을 투여한 결과, 3마리의 마우스 모두에서 RBC 수치가 정상보다 낮았고, 그 중 한 마리에서 망상적혈구 및 혈소판 수치가 정상보다 높았다. 매일 PCLX-001을 투여한 결과, 3마리의 마우스 모두에서 호중구 및 단핵구 수가 정상보다 낮았고, 그 중 한 마리에서 단핵구 및 혈소판 수는 정상보다 낮았다. 이들 마우스의 대퇴골 골수에서 조직병리학적 소견은 없었다.
이러한 데이터는 하기 표에 요약되어 있다.
Figure pct00008
투약 기간의 종료시, 혈청 AST 및 CK 활성은 비히클 대조군을 포함하는 각 군의 1마리 이상의 마우스에서 정상보다 높았다.
보충 고찰/결론: 마우스를 억제하기 위해 - 예를 들어, 종양 크기를 측정하기 위해 - 필요한 취급으로 인해 약간의 근육 손상(타박상) 또는 간 손상을 입는 것은 마우스에서 드문 일이 아니며, 이는 증가된 혈청 AST 및 /또는 CK 활성을 유발할 수 있다. PCLX-001을 50mg/kg으로 투여한 마우스의 혈액학적 소견은 비교적 경미했으며 고용량 수준에서 PCLX-001을 투여한 랫트와 개에서 관찰된, 조혈 독성을 반영할 수 있다55.
[표 5]
Figure pct00009
[표 6]
Figure pct00010
[표 7]
Figure pct00011
BL2 NODscid 이종이식의 독성학 요약(Jackson Lab, JAX)
설계: 하기 표에 나타낸 용량 수준 및 용량 처방을 사용하여 한 그룹의 마우스에 비히클을 제공하고 3개의 그룹에 PCLX 001을 제공했다.
Figure pct00012
수집된 데이터는 Charles River 이종이식 연구에서와 동일했다 - 임상 징후, 체중, 종양 부피, 혈액학 및 임상 화학(ALT, AST, BUN, 크레아티닌, CK)을 위한 3마리 마우스/그룹의 혈액 샘플, 및 동일한 3마리의 마우스로부터 수집 및 고정된 조직 샘플. 간, 신장, 및 소장의 무게도 측정했다.
결과: PCLX-001과 잠재적으로 관련된 부작용은 다음과 같았다:
PCLX-001을 투여한 그룹의 대부분의 마우스에서 건강 불량 징후(예를 들어, 거칠고 지저분한 털, 털세움). 이러한 징후는 20mg/kg/일에 비해 50 또는 60mg/kg/일에서 더 일찍 발생했다.
PCLX-001을 50 또는 60mg/kg/일로 투여한 그룹의 탈수 및 체중 감소. 지속적인 투약에도 불구하고, 약 1주일 후에 체중 감소가 멈춘 것으로 보이며, 그 후 마우스의 체중이 증가하기 시작했다.
고찰/결론: PCLX-001과 관련된 임상 병리 또는 해부학적 병리 소견이 없었다. PCLX-001을 20mg/kg/일 투여했을 때 호중구 수가 증가하고 RBC 수가 감소하는 경향이 있었고; 그러나, 이것은 용량 수준과 관련이 없으므로 우연에 의한 것일 수 있다. 그룹 1(대조군)과 그룹 4에서 각각 1마리의 마우스에서 더 큰 평균 CK(및 더 적은 정도의, AST 및 ALT) 활성이 관찰되었다. 이러한 효소 활성 증가 패턴은 PCLX-001와 관련이 없는 골격근 손상을 강력하게 시사한다.
[표 8]
Figure pct00013
DLBCL3 환자 유래 NODscid 마우스 이종이식편의 독성 요약
설계: 한 그룹의 마우스에는 비히클을 제공했고 두 그룹에는 아래 표에 나타낸 용량 수준 및 용량 요법을 이용하여 PCLX-001을 제공했다.
Figure pct00014
수집된 데이터는 이전 두 연구에서와 동일했다 - 임상 징후, 체중, 종양 부피, 혈액학 및 임상 화학(AST, CK, 빌리루빈, 크레아티닌)을 위한 3마리 마우스/그룹의 혈액 샘플, 동일한 3마리의 마우스에서 수집되고 고정화시킨 조직 샘플.
결과: PCLX-001과 관련된 독성의 임상 징후, 임상 병리 매개변수에 대한 영향, 또는 해부학적 병리 소견이 없었다.
논의/결론: DoHH-2 세포를 사용하는 연구에서 50mg/kg/일에서 혈액학 매개변수에 대한 영향이 있는 것처럼 보였기 때문에 부작용의 부재는 다소 놀라웠다. 여기에 차이가 있는 이유는 알려져 있지 않다. 이 연구에서 마우스가 3주 동안 50mg/kg의 일일 용량을 견뎌냈지만, 모든 연구에서 그렇지 않은 이유는 알려져 있지 않다. NODscid 클론, 먹이(chow) 유형 또는 미생물군(microbiota)을 포함한 차이점이 이를 설명할 수 있을 것이다.
[표 9]
Figure pct00015
랫트와 개에서 용량 범위 독성 연구를 수행하고 기록했으며55, 이들 종에 대한 공식 GLP 독성 연구를 인간 임상 시험에 대한 규제 검토를 준비하면서 거의 완료했다.
전체적으로, 본 발명자들의 결과는 PCLX-001 처치가 다른 임상적으로 승인된 처치에 불응성인 질병의 완전한 퇴행을 포함하여, 생체내(in vivo) 림프종의 성장을 억제하고, 그에 따라 암에서 PCLX-001과 같은 진정한(bona fide) NMT 억제제의 사용을 확립한다.
고찰
여기서, 본 발명자들은 혈액암 세포, 특히 B-세포 림프종이 새로운 팬-NMT 억제제인 PCLX-001에 의한 미리스토일화 억제에 매우 민감하다는 것을 발견했음을 보고한다. NMT 억제제로 암세포를 죽이는 개념이 소규모로 제안되고 테스트되었지만39,43,56,57,58,59, 본 발명자들이 알고 있는 한, 본 작업은 수백 개의 암 세포주에 대한 이 접근법의 효능 범위에 대한 최초의 규명을 제시하는 것이다. 본 발명자들은 암 세포가 불멸화된 세포 및 정상 세포의 증식을 죽이고 억제하는 데 필요한 농도보다 낮은 농도에서 NMT 억제제에 의해 선택적으로 사멸될 수 있음을 입증했다(도 1E-H, 도 10 및 11). 더 정상적인 세포 유형에 대한 추가 세포독성 분석이 없는 경우, 이 치료 적응증에 대한 이점/위험에 따라, 일부 정상 조직(예를 들어, PBMC를 포함한 혈액 세포)이 유효 용량에서 영향을 받는 것은 허용가능하며 드문 일이 아니다. 이것은 잠재적인 암 치료제로서 PCLX-001의 개발을 지원하는 데 중요한 충분히 큰 치료 창을 시사한다. B 림프종 세포에서 많은 수의 미리스토일화된 단백질의 미리스토일화를 억제하는 것 외에도(도 2a,b), 본 발명자들은 PCLX-001이 이러한 세포에서 주요 림프종 생존 촉진 경로인 BCR 신호전달을 억제하는 데 특히 효율적임을 입증했다4,5,6,7,8. 또한, PCLX-001 BCR 신호전달 억제는 임상적으로 승인된 SFK 억제제인 다사티닙과 BTK 억제제인 이브루티닙보다 우수하다. 이것은 PCLX-001이 시험관 내에서(in vitro) 악성 림프종 세포주에 대해 가장 광범위한 효능을 갖는 이유를 부분적으로 설명할 수 있다. 본 발명자들은 또한 PCLX-001이 SFK, HGAL 및 Arf1의 미리스토일화를 억제하고 이들의 분해율을 증가시키지만, 예기치 않게 P-ERK, NFκB, c-Myc, CREB 및 아마도 심지어 BTK를 포함하는 비미리스토일화 친-생존 BCR 매개체(mediators)의 분해를 촉진하는 것을 밝혀냈다(도 4a). PCLX-001 처치된 세포는 세포독성을 나타내게 되는 농도에서 여전히 적어도 75%의 생존율을 유지했다. 더 낮은 하류 신호전달 단백질 수준이 유전자 전사의 감소에 해당하는지 또는 죽어가는 세포에서 증가된 단백질 분해에 해당하는지 여부는 알려져 있지 않다. 또한, PCLX-001은 B 세포 림프종 세포에서 선택적으로 세포사멸을 유발하는 BCR 매개 칼슘 동원을 감소시킨다(도 5). 미리스토일화의 손실과 칼슘 항상성의 변화 및 BCR 매개 칼슘 방출의 억제를 연결하는 메커니즘은 알려져 있지 않다.
증가된 ER 스트레스는 이전에 또 다른 NMT 억제제로 처치한 세포에서 나타난 프로-아폽토시스 현상이다59. 우리는 Arf1 GTPase의 미리스토일화의 억제가 N-말단 글리신 잔기 또는 인근 라이신 잔기36, 37에서 막 표적화를 방해하고 소포 트래피킹을 손상시켜, 만성/강장성(tonic) 또는 항원 의존성 BCR 신호전달에 해로운 영향을 미친다고 가정했. ER에서 적절한 Arf1 기능의 상실은 부분적으로 PCLX-001 처치 시 ER 스트레스 마커 Bip60의 증가를 설명할 수 있다(도 4c).
PCLX-001 처치된 세포에서 지질 래프트 국소화된 미리스토일화된 Lyn(및 다른 SFK) 및 HGAL 단백질의 손실은 적절한 BCR 신호전달에서 이들 막 도메인의 중요성을 추가로 강조한다9,10,12,13,14,15(도 5). 또한, SFK의 PCLX-001 매개 미리스토일화 억제는 막 표적화를 폐지할 뿐만 아니라, MG132 처치로 SFK 수준이 거의 완전히 회복됨에 따라 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통한 분해도 촉진한다(도 3b). E3 유비퀴틴 리가제의 Casitas B 계통 림프종(Cbl)-계열61,62에 의한 단백질 티로신 키나아제의 유비퀴틴화 및 분해는 B 세포에서 신호 감쇠의 정상적인 부분이지만, N-말단 글리신 잔기도 최근에 단백질에 대한 불안정화 인자인 것으로 밝혀졌고, 이는 N-데그론(degron)의 매우 선택적인 새로운 부류를 나타낸다63. 실제로, 이들의 보고서에서 Timms 등(2019)은 N 말단 글리신 잔기를 노출시키는 Lyn, Fyn 및 Yes를 포함하는 미리스토일화되지 않은 단백질이 N 말단 글리신 특이적 Cullin RING 리가제 2(CRL2)-ZYG11B/ZER1 N-데그론-유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 선택적으로 분해됨을 입증한다63. 이 시스템은 N-말단 글리신 잔기가 있는 단백질에 대해 매우 선택적인데, 글리신을 임의의 다른 아미노산으로 대체하면 생성된 단백질이 실질적으로 안정화되기 때문이다63. 따라서 새로 기술된 이 N-degron 시스템63, 64은 SFK, HGAL 및 Arf1과 같은 PCLX-001로 처치한 악성 림프종 세포주에서 볼 수 있는 미리스토일화되지 않은 단백질의 빠른 분해에 기여할 수 있다(도 4). 또한 미리스토일화 불가능한 Gly2Ala-Src 티로신 키나아제 돌연변이와 Gly2Ala-HGAL이 이전에 미리스토일화된 대응 단백질보다 더 안정적인 것으로 밝혀진 이유를 부분적으로 설명할 수 있으며65, 66, 이는 인공 N 말단 알라닌(Ala) 잔기가 글리신(Gly) 잔기 특이적 CRL2-ZYG11B 또는 CRL2-ZER1 N-데그론에 의한 분해 촉진을 방지하기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 B 세포 림프종에서 PCLX-001의 작용 방식에 대한 모델을 제안하며, 이에 따라 SFK(또는 HGAL 및 Arf1을 포함한 다른 단백질)의 미리스토일화를 억제하면 막 표적화의 손실뿐만 아니라, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(도 3B)을 통해, 단백질 수준 및 기능의 손실이 초래되어, BCR 신호의 전파가 약화되게 된다(도 5). 흥미롭게도, NMT1은 Lyn, Fyn 및 Lck SFK에 의해 인산화되는 것으로 밝혀졌으며 비인산화 가능한 Y100F-NMT1 돌연변이가 촉매 활성의 98%를 상실했기 때문에 NMT1의 인산화가 미리스토일화 활성에 필요하다는 것이 밝혀졌다67. 따라서, SFK의 PCLX-001 매개 손실은 B 림프종 세포에서 NMT1 활성을 추가로 감소시켜 친-생존 신호 및 아폽토시스의 손실을 강화할 수 있다.
미리스토일화된 SFK, HGAL 및 Arf1 단백질에 의존하는 효과 이외에, 수백 개의 공지된 미리스토일화된 단백질이 있다는 점을 감안할 때, 림프종 세포 생존력에 대한 PCLX-001-매개 효과는 또한 다른 미리스토일화된 단백질의 기능성 손실을 통해 일어날 가능성이 있다. 본 발명자들은 혈액암 세포가 다른 암 세포 유형보다 PCLX-001에 더 취약한 이유를 여전히 알지 못하지만, 이것이 NMT1 또는 NMT2의 변경된 발현과 관련이 있을 수 있다고 생각한다. CCLE NMT1 또는 NMT2 발현 데이터(도 22)의 분석은 NMT 발현 수준이 일부 암에서 과발현될 뿐만 아니라(일명 현재 교리) 다른 암에서 실제로 더 낮다는 것을 보여주며, 그 중 다수는 혈액학적 기원의 것이다. 전체적으로, 이러한 관찰은 혈액암 세포에서 NMT 효소 표적 수의 감소와 PCLX-001에 대한 이들 세포의 민감성 사이의 가능한 연관성을 시사한다. 변경된 NMT 수준이 혈액암 세포의 감수성에 자체적으로 영향을 미치는지 아니면 혈액암 세포의 개별 미리스토일화된 프로테옴의 변이와 함께 작용할 수 있는지, 그리고 생존을 위한 다양한 미리스토일화된 단백질에 대한 이들 세포의 세포 특이적 의존성은 알려져 있지 않다. 이러한 가능성은 현재 본 발명자들의 연구실에서 추가 조사 중이지만, 림프종 세포 생존에 대한 NMT 활동의 잠재적 중요성은 NMT1이 림프종 세포주에서 가장 중요한 생존 인자 중 하나로 선정된 게놈 차원의 Cas9-Crispr 스크린에서 확인되었다68. 또한, 암 세포주 스크리닝 결과는 PCLX-001을 백혈병 및 골수종뿐만 아니라 유방암 및 폐암과 같은 특정 고형 종양의 치료에 더 광범위하게 적용할 수 있는 가능성을 제시한다.
PCLX-001은 20mpk의 허용 용량[약 66% 종양 감소(도 7)]에서 약간만 효능이 있는 반면, 본 발명자들은 이것이 CHOP, 리툭시맙 및 기타 구제 요법에 반응하지 않는 림프종의 완전한 반응을 포함하는, 50mpk 효능 용량에서 3가지 인간 림프종 이종이식 모델에서 질병의 주요한 또는 완전한 퇴행을 초래하는 생체 내 종양 세포 성장을 효과적으로 억제한다는 것을 밝혀냈다.
결론
본 발명자들은 소분자 NMT 억제제인 PCLX-001이 시험관 내에서 광범위한 배양된 암 세포의 성장을 강력하고 선택적으로 억제한다는 것을 확립했으며, 친-생존 신호의 주요 소스인, BCR 매개 신호 이벤트의 손실로 인해 B-세포 림프종을 포함하는 혈액암에서 유래된 세포에서 특히 현저한 효과가 수반되었다4, 5, 6, 7, 8. 생체 내 B 세포 림프종의 전임상 모델에서 PCLX-001의 현저한 효능과 함께, 이러한 발견은 B 세포 림프종 및 가능하게는 다른 암에 대한 치료법으로서 PCLX-001 및 관련 NMT 억제제의 지속적인 개발 및 잠재적 임상 시험을 뒷받침한다.
방법
래빗 항-PARP-1(1:5000, 친화성 정제된 다클론성#EU2005, 로트1), 항-GAPDH(1:5000, 친화성 정제된 다클론성, #EU1000, 로트1) 및 항-GFP(1:10000, 친화성 정제된, #EU1, 로트 B3-1)를 실험실 재고로부터 입수했고 Eusera를 통해 이용가능하다(www.eusera.com). 본 발명자들의 친화성 정제된 래빗 항-GFP는 또한 Abcam(Cambridge, MA)으로부터 Ab6556으로 이용가능하다. 래빗 단일클론 항-Src(1:2000, 클론 32G6, #2123, 로트 5), Lyn(1:2000, 클론 C13F9, #2796, 로트 4), P-Lyn Y507(1:5000, 다클론성, #2731, 로트 5), Fyn(1:2000, 다클론성, #4023, 로트 3), Lck(1:2000, 클론 D88, #2984, 로트 4), Hck(1:2000, 클론 E1I7F, #14643, 로트1), c-Myc(1:10000, 클론 D3N8F, #13987, 로트 5), ERK(1:2000, 클론 4695, #9102, 로트 27), P-ERK(1:5000, 클론 3510, #9101, 로트 30), P-SFK(1:10000, 클론 D49G4, #6943, 로트 4), BTK(1:2000, 클론 D3H5, #8547, 로트13), P-BTK Y223(1:5000, 클론 D9T6H, #87141, 로트1) SYK(1:2000, 클론 D3Z1E, #13198, 로트 5), P-SYK Y525/526(1:5000, 클론 C87C1, 로트18) 및 항-절단된 칼스파제-3(1:1000, 클론 5A1E, #9664, 로트 20)을 Cell Signaling Technologies로부터 구입했다. 래빗 단일클론 항-BIP(1:2000, 다클론성, ADI-SPA-826)을 Enzo Life Sciences로부터 구입했다. 래빗 항-Mcl-1(1:2000, 클론 Y37, #32087, 로트 GR119342-5), NFB(1:2000, 클론 E379, #32536, 로트 GR3199609-2), P-Lyn Y396(1:5000, 다클론성, #226778, 로트 GR3195652-5)을 Abcam(Cambridge, MA)으로부터 구입했다. 마우스 단일클론 항-p-Tyr(1:10000, PY99, sc-7020, 로트 I2118) 항체를 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입했다. 마우스 항 인간 HGAL을 eBioscience(1:10000, 클론1H1-A7, #14-9758-82, 로트 E24839-101)에서 구입했다. 래빗 다클론성 항-ARF-1 항체(1:2000, 다클론성, #PA1-127, 로트 TK 279638)를 ThermoFisher Scientific으로부터 구입했다. Enhanced chemiluminescence (ECL) Prime 웨스턴 블랏팅 검출 키트를 GE Healthcare로부터 구입했다. Clarity ECL 웨스턴 블랏팅 기질을 Bio-Rad로부터 구입했다. 염소 항-인간 IgM(μ 쇄)(70-8028-M002, 로트 S728028002001)을 Tonbo biosciences로부터 구입했다. 염소 F(ab')2 항-인간 IgM을 BioRad(STAR146, 로트152684)로부터 구입했다. Sigma-Aldrich(다클론성, Ab-529, 로트 871521168)로부터의 래빗 항-인간 Src 항체를 면역침전에 사용했다. 독소루비신 하이드로클로라이드를 Pfizer로부터 입수했다. 다사티닙과 이브루티닙을 ApexBio Technology로부터 입수했다. PCLX-001은 데이비드 그레이 및 폴 야트 박사(University of Dundee, Scotland, UK)에 의해 DDD86481로 확인되었다38, 69. 모든 화학 물질은 달리 명시되지 않는 한 시그마 알드리치에서 구입한 최고 순도의 제품이었다.
세포 배양
IM9, Ramos, SU-DHL-10 및 COS-7은 ATCC에서 구입했다. BL2, DOHH2, WSU-DLCL2 & BJAB는 DSMZ(독일)에서 구입했다. Ramos와 BL2를 앨버타 대학의 짐 스톤과 로버트 잉햄 박사가 친절하게 제공해 주었다. VDS 분리를 Tosato G 등에 기술된 대로 했다(참조 47). VDS, BJAB 및 SU-DHL-10을 브리티시 컬럼비아 대학의 마이클 골드가 친절하게 제공해 주었다. HUVEC 세포(최대 4개의 탯줄에서 풀링됨)를 PromoCell에서 구입했다. 모든 세포주 동일성을 The Genetic Analysis Facility, The Center for Applied Genomics, The Hospital for Sick Children, Peter Gilgan Center for Research and Learning, 686 Bay St., Toronto, ON, Canada M5G 0A4(www.tcag.ca)에서의 STR 프로파일링으로 확인했다. MycoAlert Plus 마이코플라즈마 검출 키트(Lonza, ME, USA)를 이용하여 세포주를 정기적으로 마이코플라스마 오염에 대해 테스트했다. 모든 세포주는 마이코플라즈마 오염에 대해 음성으로 테스트되었다. 모든 세포주를 5-10% 태아 소 혈청, 100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 1mM 피루브산나트륨, 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI 또는 DMEM 배지에서 유지했다. HUVEC 세포(최대 4개의 탯줄에서 풀링됨)를 PromoCell에서 구입goTRh 인슐린 유사 성장 인자(Long R3 IGF) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 있는 내피 세포 성장 배지에서 배양하고 7회보다 낮은 계대로 유지했다. 모든 세포주를 가습 배양기에서 37℃ 및 5% CO2로 유지했고 오염 마이코플라스마의 존재를 정기적으로 확인했다. 세포주 이름, 유형 및 조직학에 대해서는 보충 표 3을 참조. 형질감염을 위해, 부착 세포 COS-7 세포를 제조업체의 지침에 따라 X-tremeGENE9 DNA(Roche) 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시켰다. BCR 활성화 실험을 위해, 세포를 25 μg/ml의 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(또는 동일한 BCR 활성화 특성을 나타내는 항-인간 IgM(μ 쇄))과 함께 2분 동안 인큐베이션하고 PBS 중의 1mM 바나데이트(Bio Basic Inc) 용액의 추가로 활성화를 중단시켰다.
세포의 용해
세포를 수확하고, 차가운 PBS에서 세척하고, 4℃에서 15분 동안 흔들어 0.1% SDS-RIPA 완충액(1x 완전 프로테아제 억제제;(Roche Diagnostics)와 함께 50mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 2mM MgCl2, 2mM EDTA)에서 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심분리하고 핵 후 상층액을 수집했다.
알킨-미리스테이트로 세포의 면역블롯팅, 면역침전 및 대사 표지화
제조업체의 지침에 따라 BCA 분석(Thermo Scientific)으로 단백질 농도를 측정했다. 5X 로딩 버퍼를 첨가하여 전기영동을 위한 샘플을 준비하고 5분 동안 끓였다. 달리 명시되지 않는 한, 레인당 총 단백질 30μg을 12.5% 아크릴아미드 겔에 로딩했다. 전기영동 후 젤을 0.2μM 니트로셀룰로스 멤브레인(Bio-Rad)으로 옮기고 재료 섹션에 설명된 대로 항체로 프로빙했다. 과산화효소 활성이 ECL Prime 웨스턴 블랏팅 검출 시약(GE Healthcare, PA, USA)에 제공된 절차를 거친후 드러났다.
이전에 Yap 등47에 기재된 바와 같이 면역침전을 수행했다. 요약하면, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 수확하고, 4℃에서 15분 동안 흔들어 차가운 EDTA가 없는 RIPA 완충액(0.1% SDS, 50mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 2mM MgCl2, EDTA가 없는 완전 프로테아제 억제제(Roche))에서 용해시켰다. 세포 용해물을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심분리하고 핵-후(post-nuclear) 상청액을 수집했다. EGFP 융합 단백질 또는 내인성 c-Src 비수용체 티로신 키나아제(Src)를 4℃에서 하룻밤 흔들어 친화성 정제 염소 항-GFP(www.eusera.com) 또는 토끼 항-Src 항체(Sigma, Ab- 529, lot 871521168)로 약 1 mg의 단백질 용해물로부터 면역침전시켰다. 순수한 프로테옴 단백질 G 자성 비드(Millipore)를 2시간 동안 면역침전된 단백질과 함께 인큐베이션하고 0.1% SDS-RIPA로 광범위하게 세척하고, 50mM HEPES(pH 7.4) 중의 1% SDS에 재현탁하고 80℃에서 15분 동안 가열했다. 웨스턴 블롯 분석 또는 클릭 화학을 위해 면역침전된 단백질을 함유하는 상청액을 수집했다.
IM9, BL2 및 COS-7 세포를 PCLX-001로 1시간 동안 처치한 다음 세포를 각 시점에서 수확하기 30분 전에 25 μM ω-알키닐 미리스트산으로 표지시켰다. 생성된 세포 용해물의 단백질을 클릭 화학을 이용하여 100μM 아지도-비오틴과 반응시키고 Yap 등47 및 Perinpanayagam 등33에 설명된 대로 처리했다.
PCLX-001, 다사티닙 및 이브루티닙으로 처치한 세포의 생존도
IM9, VDS, BL2, Ramos, BJAB, DOHH2, WSU-DLCL2, 및 SU-DHL-10 세포(1x 105개 세포)를 4ml 배지/웰로 6-웰 플레이트에서 성장시키고 증가하는 농도의 PCLX-001, 다사티닙 및 이브루티닙과 함께 최대 96시간 동안 인큐베이션했다. PCLX-001로 처치된 세포의 생존력을 Cytation 5 플레이트 판독기(Biotek, Winooski, VT)에서 제조업체의 지침에 따라 CellTiter-Blue Cell Viability Assay(Promega) 또는 calcein AM 염색(Life Technologies)으로 측정했다. Calcein 분석은 세포 생존도를 측정하는 것으로 구성되었다(살아 있는 세포/총 세포 및 생존율 %로 표시됨). 세포를 Nuclear-ID Blue/Red 세포 생존율 시약(GFP 인증, Enzo Life Sciences)으로 염색하여 전체 세포와 죽은 세포를 확인했으며, 살아있는 세포는 제조업체의 지침에 따라 Calcein AM(Life Technologies)으로 염색했다. 세포 계수를 Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(Biotek Instruments, Inc.)를 이용하여 수행하고 Biotek Gen5 데이터 분석 소프트웨어(버전 2.09)로 분석했다.
Horizon(St. Louis, MO) 플랫폼을 사용하여 세포 생존도를 또한 측정했다. 세포를 웰당 500개 세포로 검은색 384-웰 조직 배양 처리된 플레이트의 성장 배지에 시딩했다. 세포를 원심분리를 통해 분석 플레이트에서 평형화시키고 처치 전에 24시간 동안 37℃의 인큐베이터에 배치했다. 처리 시, 분석 플레이트 세트(처치를 제공받지 않음)를 수집하고 ATPLiteⓒ(Perkin Elmer, Waltham, MA)를 추가하여 ATP 수준을 측정했다. 이러한 Tzero(T0) 플레이트를 Envision 플레이트 판독기의 초고감도 발광을 이용하여 판독했다. 분석 플레이트를 96시간 동안 화합물과 함께 인큐베이션한 다음(분석기에 표시된 경우 제외) ATPLiteⓒ를 사용하여 분석했다. 모든 데이터 포인트를 자동화된 프로세스를 통해 수집했고 품질 관리에 적용했으며 Horizon의 Chalice Analyzer 독점 소프트웨어(1.5)를 사용하여 분석했다. 분석 플레이트는 다음 품질 관리 표준을 통과한 경우 승인되었다: 상대 원시 값은 전체 실험에서 일관되었고, Z-인자 점수는 0.6보다 컸으며, 무처치/비히클 대조군은 플레이트에서 일관되게 거동했음. Horizon은 성장 억제(GI)를 세포 성장의 척도로 이용한다. GI 백분율은 다음 테스트 및 방정식을 적용하여 계산된다.
Figure pct00016
이면:
Figure pct00017
Figure pct00018
이면:
Figure pct00019
여기서 T는 테스트 물품에 대한 신호 척도이고, V는 무처치/비히클-처치 대조군 척도이고, V0는 시간 0에서의 무처치/비히클 대조군 척도이다(구어체로 T0 플레이트라고도 함). 이 공식은 National Cancer Institute의 NCI-60 고처리량 스크린에서 사용되는 성장 억제 계산에서 유래된 것이다. 따라서 100% GI는 완전한 성장 억제(세포 증식 억제)를 나타내는 반면, 200% GI는 완전한 세포 사멸을 나타낸다.
Oncolines(Netherlands Translational Research Center B.V.) 플랫폼을 사용하여 세포 생존도를 또한 측정했다. 세포를 해당 ATCC 권장 배지에 희석하고 사용된 세포주에 따라 45μl 배지에서 웰당 200 내지 6400개 세포의 밀도로 384-웰 플레이트에 분배했다. 사용된 각 세포주에 대해 최적의 세포 밀도가 사용된다. 플레이트의 나머지를 인산염 완충 식염수로 채웠다. 플레이팅된 세포를 37℃에서 5% CO2의 가습 분위기에서 인큐베이션했다. 24시간 후, 5μL의 화합물 희석액을 첨가하고 플레이트를 추가로 인큐베이션했다. t=종료(end)에서, 24μL의 ATPlite 1Step™(PerkinElmer) 용액을 각 웰에 첨가한 후, 이어서 2분 동안 진탕시켰다. 암실에서 10분간 인큐베이션한 후, 발광을 Envision 다중 모드 판독기(PerkinElmer) 상에서 기록했다.
마지막으로, ChemPartner 플랫폼(Shanghai, China)을 이용하여 제3 폭의 PCLX-001 효율 스크린(도 9)을 수행했다. 131개 세포주를 흑색 벽의, 96-웰 플레이트에 시딩하고, 조직 배양물(Corning, Cat.3904)로 처치하고 ATCC 포뮬레이션에 따라 배양했다. 72시간 및 144시간 후 세포 생존율을 Cell Titer Blue Viability Assay(Promega, Cat. G8081, Lot. No. 0000190181)를 이용하여 측정하고 Enspire(PerkinElmer)로 560/590 nm에서 형광을 기록했다. EC50은 XLfit 소프트웨어(5.5)를 사용하여 계산했다.
세포 증식 분석
세포의 증식은 더 나은 정확도를 위해 디지털 위상차 화상 변환 후 이미징 및 계수로 측정했다. 2 x 105개 세포를 4 ml 배양 배지의 6-웰 플레이트에서 배양하고 증가하는 농도의 PCLX-001과 함께 인큐베이션했다. 균질화 후, 50μl의 배양물을 고결합 투명 유리 바닥 ½ 영역 96웰 플레이트(Greiner bio-one)로 옮겼다. 전체 웰 영역을 Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(Biotek Instruments, Inc.)를 사용하여 명시야(12개의 스티치 사진)에서 이미지화했고 단일 디지털 위상차 사진으로 변환했다. 총 세포 계수를 최대 4일 동안 매일 수행했다(Biotek Gen5 데이터 분석 소프트웨어 2.09).
세포내 칼슘 측정:
세포질 유리 칼슘 농도 측정을 맞춤화된 이전에 기술된 프로토콜53을 이용하여 PTI 형광계(Photon Technology International)를 사용하여 1μM PCLX-001, 다사티닙 또는 이브루티닙과 함께 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션된 BL2 림프종 세포에서 수행했다. 10.106개의 세포를 8μM Fura-2 AM(Molecular Probes) 및 1mM CaCl2가 포함된 신선한 배지에 30분 동안 현탁시키고 세척하고 추가 15분 동안 칼슘이 보충된 배지에 재현탁시켰다. 그런 다음 세포를 세척하고 따뜻한 Krebs Ringer 용액(10mM HEPES pH 7.0, 140mM NaCl, 4mM KCl, 1mM MgCl2 및 10mM 포도당)에 재현탁하고 4면 투명 큐벳에 넣었다. 활성화 전에, 유리 세포질 칼슘을 0.5mM EGTA로 1분 동안 킬레이트화했다. BCR 수용체 의존성 칼슘 방출은 10μg/ml 염소 F(ab')2 항 인간 IgM(BioRad)의 첨가에 의해 활성화된다. 이어서, 소포체로부터의 BCR 독립적이고 비가역적인 Ca2+ 방출을 나타내기 위해 탑시가르긴(300nM)을 사용했다. Ca2+ 농도를 다음 방정식으로 계산했다:
[Ca ++ ] = Kd (R - Rmin)/(Rmax - R)
여기서 R = 340nm에서의 형광 강도를 380nm에서의 형광 강도로 나눈 값, Rmax = 이오노마이신(7.5μM) 및 CaCl2(12mM) 첨가 후에 측정된 형광, Rmin = EGTA(32mM), 트리스(24mM) 및 Triton™ X-100(0.4%) 후에 측정된 형광 및 Kd = 224(Fura-2 AM의 경우 37C에서).
나타낸 결과는 실험의 다수 복제물을 대표한다(PCLX-001 인큐베이션의 경우 n=6, 다사티닙 및 이브루티닙의 경우 n=3).
PBMC 및 림프구의 분리 및 세포 생존능 검정
20 ml 혈액 수집으로부터 PBMC 및 림프구 단리를 위해 2명의 건강한 인간 연구 지원자를 모집했다(환자 #1: 남성, 34세, 진단 없음, 치료 없음; 환자 #2: 남성, 54세, 진단 없음 , 치료 없음). 연구 프로토콜은 Alberta Cancer Committee의 건강 연구 윤리 위원회(Health Research Ethics Board of Alberta Cancer Committee)의 승인을 받았다(연구 제목: 신선한 혈액 및 조혈 세포에서 지방 아실트랜스퍼라제(FAT) 평가; HREBA.CC-17-0624).
Ficoll-Paque(GE Healthcare, PA, USA)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 단핵 세포를 분리했다. 제조업체의 지침에 따라 EasySep™ 림프구 분리 키트(Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada)를 사용하여 전혈 샘플에서 림프구를 분리했다. PBMC 및 림프구를 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 배지에서 배양했다. 세포를 2 x 106개 세포/ml의 농도로 플레이팅했다. 96시간 동안 0.001 - 10μM PCLX-001과 함께 배양한 후, CellTiter-Fluor™ 생존능 분석(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 세포 생존력을 측정했다.
면역조직화학
COS-7 세포를 폴리-d-리신 코팅된 35mm 유리 바닥 접시(MatTek Corporation, Ashland, MA, USA)에서 배양했고, 공급업체가 권장하는 대로 X-tremeGENE9 DNA(Roche)를 사용하여 표시된 형광 태그 단백질로 일시적으로 형질감염시켰다. Zeiss Observer Z1 현미경과 Axiovision 소프트웨어(Axiovision, 버전 4.8)를 사용하여 이미지를 획득했다. B 세포 림프종을 포르말린에 고정하고, 파라핀에 포매하고, 마이크로톰으로 5mm 절편으로 자르고, Superfrost Plus 슬라이드(Fisher Scientific)에 장착하고, 크실렌으로 파라핀을 제거하고(각각 10분 동안 3회), 일련의 등급별 에탄올(100%, 80%, 50%)에서 탈수시키고, 흐르는 찬물로 10분간 세척했다.
항원 추적을 위해, 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 Nordicware 마이크로웨이브 압력 쿠커에 넣었다. 800ml의 10mM 시트레이트 완충액(pH 6.0)을 첨가하고, 압력 쿠커를 단단히 닫고 20분 동안 높은 온도에서 마이크로파에 적용시켰다. 슬라이드를 흐르는 찬물로 10분 동안 세척하고, 3% H2O2 메탄올에 10분 동안 담갔다가 흐르는 따뜻한 물로 10분, PBS로 3분 동안 세척했다. 과량의 PBS를 제거하고 PAP 펜(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 샘플 주위에 소수성 원을 그렸다. 항-절단된 카스파제 3 또는 항-Ki-67을 Dako 항체 희석 완충액(1:50, 슬라이드당 ~400 μml)으로 희석하고, 습도 챔버에서 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 슬라이드를 각각 5분 동안 PBS에서 2회 세척하고 EnVision+System-HRP 표지 폴리머(항-토끼)(Dako, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 약 4방울을 각 슬라이드에 첨가하고 실온에서 30분간 인큐베이션했다. 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 2번 세척하고, 액체 디아미노벤지딘 + 기질 크로모겐(제조업체의 지침에 따라 준비됨; Dako, Agilent Technologies) 4방울을 첨가했다. 슬라이드를 5분 동안 현상하고 흐르는 찬물로 10분 동안 헹구었다. 그런 다음 슬라이드를 1% CuSO4에 5분 동안 담그고, 흐르는 찬물로 간단히 헹구고, 헤마톡실린으로 60초 동안 대조염색하고, 흐르는 찬물로 헹구었다. 다음으로, 슬라이드를 탄산리튬에 3회 담그고, 헹구고, 일련의 단계별 에탄올에서 탈수시켰다. 커버슬립을 추가하고, 슬라이드를 Nikon Eclipse 80i 현미경으로 검사하고 QImaging 카메라로 촬영했다.
윤리 승인
본 발명자들은 인간, 동물 실험 및 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수했다. 이 연구의 모든 관련 실험은 적절한 윤리적 승인을 받았다. 연구 프로토콜을 승인한 위원회 및/또는 기관의 이름은 아래에 설명되어 있다.
Charles River Discovery Services North Carolina(CR Discovery Services)는 구속, 축산, 수술 절차, 사료 및 유체 규제, 수의학적 관리에 관한 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장사항을 구체적으로 준수한다. CR Discovery Services의 동물 관리 및 사용 프로그램은 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 승인된 표준 준수를 보장하는 국제 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회의 인증을 받았다.
OLAW 보증 및 AAALAC 인증 기관인 The Jackson Laboratory - Sacramento 시설의 In Vivo Services에서 DOHH2 마우스 이종이식편 연구를 수행했다. IACUC 승인 프로토콜과 실험실 동물 관리 및 사용 지침(National Research Council, 2011)에 따라 수행되었다.
DLBCL 림프구를 사용한 연구의 경우, 싱가포르 종합 병원(SGH)의 기관 검토 위원회의 지도 윤리 원칙에 따라 모든 절차가 승인되고 수행되었다. 특정 연구 목적으로만 이러한 샘플을 사용하기 위해 서면 동의서를 받았다. 실험 프로토콜(#130812)은 A*STAR의 생물학적 자원 센터(BRC)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았다. 인간 샘플과 관련된 모든 절차는 Sing Health Centralized Institutional Review Board의 윤리 원칙에 따라 승인되고 수행되었다. 특정 연구 목적으로만 이러한 샘플을 사용하기 위해 서면 동의서를 받았다.
마우스에서의 이종이식편 연구
Charles River 시설에서의 DOHH2 이종이식편 연구: 암컷 중증 복합 면역결핍 마우스(Fox Chase SCID®, C.B-17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Charles River)를 연구 1일째에 생후 9주였고 17.8-22.9g의 BW 범위를 나타냈다. 동물에게 물(역삼투, 1ppm Cl)과 18.0% 조단백질, 5.0% 조지방 및 5.0% 조섬유로 구성된 NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet®를 자유롭게 급이했다. 연구 1일차에, 연구의 투약 단계 동안 탈수를 줄이기 위한 노력의 일환으로 동물에게 재수화 용액을 자유롭게 제공했다. 재수화 용액은 멸균수에 0.45% NaCl: 2.5% 포도당: 및 0.075% KCl로 구성되었다. 마우스를 20-22℃(68-72 ℉) 및 40-60% 습도에서 12시간 광 주기로 정적 마이크로 아이솔레이터의 조사된 Enrich-o'cobs™ 베딩에 수용시켰다. 잭슨 연구소에서의 BL2 이종이식편 연구: 6주령 암컷 NOD.CB17-Prkdc scid/J(NOD scid, Stock #001303) 마우스 105마리를 캘리포니아주 새크라멘토에 있는 생체내 연구 실험실로 옮겼다. 마우스를 식별을 위해 귀에 새김눈을 냈고 HEPA 여과 공기가 포함된 개별적이고 포지티브하게 환기되는 폴리설폰 케이지에 케이지당 5마리의 밀도로 수용했다. 처음에는 케이지를 2주마다 교체했다. 동물실은 12시간 명/암 주기(오전 6시부터 오후 6시까지)를 조절하여 인공 형광등으로 전체적으로 조명을 비췄다. 동물실의 정상온도는 20-26℃, 상대습도는 30~70%였다. 동물실을 시간당 최대 15회의 공기 교환이 이루어지도록 설정했다. pH 2.5 내지 3.0으로 산성화된 여과된 수돗물과, 표준 실험실 먹이를 자유롭게 제공했다.
BL2 또는 DOHH-2 세포(1 x 107) 및 동의한 환자 DLBCL3의 흉막액으로부터 단리된 신생물성 DLBCL 림프구를 함유하는 세포 현탁액을, Jackson Laboratory, Charles River, 및 Singapore General Hospital, 각각의 시설에서, 면역 손상된 암컷 NODscid 마우스의 옆구리에 피하 주사했다. 종양이 형성된 후, 마우스를 약 10마리의 동물 그룹으로 나누고, 각 도면에 표시된 대로 비히클을 매일, PCLX-001을 매일 10-60mg/kg, 또는 독소루비신을 매주 3mg/kg70 피하 주사했다. 용량 부피는 10mL/kg이었다. 2주 내지 3주의 투약 기간 종료 시, 마우스를 안락사시키고 그룹당 3마리를 부검했다. 인도적인 이유로 일찍 죽거나 안락사시킨 마우스도 부검했다. 마우스를 매일 정기적으로 모니터링하고 체중을 측정했으며, 격일로 디지털 버니어 캘리퍼스(Mitutoyo)로 종양을 측정했다. 종양 부피를 길이(mm) x 너비(mm)2/2로 계산했으며; 길이와 너비는 각각 가장 긴 직경과 가장 짧은 직경이었다. 안락사 시, 투약 기간 말기에 AST 및 CK 활성, 빌리루빈 및 크레아티닌 농도(Jackson Laboratory 연구에서 ALT 활동 및 BUN 농도 포함)를 포함하는 혈액학 분석 및 임상 화학 분석을 위해 혈액 샘플을 채취했다. 부검 시, 대퇴골, 양쪽 신장, 간, 소장 및 주사 부위의 샘플을 채취하여 고정했다. 이들은 조직병리학적 소견을 위해 광학 현미경으로 후속 처리 및 검사했다. 또한 부검에서 종양을 제거하고 2개로 나누었다. 한 조각을 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매시켰고; 다른 하나는 RNA 및 단백질 분석을 위해 급속 동결시켰다. 모든 이종이식편 실험에 대한 종양 성장 억제(TGI)를 다음 공식에 따라 계산했다:
TGI (%) = (Vcontrol - Vtreated) / (Vcontrol - Vinitial) *100.
환자 유래 이종이식 마우스 연구:
i) 환자 데이터
DLBCL3 환자는, 43세에 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론(CHOP)으로 1기 미만성 거대 B 세포 림프종 치료를 받은 58세 남성이었으며, 이는 완전한 관해를 초래했다(보충 표 2). 이후 DLBCL3 환자는 10년 후 골수 및 연수막의 재발성 질환과 흉막삼출로 싱가포르 종합병원에 내원했다. 환자는 리툭시맙, 이포스파마이드, 카보플라틴, 에토포사이드 및 척수강내(intrathecal) 메토트렉세이트/시타라빈의 2가지 코스를 제공받았고, 이어서 덱사메타손, 시타라빈, 및 시스플라틴과 척수강내 메토트렉세이트의 4개 코스를 제공받았다. 이때 PDX 전파를 위해 환자의 조직을 수확했다. 환자의 병은 계속 진행되었고, 1년 후에 사망했다.
ii) 병리학
흉막액의 세포학적 검사는 소포성 염색질 및 눈에 띄는 핵소체가 있는 큰 세포를 특징으로 하는 부조화성 림프종 집단을 보여주었다. 신생물성(Neoplastic) 세포에서는, CD5의 비정상적인 발현, bcl2의 강한 발현, 및 높은 증식률(70-80%)과 함께, 팬-B 마커(PAX5, CD20, CD22, CD79a)가 발현되었다. 신생물성 림프구는 비생식 중심 표현형(CD10에 대해 음성이고 bcl6, MUM1, FOXP1에 대해 양성)을 나타냈으나 c-Myc에 대한 염색은 낮았다(20%). 간기 형광 인 시튜 혼성화는 BCL2의 증가와 BCL6 및 IGH의 재배열을 나타냈고; C-MYC의 경우 정상적인 패턴이 나타났다. RNA 인 시튜 혼성화는 NMT2 발현의 부족을 나타냈다.
iii) 이종이식 구축 및 처치
흉막액을 저온 멸균 20% RPMI 1640 배지에 수집하고 신생물성 세포를 Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)로 분리하고 20% 태아 소 혈청(Life Technologies, Carlsbad, CA)이 포함된 RPMI 160 배지(Life Technologies)에 재현탁시켰다. 종양 샘플의 대표적인 부분을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰고; 다른 부분은 이종이식에 사용했다. 세포 현탁액을 4-6주된 NODscid 마우스의 옆구리에 피하 주사했다. 종양이 최대 1000 ㎣에 도달하면 마우스를 희생시키고 종양을 수확하고 부검을 수행했다. 이종이식 종양을 즉시 동결하고, 포르말린에 고정하고, 90% 태아 소 혈청 및 10% 디메틸 설폭사이드에 저장하거나, RPMI 1640 배지에 넣었다. 이 과정을 반복하여 후속 세대의 환자 유래 이종이식 모델(P2, P3, P4, ...)을 생성했다. 종양 기원의 형태 및 주요 특성의 유지를 평가하기 위해, 환자 종양 샘플의 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 절편 및 확립된 모든 환자-유래 이종이식편 모델의 이종이식편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색했다. 이들 절편을 또한 다양한 마커의 발현을 측정하기 위해 면역염색했다. 임상 병리학자가 모든 슬라이드를 검토했다. 본 연구를 위해, 종양 조각(~50mg, P4)을 4-6주령 암컷 NODscid 마우스의 옆구리에 피하 이식하고 200-300㎣까지 성장하도록 했다. 그런 다음 마우스를 그룹으로 무작위 배정하고(그룹당 n=8), 비히클(10ml/kg); PCLX-001, 21일 동안 매일 20mg/kg; 또는 PCLX 001, 18일 동안 매일 50 mg/kg을 피하 주사했으며, 이때 9일 후 3일간 휴식기를 가졌다. 종양 측정 및 성장 억제 계산을 상기한 바와 같이 수행했다.
DLBCL3 PDX 연구를 위해, NODscid 마우스를 InVivos, Singapore에서 구입하고 표준 실험실 식단과 증류수를 임의로 공급했다. 동물을 BRC, A*STAR에서 22 ± 2℃에서 12시간 명/암 주기로 유지하고 기관 지침에 따라 유지했습니다.
NMT 활성 분석
NMT 활성 분석은 Perinpanayagam 등33에 설명되어 있다. 요약하면, 세포를 수크로스 완충액(50mM NaH2PO4, pH 7.4 및 0.25M 수크로스)에서 용해시키고 초음파처리(10초)했다. 종양 샘플을 작은 조각으로 자르고, 수크로스 완충액에서 유리 다운스 균질화(12 전체 스트로크)로 추출하고 초음파 처리(10초)했다. 단백질 용해물을 25μl 반응물에서 NMT 분석 완충액(0.26 M Tris-HCl pH 7.4, 3.25mM EGTA, 2.92mM EDTA 및 29.25mM 2-메르캅토에탄올, 1% 트리톤 X-100) 중의 p60 Src의 N-말단 서열에 해당하는 미리스토일화 가능 또는 비미리스토일화 가능 데카펩티드 0.1 mM와 [3H]-미리스토일-CoA(Perkin Elmer, Waltham, MA) 12pM과 함께 인큐베이션하고 30℃에서 15분 동안 인큐베이션했다. 15 ㎕의 반응 혼합물을 P81 포스포셀룰로오스 페이퍼 디스크(Whatman, Maidstone, UK)에 점적하여 반응을 종료하고, 세척하고, 섬광 계수를 위해 처리했다.
통계적 방법
Prism 8 소프트웨어(GraphPad, 버전 8.4.1)를 사용하여 데이터를 분석하고 일반적으로 평균 ± S.E.M.으로 나타냈다. 적용가능한 경우 스튜던트 t-테스트 또는 일원 분산분석을 이용하여 통계적 유의성을 결정했다. 종양 부피에 대한 약물 치료의 중요성 분석을 2-원 분산분석으로 평가했다. 0.05보다 높은 P 값은 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주했다. (***) P ≤ 0.001, (**) P ≤ 0.01 and (*) P ≤ 0.05.
NMT1 및 NMT2 발현의 통계적 분석: NMT1 및 NMT2 mRNA 발현 데이터를 Broad Institute CCLE 데이터베이스54(https://portals.broadinstitute.org/ccle)에서 2020년 3월 26일에 추출했고 1269개 암 세포주에 대한 mRNA 발현 데이터를 포함했다. RNAseq TPM 유전자 발현 데이터(Expression Public 20Q1)를 RSEM을 이용하여 단백질 코딩 유전자에 대해 분석했고 1의 슈도-카운트를 이용하여 Log2 변환된값으로 제시된다(도 22).
T 세포 수용체(TCR) 활성화
Jurkat T 세포를 ATCC에서 구입했다. 세포를 5% 태아 소 혈청, 100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 배지에서 37℃ 및 5% CO2로 습한 인큐베이터에서 유지했고, 마이코플라스마 오염의 존재에 대해 정기적으로 확인했다. TCR 활성화 실험을 위해, PCLX-001 전처치한 세포를 다양한 시간 동안 2μg/ml의 CD3 및 CD28 단클론 항체(각각, ThermoFisher Scientific, Cat# 14-0037-82 및 #14-0281-82)와 함께 인큐베이션했고(최적의 활성화는 15-60분 후) 활성화를 PBS 중의 1mM 바나데이트(Bio Basic Inc) 용액을 첨가하여 중단시켰다. 세포를 수확하고, 차가운 PBS에서 세척하고, 4C에서 15분 동안 교반하여 0.1% SDS-RIPA 완충액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 2mM MgCl2, 2mM EDTA와 함께 1x 완전 프로테아제 억제제; (Roche Diagnostics)에서 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심분리하고 용해물을 핵-후(post-nuclear) 상청액을 수집하고 면역블롯팅으로 분석했다.
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실시예 2
도 23 PCLX-001 처치는 Jurkat T 세포에서 TCR 의존성 P-ERK 활성화를 약화시킨다. Jurkat T 세포를 최대 60분(2ug/ml) 동안 CD3/CD28 항체로 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석으로 24/48h(1μM) 동안 인큐베이션된 PCLX-001이 PERK 활성화를 억제함이 드러났다.
도 24 PCLX-001 처치(24h)는 Jurkat T 세포에서 TCR 의존성 P-ERK 및 P SFK 활성화를 약화시킨다. Jurkat T 세포를 최대 4시간(2ug/ml) 동안 CD3/CD28 항체로 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석은 PCLX-001이 24시간(0.1 및 1μM) 동안 인큐베이션되어 P-ERK 활성화 및 Src 계열 키나아제(P-SFK)의 인산화를 나타냈다.
도 25 PCLX-001 처치(48h)는 Jurkat T 세포에서 TCR 의존성 P-ERK 및 P SFK 활성화를 약화시킨다. Jurkat T 세포를 최대 4시간(2ug/ml) 동안 CD3/CD28 항체로 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석은 48시간(0.1 및 1μM) 동안 인큐베이션된 PCLX-001이 PERK 활성화 및 Src 계열 키나아제(P-SFK)의 인산화를 억제함을 보여주었다.
도 26 PCLX-001 및 다사티닙 처치는 TCR 하류 신호전달 이벤트를 약화시키고 일차 배양된 T 세포에서 ER 스트레스를 유도했다. 90% αb 1차 T 세포를 CD3/CD28 항체로 30분(2ug/ml) 동안 활성화시켰다. 면역블롯팅 분석은 PCLX-001과 다사티닙이 P-티로신 인산화(PY99), P-ERK 활성화, Src 계열 키나아제(P-SFK)의 인산화를 억제함을 보여주었다. 또한, PCLX-001은 Src와 Lyn의 단백질 수준을 현저히 감소시켰고 Bip 단백질 함량(ER 스트레스 마커)을 증가시켰다.
도 27a-e PCLX-001은 T 세포가 아닌 PBMC, B 세포 및 단핵구의 생존력을 감소시켰다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 세포 하위집단의 생존도와 풍부도를 유세포 계측법을 이용하여 테스트했다. PBMC의 생존도는 현저하게 감소했다(a). CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도는 약물 처치에 의해 변화되지 않았으며(b 및 c), 그러나, B 세포(d) 및 단핵구 CD14+(e) 수는 PCLX-001 처치 96시간 후에 유의하게 감소했다.
도 28a-d PCLX-001은 T 세포에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 감소시킨다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. T 세포 하위집단에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 유세포 분석을 통한 세포내 염색을 이용하여 테스트했다. CD4+ T 세포에서 Lyn(a) 및 HGAL(b)의 발현은 둘 다 감소했다. 또한, PCLX-001은 CD8+ T 세포에서 Lyn(c) 및 HGAL(d)의 발현도 모두 감소시켰다.
도 29a-d PCLX-001은 B 세포가 아닌 단핵구에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 감소시킨다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX 001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. B 세포 및 단핵구 하위집단에서 Lyn 및 HGAL의 발현을 유세포 분석을 통한 세포내 염색을 이용하여 테스트했다. PCLX-001은 B 세포에서 Lyn(a) 및 HGAL(b)의 발현을 감소시킬 수 없었지만, 단핵구(c 및 d)에서 두 단백질 마커 모두 현저하게 감소했다.
도 30a-e PCLX-001은 염증성 사이토카인의 생산을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 염증성 사이토카인 IL-6(a), TNF-α(b), IL-8(c), IFN-γ(d) 및 IL-17a(e)의 생성을 유도한다.
도 31a-d PCLX-001은 항염증 사이토카인 생성을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 이용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 항염증 사이토카인 IL-1RA(a), IL-10(b), IL-13(c) 및 IL-16(d)의 생성을 유도한다.
도 32a-d PCLX-001은 염증성 케모카인의 생산을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 이용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 염증성 케모카인 MIP-1α(a), MCP-2(b), TARC(c) 및 GRO-α(d)의 생성을 유도한다.
도 33a-d PCLX-001은 염증성 케모카인의 생산을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX-001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 사용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PB<C에서 염증성 케모카인 RATES(a), MIP-1β(b), MCP-4(c) 및 MDC(d)의 생성을 유도했다.
도 34a-c PCLX-001은 T 헬퍼 2-매개 케모카인 및 GM-CSF의 생성을 유도한다. PBMC를 증가하는 농도의 PCLX 001(0-10 ug/ml)의 존재 하에 4일 동안 배양했다. 4일 후 세포 배양 상청액을 멀티플렉스 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA) 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71)를 이용하여 다양한 바이오마커에 대해 분석했다. PCLX-001은 살아있는 PBMC에서 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자 I-309(A), T 헬퍼 2 매개 케모카인으로서의 에오탁신-2(B) 및 GM-CSF(C)의 생산을 유도했다.
도 35a-d NMT 억제제(PCLX-001, PCLX-002, IMP-1088)는 전염증성 사이토카인의 정상화된 분비를 감소시킨다; IL-6(a), IL-8(b), TNF-α(c) 및 IFN-γ(d). T 세포를 NMT 억제제의 농도를 증가시키면서 48시간 동안 배양한 다음, 약물의 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS)로 2일 동안 더 유도했다. NMT 억제제는 IL-6, IL-8 및 IFN-감마의 수준을 유의하게 감소시켰다. (2-원 분산분석, 무처치에 대한 P 값: *<0.05-0.01 **<0.01-0.001 ***<0.001-0.0001. 사이토카인 분비의 감소가 PCLX-002에 비해 더 강력한 NMT 억제제 PCLX-001에서 더 강하고, 처치 4일 후 세포의 생존이 무처치 샘플의 10% 이내인 것은 언급할 가치가 있다.
도 36a-d NMT 억제제(PCLX-001, PCLX-002, IMP-1088)는 항염증 사이토카인의 정규화된 분비를 감소시킨다; IL-4(a), IL-5(b), IL-10(c), 및 IL-13(d). T 세포를 NMT 억제제의 농도를 증가시키면서 48시간 동안 배양한 다음, 약물의 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS)로 2일 동안 더 유도했다. NMT 억제제는 IL-5, IL-10 및 IL-13의 수준을 상당히 감소시켰다.(2-원 분산분석, 무처치에 대한 P 값: *<0.05-0.01 **<0.01-0.001 ***<0.001-0.0001. 사이토카인 분비의 감소가 PCLX-002에 비해 더 강력한 NMT 억제제 PCLX-001에서 더 강하고, 처치 4일 후 세포의 생존이 무처치 샘플의 10% 이내인 것은 언급할 가치가 있다.
도 23-25는 30분 동안(2ug/ml) CD3/CD28 항체로 활성화된 Jurkat T 세포에서 TCR 경로에 대한 PCLX-001 및 다사티닙의 효과를 도시한다.
도 26은 30분 동안(2ug/ml) CD3/CD28 항체로 활성화된 90% αb 1차 T 세포에서 TCR 경로에 대한 PCLX-001 및 다사티닙의 효과를 도시한다.
도 27은 증가하는 양의 PCLX-001의 존재 하에 상이한 혈액학적 세포 서브세트의 생존력을 도시한다.
도 28-29는 증가하는 양의 PCLX-001의 존재하에 상이한 혈액학적 세포 서브세트에서 미리스토일화된 단백질 Lyn 및 HGAL의 양을 도시한다.
도 30 내지 34는 증가하는 양의 PCLX-001의 존재하에 배양된 PBMC에서의 사이토카인 및 케모카인 생성을 도시한다.
도 35-36은 증가하는 양의 PCLX-001의 존재 하에 배양된 T 세포에서의 염증 촉진 및 항염증 사이토카인 생성을 도시한다.
다음 표에는 케모카인 및 케모카인 수용체가 나열되어 있다.
Figure pct00020
도 35 및 36은 -001 또는 -002로 처치된 세포에서 T 세포로부터의 전염증성 사이토카인 분비의 깊은 감소를 보여준다. 효과는 사용된 PCLX 001 대 PCLX-002의 효능에 비례한다. IMP-1088은 또한 분비를 증가시키는 TNFa의 경우를 제외하고 전체적으로 사이토카인 분비에 대해 상당한 억제 효과를 갖는다.
NMT 억제제가 사이토카인 분비를 억제하고, 아마도 류마티스 관절염, 루푸스, 쇼그렌 증후군, 제1형 당뇨병, 건선, 및 항염증성 질환(아래 목록 참조)과 같은 자가면역 질환에 영향을 미치는 TCR의 억제를 통해 T 세포의 활성을 감소시키기 위한 면역조절제로서 사용될 수 있음이 본 명세서에 제시되어 있다.
도 35 NMT 억제제(PCLX-001, PCLX-002, IMP-1088)는 친(pro)-염증성 사이토카인의 정상화된 분비를 감소시킨다; IL-6(A), IL-8(B), TNF-α(C) 및 IFN-γ(D). T 세포(3명의 독립 기증자로부터 n=3)를 증가하는 농도의 NMT 억제제와 함께 48시간 동안 인큐베이션한 다음, 약물의 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS Inc.)로 2일 동안 더 유도했다. (2-원 분산분석, 무처치에 대한 P 값: *<0.05-0.01 **<0.01-0.001 ***<0.001-0.0001. 사이토카인 분비의 감소는 PCLX 002보다 더 강력한 NMT 억제제 PCLX-001에서 더 강하고, 처치 4일 후 세포의 생존율은 무처치 샘플의 10% 이내였다.
도 36 NMT 억제제(PCLX-001, PCLX-002, IMP-1088)는 항-염증성 사이토카인의 정상화된 분비를 감소시켰다; IL-4(A), IL-5(B), IL-10(C), 및 IL13(D). T 세포(3명의 독립 기증자로부터 n=3)를 NMT 억제제의 농도를 증가시키면서 48시간 동안 인큐베이션한 다음, 약물의 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS)로 2일 동안 더 유도했다. (2-원 분산분석, 무처치에 대한 P 값: *<0.05-0.01 **<0.01-0.001 ***<0.001-0.0001. 사이토카인 분비의 감소는 PCLX-002에 비해 더 강력한 NMT 억제제인 PCLX-001에서 더 강했고, 처치 4일 후 세포의 생존은 무처치 샘플의 10% 이내였다.
T 세포 생존율을 보여주는 표
Figure pct00021
T 세포 생존율을 보여주는 표
Figure pct00022
T 세포 생존율을 보여주는 표
Figure pct00023
재료 및 방법
Jurkat T 세포 배양
Jurkat T 세포를 원래 ATCC(https://www.atcc.org/products/tib-152)에서 구입했다. MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit(Lonza, ME, USA)를 사용하여 세포주를 정기적으로 마이코플라스마 오염에 대해 테스트했다. Jurkat T 세포는 마이코플라스마 오염에 대해 음성으로 테스트되었다. Jurkat T 세포를 5% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린, 0.1mg/ml 스트렙토마이신, 1mM 피루브산나트륨, 및 2mM L-글루타민이 보충된 RPMI 배지에서 유지했다.
일차 세포 배양
일차 인간 T αβT 세포는 기술된 바와 같이 건강한 공여자 혈액으로부터 유래되었다(Siegers GM, Ribot EJ, Keating A, Foster PJ. Extensive expansion of primary human gamma delta T cells generates cytotoxic effector memory cells that can be labeled with Feraheme for cellular MRI.　Cancer Immunol Immunother. (2013) 62:571-83. doi: 10.1007/s00262-012-1353-y). 요약하면, 말초 혈액 단핵 세포를 분리하고 1 μg/ml 콘칸나발린 A 및 10 ng/ml IL-2 및 IL-4를 포함하는 배지에서 배양했다. T 세포는 6-8일 동안 함께 확대된 다음, 자기 세포 분리에 의해 기존의 αβTc가 고갈되었다. 생존도 및 배수 확대를 트리판 블루 배제 및 세포 계수를 통해 일상적으로 평가했다. 먹이를 줄 때, 세포를 10 ng/ml IL-2 및 IL-4(Siegers GM, Dutta I, Kang EY, Huang J, K
Figure pct00024
bel M 및 Postovit LM (2020) Aberrantly Expressed Embryonic Protein NODAL Alters Breast Cancer Cell Susceptibility to γδ T Cell Cytotoxicity. Front. Immunol. 11:1287. doi: 10.3389/fimmu.2020.01287)가 보충된 완전 배지(10% FBS 함유 RPMI 1640, 열 불활성화, 1×MEM NEAA, 10mM HEPES, 1mM 피루브산나트륨, 50 U/ml 페니실린-스트렙토마이신, 및 2 mM L 글루타민 - 모두 Invitrogen™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)로 100만개 세포/ml로 희석했다.
이 실험을 위한 1차 혼합 T 세포의 바이알을 해동하고, 해동 5일 후 유세포 분석을 위해 세포를 염색한 다음, 해동 7일 후 획득했다.
다사티닙 및 PCLX-001과의 인큐베이션
다사티닙은 Apex Bio Technology로부터 입수했다. PCLX-001은 데이비드 그레이 박사와 폴 야트 박사(University of Dundee, Scotland, UK)에 의해 DDD86481로 확인되었고, Pacylex Pharmaceuticals에서 제공했다. Jurkat T 세포를 6-웰 플레이트에서 4ml 배지/웰로 성장시키고, 최대 48시간 동안 증가하는 농도의 PCLX-001, 다사티닙과 함께 인큐베이션했다.
T 세포 수용체의 활성화
TCR 활성화 실험을 위해, 세포를 최대 4시간 2분 동안 인간 CD3 단클론 항체(OKT3), eBioscience™ 및 마우스 CD28 단클론 항체(37.51), eBioscience™(ThermoFisher Scientific에서 구입)의 혼합물 2㎍/ml와 함께 인큐베이션했고, 그런 다음 PBS 중의 1mM 바나데이트(Bio Basic Inc) 용액을 첨가하여 활성화를 중단시켰다.
면역블롯팅
토끼 항-GAPDH(1:5000, 친화성 정제된 다클론성, #EU1000, 로트 1)은 실험실 스톡에서 얻었으며 Eusera(www.eusera.com)를 통해 입수할 수 있다. 래빗 단일클론 항-Src(1:2000, 클론 32G6, #2123, 로트 5), Lck(1:2000, 클론 D88, #2984, 로트 4 ERK (1:2000, 클론 4695, #9102, 로트 27), P-ERK(1:5000, 클론 3510, #9101, 로트 30), P-SFK(1:10,000, 클론 D49G4, #6943, 로트 4)를 Cell Signaling. echnologies로부터 구입했다. 래빗 단일클론 항-BIP(1:2000, 다클론성, ADI-SPA-826)를 Enzo Life Sciences로부터 구입했다. 마우스 단일클론 항-p-Tyr(1:10,000, PY99, sc-7020, 로트I2118) 항체를 Santa Cruz Biotechnology로부터 구입했다. 인핸스드 케미루미네슨스(ECL) 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 키트를 GE Healthcare에서 구입했다. Clarity ECL 웨스턴 블롯팅 기질을 Bio-Rad에서 구입했다. 염소 항-인간 IgM(μ 쇄)(70-8028-M002, 로트 S728028002001)을 Tonbo biosciences에서 구입했다.
세포를 수확하고, 차가운 PBS에서 세척하고, 4℃에서 15분 동안 교반하여 0.1% SDSRIPA 완충액(50mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 2mM MgCl2, 2mM EDTA과 함께 1 × 완전 프로테아제 억제제(Roche Diagnostics)에서 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심분리하고 핵 후 상층액을 수집했다.
제조업체의 지침에 따라 BCA 분석(Thermo Scientific)으로 단백질 농도를 측정했다. 샘플을 5X 로딩 버퍼를 첨가하여 전기영동을 위해 준비하고 5분 동안 끓였다. 달리 명시되지 않는 한, 레인당 총 단백질 30μg을 12.5% 아크릴아미드 겔에 로딩했다. 전기영동 후, 젤을 0.2 μM 니트로셀룰로스 멤브레인(Bio-Rad)으로 옮긴 후, 재료 섹션에 설명된 대로 항체로 프로빙했다. 과산화효소 활성은 ECL 프라임 웨스턴 블롯팅 검출 시약(GE Healthcare, PA, USA)에 제공된 절차를 거친후 드러났다.
인간 세포 배양
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 건강한 기증자로부터의 정제된 T 세포를 STEMCELL Technologies(CA)에서 구입했다. 세포(7.5x106/ml)를 100 IU/ml 인터루킨 2(STEMCELL Technologies 또는 HIV 시약 프로그램(ATCC에서 관리)의 존재 하에 24개의 웰 플레이트에서 10% 열 불활성화 우태아 혈청(vWR), 1% 페니실린/스트렙토마이신(SigmaMillipore), 1% 피루브산나트륨 및 1% 비필수 아미노산(Gibco)가 보출된 RPMI에서 배양했다.
PBMC 샘플의 경우, 세포를 다양한 농도의 PCLX-001(0.10ug/ml)로 2일 및/또는 4일 동안 처리했다. 수확된 세포를 먼저 Zombie aqua를 사용하여 생존력에 대해 염색하고, 인간 Trustain FcX Fc 수용체 차단 용액을 사용하여 FC 수용체를 차단하고, 각각 Biolegend의 형광단 컨주게이션된 단일클론 항체(CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD14)로 표지시켰다. 그런 다음 고정/펌 버퍼 키트(eBiosciences)로 세포를 투과성화하고 항-Lyn 및 HGAL 항체로 세포내 염색했다. LSRFortessa X20(BD Biosciences)을 사용하여 샘플을 수집하고 FlowJo 소프트웨어로 분석했다.
정제된 T 세포의 경우, PCLX-001, PCLX-002(PACYLEX), 및 IMP-1088(α)을 다양한 농도(0-500 nM)로 2일 동안 첨가했다. 그런 다음, 약물의 존재 하에 T 세포 활성화제(STEMCELLS)로 세포를 2일 더 유도했다. 4일 후, 처치된 T 세포의 생존력을 유세포 측정법을 이용하여 분석했다. 추가 분석을 위해 PBMC 및 T 세포 모두에 대한 상청액을 수집했다.
다중 어레이 분석
PBMC에 대한 인간 사이토카인/케모카인 71-Plex(HD71) 또는 T 세포 샘플에 대한 인간 염증 유발 집중 15-Plex(HDF15)에 대해 다중 사이토카인 어레이(Eve Technologies Discovery assay, Calgary, CA)를 이용하여 수집된 상청액을 다양한 바이오마커에 대해 분석했다.
여기에 설명된 실시형태는 단지 예로 의도된 것이다. 변경, 수정 및 변형이 당업자에 의해 특정 실시형태에 영향을 미칠 수 있다. 청구범위는 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 제한되지 않아야 하며, 명세서 전체와 부합되는 방식으로 해석되어야 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자의 수준을 나타내며, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 참조로 통합되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 나타낸 것과 마찬가지로 본 명세서에 참조로 통합된다.
본 발명은 이상과 같이 설명되며, 동일한 것이 많은 방식으로 변경될 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나는 것으로 간주되어서는 안 되며, 당업자에게 자명한 그러한 모든 변형은 다음 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (120)

  1. 치료적 유효량의 PCLX 001을 투여하는 것을 포함하는, 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 암이 림프종인, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  5. 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  6. 암이 발병할 위험이 있거나, 또는 상기 암에 걸리기 쉬운 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제의 제조에서 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  7. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서,
    상기 암이 림프종인, 용도.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종인, 용도.
  9. 청구항 5 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  10. 치료적 유효량의 PCLX-001을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체 림프종에서 세포 사멸을 유도하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종인, 방법.
  12. 청구항 10 또는 청구항 11에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  13. 대상체에서 림프종을 유도하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  14. 대상체에서 림프종을 유도하기 위한 약제의 제조에서 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  15. 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종인, 용도.
  16. 청구항 13 내지 청구항 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  17. 대상체의 세포에서 SFK 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 PCLX-001과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 SFK 단백질이 Src 단백질, Lyn 단백질, 또는 Src 단백질 및 Lyn 단백질 둘 다인, 방법.
  19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    상기 세포가 림프종 세포인, 방법.
  20. 청구항 19에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종 세포인, 방법.
  21. 청구항 17 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  22. 청구항 17 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
  23. 청구항 17 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    복수개의 상기 세포를 포함하는, 방법.
  24. 대상체의 세포에서 SFK 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와 접촉하도록 제형화되는, 용도.
  25. 대상체의 세포에서 SFK 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와 접촉하도록 제형화되는, 용도.
  26. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
    상기 SFK 단백질이 Src 단백질, Lyn 단백질, 또는 Src 단백질과 Lyn 단백질 둘 다인, 용도.
  27. 청구항 24 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포가 림프종 세포인, 용도.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종 세포인, 용도.
  29. 청구항 24 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  30. 청구항 24 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
  31. 청구항 24 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 상기 세포를 포함하는, 용도.
  32. 대상체의 세포에서 Src 단백질, Lyn 단백질, 팬-P-SFK 단백질, ERK 단백질, P-ERK 단백질, NFκB 단백질, c-Myc 단백질, 또는 CREB 단백질 중 하나 이상의 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 PCLX-001과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서,
    상기 세포가 림프종 세포인, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서,
    상기 림프종 세포가 B-세포 림프종인, 방법.
  35. 청구항 32 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  36. 청구항 32 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
  37. 청구항 32 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 상기 세포를 포함하는, 방법.
  38. 대상체의 세포에서 Src 단백질, Lyn 단백질, 팬-P-SFK 단백질, ERK 단백질, P-ERK 단백질, NFκB 단백질, c-Myc 단백질, 또는 CREB 단백질 중 하나 이상의 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와의 접촉을 위해 제형화된 것인, 용도.
  39. 대상체의 세포에서 Src 단백질, Lyn 단백질, 팬-P-SFK 단백질, ERK 단백질, P-ERK 단백질, NFκB 단백질, c-Myc 단백질 또는 CREB 단백질 중 하나 이상의 수준을 감소시키기 위한 약제 제조에서의 PCLX-001의 용도로서, 상기 PCLX-001은 상기 세포와의 접촉을 위해 제형화된 것인, 용도.
  40. 청구항 38 또는 청구항 39에 있어서,
    상기 세포가 림프종 세포인, 용도.
  41. 청구항 40에 있어서,
    상기 림프종이 B-세포 림프종 세포인, 용도.
  42. 청구항 38 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  43. 청구항 38 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
  44. 청구항 38 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 상기 세포를 포함하는, 용도.
  45. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  46. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 DDD85646을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  47. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 IMP1008을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  48. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 NMT 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 45 내지 청구항 48 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자가면역 장애가 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 당뇨병(제1형), 위염, 대장염, 및 인슐린 의존성 자가면역 당뇨병, 이식편 이식/거부 억제, 건선, 쇼그렌 증후군 또는 이식편대숙주병인, 방법.
  50. 청구항 45 내지 청구항 49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  51. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 PCLX-001을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  52. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 DDD85646을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  53. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 IMP1008을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  54. 대상체에서 염증성 장애를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 NMT 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 장애는
    급성, 유착성(adhesive), 위축성(atrophic), 카타르성(catarrhal), 만성(chronic), 간경변성(cirrhotic), 확산성(diffuse), 파종성(disseminated), 삼출성(exudative), 섬유소성(fibrinous), 섬유화성(fibrosing), 국소성(focal), 육아종성(granulomatous), 과형성(hyperplastic), 비대성(hypertrophic), 간질성(interstitial), 전이성(metastatic), 괴사성(necrotic), 폐색성(obliterative), 실질성(parenchymatous), 가소성(plastic), 생산성(productive), 증식성(proliferous), 위막성(pseudomembranous), 화농성(purulent), 경화성(sclerosing), 혈청형성성(seroplastic), 장액성(serous), 단순성(simple), 특이성(specific), 아급성(subacute), 화농성(suppurative), 독성(toxic), 외상성(traumatic), 궤양성(ulcerative) 염증, 위장 장애, 소화성 궤양, 국소 장염, 게실염, 위장관 출혈, 호산구성, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 대장염, 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD 또는 GERD), 염증성 장질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염(diversion colitis), 베체트 증후군, 불확정 대장염, 염증성 장 증후군(IBS), 또는 흉막염, 폐포염, 맥관염, 폐렴, 만성 기관지염, 기관지확장증, 미만성 범세기관지염, 과민성 폐렴, 천식, 특발성 폐 섬유증(IPF) 및 낭포성 섬유증에서 선택되는 폐의 장애인, 방법.
  56. 청구항 51 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  57. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 PCLX-001과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  58. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 DDD85646과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  59. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  60. 청구항 57 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  61. 청구항 57 내지 청구항 60 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
  62. 청구항 57 내지 청구항 61 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 상기 세포를 포함하는, 방법.
  63. 대상체로부터의 면역 세포의 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 T-세포 및/또는 상기 B-세포를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  64. 대상체로부터의 T-세포 및/또는 B-세포의 활성을 감소시키는 방법으로서, 상기 T-세포 및/또는 상기 B-세포를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  65. 청구항 63 또는 청구항 64에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 방법.
  66. 청구항 63 또는 청구항 64에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 방법.
  67. 청구항 63 또는 청구항 64에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 방법.
  68. 청구항 63 내지 청구항 67 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  69. 청구항 63 내지 청구항 68 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
  70. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  71. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 DDD85646의 용도.
  72. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 IMP1088의 용도.
  73. 대상체에서 자가면역 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 NMT 억제제의 용도.
  74. 청구항 63 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자가면역 장애가 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 홍반성 루푸스, 인슐린 의존성 당뇨병(제1형), 위염, 대장염, 및 인슐린 의존성 자가면역 당뇨병, 이식편 이식/거부 억제, 또는 이식편대숙주병인, 용도.
  75. 청구항 63 내지 청구항 74 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  76. 대상체에서 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  77. 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 DDD85646의 용도.
  78. 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 IMP1088의 용도.
  79. 대상체의 염증성 장애를 치료하기 위한 치료적 유효량의 NMT 억제제의 용도.
  80. 청구항 76 내지 청구항 79 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 장애가 급성, 유착성, 위축성, 카타르성, 만성, 간경변성, 확산성, 파종성, 삼출성, 섬유소성, 섬유화성, 국소성, 육아종성, 과형성, 비대성, 간질성, 전이성, 괴사성, 폐색성, 실질성, 가소성, 생산성, 증식성, 위막성, 화농성, 경화성, 혈청형, 장액성, 단순성, 특이성, 아급성, 화농성, 독성, 외상성, 궤양성 염증, 위장 장애, 소화성 궤양, 국소 장염, 게실염, 위장관 출혈, 호산구성, 호산구성 식도염, 호산구성 위염, 호산구성 위장염, 호산구성 대장염, 위염, 설사, 위식도 역류 질환(GORD 또는 GERD), 염증성 장질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 교원성 대장염, 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환 대장염, 베체트 증후군, 불확정 대장염, 염증성 장 증후군(IBS), 또는 흉막염, 폐포염, 맥관염, 폐렴, 만성 기관지염, 기관지확장증, 미만성 범세기관지염, 과민성 폐렴, 천식, 특발성 폐 섬유증(IPF), 쇼그렌 증후군 및 낭포성 섬유증으로부터 선택되는 폐의 장애인, 용도.
  81. 청구항 76 내지 청구항 80항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  82. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 치료적 유효량의 PCLX-001의 용도.
  83. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 치료적 유효량의 DDD85646의 용도.
  84. 대상체의 세포에서 BCR 단백질 수준 또는 활성 및/또는 TCR 단백질 수준 또는 활성을 감소시키기 위한 치료적 유효량의 NMT 억제제의 용도.
  85. 청구항 82 내지 청구항 84 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  86. 청구항 82 내지 청구항 85 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
  87. 청구항 82 내지 청구항 86 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 상기 세포를 포함하는, 용도.
  88. 대상체로부터 면역 세포의 활성을 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
  89. 대상체로부터 T-세포 및/또는 B-세포의 활성을 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
  90. 청구항 87 또는 청구항 89에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 용도.
  91. 청구항 87 또는 청구항 89에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 용도.
  92. 청구항 87 또는 청구항 89에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 용도.
  93. 청구항 87 내지 청구항 89 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  94. 청구항 87 내지 청구항 93 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
  95. 대상체에서 단핵구 세포의 활성을 감소시키거나, 또는 대상체에서 단핵구 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 상기 단핵구를 NMT 억제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  96. 청구항 95에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 방법.
  97. 청구항 95에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 방법.
  98. 청구항 95에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 방법.
  99. 청구항 95 내지 청구항 98 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  100. 청구항 95 내지 청구항 99 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
  101. 대상체에서 단핵구 세포의 활성을 감소시키거나, 또는 대상체에서 단핵구 세포의 수를 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
  102. 청구항 101에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 용도.
  103. 청구항 101에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 용도.
  104. 청구항 101에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 IMP1088인, 용도.
  105. 청구항 101 내지 청구항 104 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 용도.
  106. 청구항 101 내지 청구항 105 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 용도.
  107. 대상체의 T-세포에서 사이토카인 분비량을 감소시키는 방법으로서, NMT 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  108. 청구항 107에 있어서,
    상기 사이토카인이 IL-6, IL-8 및 IFN-감마. IL-5, IL-10, 또는 IL-13인, 방법.
  109. 청구항 107 또는 청구항 108에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 방법.
  110. 청구항 107 또는 청구항 108에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 방법.
  111. 청구항 107 또는 청구항 108에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 IMP-1088인, 방법.
  112. 청구항 107 내지 청구항 111 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  113. 청구항 107 내지 청구항 112 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
  114. 대상체의 T-세포에서 사이토카인 분비량을 감소시키기 위한 NMT 억제제의 용도.
  115. 청구항 114에 있어서,
    상기 사이토카인이 IL-6, IL-8 및 IFN-감마. IL-5, IL-10, 또는 IL-13인, 용도.
  116. 청구항 114 또는 청구항 115에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 PCLX-001인, 용도.
  117. 청구항 114 또는 청구항 115에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 DDD85646인, 용도.
  118. 청구항 114 또는 청구항 115에 있어서,
    상기 NMT 억제제가 IMP-1088인, 용도.
  119. 청구항 114 내지 청구항 118 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상체가 인간인, 방법.
  120. 청구항 114 내지 청구항 119 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 접촉이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo)인, 방법.
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