CN116234547A - N-豆蔻酰基转移酶(nmt)抑制剂在治疗癌症、自身免疫性病症和炎症性病症中的用途 - Google Patents

N-豆蔻酰基转移酶(nmt)抑制剂在治疗癌症、自身免疫性病症和炎症性病症中的用途 Download PDF

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Abstract

公开了N‑豆蔻酰基转移酶(NMT)抑制剂在治疗癌症、自身免疫性病症和炎症性病症中的用途。关于癌症，优选待治疗的癌症是B细胞淋巴瘤，所用的NMT是PCLX‑001(DDD86481，CAS RN 1215011‑08‑7)。用于治疗自身免疫性病症和炎症性病症的优选NMT抑制剂包括上述PCLX‑001、PCLX‑002(DDD85646，CAS RN 1215010‑55‑10)和IMP‑1088(CAS RN 2059148‑82‑0)，待治疗的病症包括类风湿性关节炎、哮喘、胃炎、结肠炎以及其他消化道和呼吸道疾病。

Description

N-豆蔻酰基转移酶(NMT)抑制剂在治疗癌症、自身免疫性病症 和炎症性病症中的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月20日提交的美国专利申请号63/093,970的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
技术领域
靶向N-豆蔻酰化用于治疗B细胞淋巴瘤、自身免疫性病症和/或炎症性病症。
背景技术
血液癌症如淋巴瘤约占全球新增癌症病例和癌症相关死亡的9％1,2,3。尽管患有侵袭性非霍奇金淋巴瘤(如Burkitt淋巴瘤(BL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))的患者经常通过当前的治疗获得初始缓解，但这些治疗是有毒的，并且相当大比例的患者经历疾病复发和过早死亡2,3。美国国家癌症研究所(NCI)的监测、流行病学和最终结果(SEER)的最新数据显示，相对于年龄匹配的对照组，非霍奇金淋巴瘤和DLBCL的诊断后5年生存率分别仅为70％和63％2。因此，迫切需要鉴定侵袭性淋巴瘤的新成药靶点和耐受性更好的治疗方法。
虽然B细胞受体(BCR)信号传导对于正常B细胞功能是必需的，但其通常被解除调控，并为BL和DLBCL4中的B细胞淋巴瘤形成提供关键的促存活信号5,6,7,8。事实上，自身抗原的存在和/或关键BCR效应因子的突变影响了BCR的不同信号传导模式。除了配体激活的BCR信号传导模式外，这些包括在活化的B细胞样DLBCL(ABC-DLBCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的慢性活性BCR信号传导，以及在BL中的强直性(抗原非依赖性组成型基线信号传导)BCR信号传导4,5,6,7,8。典型地，BCR的结合导致该受体转位到含有豆蔻酰化的Src家族激酶(SFK)Lyn的质膜脂筏9,10,11。豆蔻酰化的Lyn磷酸化选择BCR相关CD79A-CD79B异二聚体的免疫受体酪氨酸基序(ITAM)中的酪氨酸残基12,13，导致脾酪氨酸激酶(SYK)的募集。人生发中心相关(HGAL)蛋白是另一种定位于脂筏的豆蔻酰化的蛋白质，在BCR活化后被磷酸化14,15。磷酸化的HGAL通过扩张SYK对磷酸化的ITAM的活化和募集来增强BCR信号传导，触发Tec家族成员Bruton酪氨酸激酶(BTK)16、磷脂酶CΥ和蛋白激酶Cβ(PKCβ)13的酪氨酸磷酸化。活化的磷脂酶CΥ活性产生二酰基甘油(DAG)和肌醇-三磷酸(IP3)，它们分别从内质网储备中活化PKC和动员钙离子。这些化学介质反过来激活各种信号传导通路17。所有这些早期信号传导事件通过由NFκB、PI3K、细胞外信号调节激酶(ERK)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、CREB和NF-AT途径激活转录来促进细胞存活和增殖4,5,6,18。BCR信号传导在淋巴瘤形成中的重要性已经促进了许多药剂的开发，这些药剂靶向BCR下游的效应蛋白，包括各种SFK(达沙替尼)、BTK(伊布替尼)和PI3Kδ(CAL-101)4,5,19,20。
在人类中，蛋白质豆蔻酰化由两种普遍表达的N-豆蔻酰基转移酶NMT1和NMT2介导，其将14碳脂肪酸豆蔻酸酯添加到许多蛋白质上21,22。豆蔻酰化在细胞信号传导中起着基本作用，并允许蛋白质与细胞膜的动态相互作用23,24。豆蔻酰化发生在蛋白质的N-末端甘氨酸残基处，要么在去除起始甲硫氨酸后共翻译，要么在凋亡过程中在半胱天冬酶裂解后翻译23。人类中多达600种蛋白形式25被豆蔻酰化，这些蛋白质的正确膜靶向和功能需要豆蔻酰化23,24,26,27,28。SFK、Abl、Gα亚单位、Arf GTP酶、半胱天冬酶截短型(ct-)Bid和ct-PAK2是豆蔻酰化的蛋白质的实例，其关键性地调节细胞生长和凋亡23,29,30,31,32,33,34,35。最近，NMT也被显示负责Arf6 GTP酶的N-末端定位的赖氨酸残基的豆蔻酰化，从而增加了它们在细胞信号传导中的作用36,37。因为NMT对寄生虫的活力是必不可少的，所以小分子抑制剂(例如DDD85646)被开发为非洲锥虫(T.brucei)NMT抑制剂，用于治疗非洲昏睡病38。DDD85646也被合成并被独立验证为名为IMP-366的人类NMT真正的抑制剂39。
传统上，将自身免疫性病症分类为T细胞介导的或自身抗体介导的。然而，对免疫系统复杂性的进一步理解已经极大地影响了我们看待自身免疫性疾病及其病因的方式。越来越多的人认识到，在适应性免疫反应中T细胞帮助B细胞以及B细胞帮助CD4+T细胞活化的相互作用。在传统的自身抗体介导的疾病中，观察到大多数自身抗体是IgG同种型并携带体细胞突变，这强烈表明T细胞在自身免疫性B细胞反应中起帮助作用。同样，B细胞在自身免疫性疾病中作为重要的抗原呈递细胞发挥作用，这些疾病传统上被认为是T细胞介导的。据认为，大多数自身免疫性疾病是由B细胞、T细胞和其他免疫细胞组成的免疫网络的功能障碍引起的。
通过BCR进行的信号传导在抗体的产生、自身免疫和免疫耐受性的建立中起重要作用。
在Marston,B.等人(2010)Curr Opin Rheumatol.2010May；22(3):307-315中讨论了B细胞在类风湿性关节炎的发病机理和治疗中的作用。在Kwan-Morley,J.和Albert,D(2007)Current Rheumatology Reports.9:401-406中讨论了B细胞抑制剂作为用于类风湿性关节炎的疗法的作用：更新。在Iwata,S.等人(2015)Arthritis&rheumatology.Vol67.No 1.pp 63-73中讨论了类风湿性关节炎患者外周血B细胞中Syk的活化。在Pritchard,N.R.,&Smith,K.G.C.(2003)Immunology.108.263-273中讨论了B细胞抑制性受体和自身免疫的作用。在Chu,A.&Chang,BY(2013)OA Arthritis.Oct 27；1(2):17中讨论了B细胞激酶抑制剂在类风湿性关节炎中的作用。在Martin,F.和Chan,A.C.(2004)Immunity.Vol 20,517-527中讨论了B细胞在人类自身免疫中的致病作用：来自临床的见解。在Tsubata,T(2018)Frontiers in Immunology.Vol 9.Article 2276中讨论了配体识别决定抑制性B细胞共受体在调节B细胞稳态和自身免疫中的作用。在Hofmann,K.等人(2018)Frontiers inImmunology.Vol 9.Article 835中讨论了自身免疫性疾病中的靶向B细胞和浆细胞。在Byeon,S.E.等人(2012)Mediators of Inflammation.Volume 2013.18,pages中讨论了Src激酶在巨噬细胞介导的炎症反应中的作用。在Braselmann,S.等人(2006)JPET.319:998-1008中讨论了R406，它是一种阻断Fc受体信号传导并减少免疫复合物介导的炎症的口服脾酪氨酸激酶抑制剂。在Bluom，M.等人(2012)Br J Clin Pharmacol.76:1.78-88中描述了在三项I期研究中单次和多次口服施用Fostamatinib(一种脾酪氨酸激酶(SYK)抑制剂)后健康人类受试者的药代动力学。在Taams，L.S.等人(2006)Immunology.118.1-9中讨论了人类疾病中的调节性T细胞及其用于治疗操作的潜力。在Jee,M.H.等人(2020)ImmunologicalReviews.2020；00:1-13中讨论了γδT细胞的作用和炎症性皮肤病。
抗B细胞受体(BCR)复合物抗体在自身免疫、癌症、炎症性疾病和移植的治疗中具有治疗用途。
抑制T细胞受体(TCR)信号有望用于治疗广谱的人类T细胞介导的自身免疫性和炎症性疾病。
仍然需要BCR和/或TCR的抑制剂，用于治疗自身免疫、癌症、炎症性疾病和/或移植。
发明内容
在一个方面，提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症，所述方法包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
如本文所述，提供了：
1.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症，所述方法包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
2.条款1的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
3.条款2的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
4.条款1至3中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
5.治疗有效量的PCLX-001用于治疗受试者中的癌症的用途，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症。
6.治疗有效量的PCLX-001在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症。
7.条款5或6的用途，其中所述癌症是淋巴瘤。
8.条款7的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
9.条款5至8中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
10.一种诱导受试者中淋巴瘤细胞死亡的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的PCLX-001。
11.条款10的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
12.条款10或11的方法，其中所述受试者为人类。
13.治疗有效量的PCLX-001用于在受试者中诱导淋巴瘤的用途。
14.治疗有效量的PCLX-001在制备用于在受试者中诱导淋巴瘤的药物中的用途。
15.条款13或14的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
16.条款13至15中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
17.一种降低受试者细胞中SFK蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与PCLX-001接触。
18.条款17的方法，其中所述SFK蛋白是Src蛋白、Lyn蛋白或Src蛋白和Lyn蛋白两者。
19.条款17或18的方法，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
20.条款19的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤细胞。
21.条款17至20中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
22.条款17至21中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
23.条款17至22中任一项的方法，其包含多个所述细胞。
24.PCLX-001用于降低受试者细胞中SFK蛋白水平或活性的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
25.PCLX-001在制备用于降低受试者细胞中SFK蛋白水平或活性的药物中的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
26.条款24或25的用途，其中所述SFK蛋白是Src蛋白、Lyn蛋白或Src蛋白和Lyn蛋白两者。
27.条款24至26中任一项的用途，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
28.条款27的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤细胞。
29.条款24至28中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
30.条款24至29中任一项的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
31.条款24至30中任一项的用途，其包含多个所述细胞。
32.一种降低受试者细胞中Src蛋白、Lyn蛋白、泛P-SFK蛋白、ERK蛋白、P-ERK蛋白、NFκB蛋白、c-Myc蛋白或CREB蛋白水平或活性中的一种或多种的方法，其包括：将所述细胞与PCLX-001接触。
33.条款32的方法，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
34.条款33的方法，其中所述淋巴瘤细胞是B细胞淋巴瘤。
35.条款32至34中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
36.条款32至35中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
37.条款32至36中任一项的方法，其包含多个所述细胞。
38.PCLX-001用于降低受试者细胞中Src蛋白、Lyn蛋白、泛P-SFK蛋白、ERK蛋白、P-ERK蛋白、NFκB蛋白、c-Myc蛋白或CREB蛋白水平或活性中的一种或多种的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
39.PCLX-001在制备用于降低受试者细胞中Src蛋白、Lyn蛋白、泛P-SFK蛋白、ERK蛋白、P-ERK蛋白、NFκB蛋白、c-Myc蛋白或CREB蛋白水平中的一种或多种的药物中的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
40.条款38或39的用途，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
41.条款40的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤细胞。
42.条款38至41中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
43.条款38至42中任一项的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
44.条款38至43中任一项的用途，其包含多个所述细胞。
45.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
46.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的DDD85646。
47.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的IMP1008。
48.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的NMT抑制剂。
49.条款45至48中任一项的方法，其中所述自身免疫性病症为类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胃炎、结肠炎和胰岛素依赖性自身免疫性糖尿病、移植物移植/排斥抑制、银屑病、干燥综合征或移植物抗宿主病。
50.条款45至49中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
51.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
52.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的DDD85646。
53.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的IMP1008。
54.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的NMT抑制剂。
55.条款51至54中任一项的方法，其中所述炎症性病症为急性、粘连性、萎缩性、卡他性、慢性、硬变性、弥漫性、播散性、渗出性、纤维素性、纤维化、局灶性、肉芽肿性、增生性、肥大性、间质性、转移性、坏死性、闭塞性、实质性、可塑性、生产性、增殖性、伪膜性、脓性、硬化性、浆液纤维蛋白性、浆液性、单纯性、特异性、亚急性、化脓性、毒性、创伤性、溃疡性炎症、胃肠病症、消化性溃疡、区域性肠炎、憩室炎、胃肠出血、嗜酸性、嗜酸性食管炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎、胃炎、腹泻、胃食管反流病(GORD或GERD)、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞综合征、不确定性结肠炎、炎症性肠综合征(IBS)，或选自胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、过敏性肺炎、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)和囊性纤维化的肺部病症。
56.条款51至55中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
57.一种降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与PCLX-001接触。
58.一种降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与DDD85646接触。
59.一种降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与NMT抑制剂接触。
60.条款57至59中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
61.条款57至60中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
62.条款57至61中任一项的方法，其包含多个所述细胞。
63.一种降低受试者免疫细胞活性的方法，其包括：将所述T细胞和/或所述B细胞与NMT抑制剂接触。
64.一种降低受试者T细胞和/或B细胞活性的方法，其包括：将所述T细胞和/或所述B细胞与NMT抑制剂接触。
65.条款63或64的方法，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
66.条款63或64的方法，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
67.条款63或64的方法，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
68.条款63至67中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
69.条款63至68中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
70.治疗有效量的PCLX-001用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
71.治疗有效量的DDD85646用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
72.治疗有效量的IMP 1088用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
73.治疗有效量的NMT抑制剂用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
74.条款63至73中任一项的用途，其中所述自身免疫性病症为类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胃炎、结肠炎和胰岛素依赖性自身免疫性糖尿病、移植物移植/排斥抑制或移植物抗宿主病。
75.条款63至74中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
76.治疗有效量的PCLX-001用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
77.治疗有效量的DDD85646用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
78.治疗有效量的IMP 1088用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
79.治疗有效量的NMT抑制剂用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
80.条款76至79中任一项的用途，其中所述炎症性病症为急性、粘连性、萎缩性、卡他性、慢性、硬变性、弥漫性、播散性、渗出性、纤维素性、纤维化、局灶性、肉芽肿性、增生性、肥大性、间质性、转移性、坏死性、闭塞性、实质性、可塑性、生产性、增殖性、伪膜性、脓性、硬化性、浆液纤维蛋白性、浆液性、单纯性、特异性、亚急性、化脓性、毒性、创伤性、溃疡性炎症、胃肠病症、消化性溃疡、区域性肠炎、憩室炎、胃肠出血、嗜酸性、嗜酸性食管炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎、胃炎、腹泻、胃食管反流病(GORD或GERD)、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞综合征、不确定性结肠炎、炎症性肠综合征(IBS)，或选自胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、过敏性肺炎、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)、干燥综合征和囊性纤维化的肺部病症。
81.条款76至80中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
82.治疗有效量的PCLX-001用于降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的用途。
83.治疗有效量的DDD85646用于降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的用途。
84.治疗有效量的NMT抑制剂用于降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的用途。
85.条款82至84中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
86.条款82至85中任一项的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
87.条款82至86中任一项的用途，其包含多个所述细胞。
88.NMT抑制剂用于降低受试者免疫细胞活性的用途。
89.NMT抑制剂用于降低受试者T细胞和/或B细胞活性的用途。
90.条款87或89的用途，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
91.条款87或89的用途，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
92.条款87或89的用途，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
93.条款87至89中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
94.条款87至93中任一项的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
95.一种降低受试者单核细胞活性或减少受试者单核细胞数量的方法，其包括：将所述单核细胞与NMT抑制剂接触。
96.条款95的方法，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
97.条款95的方法，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
98.条款95的方法，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
99.条款95至98中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
100.条款95至99中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
101.NMT抑制剂用于降低受试者单核细胞活性或减少受试者单核细胞数量的用途。
102.条款101的用途，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
103.条款101的用途，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
104.条款101的用途，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
105.条款101至104中任一项的用途，其中所述受试者为人类。
106.条款101至105中任一项的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
107.一种减少受试者T细胞中细胞因子分泌量的方法，其包括：施用NMT抑制剂。
108.条款107的方法，其中所述细胞因子是IL-6、IL-8和IFN-γ、IL-5、IL-10或IL-13。
109.条款107或108的方法，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
110.条款107或108方法，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
111.条款107或108的方法，其中所述NMT抑制剂是IMP-1088。
112.条款107至111中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
113.条款107至112中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
114.NMT抑制剂用于减少受试者T细胞中细胞因子分泌量的用途。
115.条款114的用途，其中所述细胞因子是IL-6、IL-8和IFN-γ、IL-5、IL-10或IL-13。
116.条款114或115的用途，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
117.条款114或115的用途，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
118.条款114或115的用途，其中所述NMT抑制剂是IMP-1088。
119.条款114至118中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
120.条款114至119中任一项的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
附图说明
现在将参考附图，仅通过示例方式描述本公开的实施方案。
图1A-H.与其他来源的癌细胞系相比，PCLX-001选择性杀死血液癌细胞系。用1.2μM PCLX-001处理96小时后(使用Horizon细胞系筛选确定)(A，B)，或用1μM PCLX-001处理72小时后(使用OncolinesTM细胞系筛选确定)(C，D)，各种细胞系的最大生长抑制百分比。细胞系根据肿瘤细胞类型排列。交叉阴影区代表细胞毒性效应。血液癌细胞系用灰色表示，而所有其他类型的癌细胞系用白色表示。相应的小提琴图比较了由Horizon(B)和OncolinesTM(D)细胞筛选计算的对血液癌细胞系和其他来源的癌细胞系总计的PCLX-001介导的平均生长抑制(不成对t检验，双尾P<0.0001)。四分位数由虚线分隔。误差棒代表每组内的标准偏差。用0.001-5μM的PCLX-001处理96小时的永生化淋巴细胞(IM9、VDS)、BL(BL2、Ramos、BJAB)和DLBCL(DOHH2、WSU-DLCL2、SU-DHL-10)细胞系的标准化细胞活力曲线，如通过CellTiter Blue活力测定(E)所确定的。从E中绘制的细胞活力曲线得到的绝对IC50值的相应直方图(F)。(***)表示IM9细胞和所有其他受试细胞系之间的IC50有显著差异(P≤0.001)(普通单因素方差分析，Tukey多重比较检验，P<0.0001)。用0-5μM的PCLX-001处理96小时的IM9(G)和BL2(H)细胞的标准化增殖，如通过细胞计数所确定的。数值为3次独立实验的平均值±s.e.m.。
图2A-G.PCLX-001在体外选择性抑制豆蔻酰化并在淋巴瘤细胞系中诱导凋亡。在炔烃-豆蔻酸酯标记的细胞裂解物上使用点击化学来确定：用0.01-1.0μMPCLX-001处理1小时的BL2细胞(A)和IM9细胞(B)中的总蛋白质豆蔻酰化水平，在COS-7细胞中表达的WT-Src-EGFP构建体的豆蔻酰化水平(C)，以及用1.0-10μM PCLX-001处理1小时后IM9细胞中免疫沉淀的内源性pp60-Src的豆蔻酰化(D)。用WT-Src-EGFP(左)、不可豆蔻酰化的G2A-Src-EGFP突变体(中)和用10μMPCLX-001处理24小时的WT-Src-EGFP构建体(右)转染的COS-7细胞的荧光显微照片(E)。比例尺等于10μm。通过Western印迹测量的用1μM PCLX-001处理0-5天的IM9和BL2细胞中的内源性Src蛋白水平(F)。用0–1,0μM PCLX-001(复合凝胶)孵育72小时后，在IM9、BL2和Ramos细胞裂解物中裂解的PARP-1和裂解的半胱天冬酶-3的Western印迹(G)。所有显示的数据代表至少三个独立的实验。GAPDH作为上样对照。
图3A、B.PCLX-001处理导致淋巴瘤细胞系中的SFK不稳定性和经由蛋白酶体的降解。用0.1μM或1.0μM PCLX-001处理24-48小时后，永生化淋巴细胞(IM9、VDS)、BL(BL2、Ramos、BJAB)和DLBCL(DOHH2、WSU-DLCL2、SU DHL 10)细胞系裂解物中总Src和Lyn蛋白的Western印迹(A)。在最后6小时中，在存在或不存在10μM蛋白酶体抑制剂MG132的情况下，用1μMPCLX-001处理24-48小时的BL2中总Src、Lyn、Hck、Lck、Mcl-1、总磷酸-酪氨酸(PY99)和泛磷酸化SFK(P-SFK)蛋白水平的Western印迹(B)。GAPDH用作上样对照。显示的所有western印迹代表三个独立的实验。
图4A-C.PCLX-001处理减弱了BL2淋巴瘤细胞中的BCR下游信号传导事件。用0.1μM或1.0μM的达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理48小时的BL2细胞的Western印迹，以检测总酪氨酸磷酸化(P-Tyr)、Lyn、酪氨酸396或507上的Lyn磷酸化、BTK、酪氨酸223或551上的BTK磷酸化(A)、HGAL、SYK、磷酸化SYK(P-SYK)(B)或ERK、磷酸化ERK(P-ERK)、NFKB、c-Myc、CREB、Arf-1、BIP和PARP-1(C)。Western印迹代表至少三个独立的实验。GAPDH用作上样对照。用25μg/ml的F(ab’)2抗人IgM活化BL2细胞2min，进行western印迹。显示的所有western印迹代表三个独立的实验。
图5A、B.描述所提出的PCLX-001在B细胞淋巴瘤中的作用机制的模型。(A)在BCR活化时，首先豆蔻酰化的SFK Lyn被募集到包含BCR的质膜的脂筏结构域，Y507处去磷酸化的Lyn导致其在Y396处的活化和自磷酸化。这导致BTK在Y551和Y223处的磷酸化和活化。其次，豆蔻酰化的HGAL也被募集到质膜并磷酸化，从而通过由肌醇-3-磷酸离子通道受体(IP3R)刺激SYK、BTK和从内质网释放Ca++离子来增强BCR信号传导。总之，这些早期信号传导事件导致经由c-Myc、P-ERK、NFKB和CREB的转录激活。(B)NMT抑制剂PCLX-001阻止Lyn-SFK(以及该模型中未显示的其他SFK)、HGAL和Arf1的豆蔻酰化，从而阻碍这些蛋白质的正确膜靶向和功能。PCLX-001处理通过减少BCR介导的Ca++从ER中释放并增加细胞中的基础Ca++水平来阻碍钙稳态，此外还促进豆蔻酰化蛋白质(Lyn、HGAL、Arf1)和出人意料的非豆蔻酰化蛋白质(NFKB、P-ERK、c-Myc和CREB)的降解，其中一些通过泛素-蛋白酶体途径，从而进一步消除下游BCR信号传导并增加ER应激，导致细胞凋亡和细胞死亡。
图6A-D.与达沙替尼和伊布替尼相比，PCLX-001相对于良性淋巴细胞选择性杀死血液癌细胞。用0.001-5μM达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理48小时(A)或96小时(B)的BL2细胞(实线)和IM9细胞(虚线)的细胞活力曲线。用0.1μM或1.0μM的达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理48小时(C)和96小时(D)的永生化淋巴细胞(IM9、VDS)、BL(BL2、Ramos、BJAB)和DLBCL(DOHH2、WSU-DLCL2、SU-DHL-10)细胞系的标准化细胞活力。所有实验的细胞活力使用钙黄绿素测定法测量，并且是三个独立实验的平均值。误差棒描述了s.e.m.。
图7A-G.PCLX-001治疗减少了B细胞淋巴瘤异种移植模型中的肿瘤体积，并导致肿瘤完全消退。作为时间的函数的鼠皮下异种移植物的剂量-反应曲线来源于测量DOHH2(A)和BL2(B)肿瘤尺寸的细胞系。误差棒代表平均肿瘤体积的标准偏差。在用PCLX-001、多柔比星或指示剂量的载体单独治疗的小鼠的BL2肿瘤样品中，如前所述21评估平均总NMT比活性。与载体相比，从用60mg/kg/天治疗的小鼠中提取的肿瘤具有降低的NMT比活性(配对t检验，P＝0.0425)。误差棒代表s.e.m.。(C)来自患者DLBCL3的鼠异种移植物的剂量-反应曲线。数据点代表所有存活动物的平均肿瘤体积。误差棒代表平均肿瘤体积的标准偏差(D)。(***)表明接受20mg/kg/天和50mg/kg/天PCLX-001的动物之间的反应率有显著差异(P<0.0001)。来自具有患者来源的DLBCL3异种移植物的小鼠的代表性肿瘤(E)。上述DLBCL3患者异种移植肿瘤样品中裂解的半胱天冬酶-3(F)和Ki-67(G)的代表性IHC染色。比例尺等于100μm。
图8.组合的Horizon和Oncoline细胞系筛选数据表明，与衍生自所有其它癌症类型的细胞系相比，PCLX-001对血液癌细胞系赋予最大的生长抑制。小提琴图描绘了在处理96小时后，来自Horizon和Oncoline细胞系筛选的PCLX-001对血液细胞系与所有其他非血液细胞系的组合生长抑制百分比。四分位数由虚线分隔。(***)表示生长抑制的显著差异(不成对t检验，双尾P<0.0001)。
图9A-D.效力筛选的广度表明PCLX-001对各种其他癌细胞系具有活性，包括衍生自实体瘤的癌细胞系。用0.0005-10μM PCLX-001处理3天(A、B)或6天(C、D)的各种细胞系的绝对IC50值。细胞系根据癌症类型排列。单个柱代表衍生自B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病(AML)、乳腺、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)的单一癌细胞系。ChemPartner机器人平台使用CellTiter Blue活力测定法测定细胞活力。由于无法从Chempartner平台获得第0天的细胞活力，因此未计算生长抑制(GI)。(不成对t检验，双尾，**P＝0.0038，ns＝不显著)。
图10A、B.与永生化淋巴细胞相比，PCLX-001选择性杀死血液癌细胞系。(A)用0.001-5μM的PCLX-001处理96小时的永生化淋巴细胞(IM9、VDS)、BL(BL2、Ramos、BJAB)和DLBCL(DOHH2、WSU-DLCL2、SU-DHL-10)细胞系的标准化细胞活力曲线，如通过钙黄绿素测定法测定的，该测定法测量活细胞的百分比，而不考虑细胞的数量。(B)由(A)中绘制的细胞活力曲线得到的绝对IC50值的相应直方图。数值为3次实验的平均值±s.e.m.。(普通单因素方差分析，Tukey多重比较检验，***P<0.0001)。
图11A-C.PCLX-001处理降低了标准化淋巴瘤细胞系增殖。(A)用0-5μM的PCLX-001处理96小时的永生化淋巴细胞(VDS)、BL(Ramos、BJAB)和DLBCL(DOHH2、WSU-DLCL2、SU-DHL-10)细胞系的标准化增殖，如通过细胞计数所确定的。(B)在0.1μM PCLX-001处理长达96小时后，各种细胞系的标准化增殖的抑制。(C)为了说明细胞生长率的差异，将我们的数据转化为各种细胞系在0.1μM PCLX-001处理长达96小时后的标准化增殖除以相应未处理细胞系的标准化增殖的相对比率。数值为3次实验的平均值±s.e.m.。
图12A、B.大部分新分离的人淋巴细胞、PBMC和原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)对PCLX-001具有抗性。用0.001–10μM PCLX-001处理96小时的2种新鲜分离的人外周血单核细胞(PBMC)和淋巴细胞制剂的细胞活力曲线。数值为平均值±s.e.m.(n＝2)。用0.001–5μMPCLX-001处理HUVEC 96小时，用Cell-Titer Blue测定法测定残余细胞活力。数值为平均值±S.D.(n＝4)。
图13A、B.PCLX-001不抑制Ras的棕榈酰化，并且在生理水平上不具有任何显著的脱靶激酶抑制剂活性。(A)将瞬时表达可棕榈酰化的EGFP-N-Ras或不可棕榈酰化的EGFP-K-Ras 48小时的COS-7细胞用100μM 2-溴棕榈酸酯(2-BP)、棕榈酰化抑制剂或下列NMT抑制剂预处理1小时：10μM PCLX-001、100μM 2-羟基豆蔻酸酯(HMA)或10μM Tris DBA。经抑制剂预处理的细胞然后用100μM炔烃C16标记4小时。如所述免疫沉淀EGFP标记的构建体，并使用点击化学与叠氮基-生物素反应。使用中性抗生物素蛋白-HRP缀合物和ECL检测生物素化-棕榈酰化蛋白。(B)TREEspotTM是美国加利福尼亚州DiscoverX公司开发的专有数据可视化软件工具。对scanMAX KINOMEscan的468种预先配置的人激酶进行了测试。突变激酶和脂质激酶未出现。发现结合PCLX-001的可能激酶用红圈标记，其中较大的圈表示较高的亲和力结合。在PCLX-001 10μM以下没有发现激酶结合，这相当于PCLX-001对BL2细胞的EC50的浓度的～400倍。在100μM PCLX-001(对BL2的EC50的～4000倍)时，仅发现3种激酶(MRCKA、PIP5K2C和SRPK1以红色显示)弱结合PCLX-001(激酶活性分数<对照的35％)。显示的所有western印迹代表三个独立的实验。
图14.用PCLX-001处理长达5天的BL2和IM9细胞中Src蛋白水平降低的定量。通过Western印迹检测的总内源性Src蛋白水平的定量(图2F)。误差棒表示平均值的标准误差。(*)表示Src蛋白水平(n＝3)的显著差异(双因素方差分析，P＝0.0174)。
图15A、B.PCLX-001处理降低了各种正常和恶性B细胞系中基础(强直性或慢性)和抗IgM活化信号传导的磷酸-酪氨酸水平。(A)用0.01-1μM PCLX-001处理24小时后，评估正常IM9和VDS细胞系以及恶性B细胞系BL2、Ramos、BJAB、DOHH2、WSU-DLCL2和SU-DHL-10细胞中基础(抗原非依赖性强直性或慢性)酪氨酸磷酸化水平(PY99)的Western印迹。(B)用0.1μM或1μM达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理24小时的未刺激(左)和抗IgM连接的BCR(右)BL2细胞的PY99 Western印迹。如所示，用25μg/ml山羊抗人IgM活化BL2细胞2分钟。所示的Western印迹代表至少3个独立实验。
图16A-C.PCLX-001处理显著降低了BL2细胞中的总磷酸-酪氨酸、磷酸-ERK(P-ERK)和NFKB水平。在用0.1μM或1.0μM的达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理48小时的BL2细胞中，使用PY99抗体(A)、P-ERK(B)和NFKB(C)对总磷酸-酪氨酸水平进行Western印迹定量(图4A)(对于A和C，n＝4，对于B，n＝3)。如所示，BL2细胞用25μg/ml山羊抗人IgM活化2分钟。误差棒表示平均值的标准误差。(*)表示磷酸-酪氨酸水平的显著差异(P<0.05)(普通单因素方差分析，Tukey多重比较检验)。
图17A、B.PCLX-001处理减弱了各种淋巴瘤细胞系中的抗IgM连接的BCR信号传导。用0.1μM或1.0μM的达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理48小时的(A)BL(Ramos、BJAB)和(B)DLBCL(DOHH2、WSU-DLCL2、SUDHL-10)细胞系的Western印迹，以检测总Src、Lyn、ERK、磷酸化SFK(P-SFK)和磷酸化ERK(P-ERK)水平。在DOHH2中没有检测到Src和Lyn。Western印迹代表至少三个独立的实验。GAPDH用作上样对照。在Western印迹之前，用25μg/mL山羊抗人IgM活化细胞系2分钟。显示的所有Western印迹代表三个独立的实验。
图18A、B.用PCLX-001、达沙替尼、伊布替尼处理48小时后BL2细胞中各种SFK水平的比较。用0.1μM或1.0μM的达沙替尼、伊布替尼或PCLX-001处理48小时的BL2细胞中Lyn、Src、Lck、Hck、Fyn和总磷酸化SFK(P-SFK印迹显示于图4A)的蛋白质水平的Western印迹(A)和定量(B)。如所示，BL2细胞用25μg/ml的山羊抗人IgM活化2分钟。误差棒表示平均值的标准误差。(***)表示蛋白或磷酸化蛋白水平的显著差异(p<0.0001)(普通单因素方差分析，Tukey多重比较检验)。
图19A-C.PCLX-001减少了BL2细胞中由抗IgM刺激活化的BCR受体依赖性钙释放。在用1μM PCLX-001(A)、达沙替尼(B)或伊布替尼(C)处理24小时或48小时的BL2细胞中测量内质网Ca++释放。用荧光Ca++指示剂上样细胞后，用10μg/ml山羊F(ab’)2抗人IgM刺激Fura-2细胞，以连接并活化BCR受体依赖性Ca++释放，然后用毒胡萝卜素(300nM)处理，以显示BCR受体非依赖性Ca++从内质网释放。显示的结果代表了实验的多次重复(对于PCLX-001孵育，n＝6，对于达沙替尼和伊布替尼，n＝3)。
图20A、B.达沙替尼和伊布替尼不协同PCLX-001在IM9和BL2细胞中的细胞毒性作用。IM9(A)和BL2(B)细胞与0.01、0.1和1μM的PCLX-001联合0.1和1M的达沙替尼或伊布替尼一起孵育96小时。在PCLX-001中加入达沙替尼或伊布替尼后没有观察到附加的或协同的效果。从我们的实验中可以看出，恶性BL2细胞比正常IM9 B细胞对PCLX-001更敏感。细胞活力使用钙黄绿素测定法测量，代表三个独立实验的平均值。误差棒描述了s.e.m.。
图21A-G.PCLX-001和多柔比星治疗对异种移植模型中体重和存活率百分比的影响。DOHH2(A)、BL2(C)和(F)DLBCL3-患者来源的异种移植模型中体重的变化百分比。黑色箭头代表注射。误差棒代表每个时间点每只小鼠平均体重的标准偏差。Kaplan-Meier曲线，其中存活事件包括因毒性死亡、因癌症死亡或因毒性安乐死，描绘了(B)DOHH2、(D)BL2和(G)DLBCL3-患者来源的异种移植模型中随时间推移的存活率百分比。在用指定剂量的PCLX-001和多柔比星治疗后，从BL2异种移植动物的Kaplan-Meier曲线分析(D)得到的中位存活期估计值(E)。
图22A-E.血液癌细胞系中NMT表达降低。NMT1转录物的平均数量大于NMT2转录物。然而，在癌细胞系中，NMT2转录物数量(灰色)显示出比NMT1转录物数量(黑色)更大的变化(A)。与源自其他类型癌症的细胞系相比，NMT2mRNA表达在血液癌细胞系中显著较低(不成对t检验；***P<0.0001)(最小至最大箱体图，B)。NMT1的表达(C)在所研究的1269个细胞系中相对恒定，在乳腺癌和白血病癌细胞系中的表达轻微但显著降低，而NMT2的表达(D)在各种癌症之间以及在给定的癌症类型中显著变化。数据还表明，虽然NMT2在CNS、肾脏和成纤维细胞来源的癌细胞系中的表达较高，但NMT2在血液癌症如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中的表达有选择性的和显著的降低。箱体图显示10-90个百分点(普通单因素方差分析，Dunnett多重比较检验，***P<0.0001)。作为一种可能的补偿机制，在表达最少NMT2的100个细胞系中，NMT1的表达没有增加(E)。所有数据均提取自20Q1公共RNA测序(Broad Institute，1269个细胞系)并在选定的癌症中进行分类。
图23.PCLX-001处理减弱了Jurkat T细胞中的TCR依赖性P-ERK活化。用CD3/CD28抗体活化Jurkat T细胞长达60分钟(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001孵育24/48h(1μM)抑制P-ERK活化。
图24.PCLX-001处理(24h)减弱了Jurkat T细胞中的TCR依赖性P-ERK和P-SFK活化。用CD3/CD28抗体活化Jurkat T细胞长达4小时(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001孵育24h(0.1和1μM)抑制P-ERK活化和Src家族激酶(P-SFK)磷酸化。
图25.PCLX-001处理(48h)减弱了Jurkat T细胞中的TCR依赖性P-ERK和P-SFK活化。用CD3/CD28抗体活化Jurkat T细胞达4小时(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001孵育48h(0.1和1μM)抑制P-ERK活化和Src家族激酶(P-SFK)磷酸化。
图26.PCLX-001和达沙替尼处理在原代培养的T细胞中减弱TCR下游信号传导事件并诱导ER应激。用CD3/CD28抗体活化90％αb原代T细胞30分钟(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001和达沙替尼抑制P-酪氨酸磷酸化(PY99)、P-ERK活化、Src家族激酶(P-SFK)磷酸化。此外，PCLX-001显著降低Src和Lyn的蛋白水平并增加Bip蛋白含量(ER应激标志物)。
图27A-E.PCLX-001降低PBMC、B细胞和单核细胞的活力，但不降低T细胞的活力。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。使用流式细胞术检测细胞亚群的活力和丰度。PBMC的活力明显降低(A)。尽管药物处理没有改变CD4+和CD8+T细胞的频率(B和C)。然而，在PCLX-001处理96小时后，B细胞(D)和单核细胞CD14+(E)的数量显著减少。
图28A-D.PCLX-001降低T细胞中Lyn和HGAL的表达。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。通过流式细胞术使用细胞内染色检测T细胞亚群中Lyn和HGAL的表达。CD4+T细胞中Lyn(A)和HGAL(B)的表达均降低。此外，PCLX-001还降低了CD8+T细胞中Lyn(C)和HGAL(D)的表达。
图29A-D.PCLX-001降低单核细胞中Lyn和HGAL的表达，但不降低B细胞中的表达。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。通过流式细胞术使用细胞内染色检测B细胞和单核细胞亚群中Lyn和HGAL的表达。虽然PCLX-001不能降低B细胞中Lyn(A)和HGAL(B)的表达，但这两种蛋白标志物在单核细胞(C和D)中均显著降低。
图30A-E.PCLX-001诱导炎性细胞因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导炎性细胞因子IL-6(A)、TNF-α(B)、IL-8(C)、IFN-γ(D)和IL-17a(E)的产生。
图31A-D.PCLX-001诱导抗炎细胞因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导抗炎细胞因子IL-1RA(A)、IL-10(B)、IL-13(C)和IL-16(D)的产生。
图32A-D.PCLX-001诱导炎性趋化因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导炎性趋化因子MIP-1α(A)、MCP-2(B)、TARC(C)和GRO-α(D)的产生。
图33A-D.PCLX-001诱导炎性趋化因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导炎性趋化因子RATES(A)、MIP-1β(B)、MCP-4(C)和MDC(D)的产生。
图34A-C.PCLX-001诱导T辅助细胞2介导的趋化因子和GM-CSF的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX 001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(EveTechnologies Discovery assay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导粒细胞-单核细胞群体刺激因子I-309(A)、作为T辅助细胞2介导的趋化因子的嗜酸性粒细胞趋化因子-2(Eotaxin-2)(B)和GM-CSF(C)的产生。
图35A-D.NMT抑制剂(PCLX-001、PCLX-002、IMP-1088)减少促炎细胞因子的标准化分泌；IL-6(A)、IL-8(B)、TNF-α(C)和IFN-γ(D)。将T细胞与浓度渐增的NMT抑制剂一起孵育48小时，然后在药物存在下通过T细胞活化剂(STEMCELLS)再诱导2天。NMT抑制剂显著降低了IL-6、IL-8和IFN-γ的水平。(双因素方差分析，针对未处理的P值：*<0.05-0.01**<0.01-0.001***<0.001-0.0001。值得注意的是，在更有效的NMT抑制剂PCLX-001中细胞因子分泌的减少强于PCLX-002，并且在处理4天后细胞的存活率在未处理样品的10％以内。
图36A-D.NMT抑制剂(PCLX-001、PCLX-002、IMP-1088)减少抗炎细胞因子的标准化分泌；IL-4(A)、IL-5(B)、IL-10(C)和IL-13(D)。将T细胞与浓度渐增的NMT抑制剂一起孵育48小时，然后在药物存在下通过T细胞活化剂(STEMCELLS)再诱导2天。NMT抑制剂显著降低了IL-5、IL-10和IL-13的水平。(双因素方差分析，针对未处理的P值：*<0.05-0.01**<0.01-0.001***<0.001-0.0001。值得注意的是，在更有效的NMT抑制剂PCLX-001中细胞因子分泌的减少强于PCLX-002，并且在处理4天后细胞的存活率在未处理样品的10％以内。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，术语“包括”应理解为是指以下列表并非详尽无遗，可包括或不包括任何其他额外的合适项目，视情况而定包括例如一个或多个其他特征、组分和/或成分。
在本文描述的一个方面，我们在三个独立的筛选中测试了包括所有主要癌症类型的300种癌细胞系对PCLX-001的NMT抑制的敏感性。PCLX-001是NMT抑制剂DDD85646的口服生物可利用衍生物，对人类NMT更具选择性和效力(表1)38。我们证明PCLX-001在体外抑制血液癌细胞的活力和生长比抑制其他癌细胞类型或选择的正常细胞的活力和生长更有效。PCLX-001破坏几种B细胞淋巴瘤细胞系中早期BCR介导的存活信号传导，并促进许多豆蔻酰化和非豆蔻酰化的BCR效应因子的降解，从而引发细胞凋亡。更重要的是，PCLX 001在3个淋巴瘤鼠异种移植模型中的2个中产生剂量依赖性肿瘤消退和完全肿瘤消退。
表1.DDD85646(PCLX-002)和DDD86418(PCLX 001)NMT抑制剂的结构和基本比较。
Figure BDA0004188841030000221
Figure BDA0004188841030000231
IV＝静脉注射；PO＝口服；Cmax＝药物的峰值浓度；Tmax＝达到药物浓度峰值的时间；T1/2＝药物消除半衰期。
PCLX-001(也称为DDD86481)的结构如下。
Figure BDA0004188841030000241
DDD 85646(PCLX-002)的结构如下。
Figure BDA0004188841030000242
在本文所述的另一方面，PCLX-001可用作抗炎剂。
在本文所述的另一方面，PCLX-001可用作抗自身免疫剂。
在一个方面，提供了一种治疗患有癌症或疑似患有癌症的受试者的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。在具体实例中，癌症是淋巴瘤。在更具体的实例中，癌症是B细胞淋巴瘤。
在一个方面，提供了一种治疗患有炎症性疾病或病症或疑似患有炎症性疾病或病症的受试者的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。因此，在一些实例中，PCLX-001可用作抗炎剂。
在一个方面，提供了一种治疗患有自身免疫性疾病或病症或疑似患有自身免疫性疾病或病症的受试者的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。因此，在一些实例中，PCLX-001可用作抗自身免疫剂。
如本文所用，术语“癌症”是指由细胞异常、不受控制的生长引起的各种病况。能够引起癌症的细胞，称为“癌细胞”，具有特征性性质，例如不受控制的增殖、永生、转移潜力、快速生长和增殖速率，和/或某些典型的形态学特征。癌细胞可以是肿瘤的形式，但是这种细胞也可以单独存在于受试者体内，或者可以是非致瘤性癌细胞。可以用许多方法中的任何一种来检测癌症，包括但不限于检测一个或多个肿瘤的存在(例如，通过临床或放射方法)，检查肿瘤内或来自另一个生物样品(例如，来自组织活检)的细胞，测量指示癌症的血液标志物，以及检测指示癌症的基因型。然而，在一种或多种上述检测方法中的阴性结果不一定表明没有癌症，例如，对癌症治疗表现出完全反应的患者可能仍然患有癌症，如随后的复发所证明的。
应理解，通常，确定疾病的严重程度需要鉴定某些疾病特征，例如，癌症是转移前的还是转移性的，癌症的阶段和/或等级等。
分期是用于描述受试者中癌症进展程度的过程。在确定预后、计划治疗和评估这种治疗的结果时，分期可能是重要的。虽然不同类型的癌症可能需要使用不同的癌症分期系统，但大多数分期系统通常涉及描述癌症在解剖学上扩散的程度，并试图将具有相似预后和治疗的受试者放在同一分期组中。
用于大多数实体瘤、某些白血病和淋巴瘤的常见分期系统的实例是整体阶段分组系统和TMN系统。在整体阶段分组系统中，罗马数字I到IV用于表示癌症的四个阶段。通常，如果癌症仅在原发病灶区域可检测到，而没有扩散到任何淋巴结，则称为I期。II和III期癌症通常是局部晚期和/或已经扩散到局部淋巴结。例如，如果癌症是局部晚期，并且只扩散到最近的淋巴结，则称为II期。在III期，癌症是局部晚期，并且通常已经扩散到接近原发病灶部位的淋巴结。已经从原发肿瘤转移到身体的远处部分(例如肝脏、骨骼、大脑或其他部位)的癌症被称为IV期，即最晚期。因此，I期癌症通常是可治愈的小的局部癌症，而IV期癌症通常代表不可手术的或转移性癌症。与其他分期系统一样，给定阶段的预后和治疗通常取决于癌症的类型。对于一些癌症，分为四个预后组是不够的，并且整体分期被进一步分成亚组。相比之下，一些癌症可能具有少于4个阶段分组。
在所有可见肿瘤被根除后复发的癌症被称为复发性疾病，局部复发发生在原发肿瘤的位置，而远处复发代表远处转移。
分期系统的变化可取决于癌症的类型。再则，某些类型的癌症。个体癌症的分期系统可以用新的信息进行修改，随后，所得到的阶段可以改变特定癌症的预后和治疗。
癌症的“等级”可用于描述肿瘤与其同类型正常组织的相似程度。基于肿瘤的微观外观，病理学家根据诸如细胞形态、细胞组织和其他分化标志物的参数来鉴定肿瘤的等级。一般来说，肿瘤的等级与其生长速度或侵袭性相对应，通常将肿瘤从侵袭性最小(I级)到侵袭性最大(IV级)进行分类。
因此，等级越高，癌症的侵袭性越强，生长越快。关于肿瘤等级的信息对于计划治疗和预测预后是有用的。
在一些实例中，在淋巴瘤的情况下，1期指仅在一组淋巴结中的淋巴瘤。II期指两组或多组淋巴结受到影响，但它们都在隔膜之上或之下，都在胸部或者都在腹部。III期指两组或多组淋巴结在胸部和腹部都受到影响。IV期指淋巴瘤位于至少一个器官(例如骨髓、肝脏或肺)以及淋巴结中。可以将额外的名称添加到前述阶段。例如，“A”通常表示患者没有经历任何引起麻烦的症状。“B”表示患者出现了B症状(例如，发烧、盗汗、体重减轻)。X表示患者患有大块疾病(例如，尺寸大于10cm的大肿瘤)。E表示患者患有结外疾病(例如，淋巴结外的疾病)。
在具体实例中，癌症是淋巴瘤。
术语“淋巴瘤”通常指淋巴系统的恶性肿瘤，包括淋巴系统的癌症。淋巴瘤的两种主要类型是霍奇金病(HD或HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。异常细胞以聚集的形式出现，使淋巴结增大，在体内形成实体瘤，或者更罕见地(如白血病)在血液中循环。霍奇金病淋巴瘤，包括结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤；经典型霍奇金淋巴瘤；结节硬化型霍奇金淋巴瘤；富于淋巴细胞经典型霍奇金淋巴瘤；混合细胞型霍奇金淋巴瘤；淋巴细胞耗竭型霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤包括小淋巴细胞性NHL、滤泡性NHL；套细胞NHL；粘膜相关淋巴组织(MALT)NHL；弥漫性大细胞B细胞NHL；纵隔大B细胞NHL；前体T淋巴母细胞性NHL；皮肤T细胞NHL；T细胞和自然杀伤细胞NHL；成熟(外周)T细胞NHL；Burkitt淋巴瘤；蕈样肉芽肿；Sezary综合征；前体B淋巴母细胞淋巴瘤；B细胞小淋巴细胞淋巴瘤；淋巴浆细胞性淋巴瘤；脾边缘区B细胞淋巴瘤；结边缘区淋巴瘤；浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤；血管内大B细胞NHL；原发性渗出性淋巴瘤；母细胞性自然杀伤细胞淋巴瘤；肠病型T细胞淋巴瘤；肝脾γ-δT细胞淋巴瘤；皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤；和原发性系统性间变性大T/空细胞淋巴瘤(primary systemic anaplastic large T/null cell lymphoma)。
在具体实例中，淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
在一些实例中，本文所述的组合物和/或组合物(例如，PCLX-001)可用于治疗癌症发展和进展的各种阶段和等级。在一些实例中，PCLX-001可用于治疗早期癌症，包括早期瘤形成，其可以是小的、生长缓慢的、局部的和/或非侵袭性的，例如，旨在治愈疾病或引起癌症消退，以及用于治疗中期癌症和治疗末期癌症，包括晚期和/或转移性和/或侵袭性瘤形成，例如，以减缓疾病的进展、减少转移或增加患者的存活率。类似地，PCLX-001可用于治疗低等级癌症、中等级癌症和/或高等级癌症。
在一些实例中，预期PCLX-001可用于治疗惰性癌症、包括局部复发、远处复发和/或难治性癌症(即，对治疗无反应的癌症)在内的复发癌症、转移性癌症、局部晚期癌症和侵袭性癌症。
在一些实例中，PCLX-001可单独使用或与一种或多种治疗剂组合使用，所述治疗剂作为主要治疗或辅助治疗的一部分。“主要治疗”或“一线治疗”是指在受试者中癌症的初始诊断时进行的治疗。示例性的主要治疗可包括手术、多种化疗、免疫疗法和/或放射疗法。当一线或主要治疗不是全身化疗或免疫疗法时，那么后续的化疗或免疫疗法可能被认为是“一线全身治疗”。在一个实例中，PCLX-001可用于一线全身治疗。
术语“辅助治疗”是指在主要治疗之后进行的治疗，施用于有复发风险的受试者。辅助全身治疗通常在主要治疗后不久开始，以延迟复发、延长生存期或治愈受试者。难治性癌症的治疗可以称为“二线治疗”，并且是除一线治疗之外的本发明的预期用途。
如本文所用，术语“样品”是指来自受试者的任何样品，包括但不限于包含一种或多种细胞的流体、细胞或组织样品，可对其进行基因表达水平、蛋白质水平、酶活性水平等的测定。样品可以包括例如血液样品、分级血液样品、骨髓样品、活检、冷冻组织样品、新鲜组织样品、细胞样品和/或石蜡包埋切片、可以从中提取足够量和足够质量的RNA以允许测量相对mRNA水平的材料、或者可以从中提取足够量和足够质量的多肽以允许测量相对多肽水平的材料。
在本发明的一个实施方案中，该组合用于早期癌症的治疗。在另一个实施方案中，该组合用于早期癌症的一线全身治疗。
在替代实例中，PCLX-001可用于末期和/或晚期和/或转移性癌症的治疗。在另一个实施方案中，PCLX-001可作为用于治疗末期和/或晚期和/或转移性癌症的一线全身治疗来施用。
在具体实例中，PCLX-001可用于淋巴瘤的治疗。在更具体的实例中，PCLX-001可用于B细胞淋巴瘤的治疗。
如本文所示，PCLX-001抑制BCR，因此可用作抗炎剂，和/或可用作抗自身免疫剂。
术语“免疫细胞”通常包括在免疫反应中起作用的源自造血干细胞的任何细胞。该术语旨在包括先天或适应性免疫系统的免疫细胞。本文所指的免疫细胞可以是处于任何分化阶段(例如干细胞、祖细胞、成熟细胞)或任何活化阶段的白细胞。免疫细胞包括淋巴细胞(例如自然杀伤细胞、T细胞(包括例如胸腺细胞、Th或Tc；Th1、Th2、Thl7、
Figure BDA0004188841030000291
CD4+、CD8+、效应Th、记忆Th、调节Th、CD4+/CD8+胸腺细胞、CD4-/CD8-胸腺细胞、γδT细胞等)或B细胞(包括例如pro-B细胞、早期pro-B细胞、末期pro-B细胞、pre-B细胞、大pre-B细胞、小pre-B细胞、产生任何同种型抗体的未成熟或成熟B细胞、T1 B细胞、T2 B细胞、幼稚B细胞、GC B细胞、浆母细胞、记忆B细胞、浆细胞、滤泡B细胞、边缘区B细胞、B-l细胞、B-2细胞、调节B细胞等)，例如单核细胞(包括例如经典型、非经典型或中间单核细胞)、(分段或带状)嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、组织细胞、小胶质细胞，包括各种亚型、成熟、分化或活化阶段，例如造血干细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、成髓细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、成单核细胞、前单核细胞、成淋巴细胞、前淋巴细胞、小淋巴细胞、巨噬细胞(包括例如枯否细胞、星状巨噬细胞、Ml或M2巨噬细胞)、(髓样或淋巴样)树突细胞(包括例如朗格汉斯细胞、常规或髓样树突细胞、浆细胞样树突细胞、mDC-1、mDC-2、Mo-DC、HP-DC、隐匿细胞(veiled cell))、粒细胞、多形核细胞、抗原呈递细胞(APC)等。
术语“B细胞”是指适应性免疫系统的体液免疫中的一种淋巴细胞。B细胞的主要功能是制造抗体，充当抗原呈递细胞，释放细胞因子，并在经抗原相互作用活化后发育成记忆B细胞。B细胞与其他淋巴细胞(如T细胞)的区别在于细胞表面存在B细胞受体。
术语“T细胞”是指一种在胸腺中成熟的淋巴细胞。T细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且与其他淋巴细胞(如B细胞)的区别在于细胞表面存在T细胞受体。
B细胞受体(BCR)和BCR复合物B细胞是负责产生抗体的免疫系统细胞。B细胞对抗原的反应是正常免疫系统的重要组成部分。B细胞具有专门的细胞表面受体(B细胞受体；“BCR”)。如果B细胞遇到能够与该细胞的BCR结合的抗原，则B细胞将被刺激增殖并产生对结合的抗原具有特异性的抗体。为了产生对抗原的有效反应，还需要BCR相关蛋白和T细胞的辅助。
通过BCR进行的信号传导在抗体的产生、自身免疫和免疫耐受性的建立中起重要作用。
抗BCR复合物抗体在自身免疫、癌症、炎症性疾病和移植的治疗中具有治疗用途。
因此，如本文所示，PCLX-001抑制BCR，因此可用作抗炎剂，和/或可用作抗自身免疫剂。
如补充图16-18所示，PCLX-001抑制TCR，因此可用作抗炎剂，和/或可用作抗自身免疫剂。术语“T细胞受体”(TCR)是指在T细胞表面发现的异二聚体，包含α链和β链或γ链和δ链。T细胞受体识别与MHC分子相关的加工的抗原。
抑制T细胞受体(TCR)信号有望用于治疗广谱的人类T细胞介导的自身免疫性和炎症性疾病。
在其它实例中，NMT抑制剂可抑制BCR和TCR。
在其它实例中，DDD85646可用于抑制BCR和TCR。
在其它实例中，WO 2010/026365中描述的NMT抑制剂可用于抑制BCR和TCR，其全部内容通过引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“抑制”或“抑制剂”是指抑制蛋白质合成、水平、活性或功能的任何方法或技术，以及抑制目的蛋白质的合成、水平、活性或功能的诱导或刺激的方法。在一些实例中，该术语还指可以调节目的蛋白质的合成、水平、活性或功能的任何代谢或调节途径。该术语包括与其他分子结合和复合物形成。因此，术语“抑制剂”是指一种药剂或化合物，其应用导致蛋白质功能或蛋白质途径功能的抑制。然而，该术语并不意味着必须同时抑制这些功能中的每一个。
因此，在一些实例中，本文的化合物和组合物可用于治疗患有或疑似患有炎症性病症的受试者。在具体实例中，PCLX-001可用于治疗患有或疑似患有炎症性病症的受试者。因此，在一些实例中，PCLX-001可用作抗炎剂。
在其它实例中，DDD85646可用于治疗患有或疑似患有炎症性病症的受试者。因此，在一些实例中，DDD85646可用作抗炎剂。
在其它实例中，WO 2010/026365中描述的NMT抑制剂可用于治疗患有或疑似患有炎症性病症的受试者。因此，在一些实例中，WO 2010/026365中描述的NMT抑制剂可用作抗炎剂。
术语抗炎是指防止或减轻炎症的物质或治疗的性质。
如本文所用，术语“病症”和“疾病”可互换使用，指受试者的病况。特别地，术语“炎症性疾病”可与术语“炎症性病症”互换使用。
如本文所用，术语“炎症”、“炎症状态”或“炎症反应”表示个体的血管组织对有害刺激(如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应，包括细胞因子的分泌，更特别是促炎细胞因子，即主要由活化的免疫细胞如小胶质细胞产生并参与炎症反应放大的细胞因子。在一些实例中，炎症包括急性炎症和慢性炎症。
如本文所用，术语“急性炎症”表示一种短期过程，其特征在于由于血浆和白细胞对组织的浸润而导致的典型炎症体征(肿胀、发红、疼痛、发热和功能丧失)。只要有害刺激存在，急性炎症通常就会发生，一旦刺激被去除、分解或通过结疤(纤维化)隔离，急性炎症就会停止。
如本文所用，术语“慢性炎症”表示以并发的活动性炎症、组织破坏和修复尝试为特征的病况。慢性炎症的特征不是上面列出的急性炎症的典型体征。相反，慢性发炎组织的特征在于单核免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞)的浸润、组织破坏和愈合尝试，其包括血管生成和纤维化。
在一些实例中，所述炎症性病症为急性、粘连性、萎缩性、卡他性、慢性、硬变性、弥漫性、播散性、渗出性、纤维素性、纤维化、局灶性、肉芽肿性、增生性、肥大性、间质性、转移性、坏死性、闭塞性、实质性、可塑性、生产性、增殖性、伪膜性、脓性、硬化性、浆液纤维蛋白性、浆液性、单纯性、特异性、亚急性、化脓性、毒性、创伤性和/或溃疡性炎症。
在一些实例中，所述炎症性病症来自胃肠病症(例如消化性溃疡、区域性肠炎、憩室炎、胃肠出血、嗜酸性)、胃肠病症(例如嗜酸性食管炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎)、胃炎、腹泻、胃食管反流病(GORD或GERD)、炎症性肠病(IBD)(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞综合征、不确定性结肠炎)和炎症性肠综合征(IBS))。
在一些实例中，所述炎症性病症为选自胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、过敏性肺炎、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)和囊性纤维化的肺部病症。
因此，在一些实例中，本文的化合物和组合物可用于治疗患有或疑似患有自身免疫性疾病或病症的受试者。在具体实例中，PCLX-001可用于治疗患有或疑似患有自身免疫性疾病或病症的受试者。因此，在一些实例中，PCLX-001可用作抗自身免疫剂。
在其它实例中，DDD85646可用于治疗患有或疑似患有自身免疫性病症的受试者。因此，在一些实例中，DDD85646可用作抗自身免疫剂。
在其它实例中，WO 2010/026365中描述的NMT抑制剂可用于治疗患有或疑似患有自身免疫性病症的受试者。因此，在一些实例中，WO 2010/026365中描述的NMT抑制剂可用作抗自身免疫剂。
如本文所用，术语“病症”和“疾病”可互换使用，指受试者的病况。特别是，术语“自身免疫性疾病”可与术语“自身免疫性病症”互换使用。
如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指与自身抗体形成相关的任何疾病状态或病况，所述自身抗体与患者自身细胞反应形成抗原抗体复合物。术语“自身免疫性疾病”包括通常不由特定外部因素触发的病况，包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、自身免疫性甲状腺炎和自身免疫性溶血性贫血，以及由特定外部因素触发的那些病症，例如急性风湿热。
自身免疫性疾病的其它实例包括但不限于类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮和胰岛素依赖性糖尿病(1型)，据信为自身免疫性病况的实例。
自身免疫性疾病的其它实例包括但不限于胃炎、结肠炎和胰岛素依赖性自身免疫性糖尿病、移植物移植/排斥抑制、移植物抗宿主病。
如本文所用，术语“受试者”是指动物，可包括例如家养动物(如猫、狗等)、家畜(如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)、哺乳动物、非人哺乳动物、灵长类动物、非人灵长类动物、啮齿动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和任何其他动物。
在具体实例中，受试者为人类。
如本文所用，术语“治疗”是指获得有益的或期望的结果，包括临床结果。有益的或期望的临床结果可包括但不限于一种或多种症状或病况的缓解或改善、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即不恶化)、预防疾病的传播、延缓或减缓疾病的进展、疾病状态的改善或减轻、疾病复发的减少和缓解(无论是部分的还是全部的)，无论所述临床结果是否可检测到。“治疗”也可以指与如果不接受治疗的预期存活期相比，延长存活期。如本文所用，“治疗”也包括预防性治疗。例如，可以治疗患有早期癌症(例如早期淋巴瘤)的受试者以防止其发展，或者可以用本文所述的化合物或组合物治疗处于缓解期的受试者以防止其复发。
术语“预防”或是指预防和/或减缓目标病理状况或病症发展的防控性或预防性措施。因此，需要预防的受试者包括那些有患这种病症风险或易患这种病症的受试者。在某些实施方案中，如果患者与未接受本发明方法治疗的患者相比，暂时或永久地发展了例如较少或不太严重的与疾病或病症相关的症状，或较晚出现与疾病或病症相关的症状，则根据本文提供的方法成功预防了疾病或病症。
在一些实例中，治疗导致受试者疾病症状的预防或延迟发作或改善，或达到所需的生物学结果。
如本文所用，术语“诊断”是指分子和/或病理状态、疾病或病况的鉴定，例如淋巴瘤或其他类型癌症的鉴定。
如本文所用，术语“缓解”是指减少、减轻或消除病况、疾病、病症或表型，包括异常或症状。
在一些实例中，使用药学有效量的PCLX-001。在一些实例中，使用治疗有效量的PCLX-001。
如本文所用，术语“药学有效量”或“有效量”是指将引发组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的药物或药剂的量，所述反应是研究者或临床医生所寻求的。该量可以是“治疗有效量”。这些术语是指本文所述的化合物和/或组合物在单剂量或多剂量施用后治疗患有疾病或病症的受试者的量。作为本领域技术人员，通过使用已知的技术和通过观察在类似情况下获得的结果，主治诊断医师可以容易地确定有效量。在确定有效量、剂量时，主治诊断医师要考虑许多因素，包括但不限于：受试者的物种；其大小、年龄和一般健康状况；所涉及的特定病况、病症或疾病；病况、病症或疾病的程度或涉及程度或严重性，个体受试者的反应；施用的特定化合物；施用方式；施用的制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；伴随药物的使用；以及其他相关情况。
因此，如本文所用，术语“治疗有效量”是指在达到所需结果所需的剂量和时间段内的有效量。有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和/或体重等因素而变化。对应于该量的给定化合物或组合物的量将根据各种因素而变化，例如给定药物或化合物、药物制剂、施用途径、被治疗受试者的身份等，但尽管如此可由本领域技术人员常规确定。
如本文所用，术语“药学上可接受的”包括化合物、材料、组合物和/或剂型(如单位剂量)，其适用于与受试者的组织接触，而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相当。每种载体、赋形剂等在与制剂的其它成分相容的意义上也是“可接受的”。
术语“赋形剂”是指药理学上无活性的组分，如稀释剂、润滑剂、表面活性剂、载体等。用于制备药物组合物的赋形剂通常是安全无毒的，并且对于人类药物使用是可接受的。提及赋形剂时，包括一种和一种以上这样的赋形剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准药物载体，包括但不限于，磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(例如，油/水或水/油乳液)，以及各种类型的润湿剂、任何和所有溶剂、分散介质、包衣、十二烷基硫酸钠、等渗剂和吸收延迟剂、崩解剂(如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)、稳定剂和防腐剂等。
本发明的药物组合物可以以含有常规的无毒的药学上可接受的载体、佐剂和载体的剂量单位制剂口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或直肠施用。如本文所用，术语肠胃外包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、注射或输注技术。
所述药物组合物可为适于口服使用的形式，例如，作为片剂、锭剂(troche)、锭剂(lozenge)、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳化硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据药物组合物生产领域已知的方法制备，并且可以包含一种或多种选自由甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂组成的组的试剂，以提供药学上精美和可口的制剂。片剂含有与合适的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂包括例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知技术包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服使用的药物组合物也可以作为硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或作为软明胶胶囊提供，其中活性成分与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性悬浮液包含与合适的赋形剂混合的活性化合物，所述赋形剂包括，例如，悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或亚烷基氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(hepta-decaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖酸酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂或一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂(例如上面列出的那些)和/或调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂(例如抗坏血酸)来保存。
适于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性化合物。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上面已经提到的那些来举例说明。也可以存在额外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油(例如橄榄油或花生油)或者矿物油(例如液体石蜡)，或者可以是这些油的混合物。
合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂；或衍生自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯，酸酐，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可以含有甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂配制，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。这种制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和/或调味剂和着色剂。
药物组合物可为无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用如上述那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂包括但不限于水、林格氏液、乳酸林格氏液和等渗氯化钠溶液。其他实例是无菌的不挥发油，其通常用作溶剂或悬浮介质，以及各种温和的不挥发油，包括例如合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸也可用于注射剂的制备。
在一些实例中，治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物或组合物，且任选地由单次施用或应用组成，或替代地包含一系列施用或应用。
在一些实例中，制剂可方便地以单位剂型提供，并可通过制药领域中众所周知的任何方法制备。这些方法包括将活性化合物与载体结合的步骤，所述载体可以构成一种或多种辅助成分。一般来说，制剂是通过将活性化合物与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀而紧密地结合在一起，然后如果需要，将产品成型来制备的。
化合物和组合物可通过任何方便的施用途径向受试者施用，无论是全身/外周施用还是在所需作用部位施用，包括但不限于口服(例如，通过摄入)；局部(包括例如透皮、鼻内、眼睛、口腔和舌下)；肺部(例如，通过使用例如气雾剂的吸入或吹入疗法，例如通过口或鼻)；直肠；阴道；肠胃外，例如通过注射，包括皮下、肿瘤内、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过植入贮库/例如，皮下或肌内。
如本文所用，术语“接触”是指例如化合物可以经其递送至细胞的过程。化合物可以以多种方式施用，包括但不限于直接导入细胞(即细胞内)和/或细胞外导入腔、间隙或生物体的循环。
因此，在一些实例中，接触发生在体内。在其他实例中，接触可以发生在体外。
“细胞”是指单个细胞或细胞培养物。在一个实例中，细胞是从受试者获得或衍生的细胞。细胞的培养和合适的培养基是已知的。
适于口服施用(例如，通过摄入)的制剂可以作为离散单元提供，例如胶囊、扁形囊剂或片剂，各自含有预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒；作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳液或油包水液体乳液；作为丸剂；作为药糖剂；或者作为糊剂。
适于肠胃外施用(例如，通过注射，包括皮肤、皮下、肌内、静脉内和皮内)的制剂包括水性和非水性等渗的、无热原的、无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂，以及脂质体或其它微粒系统，其被设计成将化合物靶向血液组分或一个或多个器官。用于这种制剂的合适等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏液或乳酸林格氏注射液。
所述制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿和小瓶，并可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。制剂可以是脂质体或其他微粒系统的形式，其被设计成将活性化合物靶向血液组分或一个或多个器官。
本文所述的化合物和/或组合物可根据待治疗的病况同时(或基本上同时)或依次施用，并可与其他治疗联合施用。其他治疗可以同时(或基本上同时)或依次施用。
如本文所用，“治疗或剂量方案”是指在添加或不添加第二种药物的情况下，剂量、施用频率或治疗持续时间的组合。
化合物或组合物可单独施用或与其他治疗联合施用，可同时或相继施用，取决于待治疗的病况。
在治疗受试者时，可向受试者施用治疗有效量。
所述制剂可方便地以单位剂型提供，并可通过制药领域中众所周知的任何方法制备。这些方法包括将活性化合物与载体结合的步骤，所述载体可以构成一种或多种辅助成分。一般来说，制剂是通过将活性化合物与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀而紧密地结合在一起，然后如果需要，将产品成型来制备的。
如技术人员所知，本文公开的化合物和/或包含化合物的组合物可与标准治疗方案联合用于本文所述的方法中。
在一些实例中，可通过将具有所需纯度的化合物或组合物与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本文所述的化合物或组合物的治疗制剂，其为水溶液、冻干或其它干燥制剂的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TweenTM、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
所述治疗制剂还可根据所治疗的特定适应症的需要，包含一种以上的活性化合物，通常为具有互补活性且不会相互产生不利影响的活性化合物。适当地，这些分子以对预期目的有效的量组合提供。
技术人员将能够通过遵循标签上的说明来确定个体受试者的适当剂量。与本文所述的化合物或组合物联合或伴随施用的市售第二种治疗剂和其它化合物的制备和剂量方案可根据制造商的说明使用，或由熟练的从业者凭经验确定。
确定适当剂量时可考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用时间和频率、组合物的特定组分、反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。
本发明的方法通过以试剂盒的形式提供该方法中使用的化合物和/或组合物来方便地实施。这种试剂盒优选包含所述组合物。这种试剂盒优选包含其使用说明。
为了更好地理解本文所述的发明，阐述了以下实施例。应该理解，这些实施例仅用于说明目的。因此，它们不应该以任何方式限制本发明的范围。
实施例
摘要
豆蔻酰化，即用脂肪酸豆蔻酸酯对蛋白质进行的N-末端修饰，对于膜靶向和细胞信号传导至关重要。因为癌细胞通常具有增加的N-豆蔻酰基转移酶(NMT)表达，NMT被提出作为抗癌靶点。为了对此进行系统研究，我们进行了机器人癌细胞系筛选，并发现血液癌细胞系(包括B细胞淋巴瘤)对强效泛NMT抑制剂PCLX-001具有显著的敏感性。PCLX-001治疗影响淋巴瘤细胞蛋白的整体豆蔻酰化，并抑制对存活至关重要的早期B细胞受体(BCR)信号传导事件。除了消除Src家族激酶的豆蔻酰化，PCLX-001还促进它们的降解，并且出乎意料地促进许多非豆蔻酰化的BCR效应物(包括c-Myc、NFkB和P-ERK)的降解，导致体外和异种移植模型中的癌细胞死亡。因为一些接受治疗的淋巴瘤患者会复发和死亡，所以用NMT抑制剂靶向B细胞淋巴瘤可能为淋巴瘤提供了一种额外的非常需要的治疗选择。
结果
PCLX-001在体外选择性杀死血液癌细胞
为了研究NMT抑制在癌症中的治疗潜力，我们进行了三次独立的机器人筛选，以测量PCLX-001在各种癌细胞系中的生长抑制(GI)百分比。使用Horizon(St.Louis,MO)平台上的68个细胞系，我们显示PCLX-001抑制多种细胞系的生长(图1A)。然而，在包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤在内的血液(血)癌细胞中的GI显著高于其他癌细胞系类型(P<0.0001)(图1B)。使用101个细胞系OncolineTM(Oss，荷兰)筛选来总结这些结果(图1C、1D，P＝0.0001，图7)，并且在第三个筛选(Chempartner，上海，中国)中，131个癌细胞系暴露于PCLX-001 3天和6天(图9)。与源自实体瘤的细胞系(10μM，测试的最高剂量；P＝0.0038)相比，所述实体瘤包括乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)(图9A、9B)，PCLX-001处理3天后的中值IC50在血液癌细胞系中显著降低(0.166μM)。然而，到第6天，PCLX-001有效地杀死了几乎所有类型的测试癌细胞系(图9C、9D)。
为了证实使用筛选获得的数据，我们测试了PCLX-001处理对几种常见B细胞淋巴瘤细胞系的影响，包括BL细胞系BL2、Ramos和BJAB，DLBCL细胞系DOHH2、WSU-DLCL2和SU-DHL-10，以及作为对照的永生化B细胞IM9和VDS46。我们对这些细胞进行了三种类型的测定：1)CellTiter Blue测定，其读数依赖于增殖(总细胞数)和活力(活细胞百分比)来评估活细胞总数，2)钙黄绿素测定，其读数与增殖速率无关，因为它仅测量活细胞的百分比，以及3)细胞增殖测定，其简单地对随时间推移的细胞总数进行计数，而与它们的活力无关。恶性细胞系与PCLX-001的孵育在所有三种测定中以时间和浓度依赖性方式杀死这些细胞。此外，PCLX-001处理杀死恶性细胞系的浓度显著低于杀死良性IM9和VDS B细胞所需的浓度，这通过CellTiter Blue(所需的PCLX-001少4至111倍；图1E、1F)和钙黄绿素(所需的PCLX-001少2至40倍；图10)测定进行测量。与良性IM9和VDS B细胞相比，PCLX-001在抑制6种恶性B淋巴瘤细胞系的增殖和活力方面也更好(图1E-1H，图10和11)。为了说明这一点，我们显示用0.05和0.1μM PCLX-001处理恶性BL2细胞完全抑制了它们随时间的增殖，在这些浓度下对良性IM9细胞几乎没有影响(图1G、1H)。重要的是，新鲜分离的人淋巴细胞和外周血单核细胞(PBMC)的96小时PCLX-001处理仅轻微影响淋巴细胞存活率，而0.1μM PCLX-001导致PBMC存活率下降～50％(图12)。然而，存活的PBMC耐受高达10μM浓度的PCLX-001处理，该剂量比体外大多数血液癌细胞系的IC50(～0.050-0.100μM)大～100倍。在原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC；图12B)中观察到了相似的趋势。总之，这些数据表明PCLX-001处理以时间和浓度依赖的方式选择性地抑制多种癌细胞系的增殖和活力，并且在体外杀死恶性血液癌细胞方面特别有效。
豆蔻酰化抑制诱导淋巴瘤细胞凋亡
为了验证PCLX-001作用于靶标，我们使用所述的点击化学47来显现恶性BL2淋巴瘤细胞和良性IM9 B细胞中内源性蛋白质豆蔻酰化的抑制(图2A、2B)。PCLX-001以浓度依赖性方式抑制两种细胞系中的总蛋白质豆蔻酰化。然而，只需要～0.1μM的PCLX-001来降低BL2豆蔻酰化，而在IM9细胞中需要5倍于此量的PCLX-001(图2A、2B)。这表明恶性BL2细胞中的蛋白质豆蔻酰化过程可能在某种程度上对PCLX-001抑制更敏感。尽管PCLX-001(表1)38是DDD85646/IMP-366的密切相关的类似物，并且是最近验证的NMT抑制剂s系列的一部分38,39，我们进一步评估了它对棕榈酰化和磷酸化的作用。PCLX-001不抑制在COS-7细胞中表达的EGFP-N-Ras构建体的棕榈酰化(图13A)，也不在高达10μM的浓度下显著抑制预先配置的scanMAX KINOMEscanTM(Eurofins DiscoverX,San Diego，美国)的468种人激酶中的任何一种(图13B)。值得注意的是，在100μM的PCLX-001时仅发现了3个可能的阳性匹配记录，该浓度比PCLX-001对BL2细胞的EC50高～4000倍。因此，PCLX-001对细胞功能和活力的时间和浓度依赖性作用似乎是NMT特异性的。
我们接下来通过使用在COS-7细胞中表达的截短的Src-EGFP48构建体，通过点击化学47和荧光显微术监测Src蛋白酪氨酸激酶(一种已知的豆蔻酰化的蛋白质)的豆蔻酰化和定位来验证PCLX-001对NMT功能的抑制。PCLX-001分别在COS-7和IM9细胞中以浓度依赖性方式抑制WT-Src-EGFP构建体和内源性Src的豆蔻酰化(图2C、2D)。值得注意的是，豆蔻酰化抑制将COS-7细胞中的WT-Src-EGFP从原生质和内体膜重新定位到细胞质中，产生了与非豆蔻酰化的Gly2Ala-Src-EGFP突变体构建体48相当的分布模式(图2E)。抑制内源性Src豆蔻酰化还在用PCLX-001处理长达5天的BL2和IM9细胞中产生意想不到的Src蛋白水平的时间依赖性降低(图2F)，与IM9对照相比，这在恶性BL2细胞中加速(P＝0.0174；图14)。此外，PCLX-001处理选择性地诱导BL细胞系BL2和Ramos中的细胞凋亡，但不诱导永生化IM9 B细胞的凋亡，如通过PARP-1和半胱天冬酶-3裂解所测量的(图2G)，这与良性的永生化B细胞显示出较高的PCLX-001毒性阈值一致(图1E、1F，图10)。总之，这些数据表明，与导致选择性细胞死亡的正常永生化B细胞相比，PCLX-001优先消除恶性淋巴瘤细胞中的豆蔻酰化。
PCLX-001降低SFK水平和BCR下游信号传导
BCR信号传导在B细胞淋巴瘤中提供关键的存活信号，并且SFK(尤其是Lyn)在正常B细胞和淋巴瘤中启动BCR信号传导中起关键作用5,6,11,49,50。由于与良性IM9对照相比，PCLX-001处理优先降低恶性BL2细胞中的内源性Src蛋白水平(图2F)，我们试图确定是否可以在各种淋巴瘤细胞系中的其他SFK上观察到类似的效果。我们发现，与良性IM9和VDS对照相比，经PCLX-001处理的BL2、Ramos、BJAB、DOHH2、WSU-DLCL2和SU-DHL-10淋巴瘤细胞均表现出Src和Lyn SFK蛋白水平的更显著的剂量和时间依赖性降低(图3A)。为了研究蛋白酶体降解机制是否参与其中，在将PCLX-001加入BL2细胞24或48小时后，我们在收获和裂解细胞前用蛋白酶体抑制剂MG132处理BL2细胞6小时或不用蛋白酶体抑制剂MG132处理，并且不仅测量Src和Lyn SFK的残余蛋白水平，还测量造血细胞激酶(Hck)和淋巴细胞特异性激酶(Lck)SFK的残余蛋白水平，这两者也与淋巴瘤进展相关50。PCLX-001处理降低Hck和Lck蛋白水平的程度低于Src和Lyn的程度(图3B)。然而，与对照相比，向经PCLX-001处理的细胞中添加MG132导致4种SFK蛋白的部分或完全恢复，尤其是在24h时间点(图3B)。这表明非豆蔻酰化的SFK的降解可部分归因于泛素-蛋白酶体系统。通过监测Mcl-1水平，它是一种被蛋白酶体主动降解的蛋白质51，证实了MG132抑制蛋白酶体的功效(图3B)。
由于淋巴瘤细胞中抗原非依赖性基础BCR信号传导通常升高6,49，我们通过使用抗磷酸-酪氨酸(P-Tyr)抗体(PY99)监测上述细胞系中的内源性酪氨酸磷酸化水平，评估了PCLX-001处理对配体非依赖性BCR信号传导的影响。用PCLX-001处理24小时以浓度依赖性方式降低了所有受试细胞系中抗原非依赖性整体磷酸-酪氨酸水平(图15A)。此外，在用抗IgM进行BCR连接后，1μM PCLX-001消除了BL2细胞中几乎所有的配体依赖性BCR介导的磷酸-酪氨酸和泛磷酸-SFK水平(图3B)。虽然蛋白酶体抑制导致SFK的稳定，正如它们的蛋白水平增加所表明的，但它不能逆转PCLX-001对配体非依赖性酪氨酸磷酸化或BL2细胞中整体SFK磷酸化的影响(图3B)，这支持了已确立的观点，即非豆蔻酰化的SFK不再起作用，因为它们定位错误且不能磷酸化它们的底物。总之，这些结果表明SFK的豆蔻酰化对它们的活性和稳定性都是必需的，并且是淋巴瘤细胞中下游BCR信号传导所必需的。
PCLX-001有效抑制BCR存活信号传导组分
由于PCLX-001影响SFK蛋白水平和配体依赖性BCR介导的酪氨酸磷酸化，我们接下来使用两种临床批准的BCR信号传导抑制剂达沙替尼(一种广谱酪氨酸激酶抑制剂)和伊布替尼(一种BTK抑制剂)作为对照52，评估了其对其他BCR介导的信号传导中间体的影响。因为发现BL2细胞对抗人IgM BCR刺激最敏感(图15B)，所以选择这些细胞作为研究PCLX-001介导的对激活的BCR信号传导的影响的模型。用0.1或1.0μM PCLX-001处理的BL2细胞显示出抗IgM刺激的BCR介导的酪氨酸磷酸化(图4A，在图16中定量)的浓度依赖性部分消除(在24小时，图15B)和接近完全消除(在48小时)。用PCLX-001处理的BL2细胞中的酪氨酸磷酸化的总体减少比用相同浓度的达沙替尼或伊布替尼处理的BL2细胞更明显。PCLX-001处理还降低或消除了BL2细胞中总Lyn、活化的磷酸化的Lyn(Y396)的水平，以及总BTK和活化的磷酸化的BTK(Y223)的水平(图4A)。这些发现在其他几种淋巴瘤细胞系(图17)和其他几种SFK(包括Src、Lck、Hck和Fyn)以及BL2细胞中活化的泛磷酸-SFK中得到证实(图4A、图18)。如使用抗P-Lyn、抗P-SFK和抗P-BTK抗体所测量的，达沙替尼和伊布替尼选择性抑制它们各自的靶标(图4A)。
PCLX-001处理还介导其它豆蔻酰化的蛋白质水平的降低，包括BCR信号传导增强蛋白HGAL和Arf1 GTP酶，而达沙替尼和伊布替尼对这些蛋白中任一种的水平没有影响(图4B、4C)。值得注意的是，HGAL蛋白的损失比SFK和Arf1 GTP酶的损失快得多，并且HGAL蛋白水平的损失与磷酸化和活性形式的SYK的减少有关，正如预期的那样14,15(图4B)。由于经PCLX-001处理后，豆蔻酰化的HGAL和豆蔻酰化的小GTP酶Arf1的水平也减弱，因此PCLX-001促进豆蔻酰化的蛋白质降解的能力不限于豆蔻酰化的SFK(图4)。
BCR信号传导最终汇聚于参与B细胞增殖和存活的转录因子，包括磷酸-ERK(P-ERK)、NFκB、c-Myc和CREB4,5。因此，我们评估了PCLX-001、达沙替尼和伊布替尼在0.1和1.0μM下对BL2细胞作用48小时时对这些效应因子的影响。值得注意的是，这些处理导致PCLX-001作用48小时的细胞死亡少于25％，并且在任一使用浓度下达沙替尼和伊布替尼作用的细胞死亡少于5％(图6A和6C)。与BCR信号传导的损伤一致，PCLX-001以浓度依赖性方式降低P-ERK、NFκB、c-Myc和CREB的水平，在磷酸-ERK和NFKB水平中检测到统计学上显著的降低(P<0.05)(图4C，在图16中定量)。同样，这些作用在经PCLX-001处理的细胞中比用达沙替尼和伊布替尼处理的细胞更明显。这些发现，包括Src、Lyn、泛-P-SFK、ERK和P-ERK水平的降低，也在其他几种恶性淋巴瘤细胞系中观察到(图17)。我们还显示，PCLX-001处理比达沙替尼和伊布替尼处理增加了ER应激促细胞凋亡标志物Bip的水平，导致细胞凋亡总体增加，如通过半胱天冬酶裂解的PARP1所测量的(图4C)。因此，PCLX-001促进蛋白质降解的能力不限于其对豆蔻酰化的蛋白质如SFK、HGAL和Arf1的作用，还包括对BCR下游的非豆蔻酰化的蛋白质如磷酸-ERK和NFKB信号传导的作用。
BCR信号传导中的早期事件也在胞质溶胶中磷脂酶Cγ的活化和钙动员中达到顶点。我们使用荧光比率法Fura-2 Ca++-螯合剂测定53证明了PCLX-001(1μM)处理BL2细胞48小时有效地抑制了抗IgM BCR诱导的来自细胞内储备的钙动员(图19)。除了显著降低钙释放峰的强度外，与达沙替尼处理相似，PCLX-001延迟了钙释放过程。总的来说，PCLX-001比相同浓度下使用的达沙替尼和伊布替尼更能抑制钙动员。值得注意的是，用PCLX-001对BL2细胞延长处理48小时干扰了钙稳态，并导致胞质钙的基础水平增加(图19)，这可能有助于ER钙耗竭和细胞凋亡。总之，我们的数据表明PCLX-001处理有效地削弱了BCR介导的促存活信号传导并诱导淋巴瘤细胞凋亡(图5)。
由于PCLX-001、达沙替尼和伊布替尼的效力不同，并对下游BCR信号传导产生不同影响，我们接下来比较了这些药物对上述测试的淋巴瘤细胞系的总体活力的影响。在处理48和96小时后，达沙替尼和伊布替尼处理对BL2(实线)和IM9(虚线)细胞具有最小的影响，而PCLX-001杀死恶性BL2细胞(实线)的浓度显著低于杀死良性IM9对照(虚线)所需的浓度(图6A、6B)。在除SU-DHL-10之外的所有其他细胞系中观察到类似的细胞活力趋势，该SU-DHL-10对PCLX-001和达沙替尼同样敏感(图6C、6D)。重要的是，浓度为0.1和1.0μM的达沙替尼或伊布替尼与浓度为0.01、0.1和1.0μM的PCLX-001的组合处理没有进一步降低活力，这表明PCLX-001效应是在达沙替尼和伊布替尼靶标的上游介导的(图20)。总之，与达沙替尼和伊布替尼相比，PCLX-001在48小时和96小时对恶性淋巴瘤细胞系具有最广谱的效力，并且在使良性的永生化IM9和VDS B细胞对照不受伤害方面更好，表现出更高的选择性和优于两种临床批准药物的体外治疗窗。
血液癌细胞中NMT的表达被改变
虽然我们仍然不知道为什么血液癌细胞比其他癌细胞类型更易受PCLX-001影响，但我们认为这可能与血液癌细胞中NMT1或NMT2表达的改变有关。为了证实这种可能性，我们对来自癌细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia)54的基因表达数据进行了计算机分析。我们首先发现，在所有细胞系中，平均而言，NMT1转录物的数量约为NMT2转录物的数量的八倍(23)，其次，与其他类型的癌细胞系相比，在许多血液癌细胞系中，NMT2异源表达但显著减少(图22A、22B)。NMT1的表达在所研究的1269个细胞系中相对恒定，在乳腺癌和白血病癌细胞系中的表达轻微但显著降低，而NMT2的表达在各种癌症之间以及同样在给定的癌症类型中显著变化(图22C、22D)。数据还说明，虽然NMT2在CNS、肾和成纤维细胞来源的癌细胞系中的表达较高，但在血液癌症如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中NMT2的表达选择性地显著降低(图22D)。有趣的是，在淋巴瘤、白血病和其他细胞系中观察到的低NMT2表达水平没有被NMT1表达的增加所补偿(图22E)。总之，我们发现血液癌细胞系中NMT2的表达减少，这可能是它们对PCLX-001敏感性增加的原因。
PCLX-001治疗在体内具有有效的抗肿瘤活性
基于淋巴瘤细胞对体外NMT抑制的敏感性，我们研究了PCLX-001是否可以在两种鼠淋巴瘤细胞系衍生的皮下肿瘤异种移植模型中减缓体内肿瘤进展，并使用多柔比星作为临床批准的药物参考。在携带DOHH2肿瘤的小鼠中，当每天施用20mg/kg或每隔一天施用50mg/kg时，PCLX-001显示出显著的杀肿瘤作用(P<0.001)(图7A)。在每天50mg/kg的剂量下，到第7天，PCLX-001将肿瘤大小减少了高达70％(第7天的平均肿瘤大小＝44.0±8.1mm3)，但是这伴随着显著的体重减轻，需要中断5天治疗(图21A)。恢复治疗后，在第16天观察到95％的平均肿瘤生长抑制(TGI)。相比之下，多柔比星治疗导致57％的TGI，体重降低高达8％(图21A)。重要的是，用PCLX-001治疗在任何剂量下都不会增加死亡率(图21B)。
在携带BL2异种移植物的小鼠中，PCLX-001在20mg/kg每日剂量下显示部分TGI，在第9天达到42.5％肿瘤消退(P＝0.016)(图7B)。此外，当施用13天时，50或60mg/kg每日剂量的PCLX-001分别在9只存活小鼠中的9只和7只存活小鼠中的7只中引起100％的肿瘤消退。该异种移植模型的Kaplan-Meier存活分析还显示，与未治疗的载体对照相比，20-50mg/kg/天的PCLX-001剂量延长了携带BL2肿瘤的小鼠的存活期(图21D、21E)。相比之下，多柔比星对BL2肿瘤生长没有影响(图7B)，并且由于副作用，治疗在第11天终止(图21C)。在治疗结束时，我们测量了BL2肿瘤裂解物中的NMT活性21，发现其以PCLX-001浓度依赖的方式降低(P＝0.03；图7C)，表明PCLX-001在体内作用于靶标。
由于细胞系衍生的异种移植物缺乏人类肿瘤的复杂性，我们解剖并繁殖了源自患者DLBCL3的DLBCL淋巴瘤，以在NODscid小鼠中建立源自患者的异种移植模型，该患者的癌症对包括CHOP、RICE、鞘内甲氨蝶呤/阿糖胞苷和DHAP(表2)在内的多种化疗路线来说是难治的。在每组8只小鼠中评估治疗。20mg/kg皮下每日剂量的PCLX-001治疗持续21天，产生66％的TGI(P<0.001；图7D)。然后在另一组小鼠中将该剂量增加至每天50mg/kg，持续两个9天的周期，中间间隔3天的治疗中断，以使小鼠从～15％的体重损失中恢复(图21F)。在这种较高剂量方案之后，PCLX-001施用导致7只存活小鼠中的6只在第13天肿瘤完全消退(图7D)，其中一只未检测到肿瘤的小鼠在第11天死亡(图21G)。从载体对照和经PCLX-001治疗的小鼠中手术切除的肿瘤证实了在21天的PCLX-001治疗后的整体肿瘤尺寸的浓度依赖性减少(图7E)，伴随着细胞凋亡的增加(裂解的半胱天冬酶-3增加；图7F)和细胞增殖的减少(如通过Ki-67分析确定的；图7G)。因此，PCLX-001治疗以剂量特异性的方式在体内诱导患者来源的淋巴瘤肿瘤中的细胞凋亡和细胞周期停滞。由于在实验的前7天内大多数携带肿瘤的小鼠出现了严重的药物毒性和死亡，因此无法评估多柔比星治疗的效果。
表2.病鼠来源的肿瘤异种移植研究中使用的肿瘤和患者DLBCL3的描述。
Figure BDA0004188841030000481
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Figure BDA0004188841030000491
小鼠耐受有效剂量水平的PCLX-001
小鼠耐受有效剂量的PCLX-001，无特定的终末器官毒性。用PCLX-001治疗的所有小鼠在第一次异种移植研究中存活(图7A)，而用较高剂量水平的PCLX-001治疗的一些小鼠在另外两次研究中死亡(图7B、7D)。临床病理学和解剖病理学评估均未确定死亡原因。在两项研究中发现了毒性。在三只携带BL2异种移植物的小鼠中，每天施用50mg/kg的PCLX-001并进行短时间的治疗暂缓，在施用期结束时，所有小鼠的嗜中性粒细胞和淋巴细胞计数均低于正常值，并且一只小鼠的单核细胞和血小板计数也低于正常值。在携带DLBCL淋巴细胞异种移植物并每日施用20、50或60mg/kg的PCLX-001的小鼠中，在所有剂量水平下，大多数小鼠都出现了健康不良的迹象(例如，粗糙和邋遢的皮毛；立毛)，在每日50和60mg/kg下出现了脱水和体重减轻(表3-8)。
表3.PCLX-001和多柔比星治疗对DOHH2 NODscid小鼠异种移植模型中血清化学值的影响(补充注释1)。按治疗组对测量值进行平均(n＝3)。计算平均值的标准误差(SEM)。
Figure BDA0004188841030000492
Figure BDA0004188841030000501
表4.PCLX-001和多柔比星治疗对DOHH2 NODscid小鼠异种移植模型中血液学值的影响(补充注释1)。
Figure BDA0004188841030000502
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Figure BDA0004188841030000511
Figure BDA0004188841030000521
DOHH-2NODscid异种移植物的毒理学总结(Charles River)
设计：使用下表所示的剂量水平和剂量方案，对一组小鼠施用载体，对四组小鼠施用PCLX-001。
Figure BDA0004188841030000522
每天观察小鼠的毒性临床体征和对体重的影响。最后一个剂量后，对三只小鼠/组实施安乐死并进行尸检。在安乐死时，抽取血液样本进行血液学分析，并测量AST和CK活性以及胆红素和肌酐浓度。尸检时，取股骨、双肾、肝脏、小肠和注射部位的样本并固定。病理学家Wei-feng Dong博士对这些标本进行了处理和显微镜检查。
结果：与PCLX-001潜在相关的唯一不良发现出现在施用50mg/kg的PCLX-001的组中(第5组和第6组)。隔天使用PCLX-001，所有三只小鼠的RBC计数均低于正常值，其中一只小鼠的网织红细胞和血小板计数高于正常值。每天使用PCLX-001，所有三只小鼠的嗜中性粒细胞和单核细胞计数均低于正常值，其中一只小鼠的单核细胞和血小板计数低于正常值。在这些小鼠的任何一只的股骨骨髓中没有组织病理学发现。
这些数据总结在下表中。
Figure BDA0004188841030000531
在施用期结束时，每组(包括载体对照组)中一只或多只小鼠的血清AST和CK活性高于正常值。
补充讨论/结论：由于控制小鼠所需的操作(例如，测量肿瘤大小)，小鼠遭受一些肌肉损伤(擦伤)或肝脏损伤并不罕见，这可能导致血清AST和/或CK活性增加。以50mg/kg施用PCLX-001的小鼠的血液学结果相对较轻，可能反映了造血毒性，这一结果在以高剂量施用PCLX-001的大鼠和狗中已经观察到55。
表5.PCLX-001和多柔比星治疗对BL2 NODscid小鼠异种移植模型中平均器官重量的影响(补充注释2)。按治疗组对测量值进行平均(n＝2)。
Figure BDA0004188841030000532
Figure BDA0004188841030000541
表6.PCLX-001和多柔比星治疗对BL2 NODscid小鼠异种移植模型中血清化学值的影响(补充注释2)。按治疗组对测量值进行平均(n＝3)。计算平均值的标准误差(SEM)。
Figure BDA0004188841030000542
表7.PCLX-001和多柔比星治疗对BL2 NODscid小鼠异种移植模型中血液学值的影响(补充注释2)。按治疗组对测量值进行平均(n＝3)。计算平均值的标准误差(SEM)。[正常范围]；蓝色代表低，黑色代表正常范围，红色代表高。
Figure BDA0004188841030000543
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Figure BDA0004188841030000551
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Figure BDA0004188841030000561
BL2 NODscid异种移植物的毒理学总结(Jackson Lab，JAX)
设计：使用下表所示的剂量水平和剂量方案，对一组小鼠施用载体，对三组小鼠施用PCLX-001。
Figure BDA0004188841030000562
Figure BDA0004188841030000571
收集的数据与Charles River异种移植研究中的数据相同-临床体征、体重、肿瘤体积、来自3只小鼠/组的用于血液学和临床化学(ALT、AST、BUN、肌酐、CK)的血液样本以及从相同的3只小鼠收集和固定的组织样本。肝脏、肾脏和小肠也被称重。
结果：可能与PCLX-001相关的不良发现为：
在施用PCLX-001的组中的大多数小鼠中出现健康不良的迹象(例如，粗糙和邋遢的皮毛、立毛)。50或60mg/kg/天时比20mg/kg/天时更早出现这些症状。
以50或60mg/kg/天施用PCLX-001的组中的脱水和体重减轻。体重减轻似乎在大约一周后停止，尽管继续施用，之后小鼠开始体重增加。
讨论/结论：没有与PCLX-001相关的临床病理学或解剖病理学发现。PCLX-001为20mg/kg/天时，嗜中性粒细胞计数有升高的趋势，而RBC计数有降低的趋势；然而，这与剂量水平无关，因此很可能是偶然的。在第1组(对照)和第4组中各有一只小鼠观察到较高的平均CK(以及在较低程度上，AST和ALT)活性。这种酶活性增加的模式强烈表明骨骼肌损伤，这与PCLX-001无关。
表8.PCLX-001和多柔比星治疗对DLBCL NODscid患病小鼠来源的异种移植模型中血液学值的影响(补充注释3)。按治疗组对测量值进行平均(n＝3)。计算平均值的标准误差(SEM)。[正常范围]；蓝色代表低，黑色代表正常范围，红色代表高。
Figure BDA0004188841030000572
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Figure BDA0004188841030000581
DLBCL3患者来源的NODscid小鼠异种移植物的毒理学总结
设计：使用下表所示的剂量水平和剂量方案，对一组小鼠施用载体，对两组小鼠施用PCLX-001。
组号 组名 剂量水平(mg/kg) 方案
1 盐水对照 0 持续21天每天施用
3 低剂量PCLX-001 20 持续21天每天施用
5 高剂量PCLX-001 50 持续21天每天施用
收集的数据与前两项研究中的数据相同-临床体征、体重、肿瘤体积、来自3只小鼠/组的用于血液学和临床化学(AST、CK、胆红素、肌酐)的血液样本以及从相同的3只小鼠收集和固定的组织样本。
结果：没有与PCLX-001相关的毒性临床体征、对临床病理学参数的影响或解剖病理学发现。
讨论/结论：不存在不利影响有些令人惊讶，因为在使用DoHH-2细胞的研究中，50mg/kg/天时似乎对血液学参数有影响。为什么这里会有不同还不知道。尚不清楚为什么小鼠在本研究中持续3周耐受50mg/kg的每日剂量，但并非在所有研究中如此。包括NODscid克隆、食物类型或微生物群在内的差异可能解释了这一点。
表9.本研究中使用的细胞系列表
Figure BDA0004188841030000591
Figure BDA0004188841030000601
进行并报告了大鼠和狗中的剂量范围毒理学研究55，在这些物种中的正式GLP毒理学研究接近完成，为人类临床试验的监管审查做准备。
总之，我们的结果表明，PCLX-001治疗抑制体内淋巴瘤的生长，包括对其他临床批准的治疗难以治愈的疾病的完全消退，从而确立了真正的NMT抑制剂(如PCLX-001)在癌症中的用途。
讨论
在本文中，我们报告了血液癌细胞，特别是B细胞淋巴瘤，对新型泛NMT抑制剂PCLX-001的豆蔻酰化抑制高度敏感的发现。虽然已经提出了用NMT抑制剂杀死癌细胞的概念，并在小规模上进行了测试39,43,56,57,58,59，但据我们所知，这项工作代表了对这种方法在数百种癌细胞系中的效力范围的原始研究。我们证明，癌细胞可以被浓度低于杀死和抑制永生化细胞和正常细胞增殖所需浓度的NMT抑制剂选择性杀死(图1E-1H、图10和11)。在没有对更普通的细胞类型进行额外的细胞毒性测定的情况下，基于该治疗指征的获益/风险，一些正常组织(例如包括PBMC在内的血细胞)在有效剂量下受到影响是可以接受的，而且并不罕见。这表明了有足够大的治疗窗口，其对于支持PCLX-001作为潜在的癌症治疗方法的发展是至关重要的。除了抑制B淋巴瘤细胞中大量豆蔻酰化的蛋白质的豆蔻酰化(图2A、2B)之外，我们还证明PCLX-001在抑制BCR信号传导方面特别有效，BCR信号传导是这些细胞中主要的淋巴瘤促存活途径4,5,6,7,8。此外，PCLX-001BCR信号传导抑制优于临床批准的SFK抑制剂达沙替尼和BTK抑制剂伊布替尼。这可以部分解释为什么PCLX-001在体外对恶性淋巴瘤细胞系也具有最广谱的效力。我们还显示PCLX-001抑制SFK、HGAL和Arf1的豆蔻酰化，并增加它们的降解速率，但也出乎意料地促进非豆蔻酰化的促存活BCR介质的降解，包括P-ERK、NFκB、c-Myc、CREB，甚至可能BTK(图4A)。经PCLX-001处理的细胞在具有细胞毒性的浓度下仍然保持至少75％的活力。尚不清楚较低的下游信号传导蛋白水平是否对应于死亡细胞中基因转录的减少或蛋白质降解的增加。此外，PCLX-001还减少了BCR介导的钙动员，从而选择性地导致B细胞淋巴瘤细胞的细胞凋亡(图5)。将豆蔻酰化的丧失与钙稳态中的改变和BCR介导的钙释放的抑制联系起来的机制是未知的。
ER应激增加是一种促细胞凋亡现象，先前在用另一种NMT抑制剂处理的细胞中显示59。我们假设Arf1 GTP酶豆蔻酰化的抑制，无论是在其N-末端甘氨酸残基还是附近的赖氨酸残基36,37，都会干扰其膜靶向并损害囊泡运输，从而不利地影响慢性/强直性或抗原依赖性BCR信号传导。ER中正确Arf1功能的丧失也可以部分解释PCLX-001处理后ER应激标志物Bip60的增加(图4C)。
经PCLX-001处理的细胞中脂筏定位的豆蔻酰化Lyn(和其它SFK)和HGAL蛋白的损失进一步突出了这些膜结构域在适当的BCR信号传导中的重要性9,10,12,13,14,15(图5)。此外，PCLX-001介导的SFK的豆蔻酰化抑制不仅消除了它们的膜靶向性，而且通过泛素-蛋白酶体系统促进了它们的降解，因为MG132处理导致SFK水平几乎完全恢复(图3B)。虽然E3泛素连接酶的Casitas B谱系淋巴瘤(Cbl)家族61,62的蛋白酪氨酸激酶的泛素化和降解是B细胞中信号衰减的正常部分，但N-末端甘氨酸残基最近也被证明是蛋白质的不稳定因素，代表了一类高选择性的新N-降解决定子(N-degron)63。事实上，在他们的报告中，Timms等人(2019)证明了包括Lyn、Fyn和Yes在内的暴露其N-末端甘氨酸残基的未豆蔻酰化的蛋白质被N-末端甘氨酸特异性Cullin RING连接酶2(CRL2)-ZYG11B/ZER1 N-降解决定子-泛素-蛋白酶体系统选择性降解63。该系统对具有N-末端甘氨酸残基的蛋白质具有高度选择性，因为用甘氨酸替代任何其他氨基酸都会导致所得蛋白质的基本稳定63。因此，这种新描述的N-降解决定子系统63,64可能有助于在用PCLX-001处理的恶性淋巴瘤细胞系中发现的非豆蔻酰化蛋白质如SFK、HGAL和Arf1的更快降解(图4)。这也可以部分解释为什么不可豆蔻酰化的Gly2Ala-Src酪氨酸激酶突变体和Gly2Ala HGAL先前被证明比它们的豆蔻酰化的对应蛋白更稳定65,66，因为人工N-末端丙氨酸(Ala)残基会阻止甘氨酸(Gly)残基特异性CRL2-ZYG11B或CRL2-ZER1 N-降解决定子对降解的促进。因此，我们提出了PCLX-001在B细胞淋巴瘤中的作用模式模型，其中通过泛素-蛋白酶体系统抑制SFK(或其他蛋白，包括HGAL和Arf1)的豆蔻酰化不仅导致膜靶向性的丧失，还导致其蛋白水平以及由此而来功能的丧失(图3B)，从而抑制BCR信号的传播(图5)。有趣的是，发现NMT1被Lyn、Fyn和Lck SFK磷酸化，并且NMT1的磷酸化对于豆蔻酰化活性是必需的，因为不可磷酸化的Y100F-NMT1突变体失去了98％的催化活性67。因此，PCLX-001介导的SFK的丧失可以进一步降低B淋巴瘤细胞中NMT1的活性，从而加强促存活信号的丧失和细胞凋亡。
除了依赖于豆蔻酰化的SFK、HGAL和Arf1蛋白的作用外，鉴于存在数百种已知的豆蔻酰化的蛋白质，PCLX-001介导的对淋巴瘤细胞活力的作用也可能通过其他豆蔻酰化的蛋白质的功能性丧失而发生。虽然我们仍然不知道为什么血液癌细胞比其他癌细胞类型更易受PCLX-001的影响，但我们认为这可能与NMT1或NMT2的表达改变有关。对CCLE NMT1或NMT2表达数据的分析(图22)揭示，除了在一些癌症中过度表达(也称为当前教条)，NMT表达水平实际上在其他癌症中较低，其中许多癌症是血液来源的。总之，这些观察结果表明，血液癌细胞中NMT酶靶标数量的减少与这些细胞对PCLX-001的敏感性之间可能存在联系。尚不清楚改变的NMT水平是否单独影响血液癌细胞的敏感性，或者是否可能与血液癌细胞的个体豆蔻酰化蛋白质组的变种联合作用，以及这些细胞对各种豆蔻酰化蛋白质的细胞特异性生存依赖。虽然我们实验室目前正在进一步研究这些可能性，但NMT活性对淋巴瘤细胞存活的潜在重要性在全基因组Cas9-Crispr筛选中得到证实，其中NMT1是淋巴瘤细胞系中最关键的存活因子之一68。此外，我们的癌细胞系筛选结果表明PCLX-001在治疗白血病和骨髓瘤以及某些实体瘤(如乳腺癌和肺癌)方面具有更广泛的应用潜力。
虽然PCLX-001在20mpk的耐受剂量下仅在最低程度上有效[～66％的肿瘤减少(图7)]，但我们发现，在50mpk有效剂量下，其可有效抑制体内肿瘤细胞生长，导致三种人类淋巴瘤异种移植模型中疾病的主要或完全消退，包括对CHOP、利妥昔单抗和其他补救疗法难以治愈的淋巴瘤的完全反应。
结论
我们确定，小分子NMT抑制剂PCLX-001可有效且选择性地抑制体外培养的广谱癌细胞的生长，由于BCR介导的信号传导事件(其促存活信号的主要来源)的丧失，对源自血液癌症(包括B细胞淋巴瘤)的细胞具有特别显著的效果4,5,6,7,8。连同PCLX-001在体内B细胞淋巴瘤的临床前模型中的显著功效，这些发现支持PCLX-001和相关NMT抑制剂作为B细胞淋巴瘤和可能的其他癌症的疗法的正在进行的开发和潜在的临床试验。
方法
兔抗PARP-1(1:5000，亲和纯化的多克隆#EU2005，第1批)、抗GAPDH(1:5000，亲和纯化的多克隆，#EU1000，第1批)和抗GFP(1:10000，亲和纯化的，#EU1，批号B3-1)来自实验室库存，并可通过Eusera(www.eusera.com)获得。我们的亲和纯化的兔抗GFP也可以从Abcam(Cambridge,MA)以Ab6556获得。兔单克隆抗Src(1:2000，克隆32G6，#2123，第5批)、Lyn(1:2000，克隆C13F9，#2796，第4批)、P-Lyn Y507(1:5000，多克隆，#2731，第5批)、Fyn(1:2000，多克隆，#4023，第3批)、Lck(1:2000，克隆D88，#2984，第4批)、Hck(1:2000，克隆E1I7F，#14643，第1批)、c-Myc(1:10000，克隆D3N8F，#13987，第5批)、ERK(1:2000，克隆4695，#9102，第27批)、P-ERK(1:5000，克隆3510，#9101，第30批)、P-SFK(1:10000，克隆D49G4，#6943，第4批)、BTK(1:2000，克隆D3H5，#8547，第13批)、P-BTK Y223(1:5000，克隆D9T6H，#87141，第1批)、SYK(1:2000，克隆D3Z1E，#13198，第5批)、P-SYK Y525/526(1:5000，克隆C87C1，第18批)和抗裂解半胱天冬酶-3(1:1000，克隆5A1E，#9664，第20批)从CellSignaling Technologies购买。兔单克隆抗BIP(1:2000，多克隆，ADI-SPA-826)从EnzoLife Sciences购买。兔抗Mcl-1(1:2000，克隆Y37，#32087，批号GR119342-5)、NFKB(1:2000，克隆E379，#32536，批号GR3199609-2)、P-Lyn Y396(1:5000，多克隆，#226778，批号GR3195652-5)从Abcam(Cambridge,MA)购买。小鼠单克隆抗p-Tyr(1:10000，PY99，sc-7020，批号I2118)抗体从Santa Cruz Biotechnology购买。小鼠抗人HGAL(1:10000，克隆1H1-A7，#14-9758-82，批号E24839-101)从eBioscience购买。兔多克隆抗ARF-1抗体(1:2000，多克隆，#PA1-127，批号TK 279638)从ThermoFisher Scientific购买。增强型化学发光(ECL)Prime Western印迹检测试剂盒从GE Healthcare购买。Clarity ECL Western印迹底物来自Bio-Rad。山羊抗人IgM(μ链)(70-8028-M002，批号S728028002001)从Tonbo biosciences购买。山羊F(ab’)2抗人IgM从BioRad(STAR146，批号152684)购买。来自Sigma-Aldrich的兔抗人Src抗体(多克隆，Ab-529，批号871521168)用于免疫沉淀。盐酸多柔比星来自Pfizer。达沙替尼和伊布替尼来自ApexBio Technology。PCLX-001被David Gray博士和Paul Wyatt博士(University of Dundee,Scotland,英国)鉴定为DDD 8648138,69。除非另有说明，所有化学品均为最高纯度，从Sigma-Aldrich购买。
细胞培养
IM9、Ramos、SU-DHL-10和COS-7从ATCC购买。BL2、DOHH2、WSU-DLCL2和BJAB从DSMZ(德国)购买。Ramos和BL2是Alberta大学的Jim Stone博士和Robert Ingham博士赠送的。Tosato G等人(参考文献47)描述了VDS分离。VDS、BJAB和SU-DHL-10是British Columbia大学的Michael Gold博士赠送的。HUVEC细胞(从多达4根脐带收集)从PromoCell购买。在遗传分析机构(Genetic Analysis Facility)、应用基因组学中心(The Centre for AppliedGenomics)、病童医院、Peter Gilgan研究和学习中心(Peter Gilgan Centre forResearch and Learning)，686Bay St.，多伦多，ON，加拿大M5G 0A4(www.tcag.ca)，通过STR图谱分析来确认所有细胞系的身份。使用MycoAlert Plus支原体检测试剂盒(Lonza，ME，美国)定期检测细胞系的支原体污染。所有细胞系的支原体污染检测均为阴性。将所有细胞系维持在补充有5-10％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的RPMI或DMEM培养基中。HUVEC细胞(从多达4条脐带收集)从PromoCell购买，在含有胰岛素样生长因子(长R3 IGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的内皮细胞生长培养基中培养，并维持在低于7的传代次数。所有细胞系都在37℃和5％ CO2下在湿化培养箱中维持，并常规检查污染支原体的存在。细胞系名称、类型和组织学见补充表3。对于转染，粘附细胞COS-7细胞使用X-tremeGENE9 DNA(Roche)转染试剂根据制造商的说明进行转染。对于BCR活化实验，将细胞与25μg/ml的山羊F(ab’)2抗人IgM(或表现出相同BCR活化特性的抗人IgM(μ链))孵育2分钟，并通过加入1mM钒酸盐(Bio Basic Inc)的PBS溶液来终止活化。
细胞裂解
收获细胞，在冷PBS中洗涤，并在0.1％ SDS-RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，1％ Igepal CA-630，0.5％脱氧胆酸钠，2mM MgCl2，2mM EDTA，含1x完全蛋白酶抑制剂；(Roche Diagnostics))中在4℃下震荡15分钟来裂解。将裂解物在4℃下以16,000g离心10分钟，并收集核后上清液。
用炔烃-豆蔻酸酯对细胞进行免疫印迹、免疫沉淀和代谢标记
根据制造商的说明，通过BCA测定(Thermo Scientific)来测定蛋白质浓度。通过加入5X上样缓冲液制备电泳样品，并将样品煮沸5分钟。如果没有另外说明，在12.5％丙烯酰胺凝胶上每个泳道装载30μg总蛋白。电泳后，将凝胶转移到0.2μM硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，然后用抗体探测，如材料部分所述。按照为ECL Prime Western印迹检测试剂(GEHealthcare，PA，美国)提供的程序显示过氧化物酶活性。
如先前在Yap等人47中所述进行免疫沉淀。简而言之，用冷PBS洗涤细胞，收获细胞，并用冷的不含EDTA的RIPA缓冲液(0.1％ SDS，50mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，1％ IgepalCA-630，0.5％脱氧胆酸钠，2mM MgCl2，不含EDTA的完全蛋白酶抑制剂(Roche))通过在4℃下震荡15分钟来裂解细胞。将细胞裂解物在4℃下以16,000g离心10分钟，并收集核后上清液。通过在4℃下震荡过夜，用亲和纯化的山羊抗GFP(www.eusera.com)或兔抗Src抗体(Sigma，Ab-529，批号871521168)从约1mg蛋白质裂解物中免疫沉淀出EGFP融合蛋白或内源性c-Src非受体酪氨酸激酶(Src)。将纯蛋白质组蛋白G磁珠(Millipore)与免疫沉淀的蛋白质一起孵育2小时，用0.1％ SDS-RIPA充分洗涤，然后重新悬浮在50mM HEPES(pH 7.4)中的1％ SDS中，并在80℃下加热15分钟。收集含有免疫沉淀的蛋白质的上清液用于Western印迹分析或点击化学。
用PCLX-001处理IM9、BL2和COS-7细胞1小时，然后在每个时间点收获前30分钟用25μMω-炔基豆蔻酸标记细胞。使用点击化学将来自所得细胞裂解物的蛋白质与100μM叠氮-生物素反应，并如Yap等人47和Perinpanayagam等人33所述进行处理。
用PCLX-001、达沙替尼和伊布替尼处理的细胞的活力
IM9、VDS、BL2、Ramos、BJAB、DOHH2、WSU-DLCL2和SU-DHL-10细胞(1x 105个细胞)以4ml培养基/孔在六孔板中生长，并与浓度渐增的PCLX-001、达沙替尼和伊布替尼一起孵育长达96小时。用PCLX-001处理的细胞的活力通过CellTiter-Blue Cell活力测定(Promega)或用钙黄绿素AM染色(Life Technologies)在Cytation 5酶标仪(Biotek，Winooski，VT)上根据制造商的说明进行测量。钙黄绿素测定包括测量细胞活力比率(活细胞/总细胞，以％活力表示)。根据制造商的说明，用核-ID蓝/红细胞活力试剂(GFP-certified，Enzo LifeSciences)对细胞进行染色，以鉴定总细胞和死细胞，同时用钙黄绿素AM(LifeTechnologies)对活细胞进行染色。使用Cytation 5细胞成像多模式读取器(BiotekInstruments，Inc.)进行细胞计数，并通过Biotek Gen5数据分析软件(版本2.09)进行分析。
还使用Horizon(St.Louis，MO)平台测量细胞活力。将细胞以每孔500个细胞接种在经组织培养处理的黑色384孔板中的生长培养基中。细胞通过离心在测定板中平衡，并在处理前置于37℃的培养箱中24小时。在处理时，收集一组测定板(未接受处理)，通过加入
Figure BDA0004188841030000661
(Perkin Elmer，Waltham，MA)测量ATP水平。这些Tzero(T0)板使用Envision酶标仪上的超灵敏发光来读取。测定板与化合物一起孵育96小时(分析仪中注明的情况除外)，然后使用/>
Figure BDA0004188841030000671
进行分析。所有数据点都通过自动化流程收集，并接受质量控制，使用Horizon的Chalice Analyzer专有软件(1.5)进行分析。如果测定板通过了以下质量控制标准，则它们是可接受的：相对原始值在整个实验中是一致的，Z因子分数大于0.6，并且未处理的/载体对照在板上表现一致。Horizon利用生长抑制(GI)作为细胞生长的测量。通过应用以下测试和公式计算GI百分比：
如果T<V0:
Figure BDA0004188841030000672
如果T≥V0:
Figure BDA0004188841030000673
/>
其中T是测试制品的信号测量值，V是未处理的/经载体处理的对照测量值，Vo是时间为零时的未处理的/载体对照测量值(俗称T0板)。该公式来自国家癌症研究所的NCI-60高通量筛选中使用的生长抑制计算。因此，100％ GI代表完全的生长抑制(细胞抑制(cytostasis))，而200％ GI代表完全的细胞死亡。
还使用Oncolines(荷兰转化研究中心B.V.)平台测量细胞活力。将细胞稀释在相应的ATCC推荐的培养基中，并根据所用的细胞系，在45μl培养基中以200-6400个细胞/孔的密度分配在384孔板中。对于每个使用的细胞系，使用最佳细胞密度。用磷酸盐缓冲盐水充满板的边缘。将铺板的细胞在37℃下在5％CO2的湿润气氛中孵育。24小时后，加入5μL化合物稀释液并进一步孵育板。在t＝结束时，向每个孔中加入24μL ATPlite 1stepTM(PerkinElmer)溶液，随后振荡2分钟。在黑暗中孵育10分钟后，在Envision多模式酶标仪(PerkinElmer)上记录发光。
最后，使用ChemPartner平台(上海，中国)进行PCLX-001效率筛选的第三个广度(图9)。将131个细胞系接种在黑壁的经组织培养处理的96孔板(来自Corning，Cat.3904)中并按照ATCC配方培养。72小时和144小时后使用Cell Titer Blue活力测定(来自Promega，Cat.G8081，批号0000190181号)来测量细胞活力并用Enspire(PerkinElmer)记录560/590nm处的荧光。使用XLfit软件(5.5)计算EC50。
细胞增殖测定
为了更精确，在数字相位对比图转换后，通过成像和计数来测量细胞增殖。将2×105个细胞培养在4ml培养基的六孔板中，并与浓度递增的PCLX-001一起孵育。匀化后，将50μl培养物转移到高结合透明玻璃底部1/2区域96孔板(Greiner bio-one)中。使用Cytation5细胞成像多模式酶标仪(Biotek Instruments，Inc.)，在明场中对总的孔面积进行成像(12张拼接图片)，并将其转换成单一数字相位对比图。长达4天每天进行总细胞计数(Biotek Gen5数据分析软件2.09)。
细胞内钙测量：
在与1μM PCLX-001、达沙替尼或伊布替尼一起孵育24小时或48小时的BL2淋巴瘤细胞中，使用PTI荧光计(Photon Technology International)并采用之前描述的改良方案53，进行细胞溶质的游离钙浓度测量。将10.106细胞悬浮在含有8μM Fura-2 AM(分子探针)和1mM CaCl2的新鲜培养基中30分钟，洗涤并重新悬浮在补充有钙的培养基中额外15分钟。然后将细胞洗涤并重新悬浮在温热的Krebs林格氏液(10mM HEPES pH 7.0，140mMNaCl，4mM KCl，1mM MgCl2和10mM葡萄糖)中，并置于四面透明的比色皿中。在活化之前，游离的细胞质钙与0.5mM EGTA螯合1分钟。通过添加10μg/ml山羊F(ab’)2抗人IgM(BioRad)来活化BCR受体依赖性钙释放。随后，毒胡萝卜素(300nM)被用于显示BCR非依赖性和不可逆的Ca2+从内质网的释放。Ca2+浓度用以下公式计算：
[Ca++]＝Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)
其中R＝340nm处的荧光强度除以380nm处的荧光强度，Rmax＝添加离子霉素(7.5μM)和CaCl2(12mM)后测量的荧光，Rmin＝添加EGTA(32mM)、Tris(24mM)和TritonTM X-100(0.4％)后测量的荧光，Kd＝224(对于Fura-2 AM，在37C下)。
显示的结果代表实验的多次重复(PCLX-001孵育n＝6，达沙替尼和伊布替尼n＝3)。
PBMC和淋巴细胞的分离和细胞活力测定
招募2名健康人类研究志愿者，用于从20ml血样采集中分离PBMC和淋巴细胞(患者#1：男性，34岁，未诊断，未治疗；患者#2：男性，54岁，未诊断，未治疗)。Alberta癌症委员会健康研究伦理委员会批准了研究方案(研究标题：新鲜血液和造血细胞中脂肪酰基转移酶(FAT)的评估；HREBA.CC-17-0624)。
使用Ficoll-Paque(GE Healthcare，PA，美国)通过密度梯度离心从外周血中分离单核细胞。按照制造商的说明，使用EasySepTM淋巴细胞分离试剂盒(StemcellTechnologies，Vancouver，BC，加拿大)从全血样品中分离淋巴细胞。PBMC和淋巴细胞在含10％ FBS、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基中培养。细胞以2×106个细胞/ml的浓度铺板。在用0.001-10μMPCLX-001孵育96小时后，通过使用CellTiter-FluorTM活力测定(Promega，Madison，WI，美国)来测量细胞活力。
免疫组织化学
在聚-d-赖氨酸包被的35-mm玻璃底皿(MatTek Corporation，Ashland，MA，美国)上培养COS-7细胞，并使用供应商推荐的X-tremeGENE9 DNA(Roche)用指示的荧光标记的蛋白质瞬时转染。使用Zeiss Observer Z1显微镜和Axiovision软件(Axiovision，版本4.8)获取图像。将B细胞淋巴瘤固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，用切片机切成5mm的切片，固定在Superfrost Plus载玻片(Fisher Scientific)上，用二甲苯脱蜡(3次，每次10分钟)，在分级系列的乙醇(100％、80％和50％)中脱水，并在流动冷水中洗涤10分钟。
对于抗原回收，将载玻片装载在载玻片架中，并置于Nordicware微波高压锅中。加入800ml pH 6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液，将高压锅密闭，在高压下微波20分钟。将载玻片在冷流水中洗涤10分钟，在甲醇中的3％ H2O2中浸泡10分钟，用温流水洗涤10分钟，并用PBS洗涤3分钟。除去过量的PBS，用PAP笔(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在样品周围画一个疏水圈。用Dako抗体稀释缓冲液(1:50，每张载玻片约400μml)稀释抗裂解半胱天冬酶3或抗Ki-67，并在4℃的湿度箱中孵育过夜。将载玻片在PBS中洗涤两次，每次5分钟，向每个载玻片中加入～4滴EnVision+System-HRP标记的聚合物(抗兔)(Dako，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)并在室温下孵育30分钟。将载玻片在PBS中再次洗涤两次，每次5分钟，并加入4滴液体二氨基联苯胺+底物色原体(根据制造商的说明制备；Dako，AgilentTechnologies)。将载玻片显影5分钟，并在流动冷水下冲洗10分钟。然后将载玻片浸泡在1％ CuSO4中5分钟，用流动冷水短暂冲洗，用苏木精复染60秒，并用流动冷水冲洗。接下来，将载玻片在碳酸锂中浸沾3次，冲洗，并在分级系列的乙醇中脱水。添加盖玻片，用尼康Eclipse 80i显微镜检查载玻片，并用QImaging相机拍照。
伦理批准
我们遵守了人类、动物试验和研究的所有相关伦理法规。本研究中的所有相关实验都获得了相应的伦理批准。批准研究方案的委员会和/或机构的名称如下所述。
Charles River Discovery Services North Carolina(CR DiscoveryServices)特别遵守实验动物护理和使用指南中关于约束、饲养、手术程序、饲养和液体管理以及兽医学护理的建议。CR Discovery Services的动物护理和使用计划得到了国际实验动物护理评估和认证协会的认可，该协会确保遵守公认的实验动物护理和使用标准。
在Jackson实验室-Sacramento机构的体内服务中，OLAW保证和AAALAC认可的组织进行了DOHH2小鼠异种移植研究。该研究根据IACUC批准的方案进行，并符合实验动物护理和使用指南(国家研究委员会，2011年)。
对于使用DLBCL淋巴细胞的研究，所有程序均根据新加坡综合医院(SGH)机构审查委员会的指导伦理原则获得批准并实施。仅出于特定研究目的使用这些样本获得了书面知情同意。该实验方案(#130812)由A*STAR生物资源中心(BRC)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。所有涉及人体样本的程序均由Sing健康集中机构审查委员会批准，并根据其伦理原则执行。获得了仅出于特定研究目的使用这些样本的书面知情同意。
小鼠中的异种移植研究
在Charles River的设施中进行的DOHH2异种移植研究：雌性重度联合免疫缺陷小鼠(Fox Chase
Figure BDA0004188841030000711
C.B-17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl,Charles River)在研究的第1天为9周龄，BW范围为17.8-22.9g。不限制地给动物喂食水(反渗透，1ppm Cl)和NIH 31改良和辐照的实验室饮食(NIH 31Modified and Irradiated Lab Diet)/>
Figure BDA0004188841030000712
该饮食由18.0％粗蛋白质、5.0％粗脂肪和5.0％粗纤维组成。在研究的第一天，为了减少研究施用阶段的脱水，动物被不限制地给予补液溶液。补液溶液由在无菌水中的0.45％ NaCl、2.5％葡萄糖和0.075％ KCl组成。在20–22℃(68–72°F)和40–60％的湿度下，将小鼠安置在静态微隔离器中经过辐照的Enrich-o'cobsTM垫床上，光照周期为12小时。
在Jackson实验室进行BL2异种移植研究：将105只6周龄雌性NOD.CB17-Prkdcscid/J(NOD scid，库存#001303)小鼠转移到加利福尼亚州萨克拉门托的体内研究实验室。小鼠的耳朵上有缺口，以便辨认，并以每笼5只小鼠的密度饲养在单独和绝对通风的聚砜笼中，用HEPA过滤空气。最初每两周更换一次笼子。动物房完全用人工荧光灯照明，控制12小时的光照/黑暗周期(6am到6pm光照)。动物房的正常温度和相对湿度范围分别为20-26℃和30-70％。动物房被设定为每小时换气高达15次。不限制地提供酸化至pH为2.5至3.0的过滤自来水和标准实验室食物。
将BL2或DOHH-2细胞(1×107)和含有从同意的患者DLBCL3的胸腔液中分离的肿瘤性DLBCL淋巴细胞的细胞悬浮液分别在Jackson实验室、Charles River和新加坡综合医院的设施中皮下注射到免疫受损的雌性NODscid小鼠的侧腹。肿瘤形成后，将小鼠分成大约10只动物的组，每天皮下注射载体，每天皮下注射10-60mg/kg的PCLX-001，或每周皮下注射3mg/kg的多柔比星70，如每个图所示。剂量体积为10mL/kg。在2-3周施用期结束时，对小鼠实施安乐死，并对3只/组小鼠进行尸检。出于人道原因早期死亡或安乐死的小鼠也进行尸检。在存活期，定期监测小鼠并每日称重，每隔一天用数字游标卡尺(Mitutoyo)测量肿瘤。肿瘤体积计算为长度(mm)×宽度(mm)2/2；长度和宽度分别是最长和最短的直径。在安乐死时，在施用期结束时，采集血样进行血液学分析和临床化学分析，包括AST和CK活性以及胆红素和肌酐浓度(加上Jackson实验室研究中的ALT活性和BUN浓度)。尸检时，收集并固定股骨、双肾、肝脏、小肠和注射部位的样本。随后对这些样本进行处理，并通过光学显微镜检查组织病理学发现。同样在尸检时，将肿瘤取出并分成两半。一片在室温下在10％中性缓冲福尔马林中固定24小时，并包埋在石蜡中；另一片被瞬时冷冻用于RNA和蛋白质分析。所有异种移植实验的肿瘤生长抑制(TGI)按照以下公式计算：
TGI(％)＝(V对照–V处理)/(V对照–V初始)*100。
患者来源的异种移植小鼠研究：
i)患者数据
患者DLBCL3是一名58岁的男性，他在43岁时接受了环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙(CHOP)的I期弥漫性大B细胞淋巴瘤治疗，导致完全缓解(补充表2)。10年后，患者DLBCL3因骨髓、软脑膜和胸腔积液中的疾病复发而被送往新加坡综合医院。他接受了两个疗程的利妥昔单抗、异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷和鞘内甲氨蝶呤/阿糖胞苷治疗，随后接受了四个疗程的地塞米松、阿糖胞苷、顺铂和鞘内甲氨蝶呤治疗。在这时，他的组织被收获用于PDX的繁殖。他的病情继续恶化，一年后去世。
ii)病理学
胸腔液体的细胞学检查显示了弥散性淋巴瘤群体，其特征为具有泡状染色质和明显核仁的大细胞。肿瘤性细胞表达泛B(pan-B)标志物(PAX5、CD20、CD22、CD79a)，伴有CD5异常表达、bcl2强表达和高增殖部分(70-80％)。肿瘤性淋巴细胞具有非生发中心表型(CD10阴性和bcl6、MUM1、FOXP1阳性)，但c-Myc染色较低(20％)。间期荧光原位杂交显示BCL2增加，BCL6和IGH重排；C-MYC的模式正常。RNA原位杂交显示缺乏NMT2表达。
iii)异种移植构造和处理
在冷的无菌20％ RPMI 1640培养基中收集胸腔液体，用Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare)分离肿瘤性细胞，并将其重新悬浮在含20％胎牛血清(Life Technologies，Carlsbad，CA)的RPMI 160培养基(Life Technologies)中。将肿瘤样品的代表性部分固定在10％中性缓冲福尔马林中；另一部分用于异种移植。将细胞悬浮液皮下注射到4-6周龄NODscid小鼠的侧腹。当肿瘤达到最大1000mm3时，处死小鼠，收获肿瘤，并进行尸检。将异种移植肿瘤立即冷冻，在福尔马林中固定，并储存在90％胎牛血清和10％二甲基亚砜中或置于RPMI 1640培养基中。重复这一过程以产生随后几代的患者来源的异种移植模型(P2、P3、P4……)。为了评估来源肿瘤的形态学和主要特征的保持，将来自患者肿瘤样品和所有已建立的患者来源的异种移植模型的异种移植物的福尔马林固定的石蜡包埋组织切片用苏木精和伊红染色。这些切片还被免疫染色以测量各种标志物的表达。临床病理学家检查了所有的载玻片。对于目前的研究，将肿瘤碎片(～50mg，P4)皮下植入4-6周龄雌性NODscid小鼠的侧腹，使其生长至200-300mm3。然后将小鼠随机分组(每组n＝8)并皮下注射载体(10ml/kg)；PCLX-001，每日20mg/kg，持续21天；或PCLX-001，每日50mg/kg，持续18天，9天后中断3天。如上所述进行肿瘤测量和生长抑制计算。
对于DLBCL3 PDX研究，NODscid小鼠从新加坡InVivos购买，并不限制地喂食标准实验室饮食和蒸馏水。动物在A*STAR的BRC中在22±2℃下保持12小时的光照/黑暗循环，并根据机构指南进行维持。
NMT活性测定
Perinpanayagam等人33描述了NMT活性测定。简而言之，在蔗糖缓冲液(50mMNaH2PO4，pH 7.4和0.25M蔗糖)中裂解并超声处理(10秒)细胞。将肿瘤样品切成小片，通过玻璃Dounce匀化(12个完整行程)在蔗糖缓冲液中提取，并超声处理(10秒)。在25μl反应中，将蛋白质裂解物与在NMT测定缓冲液(0.26MTris-HCl pH 7.4，3.25mM EGTA，2.92mM EDTA和29.25mM 2-巯基乙醇，1％Triton X-100)中的0.1mM可豆蔻酰化或不可豆蔻酰化的十肽(对应于p60-Src的N-末端序列)和12pM[3H]-豆蔻酰基-CoA(Perkin Elmer，Waltham，MA)一起孵育，并在30℃下孵育15分钟。通过将15μl反应混合物点样到P81磷酸纤维素纸盘(Whatman，Maidstone，英国)上终止反应，洗涤并处理用于闪烁计数。
统计方法
数据使用Prism 8软件(GraphPad，版本8.4.1)进行分析，并通常表示为平均值±s.e.m.。适用时，使用Student t检验或单因素方差分析确定统计显著性。通过双因素方差分析评估药物治疗对肿瘤体积的显著性分析。高于0.05的P值被认为没有统计显著性。(***)P≤0.001，(**)P≤0.01，(*)P≤0.05。
NMT1和NMT2表达的统计分析：NMT1和NMT2 mRNA表达数据于2020年3月26日从Broad Institute CCLE数据库54(https://portals.broadinstitute.org/ccle)中提取，并包含1269种癌细胞系的mRNA表达数据。使用RSEM分析RNAseq TPM基因表达数据(Expression Public 20Q1)的蛋白质编码基因，并使用伪计数1表示为Log2转化值(图22)。
T细胞受体(TCR)活化
Jurkat T细胞从ATCC购买。在湿润的培养箱中，在37℃和5％ CO2下，将细胞维持在补充有5％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的RPMI培养基中，并常规检查污染支原体的存在。对于TCR活化实验，将PCLX-001预处理的细胞与2μg/ml的CD3和CD28单克隆抗体(ThermoFisher Scientific，分别为Cat#14-0037-82和#14-0281-82)孵育不同的时间(15-60分钟后最佳活化)，并通过加入1mM钒酸盐(Bio Basic Inc)的PBS溶液来终止活化。收获细胞，在冷PBS中洗涤，并在0.1％ SDS-RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，150mMNaCl，1％ Igepal CA-630，0.5％脱氧胆酸钠，2mM MgCl2，2mM EDTA，含1x完全蛋白酶抑制剂；(Roche Diagnostics))中在4C下震荡15分钟来裂解。裂解物在4℃下以16,000g离心10分钟，收集核后上清液并通过免疫印迹进行分析。
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实施例2
图23PCLX-001处理减弱了Jurkat T细胞中的TCR依赖性P-ERK活化。用CD3/CD28抗体活化Jurkat T细胞长达60分钟(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001孵育24/48h(1μM)抑制P-ERK活化。
图24PCLX-001处理(24h)减弱了Jurkat T细胞中的TCR依赖性P-ERK和P-SFK活化。用CD3/CD28抗体活化Jurkat T细胞长达4小时(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001孵育24h(0.1和1μM)抑制P-ERK活化和Src家族激酶(P-SFK)磷酸化。
图25PCLX-001处理(48h)减弱了Jurkat T细胞中的TCR依赖性P-ERK和P-SFK活化。用CD3/CD28抗体活化Jurkat T细胞长达4小时(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001孵育48h(0.1和1μM)抑制P-ERK活化和Src家族激酶(P-SFK)磷酸化。
图26PCLX-001和达沙替尼处理在原代培养的T细胞中减弱TCR下游信号传导事件并诱导ER应激。用CD3/CD28抗体活化90％αb原代T细胞30分钟(2ug/ml)。免疫印迹分析表明，PCLX-001和达沙替尼抑制P-酪氨酸磷酸化(PY99)、P-ERK活化、Src家族激酶(P-SFK)磷酸化。此外，PCLX-001显著降低Src和Lyn的蛋白水平并增加Bip蛋白含量(ER应激标志物)。
图27A-E PCLX-001降低PBMC、B细胞和单核细胞的活力，但不降低T细胞的活力。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。使用流式细胞术检测细胞亚群的活力和丰度。PBMC的活力明显降低(A)。尽管药物处理没有改变CD4+和CD8+T细胞的频率(B和C)。然而，在PCLX-001处理96小时后，B细胞(D)和单核细胞CD14+(E)的数量显著减少。
图28A-D PCLX-001降低T细胞中Lyn和HGAL的表达。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。通过流式细胞术使用细胞内染色检测T细胞亚群中Lyn和HGAL的表达。CD4+T细胞中Lyn(A)和HGAL(B)的表达均降低。此外，PCLX-001还降低了CD8+T细胞中Lyn(C)和HGAL(D)的表达。
图29A-D PCLX-001降低单核细胞中Lyn和HGAL的表达，但不降低B细胞中的表达。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。通过流式细胞术使用细胞内染色检测B细胞和单核细胞亚群中Lyn和HGAL的表达。虽然PCLX-001不能降低B细胞中Lyn(A)和HGAL(B)的表达，但这两种蛋白标志物在单核细胞(C和D)中均显著降低。
图30A-E PCLX-001诱导炎性细胞因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导炎性细胞因子IL-6(A)、TNF-α(B)、IL-8(C)、IFN-γ(D)和IL-17a(E)的产生。
图31A-D PCLX-001诱导抗炎细胞因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导抗炎细胞因子IL-1RA(A)、IL-10(B)、IL-13(C)和IL-16(D)的产生。
图32A-D PCLX-001诱导炎性趋化因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导炎性趋化因子MIP-1α(A)、MCP-2(B)、TARC(C)和GRO-α(D)的产生。
图33A-D PCLX-001诱导炎性趋化因子的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX-001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discoveryassay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导炎性趋化因子RATES(A)、MIP-1β(B)、MCP-4(C)和MDC(D)的产生。
图34A-C PCLX-001诱导T辅助细胞2介导的趋化因子和GM-CSF的产生。PBMC在浓度渐增的PCLX 001(0-10ug/ml)存在下培养4天。4天后，使用多重细胞因子阵列(EveTechnologies Discovery assay，Calgary，CA)分析细胞培养物上清液的各种生物标志物，人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)。PCLX-001在活PBMC中诱导粒细胞-单核细胞集落刺激因子I-309(A)、作为T辅助细胞2介导的趋化因子的嗜酸性粒细胞趋化因子-2(B)和GM-CSF(C)的产生。
图35A-D NMT抑制剂(PCLX-001、PCLX-002、IMP-1088)减少促炎细胞因子的标准化分泌；IL-6(A)、IL-8(B)、TNF-α(C)和IFN-γ(D)。将T细胞与浓度渐增的NMT抑制剂一起孵育48小时，然后在药物存在下用T细胞活化剂(STEMCELLS)再诱导2天。NMT抑制剂显著降低了IL-6、IL-8和IFN-γ的水平。(双因素方差分析，针对未处理的P值：*<0.05-0.01**<0.01-0.001***<0.001-0.0001。值得注意的是，在更有效的NMT抑制剂PCLX-001中细胞因子分泌的减少强于PCLX-002，并且在处理4天后细胞的存活率在未处理样品的10％以内。
图36A-D NMT抑制剂(PCLX-001、PCLX-002、IMP-1088)减少抗炎细胞因子的标准化分泌；IL-4(A)、IL-5(B)、IL-10(C)和IL-13(D)。将T细胞与浓度渐增的NMT抑制剂一起孵育48小时，然后在药物存在下用T细胞活化剂(STEMCELLS)再诱导2天。NMT抑制剂显著降低了IL-5、IL-10和IL-13的水平。(双因素方差分析，针对未处理的P值：*<0.05-0.01**<0.01-0.001***<0.001-0.0001。值得注意的是，在更有效的NMT抑制剂PCLX-001中细胞因子分泌的减少强于PCLX-002，并且在处理4天后细胞的存活率在未处理样品的10％以内。
图23-25描述了PCLX-001和达沙替尼对用CD3/CD28抗体活化30分钟(2ug/ml)的Jurkat T细胞中的TCR途径的影响。
图26描述了PCLX-001和达沙替尼对用CD3/CD28抗体活化30分钟(2ug/ml)的90％αb原代T细胞中的TCR途径的影响。
图27描述了在量渐增的PCLX-001存在下，不同血液细胞亚群的活力。
图28-29描述了在量渐增的PCLX-001存在下，不同血液细胞亚群中豆蔻酰化的蛋白质Lyn和HGAL的量。
图30至34描述了在量渐增的PCLX-001存在下，培养的PBMC中细胞因子和趋化因子的产生。
图35-36描述了在量渐增的PCLX-001存在下，培养的T细胞中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的产生。
下表列出了趋化因子和趋化因子受体。
Figure BDA0004188841030000841
/>
Figure BDA0004188841030000851
/>
Figure BDA0004188841030000861
/>
Figure BDA0004188841030000871
图35和36显示了在用-001或-002处理的细胞中，T细胞的促炎细胞因子分泌显著减少。这种作用与所用PCLX-001和PCLX-002的效力成比例。IMP-1088对细胞因子的分泌也有显著的抑制作用，除了对TNFa有增加分泌的作用。
本文显示，NMT抑制剂抑制细胞因子分泌，并可用作免疫调节剂，可能通过抑制TCR来降低T细胞活性，这涉及自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎、狼疮、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、I型糖尿病、银屑病和抗炎疾病(见下表)。
图35NMT抑制剂(PCLX-001、PCLX-002、IMP-1088)减少促炎细胞因子的标准化分泌；IL-6(A)、IL-8(B)、TNF-α(C)和IFN-γ(D)。将T细胞(n＝3，来自3个独立的供体)与浓度渐增的NMT抑制剂一起孵育48小时，然后在药物存在下用T细胞活化剂(STEMCELLS Inc.)再诱导2天。(双因素方差分析，针对未处理的P值：*<0.05-0.01**<0.01-0.001***<0.001-0.0001。在更有效的NMT抑制剂PCLX-001中细胞因子分泌的减少强于PCLX-002，并且处理4天后细胞的存活率在未处理样品的10％以内。
图36NMT抑制剂(PCLX-001、PCLX-002、IMP-1088)减少抗炎细胞因子的标准化分泌；IL-4(A)、IL-5(B)、IL-10(C)和IL-13(D)。将T细胞(n＝3，来自3个独立的供体)与浓度渐增的NMT抑制剂一起孵育48小时，然后在药物存在下用T细胞活化剂(STEMCELLS)再诱导2天。(双因素方差分析，针对未处理的P值：*<0.05-0.01**<0.01-0.001***<0.001-0.0001。在更有效的NMT抑制剂PCLX-001中细胞因子分泌的减少强于PCLX-002，并且在处理4天后细胞的存活率在未处理样品的10％以内。
显示T细胞活力的表
T细胞活力(#1)
Figure BDA0004188841030000881
显示T细胞活力的表
T细胞活力(#2)
Figure BDA0004188841030000882
Figure BDA0004188841030000891
显示T细胞活力的表
T细胞活力(#3)
Figure BDA0004188841030000892
材料与方法
Jurkat T细胞培养
Jur kat T细胞最初从ATCC(https://www.atcc.org/products/tib-152)购买。使用MycoAlert Plus支原体检测试剂盒(Lonza，ME，美国)定期检测细胞系的支原体污染。Jurkat T细胞支原体污染检测呈阴性。Jurkat T细胞维持在补充有5％胎牛血清、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基中。
原代细胞培养
原代人TαβT细胞衍生自健康供体血液，如所述(Siegers GM,Ribot EJ,KeatingA,Foster PJ.Extensive expansion of primary human gamma delta T cellsgenerates cytotoxic effector memory cells that can be labeled with Ferahemefor cellular MRI.Cancer Immunol Immunother.(2013)62:571–83.doi:10.1007/s00262-012-1353-y)。简言之，分离外周血单核细胞，并在含有1μg/ml伴刀豆球蛋白A和10ng/ml IL-2和IL-4的培养基中培养。T细胞一起扩增6-8天，然后通过磁性细胞分离耗尽常规的αβTc。通过台盼蓝拒染和细胞计数常规评估活力和倍数扩增。饲养时，用补充有10ng/ml IL-2和IL-4的完全培养基(含10％ FBS的RPMI 1640，热灭活，1×MEM NEAA，10mMHEPES，1mM丙酮酸钠，50U/ml青霉素–链霉素和2mM L-谷氨酰胺—均来自InvitrogenTM,Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts,美国)将细胞稀释至一百万个细胞/ml(Siegers GM,Dutta I,Kang EY,Huang J,
Figure BDA0004188841030000901
M和Postovit L-M(2020)AberrantlyExpressed Embryonic Protein NODAL Alters Breast Cancer Cell Susceptibility toγδT Cell Cytotoxicity.Front.Immunol.11:1287.doi:10.3389/fimmu.2020.01287)。/>
将用于该实验的原代混合T细胞的小瓶解冻，解冻后5天，对细胞进行染色以用于流式细胞术，然后在解冻后7天采集。
用达沙替尼和PCLX-001孵育
达沙替尼来自Apex Bio Technology。PCLX-001被David Gray博士和Paul Wyatt博士(University of Dundee，苏格兰，英国)鉴定为DDD86481，由PacylexPharmaceuticals提供。Jurkat T细胞在4ml培养基/孔的六孔板中生长，并与浓度渐增的PCLX-001、达沙替尼一起孵育长达48小时。
T细胞受体的活化
对于TCR活化实验，将细胞与2μg/ml的人CD3单克隆抗体(OKT3)、eBioscienceTM和小鼠CD28单克隆抗体(37.51)的混合物、eBioscienceTM(购自ThermoFisher Scientific)一起孵育长达4小时2分钟，并通过添加PBS中的1mM钒酸盐(Bio Basic Inc)溶液来终止活化。
免疫印迹
兔抗GAPDH(1:5000，亲和纯化的多克隆，#EU1000，第1批)来自实验室库存，并且可通过Eusera(www.eusera.com)获得。兔单克隆抗Src(1:2000，克隆32G6，#2123，第5批)、Lck(1:2000，克隆D88，#2984，第4批)、ERK(1:2000，克隆4695，#9102，第27批)、P-ERK(1:5000，克隆3510，#9101，第30批)、P-SFK(1:10,000，克隆D49G4，#6943，第4批)从CellSignaling.echnologies购买。兔单克隆抗BIP(1:2000，多克隆，ADI-SPA-826)从Enzo LifeSciences购买。小鼠单克隆抗p-Tyr(1:10,000，PY99，sc-7020，批号I2118)抗体从SantaCruz Biotechnology购买。增强型化学发光(ECL)Prime Western印迹检测试剂盒从GEHealthcare购买。Clarity ECL western印迹底物来自Bio-Rad。山羊抗人IgM(μ链)(70-8028-M002，批号S728028002001)从Tonbo biosciences购买。
收获细胞，在冷PBS中洗涤，并在0.1％ SDSRIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，1％ Igepal CA-630，0.5％脱氧胆酸钠，2mM MgCl2，2mM EDTA，含1×完全蛋白酶抑制剂；(Roche Diagnostics))中在4℃下震荡15分钟来裂解。将裂解物在4℃下以16,000g离心10分钟，并收集核后上清液。
根据制造商的说明，通过BCA测定(Thermo Scientific)来测定蛋白质浓度。通过加入5×上样缓冲液来制备电泳样品，并将样品煮沸5分钟。如果没有另外说明，每个泳道在12.5％丙烯酰胺凝胶上装载30μg总蛋白。电泳后，将凝胶转移到0.2μM硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，然后如材料部分所述用抗体探测。按照为ECL Prime Western印迹检测试剂(GEHealthcare，PA，美国)提供的程序显示过氧化物酶活性。
人细胞培养
人外周血单核细胞(PBMC)和来自健康供体的纯化T细胞从STEMCELLTechnologies(CA)购买。在100IU/ml白介素2(STEMCELL Technologies)或HIV试剂程序(由ATCC管理)的存在下，在24孔板中的RPMI中培养细胞(7.5×106/ml)，所述RPMI补充有10％热灭活的胎牛血清(vWR)、1％青霉素/链霉素(SigmaMillipore)、1％丙酮酸钠和1％非必需氨基酸(Gibco)。
对于PBMC样品，用各种浓度的PCLX-001(0-10ug/ml)处理细胞2天和/或4天。首先用Zombie aqua对收获的细胞进行活力染色，用人Trustain FcX Fc受体封闭溶液封闭FC受体，并用荧光团缀合的单克隆抗体(CD3、CD4、CD8、CD19和CD14)进行标记，这些抗体分别来自Biolegend。然后，用固定/透化(fix/perm)缓冲液试剂盒(eBiosciences)透化细胞，并用抗Lyn和HGAL抗体进行细胞内染色。使用LSRFortessa X20(BD Biosciences)获得样品，并通过FlowJo软件进行分析。
对于纯化的T细胞，PCLX-001、PCLX-002(PACYLEX)和IMP-1088(？)以各种浓度(0-500nM)添加2天。然后，在药物存在下用T细胞活化剂(STEMCELLS)再诱导细胞2天。4天后，使用流式细胞术分析经处理的T细胞的活力。收集PBMC和T细胞的上清液用于进一步分析。
多重阵列测定
使用多重细胞因子阵列(Eve Technologies Discovery assay，Calgary，CA)分析收集的上清液的各种生物标志物，对于PBMC，分析人类细胞因子/趋化因子71-Plex(HD71)，或对于T细胞样品，分析人促炎聚焦15-Plex(HDF15)。
本文所述的实施方案仅为示例。本领域技术人员可以对特定实施方案进行变更、修改和变化。权利要求的范围不应受本文阐述的特定实施方案的限制，而应以与整个说明书一致的方式来解释。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请表明了本发明所属领域的技术人员的技术水平，并通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地表明通过引用并入本文一样。
如此对本发明进行了描述，很明显，本发明可以以多种方式变化。这些变化不应被视为背离本发明的精神和范围，并且对本领域技术人员来说显而易见的所有这些修改都预期包括在所附权利要求的范围内。

Claims (120)

1.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症，所述方法包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
5.治疗有效量的PCLX-001用于治疗受试者中的癌症的用途，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症。
6.治疗有效量的PCLX-001在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，所述受试者具有发展所述癌症的风险，或易患所述癌症。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
10.一种诱导受试者中淋巴瘤细胞死亡的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的PCLX-001。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述受试者为人类。
13.治疗有效量的PCLX-001用于在受试者中诱导淋巴瘤的用途。
14.治疗有效量的PCLX-001在制备用于在受试者中诱导淋巴瘤的药物中的用途。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
17.一种降低受试者细胞中SFK蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与PCLX-001接触。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述SFK蛋白是Src蛋白、Lyn蛋白或Src蛋白和Lyn蛋白两者。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤细胞。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其包含多个所述细胞。
24.PCLX-001用于降低受试者细胞中SFK蛋白水平或活性的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
25.PCLX-001在制备用于降低受试者细胞中SFK蛋白水平或活性的药物中的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
26.根据权利要求24或25所述的用途，其中所述SFK蛋白是Src蛋白、Lyn蛋白或Src蛋白和Lyn蛋白两者。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤细胞。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的用途，其包含多个所述细胞。
32.一种降低受试者细胞中Src蛋白、Lyn蛋白、泛P-SFK蛋白、ERK蛋白、P-ERK蛋白、NFκB蛋白、c-Myc蛋白或CREB蛋白水平或活性中的一种或多种的方法，其包括：将所述细胞与PCLX-001接触。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述淋巴瘤细胞是B细胞淋巴瘤。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其包含多个所述细胞。
38.PCLX-001用于降低受试者细胞中Src蛋白、Lyn蛋白、泛P-SFK蛋白、ERK蛋白、P-ERK蛋白、NFκB蛋白、c-Myc蛋白或CREB蛋白水平或活性中的一种或多种的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
39.PCLX-001在制备用于降低受试者细胞中Src蛋白、Lyn蛋白、泛P-SFK蛋白、ERK蛋白、P-ERK蛋白、NFκB蛋白、c-Myc蛋白或CREB蛋白水平中的一种或多种的药物中的用途，其中所述PCLX-001被配制用于与所述细胞接触。
40.根据权利要求38或39所述的用途，其中所述细胞是淋巴瘤细胞。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤细胞。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的用途，其包含多个所述细胞。
45.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
46.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的DDD85646。
47.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的IMP1008。
48.一种治疗受试者中的自身免疫性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的NMT抑制剂。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述自身免疫性病症为类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胃炎、结肠炎和胰岛素依赖性自身免疫性糖尿病、移植物移植/排斥抑制、银屑病、干燥综合征或移植物抗宿主病。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
51.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的PCLX-001。
52.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的DDD85646。
53.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的IMP 1008。
54.一种治疗受试者中的炎症性病症的方法，其包括：施用治疗有效量的NMT抑制剂。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其中所述炎症性病症为急性、粘连性、萎缩性、卡他性、慢性、硬变性、弥漫性、播散性、渗出性、纤维素性、纤维化、局灶性、肉芽肿性、增生性、肥大性、间质性、转移性、坏死性、闭塞性、实质性、可塑性、生产性、增殖性、伪膜性、脓性、硬化性、浆液纤维蛋白性、浆液性、单纯性、特异性、亚急性、化脓性、毒性、创伤性、溃疡性炎症、胃肠病症、消化性溃疡、区域性肠炎、憩室炎、胃肠出血、嗜酸性、嗜酸性食管炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎、胃炎、腹泻、胃食管反流病(GORD或GERD)、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞综合征、不确定性结肠炎、炎症性肠综合征(IBS)，或选自胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、过敏性肺炎、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)和囊性纤维化的肺部病症。
56.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
57.一种降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与PCLX-001接触。
58.一种降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与DDD85646接触。
59.一种降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的方法，其包括：将所述细胞与NMT抑制剂接触。
60.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
61.根据权利要求57至60中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其包含多个所述细胞。
63.一种降低受试者免疫细胞活性的方法，其包括：将所述T细胞和/或所述B细胞与NMT抑制剂接触。
64.一种降低受试者T细胞和/或B细胞活性的方法，其包括：将所述T细胞和/或所述B细胞与NMT抑制剂接触。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
66.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
67.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
68.根据权利要求63至67中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
69.根据权利要求63至68中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
70.治疗有效量的PCLX-001用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
71.治疗有效量的DDD85646用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
72.治疗有效量的IMP 1088用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
73.治疗有效量的NMT抑制剂用于治疗受试者的自身免疫性病症的用途。
74.根据权利要求63至73中任一项所述的用途，其中所述自身免疫性病症为类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、重症肌无力、红斑狼疮、胰岛素依赖性糖尿病(1型)、胃炎、结肠炎和胰岛素依赖性自身免疫性糖尿病、移植物移植/排斥抑制或移植物抗宿主病。
75.根据权利要求63至74中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
76.治疗有效量的PCLX-001用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
77.治疗有效量的DDD85646用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
78.治疗有效量的IMP 1088用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
79.治疗有效量的NMT抑制剂用于治疗受试者的炎症性病症的用途。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的用途，其中所述炎症性病症为急性、粘连性、萎缩性、卡他性、慢性、硬变性、弥漫性、播散性、渗出性、纤维素性、纤维化、局灶性、肉芽肿性、增生性、肥大性、间质性、转移性、坏死性、闭塞性、实质性、可塑性、生产性、增殖性、伪膜性、脓性、硬化性、浆液纤维蛋白性、浆液性、单纯性、特异性、亚急性、化脓性、毒性、创伤性、溃疡性炎症、胃肠病症、消化性溃疡、区域性肠炎、憩室炎、胃肠出血、嗜酸性、嗜酸性食管炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎、胃炎、腹泻、胃食管反流病(GORD或GERD)、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞综合征、不确定性结肠炎、炎症性肠综合征(IBS)，或选自胸膜炎、肺泡炎、血管炎、肺炎、慢性支气管炎、支气管扩张、弥漫性泛细支气管炎、过敏性肺炎、哮喘、特发性肺纤维化(IPF)、干燥综合征和囊性纤维化的肺部病症。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
82.治疗有效量的PCLX-001用于降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的用途。
83.治疗有效量的DDD85646用于降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的用途。
84.治疗有效量的NMT抑制剂用于降低受试者细胞中BCR蛋白水平或活性和/或TCR蛋白水平或活性的用途。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
86.根据权利要求82至85中任一项所述的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
87.根据权利要求82至86中任一项所述的用途，其包含多个所述细胞。
88.NMT抑制剂用于降低受试者免疫细胞活性的用途。
89.NMT抑制剂用于降低受试者T细胞和/或B细胞活性的用途。
90.根据权利要求87或89所述的用途，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
91.根据权利要求87或89所述的用途，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
92.根据权利要求87或89所述的用途，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
93.根据权利要求87至89中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
94.根据权利要求87至93中任一项所述的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
95.一种降低受试者单核细胞活性或减少受试者单核细胞数量的方法，其其包括：将所述单核细胞与NMT抑制剂接触。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
97.根据权利要求95所述的方法，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
98.根据权利要求95所述的方法，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
99.根据权利要求95至98中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
100.根据权利要求95至99中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
101.NMT抑制剂用于降低受试者单核细胞活性或减少受试者单核细胞数量的用途。
102.根据权利要求101所述的用途，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
103.根据权利要求101所述的用途，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
104.根据权利要求101所述的用途，其中所述NMT抑制剂是IMP 1088。
105.根据权利要求101至104中任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。
106.根据权利要求101至105中任一项所述的用途，其中所述接触是体外的或体内的。
107.一种减少受试者T细胞中细胞因子分泌量的方法，其包括：施用NMT抑制剂。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6、IL-8和IFN-γ、IL-5、IL-10或IL-13。
109.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
110.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
111.根据权利要求107或108所述的方法，其中所述NMT抑制剂是IMP-1088。
112.根据权利要求107至111中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
113.根据权利要求107至112中任一项所述的方法，其中所述接触是体外的或体内的。
114.NMT抑制剂用于减少受试者T细胞中细胞因子分泌量的用途。
115.根据权利要求114所述的用途，其中所述细胞因子是IL-6、IL-8和IFN-γ、IL-5、IL-10或IL-13。
116.根据权利要求114或115所述的用途，其中所述NMT抑制剂是PCLX-001。
117.根据权利要求114或115所述的用途，其中所述NMT抑制剂是DDD85646。
118.根据权利要求114或115所述的用途，其中所述NMT抑制剂是IMP-1088。
119.根据权利要求114至118中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
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