TW201722964A

TW201722964A - 用於抑制ｒｏｒ－ｇａｍｍａ－ｔ之化合物

Info

Publication number: TW201722964A
Application number: TW105127541A
Authority: TW
Inventors: 約翰理查墨非
Original assignee: 美國禮來大藥廠
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2017-07-01
Also published as: PT3347360T; MD3347360T2; NZ739518A; ZA201800515B; EP3347360A1; CL2018000558A1; HK1249901B; IL257202A; EP3347360B1; TN2018000057A1; MA42776B1; CA2994732C; EA201890364A1; DK3347360T3; CO2018002440A2; CR20180089A; CA2994732A1; JP2018507203A; CN108026112A; US9598431B1

Abstract

本發明提供新穎ROR gamma-t抑制劑及其醫藥組合物，□

Description

用於抑制ROR-GAMMA-T之化合物

本發明係關於可用於抑制視黃酸受體相關之孤兒受體gamma-t(RORγt)之化合物、醫藥組合物及用於治療與RORγ活性有關之疾病之方法。

視黃酸受體相關之孤兒受體(ROR)係核受體(NR)超家族之成員，其在許多疾病中經鑑別為重要病理調節劑。ROR子族係由RORα、RORβ及RORγ組成。小鼠及人類RORγ基因生成兩種同型γ1及γ2，後者最通常稱為γt。經常因應IL-23/IL-23受體信號傳導之RORγt信號傳導係幼稚CD4+ T細胞分化成稱為Th17之T細胞亞群所需的，Th17不同於經典的Th1及Th2細胞並且支持其維持。Th17細胞產生介白素-17A(IL-17)及IL-17F。另外，Th17細胞產生已知驅動發炎反應之一系列其他因子，其包含腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、介白素-6(IL-6)、GM-CSF、CXCL1及CCL20。NK細胞及先天性淋巴樣細胞(例如淋巴組織誘導(LTi)樣細胞)表現IL-23受體及RORγt並因應刺激及IL-23而產生IL-17。存在大量證據證明IL-23-反應性、RORγt及IL-17表現細胞與自體免疫疾病(AI)、發炎性疾病及癌症相關聯。因此，RORγt之靶向抑制對於減少彼等疾病之病因可係重要的。

AI疾病係慢性病狀，目前其無法治癒。AI疾病之治療通常涉及試圖藉由投與抗發炎、抗疼痛或免疫抑制劑醫物來控制疾病之過程及減少症狀。不幸地，使用抗發炎及抗疼痛藥物有時係無效的且使用免疫抑制劑經常導致毀滅性長期副作用。免疫抑制劑藥物之最顯著副作用係增加感染風險及較高的癌症風險。

已經鑑別出RORγt之天然及合成配體。針對RORγt之小分子抑制劑已報導於針對AI之文獻中。參見WO 2015/017335及WO 2014/179564。然而，AI疾病之盛行率加上當前治療之無效性或毀滅性副作用使得有更多治療選擇可用於患者成為必需的。靶向RORγt可藉由靶向致病性免疫細胞來最大化治療益處同時最小化阻抑宿主防禦之風險而呈現優於當前AI療法之優點。

本發明提供為RORγt抑制劑之新穎化合物。此等新化合物可解決對於以下各項之強力、有效治療之需要：眼色素層炎、多發性硬化、類風濕性關節炎、移植物抗宿主病、克隆氏病(Crohn’s disease)、其他發炎性腸病、癌症、牛皮癬及血清陰性脊椎關節疾病，例如軸心型脊椎關節炎、關節黏連性脊椎炎及牛皮癬關節炎。

本發明提供下式之化合物或其醫藥上可接受之鹽。

本發明亦提供用於治療患者之牛皮癬之方法，其包括將本發明之化合物或其醫藥上可接受之鹽投與給需要其之患者。此外，本發明提供用於治療患者之血清陰性脊椎關節疾病之方法，其包括將本發明之化合物或其醫藥上可接受之鹽投與給需要其之患者。在該實施例中，血清陰性脊椎關節疾病係軸心型脊椎關節炎、關節黏連性脊椎炎或牛皮癬關節炎。

本發明提供醫藥組合物，其包括本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。在又一實施例中，組合物進一步包括一或多種其他治療劑。在又一實施例中，本發明提供用於治療牛皮癬之醫藥組合物，其包括本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。在另一實施例中，本發明提供用於治療血清陰性脊椎關節疾病之醫藥組合物，其包括本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。在該實施例中，血清陰性脊椎關節疾病係軸心型脊椎關節炎、關節黏連性脊椎炎或牛皮癬關節炎。

此外，本發明提供本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法、尤其用於治療牛皮癬。此外，本發明提供本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療牛皮癬。在又一實施例中，本發明提供本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療牛皮癬之藥劑。

此外，本發明提供本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法、尤其用於治療血清陰性脊椎關節疾病。此外，本發明提供本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療血清陰性脊椎關節疾病。在又一實施例中，本發明提供本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療血清陰性脊椎關節疾病之藥劑。在該等實施例中，血清陰性脊椎關節疾病具有軸心型脊椎關節炎、關節黏連性脊椎炎或牛皮癬關節炎。

本發明亦涵蓋可用於合成本發明化合物之中間體及製程。

如本文所用之術語「治療(treating)」(或「treat」或「treatment」)係指遏製、減緩、停止或逆轉現有症狀、病狀或病症之進展或嚴重性。

術語「脊椎關節疾病」係指通常涉及脊柱及其中韌帶與肌腱附接至骨之區域之若干慢性關節疾病。脊椎關節疾病(spondylarthropathies)有時亦稱為脊椎關節疾病(spondyloarthropathies)或脊椎關節炎。

術語「血清陰性」係指類風濕因子為陰性之疾病。

本發明化合物可反應形成醫藥上可接受之鹽。醫藥上可接受之鹽及用於製備其之通常方法為業內所熟知。參見(例如)P.Stahl等人，Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection and Use，第二修訂版(Wiley-VCH,2011)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。

熟習此項技術者將瞭解，如式(I)所顯示之本發明化合物或其醫藥上可接受之鹽包括含有如下文由*表示之至少兩個對掌性中心之核心：

儘管本發明涵蓋所有個別鏡像異構物以及該等化合物之鏡像異構物之混合物(包含外消旋物)，但本發明之較佳化合物由下式(II)表示：或其醫藥上可接受之鹽。

熟習此項技術者亦將瞭解，所有對掌性中心之坎-殷高-普利洛(Cahn-Ingold-Prelog)(R)或(S)名稱將端視特定化合物之取代模式而變化。單一鏡像異構物或非鏡像異構物可以對掌性試劑開始或藉由立體選擇性或立體特異性合成技術而製備。或者，單一鏡像異構物或非鏡像異構物可在本發明化合物之合成中之任一方便點處藉由標準對掌性層析或結晶技術自混合物分離。本發明化合物之單一鏡像異構物係本發明之較佳實施例。

本發明化合物較佳調配為藉由多種途徑投與之醫藥組合物。此等醫藥組合物及製備其之製程為業內所熟知。參見(例如)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(A.Gennaro等人編輯，第21版，Mack Publishing Co.，2005)。更特定地較佳地係包括以下各項之醫藥組合物：下式化合物或其醫藥上可接受之鹽及一或多種醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。

本發明之尤其較佳實施例係關於化合物(5’S)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲醯胺：或其醫藥上可接受之鹽。

本發明之另一尤其較佳實施例係關於化合物，

本發明化合物通常在寬劑量範圍內有效。例如，每日劑量在約1mg至1g之範圍內。在一些情形下，低於上述範圍下限之劑量含量可能係過量的，然而在其他情形下可採用更大劑量同時維持有利益處/風險概況，且因此以上劑量範圍並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。應瞭解，該化合物之實際投與量將由醫師根據相關情況來確定，包含欲治療之病狀、所選投與途徑、投與之一或多種實際化合物、個別患者之年齡、體重及反應及患者症狀之嚴重性。

個別異構物、鏡像異構物及非鏡像異構物可由熟習此項技術者在式I化合物之合成中之任一便利點處藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析來分離或拆分(參見(例如)J.Jacques等人，「Enantiomers,Racemates,and Resolutions」，John Wiley and Sons,Inc.，1981及E.L.Eliel及S.H.Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds」，Wiley-Interscience,1994)。名稱「異構物1」及「異構物2」係指分別自對掌性層析第一及第二溶析出之化合物，且若對掌性層析起始於合成早期，則相同名稱適用於隨後中間體及實例。

另外，本文所述之某些中間體可含有一或多個保護基團。端視特定反應條件及欲實施之特定轉變，可變保護基團在每次出現時可相同或不同。保護及去保護條件為熟習此項技術者所熟知且闡述於文獻中(參見(例如)「Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis」，第4版，Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene，John Wiley and Sons,Inc.2007)。

某些縮寫係定義如下：「AUC」係指曲線下面積；「BSA」係指牛血清白蛋白；「CFA」係指完全弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)；「DBA」係指淺褐色非野鼠色；「DCM」係指二氯甲烷；「DPBS」係指杜爾貝寇磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)；「DMEM」係指杜爾貝寇改良之伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)；「DMSO」係指二甲亞碸；「EC₅₀」係指半最大反應之有效濃度；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「Et₂O」係指乙醚；「EtOH」係指乙醇(ethyl alcohol或ethanol)；「ee」係指鏡像異構物過量；「Ex」係指實例；「FBS」係指胎牛血清；「G」係指重力；「GAL」係指β-半乳糖苷酶DNA結合域；「GPI」係指葡萄糖-6-磷酸異構酶；「HEC」係指羥乙基纖維素；「HEK」係指人類胚腎；「HEPES」係指4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸；「IC₅₀」係指試劑產生50%之彼試劑可能之最大抑制反應之濃度；「IL」係指介白素；「IPA」係指異丙醇(isopropyl alcohol或isopropanol)；「Kd」係指解離常數；「Ki」係指抑制常數；「MeOH」係指甲醇(methyl alcohol或methanol)；「MEM」係指最低必需培養基；「PBMC」係指外周血液單核細胞；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「Prep」係指製備；「RAR」係指視黃酸受體；及「RPMI」係指羅斯威爾派克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)。「R_t」係指滯留時間；「SCX」係指強陽離子交換；「SFC」係指超臨界流體層析；且「THF」係指四氫呋喃。

本發明化合物或其鹽可藉由業內已知之多種程序來製備，其中一些程序說明於下文之製備及實例中。所述路徑之每一者的具體合成步驟可以不同方式組合以製備本發明化合物或其鹽。下文每一步驟之產物可藉由業內熟知之習用方法回收，該等方法包含萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。熟習此項技術者可容易地獲得試劑及起始材料。

以下製備及實例進一步說明本發明且表示本發明化合物之典型合成。

製備及實例

製備1

1-(3-噻吩基)丙-2-酮

將2-(3-噻吩基)乙酸(26.5g,146.5mmol)懸浮於乙酸酐(87.9mL,913mmol)中並添加1-甲基咪唑(7.57g,91.3mmol)。在室溫下在氮存在下將反應混合物攪拌4小時。將反應混合物冷卻至0℃，添加水(150mL)並攪拌1小時。利用EtOAc(300mL)稀釋溶液並相繼用2M NaOH(2×200ml)、水(200mL)及鹽水(200mL)洗滌。分離有機萃取物相，經硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮至乾燥以獲得呈黃色油狀物之標題化合物(28.16g,77%)。¹H NMR(400.13MHz,CDCl₃)δ 2.14(s 3H)，3.7(s,2H)，6.94(d,J=5.1Hz,1H)，7.08(bs,1H)，7.29-7.26(m,1H)。

製備2

1-(3-噻吩基)丙-2-醇

將無水MeOH(63mL)添加至硼氫化鈉(1.61g,41.67mmol)並在添加MeOH同時使反應混合物冷卻至-10℃。進一步冷卻至-20℃並經40分鐘逐滴添加1-(3-噻吩基)丙-2-酮(4.92g,33.34mmol)於無水MeOH(26.7mL)中之溶液並在-20℃下攪拌1.5小時，然後在室溫下攪拌17小時。使溶液冷卻至-5℃(內部溫度)並利用氯化銨飽和溶液(15ml)、然後利用1N HCl(15mL)中止反應。添加水(30mL)及EtOAc(100mL)。使混合物在減壓下濃縮至1/3之總體積。利用EtOAc(2×100mL)萃取混合物。將有機萃取物合併並經硫酸鎂乾燥，過濾並濃縮至乾燥以得到標題化合物(4.74g,100%)。質譜(m/z)：125(M-OH+H)，164.8(M+Na)。

替代製備2a

在0℃下經30分鐘將硼氫化鈉(7.06g,182.8mmol)分批添加至1-(3-噻吩基)丙-2-酮(28.16g,140.6mmol)於MeOH(282mL)中之溶液並在室溫下攪拌過夜。濃縮至乾燥，利用EtOAc(200mL)稀釋並利用氯化銨之飽和溶液(150mL)洗滌。利用EtOAc(2×200mL)萃取水層。將有機萃取物合併，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠急速層析利用MeOH：DCM(0：100至5：95)溶析來純化殘留物，以得到呈淺紅色油狀物之標題化合物(12.85g,64%)。質譜(m/z)：125(M-OH+H)。

製備3

(2S)-1-(3-噻吩基)丙-2-醇

將3-溴噻吩(6.88g,42.2mmol)溶解於無水THF(10mL)及甲苯(100mL)中。冷卻至-78℃。經15分鐘經由注射器向其中添加第二丁基鋰(1.3mol/L於環己烷中，34mL,44mmol)。使溫度維持在<-60℃，攪拌10分鐘，然後逐滴添加(2S)-2-甲基環氧乙烷(4.9g,84.4mmol)。5分鐘後，經15分鐘經由滴液漏斗添加三氟化硼-乙醚錯合物(5.3mL,42mmol)。使溫度維持在<-55℃。添加完成後，在-78℃下攪拌2小時。在-78℃下利用碳酸氫鈉飽和溶液中止反應，添加Et₂O並升溫至環境溫度。利用碳酸氫鈉飽和溶液(2×)、隨後飽和鹽水洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠急速層析利用15% EtOAc/己烷溶析純化以得到標題化合物(3.85g，64.2%)。再純化混合溶出份以得到呈無色液體之標題化合物之總量(4.29g,71.5%)。¹H NMR(400.13MHz,CDCl₃)δ 7.28-7.26(dd,J=2.9,5.0,1H)，7.03-7.01(m,1H)，6.96(dd,J=1.2,4.9,1H)，4.04-3.95(m,1H)，2.83-2.68(m,2H)，1.63(s,1H)，1.22(d,J=6.2,3H)，OR[α]²⁰D +25.50(c 1.00,CHCl₃)。

製備4

(5'S)-5'-甲基-4',5'-二氫螺[六氫吡啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]

將4-側氧基六氫吡啶-1-甲酸第三丁酯(6.50g,32.6mmol)及(2S)-1-(3-噻吩基)丙-2-醇(4.64g,32.6mmol)溶解於DCM(100mL)中。添加三氟乙酸(20mL,264.5mmol)。將混合物在環境溫度下攪拌18小時。將混合物在減壓下濃縮，且然後添加水及Et₂O。利用水洗滌有機層，將水性洗滌液合併，且然後利用固體碳酸鈉調整pH至鹼性。利用固體氯化鈉使水層飽和，然後利用EtOAc(5×)洗滌水層。將EtOAc層合併，用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮以得到呈淺黃色油狀物之標題化合物(4.61g,63%)。質譜(m/z)：224.2(M+H)。

製備5

(5’S)-5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯

將(5'S)-5'-甲基-4',5'-二氫螺[六氫吡啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃](10.39g,46.53mmol)溶解於DCM(100mL)中。逐滴添加二碳酸二-第三丁酯(11.52mL,51.18mmol)並將混合物在環境溫度下攪拌1.5小時。添加額外的二碳酸二-第三丁酯(2.00mL,9.17mmol)並攪拌30分鐘，然後在減壓下濃縮。添加咪唑(2.21g,32.5mmol)以消除過量的二碳酸二-第三丁酯(Synthesis,2001，第4期，550)。添加Et₂O並用鹽水洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠急速層析利用10% EtOAc/己烷溶析來純化。藉由矽膠急速層析利用15% EtOAc/己烷溶析再純化，以得到呈無色油狀物之標題化合物(12.92g,86%)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ 7.33(d,J=5.1,1H)，6.77(d,J=5.1,1H)，3.92-3.72(m,3H)，3.15-2.91(s,2H)，2.62(dd,J=15.8,3.0,1H)，2.30(dd,J=15.8,10.6,1H)，2.1(m,1H)，1.76-1.63(m,2H)，1.51-1.40(m,1H)，1.38(s,9H)，1.24(d,J=6.2,3H)，100% ee，基於SFC層析、Lux Amylose-2、5mL/min、225nm，R_t=1.75min，OR[α]²⁰D +82.1(c 1.00,CHCl₃)。

製備6

5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯

在0℃下將三氟乙酸(34.16mL,451.8mmol)逐滴添加至1-(3-噻吩基)丙-2-醇(12.85g,90.35mmol)及4-側氧基六氫吡啶-1-甲酸第三丁酯(23.40g,117.5mmol)於無水DCM(135mL)中之溶液並在室溫下保持攪拌17小時。使混合物濃縮至乾燥，用MeOH稀釋殘留物且然後在減壓下去除溶劑。將殘留物吸收於MeOH中並藉由離子交換層析純化。將含有期望產物之層合併並在減壓下與甲苯(3×)共蒸發來濃縮，以得到呈淺橙色固體之粗5-甲基螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-六氫吡啶]。將4-二甲基胺基吡啶(2.23g,18.07mmol)及三乙胺(37.8mL,271.1mmol)逐滴添加至冷卻至0℃之5-甲基螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-六氫吡啶](20.18g,90.35mmol)於無水DCM(90.35mL)中之溶液中。向其中添加二碳酸二-第三丁酯(30.49g,135.5mmol)於無水DCM(27.1mL)中之溶液。在室溫下攪拌過夜。添加水(100mL)，利用DCM(3×100mL)萃取水層，利用鹽水(100mL)洗滌並在減壓下濃縮。藉由矽膠急速層析利用EtOAc：異己烷(0：100至20：80)溶析來純化。使殘留物與DCM(3×)共蒸發以得到呈白色固體之標題化合物(27.64g,92.7%)。質譜(m/z)：346(M+Na)

替代製備6a

在0℃下將三氟乙酸(20.17mL,266.72mmol)逐滴添加至1-(3-噻吩基)丙-2-醇(4.74g,33.34mmol)及4-側氧基六氫吡啶-1-甲酸第三丁酯(7.80g,38.34mmol)於無水DCM(100mL)中之溶液並在室溫下攪拌過夜。使混合物濃縮至乾燥並利用MeOH稀釋殘留物。藉由離子交換層析純化粗材料。將含有期望產物之層合併並在減壓下與DCM(3×)共蒸發來濃縮，以得到粗5-甲基螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-六氫吡啶](8.17g)。將4-二甲基胺基吡啶(0.831g,6.67mmol)及三乙胺 (9.29mL,66.68mmol)添加至冷卻至0℃之5-甲基螺[4,5-二氫噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-六氫吡啶](8.17g)於無水DCM(66.7mL)中之溶液中。向其中逐滴添加二碳酸二-第三丁酯(18.19g,83.35mmol)於無水DCM(16.7mL)中之溶液。在室溫下攪拌3天。添加水(60mL)，利用DCM(3×50mL)萃取水層，利用鹽水(20mL)洗滌，藉助相分離器過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠急速層析利用EtOAc：異己烷(0：100至20：80)溶析來純化殘留物。使殘留物與DCM(2×)共蒸發以得到標題化合物(9.41g,80%)。質譜(m/z)：346(M+Na)

製備7

1-(第三丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸

將5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯(7.16g,21.71mmol)溶解於THF(108.5mL)中並冷卻至-78℃。經20分鐘向其中逐滴添加丁基鋰(2.5M於己烷中，13mL,32.56mmol)並在添加完成後將混合物再攪拌30分鐘。經由套管以CO₂鼓泡並在此溫度下利用連續添加CO₂維持攪拌1小時。利用連續添加CO₂經2小時使反應液升溫至0℃並利用水(80mL)小心地驟冷。將反應混合物傾倒於水中並利用Et₂O(100mL)萃取水層。利用2N NaOH(3×15mL)及水(50mL)洗滌有機相。利用2N HCl(3×)使水層酸化至pH=6，並利用EtOAc萃取。將有機萃取物合併並利用鹽水(50mL)洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以獲得呈灰白色固體之標題化合物 (7.89g,97%)。質譜(m/z)：390(M+Na)。

製備8

1-(第三丁氧基羰基)-4',5'-二氫螺[六氫吡啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2'-甲酸

將4',5'-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯(如J.Med.Chem.,2011,54,(8)，第2687-2700頁及WO2011060035中所述製備)(10g,32.32mmol)溶解於THF(100mL)中並冷卻至-78℃。經15分鐘向其中逐滴添加丁基鋰(22.22mL,35.55mmol)並在添加完成後將混合物再攪拌15分鐘。經由套管以CO₂鼓泡並利用連續添加CO₂使混合物升溫至室溫。2小時後，使混合物冷卻至0℃並添加水、隨後Et₂O。利用1N NaOH鹼化水層並利用1N NaOH(3×)洗滌有機層。將鹼性洗滌液合併並利用5N HCl酸化至pH 2。利用EtOAc(3×)洗滌水層，將有機萃取物合併並利用鹽水洗滌。經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮以得到呈白色固體之標題化合物(11.11g,97.27%)。質譜(m/z)：352.2(M-H)。

製備9

(5’S)-1-(第三丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸

將(5’S)-5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯(11.19g,34.60mmol)溶解於無水THF(200mL)中並冷卻至-78℃。經20分鐘逐滴添加正丁基鋰(21mL,34.64mmol)。添加完成後，在-78℃下攪拌20分鐘，然後經由套管以CO₂氣體鼓泡60分鐘。利用連續添加CO₂使混合物升溫至室溫。在室溫下攪拌1小時後，利用水(3mL)驟冷並在減壓下濃縮至25%體積。添加Et₂O及水。利用水(2×)洗滌並將水性洗滌液合併。利用1N HCl調整pH至酸性。利用氯化鈉使水層飽和並利用EtOAc(2×)萃取。將EtOAc萃取物合併，利用鹽水洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮以得到呈白色泡沫狀之標題化合物(13.40g,100%)。質譜(m/z)：366(M-H)。

製備10

5-(乙硫基)吡啶-2-甲腈

將5-溴吡啶-2-甲腈(49.42g,270.1mmol)及碳酸鉀(113.5g,821.2mmol)溶解於1-甲基-2-吡咯啶酮(280mL)中並經30分鐘分多次添加乙硫醇(26.4mL,356mmol)，使得溫度保持低於50℃。將反應液冷卻至室溫並攪拌過夜。利用EtOAc(1200mL)及水(2200mL)稀釋。收集有機層並利用鹽水(3×300mL)洗滌，有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以得到呈灰白色固體之標題化合物(44.87g,100%)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ 8.63(s,1H)，7.93(s,2H)，3.17(q,J=7.3,2H)，1.29(t,J=7.3,3H)。

製備11

5-(乙基磺醯基)吡啶-2-甲腈

將5-(乙硫基)吡啶-2-甲腈(44.36g,270.1mmol)溶解於無水DCM(540mL)中並冷卻至-20℃。經1小時以10-12克分多次添加3-氯過氧苯甲酸(130g,565.0mmol)，同時將內部溫度維持在0℃與-10℃之間。在冷浴中攪拌反應混合物使其升溫至室溫過夜。利用1N NaOH(1L)、水、1N NaOH(2×500mL)及鹽水洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮，以得到呈白色固體之標題化合物(49.52g,93%)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ 9.20(d,J=1.9,1H)，8.56(dd,J=2.0,8.1,1H)，8.36(d,J=8.1,1H)，3.52(q,J=7.3,2H)，1.16(t,J=7.5,3H)。

製備12

1-[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲胺鹽酸鹽

將5-(乙基磺醯基)吡啶-2-甲腈(49.52g,252.4mmol)分成三份16.5g之部分。在N₂下在2250mL帕爾(Parr)瓶中將10% Pd/C(1.65g,15.5mmol)添加至容器中並利用MeOH(750mL)潤濕。向其中添加溶解於MeOH(750mL)中之5-(乙基磺醯基)吡啶-2-甲腈(16.5g,84.09mmol)。向其中添加HCl(6N水溶液，17.1ml,102.6mmol)。將瓶密封，利用N₂吹掃，利用H₂吹掃並在室溫下加壓至68.9kPa保持3小時。利用N₂吹掃並然後過濾混合物。對5-(乙基磺醯基)吡啶-2-甲腈之剩餘部分重複以上步驟。將所有濾液合併並在減壓下濃縮，以得到呈米色固體之標題化合物(59.61g,99%)。質譜(m/z)：201(M+H-HCl)。

製備13

2’-({[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}胺甲醯基)-5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯

將1-[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲胺鹽酸鹽(3.1g,13mmol)、1-(第三丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸(3.9g,10mmol)溶解於無水DCM(52mL)中。冷卻至0℃並逐滴添加三甲胺(10mL,73mmol)，隨後添加2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷-2,4,6-三氧化物(8.6g,14mmol)於EtOAc中之1.67M溶液。使混合物升溫至室溫並攪拌過夜。小心地添加水(50mL)並在室溫下攪拌10分鐘。利用DCM(2×)萃取水層，然後將有機萃取物合併。利用鹽水洗滌有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮。利用矽膠層析利用50%至100% EtOAc/己烷梯度溶析純化粗材料，以得到呈黃色泡沫狀之標題化合物(4.89g,83%)。質譜(m/z)：550(M+H)。

製備14

(5’S)-2’-({[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}胺甲醯基)-5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯

將1-[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲胺鹽酸鹽(2.86g,10.5mmol、 (5’S)-1-(第三丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸(3.50g,9.52mmol)及1-羥基苯并三唑(1.44g,10.5mmol)溶解於無水THF(100mL)及二甲基甲醯胺(50mL)中。添加N,N-二異丙基乙胺(4.98mL,28.6mmol)，隨後添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽並使其在室溫下攪拌過夜。在減壓下濃縮至約40%體積，然後添加EtOAc。利用碳酸氫鈉飽和溶液(2×)、水(2×)、鹽水(2×)洗滌，有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮。利用80% EtOAc/己烷於矽膠上層析以得到呈灰色泡沫狀之標題化合物(4.51g,86%)。質譜(m/z)：550(M+H)。

製備15

N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲醯胺二鹽酸鹽

將2’-({[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}胺甲醯基)-5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯(0.95g,1.68mmol)溶解於MeOH(10mL)中並添加於二噁烷中之4M HCl(4.5mL,18mmol)。在室溫下攪拌1小時，然後在減壓下濃縮以得到呈白色固體之標題化合物(0.86g,100%)。質譜(m/z)：450(M+H-2HCl)。

製備16

(5’S)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲醯胺二鹽酸鹽

將(5’S)-2’-({[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}胺甲醯基)-5’-甲基-4’,5’-二氫-1H-螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸第三丁酯(1.14g,2.0mmol)溶解於1,4-二噁烷(10mL)及MeOH(5mL)中。添加於二噁烷中之4M HCl(5.0mL,20mmol)並在室溫下攪拌2小時。濃縮至約10mL，然後添加Et₂O並劇烈攪拌過夜。添加己烷，過濾並利用己烷沖洗以得到呈淡黃色固體之標題化合物(0.99g,91%)。質譜(m/z)：450(M+H-2HCl)。

製備17

1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙醇

將2-(三氟甲基)嘧啶-5-甲醛(11.31mmol,1.992g)溶解於THF(56.56mL)中，冷卻至0℃並緩慢添加甲基溴化鎂(3M於Et2O中)(33.94mmol,11.31mL)。使反應液升溫至室溫並攪拌2.5小時。利用1N HCl使反應液驟冷。添加EtOAc並利用1N HCl洗滌。有機物經硫酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮以得到標題化合物(1.663g,76.5%)。質譜(m/z)：193.0(M+H)。

製備18

5-(1-溴乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶

將1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙醇(8.655mmol,1.663g)及三苯基膦(12.98mmol,3.405g)溶解於DCM(86.55mL)中並在室溫下添加N-溴琥珀醯亞胺(12.98mmol,2.311g)。3小時後，將反應液在減壓下濃縮。經由矽膠層析利用10% EtOAc/己烷溶析來純化所得殘留物，以得到標題化合物(1.641g,74.34%)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ 9.26(s,2H)，5.63(q,J=7.0Hz,1H)，2.09(d,J=7.0Hz,3H)。

實例1

N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺

將N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲醯胺二鹽酸鹽(1.12g,2.31mmol)溶解於乙腈(11.6mL)及二異丙基乙胺(2.42mL,13.9mmol)中並添加5-(1-溴乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶(0.71g,2.77mmol)。將混合物在60℃下加熱90分鐘，然後冷卻至環境溫度並在減壓下濃縮。將粗混合物溶解於MeOH(5mL)中，然後加載至50g SCX管柱上。利用MeOH(150mL)沖洗且然後利用2N氨/MeOH(150mL)溶析產物。將氨 /MeOH洗滌液在減壓下濃縮成橙色泡沫狀物。利用矽膠層析利用100% DCM至95% DCM/MeOH梯度溶析來層析粗材料，以得到標題化合物(1.54g,43%)。質譜(m/z)：624(M+H)。

實例2

(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺

實例3

(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺

實例4

(5R’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺異構物1

實例5

(5R’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺異構物2

將N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺(1.28g,2.05mmol)溶解於MeOH(58.5mL)中。藉由SFC[AD-IC管柱(30×250mm,5μm)並利用50% IPA(20mM NH₃)以120mL/分鐘溶析，每10分鐘注射4.5mL(200mg)]經由對掌性層析分離以得到實例5(即，(5R’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺異構物2)及含有實例2(即，(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺)、實例3(即，(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺)及實例4(即，(5R’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺異構物1)之混合溶出份。將混合溶出份濃縮並將其溶解於MeOH(55.5mL)中。藉由SFC[OJ-H管柱(30×250mm,5μm)並利用22% MeOH(20mM NH₃)以160mL/分鐘溶析，每5分鐘注射5.0mL]經由對掌性層析分離混合物以得到實例4(即，(5R’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺異構物1)及含實例3(即，(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺)與實例2(即，(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺)之混合物。將混合溶出份濃縮並將其溶解於MeOH(30.0mL)中。藉由SFC[AD-H管柱(50×250mm,5μm)並利用50% IPA(20mM NH₃)以200mL/min溶析，每32分鐘注射3.0mL]經由對掌性層析分離混合物以得到實例2(即，(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺及實例3(即， (5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲醯胺。將每組純淨溶出份濃縮，然後將經分離之產物溶解於乙腈(0.6mL)中，添加水，在-78℃下冷凍並凍乾以得到實例2(0.214g，16%，99.5% ee，R_t=2.94分鐘，質譜(m/z)：624(M+H))。實例3(0.203g，15%，98.9% ee，R_t=2.75分鐘，質譜(m/z)：624(M+H))。實例4(0.251g，17%，98.3% ee，R_t=4.75分鐘，質譜(m/z)：624(M+H))。實例5(0.272g，18%，100% ee，R_t=4.33分鐘，質譜(m/z)：624(M+H))。分析條件：SFC(220nm UV)，管柱：AD-IC 30×250mm,5μm，移動相：50% IPA(20mM NH₃)。對掌性LC分析條件：SFC(225nm UV)，管柱Chirocel OJ-H，20% MeOH(0.2%異丙胺)/CO₂、5mL/min。

實例2之替代製備

及實例3之替代製備

將(5S’)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’,二氫螺[六氫吡啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲醯胺二鹽酸鹽(28.28g,58.19mmol)溶解於乙腈(280mL)及二異丙基乙胺(50mL,290.9mmol)中並添加5-(1-溴乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶(0.71g,2.77mmol)，然後在環境溫度下攪拌過夜。在減壓下濃縮，然後將粗混合物溶解於DCM中並利用矽膠層析用100% EtOAc溶析來純化，以得到標題化合物之混合物。經由對掌性層析[Chiralpak IA管柱(8×40.5cm,225nm)並利用40%乙腈/60%異丙醇(具有0.2%二甲基乙胺)以400mL/分鐘溶析，注射20mL(2000mg)]來分離。將每一非鏡像異構物在減壓下濃縮，然後溶解於熱乙醇(250mL)中，熱過濾，然後冷卻至環境溫度並利用冷乙醇沖洗。在真空烘箱中在55℃下乾燥固體以得到呈結晶材料之實例2(9.94g，27%，90.8% ee，R_t=3.93分鐘，質譜(m/z)：624(M+H))及實例3(9.42g，26%，98.8% ee，R_t=9.25分鐘，質譜(m/z)：624(M+H))。分析條件：Chiralpak IA管柱(4.6×150mm,225nm)並利用40%乙腈/60%異丙醇(具有0.2%二甲基乙胺)以1mL/分鐘溶析。

X-射線繞射，實例3

在23℃下將單晶體安裝於薄MiTeGen纖維上。使用CuKα輻照源(λ=1.54178Å)及配置有SMART 6000CCD面積檢測器之基於3環測角儀繞射計之Bruker D8(Bruker-AXS.SHELXTL(V2013 6.2)Madison,Wisconsin,USA)收集數據。使用SAINT程式V8.32b實施晶胞精修及數據簡化(Sheldrick,G.M.,(2008),SHELXS-97,Acta Cryst.A64,112-122)。指示具有單斜晶參數a=10.1624(2)Å、b=9.9080(2)Å、c=15.1085(3)Å及α=90°、β=100.6879(14)°、γ=90°之單位晶胞。晶體結構之晶胞體積係1494.87(5)Å³。在23℃下結構之計算密度係1.386g/cm³。藉由直接法解出結構(Sheldrick,G.M.,(2008),SHELXS-97,Acta Cryst.A64,112-122)。所有原子參數均獨立地精修。空間群選擇(即P2₁)係藉由對F²之全矩陣最小平方精修之成功收斂來確認(Sheldrick,G.M.,(2013),SHELXL-2013，Program for crystal structure refinement，Institute fur anorg chemie,Göttingen,Germany)，其中最終擬合優度為1.088。最終殘差因子R₁=0.0771且最終精修循環後之最大差異峰值及谷值分別係0.315及-0.333(e.A^-3)。絕對結構參數精修至0.072(17)。

實例3之結構經測定且分子結構與實例3所顯示者一致。應注意，晶體結構具有高品質且藉由使用結構中重原子(硫)之異常散射貢獻建立實例3之對掌性中心之絕對立體化學，C5為(S)且C1為(R)，遠離六氫吡啶基。絕對構型係根據晶體結構確定為(5'S)-N-{[5-(乙基磺醯基)吡啶-2-基]甲基}-5'-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4',5'-二氫螺[六氫吡啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2'-甲醯胺構型。

生物分析

RORa、b及g結合抑制劑

使用經His標記之人類RAR相關孤兒受體α(hRORa)、人類RAR相關孤兒受體β(hRORb)及人類RAR相關孤兒受體γ(hRORg)用於受體-配體競爭結合分析以測定K_i值。典型程序提供於下文。

受體競爭結合分析係於由DPBS(1L)(Hyclone #SH30028.03)、 2.2g BSA Fraction v(Roche #9048-46-8)、100mL甘油(Fischer #56-81-5)及40mL DMSO(試劑級)構成之緩衝劑中運行。最終孔含有20μg/mL抑肽酶及20μg/mL亮抑肽酶及10μM Pefabloc。通常，受體結合分析包含經放射性標記之配體(例如用於α結合之7nM[³H]-25-羥基膽固醇、用於β結合之20nM[³H]-3-[[4-[[3-(2,6-二氯苯基)-5-異丙基-異噁唑-4-基]甲氧基]-N,2-二甲基-苯胺基]甲基]苯甲酸及用於γ結合之6nM[³H]-25-羥基膽固醇)及每孔0.5μg RORa受體、0.03μg RORb受體或0.13μg RORg受體。分析通常以96-孔格式運行。競爭測試化合物係以在約0.4nM至25μM範圍內之多個濃度添加。非特異性結合係在用於RORa及RORg結合之250nM 25-羥基膽固醇、用於RORb結合之250nM 3-[[4-[[3-(2,6-二氯苯基)-5-異丙基-異噁唑-4-基]甲氧基]-N,2-二甲基-苯胺基]甲基]苯甲酸之存在下測定。將樣品、標記及受體溶液合併於96孔分析板(Costar 3632)中並在室溫下培育過夜，然後將25μl珠粒(Amersham YSi(2-5微米)銅His-標籤Spa珠粒，#RPNQ0096)以1mg/孔之最終珠粒濃度添加至每一反應中。在室溫下在定軌振盪器上將板混合30分鐘。培育4小時後，於Wallac MICROBETA®計數器中讀取板。

數據用於使用4參數邏輯擬合計算估計之IC₅₀。針對RORa及RORg之[³H]-25-羥基膽固醇及針對RORb結合之[³H]-3-[[4-[[3-(2,6-二氯苯基)-5-異丙基-異噁唑-4-基]甲氧基]-N,2-二甲基-苯胺基]甲基]苯甲酸之Kd係藉由飽和結合測定。使用鄭-普魯薩福(Cheng-Prushoff)方程將化合物之IC₅₀值轉換為Ki。

以下例示化合物之結果顯示於下表2中。

平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差

該等結果展現表2之化合物對於RORg相對於RORa及RORb具有選擇性。

HEK293 RORg GAL4受體-報導基因分析

作為反向激動劑活性之指示劑，RAR-相關孤兒受體γ(RORg)受體-報導基因分析(RORg-GAL4/pGL4.31)係於HEK293細胞中實施。HEK293細胞使用Fugene^TM試劑進行共轉染。將含有GAL4結合域及螢火蟲螢光素酶基因之最小腺病毒啟動子上游之報導質體與持續表現融合至酵母GAL4 DNA結合域之人類RORg配體結合域之質體共轉染。將細胞在T150cm²燒瓶中在無FBS之MEM培養基中轉染。培育18小時後，使經轉染之細胞胰蛋白酶化，將其平鋪於96-孔微量滴定板中於含有10% FBS之3：1 DMEM-F12培養基中，培育4小時且然後暴露於約0.05nM至10μM範圍內之多個濃度之測試化合物中。用化合物培育18小時後，將細胞溶解並使用標準技術量化螢光素酶活性。將數據擬合至4參數擬合邏輯以測定IC₅₀值。

以下例示化合物之結果顯示於下表3中。

平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差

該等結果展現表3之化合物係人類RORg受體之反向激動劑。

PBMC IL-17分泌ELISA及Cell TiterGlo存活分析

PBMC係藉由首先將新鮮的膚色血球層與等體積之磷酸鹽緩衝鹽水合併而自全血膚色血球層分離。然後將35mL之PBS/膚色血球層溶液輕柔地覆蓋於50mL錐形管中15mL Ficoll上。以500×g(具有緩慢加速及減速)離心30分鐘後，丟棄上層血漿並沿Ficoll界面收集細胞層並將其彙集。每一250mL管用室溫RPMI-1640培養基填充至頂部。以500×G(具有緩慢加速及減速)將管旋轉10分鐘，藉由抽吸去除培養基並重複洗滌步驟。將細胞再懸浮於冰上之來自Life Technologies(目錄編號12648-010)之冰冷Recovery細胞培養冷凍培養基上。將細胞濃度調整至66.7百萬個細胞/mL。將細胞以-1℃/分鐘在具有100百萬細胞之小瓶中緩慢冷凍並儲存於液氮中。

IL-17分泌之刺激及化合物添加

藉由利用1mL完全培養基(RPMI-1640，含有30mM HEPES、100單位/mL青黴素、100μg/mL鏈黴素、3.25mM L-麩醯胺酸、0.2μM β-巰基乙醇及10% FBS)再懸浮以解凍PBMC，隨後在輕柔渦漩的同時逐滴添加2mL、4mL、8mL及16mL之完全培養基。使細胞旋轉減慢5分鐘且將細胞糰粒再懸浮於完全培養基中。藉由使細胞溶液運行穿過23號注射器針頭及40μM細胞濾器使細胞團塊破碎。將每孔10萬細胞添加至384孔聚苯乙烯經組織培養物處理之平底板中，總共30μL。將於完全培養基中製備之含有抗人類CD3抗體、抗人類CD28抗體、IL-23及化合物之刺激混合物以30μL總體積同時添加至細胞中。所添加刺激物之最終濃度對於抗CD3抗體、抗CD28抗體及IL-23分別係160ng/mL、500ng/mL及5ng/mL且DMSO為0.3%。將板利用AERASEAL®密封膜密封並在37℃、95%濕度及5% CO₂下培育48小時。

培育期後，將板以200×g旋轉5分鐘。上清液利用等體積1% BSA/PBS 1：1稀釋且利用來自R&D系統之人類IL-17 ELISA套組(目錄編號D317E)根據套組提供之方案(其中1個例外，使用比色受質OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽，Sigma目錄編號P6912)代替套組中供給之受質)測試IL-17。利用Envision多標記板讀取器量測492nm下之吸光度。基於如下所示之IL-17標準曲線將A492值轉換為IL-17之濃度：

pg/mL IL-17=EC50*[[(極大值-極小值)/(A492-極小值)]-1](1/-希爾係數(Hill))。IL-17分泌抑制之IC₅₀係基於經轉換值使用標準4參數擬合來計算，其中最大抑制係自無添加之刺激物及化合物之孔之平均值測定且最小抑制係自僅具有刺激物而無添加之化合物之孔之平均值測定。

將等體積之Cell TITERGLO®細胞存活測試試劑(Promega目錄號G7573)添加至板中剩餘之細胞並在室溫下輕柔振盪的同時培育15分鐘後，利用Envision多標記板讀取器量測發光。細胞死亡百分比係藉由將100%活性(細胞死亡)設定為0發光單元且最小活性(最大數目之活細胞)設定為僅含有刺激物而無添加之化合物之孔之平均發光單元來計算。使用標準4參數擬合計算IC₅₀。

以下例示化合物之結果顯示於下表4中。

平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差

該等結果顯示表4之化合物抑制在PBMC中經抗CD3/抗CD28/IL-23刺激之IL-17分泌並無顯著細胞毒性效應。

葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)誘導之關節炎模型：

GPI誘導之關節炎模型係改編自K.Iwanami等人Arthritis Rheumatism 58,754-763,2008及D.Schubert等人J Immunology 172,4503-4509,2004。小鼠(8至9週齡雄性DBA/1小鼠)(Harlan)基於在免疫之日(第0天)收集之體重隨機指派至治療組中。在免疫之日(第0天)，將重組人類GPI(於PBS中稀釋至4mg/mL,Gibco)及完全弗氏佐劑(CFA,Sigma)之1：1(v：v)混合物在冷室中在高速均質機(Omni)上混合40分鐘。在乳液中達成2mg/mL GPI之最終濃度。小鼠在尾巴基部處注射GPI乳液(2個注射位點，經皮下，每一位點100μL)。在免疫之同一天(第0天)開始經口投用測試化合物。在第0天開始，每隻爪基於0至3評分系統對關節腫脹之嚴重性進行評分(參見K.Iwanami等人Arthritis Rheumatism 58,754-763,2008)。臨床得分代表所有4隻爪之總得分(最大得分=12)。在第0、2、4、7、8、9、10、11、12、14、16、18及21天評價臨床得分。

AUC係藉由梯形法針對自免疫之日(第0天)至第21天隨時間之臨床得分來計算。測試p值係源自學生t-測試(Student’s t-test)。

實例3(1000mg/Kg)及媒劑(於純化水中之1% HEC、0.25%聚山梨醇酯80及0.05%消泡劑)治療(n=8隻/組)起始於第0天且每天1次經口投與。與媒劑組相比，實例3減小爪腫脹之嚴重性及在疾病過程中維持較低之平均臨床得分。此效應導致臨床得分AUC(爪腫脹隨時間之累計量測)減少75%，此與媒劑組相比係統計上顯著的，如表5中所顯示。

值顯示為平均值±SEM。*p<0.05相對於媒劑(學生t-測試)。SEM=平均值之標準誤差

Claims

一種下式之化合物，或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係下式之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
如請求項1或2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係式之化合物。
如請求項1或2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於療法。
如請求項1或2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療牛皮癬。
如請求項1或2之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療血清陰性脊椎關節疾病。
如請求項6之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療軸心型脊椎關節炎、關節黏連性脊椎炎或牛皮癬關節炎。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽，與一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。
如請求項8之醫藥組合物，其包括一或多種其他治療劑。
一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療牛皮癬之藥劑。
一種如請求項1至3中任一項之化合物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造治療血清陰性脊椎關節疾病之藥劑。
如請求項11之用途，其用於製造治療軸心型脊椎關節炎、關節黏連性脊椎炎或牛皮癬關節炎之藥劑。