TW201642845A

TW201642845A - 黏膜免疫調節劑

Info

Publication number: TW201642845A
Application number: TW105112471A
Authority: TW
Inventors: 三隅将吾; 生田智樹; 立藤智基
Original assignee: 山田養蜂場本社股份有限公司; 國立大學法人熊本大學
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2016-12-16
Also published as: TWI719977B; JPWO2016170959A1; EP3287129A4; EP3287129A1; MY180228A; US20180104205A1; CN107530305A; SG11201708536TA; US20200093776A1; JP6202587B2; CN107530305B; WO2016170959A1

Abstract

本發明提供一種黏膜免疫調節劑，其含有選自由下述通式(1)所表示之飽和脂肪酸及其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分；R-COOH (1) [通式(1)中，R表示經1個羥基取代之碳數7~11之烷基]。

Description

黏膜免疫調節劑

本發明係關於一種新穎之黏膜免疫調節劑。

由於與外界相接之腸管及呼吸器官等黏膜組織多數情況下成為初發感染部位，故而就預防醫學觀點而言，強化黏膜免疫功能較為重要。作為感染防禦機制之第一線障壁，關於黏膜免疫應答之誘導及控制，派氏集合淋巴結(Peyer's patch)及鼻咽相關淋巴組織(NALT)擔負中心作用。微皺褶細胞(Microfold細胞或M細胞)發現於與覆蓋派氏集合淋巴結等腸管相關淋巴組織及NALT等淋巴濾泡之濾泡相關之上皮(FAE)。M細胞係經由腸管內之抗原之引入及轉胞吞作用(transcytosis)而開始黏膜免疫應答(非專利文獻1)。糖蛋白質2(GP2)係作為M細胞特異性標記物而已知(非專利文獻2)。

作為黏膜免疫調節劑，於專利文獻1中揭示有一種含有選自蜂王漿、蜂膠、蜂花粉中之至少任1種蜂產品作為有效成分之黏膜免疫調節劑。

[先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本專利特開2011-84525號公報

[非專利文獻]

非專利文獻1：Bioscience of Microbiota, Food and Health, 2014年，33卷(3號), pp.91-97

非專利文獻2：Mucosal Immunology, 2013年，6卷(4號), pp.666-677

雖如專利文獻1所揭示般，已知有一些黏膜免疫調節劑，但為了滿足需求者之多樣化之需求，可謂仍不存在充分之選項。因此，本發明之目的在於提供一種新穎之黏膜免疫調節劑。

本發明係關於一種黏膜免疫調節劑，其含有選自由下述通式(1)所表示之飽和脂肪酸及其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分；R-COOH (1)

[通式(1)中，R表示經1個羥基取代之碳數7~11之烷基]。

本發明之黏膜免疫調節劑由於以選自由上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸及其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分，故而可使黏膜免疫活化。

上述飽和脂肪酸較佳為R為經1個羥基取代之壬基。又，上述飽和脂肪酸更佳為3-羥基癸酸及10-羥基癸酸。藉此，可進一步使黏膜免疫活化。

上述飽和脂肪酸進而較佳為10-羥基癸酸。10-羥基癸酸亦作為蜂王漿之構成成分而已知，對活體之安全性較高，且亦可長時間持續地攝取。

本發明之黏膜免疫調節劑係以選自由上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸及其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分，藉此可誘導M細胞之分化。本發明之黏膜免疫調節劑之作用機制之至少一部分係基於該M細胞之分化誘導。

又，本發明亦關於一種黏膜免疫調節用食品組合物，其包含上述黏膜免疫調節劑。於該食品組合物中包含食品、健康食品、功能性表示食品、營養輔助食品、補充品及特定保健用食品。

上述食品組合物由於包含本發明之黏膜免疫調節劑，故而具有使黏膜免疫活化之功能，適宜地用作黏膜免疫調節用。

進而，本發明亦關於一種包含上述黏膜免疫調節劑之佐劑。上述黏膜免疫調節劑由於可誘導與黏膜免疫應答之開始相關之M細胞之分化，故而可適宜地用作佐劑。

進而，又，本發明亦關於一種包含上述佐劑之疫苗製劑。

本發明亦可視為用於黏膜免疫調節之上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽。又，本發明亦可視為含有選自由用於黏膜免疫調節之上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分的劑。

本發明亦可視為黏膜免疫調節劑之製造中之上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽的使用。

本發明亦可視為調節黏膜免疫之方法，其包括如下步驟：將含有選自由上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分之黏膜免疫調節劑的有效量投予至必需其之對象中。

藉由本發明，提供一種新穎之黏膜免疫調節劑。本發明之黏膜免疫調節劑由於可誘導M細胞之分化，故而亦可用作佐劑。

圖1(a)~(d)係表示M細胞分化誘導試驗之結果之FACS之頻佈圖。

圖2係表示M細胞分化誘導試驗之結果之電子顯微鏡照片。

圖3係表示M細胞分化誘導試驗之結果之螢光免疫組織染色照片。

圖4係表示免疫調節試驗之結果之螢光免疫組織染色照片。

圖5係表示抗體效價之測定結果之圖表。

以下，對用以實施本發明之形態詳細地進行說明。但是，本發明並不限定於以下之實施形態。

本發明之黏膜免疫調節劑含有選自由通式(1)所表示之飽和脂肪酸(以下，亦簡稱為「飽和脂肪酸」)及其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分。

R-COOH (1)

通式(1)中，R表示經1個羥基取代之碳數7~11之烷基。

作為R中之碳數7~11之烷基，可列舉：庚基、辛基、壬基、癸基及十一烷基。R中之1個羥基被取代為該等烷基中之任意之氫原子即可。

R較佳為經1個羥基取代之壬基。作為於此情形時之飽和脂肪酸，可列舉：2-羥基癸酸、3-羥基癸酸、4-羥基癸酸、5-羥基癸酸、6-羥基癸酸、7-羥基癸酸、8-羥基癸酸、9-羥基癸酸、10-羥基癸酸。

作為飽和脂肪酸，更佳為3-羥基癸酸及10-羥基癸酸，進而較佳為10-羥基癸酸。

飽和脂肪酸係於存在光學異構物之情形時，可為R體及S體中之任一種。

飽和脂肪酸可為食品用途或醫藥用途中所容許之與鹼金屬、鹼土金屬、其他金屬、銨等之鹽。具體而言，例如可列舉：鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鎂鹽。

上述飽和脂肪酸及其鹽可依據將蓖麻油(castor oil)中所包含之蓖麻油酸進行鹼熔解之方法(例如Eur.J.Lipid Sci.Technol.,2010年， 112(1),pp.10-30；J.Am.Oil Chem.Soc.,1974年，51(3),pp.65-71)等常規方法而製造。又，亦可使用市售者。

本發明之黏膜免疫調節劑可單獨含有1種上述飽和脂肪酸及其鹽，亦可組合含有2種以上。

本發明之黏膜免疫調節劑可僅含有上述有效成分，亦可於不妨礙本發明之效果之範圍內，進而含有其他成分。作為其他成分，例如可列舉：藥學上所容許之成分(例如賦形劑、結合材料、潤滑劑、崩解劑、乳化劑、界面活性劑、基劑、溶解助劑、懸浮劑)；作為食品所容許之成分(例如礦物類、維生素類、類黃酮類、醌類、多酚類、胺基酸、核酸、必需脂肪酸、清涼劑、結合劑、甜味劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、香料、穩定劑、防腐劑、緩釋調整劑、界面活性劑、溶解劑、濕潤劑)。

本發明之黏膜免疫調節劑係以有效成分量換算，可以每天1mg以上且10g以下之用量而用於體重60kg之成人，較佳為以5mg以上且8g以下之用量而使用，更佳為以10mg以上且3g以下之用量而使用，進而較佳為以15mg以上且1.5g以下之用量而使用，更進一步較佳為以20mg以上且1g以下之用量而使用，並且更進一步較佳為以22mg以上且500mg以下之用量而使用，尤佳為以24mg以上且250mg以下之用量而使用。關於將本發明之黏膜免疫調節劑用於幼兒之情形時之用量，例如可於自6歲至未達13歲設為成人之3/5用量，於自1歲至未達6歲設為成人之2/5用量，於未達1歲設為1/5用量。該用量可根據攝取之人之健康狀態、投予方法及與其他劑之組合等因素，於上述範圍內適當設定。

本發明之黏膜免疫調節劑可經口投予(攝取)，亦可非經口投予(例如鼻腔內投予)。本發明之黏膜免疫調節劑若每天之有效成分量處於上述範圍內，則可一天投予一次，亦可分為複數次而投予，例如一天兩次、一天三次。又，本發明之黏膜免疫調節劑較佳為持續地投予。藉由持續地投予，進一步顯著地發揮黏膜免疫調節效果。

本發明之黏膜免疫調節劑可為固體、液體、糊劑等任一種形狀。本發明之黏膜免疫調節劑之形態例如可為素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、錠劑、膠囊(硬膠囊、軟膠囊、無縫膠囊)。本發明之黏膜免疫調節劑例如可將作為有效成分之飽和脂肪酸或其鹽視需要與其他成分進行混合並成形為上述劑型，藉此進行製備。

本發明之黏膜免疫調節劑可以醫藥品、準藥品及食品組合物本身之形式使用，且可添加至醫藥品、準藥品及食品組合物中而使用。作為食品組合物，較佳為強調食品之三次功能(身體狀況調節功能)之食品。作為強調食品之三次功能之食品，例如可列舉：健康食品、功能性表示食品、營養輔助食品、補充品及特定保健用食品。

包含本發明之黏膜免疫調節劑之醫藥品、準藥品或食品組合物、或包含本發明之黏膜免疫調節劑之醫藥品、準藥品或食品組合物可為黏膜免疫調節用，亦可附加如下顯示：「提高免疫力之意旨」、「形成耐受病毒之身體之意旨」、「支持免疫功能之意旨」、「有助於M細胞之增加之意旨」、「保持免疫力之意旨」、「維持免疫力之意旨」、「適於容易感冒之人之意旨」、「使免疫功能良好之意旨」、「有助於防止弱化之免疫系統衰弱之意旨」、「形成耐受食物中毒細菌之身體之意旨」、「支持黏膜之健康之意旨」、「支持黏膜免疫之意旨」、「支持鼻或喉嚨之健康之意旨」、「有助於維持冬季之健康之意旨」、「有助於維持寒冷時期之健康之意旨」、「耐受寒冷季節之意旨」等。

醫藥品、準藥品及食品組合物中之本發明之黏膜免疫調節劑之含量只要以每天攝取之有效成分量成為上述範圍內之方式，根據醫藥品、準藥品及食品組合物之種類等而適當設定即可。

於以食品組合物本身之形式或添加至食品組合物中而使用本發明之黏膜免疫調節劑之情形時，食品組合物之形態並無特別限定，例如可為飲料類(咖啡、果汁、茶飲料等清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、酸乳飲料、碳酸飲料等)；西點塗料類(乳蛋糕乳脂等)；糊劑類(水果糊等)；西式點心類(巧克力、甜甜圈、餡餅、泡芙、口香糖、果凍、糖果、曲奇、蛋糕、布丁等)；日式點心類(大福、年糕、饅頭、長崎蛋糕、豆沙水果涼粉、羊羹等)；冰點心類(冰淇淋、冰棒、雪糕等)；食品類(咖喱、牛肉蓋飯、雜燴粥、味噌湯、湯、肉食調味汁、意大利麵、醃製品、果醬等)；調味料類(沙拉調料、香鬆、味道調味料、湯之材料等)。

於強調食品之三次功能之食品(例如健康食品、功能性顯示食品、營養輔助食品、補充品或特定保健用食品)本身之形式，或添加至強調食品之三次功能之食品中而使用本發明之黏膜免疫調節劑的情形時，強調食品之三次功能之食品之形態除上述食品的形態以外，例如亦可為素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、錠劑、膠囊(硬膠囊、軟膠囊、無縫膠囊)。

於以醫藥品或準藥品本身之形式，或添加至醫藥品或準藥品中而使用本發明之黏膜免疫調節劑之情形時，醫藥品或準藥品之形態並無特別限定，例如可為素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、錠劑、膠囊(硬膠囊、軟膠囊、無縫膠囊)。

添加有本發明之黏膜免疫調節劑之醫藥品、準藥品或食品組合物之製法並無特別限定，可適當依據公知之方法。例如，可於醫藥品、準藥品或食品組合物之製造步驟中之中間製品或最終製品中混合本發明之黏膜免疫調節劑等，獲得上述用途中所使用之醫藥品、準藥品或食品組合物。

上述本發明亦可視為用於黏膜免疫調節之上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽。又，本發明亦可視為含有用於黏膜免疫調節之選自由上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分的劑。進而，本發明亦可視為黏膜免疫調節劑之製造中之上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽的使用。

又，上述本發明亦可視為調節黏膜免疫之方法，其包括如下步驟：將含有選自由上述通式(1)所表示之飽和脂肪酸或其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分之黏膜免疫調節劑的有效量投予至必需其之對象中。對象可為嚙齒類、有蹄類、食肉類、有袋類及靈長類。對象較佳為食蟹獼猴及人類等哺乳動物，更佳為人類。

[疫苗製劑]

本發明之黏膜免疫調節劑亦可用作佐劑。本發明之佐劑之作用機制之至少一部分係基於誘導與黏膜免疫應答之開始相關的M細胞之分化。本實施形態之佐劑可包含上述黏膜免疫調節劑，亦可包含上述黏膜免疫調節劑。

本發明之疫苗製劑包含上述佐劑。本發明之佐劑可與各種免疫原組合而製成疫苗製劑。本發明之疫苗製劑可為混合佐劑與免疫原而成者，又，亦可分別分離佐劑及免疫原，於投予時進行混合或分開投予。本發明之疫苗製劑可為治療用，亦可為預防用。

作為與本發明之佐劑進行組合之免疫原，只要為對人類等哺乳動物引起免疫應答之抗原則並無特別限制。作為免疫原之具體例，可列舉：選自由流行性感冒病毒、輪狀病毒、腺病毒、諾如病毒、麻疹病毒、風疹病毒、流行性腮腺炎病毒、艾滋病毒、肝炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、百日咳菌、白喉菌、幽門螺桿菌、出血性大腸桿菌(EHEC)、披衣菌原蟲、黴漿菌原蟲、瘧疾原蟲、球蟲原蟲及血吸蟲所組成之群中之一種或兩種以上之病原微生物、及源自該等之抗原、朊病毒蛋白質等。該等免疫原可為經不活化者，亦可為未經不活化者。

本發明之疫苗製劑中之免疫原與佐劑之量比可根據使用之免疫原的種類、疫苗製劑之目的等而適當設定，例如可設為1：0.0001~1：10,000(重量比)，較佳為設為1：0.1~1：10(重量比)。

本發明之疫苗製劑之形狀可為液狀，亦可為粉末狀。本發明之疫苗製劑之形態並無特別限定，例如可為素錠、糖衣錠、顆粒、粉末、錠劑、膠囊(硬膠囊、軟膠囊、無縫膠囊)。

可使本發明之疫苗製劑中包含公知之穩定劑及防腐劑等。本發明之疫苗製劑可藉由公知之方法而製造。本發明之疫苗製劑可經口接種，亦可經鼻攝取。

本發明之疫苗製劑可藉由包括如下步驟之方法而投予：對於對象投予佐劑；及對該對象投予免疫原。佐劑之投予與免疫原之投予可同時進行，亦可分開進行。又，例如，亦可先進行佐劑之投予，繼而進行免疫原之投予。進而，亦可一面持續地投予佐劑，一面適時地進行免疫原之投予。本發明之疫苗製劑例如較佳為以於持續地投予佐劑後，投予免疫原之方式而使用。藉此，可進一步增強免疫應答之誘導。作為持續地投予佐劑之態樣之具體例，例如可列舉3天以上、較佳為7天以上、更佳為14天以上、進而較佳為21天以上持續進行1天1次之有效量之投予。又，可於每天之有效量之範圍內，分為複數次而投予例如一天兩次、一天三次。

佐劑之有效量係以有效成分量換算，於體重60kg之成人中為每天1mg以上且10g以下之用量，較佳為5mg以上且8g以下之用量，更佳為10mg以上且3g以下之用量，進而較佳為15mg以上且1.5g以下之用量，進一步較佳為20mg以上且1g以下之用量，更進一步較佳為22mg以上且500mg以下之用量，尤佳為24mg以上且250mg以下之用量。又，關於用於幼兒之情形時之有效量，例如可於自6歲至未達13歲設為成人之3/5用量，於自1歲至未達6歲設為成人之2/5用量，於未達1歲設為1/5用量。該用量可根據攝取之人之健康狀態、投予方法及與其他劑之組合等因素，於上述範圍內適當設定。

[實施例]

以下，基於實施例更具體地說明本發明。但是，本發明並不限定於以下之實施例。

[試驗例1：M細胞分化誘導試驗-體外試驗]

[細胞培養]

作為體外M細胞模型，使用源自人類腸管上皮細胞之Caco-2細胞。Caco-2細胞係使用於EMEM(Eagle's minimum essential medium，依格爾最低必需培養基)培養基(日水製藥股份有限公司製造)中補充2%胎牛血清(FCS：CANSERA INTERNATIONAL公司製造)、2mM麩胺酸(和光純藥股份有限公司製造)及0.1mM非必需胺基酸(Gibco公司製造)而成之培養基，於37℃下於5%CO₂存在下進行培養。細胞係於對數增殖之範圍內(2.0×10⁵~1.0×10⁶cells/mL)進行繼代培養。再者，細胞濃度係利用錐蟲藍染色法，將活細胞數及死細胞數進行計數而求出。

[螢光活化細胞分類(FACS)分析]

以GP2作為指標並藉由FACS而分析利用各種脂肪酸(10-羥基癸酸、(+/-)-3-羥基癸酸、(9R)-9,10-二羥基癸酸、10-羥基-2-(E)-癸烯酸)之M細胞之分化誘導。10-羥基癸酸(10HDAA)使用SIGMA-ALDRICH公司製造者，(+/-)-3-羥基癸酸(3HDAA)使用SIGMA-ALDRICH公司製造者，10-羥基-2-(E)-癸烯酸(10-HDA)使用和光純藥工業股份有限公司製造者。(9R)-9,10-二羥基癸酸(DDA-11)係基於Tetrahedron：Asymmetry,2009年，20,pp457-460之方法，使(4R)-4-(2-羥基乙基)-2,2-二甲基-1,3-二氧雜環戊烷((4R)-4-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-1,3-dioxolane)甲苯磺醯基化，藉由格林鈉(Grignard)反應以5-溴-1-戊烯(5-Bromo-1-pentene)延長鏈後，經過臭氧分解、與乙基膦酸二乙酯(Diethylphosphonicacid ethylester)之維蒂希(Wittig)反應、藉由接觸氫化反應進行之氫化、藉由乙酸處理進行之縮丙酮化物之去除、藉由氫氧化鉀處理進行之乙基之去除，進行合成而使用。

上述各脂肪酸係製備為DMSO(dimethyl sulfoxide，二甲基亞碸)溶液(10mM)。於6孔板播種Caco-2細胞，形成單層膜後，以最終濃度成為100μM之方式添加上述各脂肪酸。又，作為對照，添加同量之DMSO。培養基如上所述。添加後，於37℃下於5%CO₂存在下培養3天。培養後，藉由1mM EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid，四乙酸乙二胺)‧2Na/PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝鹽水)(-)(pH7.2)回收細胞，藉由兔抗GP2抗體(IMGENEX公司製造)及Alexa488標記抗兔抗體(Molecular probes公司製造)進行染色。藉由FACS(BECKMAN COULTER公司製造)分析染色後之細胞，測定GP2表現量。

將FACS之頻佈圖示於圖1。如圖1所示，10-羥基癸酸(圖1(a))及(+/-)-3-羥基癸酸(圖1(b))誘導GP2之表現。又，10-羥基癸酸更強烈地誘導GP2之表現。另一方面，(9R)-9,10-二羥基癸酸(圖1(c))及10-羥基-2-(E)-癸烯酸(圖1(d))不誘導GP2之表現。

[形態分析]

於Transwell插入物(6.5mm Transwell，康寧公司製造)播種Caco-2細胞2×10⁵cells，形成單層膜後，自單層膜之頂端側使10-羥基癸酸(最終濃度100μM)發揮作用，於37℃下於5%CO₂存在下培養3天。培養後，切斷每一Transwell插入物之膜，利用電子顯微鏡(JEOL公司製造)觀察細胞形態。

將電子顯微鏡照片示於圖2。一般而言，M細胞具有形態學上頂端側之微絨毛(microvilli)短於附近之上皮細胞之特徵。於圖2中，如箭頭所示，藉由使10-羥基癸酸發揮作用，觀察到微絨毛較短之細胞。根據該結果，認為表示Caco-2細胞藉由10-羥基癸酸之作用而形態上變化為M細胞樣細胞。

[試驗例2：M細胞分化誘導試驗-體內試驗]

[試驗方法]

藉由PBS(-)將10-羥基癸酸之DMSO溶液(10mM)稀釋100倍而製備試驗液。將3隻公食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(試驗開始時3~4歲，試驗開始時之體重3.53~4.36kg)作為被試驗動物。使用Fine Atomizer(Nasal)(商品編號：FAN020，製造經銷商：吉川化成股份有限公司)，對食蟹獼猴之左右鼻腔每次噴霧上述試驗液約0.1mL。作為對照，使用PBS(-)進行相同之操作。1天1次、3天反覆進行該操作後，於第4天解剖食蟹獼猴，採集咽喉扁桃體部位之鼻咽黏膜。將所採集之鼻咽黏膜藉由Alexa555標記抗GP2抗體(IMGENEX公司製造)或Alexa555標記抗GP2抗體(Abcam公司製造)進行螢光免疫組織染色，利用一體式螢光顯微鏡BZ-9000(基恩士公司製造)觀察螢光圖像。再者，於觀察螢光圖像時，併用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色。

將螢光免疫組織染色照片示於圖3。再者，圖3為了提高視認性，使明暗反轉。如圖3所示，藉由將10-羥基癸酸暴露於鼻腔內3天，鼻咽黏膜狀地觀察到GP2陽性細胞(圖3中，箭頭所例示之黑色之部位)。另一方面，於對照中，未觀察到此種GP2陽性細胞之增加。

[試驗例3：免疫調節試驗-體內試驗]

[試驗方法]

(膠囊劑之製備)

僅將10-羥基癸酸2.4mg填充至腸溶膠囊，製備加入有10-羥基癸酸之膠囊劑(膠囊A片)。除10-羥基癸酸2.4mg以外，亦將作為抗原之胎球蛋白(Fetuin)(3mg)、不活化脊髓灰白質炎病毒抗原(10⁶TCID₅₀)及不活化流行性感冒病毒抗原(220_HA Units)填充至腸溶膠囊，製備含有10-羥基癸酸及上述3種抗原之膠囊劑(膠囊B片)。又，將作為抗原之胎球蛋白(Fetuin)(3mg)、不活化脊髓灰白質炎病毒抗原(10⁶TCID₅₀)及不活化流行性感冒病毒抗原(220_HA Units)填充至腸溶膠囊，製備含有上述3種抗原之膠囊劑(膠囊C片)。

(膠囊劑之投予)

將3頭公食蟹獼猴(Macaca fascicularis)(試驗開始時3~6歲，試驗開始時之體重3.0~6.0kg)作為被試驗動物，依據下述表1所示之排程經口投予上述膠囊A片及膠囊B片(1天1次1片)(以下為試驗群)。作為對照，對3頭公食蟹獼猴(試驗開始時3~6歲，試驗開始時之體重3.0~6.0kg)依據下述表1所示之排程僅經口投予膠囊C片(不投予膠囊A片及膠囊B片)(以下為對象群)。於第22天解剖食蟹獼猴，採集腸管黏膜。將所採集之腸管黏膜藉由Alexa555標記抗GP2抗體(IMGENEX公司製造)或Alexa555標記抗GP2抗體(Abcam公司製造)進行螢光免疫組織染色，利用一體式螢光顯微鏡BZ-9000(基恩士公司製造)觀察螢光圖像。再者，於觀察螢光圖像時，併用DAPI染色。

將螢光免疫組織染色照片之一例示於圖4。再者，圖4為了提高視認性，使明暗反轉。如圖4所示，關於1天1次持續地攝取10-羥基癸酸，並且每隔約3天藉由抗原而致敏之試驗群，於腸管黏膜上觀察到GP2陽性細胞(圖4中，箭頭所例示之黑色之部位)。另一方面，於每隔約3天僅藉由抗原而致敏之對照群中，未觀察到此種GP2陽性細胞之增加。

[試驗例4：抗體效價之測定]

[試驗方法]

採集試驗例3中所飼養之食蟹獼猴之糞便，利用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附分析法)測定糞便中之抗胎球蛋白(Fetuin)IgA抗體效價、抗脊髓灰白質炎病毒IgA抗體效價、抗流行性感冒病毒IgA抗體效價。

胎球蛋白(Fetuin)抗原(西格瑪公司製造)係藉由抗原緩衝液(antigen buffer)(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L MgCl₂、0.1% Tween80)以成為100μg/mL之方式進行溶解。將該抗原加入至Nunc MaxiSorp(註冊商標)平底96孔板(flat-bottom 96well plate)，製作抗原板。流行性感冒病毒H1N1抗原(11,000HA Unit)及脊髓灰白質炎病毒抗原III型(0.67×10⁸TCID₅₀)係藉由25mL之抗原緩衝液(antigen buffer)進行稀釋，以相同之方式製作抗原板。再者，遮蔽係於200μl/孔、4℃之條件下進行過夜(over night)反應。

對糞便試樣，以重量比成為1：4之方式添加樣本緩衝液(sample buffer)(0.1%疊氮化鈉(sodium azide)、1mmol/L EDTA‧2Na、0.05% Tween20、5%脫脂牛奶(nonfat skim milk)、1mmol/L PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride，苯基甲基磺醯氟)之PBS(-)(pH7.2)溶液)。於13,000×g、5分鐘、4℃之條件下將其進行離心分離後，回收上清液，獲得ELISA用樣本。ELISA用樣本係藉由冰感冷凍器保存。於測定時，藉由PBS(-)將ELISA用樣本稀釋10倍及100倍。

於抗原板之各孔(well)每50μl添加所製備之樣本，於低溫室中振盪1.5小時。其後，利用洗滌緩衝液(washing buffer)(0.1% Tween80 in MilliQ：200μl/孔)清洗4次。

第二抗體係以於第二抗體緩衝液(Buffer)(0.5M Tris-HCl、1.75% NaCl)中成為1%之方式溶解BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白)，利用該緩衝液(buffer)將以下之(a)及(b)之抗體稀釋5000倍而製備。

(a)過氧化酶標記親和純化抗體猴子IgA(α)(Peroxidase-Labeled Affinity Purified antibody to Monkey IgA(alpha))(Cat.No.074-11-011,KPL)

(b)山羊抗猴IgA(α-鏈特異性)-過氧化酶(親和純化)(Goat Anti-monkey IgA(alpha-chain specifc)-peroxidase(Affinity purified))(Cat.No.70041,Alpha diagnostic international)

於各孔(well)每50μl添加第二抗體之溶液，使之反應0.75小時。反應後，利用洗滌緩衝液(washing buffer)(0.1% Tween80 in MilliQ：200μl/孔)清洗4次。

於各孔(well)每50μl添加底物溶液(substrate solution)(2.68mg TMBZ(tetramethyl benzidine，四甲基聯苯胺)、1.05μl 35%過氧化氫水、7mL EDTA‧2Na(2mM))。最後，於各孔(well)每50μl添加0.3N H₂SO₄而終止反應。其後，測定吸光度(450nm/630nm)。

將糞便中之抗胎球蛋白(Fetuin)IgA抗體效價、抗脊髓灰白質炎病毒IgA抗體效價及抗流行性感冒病毒IgA抗體效價示於圖5。如圖5所示，於1天1次持續地攝取10-羥基癸酸，並且每隔約3天藉由抗原而致敏之試驗群中，觀察到抗胎球蛋白(Fetuin)IgA抗體效價、抗脊髓灰白質炎病毒IgA抗體效價及抗流行性感冒病毒IgA抗體效價之上升。另一方面，於每隔約3天僅藉由抗原而致敏之對照群中，未觀察到此種抗體效價之增加。認為該結果表示藉由持續地投予10-羥基癸酸而誘導免疫應答。又，表示藉由10-羥基癸酸之免疫應答之誘導不依賴抗原之種類，且即便於經不活化之抗原亦可見該情況。進而，表示即便於同時藉由複數個抗原而致敏之情形時，亦可誘導免疫應答。

Claims

一種黏膜免疫調節劑，其含有選自由下述通式(1)所表示之飽和脂肪酸及其鹽所組成之群中之至少1種作為有效成分；R-COOH (1)[通式(1)中，R表示經1個羥基取代之碳數7~11之烷基]。
如請求項1之黏膜免疫調節劑，其中上述R係經1個羥基取代之壬基。
如請求項1之黏膜免疫調節劑，其中上述飽和脂肪酸為3-羥基癸酸及10-羥基癸酸。
如請求項1之黏膜免疫調節劑，其中上述飽和脂肪酸為10-羥基癸酸。
如請求項1至4中任一項之黏膜免疫調節劑，其係基於誘導M細胞之分化者。
一種黏膜免疫調節用食品組合物，其包含如請求項1至5中任一項之黏膜免疫調節劑。
一種佐劑，其包含如請求項1至5中任一項之黏膜免疫調節劑。
一種疫苗製劑，其包含如請求項7之佐劑。