CN108026112B

CN108026112B - 用于抑制ROR-γ-T的化合物

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Publication number: CN108026112B
Application number: CN201680052085.5A
Authority: CN
Inventors: J·R·莫菲
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2036-09-06
Also published as: SI3347360T1; AR105821A1; BR112018001451A2; CO2018002440A2; SV2018005647A; ZA201800515B; PT3347360T; AU2016318593B2; TWI597284B; CA2994732C; EA201890364A1; LT3347360T; IL257202B; EP3347360B1; KR102048780B1; UA118824C2; MA42776B1; PE20181274A1; EA033882B1; JP6282789B1

Abstract

本发明提供了新的RORγ‑t抑制剂及其药物组合物：

Description

用于抑制ROR-γ-T的化合物

本发明涉及用于抑制视黄酸受体相关孤儿受体γ-t(retinoid-receptorrelated orphan receptor gamma-t,RORγt)的化合物、药物组合物和治疗与 RORγ活性有关的疾病的方法。

视黄酸受体相关孤儿受体(RORs)是在许多疾病中被鉴定为重要病理调节物的核受体(NR)超家族的成员。ROR亚家族由RORα、RORβ和RORγ 组成。小鼠和人RORγ基因产生两种同工型γ1和γ2，后者最常见被称作 γt。RORγt信号传导通常响应于IL-23/IL-23受体信号传导，是原初CD4+T 细胞分化成称为Th17的T-细胞亚群所必需的，所述Th17细胞与传统的 Th1和Th2细胞不同，并且支持它们的维持。Th17细胞产生白介素-17A (IL-17)和IL-17F。此外，Th17细胞产生一系列已知驱动炎症应答的其它因子，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、GM-CSF、CXCL1 和CCL20。NK细胞和先天淋巴样细胞例如淋巴组织诱导物(LTi)-样细胞表达IL-23受体和RORγt，并响应于刺激和IL-23产生IL-17。有大量证据表明IL-23响应性RORγt和表达IL-17的细胞与自身免疫性疾病(AI)、炎性疾病和癌症相关。因此，RORγt的靶向抑制对于减少这些疾病的发病可能是重要的。

AI疾病是目前无法治愈的慢性病。AI疾病的治疗典型地包括尝试通过施用抗炎药、止痛药或免疫抑制药来控制疾病过程和减轻症状。令人遗憾地，使用抗炎药和止痛药有时是无效的，并且使用免疫抑制药常导致破坏性的长期副作用。免疫抑制药最显著的副作用是感染的风险增加和癌症的风险较高。

已经鉴定了RORγt的天然和合成配体。在文献中已经报道了RORγt 的小分子抑制剂用于AI。参见WO 2015/017335和WO 2014/179564。然而，AI疾病的流行结合当前治疗的无效性或破坏性副作用使得为患者提供更多的治疗选择非常必要。通过靶向于致病性免疫细胞来最大化治疗益处、同时最小化抑制宿主防御的风险，靶向于RORγt比目前的AI疗法可呈现优势。

本发明提供了作为RORγt抑制剂的新化合物。这类新化合物可解决对于有力、有效地治疗眼色素层炎、多发性硬化、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、克隆病、其它炎性肠病、癌症、银屑病和血清阴性脊椎关节病例如中轴型脊柱关节炎(axialspondyloarthritis)、强直性脊椎炎和银屑病关节炎的需求。

本发明提供了下式的化合物：

或其药学上可接受的盐。

本发明还提供了治疗患者的银屑病的方法，其包括给有需要的患者施用本发明的化合物或其药学上可接受的盐。此外，本发明提供了治疗患者的血清阴性脊椎关节病的方法，其包括给有需要的患者施用本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在所述实施方案中，血清阴性脊椎关节病是轴性脊椎关节炎、强直性脊椎炎或银屑病关节炎。

本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中，所述组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗银屑病的药物组合物，其包含本发明化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另外一个实施方案中，本发明提供了用于治疗血清阴性脊椎关节病的药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在所述实施方案中，血清阴性脊椎关节病是轴性脊椎关节炎、强直性脊椎炎或银屑病关节炎。

此外，本发明提供了用于疗法、特别是用于治疗银屑病的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。甚至进一步，本发明提供了用于治疗银屑病的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗银屑病的药剂中的用途。

此外，本发明提供了用于疗法、特别是用于治疗血清阴性脊椎关节病的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。甚至进一步，本发明提供了用于治疗血清阴性脊椎关节病的本发明的化合物或其药学上可接受的盐。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗血清阴性脊椎关节病的药剂中的用途。在所述实施方案中，血清阴性脊椎关节病是轴性脊椎关节炎、强直性脊椎炎或银屑病关节炎。

本发明还涵盖用于合成本发明的化合物的中间体和方法。

本文使用的术语“治疗”是指抑制、减缓、停止或逆转现有症状、病症或障碍的进展或严重性。

术语“脊椎关节病”是指许多慢性关节病，其通常涉及脊柱以及韧带和肌腱附着于骨的区域。脊椎关节病有时也被称为脊椎关节病或脊椎关节炎。

术语“血清阴性”是指类风湿因子阴性的疾病。

本发明的化合物可以反应形成药学上可接受的盐。药学上可接受的盐及其常用的制备方法是本领域公知的。参见例如P.Stahl等人Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use,第2修订版 (Wiley-VCH,2011)；S.M.Berge等人,“Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences,第66卷,第1期,1977年1月。

本领域技术人员可以理解，(I)中所示的本发明的化合物或其药学上可接受的盐包含下面*所代表的至少两个手性中心的核：

尽管本发明关注所述化合物的所有各个对映体以及对映体混合物，包括外消旋物，但是本发明的优选化合物如下面(II)表示：

或其药学上可接受的盐。

本领域技术人员还可以理解，所有手性中心的Cahn-Ingold-Prelog(R) 或(S)命名将根据特定化合物的取代模式的不同而改变。可以从使用手性试剂开始或者通过立体选择性或立体特异性合成技术来制备单一对映体或非对映体。或者，可以通过标准手性色谱或结晶技术在合成本发明化合物中的任意便利的点从混合物中分离单一对映体或非对映体。本发明的化合物的单一对映体是本发明的优选实施方案。

优选地，将本发明的化合物配制成通过各种途径施用的药物组合物。这类药物组合物及其制备方法是本领域公知的。参见例如Remington: The Science and Practice ofPharmacy(A.Gennaro等人编辑,第21版, Mack Publishing Co.,2005)。更特别优选的是包含下式的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物：

本发明的一个尤其优选的实施方案涉及化合物(5’S)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’- 二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲酰胺：

或其药学上可接受的盐。

本发明的另一个尤其优选的实施方案涉及以下化合物：

本发明的化合物通常在很宽的剂量范围内有效。例如，每天的剂量落入约1mg至1g的范围内。在一些情况下，低于上述范围的下限的剂量水平可能是足够的，而在其它情况下，仍然可以使用更大的剂量，同时保持有利的利益/风险特性，因此上述剂量范围不旨在以任何方式限制本发明的范围。应当理解，实际施用的化合物的量将由临床医师根据相关情况确定，包括待治疗的病症、选择的施用途径、施用的实际的一种或多种化合物，个体患者的年龄、体重和反应，以及患者症状的严重程度。

本领域普通技术人员可以在合成式I化合物的任意便利的时间点通过例如选择性结晶技术或手性色谱法等方法分离或拆分单个异构体、对映体和非对映体(参见，例如J.Jacques等人，"Enantiomers,Racemates,and Resolutions",John Wiley and Sons,Inc.,1981,以及E.L.Eliel和S.H. Wilen,“Stereochemistry of Organic Compounds”,Wiley-Interscience, 1994)。名称“异构体1”和“异构体2”是指分别从第一和第二手性色谱洗脱的化合物，并且如果手性色谱在合成的早期开始，则将相同的命名应用于随后的中间体和实施例。

另外，本文所述的某些中间体可以含有一个或多个保护基。根据具体的反应条件和要进行的具体转化，可变的保护基在每种情况下可以相同或不同。保护和脱保护的条件是本领域技术人员公知的，并且在文献中有描述(参见例如“Greene’s ProtectiveGroups in Organic Synthesis”,第4版, Peter G.M.Wuts和Theodora W.Greene,JohnWiley and Sons,Inc. 2007)。

某些缩写定义如下：“AUC”是指曲线下面积；“BSA”是指牛血清白蛋白；“CFA”是指弗氏完全佐剂；“DBA”是指淡棕色近交系小鼠(dilute brown non-Agouti)；“DCM”是指二氯甲烷；DPBS是指Dulbecco磷酸盐缓冲盐水；“DMEM”是指达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)；“DMSO”是指二甲亚砜；“EC₅₀”是指最大响应的一半处的有效浓度；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Et₂O”是指乙醚；“EtOH”是指乙醇；“ee”是指对映体过量；“Ex”是指实施例；“FBS”是指胎牛血清；“G” 是指重力；“GAL”是指β-半乳糖苷酶DNA结合结构域；“GPI”是指葡萄糖-6-磷酸异构酶；“HEC”是指羟乙基纤维素；“HEK”是指人胚肾； “HEPES”是指4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“IC₅₀”是指产生该物质的可能的最大抑制响应的50％的物质浓度；“IL”是指白介素；“IPA”是指异丙醇；“Kd”是指解离常数；“Ki”是指抑制常数；“MeOH”是指甲醇；“MEM” 是指极限必需培养基；“PBMC”是指外周血单核细胞；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“Prep”是指制备例；“RAR”是指视黄酸受体；“RPMI”是指罗斯维尔公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)。“Rt”是指保留时间；“SCX”是指强阳离子交换；“SFC”是指超临界流体色谱法；“THF” 是指四氢呋喃。

本发明的化合物或其盐可以通过本领域已知的多种方法制备，其中一些在下文的制备例和实施例中进行了举例说明。所描述的每种途径的具体合成步骤可以以不同的方式组合以制备本发明的化合物或其盐。以下每个步骤的产物可以通过本领域公知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研磨和结晶。试剂和起始材料是本领域技术人员容易获得的。

下面的制备例和实施例进一步举例说明了本发明，代表本发明的化合物的典型合成。

制备例和实施例

制备例1

1-(3-噻吩基)丙烷-2-酮

将2-(3-噻吩基)乙酸(26.5g,146.5mmol)混悬于乙酸酐(87.9mL,913 mmol)中，加入1-甲基咪唑(7.57g,91.3mmol)。将反应混合物在室温、氮气下搅拌4小时。将反应混合物冷却至0℃，加入水(150mL)，搅拌1小时。用EtOAc(300mL)稀释该溶液，依次用2M NaOH(2×200ml)、水(200 mL)和盐水(200mL)洗涤。分离有机萃取相，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物(28.16g,77％)，为黄色油状物。¹H NMR(400.13 MHz,CDCl₃)δ2.14(s3H),3.7(s,2H),6.94(d,J＝5.1Hz,1H),7.08(bs, 1H),7.29-7.26(m,1H).

制备例2

1-(3-噻吩基)丙烷-2-醇

将干燥的MeOH(63mL)加入到硼氢化钠(1.61g,41.67mmol)中，将反应混合物冷却至-10℃，同时加入MeOH。进一步冷却至-20℃，历时40 分钟滴加1-(3-噻吩基)丙烷-2-酮(4.92g,33.34mmol)在干燥MeOH(26.7 mL)中的溶液，在-20℃下搅拌1.5小时，然后在室温下搅拌17小时。将溶液冷却至-5℃(内部温度)，用饱和氯化钠溶液(15ml)、然后用1N HCl(15mL)淬灭。加入水(30mL)和EtOAc(100mL)。减压浓缩混合物至总体积的1/3。用EtOAc(2×100mL)萃取混合物。合并有机萃取物，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物(4.74g,100％)。质谱(m/z):125 (M-OH+H),164.8(M+Na).

供替代选择的制备例2a

在0℃下历时30分钟将硼氢化钠(7.06g,182.8mmol)分份加入到 1-(3-噻吩基)丙烷-2-酮(28.16g,140.6mmol)在MeOH(282mL)中的溶液中，在室温搅下拌过夜。浓缩至干，用EtOAc(200mL)稀释，用饱和氯化铵溶液(150mL)洗涤。用EtOAc(2×200mL)萃取水层。合并有机萃取物，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。通过硅胶闪式色谱法纯化残余物，用MeOH:DCM(0:100-5:95)洗脱，得到标题化合物(12.85g,64％)，为浅红色油状物。质谱(m/z):125(M-OH+H).

制备例3

(2S)-1-(3-噻吩基)丙烷-2-醇

将3-溴噻吩(6.88g,42.2mmol)溶于无水THF(10mL)和甲苯(100mL) 中。冷却至-78℃。历时15分钟通过注射器向其中加入仲-丁基锂(1.3mol/L 的环己烷溶液,34mL,44mmol)。将温度维持在<-60℃，搅拌10分钟，然后滴加(2S)-2-甲基环氧乙烷(4.9g,84.4mmol)。5分钟后，历时15分钟通过滴液漏斗加入三氟化硼二乙基醚合物(5.3mL,42mmol)。将温度维持在<-55℃。添加完成后，在-78℃下搅拌2小时。在-78℃下用饱和碳酸氢钠淬灭，加入Et₂O，温热至环境温度。用饱和碳酸氢钠(2×)洗涤，然后用饱和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩。通过硅胶闪式色谱法纯化，用15％EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(3.85g,64.2％)。再纯化混合的级分，得到总量的标题化合物(4.29g,71.5％)，为无色液体。 ¹H NMR(400.13MHz,CDCl₃)δ7.28-7.26(dd,J＝2.9,5.0,1H),7.03-7.01(m, 1H),6.96(dd,J＝1.2,4.9,1H),4.04-3.95(m,1H),2.83-2.68(m,2H),1.63(s,1H),1.22(d,J＝6.2,3H),OR[α]²⁰D+25.50(c 1.00,CHCl₃),

制备例4

(5'S)-5'-甲基-4',5'-二氢螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]

将4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(6.50g,32.6mmol)和(2S)-1-(3-噻吩基)丙烷-2-醇(4.64g,32.6mmol)溶于DCM(100mL)。加入三氟乙酸(20mL,264.5 mmol)。将混合物在环境温度下搅拌18小时。减压浓缩该混合物，然后加入水和Et₂O。用水洗涤有机层，合并水性洗涤液，然后用固体碳酸钠将 pH调至碱性。用固体氯化钠饱和水层，然后用EtOAc(5×)洗涤水层。合并EtOAc层，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(4.61g,63％)，为浅黄色油状物。质谱(m/z):224.2(M+H).

制备例5

(5’S)-5’-甲基-4’,5’-二氢-1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯

将(5'S)-5'-甲基-4',5'-二氢螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃](10.39g,46.53mmol)溶于DCM(100mL)中。滴加焦碳酸二叔丁酯(11.52mL,51.18 mmol)，将混合物在环境温度下搅拌1.5小时。加入另外的焦碳酸二叔丁酯 (2.00mL,9.17mmol)，搅拌30分钟，然后减压浓缩。加入咪唑(2.21g,32.5 mmol)以破坏过量的焦碳酸二叔丁酯(Synthesis,2001,No.4,550)。加入 Et₂O，用盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩。通过硅胶闪式色谱法纯化，用10％EtOAc/己烷洗脱。再通过硅胶闪式色谱法纯化，用15％EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(12.92g,86％)，为无色油状物。 ¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ7.33(d,J＝5.1,1H),6.77(d,J＝5.1, 1H),3.92-3.72(m,3H),3.15-2.91(s,2H),2.62(dd,J＝15.8,3.0,1H),2.30(dd, J＝15.8,10.6,1H),2.1(m,1H),1.76-1.63(m,2H),1.51-1.40(m,1H),1.38(s, 9H),1.24(d,J＝6.2,3H),基于SFC色谱法100％ee,Lux Amylose-2,5 mL/min,225nm,R_t＝1.75min,OR[α]²⁰D+82.1(c 1.00,CHCl₃)。

制备例6

5’-甲基-4’,5’-二氢-1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯

在0℃下将三氟乙酸(34.16mL,451.8mmol)滴加到1-(3-噻吩基)丙烷 -2-醇(12.85g,90.35mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(23.40g,117.5 mmol)在干燥DCM(135mL)中的溶液中，在室温下维持搅拌17小时。将混合物浓缩至干，用MeOH稀释残余物，然后减压除去溶剂。将残余物用 MeOH吸收，通过离子交换色谱法纯化。合并包含期望的产物的层，减压浓缩，与甲苯共蒸发(3×)，得到粗品5-甲基螺[4,5-二氢噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶]的浅橙色固体。将4-二甲基氨基吡啶(2.23g,18.07mmol)和三乙胺(37.8mL,271.1mmol)滴加至冷却至0℃的5-甲基螺[4,5-二氢噻吩并 [2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](20.18g,90.35mmol)在干燥DCM(90.35mL)中的溶液中。向其中滴加焦碳酸二叔丁酯(30.49g,135.5mmol)在干燥DCM(27.1 mL)中的溶液。在室温搅拌过夜。加入水(100mL)，用DCM(3×100mL) 萃取水层，用盐水(100mL)洗涤，减压浓缩。通过硅胶闪式色谱法纯化，用EtOAc:异己烷(0:100-20:80)洗脱。将残余物与DCM(3×)共蒸发，得到标题化合物(27.64g,92.7％)，为白色固体。质谱(m/z):346(M+Na)

供替代选择的制备例6a

在0℃下将三氟乙酸(20.17mL,266.72mmol)滴加到1-(3-噻吩基)丙烷 -2-醇(4.74g,33.34mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(7.80g,38.34mmol) 在干燥DCM(100mL)中的溶液中，在室温下搅拌过夜。将混合物浓缩至干，用MeOH稀释残余物。通过离子交换色谱法纯化粗物质。合并还有所需产物的层，减压浓缩，与甲苯共蒸发(3×)，得到粗品5-甲基螺[4,5-二氢噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](8.17g)。将4-二甲基氨基吡啶(0.831g,6.67 mmol)和三乙胺(9.29mL,66.68mmol)加至冷却至0℃的5-甲基螺[4,5-二氢噻吩并[2,3-c]吡喃-7,4'-哌啶](8.17g)在干燥DCM(66.7mL)中的溶液中。想其中滴加焦碳酸二叔丁酯(18.19g,83.35mmol)在干燥DCM(16.7ml)中的溶液。在室温下搅拌3天。加入水(60mL)，用DCM(3×50mL)萃取水层，用盐水(20mL)洗涤，减压浓缩。通过硅胶闪式色谱法纯化，用EtOAc: 异己烷(0:100-20:80)洗脱。将残余物与DCM(2×)共蒸发，得到标题化合物(9.41g,80％)。质谱(m/z):346(M+Na)

制备例7

1-(叔丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸

将5’-甲基-4’,5’-二氢-1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(7.16g,21.71mmol)溶于THF(108.5mL)中，冷却至-78℃。历时20分钟向其中滴加丁基锂(2.5M的己烷溶液,13mL,32.56mmol)，添加完成后将混合物再搅拌30分钟。通过套管用CO₂鼓泡，维持在该温度下搅拌1 小时，同时持续添加CO₂。允许反应历时2小时温热至0℃，同时持续添加CO₂，小心地用水(80mL)淬灭。将反应混合物倾入水中，用Et₂O(100mL) 萃取水层。用2N NaOH(3×15mL)和水(50mL)洗涤有机相。用2N HCl(3×) 酸化水层至pH＝6，用EtOAc萃取。合并有机萃取物，用盐水(50mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(7.89g,97％)，为灰白色固体。质谱(m/z):390(M+Na).

制备例8

1-(叔丁氧基羰基)-4',5'-二氢螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2'-甲酸

将4',5'-二氢-1H-螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(如J.Med.Chem.,2011,54,(8),pp 2687-2700和WO2011060035中所述制备) (10g,32.32mmol)溶于THF(100mL)，冷却至-78℃。历时15分钟向其中滴加丁基锂(22.22mL,35.55mmol)，添加完成后将混合物再搅拌15分钟。通过套管用CO₂鼓泡，允许反应温热至0℃，同时持续添加CO₂。2小时后，将混合物冷却至0℃，加入水，然后加入Et₂O。用1N NaOH碱化水层，用1NNaOH(3×)洗涤有机层。合并碱性洗涤液，用5N HCl酸化至 pH 2。用EtOAc(3×)洗涤水层，合并有机萃取物，用盐水洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(11.11g,97.27％)，为白色固体。质谱(m/z):352.2(M-H).

制备例9

(5’S)-1-叔丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸

将(5’S)-5’-甲基-4’,5’-二氢-1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(11.19g,34.60mmol)溶于无水THF(200mL)，冷却至-78℃。历时 20分钟向其中滴加正丁基锂(21mL,34.64mmol)，添加完成后将混合物在 -78℃搅拌20分钟。通过套管用CO₂鼓泡60分钟。将混合物温热至室温，同时持续添加CO₂。在室温下搅拌1小时后，用水(3mL)淬灭，减压浓缩至25％体积。加入Et₂O和水。用水(2×)洗涤，合并水性洗涤液。用1N HCl 将pH调至酸性。用氯化钠饱和水层，用EtOAc(2×)萃取。合并EtOAc 萃取物，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物 (13.40g,100％)，为白色泡沫。质谱(m/z):366(M-H).

制备例10

5-(乙基硫基)吡啶-2-甲腈

将5-溴吡啶-2-甲腈(49.42g,270.1mmol)和碳酸钾(113.5g,821.2mmol) 溶于1-甲基-2-吡咯烷酮(280mL)中，历时30分钟分份加入乙硫醇(26.4mL, 356mmol)，使得温度停留在低于50℃。将反应冷却至室温，搅拌过夜。用EtOAc(1200mL)和水(2200mL)稀释。收集有机层，用盐水(3×300mL) 洗涤，用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(44.87g, 100％)，为灰白色固体。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ8.63(s,1H), 7.93(s,2H),3.17(q,J＝7.3,2H),1.29(t,J＝7.3,3H).

制备例11

5-(乙基磺酰基)吡啶-2-甲腈

将5-(乙基硫基)吡啶-2-甲腈(44.36g,270.1mmol)溶于无水DCM(540 mL)，冷却至-20℃。历经1小时以10-12克的份分份加入3-氯过氧苯甲酸 (130g,565.0mmol)，维持内部温度在0℃至-10℃。在冷浴中搅拌反应混合物，温热至室温过夜。用1N NaOH(1L)、水、1NNaOH(2×500mL) 和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(49.52 g,93％)，为白色固体。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ9.20(d,J＝1.9, 1H),8.56(dd,J＝2.0,8.1,1H),8.36(d,J＝8.1,1H),3.52(q,J＝7.3,2H),1.16(t, J＝7.5,3H).

制备例12

1-[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲胺盐酸盐

将5-(乙基磺酰基)吡啶-2-甲腈(49.52g,252.4mmol)分成3个16.5g的份。在N₂下，在2250mL Parr瓶中，加入10％Pd/C(1.65g,15.5mmol) 至容器中，用MeOH(750mL)湿润。向其中加入溶于MeOH(750mL)的 5-(乙基磺酰基)吡啶-2-甲腈(16.5g,84.09mmol)。向其中加入HCl(6N水溶液,17.1ml,102.6mmol)。密封瓶，用N₂吹扫，用H₂吹扫，在室温加压至68.9kPa达3小时。用N₂吹扫，然后过滤该混合物。对剩余的份的5-(乙基磺酰基)吡啶-2-甲腈重复操作。合并全部滤液，减压浓缩，得到标题化合物(59.61g,99％)，为米黄色固体。质谱(m/z):201(M+H-HCl).

制备例13

2’-({[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}氨基甲酰基)-5’-甲基-4’,5’-二氢-1H-螺 [哌啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯

将1-[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲胺盐酸盐(3.1g,13mmol)、1-(叔丁氧羰基)-5’-甲基-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸(3.9g,10 mmol)溶于无水DCM(52mL)。冷却至0℃，滴加三甲胺(10mL,73mmol)，然后加入1.67M 2,4,6-三丙基-1,3,4,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷-2,4,6-三氧化物(8.6g,14mmol)在EtOAc中的溶液。使混合物温热至室温，搅拌过夜。小心地加入水(50mL)，在室温下搅拌10分钟。用DCM(2×)萃取水层，然后合并有机萃取物。用盐水洗涤有机萃取物，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。用硅胶色谱法纯化粗物质，用50％-100％EtOAc/己烷梯度洗脱，得到标题化合物(4.89g,83％)，为黄色泡沫。质谱(m/z):550(M+H).

制备例14

(5’S)-2’-({[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}氨基甲酰基)-5’-甲基-4’,5’-二氢 -1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯

将1-[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲胺盐酸盐(2.86g,10.5mmol)、 (5’S)-1-叔丁氧基羰基)-5’-甲基-4’,5’二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2’-甲酸(3.50g,9.52mmol)和1-羟基苯并三唑(1.44g,10.5mmol)溶于无水THF(100mL)和二甲基甲酰胺(50mL)。加入N,N-二异丙基乙胺(4.98 mL,28.6mmol)，然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在室温搅拌过夜。减压浓缩至～40％体积，然后加入EtOAc。用饱和碳酸氢钠(2×)、水(2×)、盐水(2×)洗涤，用硫酸钠干燥有机层，过滤，减压浓缩。用硅胶色谱法处理，用80％EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(4.51g, 86％)，为灰色泡沫。质谱(m/z):550(M+H).

制备例15

N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’,二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并 [2,3,c]吡喃]-2’-甲酰胺二盐酸盐

将2’-({[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}氨基甲酰基)-5’-甲基-4’,5’-二氢-1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯(0.95g,1.68mmol)溶于MeOH(10mL)，加入4M HCl的二噁烷溶液(4.5mL,18mmol)。在室温下搅拌1小时，然后减压浓缩，得到标题化合物(0.86g,100％)，为白色固体。质谱(m/z):450(M+H-2HCl).

制备例16

(5’S)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’,二氢螺[哌啶-4,7’- 噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲酰胺二盐酸盐

将(5’S)-2’-({[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}氨基甲酰基)-5’-甲基 -4’,5’-二氢-1H-螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-1-甲酸叔丁酯mmol(1.14 g,2.0mmol)溶于1,4二噁烷(10mL)和MeOH(5mL)。加入4M HCl的二噁烷溶液(5.0mL,20mmol)，在室温下搅拌2小时。浓缩至约10mL，然后加入Et₂O，剧烈搅拌过夜。加入己烷，过滤，用己烷冲洗，得到标题化合物(0.99g,91％)，为淡黄色固体。质谱(m/z):450(M+H-2HCl).

制备例17

1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙醇

将2-(三氟甲基)嘧啶-5-甲醛(11.31mmol,1.992g)溶于THF(56.56 mL)，冷却至0℃，缓慢地加入溴化甲基镁(3M的Et₂O溶液)(33.94mmol, 11.31mL)。使反应温热至室温，搅拌2.5小时。用1N HCl淬灭反应。加入 EtOAc，用1N HCl洗涤。用硫酸钠干燥有机物，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(1.663g,76.5％)。质谱(m/z):193.0(M+H).

制备例18

5-(1-溴乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶

将1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙醇(8.655mmol,1.663g)和三苯膦(12.98 mmol,3.405g)溶于DCM(86.55mL)，在室温加入N-溴琥珀酰亚胺(12.98 mmol,2.311g)。3小时后，减压浓缩反应。通过硅胶色谱法纯化得到的残余物，用10％EtOAc/己烷洗脱，得到标题化合物(1.641g,74.34％)。¹H NMR(400.13MHz,d₆-DMSO)δ9.26(s,2H),5.63(q,J＝7.0Hz,1H),2.09 (d,J＝7.0Hz,3H).

实施例1

N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基] 乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺

将N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’,二氢螺[哌啶-4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲酰胺二盐酸盐(1.12g,2.31mmol)溶于乙腈(11.6 mL)和二异丙基乙基胺(2.42mL,13.9mmol)，加入5-(1-溴乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶(0.71g,2.77mmol)。将混合物在60℃下加热90分钟，然后冷却至环境温度，减压浓缩。将粗混合物溶于MeOH(5mL)，然后荷载到50g SCX 柱上。用MeOH(150mL)净化，然后用2N氨/MeOH(150mL)洗脱产物。减压浓缩氨/MeOH洗涤液，得到橙色泡沫。用硅胶色谱法对粗物质进行处理，用100％DCM-95％DCM/MeOH梯度洗脱，得到标题化合物(1.54g, 43％)。质谱(m/z):624(M+H).

实施例2

(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基) 嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺

实施例3

(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基) 嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺

实施例4

(5R’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶 -5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺异构体1

实施例5

(5R’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶 -5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺异构体2

将N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶 -5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺(1.28g,2.05mmol)溶于MeOH(58.5mL)。通过手性色谱法分离，使用SFC[AD-IC 柱(30x 250mm,5μ)，用50％IPA(20mM NH₃)以120mL/分钟洗脱，每 10分钟进样4.5mL(200mg)，得到实施例5,(5R’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶 -2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶 -4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺异构体2；和混合级分，其含有：实施例 2,(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基) 嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺；实施例3,(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺；和实施例4,(5R’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基 -1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺异构体1。浓缩混合的级分，将其溶于MeOH(55.5mL)。通过手性色谱法分离该混合物，使用SFC[OJ-H柱(30x 250mm,5μ)，用 22％MeOH(20mM NH₃)以160mL/分钟洗脱，每5分钟进样5.0mL，得到实施例4,(5R’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺异构体1；以及实施例3(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并 [2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺与实施例2(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’ 噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺的混合物。浓缩混合级分，将其溶于MeOH (30.0mL)。通过手性色谱法分离该混合物，使用SFC[AD-H柱(50x250mm, 5μ)，用50％IPA(20mM NH₃)以200mL/min洗脱，每32分钟进样3.0mL，得到实施例2,(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基 -1-{(1S)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’噻吩并 [2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺；和实施例3,(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4’,5’-二氢螺[哌啶-4,7’ 噻吩并[2,3-C]吡喃]-2’-甲酰胺。浓缩每组纯级分，然后将分离的产物溶于乙腈(0.6mL)，加入水，在-78℃冷冻，冷冻干燥，得到实施例2,0.214g, 16％,99.5％ee,R_t＝2.94分钟，质谱(m/z):624(M+H)。实施例3,0.203g, 15％,98.9％ee,R_t＝2.75分钟，质谱(m/z):624(M+H)。实施例4,0.251g, 17％,98.3％ee,R_t＝4.75分钟，质谱(m/z):624(M+H)。实施例5,0.272g, 18％,100％ee,R_t＝4.33分钟，质谱(m/z):624(M+H)。分析条件：SFC(220 nm UV),柱:AD-IC 30x 250mm,5μ,流动相:50％IPA(20mMNH₃)。手性LC分析条件：SFC(225nm UV),柱Chirocel OJ-H,20％MeOH(0.2％异丙基胺)/CO₂,5mL/min。

实施例2的供替代选择的制备

和实施例3的供替代选择的制备

将(5S’)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5’-甲基-4’,5’,二氢螺[哌啶 -4,7’-噻吩并[2,3,c]吡喃]-2’-甲酰胺二盐酸盐(28.28g,58.19mmol)溶于乙腈 (280mL)和二异丙基乙基胺(50mL,290.9mmol)，加入5-(1-溴乙基)-2-(三氟甲基)嘧啶(0.71g,2.77mmol)，然后在环境温度下搅拌过夜。减压浓缩，然后将粗混合物溶于DCM，用硅胶色谱法纯化，用100％EtOAc洗脱，得到标题化合物的混合物。通过手性色谱法分离[ChiralpakIA柱(8x 40.5 cm,225nm)，用40％乙腈/60％异丙醇(含有0.2％二甲基乙基胺)以400mL/分钟洗脱，进样20mL(2000mg)。减压浓缩每种非对映体，然后溶于热乙醇(250mL)，热滤，然后冷却至环境温度，用冷乙醇冲洗。在55℃在真空烘箱中干燥固体，得到实施例2,9.94g,27％,90.8％ee,R_t＝3.93分钟，质谱(m/z):624(M+H)；和实施例3,9.42g,26％,98.8％ee,R_t＝9.25分钟，质谱(m/z):624(M+H))，为结晶性物质。分析条件：Chiralpak IA柱(4.6x150mm,225nm)，用40％乙腈/60％异丙醇(含有0.2％二甲基乙基胺)以1 mL/分钟洗脱。

X-射线衍射，实施例3

在23℃在薄MiTeGen纤维上装上单晶。使用CuKα辐射源

和装配了SMART 6000CCD平面检测器的基于Bruker D8的3-环路测角衍射仪(Bruker-AXS.SHELXTL(V2013 6.2)Madison,Wisconsin,USA) 收集数据。使用SAINT程序V8.32b(Sheldrick,G.M.,(2008),SHELXS-97, Acta Cryst.A64,112-122)进行晶胞精制和数据归纳。将具有以下单斜晶系参数的晶胞编入索引：

和α＝90°,β＝100.6879(14)°,γ＝90°。晶体结构的晶胞体积是

计算的结构密度在23℃时为1.386g/cm³。通过直接方法拆分结构 (Sheldrick,G.M.,(2008),SHELXS-97,Acta Cryst.A64,112-122)。所有原子参数都独立地精修。空间群选择即P2₁通过对F2的全矩阵最小二乘精化的成功汇集来确证(Sheldrick,G.M.,(2013),SHELXL-2013,Program for crystal structure refinement,Institute fur anorg chemie,

德国)，最终拟合优度为1.088。最终残差因子R1＝0.0771，最终精修周期后的最大差异峰值和空穴(hole)分别为0.315和-0.333(e.A-3)。绝对结构参数精确到0.072(17)。

测定了实施例3的结构，其分子结构与实施例3中所示的结构一致。应当注意，晶体结构具有高质量并且通过使用结构中重原子(硫)的反常散射贡献确定了实施例3的手性中心的绝对立体化学，C5的绝对立体化学是 (S)，C1的绝对立体化学是(R)，远离哌啶基。根据晶体结构确定了绝对构型为(5'S)-N-{[5-(乙基磺酰基)吡啶-2-基]甲基}-5'-甲基-1-{(1R)-1-[2-(三氟甲基)嘧啶-5-基]乙基}-4',5'-二氢螺[哌啶-4,7'-噻吩并[2,3-c]吡喃]-2'-甲酰胺构型。

生物学测定

RORa、b和g结合抑制剂

将His-加标签的人RAR相关孤儿受体α(hRORa)、人RAR相关孤儿受体β(hRORb)和人RAR相关孤儿受体γ(hRORg)用于受体-配体竞争性结合测定以测定K_i值。典型的方法提供如下。

受体竞争性结合测定在缓冲液中进行，所述缓冲液由DPBS(1L) (Hyclone#SH30028.03)、2.2g BSA Fraction v(Roche#9048-46-8)、100mL 甘油(Fischer#56-81-5)和40mL DMSO(试剂级)制成。最终的孔含有20μg/ mL抑蛋白酶肽和20μg/mL亮抑蛋白酶肽和10μM Pefabloc。典型地，受体结合测定包括放射性标记的配体，例如用于α结合的7nM[3H]-25-羟基胆固醇、用于β结合的20nM[3H]-3-[[4-[[3-(2,6-二氯苯基)-5-异丙基-异噁唑-4- 基]甲氧基]-N,2-二甲基-苯胺基]甲基]苯甲酸和用于γ结合的6nM[³H]-25- 羟基胆固醇，以及每孔0.5μg RORa受体、0.03μg RORb受体或0.13μg RORg受体。测定通常在96-孔格中进行。竞争的测试化合物以约0.4nM至 25μM范围内的各种浓度添加。对于RORa和RORg结合在250nM 25-羟基胆固醇存在下、对于RORb结合在250nM 3-[[4-[[3-(2,6-二氯苯基)-5-异丙基 -异噁唑-4-基]甲氧基]-N,2-二甲基-苯胺基]甲基]苯甲酸存在下，测定非特异性结合。将样品、标记物和受体溶液在96孔测定板(Costar 3632)中合并并在室温下孵育过夜，然后将25μl珠(Amersham YSi(2-5微米)铜His-标签Spa 珠,#RPNQ0096)加入到每个反应中，最终珠浓度为1mg/孔。在室温下在轨道振荡器上将板混合30分钟。孵育4小时后，在Wallac

计数器中对板读数。

使用四参数逻辑拟合数据用数据计算估计的IC₅₀。用于RORa和RORg 的[3H]-25-羟基胆固醇的Kd和用于RORb结合的[3H]-3-[[4-[[3-(2,6-二氯苯基)-5-异丙基-异噁唑-4-基]甲氧基]-N,2-二甲基-苯胺基]甲基]苯甲酸是提供饱和结合测定的。使用Cheng-Prushoff方程将化合物的IC₅₀值转换成Ki。

下列示例性化合物的结果如下表2中所示。

表2

实施例#	RORa Ki(nM)	RORb Ki(nM)	RORg Ki(nM)
				1	>20,400	>12500	12.0±7.3,n＝2
2	>20,400	>12500	6.24+0.73,n＝2
				3	>20,400	>12500	16.6±8.8,n＝5
4	>20,400	2190	148+40,n＝2
				5	>20,400	407	153+25,n＝2

平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差

这些结果证明，表2的化合物相对于RORa和RORb而言对RORg 具有选择性。

HEK293RORg GAL4受体-报道分子测定

作为反向激动剂活性的指示物，在HEK293细胞中进行RAR相关孤儿受体γ(RORg)受体-报道分子测定(RORg-GAL4/pGL4.31)。使用Fugene^TM试剂共转染HEK293细胞。将含有GAL4结合结构域和萤火虫萤光素酶基因最小腺病毒启动子上游的报道质粒与组成型表达与酵母GAL4DNA结合结构域融合的人RORg配体结合结构域的质粒共转染。将细胞在T150cm²烧瓶中转染到不含FBS的MEM培养基中。孵育18小时后，将转染的细胞用胰蛋白酶消化，在96-孔微量滴定板中在含有10％FBS的3:1DMEM-F12培养基中铺板，孵育4小时，然后暴露于约0.05nM至10μM范围内的各种浓度的测试化合物。与化合物一起孵育18小时后，裂解细胞，使用标准技术定量萤光素酶活性。将数据拟合4参数-拟合逻辑以确定IC₅₀值。

下列示例性化合物的结果如下表3中所示。

表3

实施例#	hIC<sub>50</sub>(nM)
		1	56.5±39.4,n＝2
2	45.8±8.5,n＝4
		3	21.8±7.03,n＝7
4	97.9±5.1,n＝2
		5	59.5±1.3,n＝2

平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差

这些结果证明，表3的化合物是人RORg受体的反向激动剂。

PBMC IL-17分泌ELISA和细胞TiterGlo生存力测定

通过以下方法从全血血沉棕黄层中分离出PBMC：首先将新鲜的血沉棕黄层(buffy coat)与等体积的磷酸盐缓冲盐水合并。然后将35mL PBS/血沉棕黄层溶液温和地覆盖在50mL锥形管中的15mL Ficoll上。以500×g (缓慢加速和减速)离心30分钟后，弃去顶层血浆，收集沿Ficoll界面的细胞层并合并。用室温RPMI-1640培养基将每个250mL试管充满至顶部。以500×G(缓慢加速和减速)旋转试管10分钟，通过抽吸除去培养基，重复洗涤步骤。将细胞在冰上重新混悬于冰冷的来自Life Technologies(目录号 12648-010)的回收细胞培养物冷冻培养基中。将细胞浓度调至6670万个细胞/mL。在具有1亿个细胞的小瓶中将细胞以-1℃/分钟缓慢冷冻并储存在液氮中。

IL-17分泌的刺激和化合物添加

通过用1mL完全培养基(含有30mM HEPES、100单位/mL青霉素、 100μg/mL链霉素、3.25mM L-谷氨酰胺、0.2μMβ-巯基乙醇和10％FBS 的RPMI-1640)重新混悬、随后滴加2mL、4mL、8mL和16mL完全培养基并同时温和旋转使PBMC融化。将细胞旋转5分钟，并将细胞沉淀重新混悬在完全培养基中。通过使细胞溶液通过23号注射器针头和40μM细胞过滤器打碎细胞团块。将每孔10万个细胞以总计30μL的体积加入384 孔聚苯乙烯组织培养物处理的平底板中。将含有抗-人CD3抗体、抗人CD28 抗体、IL-23和在完全培养基中制备的化合物的刺激性混合物以30μL的总体积同时加入到细胞中。添加的刺激物的终浓度是：抗-人CD3抗体、抗- 人CD28抗体和IL-23分别为160ng/mL、500ng/mL和5ng/mL，DMSO 为0.3％。用

密封膜密封板并在37℃、95％湿度和5％CO₂下孵育48小时。

孵育期后，将板以200×g旋转5分钟。使用等体积的1％BSA/PBS将上清液按照1:1稀释，根据试剂盒提供的方案，使用来自R&D system的人IL-17ELISA试剂盒(目录号D317E)测试IL-17，一个不同之处是：使用比色底物OPD(邻苯二胺二盐酸盐，Sigma Cat#P6912)替代试剂盒中提供的底物。用Envision多标记读板仪测量492nm处的吸光度。如下所示基于IL-17标准曲线将A492值转化为IL-17的浓度：

pg/mL IL-17＝EC50*[[(上-下)/(A492-下)]-1](1/-Hill)

基于转换值，使用标准4-参数拟合来计算抑制IL-17分泌的IC₅₀，最大抑制来自既不添加刺激物、也不添加化合物的孔的平均值，最小抑制来自仅具有刺激物、不添加化合物的孔的平均值。

将等体积的Cell

细胞生存力测试试剂(Promega Cat# G7573)加入到板中剩余的细胞中，在室温下通过温和振荡孵育15分钟后，用Envision多标记读板仪测量发光。通过将100％活性(细胞死亡)设定为零发光单位并将最小活性(活细胞的最大数量)设定为仅含有刺激物、不含添加化合物的孔的平均发光单位来计算细胞死亡百分比。使用标准四参数拟合计算IC₅₀。

下列示例性化合物的结果如下表4中所示。

表4

平均值±SEM；SEM＝平均值的标准误差

这些结果证明，表4的化合物抑制PBMC中抗-CD3/抗-CD28/IL-23刺激的IL-17分泌，没有可测量的细胞毒性作用。

葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)诱导的关节炎模型：

GPI诱导的关节炎模型是由K.Iwanami等人Arthritis Rheumatism 58, 754–763,2008以及D.Schubert等人J Immunology 172,4503-4509,2008 调整获得的。基于在免疫接种当天(第0天)收集的体重，将小鼠(8-9周龄雄性DBA/1小鼠)(Harlan)随机分配到治疗组中。在免疫接种的当天(第0天)，将重组人GPI(在PBS中稀释至4mg/mL，Gibco)和完全弗氏佐剂(CFA， Sigma)的1:1(v:v)混合物在高速均浆器(Omni)上在冷室中混合40分钟。在乳剂中达到2mg/mL GPI的终浓度。给小鼠在尾基底部注射GPI乳剂(2 个注射部位，皮下，每个部位100μL)。从免疫接种当天(第0天)开始口服施用测试化合物。从第0天开始，基于0至3的评分系统对每只爪进行关节肿胀的严重程度评分(参见K.Iwanami等人ArthritisRheumatism 58, 754–763,2008.临床评分代表了所有4只爪的总评分(最高分数＝12)。在第 0、2、4、7、8、9、10、11、12、14、16、18和21天评价临床评分。

从免疫接种当天(第0天)到第21天，通过梯形方法计算AUC以用于随时间推移变化的临床评分。用Student检验p-值。

在第0天开始实施例3(1000mg/Kg)和媒介物(在纯水中的1％HEC、 0.25％聚山梨醇酯80和0.05％消泡剂)治疗(n＝8/组)，每天一次口服施用。实施例3与媒介物组相比减少了爪肿胀的严重程度并且在疾病过程中维持较低的平均临床评分。该作用导致临床评分AUC降低75％，所述临床评分AUC是爪肿胀随时间推移变化的累积量度，其与媒介物组相比具有统计学显著性，如表5中所示。

表5

治疗	临床打分AUC(平均值±SEM)
		媒介物	87.70±4.88
实施例3	22.20±8.68*

数值显示为平均值±SEM。*与媒介物相比p<0.05(Student t-检验)。SEM＝平均的标准误差

Claims

1.下式的化合物

或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的化合物，其是下式的化合物

或其药学上可接受的盐。

3.权利要求1或2的化合物，其是下式的化合物

4.药物组合物，其包含权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

5.权利要求4的药物组合物，其中所述赋形剂是稀释剂。

6.权利要求4的药物组合物，其包含一种或多种另外的治疗剂。

7.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗。

8.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗银屑病。

9.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗血清阴性脊椎关节病。

10.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗中轴型脊柱关节炎。

11.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗强直性脊椎炎。

12.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐，其用于治疗银屑病关节炎。

13.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗银屑病的药剂中的用途。

14.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗血清阴性脊椎关节病的药剂中的用途。

15.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗中轴型脊柱关节炎的药剂中的用途。

16.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗强直性脊椎炎的药剂中的用途。

17.权利要求1-3中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗银屑病关节炎的药剂中的用途。