TW201536803A - 結合至ｃｄ３７蛋白質之抗體藥物結合物（ａｄｃ） - Google Patents

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Abstract

本發明係關於結合至CD37蛋白質及其變異體之抗體藥物結合物(ADC)。CD37在正常成人組織中呈現獨特且有限之表現模式且在表I中所列之癌症中異常表現。因此，在一些實施例中，本發明之ADC提供一種用於治療癌症之治療性組合物。

Description

結合至CD37蛋白質之抗體藥物結合物(ADC) 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2013年8月1日申請之美國臨時專利申請案第61/861,321號之優先權。其內容以全文引用之方式併入本文中。
序列表以ASCII正文檔案形式提交
以ASCII正文檔案形式提交之以下內容以全文引用的方式併入本文中：序列表之電腦可讀形式(CRF)(檔案名稱：511582008900SeqList.txt，記錄日期：2014年7月28日，大小：32,152個位元組)。
在一些態樣中，本文所述之本發明係關於結合稱為CD37之蛋白質的抗體、其抗原結合片段及其抗體藥物結合物(ADC)。在一些態樣中，本發明進一步關於適用於治療表現CD37之癌症的預後性、預防性及治療性方法及組合物。
據估計，2013年有1,660,290名男性及女性(854,790名男性及805,500名女性)診斷患有且580,350名男性及女性死於所有部位之癌症。2006-2010年，診斷出所有部位之癌症的中值年齡為66歲。年齡調整發病率為每年每100,000名男性及女性有463.0例。此等比率係基於2006-2010年18個SEER地理區域中所診斷之病例。2006-2010年，死 於所有部位之癌症的中值年齡為72歲。年齡調整死亡率為每年每100,000名男性及女性有176.4例。此等比率係基於2006-2010年美國死亡之患者。2003-2009年18個SEER地理區域中5年總相對存活率為65.8%。
非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma，NHL)可在任何年齡發生且通常特徵為淋巴結大於正常狀態、發熱且體重減輕。有多種不同類型之非霍奇金氏淋巴瘤。此等類型可分成侵襲性(快速生長)及惰性(緩慢生長)類型，且其可由B細胞或T細胞形成。B細胞非霍奇金氏淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤(CLL/SLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、免疫母細胞性大細胞淋巴瘤、前驅物B-淋巴母細胞性淋巴瘤及套細胞淋巴瘤。T細胞非霍奇金氏淋巴瘤包括蕈樣真菌病、間變性大細胞淋巴瘤及前驅T-淋巴母細胞性淋巴瘤。骨髓或幹細胞移植後發生之淋巴瘤通常為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤。預後及治療取決於疾病之階段及類型。
據估計，2013年將有69,740名男性及女性(37,600名男性及32,140名女性)診斷患有且19,020名男性及女性死於非霍奇金氏淋巴瘤。2006-2010年，診斷出非霍奇金氏淋巴瘤之中值年齡為66歲。年齡調整發病率為每年每100,000名男性及女性有19.7例。此等比率係基於2006-2010年18個SEER地理區域中所診斷之病例。2006-2010年，死於非霍奇金氏淋巴瘤之中值年齡為76歲。年齡調整死亡率為每年每100,000名男性及女性有6.4例。此等比率係基於2006-2010年美國死亡之患者。2003-2009年18個SEER地理區域中5年總相對存活率為69.0%。
白血病為起始於血液形成組織(諸如骨髓)中且使大量血細胞產生且進入血流的癌症。主要的白血病包含急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)及毛細胞性白血病(CLL)。
對於此等白血病組，據估計，2013年將有48,610名男性及女性(27,880名男性及20,730名女性)診斷患有且23,720名男性及女性死於白血病。2006-2010年，診斷出白血病之中值年齡為66歲。年齡調整發病率為每年每100,000名男性及女性有12.8例。此等比率係基於2006-2010年18個SEER地理區域中所診斷之病例。2006-2010年，死於白血病之中值年齡為75歲。年齡調整死亡率為每年每100,000名男性及女性有7.1例。此等比率係基於2006-2010年美國死亡之患者。2003-2009年18個SEER地理區域中5年總相對存活率為56.0%。
CLL為成人中之第二最常見類型白血病且其通常緩慢地惡化。其通常在中等年齡期間或中等年齡後發生且很少在兒童中發生。患有早期CLL之患者不用化學療法治療直至其有症狀或呈現疾病快速進展之證據。早期開始化學療法在CLL中未能展示益處且可能甚至提高死亡率。當開始化學療法時，核苷類似物氟達拉濱(fludarabine)為CLL中之最常用一線療法。組合療法在數個臨床試驗中展示改良反應率且包括以下：氟達拉濱、環磷醯胺(cyclophosphamide)及利妥昔單抗(rituximab)(FCR)；噴司他汀(Pentostatin)、環磷醯胺及利妥昔單抗(PCR)；氟達拉濱、環磷醯胺及米托蒽醌(mitoxantrone)(FCM)；環磷醯胺、長春新鹼(vincristine)及潑尼松(prednisone)(CVP)；環磷醯胺、小紅莓(doxorubicin)、長春新鹼及潑尼松(CHOP)。據估計，2013年將有15,680名男性及女性(9,720名男性及5,960名女性)診斷患有且4,580名男性及女性死於慢性淋巴細胞性白血病。2006-2010年，診斷出慢性淋巴細胞性白血病之中值年齡為71歲。年齡調整發病率為每年每100,000名男性及女性有4.3例。此等比率係基於2006-2010年18個SEER地理區域中所診斷之病例。2006-2010年，死於慢性淋巴細胞性 白血病之中值年齡為79歲。年齡調整死亡率為每年每100,000名男性及女性有1.4例。此等比率係基於2006-2010年美國死亡之患者。2003-2009年18個SEER地理區域中5年總相對存活率為79.2%。
急性骨髓性白血病(AML)為成人中最常見類型之急性白血病。AML之當前療法應具有足夠侵襲性以達成完全緩解(CR)，因為部分緩解不能提供實質上存活益處。成人AML中之緩解率關於年齡相反地變化，其中對於小於60歲之成人，預期緩解率超過65%。資料表明，達60歲後，年長患者中緩解持續時間可能變短。表現祖細胞抗原CD34及/或P-醣蛋白(MDR1基因產物)之患者具有較差結果。細胞遺傳學分析提供一些可獲得之最強預後資訊，從而可預測緩解誘導與緩解後療法之結果。表明良好預後之細胞遺傳學異常包括t(8；21)、inv(16)或t(16；16)及t(15；17)。正常細胞遺傳學預示平均風險AML。特徵為缺失染色體5或7之長臂或單染色體；染色體3易位或反轉(t(6；9)、t(9；22))；或染色體11q23異常的患有AML之患者對化學療法具有尤其不良預後。據估計，2013年將有14,590名男性及女性(7,820名男性及6,770名女性)診斷患有且10,370名男性及女性死於急性骨髓性白血病。2006-2010年，診斷出急性骨髓性白血病之中值年齡為67歲。年齡調整發病率為每年每100,000名男性及女性有3.7例。此等比率係基於2006-2010年18個SEER地理區域中所診斷之病例。2006-2010年，死於急性骨髓性白血病之中值年齡為72歲。年齡調整死亡率為每年每100,000名男性及女性有2.8例。此等比率係基於2006-2010年美國死亡之患者。2003-2009年18個SEER地理區域中5年總相對存活率為24.2%。請注意，所有一般癌症資訊均獲自NCI網站(www.cancer.gov)，且所有統計資料係基於以下中可見之SEER發病率及NCHS死亡率統計：Howlader N.等人，SEER Cancer Statistics Review,1975-2010,National Cancer Institute.Bethesda,MD, http：//seer.cancer.gov/csr/1975_2010/，基於2012年11月SEER資料提交，公佈於SEER網站，2013年。
正在實現單株抗體(mAb)之治療效用(G.Kohler及C.Milstein,Nature 256：495-497(1975))。單株抗體現已獲准作為移植、癌症、傳染性疾病、心血管疾病及炎症之療法。不同同型具有不同效應功能。該等功能差異體現在各種免疫球蛋白同型之不同三維結構上(P.M.Alzari等人，Annual Rev.Immunol.,6：555-580(1988))。
由於小鼠方便進行免疫接種且可將大部分人類抗原識別為外來抗原，因此，具有治療潛力之針對人類標靶之mAb通常具有鼠類起源。然而，鼠類mAb作為人類治療劑具有內在缺陷。由於mAb在人體中的循環半衰期比人類抗體短，因此需要更頻繁地給藥。更重要地，向人類免疫系統重複投與鼠類抗體會使人類免疫系統起反應，其將小鼠蛋白識別為外來蛋白且產生人類抗小鼠抗體(HAMA)反應。此類HAMA反應可能引起過敏反應及鼠類抗體自系統中快速清除，從而使鼠類抗體治療無效。為避免該等影響，已試圖在小鼠內建立人類免疫系統。
最初之嘗試希望產生能夠以具有人類序列之抗體對抗原起反應的轉殖基因小鼠(參見Bruggemann等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 86：6709-6713(1989))，但因可用選殖媒劑可穩定維持之DNA量而受限制。酵母人工染色體(YAC)選殖載體之使用將路引向將人類Ig基因座之大生殖系片段引入轉殖基因哺乳動物中。在人類基因組及人類恆定區中發現之以相同間隔排列之大部分人類V、D及J區基因基本上使用YAC引入小鼠中。一個此類轉殖基因小鼠品系稱為XenoMouse®小鼠，且可購自Amgen Fremont,Inc.(Fremont CA)。
此外，可使用VelocImmune轉殖基因小鼠(Regeneron,Tarrytown,NY)製備抗體，在該等小鼠中，免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH區段) 及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座處具有內源小鼠可變區段之基因組序列已完全或部分用具有人類免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座之未重組生殖系可變區段的人類基因組序列置換。參見例如美國專利第6,586,251號、第6,596,541號、第7,105,348號、第6,528,313號、第6,638,768號及第6,528,314號。
在一些態樣中，本發明提供結合至CD37蛋白質及CD37蛋白質之多肽片段的抗體、其抗原結合片段及抗體藥物結合物(ADC)。在一些實施例中，本發明包含與治療劑結合之全人類抗體。在某些實施例中，限制條件為不編碼圖2之整個核酸序列及/或不製備圖3之整個胺基酸序列。在某些實施例中，編碼圖2之整個核酸序列及/或製備圖3之整個胺基酸序列，任一者均為各別人類單位劑型。
在一些態樣中，本發明進一步提供各種免疫原性或治療性組合物(諸如抗體藥物結合物)及治療表現CD37之癌症(諸如表I中所列之組織的癌症，例如AML、CLL、NHL及MM)的策略。
圖1. CD37之cDNA及胺基酸序列展示於圖1中。起始甲硫胺酸標有下劃線。開放閱讀框架自核酸122延伸至核酸967，包括終止密碼子。
圖2. CD37抗體之核酸及胺基酸序列。
圖2A. HvCD37-6b15.1.1重鏈之cDNA及胺基酸序列。雙下劃線為重鏈可變區，下劃線為重鏈可變區，且下劃線為重鏈人類IgG2恆定區。
圖2B. HvCD37-6b15.1.1輕鏈之cDNA及胺基酸序列。雙下劃線為輕鏈可變區，下劃線為人類κ恆定區。
圖3. CD37抗體之胺基酸序列。
圖3A. HvCD37-6b15.1.1重鏈之胺基酸序列。雙下劃線為重鏈可變區且下劃線為人類IgG2恆定區。
圖3B. HvCD37-6b15.1.1輕鏈之胺基酸序列。雙下劃線為輕鏈可變區且下劃線為人類κ恆定區。
圖4. HvCD37-6b15.1.1抗體與人類Ig生殖系之比對。
圖4A. HvCD37-6b15.1.1重鏈與人類Ig生殖系之比對。
圖4B. HvCD37-6b15.1.1輕鏈與人類Ig生殖系之比對。
圖5. HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在CB17/SCID小鼠中植入之皮下建立型人類濾泡B細胞淋巴瘤DoHH2中的功效研究。
圖6. HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在CB17/SCID小鼠中植入之人類淋巴瘤Ramos-RR-XCL之皮下建立型異種移植模型中的功效研究。
圖7. HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在CB17/SCID小鼠中植入之皮下建立型人類慢性淋巴細胞性白血病JVM3中的功效研究。
圖8. HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在CB17/SCID小鼠中植入之皮下建立型人類急性骨髓性白血病MV-4-11中的功效研究。
圖9.數個CD37 ADC在SCID小鼠中植入之皮下建立型人類美羅華抗性淋巴瘤細胞株Ramos-RR-XCL中的功效研究。
圖10.藉由IHC偵測癌症患者標本中之CD37蛋白質。圖10(A)及10(B)展示NHL患者標本。圖10(C)及10(D)展示MM患者標本。
圖11. HvCD37-6b15.1.1vcMMAE(a.k.a.AGS67E)及HvCD37-6b15.1.1 MAb(a.k.a.AGS67C)在SCID小鼠中植入之人類急性單核細胞性白血病細胞株MOLM-13之皮下建立型異種移植模型中的功效研究。
章節大綱
I.)定義
II.)CD37抗體
III.)抗體藥物結合物概述
III(A).類美登素(maytansinoid)
III(B).奧瑞他汀(Auristatin)及海兔毒素(dolostatin)
III(C).卡奇黴素(Calicheamicin)
III(D).其他細胞毒性劑
IV.)結合至CD37之抗體藥物結合物
V.)連接子單元
VI.)延伸子單元
VII.)胺基酸單元
VIII.)間隔子單元
IX.)藥物單元
X.)藥物負載
XI.)測定ADC之細胞毒性作用的方法
XII.)表現CD37之癌症之治療
XIII.)CD37作為基於抗體之療法之標靶
XIV.)CD37 ADC混合物
XV.)組合療法
XVI.)套組/製品
I.)定義：
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術術語、註釋及其他科學術語意欲具有熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之含義。在一些情況下，本文中定義具有通常所瞭解之含義的術語以使含義清晰及/或以備參考，且本文中包括該等定義不必要視為表示與此項技術中一般瞭解之含義有實質差異。熟習此項技術者非常瞭解本文中所描述或 引用之許多技術及程序且通常使用習知方法加以採用，例如廣泛利用之Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.中所描述之分子選殖法。除非另外說明，否則適當時，涉及使用市售套組及試劑之程序一般將根據製造商規定之方案及/或參數執行。
除非上下文中另外指示，否則當本文中使用商標名時，提及商標名亦指商標名產品之產品調配物、通用名藥及活性醫藥成分。
術語「晚期癌症」、「局部晚期癌症」、「晚期疾病」及「局部晚期疾病」意謂已擴散穿過相關組織囊之癌症，且意欲包括根據美國泌尿學學會(American Urological Association；AUA)系統之C期疾病；根據惠特莫耳-朱厄特系統(Whitmore-Jewett system)之C1-C2期疾病；及根據TNM(腫瘤、結節、轉移)系統之T3-T4期及N+疾病。一般而言，對於患有局部晚期疾病之患者，不推薦手術，且此等患者與患有臨床局部化(侷限於器官)癌症之患者相比具有實質上不太有利之結果。
縮寫「AFP」係指二甲基纈胺酸-纈胺酸-多拉異白胺酸-多拉脯胺酸-苯丙胺酸-對苯二胺(dimethylvaline-valine-dolaisoleuine-dolaproine-phenylalanine-p-phenylenediamine)(參見下文之式XVI)。
縮寫「MMAE」係指單甲基奧瑞他汀E(auristatin E)(參見下文之式XI)。
縮寫「AEB」係指由奧瑞他汀E與對乙醯基苯甲酸反應產生之酯(參見下文之式XX)。
縮寫「AEVB」係指由奧瑞他汀E與苯甲醯基戊酸反應產生之酯(參見下文之式XXI)。
縮寫「MMAF」係指多纈胺酸-纈胺酸-多拉異白胺酸-多拉脯胺酸-苯丙胺酸(dovaline-valine-dolaisoleuine-dolaproine-phenylalanine)(參見下文之式XVIV)。
除非另外說明，否則術語「烷基」係指具有約1至約20個碳原子(以及其中碳原子範圍及特定數目的所有組合及亞組合)、較佳具有約1至約8個碳原子之飽和直鏈或分支鏈烴。烷基之實例為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基及3,3-二甲基-2-丁基。
烷基，無論單獨或是作為另一基團之一部分，均可視情況經一或多個、較佳1至3個基團(及選自鹵素之任何其他取代基)取代，包括(但不限於)-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、=O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN，其中各R'係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中該-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基及-C2-C8炔基可視情況進一步經一或多個基團取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R"、-OC(O)R"、-C(O)OR"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R")2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、-N3、-NH2、-NH(R")、-N(R")2及-CN，其中各R"係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外說明，否則術語「烯基」及「炔基」係指具有約2至約20個碳原子(以及其中碳原子範圍及特定數目的所有組合及亞組合)、 較佳具有約2至約8個碳原子之直鏈及分支碳鏈。烯基鏈在鏈中具有至少一個雙鍵且炔基鏈在鏈中具有至少一個參鍵。烯基之實例包括(但不限於)乙烯基、烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基及-2,3-二甲基-2-丁烯基。炔基之實例包括(但不限於)乙炔基(acetylenic)、炔丙基、乙炔基(acetylenyl)、丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基及-3-甲基-1-丁炔基。
烯基及炔基，無論單獨或是作為另一基團之一部分，均可視情況經一或多個、較佳1至3個基團(及選自鹵素之任何其他取代基)取代，包括(但不限於)-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、=O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN，其中各R'係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基，且其中該-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基及-C2-C8炔基可視情況進一步經一或多個取代基取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R"、-OC(O)R"、-C(O)OR"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R")2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、-N3、-NH2、-NH(R")、-N(R")2及-CN，其中各R"係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基。
除非另外說明，否則術語「伸烷基」係指具有約1至約20個碳原子(以及其中碳原子範圍及特定數目的所有組合及亞組合)、較佳具有約1至約8個碳原子且具有兩個自母烷烴之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而獲得之單價基團中心的飽和分支鏈或直鏈烴。典 型伸烷基包括(但不限於)亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基、伸癸基、1,4-伸環己基及其類似基團。伸烷基，無論單獨或是作為另一基團之一部分，均可視情況經一或多個、較佳1至3個基團(及選自鹵素之任何其他取代基)取代，包括(但不限於)-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、=O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN，其中各R'係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中該-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基及-C2-C8炔基可視情況進一步經一或多個取代基取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R"、-OC(O)R"、-C(O)OR"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R")2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、-N3、-NH2、-NH(R")、-N(R")2及-CN，其中各R"係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外說明，否則術語「伸烯基」係指含有至少一個碳碳雙鍵之視情況經取代之伸烷基。例示性伸烯基包括(但不限於)例如伸乙烯基(-CH=CH-)及伸丙烯基(-CH=CHCH2-)。
除非另外說明，否則術語「伸炔基」係指含有至少一個碳碳參鍵之視情況經取代之伸烷基。例示性伸炔基包括例如伸乙炔基(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡CH-)。
除非另外說明，否則術語「芳基」係指具有6至20個碳原子(以及其中碳原子範圍及特定數目的所有組合及亞組合)且自母芳族環系統之單個碳原子移除一個氫原子而獲得之單價芳族烴基。一些芳基在例 示性結構中表示為「Ar」。典型芳基包括(但不限於)衍生自苯、經取代之苯、苯基、萘、蒽、聯苯及其類似物之基團。
芳基，無論單獨或是作為另一基團之一部分，均可視情況經一或多個、較佳1至5個或甚至1至2個基團取代，包括(但不限於)-鹵素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-NO2、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN，其中各R'係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中該-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)及-芳基可視情況進一步經一或多個取代基取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R"、-OC(O)R"、-C(O)OR"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R")2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、-N3、-NH2、-NH(R")、-N(R")2及-CN，其中各R"係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
除非另外說明，否則術語「伸芳基」係指二價(亦即自母芳族環系統之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而獲得)且可能呈鄰、間或對構型之視情況經取代之芳基，如以下結構所示，其中苯 基為例示性芳基：(請將前2個半角逗號改為頓號，最後一個半角逗號改為全角句號)。
典型「-(C1-C8伸烷基)芳基」、「-(C2-C8伸烯基)芳基」及「-(C2-C8伸炔基)芳基」包括(但不限於)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基-乙烯- 1-基、萘甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基及其類似基團。
除非另外說明，否則術語「雜環」係指具有3至14個環原子(亦稱為環成員)且至少一個環中之至少一個環原子為選自N、O、P或S之雜原子(以及其中碳原子及雜原子範圍及特定數目的所有組合及亞組合)的單環、雙環或多環系統。雜環可具有1至4個獨立地選自N、O、P或S之環雜原子。雜環中之一或多個N、C或S原子可經氧化。單環雜環較佳具有3至7個環成員(例如2至6個碳原子及1至3個獨立地選自N、O、P或S之雜原子)，且雙環雜環較佳具有5至10個環成員(例如4至9個碳原子及1至3個獨立地選自N、O、P或S之雜原子)。包括雜原子之環可為芳族或非芳族。除非另外說明，否則雜環係在任何雜原子或碳原子處連接至其側基，從而可產生穩定結構。
雜環描述於以下文獻中：Paquette,「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其第1章、第3章、第4章、第6章、第7章及第9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs」(John Wiley & Sons，New York，1950至今)，尤其第13卷、第14卷、第16卷、第19卷及第28卷；及J.Am.Chem.Soc.82：5566(1960)。
「雜環」基之實例包括例如且不限於吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚啉基(indolenyl)、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙-四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙-四氫哌喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基、哌喃基、異苯并呋喃 基、烯基、基、啡噁噻基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、啶基、喹喏啉基、喹唑啉基、啉基、喋啶基、4H-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋呫基、啡噁嗪基、異烷基、烷基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基及靛紅醯基。較佳「雜環」基包括(但不限於)苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。
雜環基，無論單獨或是作為另一基團之一部分，均可視情況經一或多個、較佳1至2個基團取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN，其中各R'係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中該-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基及-芳基可視情況進一步經一或多個取代基取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R"、-OC(O)R"、-C(O)OR"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R")2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、-N3、-NH2、-NH(R")、-N(R")2及-CN，其中各R"係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、- C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基。
經碳鍵結之雜環係在例如而不限於以下位置處鍵結：吡啶之位置2、3、4、5或6；噠嗪之位置3、4、5或6；嘧啶之位置2、4、5或6，吡嗪之位置2、3、5或6；呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5；異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5；氮丙啶之位置2或3；氮雜環丁烷之位置2、3或4；喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8；或異喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8。更通常，經碳鍵結之雜環包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
經氮鍵結之雜環可在例如而不限於以下位置處鍵結：氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉或1H-吲唑之位置1；異吲哚或異吲哚啉之位置2；嗎啉之位置4；及咔唑或β-咔啉之位置9。更通常，經氮鍵結之雜環包括1-氮丙啶基、1-氮雜環丁基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
除非另外說明，否則術語「碳環」係指具有3至14個環原子(以及其中碳原子範圍及特定數目的所有組合及亞組合)且所有環原子均為碳原子的飽和或不飽和非芳族單環、雙環或多環系統。單環碳環較佳具有3至6個環原子，更佳具有5或6個環原子。雙環碳環較佳具有例如以雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統形式排列之7至12個環原子，或以雙環[5,6]或[6,6]系統形式排列之9或10個環原子。術語「碳環」包括例如稠合至芳基環之單環碳環(例如稠合至苯環之單環碳環)。碳環 較佳具有3至8個碳環原子。
碳環基，無論單獨或是作為另一基團之一部分，均可視情況經例如一或多個基團、較佳1或2個基團(及選自鹵素之任何其他取代基)取代，包括(但不限於)-鹵素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SR'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、=O、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN，其中各R'係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基，且其中該-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)及-芳基可視情況進一步經一或多個取代基取代，包括(但不限於)-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-鹵素、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C(O)R"、-OC(O)R"、-C(O)OR"、-C(O)NH2、-C(O)NHR"、-C(O)N(R")2、-NHC(O)R"、-SR"、-SO3R"、-S(O)2R"、-S(O)R"、-OH、-N3、-NH2、-NH(R")、-N(R")2及-CN，其中各R"係獨立地選自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。
單環碳環取代基之實例包括-環丙基、-環丁基、-環戊基、-1-環戊-1-烯基、-1-環戊-2-烯基、-1-環戊-3-烯基、環己基、-1-環己-1-烯基、-1-環己-2-烯基、-1-環己-3-烯基、-環庚基、-環辛基、-1,3-環已二烯基、-1,4-環已二烯基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚三烯基及-環辛二烯基。
「碳環基」，無論單獨使用或是作為另一基團之一部分，均係指視情況經取代之二價(亦即自母碳環系統之同一碳原子或兩個不同碳原子移除兩個氫原子而獲得)如上文所定義之碳環基。
除非上下文另外指出，否則連字符(-)表示與側位分子之連接 點。因此，術語「-(C1-C8伸烷基)芳基」或「-C1-C8伸烷基(芳基)」係指如本文所定義之C1-C8伸烷基，其中伸烷基係在伸烷基之任何碳原子處連接至側位分子，且鍵結至伸烷基之碳原子的氫原子之一經如本文所定義之芳基置換。
當特定基團「經取代」時，該基團可具有一或多個取代基，較佳具有1至5個取代基，更佳具有1至3個取代基，最佳具有1至2個取代基，該等取代基係獨立地選自取代基清單。然而，該基團一般可具有任何數目之選自鹵素之取代基。以此方式指示經取代之基團。
意欲在分子中之特定位置處之任何取代基或變數的定義與其在該分子中之其他位置處之定義無關。應理解，本文所提供化合物上之取代基及取代型式可由一般技術者選擇，以便提供化學上穩定且可藉由此項技術中已知之技術以及本文中所述之方法容易地合成的化合物。
如本文所用之保護基係指暫時或永久地選擇性阻斷多官能化合物中之一個反應位點的基團。適用於本文所提供之羥基保護基在醫藥學上可接受且在投與個體後可能需要或不需要自母體化合物裂解以使該化合物具有活性。裂解係經由體內正常的代謝過程實現。羥基保護基為此項技術中所熟知，參見T.W.Greene及P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis(John Wiley & sons，第3版)，該文獻係以全文引用的方式且出於所有目的併入本文中，且包括例如醚(例如烷基醚及矽烷基醚，包括例如二烷基矽烷基醚、三烷基矽烷基醚、二烷基烷氧基矽烷基醚)、酯、碳酸酯、胺基甲酸酯、磺酸酯及磷酸酯保護基。羥基保護基之實例包括(但不限於)甲醚；甲氧基甲醚、甲硫基甲醚、(苯基二甲基矽烷基)甲氧基甲醚、苯甲氧基甲醚、對甲氧基苯甲基氧基甲醚、對硝基苯甲氧基甲醚、鄰硝基苯甲氧基甲醚、(4-甲氧基苯氧基)甲醚、愈創木酚甲醚、第三丁氧基甲醚、4-戊烯氧基甲 醚、矽氧基甲醚、2-甲氧基乙氧基甲醚、2,2,2-三氯乙氧基甲醚、雙(2-氯乙氧基)甲醚、2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲醚、甲氧基甲醚、四氫哌喃醚、1-甲氧基環己醚、4-甲氧基四氫硫代哌喃醚、4-甲氧基四氫硫代哌喃醚S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基醚、1,4-二噁烷-2-基醚、四氫呋喃醚、四氫硫代呋喃醚；經取代之乙醚，諸如1-乙氧基乙醚、1-(2-氯乙氧基)乙醚、1-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]乙醚、1-甲基-1-甲氧基乙醚、1-甲基-1-苯甲氧基乙醚、1-甲基-1-苯甲氧基-2-氟乙醚、1-甲基-1-苯氧基乙醚、2-三甲基矽烷醚、第三丁基醚、烯丙醚、炔丙醚、對氯苯基醚、對甲氧苯基醚、苯甲基醚、對甲氧基苯甲基醚、3,4-二甲氧基苯甲基醚、三甲基矽烷醚、三乙基矽烷醚、三丙基矽烷醚、二甲基異丙基矽烷醚、二乙基異丙基矽烷醚、二甲基己基矽烷醚、第三丁基二甲基矽烷醚、二苯基甲基矽烷醚、苯甲醯基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯乙酸酯、苯甲酸酯、烷基甲基碳酸酯、烷基9-茀基甲基碳酸酯、烷基乙基碳酸酯、烷基2,2,2,-三氯乙基碳酸酯、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基碳酸酯、烷基磺酸酯、甲烷磺酸酯、苯甲基磺酸酯、甲苯磺酸酯、亞甲基縮醛、亞乙基縮醛及第三丁基亞甲基縮酮。較佳保護基係由以下各式表示：-Ra、-Si(Ra)(Ra)(Ra)、-C(O)Ra、-C(O)ORa、-C(O)NH(Ra)、-S(O)2Ra、-S(O)2OH、P(O)(OH)2及-P(O)(OH)ORa，其中Ra為C1-C20烷基、C2-C20烯基、C2-C20炔基、-C1-C20伸烷基(碳環)、-C2-C20伸烯基(碳環)、-C2-C20伸炔基(碳環)、-C6-C10芳基、-C1-C20伸烷基(芳基)、-C2-C20伸烯基(芳基)、-C2-C20伸炔基(芳基)、-C1-C20伸烷基(雜環)、-C2-C20伸烯基(雜環)或-C2-C20伸炔基(雜環)，其中該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基、碳環基及雜環基不論單獨或是作為另一基團之一部分均視情況 經取代。
出於本文之目的，「改變天然糖基化模式」意欲意謂在天然序列CD37中所發現之一或多個碳水化合物部分缺失(藉由移除潛在糖基化位點，或藉由用化學及/或酶促方式使糖基化作用缺失)，及/或添加天然序列CD37中不存在之一或多個糖基化位點。此外，該短語包括天然蛋白之糖基化的定性變化，包含所存在之各種碳水化合物部分之性質及比例變化。
術語「類似物」係指一種與另一種分子(例如CD37相關蛋白質)結構相似或者共有相似或一致屬性的分子。舉例而言，特異性結合至CD37之抗體或T細胞可特異性結合CD37蛋白質之類似物。
除非另外明確指示，否則術語「抗體」係以最廣泛之意義使用。因此，「抗體」可為天然存在之抗體或人造抗體，諸如由習知融合瘤技術產生之單株抗體。CD37抗體包含單株及多株抗體以及含有此等抗體之抗原結合域及/或一或多個互補決定區之片段。如本文中所用，術語「抗體」係指特異性結合CD37及/或展現所要生物活性之任何形式之抗體或其片段，且特別涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其特異性結合CD37及/或展現所要生物活性即可。任何特異性抗體均可用於本文所提供之方法及組合物中。因而，在一個實施例中，術語「抗體」涵蓋包含至少一個來自輕鏈免疫球蛋白分子之可變區與至少一個來自重鏈分子之可變區，組合形成標靶抗原之特異性結合位點的分子。在一個實施例中，抗體為IgG抗體。舉例而言，抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。適用於本發明方法及組合物中之抗體可在細胞培養物、噬菌體或各種動物中產生，包括(但不限於)牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩及猿。因此，在一個實施例中，在一些實施例中，本發明之抗體為哺乳動物 抗體。可使用噬菌體技術分離初始抗體或產生具有改變之特異性或親合力特徵的變異體。該等技術為常規技術且為此項技術中所熟知。在一個實施例中，該抗體係由此項技術中已知之重組方式產生。舉例而言，可藉由用包含編碼該抗體之DNA序列之載體轉染宿主細胞來產生重組抗體。可使用一或多種載體在宿主細胞中將表現至少一個VL及至少一個VH區之DNA序列轉染。抗體產生及製造之重組方式之例示性描述包括Delves,ANTIBODY PRODUCTION：ESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley,1997)；Shephard等人，MONOCLONAL ANTIBODIES(Oxford University Press,2000)；Goding,MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press,1993)；及CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley & Sons，最新版本)。可藉由重組方式修飾本發明之抗體以增強抗體介導所要功能時之功效。因而，使用重組方式藉由取代來修飾抗體在本發明之範疇內。取代通常將為保守性取代。舉例而言，抗體恆定區中之至少一個胺基酸可用不同殘基置換。參見例如美國專利第5,624,821號、美國專利第6,194,551號、申請案第WO 9958572號；及Angal等人，Mol.Immunol.30：105-08(1993)。胺基酸之修飾包括胺基酸之缺失、添加及取代。在一些情況下，進行該等改變以降低不需要之活性，例如補體依賴性細胞毒性。通常藉由與提供可偵測信號之物質共價或非共價地接合來標記抗體。已知多種標記及結合技術且廣泛報導於科學及專利文獻中。可針對與正常或缺陷性CD37之結合情況，篩檢此等抗體。參見例如ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press,1996)。可用以下活體外分析法，包括(但不限於)：增殖、遷移、黏著、軟瓊脂生長、血管生成、細胞間通信、細胞凋亡、轉運、信號轉導，及以下活體內分析法，諸如抑制腫瘤生長，來鑑別具有所要生物 活性之適合抗體。本文所提供之抗體亦可用於診斷性應用。作為捕捉抗體或非中和抗體時，可針對結合至特異性抗原而不抑制抗原之受體結合活性或生物活性的能力來篩檢其。作為中和抗體時，該等抗體可用於競爭性結合分析法。其亦可用於定量CD37或其受體。
如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」或「抗體片段」(或單純「抗體部分」)係指CD37抗體之保留特異性結合至抗原(例如CD37及變異體；圖1)之能力的一或多個片段。已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段之實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含兩個在鉸鏈區處由雙硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，其係由VH結構域組成；及(vi)分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由各別基因編碼，但其可使用重組法由使其能夠形成其中VL與VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)的合成連接子接合。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用來篩檢該等片段。
如本文所使用，任何形式之「抗原」均可用於產生對CD37具有特異性之抗體。因而，該引發抗原可為單一抗原決定基、多抗原決定基或者單獨或與此項技術中已知之一或多種免疫原性增強劑組合之完整蛋白。該引發抗原可為分離之全長蛋白、細胞表面蛋白(例如用經該抗原之至少一部分轉染之細胞免疫接種)或可溶性蛋白(例如僅用該 蛋白之細胞外域部分免疫接種)。抗原可在遺傳修飾之細胞中產生。編碼該抗原之DNA可為基因組DNA或非基因組DNA(例如cDNA)且編碼胞外域之至少一部分。如本文中所用，在抗原之情形下，術語「部分」係指視情況組成相關抗原之免疫原性抗原決定基的最少數目之胺基酸或核酸。可採用適合轉形相關細胞之任何遺傳載體，包括(但不限於)腺病毒載體、質體及非病毒載體，諸如陽離子脂質。在一個實施例中，本文之方法及組合物之抗體特異性結合相關CD37細胞外域之至少一部分。
本文所提供之抗體或其抗原結合片段可結合至「生物活性劑」。如本文中所用，術語「生物活性劑」係指結合抗原及/或增強或介導所要生物效應以增強殺死細胞之毒素的任何合成或天然存在之化合物。在一個實施例中，適用於本發明之結合片段為生物活性片段。如本文中所用，術語「生物活性」係指抗體或抗體片段能夠結合所要抗原決定基且直接或間接發揮生物效應。直接效應包括(但不限於)：調節、刺激及/或抑制生長信號；調節、刺激及/或抑制抗細胞凋亡信號；調節、刺激及/或抑制細胞凋亡或壞死信號；調節、刺激及/或抑制ADCC級聯；及調節、刺激及/或抑制CDC級聯。
「雙特異性」抗體亦適用於本發明之方法及組合物。如本文中所用，術語「雙特異性抗體」係指對至少兩種不同抗原決定基具有結合特異性之抗體，通常為單株抗體。在一個實施例中，抗原決定基來自同一抗原。在另一實施例中，抗原決定基來自兩種不同抗原。製備雙特異性抗體之方法為此項技術中已知。舉例而言，雙特異性抗體可利用兩個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對之共同表現以重組性方式產生。參見例如Milstein等人，Nature 305：537-39(1983)。或者，雙特異性抗體可使用化學鍵聯來製備。參見例如Brennan等人，Science 229：81(1985)。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片段。參見例如Hollinger等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-48(1993)，Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994)。
本文中描述之單株抗體特別包括「嵌合」抗體，其中一部分重鏈及/或輕鏈與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之抗體中的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其特異性結合標靶抗原及/或展現所要生物活性即可(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
術語「化學治療劑」係指可有效抑制腫瘤生長之所有化合物。化學治療劑之非限制性實例包括烷基化劑，例如氮芥類、伸乙亞胺化合物及烷基磺酸酯；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如抗微管蛋白劑，諸如長春花生物鹼、奧瑞他汀及鬼臼黴素(podophyllotoxin)衍生物；細胞毒性抗生素；損傷或干擾DNA表現或複製之化合物，例如DNA小溝結合劑；及生長因子受體拮抗劑。此外，化學治療劑包括細胞毒性劑(如本文中所定義)、抗體、生物分子及小分子。
術語「化合物」係指且涵蓋化合物自身以及以下(無論是否明確陳述，且除非上下文明確闡述不包括以下)：化合物之非晶形及結晶形態，包括多晶形態，其中此等形態可為混合物之一部分或呈分離形式；化合物之游離酸及游離鹼形式，其通常為本文所提供之結構中所示之形式；化合物之異構體，其係指光學異構體及互變異構體，其中光學異構體包括對映異構體及非對映異構體、對掌性異構體及非對掌性異構體，且光學異構體包括分離之光學異構體以及光學異構體之混合物，包括外消旋混合物及非外消旋混合物；其中異構體可呈分離形式或呈與一或多種其他異構體之混合物形式；化合物之同位素，包括 含有氘及氚之化合物，且包括含有放射性同位素之化合物，包括治療上有效及診斷上有效之放射性同位素；化合物之多聚體形式，包括二聚體、三聚體等形式；化合物之鹽，較佳為醫藥學上可接受之鹽，包括酸加成鹽及鹼加成鹽，包括具有有機相對離子及無機相對離子之鹽，且包括兩性離子形式，其中若化合物與兩個或兩個以上相對離子締合，則該兩個或兩個以上相對離子可能相同或不同；及化合物之溶劑合物，包括半溶劑合物、單溶劑合物、二溶劑合物等等，包括有機溶劑合物及無機溶劑合物，該等無機溶劑合物包括水合物；其中若化合物與兩個或兩個以上溶劑分子締合，則該兩個或兩個以上溶劑分子可能相同或不同。在一些情況下，本文提及本發明化合物將包括明確提及一或多種以上形式，例如鹽及/或溶劑合物，然而此提及僅用於強調，且不應視為排除如上文所確定之以上形式之其他形式。
已知在此項技術中術語「互補決定區」及「CDR」係指抗體可變區內胺基酸之非鄰接序列，其提供抗原特異性及結合親和力。通常，各重鏈可變區中存在三個(3)CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且各輕鏈可變區中存在三個(3)CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
既定CDR之胺基酸序列邊界可使用多種已知方案中之任一種確定，包括由以下文獻描述之方案：Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號方案)、Al-Lazikani等人(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號方案)、MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996),「Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding site topography」,J.Mol.Biol.262,732-745(「Contact」編號方案)、Lefranc MP等人，「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」,Dev Comp Immunol,2003 年1月；27(1)：55-77(「IMGT」編號方案)以及Honegger A及Plückthun A,「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains：an automatic modeling and analysis tool」,J Mol Biol,2001年6月8日；309(3)：657-70(AHo編號方案)。
既定CDR之邊界可視所用方案而不同。下表V列舉分別根據Kabat、Chothia及Contact方案鑑別之CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之例示性位置。對於CDR-H1，使用Kabat與Chothia編號方案列舉殘基編號。
因此，除非另有說明，否則術語既定抗體或其中某一區域(諸如可變區)之「CDR」及「互補決定區」以及抗體或其中某一區域之個別CDR(例如CDR-H1、CDR-H2)及構架區(FR)應理解為涵蓋如由上文中所描述之已知方案中之任一種定義的各別區(例如互補決定區)。在一些情況下，指定用於鑑別特定CDR之方案，諸如藉由Kabat、Chothia或Contact方法定義CDR。在其他情況下，提供CDR之特定胺基酸序列。
如本文中所用，術語「保守性取代」係指胺基酸取代為熟習此項技術者所知且通常可在不改變所得分子之生物活性的情況下進行。熟習此項技術者認識到，一般地，多肽之非必要區域中之單一胺基酸取代不會實質上改變生物活性(參見例如Watson等人，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版1987))。該等例示性取代較佳根據表II及表III(a-b)中陳述之取代來進行。舉例而言，該等改變包括用異白胺酸(I)、纈胺酸(V)及白胺酸(L)中之任一者取代該等疏水性胺基酸中之任何另一者；用天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)且反之亦然；用麩醯胺酸(Q)取代天冬醯胺(N)且反之亦然；及用絲胺酸(S)取代蘇胺酸(T)且反之亦然。視特定胺基酸之環境及其在蛋白之三維結構中的作用而定，亦可認為其他取代為 保守的。舉例而言，甘胺酸(G)與丙胺酸(A)通常可互換，如同丙胺酸(A)與纈胺酸(V)亦可互換一樣。相對疏水性之甲硫胺酸(M)通常與白胺酸及異白胺酸可互換，且有時與纈胺酸互換。離胺酸(K)與精胺酸(R)在胺基酸殘基之重要特徵係其電荷且此兩種胺基酸殘基之不同pK並不顯著的位置處通常可互換。在特定環境中可將其他變化視為「保守性」(參見例如本文中之表III(a)；第13-15頁「Biochemistry」第2版，Lubert Stryer編(Stanford University)；Henikoff等人，PNAS 1992第89卷10915-10919；Lei等人，J Biol Chem 1995年5月19日；270(20)：11882-6)。其他取代亦為容許的且可依據經驗或依照已知之保守性取代來判定。
術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞之表現活性、細胞功能及/或引起細胞破損的物質。該術語意欲包括放射性同位素、化學治療劑及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)奧瑞他汀(例如奧瑞他汀E、奧瑞他汀F、MMAE及MMAF)、金黴素(auromycin)、類美登素、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、考布他汀(combrestatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、海兔毒素(dolastatin)、小紅莓、道諾黴素(daunorubicin)、紫杉醇(taxol)、順鉑(cisplatin)、cc1065、溴化乙錠、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、放線菌素(actinomycin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin，PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、白樹素(gelonin)、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(retstrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆 毒素(crotin)、卡奇黴素(calicheamicin)、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制劑及糖皮質激素以及其他化學治療劑，以及放射性同位素，諸如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32及Lu之放射性同位素(包括Lu177)。抗體亦可結合至能夠將前藥轉化為其活性形式之抗癌前藥活化酶。
如本文中所用，術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中相連接之重鏈可變域(VH)與輕鏈可變域(VL)。藉由使用過短而無法使同一鏈上兩個結構域之間配對的連接子，該等結構域被迫與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更全面地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48(1993)中。
在CD37結合劑對表現CD37之細胞之作用的情形中，術語「消耗」係指減少表現CD37之細胞之數目或消除表現CD37之細胞。
術語「基因產物」在本文中用於指示肽/蛋白或mRNA。舉例而言，「本發明之基因產物」在本文中有時稱為「癌症胺基酸序列」、「癌症蛋白」、「表I中所列癌症之蛋白」、「癌症mRNA」、「表I中所列癌症之mRNA」等。在一個實施例中，癌症蛋白係由圖1之核酸編碼。癌症蛋白可為片段，或為圖1之核酸所編碼之全長蛋白。在一個實施例中，癌症胺基酸序列係用於確定序列一致性或相似性。在另一實施例中，該等序列為圖1之核酸所編碼之蛋白的天然存在之對偶基因變異體。在另一實施例中，該等序列為如本文中進一步描述之序列變異體。
「異結合」抗體可用於本發明之方法及組合物中。如本文中所用，術語「異結合抗體」係指兩個共價接合之抗體。該等抗體可使用合成蛋白化學中之已知方法，包括使用交聯劑來製備。參見例如美國 專利第4,676,980號。
術語「同源物」係指一種展現與另一種分子之同源性的分子，例如在相應位置處具有相同或相似之化學殘基序列。
在一個實施例中，本文所提供之抗體為「人類抗體」。如本文中所用，術語「人類抗體」係指輕鏈與重鏈序列之整個序列(包括互補決定區(CDR))基本上來自人類基因的抗體。在一個實施例中，人類單株抗體係藉由三體雜交瘤技術、人類B細胞技術(參見例如Kozbor等人，Immunol.Today 4：72(1983))、EBV轉形技術(參見例如Cole等人，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96(1985))或使用噬菌體呈現(參見例如Marks等人，J.Mol.Biol.222：581(1991))來製備。在一特定實施例中，在轉殖基因小鼠中產生人類抗體。製造該等部分至全人類抗體之技術為此項技術中所知且可使用任何該等技術。根據一個尤其較佳之實施例，在經工程改造以表現人類重鏈及輕鏈抗體基因之轉殖基因小鼠中製造全人類抗體序列。製備產生人類抗體之轉殖基因小鼠及其後代之例示性描述可見於申請案第WO 02/43478號及美國專利6,657,103(Abgenix)中。接著可融合來自產生所要抗體之轉殖基因小鼠的B細胞以製造融合瘤細胞株，以便連續產生抗體。參見例如美國專利第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號及第5,545,806號；及Jakobovits,Adv.Drug Del.Rev.31：33-42(1998)；Green等人，J.Exp.Med.188：483-95(1998)。
如本文中所用，術語「人類化抗體」係指含有來自非人類(例如鼠類)抗體以及人類抗體之序列的抗體形式。該等抗體為嵌合抗體，其含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列。一般地，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上所有部分，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有或實質上所 有FR區域為人類免疫球蛋白序列之FR區域。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之恆定區之至少一部分。參見例如Cabilly美國專利第4,816,567號；Queen等人，(1989)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033；及ANTIBODY ENGINEERING：A PRACTICAL APPROACH(Oxford University Press 1996)。
如本文中所用，術語「抑制」或「......之抑制」意欲減少可量測之量或完全防止。
短語「經分離」或「生物學上純」係指物質實質上或基本上不含該物質以其天然狀態存在時通常伴隨該物質之組分。因此，本發明之經分離之肽較佳不含在其原始環境下通常與該等肽締合之物質。舉例而言，當聚核苷酸實質上與對應於或互補於除CD37基因外之基因或編碼除CD37基因產物外之多肽或其片段的污染性聚核苷酸分離時，稱該聚核苷酸「經分離」。熟習此項技術者可容易地使用核酸分離程序獲得經分離之CD37聚核苷酸。舉例而言，當使用物理、機械或化學方法將CD37蛋白質自通常與該蛋白締合之細胞組分中移除時，稱該蛋白「經分離」。熟習此項技術者可容易地使用標準純化方法獲得經分離之CD37蛋白質。或者，可藉由化學方法製備經分離之蛋白。
合適的「標記」包括放射性核素、酶、受質、輔因子、抑制劑、螢光部分、化學發光部分、磁性粒子及其類似物。教示該等標記之用途的專利包括美國專利第3,817,837號；第3,850,752號；第3,939,350號；第3,996,345號；第4,277,437號；第4,275,149號；及第4,366,241號。此外，本文中所提供之抗體可用作螢光體(fluorobody)之抗原結合組分。參見例如Zeytun等人，Nat.Biotechnol.21：1473-79(2003)。
術語「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何有機體，包括小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬及人類。在本發明之一個實施例中，哺乳動物為小鼠。在本發明之另一個實施例中，哺乳動物為人類。
術語「轉移性癌症」及「轉移性疾病」意謂已擴散至區域淋巴結或遠端部位之癌症，且意謂包括依據AUA系統之D期疾病及依據TNM系統之TxNxM+期疾病。
如本文所用之術語「調節劑」或「測試化合物」或「候選藥物」或語法上之相等物描述將測試直接或間接地改變癌症表型或癌症序列(例如核酸或蛋白序列)之表現或者癌症序列之效應(例如信號傳導、基因表現、蛋白相互作用等)之能力的任何分子，例如蛋白、寡肽、小有機分子、多醣、聚核苷酸等。在一個態樣中，調節劑將中和本發明癌症蛋白之效應。「中和」意謂抑制或阻斷蛋白活性以及隨後對細胞之影響。在另一態樣中，調節劑將藉由校正蛋白含量來中和本發明基因及其相應蛋白之效應。在較佳實施例中，調節劑改變表現型態，或本文所提供之核酸或蛋白之表現型態，或下游效應路徑。在一個實施例中，調節劑將癌症表型抑制為例如正常組織指紋。在另一實施例中，調節劑誘導癌症表型。一般而言，以不同藥劑濃度對複數種分析混合物進行平行試驗，以獲得對各種濃度之差異性反應。此等濃度中之一者通常充當陰性對照，亦即零濃度或低於偵測水準。
調節劑、候選藥物或測試化合物涵蓋許多化學類別，不過其通常為有機分子，較佳為分子量大於100道爾頓(Dalton)且小於約2,500道爾頓之小有機化合物。較佳小分子小於2000D或小於1500D或小於1000D或小於500D。候選藥劑包含與蛋白進行結構相互作用(尤其氫鍵結)所必需之官能基，且通常包括至少一個胺基、羰基、羥基或羧基，較佳包括該等化學官能基中之至少兩個。候選藥劑通常包含經一或多個上述官能基取代之環狀碳結構或雜環結構及/或芳族或多芳族 結構。調節劑亦包含生物分子，諸如肽、醣、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合。肽尤其較佳。一類調節劑為例如具有約5至約35個胺基酸、較佳約5至約20個胺基酸且尤其較佳約7至約15個胺基酸之肽。癌症調節性蛋白較佳為可溶的，包括非跨膜區，及/或具有有助於溶解之N端Cys。在一個實施例中，保持該片段之C端為游離酸且N端為游離胺以有助於偶合，亦即與半胱胺酸偶合。在一個實施例中，本發明之癌症蛋白結合至如本文所論述之免疫原性藥劑。在一個實施例中，癌症蛋白結合至BSA。在一些實施例中，例如具有較佳長度之本發明肽可彼此連接或與其他胺基酸連接以產生更長之肽/蛋白。調節性肽可為如上文所概述之天然存在之蛋白的消化物、隨機肽或「偏向性」隨機肽。在一較佳實施例中，基於肽/蛋白之調節劑為如本文所定義之抗體及其片段。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上均質之抗體之群體獲得的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除了可以微量存在之可能天然存在之突變外均為一致的。單株抗體高度特異性地針對單一抗原決定基。相比之下，習知(多株)抗體製劑通常包括針對(或特異性針對)不同抗原決定基之多種抗體。在一個實施例中，多株抗體含有複數種單株抗體，在含有多個抗原決定基的單一抗原內，該等單株抗體具有不同的抗原決定基特異性、親和力或親合力。修飾語「單株」指示抗體係自一群實質上均質之抗體獲得的特徵，且不應視為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，在一些實施例中，將根據本發明使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature 256：495(1975)所描述之融合瘤法來製造，或可藉由重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)來製造。舉例而言，亦可使用Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中所描述之技術自噬菌體抗體庫分離「單株抗體」。此等單株抗體通常將 以通常由ELISA所測定，至少約1μM、更通常至少約300nM、通常至少約30nM、較佳至少約10nM、更佳至少約3nM或更佳之Kd結合。
「醫藥賦形劑」包含諸如佐劑、載劑、pH值調節劑及緩衝劑、張力調節劑、濕潤劑、防腐劑及其類似試劑之物質。
「醫藥學上可接受」係指無毒、惰性及/或在生理上與人類或其他哺乳動物相容的組合物。
術語「聚核苷酸」意謂長度為至少10個鹼基或鹼基對之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式)的聚合形式，且意謂包括DNA及/或RNA之單股形式及雙股形式。在此項技術中，此術語通常可與「寡核苷酸」互換使用。聚核苷酸可包含本文所揭示之核苷酸序列，其中如例如圖1所示之胸苷(T)亦可為尿嘧啶(U)；此定義與DNA與RNA之化學結構之間的差異有關，尤其與以下觀察結果有關：RNA中之4個主要鹼基之一為尿嘧啶(U)而非胸苷(T)。
術語「多肽」意謂具有至少約4、5、6、7或8個胺基酸之聚合物。在本說明書中，使用胺基酸之標準三字母(參見表III)或單字母名稱。在此項技術中，此術語通常可與「肽」或「蛋白」互換使用。
「重組」DNA或RNA分子為已進行活體外分子操作之DNA或RNA分子。
如本文中所用，術語「單鏈Fv」或「scFv」或「單鏈」抗體係指包含抗體之VH域及VL域的抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般地，Fv多肽進一步包含在VH域與VL域之間的多肽連接子，該多肽連接子能夠使sFv形成抗原結合所需之結構。關於sFv之評述，參見Pluckthun,THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
如本文中所用，術語「特異性」及「特異性結合」係指抗體與標靶抗原決定基之選擇性結合。藉由在一組特定條件下將與適當抗原之結合同與無關抗原或抗原混合物之結合進行比較來測試抗體之結合特異性。若抗體與適當抗原之結合為抗體與無關抗原或抗原混合物之結合的至少2倍、5倍、7倍及較佳10倍，則其視為具有特異性。在一個實施例中，特異性抗體為僅結合CD37抗原且不結合至無關抗原之抗體。在另一實施例中，特異性抗體為結合人類CD37抗原但不結合與CD37抗原具有70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上胺基酸同源性之非人類CD37抗原的抗體。在另一實施例中，特異性抗體為結合人類CD37抗原且結合鼠類CD37抗原，但以更高程度結合人類抗原之抗體。在另一實施例中，特異性抗體為結合人類CD37抗原且結合靈長類動物CD37抗原，但以更高程度結合人類抗原之抗體。在另一實施例中，特異性抗體結合至人類CD37抗原及任何非人類CD37抗原，但以更高程度結合人類抗原或其任何組合。
如本文中所用，「治療」或「治療性」及語法上相關術語係指任何疾病後果之任何改善，諸如存活時間延長、發病率更低及/或作為替代治療形式之副產物的副作用減輕；如此項技術中容易瞭解，疾病完全根治雖非治療行為之要求，但為較佳。
術語「變異體」係指展現與所述類型或正常型之變異的分子，諸如在特別描述之蛋白(例如圖1中所示之CD37蛋白質)之相應位置處具有一或多個不同胺基酸殘基的蛋白。類似物為變異蛋白之一種實例。剪接同功異型物及單一核苷酸多形現象(SNP)為變異體之其他實例。
本發明之「CD37蛋白質」及/或「CD37相關蛋白」包括本文中特別鑑別之蛋白(參見圖1)以及可根據本文中概述或此項技術中易於獲 得之方法在無不當實驗情況下分離/產生及表徵之對偶基因變異體、保守性取代變異體、類似物及同系物。亦包括組合不同CD37蛋白質或其片段之部分的融合蛋白以及CD37蛋白質與異源多肽之融合蛋白。該等CD37蛋白質統稱為CD37相關蛋白、本發明之蛋白或CD37。術語「CD37相關蛋白」係指具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或25個以上胺基酸之多肽片段或CD37蛋白質序列；或具有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、276、277、278、279、280個或281個或281個以上胺基酸之多肽片段或CD37蛋白質序列。
II.)CD37抗體
本發明之另一態樣提供結合至CD37相關蛋白質(參見圖1)之抗體。在一個實施例中，結合至CD37相關蛋白質之抗體為特異性結合至包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之CD37蛋白質的抗體。特異性結合至包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之CD37蛋白質的抗體包括可結合至其他CD37相關蛋白質之抗體。舉例而言，結合包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之CD37蛋白質的抗體可結合CD37相關蛋白質，諸如CD37變異體及其同系物或類似物。
在一些實施例中，本發明之CD37抗體尤其適用於癌症(參見例如表I)預後分析、成像、診斷及治療方法。類似地，該等抗體適用於急性骨髓性白血病(「AML」)、慢性淋巴細胞性白血病(「CLL」)、非霍奇金氏淋巴瘤(「NHL」)及其他癌症之治療及/或預後，只要此等其他癌症中亦表現或過度表現CD37即可。此外，胞內表現之抗體(例如單鏈抗體)在治療學上適用於治療涉及CD37表現之癌症，諸如晚期或轉移性AML、CLL、NHL或MM癌症或其他晚期或轉移性癌症。
用於製備抗體、特別單株抗體之各種方法已為此項技術中所熟知。舉例而言，可藉由使用呈經分離或免疫結合形式之CD37相關蛋白質、肽或片段對合適哺乳動物宿主免疫接種來製備抗體(Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press,Harlow及Lane編(1988)；Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,NY(1989))。此外，亦可使用CD37之融合蛋白，諸如CD37 GST融合蛋白。在一特定實施例中，產生包含所有或大部分圖1中之胺基酸序列的GST融合蛋白且接著用作免疫原以產生合適抗體。在另一實施例中，合成CD37相關蛋白質且用作免疫原。
此外，使用此項技術中已知的裸DNA免疫接種技術(在存在或不存在經純化之CD37相關蛋白質或CD37表現細胞的情況下)對經編碼之免疫原產生免疫反應(關於評述，參見Donnelly等人，1997,Ann.Rev.Immunol.15：617-648)。
可分析如圖1中所示之CD37蛋白質之胺基酸序列以選擇用於產生抗體之CD37蛋白質之特異性區域。舉例而言，使用CD37胺基酸序列之疏水性及親水性分析來鑑別CD37結構中之親水性區域。CD37蛋白質之顯示免疫原性結構之區域以及其他區域及結構域可使用此項技術中已知之各種其他方法容易地鑑別，諸如周-法斯曼(Chou-Fasman)、卡尼爾-羅布森(Garnier-Robson)、凱特-杜立德(Kyte-Doolittle)、伊詩貝格(Eisenberg)、卡普拉斯-舒爾茨(Karplus-Schultz)或詹姆森-沃爾夫(Jameson-Wolf)分析。可使用Hopp,T.P.及Woods,K.R.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828之方法產生親水性型態。可使用Kyte,J.及Doolittle,R.F.,1982,J.Mol.Biol.157：105-132之方法產生疏水性型態。可使用Janin J.,1979,Nature 277：491-492之方法產生可及殘基百分比(%)型態。可使用Bhaskaran R.,Ponnuswamy P.K.,1988,Int.J.Pept.Protein Res.32：242-255之方法產生平均可撓性型態。可使 用Deleage,G.,Roux B.,1987,Protein Engineering 1：289-294之方法產生β-轉角型態。因此，藉由任何該等程式或方法鑑別之每一個區域均在本發明之範疇內。藉由本文所提供之實例進一步說明用於產生CD37抗體之較佳方法。製備蛋白質或多肽供用作免疫原之方法為此項技術中所熟知。製備蛋白質與載體(諸如BSA、KLH或其他載體蛋白質)之免疫原性結合物的方法亦為此項技術中所熟知。在一些情況下，使用利用例如碳化二亞胺試劑之直接結合；在其他情況下，連接試劑(諸如Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)供應之連接試劑)為有效的。投與CD37免疫原通常藉由經適合時段注射且使用適合佐劑來進行，如此項技術中所瞭解。在免疫時程期間，可獲得抗體之效價以確定抗體形成之適當性。
可藉由在此項技術中熟知的各種方法產生CD37單株抗體。舉例而言，如一般已知，使用Kohler及Milstein之標準融合瘤技術或使產生抗體之B細胞永生化的修飾來製備分泌所需單株抗體之永生化細胞株。藉由免疫分析法篩檢分泌所需抗體之永生化細胞株，其中抗原為CD37相關蛋白質。當鑑別出合適的永生化細胞培養物時，可使細胞擴增且自活體外培養物或腹水液產生抗體。
在一些實施例中，本發明之抗體或片段亦可藉由重組方法產生。亦可在多個物種來源之嵌合性或互補決定區(CDR)移植抗體環境下產生特異性結合至CD37蛋白質中之所需區域的區域。亦可產生人類化或人類CD37抗體且較佳用於治療性環境。藉由用一或多個非人類抗體CDR取代相應人類抗體序列來使鼠類及其他非人類抗體人類化之方法已為吾人所熟知(參見例如Jones等人，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332：323-327；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536)。亦參見Carter等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285及Sims等人，1993,J.Immunol.151：2296。
在一較佳實施例中，可使用VelocImmune小鼠(Regeneron,Tarrytown,NY)製備本發明之人類單株抗體，在該等小鼠中，免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH區段)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座處具有內源小鼠可變區段之基因組序列已完全或部分用具有人類免疫球蛋白重鏈(VH、DH及JH)及/或κ輕鏈(VK及JK)基因座之未重組生殖系可變區段的人類基因組序列置換。參見例如美國專利第6,586,251號、第6,596,541號、第7,105,348號、第6,528,313號、第6,638,768號及第6,528,314號。
此外，在一些實施例中，可使用HuMAb小鼠(Medarex,Inc.)產生本發明之人類抗體，該HuMAb小鼠含有編碼未重組之人類免疫球蛋白重鏈(μ及γ)及κ免疫球蛋白輕鏈序列的人類免疫球蛋白基因微型基因座以及使內源μ及κ鏈基因座不活化之靶向突變(參見例如Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。
在另一實施例中，可使用在轉殖基因及轉殖染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(諸如攜帶人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖染色體之小鼠)產生本發明之全人類抗體。本文中將該等小鼠稱為「KM小鼠」，該等小鼠描述於Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727及Tomizuka等人之PCT公開案WO 02/43478中。
在一些實施例中，亦可使用用於篩檢人類免疫球蛋白基因之文庫的噬菌體呈現方法製備本發明之人類單株抗體。該等用於分離人類抗體之噬菌體呈現方法在此項技術中確知。參見例如：Ladner等人之美國專利第5,223,409號；第5,403,484號；及第5,571,698號；Dower等人之美國專利第5,427,908號及第5,580,717號；McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；以及Griffiths等人之美國專利第5,885,793號；第6,521,404號；第6,544,731號；第6,555,313號；第6,582,915號；及第6,593,081號。
本發明之人類單株抗體亦可使用SCID小鼠製備，其中已在該等SCID小鼠中重新建立人類免疫細胞使得可在免疫接種時產生人類抗體反應。該等小鼠描述於例如Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
此外，在一些實施例中，可用使用不活化進行抗體產生、用人類重鏈及輕鏈基因座進行工程改造之稱為Xenomouse的轉殖基因小鼠(Amgen Fremont,Inc.)的技術製備本發明之人類抗體。製備產生人類抗體之轉殖基因小鼠的例示性描述可見於U.S.6,657,103中。亦參見美國專利第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,661,016號；及第5,545,806號；及Mendez等人，Nature Genetics,15：146-156(1998)；Kellerman,S.A.& Green,L.L.,Curr.Opin.Biotechnol 13,593-597(2002)。
在一較佳實施例中，本發明之CD37 MAb包含由寄存在美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)寄存編號PTA-120464下之中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary；CHO)細胞產生的稱為HvCD37-6b15.1.1之抗體的重鏈及輕鏈可變區(參見圖3)，或包含與HvCD37-6b15.1.1之重鏈及輕鏈可變區的胺基酸序列同源之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可變區，且其中抗體保留本發明CD37 MAb之所需功能性。HvCD37-6b15.1.1之重鏈可變區由在SEQ ID NO：7之第一殘基(Q)至第115殘基(S)範圍內之胺基酸序列組成，且HvCD37-6b15.1.1之輕鏈可變區由在SEQ ID NO：8之第一殘基(D)至第106殘基(R)範圍內之胺基酸序列組成。在一個實施例中，HvCD37-6b15.1.1之重鏈可變區的CDR1-3(Kabat)分別由在SEQ ID NO：7之31-35、50-65及98-104範圍內之胺基酸序列組成，且HvCD37-6b15.1.1之輕鏈可變區的CDR1-3分別由在SEQ ID NO：8之24-34、50-56及89-95範圍內之胺基酸序列組成(參見圖4及表V)。在一些實施例中，CDR-H1包含PYYWS或由 PYYWS組成；CDR-H2包含EINHSGSTNYNPSLKS或由EINHSGSTNYNPSLKS組成；CDR-H3包含RAGDFDY或由RAGDFDY組成，CDR-L1包含RASQSISSWLA或由RASQSISSWLA組成，CDR-L2包含KASSLES或由KASSLES組成，及/或CDR-L3包含QQYNSYI或由QQYNSYI組成。可選擇恆定區之任何子類作為本發明抗體之恆定區。在一個實施例中，可使用人類IgG2恆定區作為重鏈恆定區且使用人類Igκ恆定區作為輕鏈恆定區。
舉例而言，在一些實施例中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區包含與圖3中闡述之重鏈可變區胺基酸序列具有至少80%同源性的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區包含與圖3中闡述之輕鏈可變區胺基酸序列具有至少80%同源性的胺基酸序列。
在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與圖3中闡述之VH及VL序列具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性。
在另一實施例中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其抗原結合部分，其包含人類化重鏈可變區及人類化輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區包含具有圖3中闡述之重鏈可變區CDR之胺基酸序列的互補決定區(CDR)；(b)輕鏈可變區包含具有圖3中闡述之輕鏈可變區之輕鏈可變區CDR之胺基酸序列的CDR。
在一些實施例中，抗體具有包含PYYWS或由PYYWS組成之CDR-H1；包EINHSGSTNYNPSLKS含或由EINHSGSTNYNPSLKS組成之CDR-H2；包含RAGDFDY或由RAGDFDY組成之CDR-H3、包含RASQSISSWLA或由RASQSISSWLA組成之CDR-L1、包含KASSLES 或由KASSLES組成之CDR-L2及/或包含QQYNSYI或由QQYNSYI組成之CDR-L3。
在一些實施例中，本發明之經工程改造之抗體包括已對VH及/或VL內之構架殘基進行修飾(例如用於改良抗體性質)的抗體。通常進行該等構架修飾以降低該抗體之免疫原性。舉例而言，一種方法為使一或多個構架殘基「回復突變」成相應生殖系序列。更特定言之，已經受體細胞突變之抗體可含有與衍生出該抗體之生殖系序列不同的構架殘基。該等殘基可藉由將該等抗體構架序列與衍生出該抗體之生殖系序列相比較來鑑別。為使構架區序列恢復至其生殖系組態，體細胞突變可藉由例如定點突變誘發或PCR介導突變誘發而「回復突變」成生殖系序列(例如自白胺酸「回復突變」至甲硫胺酸)。該等經「回復突變」之抗體亦意欲為本發明所涵蓋。
另一類型之構架修飾涉及使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變以移除T細胞抗原決定基，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫(deimmunization)」且進一步詳細描述於Carr等人之美國專利公開案第2003/0153043號中。
除構架區或CDR區內所作之修飾以外，或取而代之，在一些實施例中，本發明之抗體可經工程改造以包括Fc區內之修飾，通常以改變該抗體之一或多種功能特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。此外，在一些實施例中，本發明之CD37 MAb可經化學修飾(例如一或多個化學部分可連接至該抗體)或經修飾以改變其糖基化，再次改變該MAb之一或多種功能性。以下進一步詳細描述此等實施例中之每一者。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得該鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數得以改變，例如增加或減少。此方法進一步描述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸 殘基數經改變以例如有利於輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低CD37 MAb之穩定性。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短CD37 MAb之生物半衰期。更特定言之，將一或多種胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區中以使得該抗體所具有的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合相對於原生Fc鉸鏈域SpA結合削弱。此方法進一步詳細描述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在另一實施例中，CD37 MAb經修飾以延長其生物半衰期。可使用多種方法。舉例而言，可如Ward之美國專利第6,277,375號中所述引入突變。或者，為延長生物半衰期，抗體可在CH1區或CL區內改變以含有取自IgG之Fc區之CH2域的兩個環之救助受體結合抗原決定基，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。
在其他實施例中，藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變CD37 MAb之效應功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸特異性殘基之胺基酸可由不同胺基酸殘基置換以使得抗體對於效應配位體之親和性發生改變，但保留親本抗體之抗原結合能力。親和性改變之效應配體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細描述於Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
可藉由多種熟知方法，視需要使用CD37相關蛋白質、表現CD37之細胞或其提取物，確定CD37抗體與CD37相關蛋白質之反應性，包括西方墨點法(Western blot)、免疫沈澱法、ELISA及FACS分析法。CD37抗體或其片段可用可偵測標記物來標記或結合至第二分子。合適可偵測標記物包括(但不限於)放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶。此外，使用此項技術中一般已知的方法產生對兩個或兩個以上CD37抗原決定基具有特異 性之雙特異性抗體。亦可藉由此項技術中已知的交聯技術產生均二聚抗體(例如Wolff等人，Cancer Res.53：2560-2565)。
在另一較佳實施例中，本發明之CD37 MAb為包含稱為HvCD37-6b15.1.1之抗體之重鏈及輕鏈的抗體。HvCD37-6b15.1.1之重鏈由SEQ ID NO：7之第一殘基(Q)至第441殘基(K)範圍內之胺基酸序列組成且HvCD37-6b15.1.1之輕鏈由SEQ ID NO：8序列之第一殘基(D)至第212殘基(C)範圍內之胺基酸序列組成。其序列闡述於圖2及圖3中。在一較佳實施例中，HvCD37-6b15.1.1結合至細胞毒性劑。
在另一實施例中，本發明之CD37 MAb藉由製備抗體或抗原結合片段之方法產生，其包含培養宿主細胞以使抗體或抗原結合片段表現，其中宿主細胞選自由以下(a)至(d)組成之群：(a)用如下表現載體轉形之宿主細胞，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第115 S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸及包含編碼由在SEQ ID NO：8之第1 D至第106 R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；(b)用以下轉形之宿主細胞：表現載體，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第115 S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；及表現載體，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：8之第1 D至第106 R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；(c)用如下表現載體轉形之宿主細胞，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第115號S範圍內胺基酸序列組成之重鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；及(d)用如下表現載體轉形之宿主細胞，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：8之第1號D至第106號R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸。
在另一實施例中，本發明之CD37 MAb藉由製備抗體之方法產生，其包含培養宿主細胞以使抗體表現，其中宿主細胞選自由以下(a)至(d)組成之群：(a)用如下表現載體轉形之宿主細胞，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈的鹼基序列的聚核苷酸及包含編碼由在SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈的鹼基序列的聚核苷酸；(b)用以下轉形之宿主細胞：表現載體，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈的鹼基序列的聚核苷酸；及表現載體，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：8之第1號D至第212 C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈的鹼基序列的聚核苷酸；(c)用如下表現載體轉形之宿主細胞，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內胺基酸序列組成之重鏈的鹼基序列的聚核苷酸；及(d)用如下表現載體轉形之宿主細胞，其含有包含編碼由在SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈的鹼基序列的聚核苷酸。
產生稱為HvCD37-6b15.1.1之抗體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(經由聯邦快遞公司(Federal Express))在2013年7月8日寄送至美國菌種保藏中心(ATCC)，郵政信箱1549,Manassas,VA 20108且指定寄存編號PTA-120464。
或者或另外，在本發明之另一實施例中，結合CD37之MAb(在此情形下為MAb HvCD37-6b15.1.1)可如此項技術中已知進行轉譯後修飾。轉譯後修飾之實例包括(但不限於)化學修飾，諸如二硫鍵、寡醣、N端焦麩胺酸酯形成、C端離胺酸加工、去醯胺、異構化、氧 化、糖基化、肽鍵裂解、非還原性交聯、截短及此項技術中已知之其他修飾。參見Liu等人，Heterogeneity of Monoclonal Antibodies,J.Pharma.Sci.第97卷，第7期，第2426-2447頁(2008年7月)。其他類型之修飾包括非共價相互作用、構形異質及聚集，同上。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb包含殘基1處之N端重鏈麩醯胺酸環化為焦麩胺酸酯。熟習此項技術者應理解且瞭解該種環化應理解為自發進行。參見Dick等人，Determination of the Origin of the N-Terminal Pyro-Glutamtate Variation in Monoclonal Antibodies Using Model Peptides,Biotechnology and Bioengineering，第97卷，第3期，第544-553頁(2007年6月15日)。
另外或或者，HvCD37-6b15.1.1 MAb之胺基酸可進一步進行轉譯後修飾，包括(但不限於)去醯胺、異構化、糖基化及/或氧化。本發明之多肽或其片段可進行額外轉譯後修飾，包括糖基化，例如此項技術中熟知之N連接或O連接之糖基化位點。如前文所述，多肽之胺基酸序列或處理條件可進行改變(諸如培養、純化及/或儲存條件改變)以排除該等更改或使該等更改減至最小或在該種加工有益之情況下促進該等更改。此外，該等製備可包含發生不同程度之一種以上加工相關修飾的多肽，例如多肽之一些、大多數或實質上所有C端離胺酸經移除及/或一些、大多數或實質上所有N端胺基酸轉化成焦麩胺酸(例如，圖2或圖3中所示之多肽或共同序列或抗原結合片段)。處理條件(諸如不同緩衝液組成及溫度)可顯著影響該等修飾之程度。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb包含殘基445處之C端重鏈離胺酸截短。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb包含向殘基295處之重鏈天冬醯胺添加糖基，包括(但不限於)G0(去唾液酸基、去半乳糖基、去海藻糖基化二分支複合物型N-聚糖)；G0F(去唾液酸基、去半 乳糖基、核心海藻糖基化二分支複合物型N-聚糖)；甘露糖-5(N連接之寡甘露糖-5)；G1F(去唾液酸基、單半乳糖基、核心海藻糖基化二分支錯合物型N-聚糖)；G2(去唾液酸基、雙半乳糖基、去海藻糖基化二分支錯合物型N-聚糖)；G2F(去唾液酸基、雙半乳糖基、核心海藻糖基化二分支錯合物型N-聚糖)；A1(單唾液酸基化二分支N連接之寡醣Neu5Acid)；及/或A2(二唾液酸基化二分支N連接之寡醣Neu5Acid)。
另外或或者，在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb包含向輕鏈之一或多個絲胺酸殘基添加糖基。一般而言，糖基化由還原糖與N端一級胺或離胺酸側鏈之胺基之間的單酶反應產生。熟習此項技術者應理解且瞭解糖基化可遮蔽N端一級胺基酸基團或離胺酸殘基之側鏈上的正電荷，從而使抗體更具酸性。
本發明多肽之胺基酸序列可藉由此項技術中已知之任何方式(例如質譜分析)檢驗且可與本文所揭示之序列(參見圖2及圖3)一致或可由於轉譯後修飾加工而在一或多個胺基酸殘基處不同於此等序列。以非限制性實例之方式，在實質上均質多肽之全部或一部分上，可藉由蛋白水解加工或培養期間進行之其他加工移除輕鏈或重鏈之C端胺基酸。類似地，N端胺基酸可不存在，例如，一(1)個、兩(2)個、三(3)個、四(4)個或五(5)個N端胺基酸可不存在。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb之重鏈可變區選自由以下組成之群：在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基115(S)範圍內之胺基酸序列；及SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基115(S)之胺基酸序列，其中N端殘基1(Q)轉化成焦麩胺酸。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb之重鏈選自由以下組成之群：在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列；在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列， 其中N端殘基1(Q)轉化成焦麩胺酸；在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列，其中C端殘基441(K)經移除；及在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列，其中N端殘基1(Q)轉化成焦麩胺酸且C端殘基441(K)經移除。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb或其抗原結合片段為藉由在宿主細胞中表現獲得之蛋白質的以重組方式產生之混合物，其中抗體或其抗原結合片段之重鏈可變區選自由以下組成之群：在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基115(S)範圍內之胺基酸序列；及SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基115(S)之胺基酸序列，其中N端殘基1(Q)轉化成焦麩胺酸。
在另一實施例中，HvCD37-6b15.1.1 MAb包含由在SEQ ID NO：7之第1號Q至第440號G範圍內之胺基酸序列組成的重鏈，其中第1號Q經修飾為焦麩胺酸酯；及由在SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈。
III.)抗體藥物結合物概述
在另一態樣中，本發明提供抗體藥物結合物(ADC)，其包含抗體結合至細胞毒性劑，諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。在另一態樣中，本發明進一步提供使用ADC之方法。在一個態樣中，ADC包含共價連接至細胞毒性劑或可偵測試劑之上述CD37 MAb中之任一者。
使用抗體藥物結合物局部遞送細胞毒性劑或細胞抑制劑(亦即在治療癌症時殺死或抑制腫瘤細胞之藥物)(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19：605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv.Drg Del.Rev.26：151-172；美國專利4,975,278)使藥物部分靶向遞送至腫瘤及其中細胞內積聚，其中此等未結合藥劑之全身性投藥可 能造成對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞而言不可接受之毒性程度(Baldwin等人，(1986)Lancet(1986年3月15日)第603-05頁；Thorpe,(1985)「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」,Monoclonal Antibodies '84：Biological And Clinical Applications,A.Pinchera等人(編)，第475-506頁)。因此設法使功效最大而毒性最小。已報導多株抗體與單株抗體均可用於此等策略中(Rowland等人(1986)Cancer Immunol.Immunother.,21：183-87)。此等方法中所使用之藥物包括道諾黴素、小紅莓、甲胺喋呤(methotrexate)及長春地辛(vindesine)(Rowland等人(1986)同上)。用於抗體-毒素結合物中之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)Jour.of the Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623)及卡奇黴素(Lode等人(1998)Cancer Res.58：2928；Hinman等人(1993)Cancer Res.53：3336-3342)。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來實現其細胞毒性及細胞抑制效應。一些細胞毒性藥物在結合至大抗體或蛋白質受體配位體時傾向於無活性或具有弱活性。
抗體藥物結合物之實例為ZEVALIN®(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Biogen/Idec)，其為由針對在正常及惡性B淋巴細胞表面上發現之CD20抗原之鼠類IgG1 κ單株抗體與111In或90Y放射性同位素以硫脲連接子螯合劑結合所構成的抗體-放射性同位素結合物(Wiseman等人(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77；Wiseman等人(2002)Blood 99(12)：4336-42；Witzig等人(2002)J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63；Witzig等人(2002)J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69)。
此外，MYLOTARGTM(吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一種由hu CD33抗體連接至卡奇黴素所構成之抗體藥物結合物，於2000年獲准用於藉由注射來治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7)：686；美國專利第4970198號、第5079233號、第5585089號、第5606040號、第5693762號、第5739116號、第5767285號及第5773001號)。
另外，CD37結合劑亦在測試作為B細胞惡性病之潛在療法。Emergent Biosolutions(以前的Trubion Pharmaceuticals)開發出CD37結合劑SMIP-016及TRU-016(Zhao等人，2007,Blood,110.2569-2577)。SMIP-016為單鏈多肽，其包括來自融合瘤之可變區及經工程改造之人類恆定區。TRU-016為人類化型式之抗CD37 SMIP蛋白。參見例如美國公開申請案第2007/0059306號。TRU-016臨床上正在測試用於治療慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。Boehringer Ingelheim亦在國際公開申請案第WO 2009/019312號中揭示CD37結合劑。然而，對於任何此等結合劑尚未描述CDC活性，且在不存在交聯劑之情況下尚未描述活體外促凋亡活性。
此外，已在兩個各別試驗中使用經輻射標記之抗CD37抗體MB-1嘗試輻射免疫療法(RIT)。投與六名復發性NHL患者治療劑量之131I-MB-1(Press等人，1989 J Clin Oncol.7(8)：1027-38；Press等人，1993,N Engl J Med.329(17)：1219-24)。所有六名患者達成在四至三十一個月之持續時間內完全緩解(CR)。在另一試驗中，投與十名復發性NHL患者131I-MB-1(Kaminski等人，1992 J Clin Oncol.10(11)：1696-711)。總共四名患者在二至六個月之持續時間內具有反應，但僅報導一例CR。然而，由於輻射標記之不利生物分佈，故並不能治療所有患者，從而引起對活非靶標器官之輻射曝露的關注。實際上，在此等試驗中觀察到RIT相關毒性，包括嚴重骨髓抑制(myclosupression)及心 肺毒性。儘管此等臨床資料表明抗CD37輻射免疫結合物可能有效，但此等療法實施起來很繁瑣，且由於與高劑量輻射有關之風險，RIT後之患者在復發時不能再用RIT治療。
此外，康圖單抗美坦辛(Cantuzumab mertansine)(Immunogen,Inc.)，一種由huC242抗體經由二硫基連接子SPP連接至類美登素藥物部分DM1所構成之抗體藥物結合物，正進入II期試驗中用於治療表現CanAg之癌症(諸如結腸癌、胰臟癌、胃癌及其他癌症)。
此外，MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)，一種由抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)單株抗體連接至類美登素藥物部分DM1所構成之抗體藥物結合物，正處於開發中用於潛在治療前列腺腫瘤。
最後，奧瑞他汀肽(奧瑞他汀E(AE)及單甲基奧瑞他汀(MMAE)，海兔毒素之合成類似物)結合至嵌合型單株抗體cBR96(對癌瘤上之LewisY具有特異性)及cAC10(對血液科惡性病上之CD30具有特異性)(Doronina等人，(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784)。
結合至MMAE之CD30 MAb目前可以ADCETRIS購得(Seattle Genetics,Bothell,WA)。ADCETRIS(貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin))為針對CD-30之抗體藥物結合物，其由如下三種組分組成：1)稱為cAC10之特異於人類CD30的嵌合IgG1抗體，2)微管破壞劑MMAE及3)將MMAE共價連接於caC10之可蛋白酶裂解之連接子。參見ADCENTRIS處方資訊。
此外，本文描述適用於產生ADC之化學治療劑。可使用的酶促活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及 PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素(crotin)、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。多種放射性核素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括212Bi、131I、131In、90Y及186Re。抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑製得，諸如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人(1987)Science,238：1098中所描述製備蓖麻毒素免疫毒素。經碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為一種用於將放射性核苷酸結合至抗體之例示性螯合劑(WO 94/11026)。
本文亦涵蓋抗體與一或多種小分子毒素(諸如卡奇黴素、類美登素、海兔毒素、奧瑞他汀、新月毒素(trichothecene)及CC1065以及此等毒素具有毒素活性之衍生物)之結合物。
III(A).類美登素
適用作類美登素藥物部分之美登素化合物為此項技術中所熟知且可根據已知方法自天然來源分離、使用遺傳工程改造技術產生(參見Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)，或美登醇(maytansinol)及美登醇類似物根據已知方法以合成方式製備。
例示性類美登素藥物部分包括具有經修飾之芳環之部分，該經修飾之芳環為諸如：C-19-去氯(US 4256746)(藉由安莎黴素P2 (ansamytocin P2)之氫化鋰鋁還原製備)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4,361,650號及第4,307,016號)(使用鏈黴菌(Streptomyce)或放線菌(Actinomyce)藉由去甲基製備或使用LAH藉由去氯製備)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(使用醯基氯藉由醯化作用製備)及在其他位置具有修飾之芳環。
例示性類美登素藥物部分亦包括具有諸如以下之修飾之部分：C-9-SH(US 4,424,219)(藉由美登醇與H2S或P2S5之反應製備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2OR)(US 4331598)；C-14-羥甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(US 4450254)(由奴卡菌(Nocardia)製備)；C-15-羥基/醯氧基(US 4,364,866)(用鏈黴菌藉由美登醇之轉化製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4,313,946號及第4,315,929號)(自滑桃樹(Trewia nudlflora)分離)；C-18-N-去甲基(美國專利第4,362,663號及第4,322,348號)(用鏈黴菌藉由美登醇之去甲基製備)；及4,5-去氧(US 4,371,533)(藉由美登醇之三氯化鈦/LAH還原製備)。
含有類美登素之ADC、其製備方法及其治療用途揭示於例如美國專利第5,208,020號、第5,416,064號、第6,441,163號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，其揭示內容以引用的方式明確併入本文中。Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)描述包含類美登素(命名為DM1)連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242的ADC。已發現該結合物對所培養之結腸癌細胞具有高細胞毒性且在活體內腫瘤生長分析法中展示抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)描述ADC，其中類美登素經由二硫化物連接子與結合至人類結腸癌細胞株上之抗原的鼠類抗體A7結合，或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1結合。活體外測試TA.1-類美登素結合物對人類乳癌細胞株SK-BR-3的細胞毒性，該細胞株每個細胞表現 3×105個HER-2表面抗原。該藥物結合物達成與游離類美登素藥物類似之細胞毒性程度，該細胞毒性程度可藉由增加每個抗體分子類美登素化合物分子之數目而增加。A7-類美登素結合物在小鼠體內展示出低全身性細胞毒性。
III(B).奧瑞他汀及海兔毒素
在一些實施例中，ADC包含本發明之抗體與海兔毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物、奧瑞他汀之結合物(美國專利第5,635,483號、第5,780,588號)。已證實海兔毒素及奧瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解以及細胞核及細胞分裂(Woyke等人，(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌活性(US 5,663,149)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素或奧瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端連接至抗體(WO 02/088172)。
例示性奧瑞他汀實施例包括「Senter等人，Proceedings of the American Association for Cancer Research，第45卷，Abstract Number 623,2004年3月28日提交」中所揭示及美國專利公開案第2005/0238649號中所述之N端連接之單甲基奧瑞他汀藥物部分DE及DF，該等專利之揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。
一種例示性奧瑞他汀實施例為MMAE(其中波形線指示共價連接至抗體藥物結合物之連接子(L))。
另一例示性奧瑞他汀實施例為MMAF，其中波形線指示共價連接至抗體藥物結合物之連接子(L)(US 2005/0238649)：
其他包含MMAE或MMAF及各種連接子組分(本文中進一步描述)之例示性實施例具有以下結構及縮寫(其中Ab意謂抗體且p為1至約8)： Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Ab-MC-MMAF
基於肽之藥物部分通常可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵可例如根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參見E.Schröder及K.Lübke，「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)製備。可根據以下文獻中之方法製備奧瑞他汀/海兔毒素藥物部分：US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.15：859-863；及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7)：778-784。
III(C).卡奇黴素
在其他實施例中，ADC包含本發明之抗體與一或多個卡奇黴素分子之結合物。抗生素之卡奇黴素家族能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙股DNA碎片。有關卡奇黴素家族結合物之製備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號、第5,877,296號(均屬American Cyanamid Company)。可使用之卡奇黴素之結構類似物包括(但不限於)γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙醯基-γ1 I、PSAG及θI 1(Hinman等人，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode等人，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及屬於American Cyanamid之上述美國專利)。抗體可結合之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸劑。卡奇黴素與QFA均具有細胞內作用位點且不易於跨過質膜。因此，細胞經由抗體介導之內化作用吸收此等藥劑可極大地增強其細胞毒性作用。
III(D).其他細胞毒性劑
在一些實施例中，可結合至本發明抗體之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素(streptozoicin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，美國專利第5,053,394號、第5,770,710號中所述之統稱為LL-E33288複合物的藥劑家族以及伊斯帕黴素(esperamicin)(美國專利第5,877,296號)。
可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(獲自綠膿桿菌)、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
在一些實施例中，本發明進一步涵蓋抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA內切酶，諸如去氧核糖核酸酶；DNA 酶)之間所形成的ADC。
為選擇性地破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。可使用多種放射性同位素產生放射性結合抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當使用結合物進行偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如再次碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物中。舉例而言，肽可生物合成，或可藉由使用涉及例如以氟-19替代氫之適合胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成來合成。諸如tc99m或I123、Re186、Re188及In111之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。可使用IODOGEN方法(Fraker等人，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
IV.)結合CD37之抗體藥物結合物化合物
本發明尤其提供用於靶向遞送藥物之抗體-藥物結合物化合物。本發明者已發現，該等抗體-藥物結合物化合物對表現CD37之細胞具有有效的細胞毒性及/或細胞抑制活性。該等抗體-藥物結合物化合物包含抗體單元共價連接至少一個藥物單元。藥物單元可直接或經由連接子單元(-LU-)共價連接。
在一些實施例中，抗體藥物結合物化合物具有下式：L-(LU-D)p (I)
或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物；其中：L為抗體單元，例如本發明之CD37 MAb；且 (LU-D)為連接子單元-藥物單元部分，其中：LU-為連接子單元；且-D為對標靶細胞具有細胞抑制活性或細胞毒性活性的藥物單元；且p為整數1至20。
在一些實施例中，p在1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2之範圍內。在一些實施例中，p在2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3之範圍內。在其他實施例中，p為1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，p為2或4。
在一些實施例中，抗體藥物結合物化合物具有下式：L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物，其中：L為抗體單元，例如CD37 MAb；且-Aa-Ww-Yy-為連接子單元(LU)，其中：-A-為延伸子單元；a為0或1；各-W-獨立地為胺基酸單元；w為0至12範圍內之整數；-Y-為自脫落型間隔子單元；y為0、1或2；-D為對標靶細胞具有細胞抑制活性或細胞毒性活性的藥物單元；且p為1至20之整數。
在一些實施例中，a為0或1，w為0或1，且y為0、1或2。在一些實施例中，a為0或1，w為0或1，且y為0或1。在一些實施例中，p在1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2之範圍 內。在一些實施例中，p在2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3之範圍內。在其他實施例中，p為1、2、3、4、5或6。在一些實施例中，p為2或4。在一些實施例中，當w不為0時，y為1或2。在一些實施例中，當w為1至12時，y為1或2。在一些實施例中，w為2至12且y為1或2。在一些實施例中，a為1且w及y為0。
對於包含複數個抗體之組合物，藥物負載係以每個抗體之藥物分子平均數目p來表示。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物(D)範圍內。在由結合反應製備時，每個抗體之藥物平均數目可藉由習知方法表徵，諸如質譜分析、ELISA分析法及HPLC。亦可測定抗體-藥物結合物中p之定量分佈。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式，來實現p為某一值之均質抗體-藥物結合物自具有其他藥物負載之抗體-藥物結合物的分離、純化及表徵。在例示性實施例中，p為2至8。
可藉由熟習此項技術者已知之任何技術產生抗體-藥物結合物化合物。簡而言之，抗體-藥物結合物化合物包含作為抗體單元之CD37 MAb、藥物及視情況存在之接合藥物與結合劑之連接子。在一較佳實施例中，抗體為包含上文所述稱為HvCD37-6b15.1.1之抗體之重鏈及輕鏈可變區的CD37 MAb。在更佳實施例中，抗體為包含上文所述稱為HvCD37-6b15.1.1之抗體之重鏈及輕鏈的CD37 MAb。許多不同反應可用於將藥物及/或連接子共價連接至結合劑。此舉通常藉由結合劑(例如抗體分子)之胺基酸殘基，包括離胺酸之胺基、麩胺酸及天冬胺酸之游離羧酸基、半胱胺酸之硫氫基及芳族胺基酸之各種部分的反應來實現。一種最常用之非特定共價連接法為使化合物之羧基(或胺基)連接至抗體之胺基(或羧基)的碳化二亞胺反應。此外，已使用諸如二醛或醯亞胺酯之雙官能劑將化合物之胺基連接至抗體分子之胺基。希夫鹼反應(Schiff base reaction)亦可用於連接藥物與結合劑。此方法包 括用過碘酸鹽氧化含有二醇或羥基之藥物，因而形成醛，接著使醛與結合劑反應。經由用結合劑之胺基形成希夫鹼來實現連接。異硫氰酸酯亦可用作將藥物共價連接至結合劑之偶合劑。其他技術為熟習此項技術者已知且在本發明之範疇內。
在某些實施例中，使作為連接子之前驅體的中間物與藥物在適當條件下反應。在某些實施例中，使用藥物及/或中間物上之反應性基團。藥物與中間物之間的反應產物或所獲得之藥物隨後在適當條件下與CD37 MAb反應。
本文更詳細地描述抗體-藥物結合物化合物之各特定單元。例示性連接子單元、延伸子單元、胺基酸單元、自脫落型間隔子單元及藥物單元之合成及結構亦描述於美國專利申請公開案第2003-0083263號、第2005-0238649號及第2005-0009751號中，各公開案係以全文引用的方式且出於所有目的而併入本文中。
V.)連接子單元
抗體-藥物結合物化合物通常包含在藥物單元與抗體單元之間的連接子單元。在一些實施例中，連接子可在細胞內條件下裂解，從而在細胞內環境中連接子之裂解使藥物單元自抗體釋放。在其他實施例中，連接子單元不可裂解，且藥物例如藉由抗體降解而釋放。
在一些實施例中，連接子可由細胞內環境中(例如溶酶體或核內體或細胞膜穴樣內陷內)所存在之裂解劑裂解。連接子可為例如肽基連接子，其由細胞內肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)溶酶體或核內體蛋白酶)裂解。在一些實施例中，肽基連接子為至少2個胺基酸長或至少3個胺基酸長。裂解劑可包括組織蛋白酶B及D以及纖維蛋白溶酶，已知所有該等酶均水解二肽藥物衍生物，從而在標靶細胞內釋放活性藥物(參見例如Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123)。最典型為可由CD37表現細胞中所存在之酶裂解的肽基連接 子。舉例而言，可使用由高度表現於癌組織中之硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B可裂解的肽基連接子(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接子(SEQ ID NO：9))。該等連接子之其他實例描述於例如美國專利第6,214,345號中，該專利係以全文引用的方式且出於所有目的而併入本文中。在一特定實施例中，細胞內蛋白酶可裂解之肽基連接子為Val-Cit連接子或Phe-Lys連接子(參見例如美國專利6,214,345，其描述用val-cit連接子合成小紅莓)。使用細胞內蛋白水解釋放治療劑之一個優勢在於，藥劑在結合時通常減毒且結合物之血清穩定性通常較高。
在其他實施例中，可裂解連接子具有pH值敏感性，亦即在某些pH值下對水解敏感。pH值敏感性連接子通常可在酸性條件下水解。舉例而言，可使用在溶酶體中可水解之酸不穩定連接子(例如腙、縮胺基脲、硫縮胺基脲、順-烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或其類似物)(參見例如美國專利第5,122,368號、第5,824,805號、第5,622,929號；Dubowchik及Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83：67-123；Neville等人，1989,Biol.Chem.264：14653-14661)。該等連接子在中性pH值條件下相對穩定，諸如在血液中，但在低於pH 5.5或pH 5.0(接近溶酶體之pH值)下不穩定。在某些實施例中，可水解連接子為硫醚連接子(諸如經由醯腙鍵連接至治療劑之硫醚(參見例如美國專利第5,622,929號))。
在其他實施例中，連接子可在還原條件下裂解(例如二硫化物連接子)。多種二硫化物連接子為此項技術中已知，包括例如可使用SATA(N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基硫乙酸酯)、SPDP(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)及SMPT(N-丁二醯亞胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB及SMPT形成之二硫化物連接子(參見例如Thorpe等人，1987,Cancer Res.47：5924-5931；Wawrzynczak等人， Immunoconjugates：Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel編)，Oxford U.Press,1987。亦參見美國專利第4,880,935號)。
在其他特定實施例中，連接子為丙二酸酯連接子(Johnson等人，1995,Anticancer Res.15：1387-93)、馬來醯亞胺基苯甲醯基連接子(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在其他實施例中，連接子單元不可裂解，且藥物藉由抗體降解而釋放(參見美國公開案第2005/0238649號，該案係以全文引用的方式且出於所有目的而併入本文中)。
連接子通常實質上對細胞外環境不敏感。如本文所用，在連接子之情形下，「實質上對細胞外環境不敏感」意謂在抗體-藥物結合物化合物之樣品中，當抗體-藥物結合物化合物存在於細胞外環境中(例如在血漿中)時，不超過約20%、通常不超過約15%、更通常不超過約10%且甚至更通常不超過約5%、不超過約3%或不超過約1%之連接子裂解。連接子是否實質上對細胞外環境不敏感可例如藉由以下方式確定：將抗體-藥物結合物化合物與血漿一起培育預定時段(例如2、4、8、16或24小時)，接著定量血漿中所存在之游離藥物之量。
在其他非互斥性實施例中，連接子有助於細胞內化。在某些實施例中，連接子在結合至治療劑時(亦即在如本文所描述之抗體-藥物結合物化合物之連接子-治療劑部分的環境中)有助於細胞內化。在其他實施例中，連接子在結合至奧瑞他汀化合物與CD37 MAb兩者時有助於細胞內化。
可用於本發明組合物及方法中之多種例示性連接子描述於WO2004-010957、美國公開案第2006/0074008號、美國公開案第20050238649號及美國公開案第2006/0024317號中(各案係以全文引用 的方式且出於所有目的而併入本文中)。
「連接子單元」(LU)為可用於連接藥物單元與抗體單元以形成抗體-藥物結合物化合物之雙官能化合物。在一些實施例中，連接子單元具有下式：-Aa-Ww-Yy-
其中：-A-為延伸子單元；a為0或1；各-W-獨立地為胺基酸單元；w為0至12範圍內之整數；-Y-為自脫落型間隔子單元；且y為0、1或2。
在一些實施例中，a為0或1，w為0或1，且y為0、1或2。在一些實施例中，a為0或1，w為0或1，且y為0或1。在一些實施例中，當w為1至12時，y為1或2。在一些實施例中，w為2至12且y為1或2。在一些實施例中，a為1且w及y為0。
VI.)延伸子單元
延伸子單元(A)在存在時能夠將抗體單元連接至胺基酸單元(-W-)(若存在)，連接至間隔子單元(-Y-)(若存在)，或連接至藥物單元(-D)。可天然或經由化學操作而存在於CD37 MAb(例如HvCD37-6b15.1.1)上之適用官能基包括(但不限於)硫氫基、胺基、羥基、碳水化合物之變旋異構羥基及羧基。適合官能基為硫氫基及胺基。在一個實例中，硫氫基可藉由還原CD37 MAb之分子內雙硫鍵而產生。在另一實施例中，硫氫基可藉由使CD37 MAb之離胺酸部分之胺基與2-亞胺基硫雜環戊烷(泰奧特試劑(Traut's reagent))或其他硫氫基產生試劑反應而產生。在某些實施例中，CD37 MAb為重組抗體且經工程改造以運載一或多個離胺酸。在某些其他實施例中，重組CD37 MAb經工 程改造以運載其他硫氫基，例如其他半胱胺酸。
在一個實施例中，延伸子單元與抗體單元之硫原子形成一鍵。硫原子可來源於抗體之硫氫基。此實施例之代表性延伸子單元描述於式IIIa及式IIIb之方括號內，其中L-、-W-、-Y-、-D、w及y係如上文所定義，且R17係選自-C1-C10伸烷基、-C1-C10伸烯基、-C1-C10伸炔基、碳環基-、-O-(C1-C8伸烷基)-、O-(C1-C8伸烯基)-、-O-(C1-C8伸炔基)-、-伸芳基-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-C2-C10伸烯基-伸芳基、-C2-C10伸炔基-伸芳基、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-伸芳基-C2-C10伸烯基-、-伸芳基-C2-C10伸炔基-、-C1-C10伸烷基-(碳環基)-、-C2-C10伸烯基-(碳環基)-、-C2-C10伸炔基-(碳環基)-、-(碳環基)-C1-C10伸烷基-、-(碳環基)-C2-C10伸烯基-、-(碳環基)-C2-C10伸炔基、-雜環基-、-C1-C10伸烷基-(雜環基)-、-C2-C10伸烯基-(雜環基)-、-C2-C10伸炔基-(雜環基)-、-(雜環基)-C1-C10伸烷基-、-(雜環基)-C2-C10伸烯基-、-(雜環基)-C1-C10伸炔基-、-(CH2CH2O)r-或-(CH2CH2O)r-CH2-，且r為1至10範圍內之整數，其中該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基、碳環、碳環基、雜環基及伸芳基無論單獨或是作為另一基團之一部分均視情況經取代。在一些實施例中，該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基、碳環、碳環基、雜環基及伸芳基無論單獨或是作為另一基團之一部分均未經取代。在一些實施例中，R17係選自-C1-C10伸烷基-、-碳環基-、-O-(C1-C8伸烷基)-、-伸芳基-、-C1-C10伸烷基-伸芳基-、-伸芳基-C1-C10伸烷基-、-C1-C10伸烷基-(碳環基)-、-(碳環基)-C1-C10伸烷基-、-C3-C8雜環基-、-C1-C10伸烷基-(雜環基)-、-(雜環基)-C1-C10伸烷基-、-(CH2CH2O)r-及-(CH2CH2O)r-CH2-；且r為1至10範圍內之整數，其中該伸烷基未經取代且其餘基團視情況經取代。
自所有例示性實施例可瞭解，甚至在未明確表示之情況下，1至 20個藥物部分亦可連接至抗體(p=1至20)。
一個說明性延伸子單元為式IIIa之延伸子單元，其中R17為-(CH2)5-：
另一個說明性延伸子單元為式IIIa之延伸子單元，其中R17為-(CH2CH2O)r-CH2-；且r為2：
一個說明性延伸子單元為式IIIa之延伸子單元，其中R17為-伸芳基-或伸芳基-C1-C10伸烷基-。在一些實施例中，芳基為未經取代之苯基。
另一個說明性延伸子單元為式IIIb之延伸子單元，其中R17為-(CH2)5-：
在某些實施例中，延伸子單元經由抗體單元之硫原子與延伸子單元之硫原子之間的雙硫鍵連接至抗體單元。此實施例之一代表性延 伸子單元描述於式IV之方括號內，其中R17、L-、-W-、-Y-、-D、w及y如上所定義。
應注意，在本申請案中，除非上下文另外指出，否則下式中之S部分係指抗體單元之硫原子。
在其他實施例中，延伸子含有可與抗體之一級或二級胺基形成一鍵的反應位點。此等反應位點之實例包括(但不限於)活性酯，諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酸氯化物、磺醯氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。此實施例之代表性延伸子單元描述於式Va及式Vb之方括號內，其中-R17-、L-、-W-、-Y-、-D、w及y如上所定義；
在一些實施例中，延伸子含有對可能存在於抗體上之改質碳水化合物(-CHO)基團具有反應性的反應位點。舉例而言，碳水化合物可使用諸如過碘酸鈉之試劑輕度氧化，且所得氧化碳水化合物之(-CHO)單元可與含有諸如以下官能基之延伸子縮合：醯肼、肟、一級或二級胺、肼、硫縮胺基脲、肼羧酸酯及芳基醯肼，諸如Kaneko等人，1991,Bioconjugate Chem.2：133-41所描述。此實施例之代表性延伸子單元描述於式VIa、式VIb及式VIc之方括號內，其中-R17-、L-、-W-、-Y-、 -D、w及y如上所定義。
VII.)胺基酸單元
若存在間隔子單元，則胺基酸單元(-W-)在存在時將延伸子單元連接至間隔子單元，若不存在間隔子單元，則將延伸子單元連接至藥物部分，且若不存在延伸子單元及間隔子單元，則將抗體單元連接至藥物單元。
Ww-可為例如單肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。各-W-單元獨立地具有以下方括號中所表示之式，且w為0至12範圍內之整數：
其中R19為氫、甲基、異丙基、異丁基、第二丁基、苯甲基、對羥基苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、- (CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、環己基、
在一些實施例中，胺基酸單元可由一或多種酶來酶促裂解，包括癌症或腫瘤相關蛋白質酶，以釋放藥物單元(-D)，在一個實施例中，藥物單元(-D)在釋放後即在活體內質子化以提供藥物(D)。
在某些實施例中，胺基酸單元可包含天然胺基酸。在其他實施例中，胺基酸單元可包含非天然胺基酸。說明性Ww單元由式(VII)至式(IX)表示：
其中R20及R21如下：
其中R20、R21及R22如下：
其中R20、R21、R22及R23如下：
例示性胺基酸單元包括(但不限於)式VII之單元，其中：R20為苯甲基且R21為-(CH2)4NH2；R20為異丙基且R21為-(CH2)4NH2；或R20為異丙基且R21為-(CH2)3NHCONH2。另一例示性胺基酸單元為式VIII之單元，其中：R20為苯甲基，R21為苯甲基且R22為-(CH2)4NH2。
可設計適用-Ww-單元，且在特定酶(例如腫瘤相關蛋白質酶)使其酶促裂解之選擇性方面進行優化。在一個實施例中，-Ww-單元為可藉由組織蛋白酶B、C及D或纖維蛋白溶酶蛋白酶催化裂解之單元。
在一個實施例中，-Ww-為二肽、三肽、四肽或五肽。當R19、R20、R21、R22或R23不為氫時，R19、R20、R21、R22或R23所連接之碳原子為對掌性的。
R19、R20、R21、R22或R23所連接之各碳原子獨立地呈(S)或(R)組態。
在胺基酸單元之一個態樣中，胺基酸單元為纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)。在另一態樣中，胺基酸單元為苯丙胺酸-離胺酸(亦即fk)。在胺基酸單元之另一態樣中，胺基酸單元為N-甲基纈胺酸-瓜胺酸。在另一態樣中，胺基酸單元為5-胺基戊酸、高苯丙胺酸離胺酸、四異喹啉甲酸酯離胺酸、環己基丙胺酸離胺酸、異哌啶甲酸離胺酸、β-丙胺酸離胺酸、甘胺酸絲胺酸纈胺酸麩醯胺酸及異哌啶甲酸。
VIII.)間隔子單元
當存在胺基酸單元時，間隔子單元(-Y-)在存在時將胺基酸單元連接至藥物單元。或者，當胺基酸單元不存在時，間隔子單元將延伸子單元連接至藥物單元。當胺基酸單元與延伸子單元均不存在時，間隔子單元亦將藥物單元連接至抗體單元。
間隔子單元具有兩種一般類型：非自脫落型及自脫落型。非自脫落型間隔子單元為胺基酸單元自抗體-藥物結合物裂解(尤其酶促裂解)後部分或所有間隔子單元仍結合至藥物部分的間隔子單元。非自脫落型間隔子單元之實例包括(但不限於)(甘胺酸-甘胺酸)間隔子單元及甘胺酸間隔子單元(均描述於流程1中)(下文)。當含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元或甘胺酸間隔子單元之結合物經由酶(例如腫瘤細胞相關蛋白質酶、癌細胞相關蛋白質酶或淋巴細胞相關蛋白質酶)進行酶促裂解時，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分或甘胺酸-藥物部分自L-Aa-Ww-裂解。在一個實施例中，在標靶細胞內進行獨立水解反應，從而使甘胺酸-藥物部分之鍵裂解且釋放藥物。
在一些實施例中，非自脫落型間隔子單元(-Y-)為-Gly-。在一些實施例中，非自脫落型間隔子單元(-Y-)為-Gly-Gly-。
在一個實施例中，提供間隔子單元不存在(y=0)之藥物-連接子結合物，或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。
或者，含有自脫落型間隔子單元之結合物可釋放-D。如本文所用，術語「自脫落型間隔子」係指能夠將兩個間隔之化學部分共價連接在一起形成穩定三聯分子的雙官能化學部分。若其與第一部分之鍵裂解，則其將自發地自第二化學部分分離。
在一些實施例中，-Yy-為伸苯基部分經Qm取代之對胺基苯甲醇(PAB)單元(參見流程2及3)，其中Q為-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-鹵素、-硝基或-氰基；且m為0至4範圍內之整數。烷基、烯基及炔基無論單獨或是作為另一基團之一部分均可視情況經取代。
在一些實施例中，-Y-為經由PAB基團之胺基氮原子連接至-Ww-且經由碳酸酯基、胺基甲酸酯基或醚基直接連接至-D的PAB基團。不受任何特定理論或機制束縛，流程2描述經由胺基甲酸酯基或碳酸酯基直接連接至-D之PAB基團之藥物釋放的可能機制，如Toki等人，2002,J.Org.Chem.67：1866-1872所描述。
流程2
在流程2中，Q為-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為0至4範圍內之整數；且p在1至約20範圍內。烷基、烯基及炔基無論單獨或是作為另一基團之一部分均可視情況經取代。
不受任何特定理論或機制束縛，流程3描述經由醚鍵或胺鍵直接連接至-D之PAB基團之藥物釋放的可能機制，其中D包括作為藥物單元之一部分的氧基或氮基。
在流程3中，Q為-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為0至4範圍內之整數；且p在1至約20範圍內。烷基、烯基及炔基無論單獨或是作為另一基團之一部分均可視情況經取代。
自脫落型間隔子之其他實例包括(但不限於)電子學上類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(Hay等人，1999,Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰或對胺基苯甲基縮醛。可使用在醯胺鍵水解後即進行環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁醯胺(Rodrigues等人，1995,Chemistry Biology 2：223)、經適當取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人，1972,J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙醯胺(Amsberry等人，1990,J.Org.Chem.55：5867)。在甘胺酸之α位經取代之含胺藥物的消除(Kingsbury等人， 1984,J.Med.Chem.27：1447)亦為自脫落型間隔子之實例。
在一個實施例中，間隔子單元為分支鏈雙(羥甲基)-苯乙烯(BHMS)單元，如流程4中所述，其可用於併入及釋放多個藥物。
在流程4中，Q為-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為0至4範圍內之整數；n為0或1；且p在1至約20範圍內。烷基、烯基及炔基無論單獨或是作為另一基團之一部分均可視情況經取代。
在一些實施例中，-D部分相同。在又一實施例中，-D部分不同。
在一個態樣中，間隔子單元(-Yy-)由式(X)至式(XII)表示：
其中Q為-C1-C8烷基、-C1-C8烯基、-C1-C8炔基、-O-(C1-C8烷基)、-O-(C1-C8烯基)、-O-(C1-C8炔基)、-鹵素、-硝基或-氰基；且m為0至4範圍內之整數。烷基、烯基及炔基無論單獨或是作為另一基團之一部分均可視情況經取代。
及
包含式I及式II之抗體-藥物結合物化合物之實施例可包括：
其中w及y各自為0、1或2；及
其中w及y各自為0，
IX.)藥物單元
藥物部分(D)可為任何細胞毒性劑、細胞抑制劑或免疫調節劑(例如免疫抑制劑)或藥物。D為具有可與間隔子單元、胺基酸單元、延伸 子單元或抗體單元形成一鍵之原子的藥物單元(部分)。在一些實施例中，藥物單元D具有可與間隔子單元形成一鍵的氮原子。如本文所用，術語「藥物單元」與「藥物部分」同義且可互換使用。
適用類別之細胞毒性劑或免疫調節劑包括例如抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑及烷基化劑。
在一些實施例中，藥物為奧瑞他汀，諸如奧瑞他汀E(在此項技術中亦稱為海兔毒素-10之衍生物)或其衍生物。奧瑞他汀可為例如在奧瑞他汀E與酮酸形成之酯。舉例而言，奧瑞他汀E可與對乙醯基苯甲酸或苯甲醯基戊酸反應，分別產生AEB及AEVB。其他典型奧瑞他汀包括AFP、MMAF及MMAE。例示性奧瑞他汀之合成及結構描述於美國專利申請公開案第2003-0083263號、第2005-0238649號及第2005-0009751號；國際專利公開案第WO 04/010957號、國際專利公開案第WO 02/088172號及美國專利第6,323,315號、第6,239,104號、第6,034,065號、第5,780,588號、第5,665,860號、第5,663,149號、第5,635,483號、第5,599,902號、第5,554,725號、第5,530,097號、第5,521,284號、第5,504,191號、第5,410,024號、第5,138,036號、第5,076,973號、第4,986,988號、第4,978,744號、第4,879,278號、第4,816,444號及第4,486,414號，各案以全文引用的方式且出於所有目的而併入本文中。
奧瑞他汀已顯示可干擾微管動力學以及細胞核及細胞分裂且具有抗癌活性。奧瑞他汀結合微管蛋白且可對CD37表現細胞發揮細胞毒性或細胞抑制效應。此項技術中已知許多不同的分析法，該等分析法可用於確定奧瑞他汀或所得抗體-藥物結合物是否對所要細胞株發揮細胞抑制或細胞毒性效應。
用於確定化合物是否結合微管蛋白之方法為此項技術中已知。參見例如Muller等人，Anal.Chem 2006,78,4390-4397；Hamel等人， Molecular Pharmacology,1995 47：965-976；及Hamel等人，The Journal of Biological Chemistry,1990 265：28,17141-17149。出於本發明之目的，可測定化合物對微管蛋白之相對親和力。本發明之一些較佳奧瑞他汀結合微管蛋白之親和力介於MMAE對微管蛋白之結合親和力的1/10(較低親和力)至MMAE對微管蛋白之結合親和力的10倍、20倍或甚至100倍(較高親和力)的範圍內。
在一些實施例中，-D為式D E 或式D F 之奧瑞他汀：
或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式；其中，獨立地在各位置處：波形線指示一鍵；R 2 為-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；R 3 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳環、-C1-C20伸烷基(碳環)、-C2-C20伸烯基(碳環)、-C2-C20伸炔基(碳環)、-芳基、-C1-C20伸烷基(芳基)、-C2-C20伸烯基(芳基)、-C2-C20伸炔基(芳基)、雜環、-C1-C20伸烷基(雜環)、-C2-C20伸烯基(雜環)或-C2-C20伸炔基(雜環)；R 4 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳環、-C1-C20伸烷基(碳環)、-C2-C20伸烯基(碳環)、-C2-C20伸炔基(碳環)、芳 基、-C1-C20伸烷基(芳基)、-C2-C20伸烯基(芳基)、-C2-C20伸炔基(芳基)、-雜環、-C1-C20伸烷基(雜環)、-C2-C20伸烯基(雜環)或-C2-C20伸炔基(雜環)；R 5 為-H或-C1-C8烷基；或R 4 與R 5 接合形成碳環且具有式-(CRaRb)s-，其中Ra及Rb獨立地為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-碳環且s為2、3、4、5或6；R 6 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；R 7 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、碳環、-C1-C20伸烷基(碳環)、-C2-C20伸烯基(碳環)、-C2-C20伸炔基(碳環)、-芳基、-C1-C20伸烷基(芳基)、-C2-C20伸烯基(芳基)、-C2-C20伸炔基(芳基)、雜環、-C1-C20伸烷基(雜環)、-C2-C20伸烯基(雜環)或-C2-C20伸炔基(雜環)；各R 8 獨立地為-H、-OH、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C1-C20炔基)或-碳環；R 9 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；R 24 為-芳基、-雜環或-碳環；R 25 為-H、C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-碳環、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)、-O-(C2-C20炔基)或OR 18 ，其中R 18 為-H、羥基保護基或直接鍵，其中OR 18 表示=O；R 26 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基、-芳基、-雜環或-碳環；R 10 為-芳基或-雜環；Z為-O、-S、-NH或-NR12，其中R 12 為-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；R 11 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-芳基、-雜 環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m為1至1000範圍內之整數；R 13 為-C2-C20伸烷基、-C2-C20伸烯基或-C2-C20伸炔基；R 14 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；R 15 在每次出現時均獨立地為-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H、-(CH2)n-SO3-C1-C20烷基、-(CH2)n-SO3-C2-C20烯基或-(CH2)n-SO3-C2-C20炔基；R 16 在每次出現時均獨立地為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-(CH2)n-COOH；且n為0至6範圍內之整數。
其中該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基、碳環基及雜環基無論單獨或是作為另一基團之一部分均視情況經取代。
式D E 之奧瑞他汀包括該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基、碳環基及雜環基未經取代之奧瑞他汀。
式D E 之奧瑞他汀包括基團R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及R9未經取代且基團R19、R20及R21如本文所述視情況經取代的奧瑞他汀。
式D E 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為C1-C8烷基；R 3 、R 4 及R 7 係獨立地選自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、單環C3-C6碳環、-C1-C20伸烷基(單環C3-C6碳環)、-C2-C20伸烯基(單環C3-C6碳環)、-C2-C20伸炔基(單環C3-C6碳環)、C6-C10芳基、-C1-C20伸烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20伸烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20伸炔基(C6-C10芳基)、雜環、-C1-C20伸烷基(雜環)、-C2-C20伸烯基(雜環)或-C2-C20伸炔基(雜環)；其中該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、碳環基、芳基及雜環基視情況經取代； R 5 為-H；R 6 為-C1-C8烷基；各R 8 係獨立地選自-OH、-O-(C1-C20烷基)、-O-(C2-C20烯基)或-O-(C2-C20炔基)，其中該烷基、烯基及炔基視情況經取代；R 9 為-H或-C1-C8烷基；R 24 為視情況經取代之苯基；R 25 為-OR 18 ；其中R 18 為H、羥基保護基或直接鍵，其中OR 18 表示=O；R 26 係選自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-碳環；其中該烷基、烯基、炔基及碳環基視情況經取代；或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式。
式D E 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為甲基；R 3 為-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或C2-C8炔基，其中該烷基、烯基及炔基視情況經取代；R 4 為-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、單環C3-C6碳環、-C6-C10芳基、-C1-C8伸烷基(C6-C10芳基)、-C2-C8伸烯基(C6-C10芳基)、-C2-C8伸炔基(C6-C10芳基)、-C1-C8伸烷基(單環C3-C6碳環)、-C2-C8伸烯基(單環C3-C6碳環)、-C2-C8伸炔基(單環C3-C6碳環)；其中該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基及碳環基無論單獨或是作為另一基團之一部分均視情況經取代；R 5 為-H；R 6 為甲基；R 7 為-C1-C8烷基、-C2-C8烯基或-C2-C8炔基；各R 8 為甲氧基；R 9 為-H或-C1-C8烷基； R 24 為-苯基；R 25 為-OR 18 ；其中R 18 為H、羥基保護基或直接鍵，其中OR 18 表示=O；R 26 為甲基；或其醫藥學上可接受之鹽形式。
式D E 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為甲基；R 3 為-H或-C1-C3烷基；R 4 為-C1-C5烷基；R 5 為H；R 6 為甲基；R 7 為異丙基或第二丁基；R 8 為甲氧基；R 9 為-H或-C1-C8烷基；R 24 為苯基；R 25 為-OR 18 ；其中R 18 為-H、羥基保護基或直接鍵，其中OR18表示=O；且R26為甲基；或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物形式。
式DE之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為甲基或C1-C3烷基；R 3 為-H或-C1-C3烷基；R 4 為-C1-C5烷基；R 5 為H；R 6 為C1-C3烷基；R 7 為-C1-C5烷基；R 8 為-C1-C3烷氧基；R 9 為-H或-C1-C8烷基；R 24 為苯基；R 25 為-OR 18 ；其中R 18 為-H、羥基保護基或直接鍵，其中OR 18 表示=O；且R 26 為C1-C3烷基；或其醫藥學上可接受之鹽形式。
式D F 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中： R 2 為甲基；R 3 、R 4 及R 7 係獨立地選自-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、單環C3-C6碳環、-C1-C20伸烷基(單環C3-C6碳環)、-C2-C20伸烯基(單環C3-C6碳環)、-C2-C20伸炔基(單環C3-C6碳環)、-C6-C10芳基、-C1-C20伸烷基(C6-C10芳基)、-C2-C20伸烯基(C6-C10芳基)、-C2-C20伸炔基(C6-C10芳基)、雜環、-C1-C20伸烷基(雜環)、-C2-C20伸烯基(雜環)或-C2-C20伸炔基(雜環)；其中該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、碳環基、芳基及雜環基無論單獨或是作為另一基團之一部分均視情況經取代；R 5 為-H；R 6 為甲基；各R 8 為甲氧基；R 9 為-H、C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基；其中該烷基、烯基及炔基視情況經取代；R 10 為視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜環；Z為-O-、-S-、-NH-或-NR12，其中R 12 為-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基，各自視情況經取代；R 11 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基、-芳基、-雜環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2，其中該烷基、烯基、炔基、芳基及雜環基視情況經取代；m為1至1000範圍內之整數或m=0；R 13 為-C2-C20伸烷基、-C2-C20伸烯基或-C2-C20伸炔基，各自視情況經取代；R 14 為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基或-C2-C20炔基，其中該烷基、烯基及炔基視情況經取代；R 15 在每次出現時均獨立地為-H、-COOH、-(CH2)n-N(R16)2、- (CH2)n-SO3H、-(CH2)n-SO3-C1-C20烷基、-(CH2)n-SO3-C2-C20烯基或-(CH2)n-SO3-C2-C20炔基，其中該烷基、烯基及炔基視情況經取代；R 16 在每次出現時均獨立地為-H、-C1-C20烷基、-C2-C20烯基、-C2-C20炔基或-(CH2)n-COOH，其中該烷基、烯基及炔基視情況經取代；n為0至6範圍內之整數；或其醫藥學上可接受之鹽。
在某些此等實施例中，R 10 為視情況經取代之苯基。
式D F 之奧瑞他汀包括基團R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8及R9未經取代且基團R10及R11如本文中所描述之奧瑞他汀。
式D F 之奧瑞他汀包括該烷基、烯基、炔基、伸烷基、伸烯基、伸炔基、芳基、碳環基及雜環基未經取代之奧瑞他汀。
式D F 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為-C1-C3烷基；R 3 為-H或-C1-C3烷基；R 4 為-C1-C5烷基；R 5 為-H；R 6 為-C1-C3烷基；R 7 為-C1-C5烷基；R 8 為-C1-C3烷氧基；R 9 為-H或-C1-C8烷基；R 10 為視情況經取代之苯基；Z為-O-、-S-或-NH-；R 11 如本文所定義；或其醫藥學上可接受之鹽。
式D F 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為甲基；R 3 為-H或-C1-C3烷基；R 4 為C1-C5烷基；R 5 為-H；R 6 為甲基；R 7 為異丙基或第二丁基；R 8 為甲氧基；R 9 為-H或-C1-C8烷基；R 10 為視情況經取代之苯基；Z為-O-、-S-或-NH-；且R11如本文所定義；或其醫藥學上可接受之鹽。
式D F 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為甲基；R 3 為-H或-C1-C3烷基；R 4 為-C1-C5烷基；R 5 為-H；R 6 為甲基；R 7 為異丙基或第二丁基；R 8 為甲氧基；R 9 為-H或C1-C8烷基；R 10 為苯基；且Z為-O-或-NH-；且R 11 如本文所定義，較佳為氫； 或其醫藥學上可接受之鹽形式。
式D F 之奧瑞他汀包括以下奧瑞他汀，其中：R 2 為-C1-C3烷基；R 3 為-H或-C1-C3烷基；R 4 為-C1-C5烷基；R 5 為-H；R 6 為-C1-C3烷基；R 7 為-C1-C5烷基；R 8 為-C1-C3烷氧基；R 9 為-H或-C1-C8烷基；R 10 為苯基且Z為-O-或-NH-；且R11如本文所定義，較佳為氫；或其醫藥學上可接受之鹽形式。
式D E 或式D F 之奧瑞他汀包括R3、R4及R7獨立地為異丙基或第二丁基且R5為-H之奧瑞他汀。在一例示性實施例中，R3及R4各自為異丙基，R5為H，且R7為第二丁基。其餘取代基如本文所定義。
式D E 或式D F 之奧瑞他汀包括R2及R6各自為甲基且R9為H之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D E 或式D F 之奧瑞他汀包括R8在每次出現時均為-OCH3之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D E 或式D F 之奧瑞他汀包括R3及R4各自為異丙基、R2及R6各自為甲基、R5為H、R7為第二丁基、R8在每次出現時均為-OCH3且R9為H之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D F 之奧瑞他汀包括Z為-O-或-NH-之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D F 之奧瑞他汀包括R10為芳基之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D F 之奧瑞他汀包括R10為-苯基之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D F 之奧瑞他汀包括Z為-O-且R11為H、甲基或第三丁基之奧瑞他汀。其餘取代基如本文所定義。
式D F 之奧瑞他汀包括當Z為-NH-時R11為-(R13O)m-CH(R15)2之奧瑞他汀，其中R15為-(CH2)n-N(R16)2且R16為-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。 其餘取代基如本文所定義。
式D F 之奧瑞他汀包括當Z為-NH-時R11為-(R13O)m-CH(R15)2之奧瑞他汀，其中R15為-(CH2)n-SO3H。其餘取代基如本文所定義。
在較佳實施例中，當D為式D E 之奧瑞他汀時，w為1至12範圍內之整數，較佳為2至12；y為1或2；且a較佳為1。
在D為式D F 之奧瑞他汀的一些實施例中，a為1且w及y為0。
說明性藥物單元(-D)包括具有以下結構之藥物單元：
或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物。
在一個態樣中，諸如但不限於三乙二醇酯(TEG)之親水性基團可在R11處連接至藥物單元。不受理論束縛，親水性基團有助於藥物單元內化及不聚集。
在一些實施例中，藥物單元不為TZT-1027。在一些實施例中，藥物單元不為奧瑞他汀E、海兔毒素10或奧瑞他汀PE。
例示性抗體-藥物結合物化合物具有以下結構，其中「L」或「mAb-s-」表示本文所述之稱為HvCD37-6b15.1.1之CD37 MAb： L-MC-vc-PAB-MMAF或L-MC-vc-PAB-MMAE.
或 L-MC-MMAF
或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，藥物單元為卡奇黴素、喜樹鹼、類美登素或蒽環黴素(anthracycline)。在一些實施例中，藥物為紫杉烷(taxane)、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼或其類似物。
在一些典型實施例中，適合細胞毒性劑包括例如DNA小溝結合劑(例如烯二炔類及來曲素(lexitropsin)類CBI化合物；亦參見美國專利第6,130,237號)、多卡米新(duocarmycin)、紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多烯紫杉醇(docetaxel))、嘌呤黴素及長春花生物鹼。其他細胞毒性劑包括例如CC-1065、SN-38、拓朴替康(topotecan)、N-嗎啉基-小紅莓、根瘤菌素(rhizoxin)、氰基(N-嗎啉基)-小紅莓、棘黴素(echinomycin)、康柏斯達汀(combretastatin)、紡錘菌素(netropsin)、埃博黴素(epothilone)A及埃博黴素B、雌莫司汀(estramustine)、自念珠藻環肽(cryptophysin)、西馬多丁(cemadotin)、類美登素、迪斯德莫來(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobin)及米托蒽醌。
在一些實施例中，藥物為抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑之實例包括奧瑞他汀、紫杉烷(例如Taxol®(太平洋紫杉醇)、Taxotere®(多烯紫杉醇))、T67(Tularik)及長春花生物鹼(例如長春新鹼、長春鹼、長春地辛及長春瑞濱(vinorelbine))。其他抗微管蛋白劑包括例如巴卡亭(baccatin)衍生物、紫杉烷類似物(例如埃博黴素A及B)、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙鹼及秋水仙醯胺、雌莫司汀、自念珠藻環肽(cryptophycin)、西馬多丁、類美登素、康柏斯達汀、迪斯德莫來及艾 榴塞洛素。
在某些實施例中，細胞毒性劑為類美登素，另一組抗微管蛋白劑。舉例而言，在特定實施例中，類美登素為美登素(maytansine)或DM-1(ImmunoGen,Inc.；亦參見Chari等人，1992,Cancer Res.52：127-131)。
在某些實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑為海兔毒素。在某些實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑屬於奧瑞他汀類。因而，在一特定實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑為MMAE(式XI)。在另一特定實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑為AFP(式XVI)。
在某些實施例中，細胞毒性劑或細胞抑制劑為式XII至式XXI之化合物或其醫藥學上可接受之鹽：
X.)藥物負載
藥物負載由p表示且為分子中每個抗體之藥物部分平均數目。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物部分(D)範圍內。在一些實施例中，本發明之ADC包括多種與1至20個範圍內之藥物部分結合的抗體。在由結合反應製備ADC時，每個抗體之藥物部分平均數目可藉由習知方法表徵，諸如質譜分析及ELISA分析法。亦可測定ADC中p之定量分佈。在一些情況下，可藉由諸如電泳之方式，來實現p為某一值之均質ADC自具有其他藥物負載之ADC的分離、純化及表徵。
對於一些抗體-藥物結合物，p可能受抗體上之連接位點數目限制。舉例而言，若連接為半胱胺酸硫醇，如以上例示性實施例中，則抗體可能僅具有一個或數個半胱胺酸硫醇基，或可能僅具有一個或數個具有足夠反應性且連接子連接所經由之硫醇基。在某些實施例中，更高藥物負載(例如p>5)可能致使某些抗體-藥物結合物聚集、不溶、具毒性或喪失細胞滲透性。在某些實施例中，本發明ADC之藥物負載在1至約8、約2至約6、約3至約5、約3至約4、約3.1至約3.9、約3.2至 約3.8、約3.2至約3.7、約3.2至約3.6、約3.3至約3.8或約3.3至約3.7範圍內。實際上，已顯示對於某些ADC，藥物部分/抗體之最佳比率可小於8，且可為約2至約5。參見US 2005-0238649 A1(以全文引用的方式併入本文中)。
在某些實施例中，少於理論最大值之藥物部分在結合反應期間結合至抗體。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間物或連接試劑反應之離胺酸殘基，如下文所論述。一般而言，抗體不含有許多可連接至藥物部分的游離及反應性半胱胺酸硫醇基；實際上抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以雙硫橋形式存在。在某些實施例中，可在部分或總體還原條件下，用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑還原抗體，以產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，抗體經歷變性條件以顯示反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可以不同方式控制，例如藉由：(i)限制藥物-連接子中間物或連接試劑相對於抗體之莫耳過量；(ii)限制結合反應時間或溫度；(iii)對於半胱胺酸硫醇修飾，施加部分或限制性還原條件；(iv)藉由重組技術工程改造抗體之胺基酸序列，以改變半胱胺酸殘基數目及位置，從而控制連接子-藥物連接之數目及/或位置(諸如如本文及WO2006/034488(以全文引用的方式併入本文中)中所揭示而製備之thioMab或thioFab)。
應瞭解，若超過一個親核基團與藥物-連接子中間物或連接試劑反應，接著與藥物部分試劑反應，則所得產物為具有一或多個藥物部分連接至一個抗體之分佈的ADC化合物之混合物。可藉由對抗體具特異性且對藥物具特異性之雙重ELISA抗體分析，計算該混合物中每個抗體之藥物平均數目。可藉由質譜分析鑑別混合物中之個別ADC分子且藉由HPLC加以分離，例如疏水性相互作用層析(參見例如Hamblett,K.J.等人「Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate」，摘要號624,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates」，摘要號627,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些實施例中，可藉由電泳或層析自結合混合物分離具有單一負載值之均質ADC。
XI.)確定ADC之細胞毒性效應的方法
確定藥物或抗體-藥物結合物是否對細胞發揮細胞抑制及/或細胞毒性效應的方法為已知的。一般而言，可藉由以下方式量測抗體藥物結合物之細胞毒性或細胞抑制活性：將表現抗體藥物結合物之標靶蛋白之哺乳動物細胞曝露於細胞培養基中；培養該等細胞約6小時至約5天之時段；及量測細胞生存力。基於細胞之活體外分析法可用於量測抗體藥物結合物之生存力(增殖)、細胞毒性及細胞凋亡之誘發(卡斯蛋白酶活化)。
為確定抗體藥物結合物是否發揮細胞抑制效應，可使用胸苷併入分析法。舉例而言，可培養以5,000個細胞/孔之密度塗於96孔盤的表現標靶抗原之癌細胞72小時之時段，且在該72小時時段之最後8小時期間曝露於0.5μCi 3H-胸苷。在存在及不存在抗體藥物結合物的情況下量測細胞培養物中3H-胸苷之併入。
為確定細胞毒性，可量測壞死或細胞凋亡(漸進式細胞死亡)。壞死通常伴隨質膜滲透性增加、細胞膨脹及質膜破裂。細胞凋亡之特徵通常在於細胞膜起泡、細胞質濃縮及內源性核酸內切酶活化。測到任何此等對癌細胞之效應均指示抗體藥物結合物適用於治療癌症。
可藉由測定細胞中染料(諸如中性紅、錐蟲藍或ALAMARTM藍)之吸收來量測細胞生存力(參見例如Page等人，1993,Intl.J.Oncology 3：473-476)。在此類分析法中，在含有染料之培養基中培育細胞，洗滌細胞，且以分光光度法量測反映染料為細胞所吸收的剩餘染料。蛋白結合染料磺醯若丹明B(sulforhodamine B，SRB)亦可用於量測細胞毒性(Skehan等人，1990,J.Natl.Cancer Inst.82：1107-12)。
或者，在定量比色分析法中，使用諸如MTT之四唑鎓鹽，藉由偵測活細胞而非死細胞，來分析哺乳動物細胞之存活及增殖(參見例如Mosmann,1983,J.Immunol.Methods 65：55-63)。
可藉由量測例如DNA斷裂來定量細胞凋亡。可利用用於活體外定量測定DNA斷裂之市售光測法。該等分析法(包括基於TUNEL(其偵測斷裂DNA中之標記核苷酸之併入)及ELISA之分析法)之實例描述於Biochemica,1999，第2期，第34-37頁(Roche Molecular Biochemicals)。
亦可藉由量測細胞之形態變化來確定細胞凋亡。舉例而言，如同壞死，可藉由量測某些染料(例如螢光染料，諸如吖啶橙或溴化乙錠)之吸收來確定質膜完整性之喪失。Duke及Cohen,Current Protocols in Immunology(Coligan等人編，1992，第3.17.1-3.17.16頁)已描述一種量測凋亡細胞數目之方法。亦可用DNA染料(例如吖啶橙、溴化乙錠或碘化丙錠)標記細胞，且觀察細胞中沿內核膜之染色質濃縮及著邊。可進行量測以確定細胞凋亡之其他形態變化包括例如細胞質濃縮、細胞膜起泡增加及細胞收縮。
可量測培養物之連接及「浮動」隔層中凋亡細胞之存在。舉例而言，可藉由在進行離心洗滌步驟(例如10分鐘，2000rpm)後，移除上清液，以胰蛋白酶處理連接之細胞，組合該等製劑來收集兩個隔層，且偵測細胞凋亡(例如藉由量測DNA斷裂)。(參見例如Piazza等人， 1995,Cancer Research 55：3110-16)。
可在適合動物模型中評估CD37治療組合物之活體內效應。舉例而言，可使用異種癌症模型，其中將癌症外植體或繼代異種移植組織引入免疫功能降低之動物中，諸如裸小鼠或SCID小鼠(Klein等人，1997,Nature Medicine 3：402-408)。舉例而言，PCT專利申請案WO 98/16628及美國專利6,107,540描述人類前列腺癌之多種異種移植模型，該等模型能夠再現原發腫瘤之出現、微轉移及晚期疾病之成骨性轉移特徵之形成。可使用量測腫瘤形成之抑制、腫瘤消退或轉移及其類似過程的分析法來預測功效。
評估對細胞凋亡之促進情況的活體內分析法適用於評估治療性組合物。在一個實施例中，可檢查經治療性組合物治療之帶有腫瘤之小鼠的異種移植物中是否存在細胞凋亡病灶且與未經治療之帶有異種移植物之對照小鼠比較。在經治療之小鼠之腫瘤中發現細胞凋亡病灶所達到的程度指示組合物之治療功效。
用於實施上述方法之治療性組合物可調配成包含適於所要遞送方法之載劑的醫藥組合物。適合載劑包括在與治療性組合物組合時保留該治療性組合物之抗腫瘤功能且一般對患者之免疫系統無反應性的任何物質。實例包括(但不限於)許多標準醫藥載劑中之任一種，諸如無菌磷酸鹽緩衝鹽水溶液、抑菌水及其類似物(一般參見Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，A.Osal.編，1980)。
可溶解治療性調配物且經由能夠將治療性組合物遞送至腫瘤部位之任何途徑投與。潛在有效投藥途徑包括(但不限於)靜脈內、非經腸、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、皮內、器官內、正位及其類似途徑。用於靜脈內注射之較佳調配物包含治療性組合物於經防腐處理之抑菌水溶液、未經防腐處理之無菌水溶液中及/或稀釋於含有0.9%注射用無菌氯化鈉(USP)之聚氯乙烯或聚乙烯袋中。可凍乾治療性蛋白製 劑，且以無菌粉末之形式較佳在真空下儲存，接著在注射前在抑菌水(含有例如苯甲醇防腐劑)或在無菌水中復原。
使用上述方法治療癌症之劑量及投藥方案將隨方法及標靶癌症而變化，且一般將視此項技術中所瞭解之許多其他因素而定。
在一個實施例中，由於HvCD37-6b15.1.1 MAb之修飾，本發明之醫藥組合物可包含本發明ADC之一種以上物質。舉例而言，本發明包括包含本發明ADC之醫藥組合物，其中HvCD37-6b15.1.1 MAb為缺乏重鏈C端離胺酸之抗體、具有N端轉譯後修飾之抗體、缺乏重鏈C端離胺酸且具有N端轉譯後修飾之抗體及/或具有重鏈C端離胺酸且不具有N端轉譯後修飾之抗體。
舉例而言，在一些實施例中，本發明之醫藥組合物包括包含本發明ADC之兩種或兩種以上物質之醫藥組合物，其中ADC之HvCD37-6b15.1.1 MAb選自以下1)至4)之群：1)HvCD37-6b15.1.1 MAb，其包含由在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列組成的重鏈及由在SEQ ID NO：8之殘基1(D)至殘基212(C)範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈；2)HvCD37-6b15.1.1 MAb，其包含由在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列組成的重鏈，其中N端殘基1(Q)轉化成焦麩胺酸；及由在SEQ ID NO：8之殘基1(D)至殘基212(C)範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈；3)HvCD37-6b15.1.1 MAb，其包含由在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列組成的重鏈，其中C端殘基441(K)經移除；及由在SEQ ID NO：8之殘基1(D)至殘基212(C)範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈；及4)HvCD37-6b15.1.1 MAb，其包含由在SEQ ID NO：7之殘基1(Q)至殘基441(K)範圍內之胺基酸序列組成的重鏈，其中N端殘基1(Q)轉 化成焦麩胺酸且C端殘基441(K)經移除；及由在SEQ ID NO：8之殘基1(D)至殘基212(C)範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈。
XII.)表現CD37之癌症之治療
鑑別出CD37為正常表現於一組有限組織中，但亦表現於癌症(諸如表I中所列之癌症)中之蛋白質為治療該等癌症提供許多治療方法。
值得注意地，即使當標靶蛋白表現於正常組織、甚至正常生命器官組織上時，靶向抗腫瘤療法亦適用。生命器官為維持生命所必需之器官，諸如心臟或結腸。非生命器官為可移除且之後個體仍能存活的器官。非生命器官之實例為卵巢、乳房及前列腺。
標靶蛋白在正常組織、甚至正常生命組織中之表現無法阻撓該蛋白質之靶向劑用作其中蛋白質亦過度表現之某些腫瘤的治療劑。舉例而言，在生命器官中之表現在本質上且自然地並不有害。此外，可移除被視為非必需之器官(諸如前列腺及卵巢)而不影響死亡率。最後，一些生命器官因免疫赦免而不受正常器官表現之影響。免疫赦免器官為受血液-器官障壁保護而避開血液，因此免疫療法無法到達的器官。免疫赦免器官之實例為腦及睪丸。
因此，抑制CD37蛋白質之活性的治療方法適用於罹患表現CD37之癌症的患者。該等治療方法一般分為三類。第一類方法調節與腫瘤細胞生長有關之CD37功能，從而抑制或延緩腫瘤細胞生長或誘導殺死腫瘤細胞。第二類方法包含抑制CD37蛋白質與其結合搭配物或其他蛋白質結合或締合的各種方法。第三類方法包含抑制CD37基因轉錄或CD37 mRNA轉譯的各種方法。
因此，可較佳使用腫瘤組織之免疫組織化學評估、定量CD37成像或可靠地指示CD37表現之存在及程度的其他技術，評估癌症患者中CD37表現之存在及程度。腫瘤活組織檢查或手術樣品之免疫組織化學分析較佳用於達成此目的。腫瘤組織之免疫組織化學分析方法為 此項技術中所熟知。
XIII.)CD37作為基於抗體之療法的標靶
CD37為一種對基於抗體之治療策略而言具有吸引力之標靶。在此項技術中已知許多用於靶向細胞外分子與細胞內分子的抗體策略(參見例如補體及ADCC介導之殺死以及胞內抗體之使用)。由於各種譜系之癌細胞相對於相應正常細胞表現CD37，所以準備全身性投與CD37免疫反應性組合物，該等組合物展現優良敏感性而不存在因免疫反應性組合物結合至非標靶器官及組織所致之毒性、非特異性及/或非標靶效應。與CD37結構域特異性反應之抗體適用於較佳呈抗體藥物結合物(亦即ADC)形式全身性治療CD37表現癌症，其中該結合物具有毒素或治療劑。
熟習此項技術者應瞭解，抗體可用於特異性靶向並結合免疫原性分子，諸如圖1中所示之CD37序列之免疫原性區域。此外，熟習此項技術者應瞭解，通常抗體結合至細胞毒性劑(參見例如Slevers等人，Blood 93：11 3678-3684(1999年6月1日))。當細胞毒性劑及/或治療劑諸如藉由結合至對細胞所表現之分子(例如CD37)具有特異性之抗體來直接遞送至細胞時，細胞毒性劑對彼等細胞發揮其已知之生物效應(亦即細胞毒性)。
在此項技術中已知使用抗體-細胞毒性劑結合物殺死細胞之多種組合物及方法。在癌症之情形下，典型方法需要向具有腫瘤之哺乳動物投與生物有效量之結合物，該結合物包含所選細胞毒性劑及/或治療劑連接至與所表現之抗原(例如CD37)結合之靶向劑(例如CD37 MAb，較佳為HvCD37-6b15.1.1)，以結合或定位於細胞表面上。一典型實施例為向表現CD37之細胞遞送細胞毒性劑及/或治療劑的方法，該方法包含使細胞毒性劑結合至與CD37抗原決定基免疫特異性結合之抗體，且使細胞曝露於抗體藥物結合物(ADC)。另一說明性實施例 為治療懷疑罹患轉移癌症之個體的方法，該方法包含向該個體非經腸投與包含治療有效量之抗體結合至細胞毒性劑及/或治療劑之醫藥組合物的步驟。
使用CD37抗體之癌症免疫療法可根據已成功用於治療其他類型癌症之各種方法來進行，該等其他類型癌症包括(但不限於)結腸癌(Arlen等人，1998,Crit.Rev.Immunol.18：133-138)、多發性骨髓瘤(Ozaki等人，1997,Blood 90：3179-3186；Tsunenari等人，1997,Blood 90：2437-2444)、胃癌(Kasprzyk等人，1992Cancer Res.52：2771-2776)、B細胞淋巴瘤(Funakoshi等人，1996,J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.19：93-101)、白血病(Zhong等人，1996,Leuk.Res.20：581-589)、結腸直腸癌(Moun等人，1994,Cancer Res.54：6160-6166；Velders等人，1995,Cancer Res.55：4398-4403)及乳癌(Shepard等人，1991,J.Clin.Immunol.11：117-127)。一些治療方法包括使裸抗體結合至毒素或放射性同位素，諸如分別使Y91或I131結合至抗-CD20抗體(例如IDEC Pharmaceuticals Corp.之ZevalinTM或Coulter Pharmaceuticals之BexxarTM)，而其他方法包括共同投與抗體與其他治療劑，諸如HerceptinTM(曲妥珠單抗(trastuzu Mab))與太平洋紫杉醇(Genentech,Inc.)。在一較佳實施例中，抗體結合上述細胞毒性劑，較佳稱為MMAE(Seattle Genetics)之奧瑞他汀衍生物。
儘管CD37抗體療法可用於癌症之所有階段，但抗體療法可尤其適用於晚期或轉移性癌症。在一些實施例中，用本發明之抗體療法治療適用於已接受一或多輪化學療法之患者。或者，在一些實施例中，將本發明之抗體療法與化學療法或放射療法組合以用於尚未接受化學療法治療之患者。此外，抗體療法能夠使用降低劑量之伴隨化學療法，尤其對於不能很好地耐受化學治療劑毒性之患者。Fan等人(Cancer Res.53：4637-4642,1993)、Prewett等人(International J.of Onco.9：217-224,1996)及Hancock等人(Cancer Res.51：4575-4580,1991)描述各種抗體連同化學治療劑一起用途。
治療表I中所述之癌症的CD37單株抗體包括引發針對腫瘤之有效免疫反應或直接具有細胞毒性的抗體。就此而言，CD37單株抗體(MAb)可藉由補體介導之或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)機制引發腫瘤細胞分解，兩者均需要免疫球蛋白分子之完整Fc部分以與補體蛋白上之效應細胞Fc受體相互作用。另外，對腫瘤生長發揮直接生物作用之CD37 MAb適用於治療表現CD37之癌症。直接細胞毒性MAb發揮作用之機制包括：抑制細胞生長、調節細胞分化、調節腫瘤血管生成因子分佈及誘導細胞凋亡。使用任何數目之此項技術中一般已知之評估細胞死亡(諸如ADCC、補體介導之細胞分解等)之活體外分析評估特定CD37 MAb發揮抗腫瘤作用之機制。
因此，本發明之治療性方法中所用之較佳單株抗體包括全人類抗體及以高親和力特異性結合至標靶CD37抗原之抗體。
XIV.)CD37 ADC混合物
在一些實施例中，本發明之治療方法涵蓋投與單一CD37 ADC以及不同MAb(亦即CD37 MAb或結合另一蛋白質之Mab)之組合或混合物。該等MAb混合物由於含有靶向不同抗原決定基之MAb、利用不同效應機制或直接組合細胞毒性MAb與依賴於免疫效應功能之MAb而具有一定優勢。該等呈組合形式之MAb可展現協同治療效應。此外，CD37 MAb可附隨其他治療形式投與，該等治療形式包括(但不限於)各種化學治療劑及生物劑、雄激素阻斷劑、免疫調節劑(例如IL-2、GM-CSF)、手術或放射。在一較佳實施例中，CD37 MAb以結合形式投與。
CD37 ADC調配物經由能夠遞送抗體至腫瘤細胞之任何途徑投與。投藥途徑包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌肉內、腫瘤內、皮 內及其類似途徑。治療一般包括經由可接受之投藥途徑(諸如靜脈內注射(IV))重複投與CD37 ADC製劑，劑量通常在包括(但不限於)每公斤體重0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25毫克之範圍內。一般而言，每週10至1000毫克MAb範圍內之劑量為有效的且耐受性良好。
基於用Herceptin®(曲妥珠單抗)治療轉移性乳癌之臨床經驗，每公斤患者體重約4毫克之初始負載劑量(IV)、接著每週約2毫克/公斤劑量(IV)之MAb製劑代表一種可接受之給藥方案。初始負載劑量較佳以90分鐘或90分鐘以上之輸注形式投與。定期維持劑量以30分鐘或30分鐘以上之輸注形式投與，其限制性條件為初始劑量之耐受性良好。如熟習此項技術者所瞭解，在特定情況下，多種因素可影響理想給藥方案。該等因素包括例如所用MAb之結合親和力及半衰期、患者中CD37之表現程度、循環排出CD37抗原之程度、所要穩態抗體濃度、治療頻率及與所提供之治療方法組合使用之化學治療劑或其他藥劑的影響，以及特定患者之健康狀況。
視情況應評估患者之指定樣品中CD37之含量(例如循環CD37抗原及/或CD37表現細胞之含量)以便有助於確定最有效之給藥方案等。該等評估亦用於在治療中達成監測之目的，且適用於與其他參數之評估(例如膀胱癌療法中之尿細胞學及/或ImmunoCyt含量，或以此類推，前列腺癌療法中之血清PSA含量)組合來估量治療成功性。
本發明之一個目標為提供抑制或延遲表現CD37之腫瘤細胞生長的CD37 ADC。本發明之另一目標為提供抑制血管生成及其他生物功能且藉此減慢哺乳動物(較佳為人類)之腫瘤生長的方法，該方法使用該等CD37 ADC，且尤其使用該等CD37 ADC與其他藥物或免疫活性治療組合。
XV.)組合療法
在一個實施例中，當用CD37 ADC連同化學治療劑或放射或其組合治療腫瘤(包括人類腫瘤)時，產生協同作用。換言之，CD37 ADC對腫瘤生長之抑制程度超過在與化學治療劑或放射或其組合進行組合時所預期之抑制程度。舉例而言，協同作用可由組合治療對腫瘤生長之抑制程度大於僅用CD37 ADC治療所預期之抑制程度或用CD37 ADC及化學治療劑或放射治療之相加效應所顯示。協同作用較佳由癌症減輕所證明，其中在用CD37 ADC治療或用CD37 ADC與化學治療劑或放射之相加組合治療時未期望減輕。
使用CD37 ADC與化學療法或放射或兩者組合抑制腫瘤細胞生長的方法包含在開始化學療法或放射療法之前、期間或之後以及其任何組合(亦即，在開始化學療法及/或放射療法之前與期間、之前與之後、期間與之後、或之前、期間及之後)投與CD37 ADC。舉例而言，CD37 ADC通常在開始放射療法及/或化學療法之前的1至60天之間，較佳在3至40天之間，更佳在5至12天之間投與。然而，視治療方案及特定患者需要而定，該方法以提供最有效治療且最終延長患者生命之方式執行。
化學治療劑之投藥可以多種方式實現，包括藉由非經腸及經腸途徑全身性投與。在一個實施例中，CD37 ADC及化學治療劑以各別分子投與。化學治療劑或化學療法之特定實例包括順鉑、達卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)、放線菌素D、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)(氮芥)、鏈脲黴素(streptozocin)、環磷醯胺、卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)、小紅莓(阿德力黴素(adriamycin))、道諾黴素、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、長春鹼、長春新鹼、博萊黴素(bleomycin)、太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多烯紫杉醇(紫杉德(taxotere))、阿地白介素(aldesleukin)、天冬醯胺酶、白 消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、達卡巴嗪、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱、羥基脲、異環磷醯胺(ifosfamide)、干擾素α、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰嘌呤(mercaptopurine)、普卡黴素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他汀、雙溴丙基哌嗪(pipobroman)、普卡黴素、鏈脲黴素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睪內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、烏拉莫司汀(uracil mustard)、長春瑞濱、吉西他濱(gemcitabine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、紫杉醇及其組合。
與CD37 ADC組合使用之放射源可處於所治療之患者之外部或內部。當該來源處於患者外部時，該療法稱為體外光束放射療法(EBRT)。當放射源處於患者內部時，該治療稱為近接療法(BT)。
上述治療方案可進一步與其他癌症治療劑及/或方案組合，例如其他化學療法、癌症疫苗、信號轉導抑制劑、適用於治療異常細胞生長或癌症之藥劑、抗體(例如WO 2005/092380(Pfizer)中所描述之抗-CTLA-4抗體)，或藉由結合至IGF-1R及細胞激素來抑制腫瘤生長的其他配位體。
當哺乳動物進行其他化學療法時，可使用上述化學治療劑。此外，可使用生長因子抑制劑、生物反應調節劑、抗激素療法、選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、血管生成抑制劑及抗雄激素劑。舉例而言，可使用抗激素劑，例如抗雌激素劑，諸如諾瓦得士(Nolvadex)(他莫昔芬)；或抗雄激素劑，諸如康士德(Casodex)(4'-氰基-3-(4-氟苯磺醯基)-2-羥基-2-甲基-3'-(三氟甲基)丙醯苯胺)。
可將上述治療方法與多種手術、化學療法或放射療法方案中之任一種組合。在一些實施例中，本發明之治療方法可容許使用降低劑量之化學療法(或其他療法)及/或更低頻率之投藥，此對於所有患者且 尤其對於不能良好耐受化學治療劑毒性之患者而言為有利的。
XVI.)套組/製品
為用於本文所述之實驗室、預後、預防、診斷及治療應用，套組在本發明之範疇內。該等套組可包含：經劃分以容納一或多個容器(諸如小瓶、管及其類似物)的承載器、封裝或容器，各容器包含將用於該方法中之各別元件之一，以及包含使用說明(諸如本文所述之用途)之標籤或說明書。舉例而言，容器可包含經標記或可偵測地標記之抗體。套組可包含含有藥物單元之容器。套組可包括圖2或圖3中之所有或部分胺基酸序列或其類似物，或編碼該等胺基酸序列之核酸分子。
在一些實施例中，本發明之套組通常將包含上述容器及一或多個與其相關之其他容器，該一或多個容器包含自商業及使用者之角度而言合乎需要之物質，包括緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器；列有含量及/或使用說明之承載器、封裝、容器、小瓶及/或管標籤；及具有使用說明之藥品說明書。
標籤可存在於容器上或隨容器存在，以指示組合物係用於特定療法或是非治療性應用，諸如預後、預防、診斷或實驗室應用，且亦可指示活體內或活體外使用說明，諸如本文所描述之使用說明。隨套組存在或包括於套組上之說明書或標籤上亦可包括說明及/或其他資訊。標籤可在容器上或與容器相聯。當形成標籤之字母、數字或其他字符模製或蝕刻於容器自身內時，標籤可在容器上；當標籤存在於亦容納容器之貯器或承載器內時，其可與該容器相聯，例如呈藥品說明書形式。標籤可指示組合物用於診斷、治療、預防或預後病狀，諸如表I中所述之組織之癌症。
術語「套組」與「製品」可作同義語使用。
在本發明之另一實施例中，提供含有諸如抗體或抗體藥物結合 物(ADC)(例如適用於診斷、預後、預防及/或治療諸如表I中所述之組織之癌症的物質)之組合物的製品。該製品通常包含至少一個容器及至少一個標籤。適合之容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。該等容器可由多種材料(諸如玻璃、金屬或塑膠)形成。該容器可容納胺基酸序列、小分子、核酸序列、細胞群體及/或抗體。在另一實施例中，容器包含用於評估細胞及組織中CD37之蛋白質表現或用於相關實驗室、預後、診斷、預防及治療目的之抗體、其結合片段或特異性結合蛋白；關於該等用途之指示及/或說明可包括於該容器上或隨該容器存在，如同用於達成此等目的之試劑及其他組合物或工具。
或者容器可容納有效治療、診斷、預後或預防病狀之組合物且可具有無菌人孔(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之活性劑可為能夠特異性結合CD37之抗體或能夠特異性結合CD37之抗體藥物結合物。
該製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及/或右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者之角度而言合乎需要的其他物質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、攪拌器、針、注射器及/或具有使用指示及/或說明之藥品說明書。
實例：
藉由以下數個實例進一步描述並說明本發明之各種態樣，該等實例不意欲限制本發明之範疇。
實例1 CD37抗原
CD37，另外稱作白細胞抗原CD37(以及尤其四跨膜蛋白-26)，為由CD37基因編碼之蛋白質。由此基因編碼之蛋白質為跨膜4超家族(亦稱為四跨膜蛋白家族)之成員。此等成員大多數為細胞表面蛋白 質，其特徵為存在四個疏水性域。該等蛋白質調節信號轉導事件，從而在調節細胞發育、活化、生長及運動性中起一定作用。此編碼蛋白質為細胞表面醣蛋白，已知其與整合素及其他跨膜4超家族蛋白質複合。參見Virtaneva KI等人，Immunogenetics 37(6)：461-465(1993年3月)。亦參見Horejsi等人，FEBS Letters，第288卷第1,2期，第1-4頁(1991年8月)。亦參見Link等人，J.Immun.，第137卷第9期，第3013-3018頁(1968年11月)。此外，已注意到替代性剪接產生多種編碼不同同功異型物之轉錄變異體。Tomlinson等人，Mol.Immun.，第33卷，第10期，第867-872頁(1996)。CD37 cDNA之長度為1,263bp且編碼281個胺基酸ORF(參見圖1)。對於CD37抗原之例示性實施例，參見圖1。
實例2 產生CD37單株抗體(MAb)
在一個實施例中，針對CD37之治療性單株抗體(「MAb」)包含與特異於CD37之抗原決定基反應將結合至細胞上所表現之CD37的單株抗體。用於產生該等MAb之免疫原包括如下免疫原，其經設計以編碼或含有胞外域或整個CD37蛋白質序列、預計含有功能性基元之區域及CD37中藉由電腦分析胺基酸序列預計具有抗原性之區域。免疫原包括肽、重組蛋白質及內源性表現CD37或經工程改造以表現CD37之細胞(諸如293T-CD37)。
針對CD37之MAb使用VelocImmune®技術(Regeneron,Tarrytown,NY)產生，其中經基因工程改造之小鼠製備具有全人類可變區及小鼠恆定區之抗體。在用表現CD37之重組293T細胞使velocimmune小鼠免疫後產生稱為HvCD37-6b15.1.1之MAb。CD37 MAb(HvCD37-6b15.1.1)特異性結合於表現CD37之細胞(重組及內源)。
選擇後，藉由將來自velocimmune抗體之人類可變序列與人類恆定區組合將HvCD37-6b15.1.1 MAb(由融合瘤細胞株天然產生)轉化成中國倉鼠卵巢(CHO)表現之全人類抗體。
在用Trizol試劑(Life Technologies,Gibco BRL)自各別融合瘤細胞分離mRNA後，測定CD37 MAb HvCD37-6b15.1.1之DNA編碼序列。
使用以下方案自融合瘤細胞對抗CD37 HvCD37-6b15.1.1重鏈及輕鏈可變核酸序列定序。用Trizol試劑(Life Technologies，Gibco BRL)溶解分泌HvCD37-6b15.1.1之融合瘤細胞。純化總RNA且定量。使用Gibco-BRL Superscript預擴增系統藉由寡聚(dT)12-18引發自總RNA產生第一股cDNA。使用人類免疫球蛋白可變重鏈引子及人類免疫球蛋白可變輕鏈引子擴增第一股cDNA。對PCR產物定序且確定可變重鏈及輕鏈區域。
圖2及圖3中列出可變重鏈及輕鏈區域之核酸及胺基酸序列。HvCD37-6b15.1.1 MAb與人類Ig生殖系之比對闡述於圖4A-圖4B中。
實例3 使用重組DNA方法表現HvCD37-6b15.1.1
為在經轉染之細胞中重組表現HvCD37-6b15.1.1 MAb，分別在人類重鏈IgG2及人類輕鏈Igκ恆定區之上游選殖HvCD37-6b15.1.1 MAb可變重鏈及輕鏈序列。在選殖載體中CMV啟動子/強化子下游選殖完整HvCD37-6b15.1.1 MAb人類重鏈及輕鏈卡匣。在MAb編碼序列下游包括聚腺苷酸化位點。將重組HvCD37-6b15.1.1 MAb表現構築體轉染至CHO細胞中。藉由FACS評估自重組細胞分泌之HvCD37-6b15.1.1 MAb與表現CD37之人類癌症細胞株的結合(參見表VI)。藉由流動式細胞測量術偵測結合。結果表明CHO細胞中表現之重組表現的HvCD37-6b15.1.1結合至細胞表面上之CD37。
結果表明CHO細胞中表現之重組表現的HvCD37-6b15.1.1與自融 合瘤純化之HvCD37-6b15.1.1類似地結合至CD37。亦藉由ELISA評估自重組細胞分泌之HvCD37-6b15.1.1 MAb與CD37重組蛋白質之結合。在來源於CHO與融合瘤細胞之MAb物質之間，HvCD37-6b15.1.1與CD37蛋白質之結合相同。
產生稱為HvCD37-6b15.1.1之抗體的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(經由聯邦快遞公司(Federal Express))在2013年7月8日寄送至美國菌種保藏中心(ATCC)，郵政信箱1549,Manassas,VA 20108且指定寄存編號120464。
藉由實驗分析，使用此項技術中已知之方法(例如蛋白酶消化、LCMS分析等)，來源於CHO細胞之HvCD37-6b15.1.1 MAb的胺基酸修飾展示典型重鏈包括在製備經純化HvCD37-6b15.1.1 MAb時將N端麩醯胺酸修飾為焦麩胺酸酯及缺失重鏈C端離胺酸。
實例4 HvCD37-6b15.1.1 MAb之抗體藥物結合
使用以下方案用本文中所描述之vc(Val-Cit)連接子使HvCD37-6b15.1.1 Mab(圖2)結合至稱為MMAE之奧瑞他汀衍生物(式XI)以產生稱為HvCD37-6b15.1.1vcMMAE之抗體藥物結合物(ADC)。使用表IV中所述之通用方法完成vc(Val-Cit)連接子與MMAE(Seattle Genetics,Seattle,WA)之結合以產生細胞毒性vcMMAE(參見US/2006/0074008)。
接著，使用以下方案產生稱為HvCD37-6b15.1.1vcMMAE之抗體藥物結合物(ADC)。
簡言之，向2.7mg/mL HvCD37-6b15.1.1 MAb於35.5mL磷酸鹽緩衝生理食鹽水(pH 7.4)中之溶液中添加1體積% 5N NaCl、11體積%0.5N硼酸鈉緩衝液(pH 9.0)及1體積% 0.5M EDTA(調節溶液之pH值至8.9)、5mM EDTA及50mM氯化鈉。隨後藉由添加11.5莫耳當量 TCEP(相對於MAb之莫耳數)使MAb部分還原，隨後在37℃下攪拌2.5小時。隨後冷卻經部分還原之MAb溶液至室溫且添加5.2莫耳當量vcMMAE(相對於抗體之莫耳數)之8%(v/v)DMSO溶液形式。在室溫下攪拌混合物六十(60)分鐘，隨後在添加五(5)莫耳當量(相對於mAb)N-乙醯半胱胺酸後再攪拌十(10)分鐘。藉由抗體藥物結合物(ADC)相對於6個透析體積20mM組胺酸(pH 5.2)進行超濾/透濾來移除經淬滅之過量vcMMAE及其他反應組分，隨後添加40%濃蔗糖溶液以調節蔗糖濃度至5%。
所得抗體藥物結合物(ADC)稱為HvCD37-6b15.1.1vcMMAE且具有下式：
其中MAb為HvCD37-6b15.1.1(圖2及圖3)且p為1至10。此實例中闡述之抗體藥物結合物之較佳p值在3.5與3.7之間。
實例5 HvCD37-6b15.1.1 MAb之表徵
使用題為「Generation of CD37 Monoclonal Antibodies(MAbs)」之實例中闡述的程序產生結合CD37之MAb且使用此項技術中已知之分析法之組合篩檢、鑑別及表徵。
A. FACS結合
測試HvCD37-6b15.1.1與活體外生長之不同NHL、CLL及AML細胞株(參見表VI)之結合。使用NHS LC生物素對HvCD37-6b15.1.1及同型匹配之對照抗體進行生物素標記。使用對數生長之活體外癌症細胞株進行所有實驗。簡言之，藉由離心收集細胞且洗滌。稀釋抗體至5 μg/mL最終濃度且與細胞在4℃下共培育1小時。在培育結束時，洗滌細胞且在4℃下與第二偵測抗生蛋白鏈菌素-PE抗體一起以最終1：400(1.25μg/mL))稀釋度培育1小時。洗滌未結合二次抗體後，藉由FACS分析細胞，每個樣品收集總共10,000個事件。使用FlowJo分析資料文件且測定螢光之幾何平均值且報導。螢光比率計算如下：幾何平均值AGS67C/幾何平均值同型對照=MFR，其為同型對照之表現的倍數的量度。
獲得幾何平均值及平均螢光比率(MFR)值(表VI)且展示直方圖(表VII)。結果展示HvCD37-6b15.1.1結合數種表現NHL、CLL及AML之人類癌細胞株。
實例6 HvCD37-6b15.1.1vcMMAE活體內抑制腫瘤生長
CD37在腫瘤細胞中之顯著表現以及其在正常細胞中之限制性表現使得CD37成為抗體療法及類似地經由ADC進行之療法的優良標靶。因此，評估HvCD37-6b15.1.1vcMMAE在人類CLL、AML及NHL癌症異種移植小鼠模型中之治療功效。
在小鼠癌症異種移植模型(例如皮下及正位)中研究抗體藥物結合物對腫瘤生長及轉移形成之功效。
藉由在雄性SCID小鼠右側腹注射以1：1倍稀釋之5×104-5×106個癌細胞與基質膜(Collaborative Research)之混合物來產生皮下(s.c.)腫瘤。為測試ADC對腫瘤形成之功效，亦即在腫瘤細胞注射的同一天開始ADC注射。作為對照，將經純化之人類IgG或PBS；或經純化之識別人類細胞中未表現之無關抗原的MAb注射至小鼠中。在初步研究中，在對照IgG或PBS之間未發現腫瘤生長之差異。藉由測徑規量測來測定腫瘤尺寸且腫瘤體積計算為寬度2×長度/2，其中寬度為最小尺寸且長度為最大尺寸。將皮下腫瘤直徑大於1.5cm之小鼠處死。
異種移植癌症模型之優點為研究新血管生成及血管生成之能力。腫瘤生長部分依賴於新血管發育。儘管毛細管系統及發育血液網路具有宿主起源，但新血管結構之起始及架構由異種移植腫瘤調節(Davidoff等人，Clin Cancer Res.(2001)7：2870；Solesvik等人，Eur J Cancer Clin Oncol.(1984)20：1295)。根據此項技術中已知的程序，諸如藉由腫瘤組織及其周圍微環境之IHC分析，來研究抗體及小分子對新血管生成之作用。
HvCD37-6b15.1.1ADC抑制稱為DoHH2、Ramos-RR-XCL、CLL-JVM3、AML-MV-4-11及人類淋巴瘤Raji癌症異種移植物之癌細胞株的形成。此等結果表明HvCD37-6b15.1.1ADC在治療局部及晚期癌症及較佳表I中所述之癌症中的效用。
CD37 ADC：
如名為「產生CD37單株抗體(MAb)」之實例中所描述產生針對CD37之單株抗體。此外如名為「HvCD37-6b15.1.1 MAb之抗體藥物結合」之實例中所描述使MAb結合至毒素以形成HvCD37-6b15.1.1vcMMAE。藉由FACS及此項技術中已知的其他方法表徵HvCD37-6b15.1.1及HvCD37-6b15.1.1vcMMAE以測定其結合CD37之能力。
細胞株及異種移植物：
如此項技術中已知，將細胞保持於補充有L-麩醯胺酸及10% FBS之DMEM中。藉由在SCID小鼠中連續繁殖來保持DoHH2、Ramos-RR-XCL、CLL-JVM3、AML-MV-4-11及人類淋巴瘤Raji異種移植物。
在CB17/SCID小鼠中植入之皮下建立型人類濾泡B細胞淋巴瘤DoHH2中評估HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE。
在此實驗中，將人類濾泡B細胞淋巴瘤DoHH2細胞(10×106個細胞/小鼠)注射至個別CB17/SCID小鼠之側腹中且使腫瘤在無處理下生長 直至其體積達到約200mm3(QW×2)。此時，使用研究導向軟體(Study Director Software，1.7版；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)基於治療開始時之腫瘤體積將動物分配至各組中以確保各組具有類似的平均腫瘤尺寸及變化。所有經ADC處理之組均藉由靜脈內快速注射在第零(0)天及第七(7)天接受二(2)次給藥。使用測徑規量測每週監測各組中之腫瘤生長情況兩次直至研究終止。當可獲得所有組之資料時，在最後一個時間點，對分級資料使用非參數性變異數分析(ANOVA)，進行腫瘤體積之統計分析。
結果表明與未經處理之對照組相比，HvCD37-6b15.1.1vcMMAE展現有效劑量增加抑制作用(p<0.0001)(圖5)。
在CB17/SCID小鼠中植入之人類淋巴瘤Ramos-RR-XCL皮下建立型異種移植模型中評估HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE。
在另一實驗中，將人類淋巴瘤RamoS-RR-XCL細胞(3×106個細胞/小鼠)注射至個別CB17/SCID小鼠之側腹中且使腫瘤在無處理下生長直至其體積達到約200mm3(QW×2)。此時，使用研究導向軟體(Study Director Software，1.7版；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)基於治療開始時之腫瘤體積將動物分配至各組中以確保各組具有類似的平均腫瘤尺寸及變化。所有經ADC處理之組均藉由靜脈內快速注射在第零(0)天及第六(6)天接受二(2)次給藥。另外，在第0、3、6及9天投與美羅華(Rituxan)四(4)次劑量(Ramos-RR-XCL為美羅華抗性細胞株)。使用測徑規量測每週監測各組中之腫瘤生長情況兩次直至研究終止。當可獲得所有組之資料時，在最後一個時間點，對分級資料使用非參數性變異數分析(ANOVA)，進行腫瘤體積之統計分析。
結果表明與未經處理之對照組或相應ADC對照H3-12bc1.1vcMMAE相比，HvCD37-6b15.1.1vcMMAE展現有效劑量增加 腫瘤抑制作用(兩種情況下，p<0.0001)(圖6)。
HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在CB17/SCID小鼠中植入之皮下建立型人類慢性淋巴細胞性白血病JVM3中的功效研究。
在另一實驗中，將慢性淋巴細胞性白血病JVM3細胞(10×106個細胞/小鼠)注射至個別CB17/SCID小鼠之側腹中且使腫瘤在無處理下生長直至其體積達到約200mm3(QW×3)。此時，使用研究導向軟體(Study Director Software，1.7版；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)基於治療開始時之腫瘤體積將動物分配至各組中以確保各組具有類似的平均腫瘤尺寸及變化。所有經ADC處理之組均藉由靜脈內快速注射在第零(0)天及第七(7)天及第十四(14)天接受三(3)次給藥。使用測徑規量測每週監測各組中之腫瘤生長情況兩次直至研究終止。當可獲得所有組之資料時，在最後一個時間點，對分級資料使用非參數性變異數分析(ANOVA)，進行腫瘤體積之統計分析。
結果表明與媒劑對照(p<0.0001)或相應ADC對照Ha3-12bc1.1vcMMAE(p=0.0001)相比，HvCD37-6b15.1.1vcMMAE展現有效劑量依賴性抑制作用(圖7)。
HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在CB17/SCID小鼠中植入之皮下建立型人類急性骨髓性白血病MV-4-11中的功效研究。
在另一實驗中，將急性骨髓性白血病My-4-11細胞(3×106個細胞/小鼠)注射至個別CB17/SCID小鼠之側腹中且使腫瘤在無處理下生長直至其體積達到約200-250mm3(QW×3)。此時，使用研究導向軟體(Study Director Software，1.7版；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)基於治療開始時之腫瘤體積將動物分配至各組中以確保各組具有類似的平均腫瘤尺寸及變化。所有經ADC處理之組均藉由靜脈內快速注射在第零(0)天及第七(7)天及第十四(14)天接受三(3)次給藥。使用測徑規量測每週監測各組中之腫瘤生長情況兩次直至研究 終止。當可獲得所有組之資料時，在最後一個時間點，對分級資料使用非參數性變異數分析(ANOVA)，進行腫瘤體積之統計分析。
結果表明與媒劑對照(p<0.0001)或相應ADC對照Ha3-12bc1.1vcMMAE(p=0.0001)相比，HvCD37-6b15.1.1vcMMAE展現有效劑量依賴性抑制作用(圖8)。
HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE在SCID小鼠中植入之皮下建立型人類美羅華抗性淋巴瘤細胞株Ramos-RR-XCL中的功效研究。
在另一實驗中，將人類淋巴瘤Ramos-RR-XCL細胞(3×106個細胞/小鼠)注射至個別ICR/SCID小鼠之側腹中且使腫瘤在無處理下生長直至其體積達到約200mm3(QW×2)。此時，使用研究導向軟體(Study Director Software，1.7版；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)基於治療開始時之腫瘤體積將動物分配至各組中以確保各組具有類似的平均腫瘤尺寸及變化。所有經ADC處理之組均藉由靜脈內快速注射在第零(0)天、第四(4)天、第七(7)天及第十一(11)天接受四(4)次給藥。使用測徑規量測每週監測各組中之腫瘤生長情況兩次直至研究終止。當可獲得所有組之資料時，在最後一個時間點，對分級資料使用非參數性變異數分析(ANOVA)，進行腫瘤體積之統計分析。
結果展示與以1mg/kg給與之其他CD37ADC相比，HvCD37-6b15.1.1vcMMAE展現顯著優良抑制作用(圖9)。
HvCD37-6b15.1.1.vcMMAE及HvCD37-6b15.1.1在SCID小鼠中植入之人類急性單核細胞性白血病細胞株MOLM-13之皮下建立型異種移植模型中的功效研究。
在另一實驗中，將人類急性單核細胞性白血病MOLM-13細胞(1.0×106個細胞/小鼠)注射至個別SCID小鼠之側腹中且使腫瘤生長。當平均腫瘤體積達到預定尺寸(例如200mm3)時，使用研究導向軟體 (Study Director Software，2.1版；Studylog Systems,Inc.,South San Francisco,CA)將動物進行尺寸匹配且隨機分成處理及對照組以使各群中具有類似平均腫瘤尺寸及變化。藉由靜脈內快速注射以1.0mg/kg以單次劑量或每週一次總共兩(2)次劑量給與HvCD37-6b15.1.1vcMMAE及HvCD37-6b15.1.1。藉由靜脈內快速注射以1.0mg/kg每週一次給與對照ADC及對照MAb(Ha8-7acd6.1-vcMMAE及Ha8-7acd6.1)總共兩(2)次劑量。使用五(5)%右旋糖作為媒劑對照。所有藥劑均基於每次臨給藥前獲得的各動物的個別體重投與。使用測徑規量測每週監測各組中之腫瘤生長情況兩次(2×)直至研究終止。使用秩和檢驗(Kruskal-Wallis test)在動物處死前最後一天進行腫瘤體積資料之統計分析。使用杜凱氏檢驗(Tukey's test)程序(雙側)進行逐對比較以逐實驗確保錯誤率。該研究評估HvCD37-6b15.1.1vcMMAE在MOLM-13人類急性單核細胞性白血病異種移植模型中的功效且將其與其裸抗體組分HvCD37-6b15.1.1比較。
結果展示，相較於展現顯著優良抑制作用之HvCD37-6b15.1.1vcMMAE抗體藥物結合物，裸MAb HvCD37-6b15.1.1未展示任何功效(圖11)。
結論
概言之，圖5至圖9及圖11展示，當相較於對照ADC時，名為HvCD37-6b15.1.1vcMMAE之CD37 ADC顯著抑制表現CD37之腫瘤細胞的生長。由此，HvCD37-6b15.1.1vcMMAE可用於治療性目的以治療且控制表I中所述之癌症。另外，可展示名為HvCD37-6b15.1.1之ADC相較於針對CD37之其他ADC及針對CD37之其他抗體展示顯著優良作用。因此，HvCD37-6b15.1.1之顯著作用展示其可顯著地作為治療且控制表I中所述之癌症的治療劑。
實例7 經由使用CD37 ADC治療及診斷人類癌瘤之人類臨床試驗
在一些實施例中，使用根據本發明之特異性結合至CD37之CD37ADC且其用於治療某些腫瘤，較佳為表I中列舉之腫瘤。關於此等適應症中之每一者，成功推行兩種臨床方法。
I.)輔助療法：在輔助療法中，用CD37 ADC組合化學治療劑或抗贅生物劑及/或放射療法或其組合來治療患者。根據標準方案，藉由向標準一線及二線療法中添加CD37 ADC來治療諸如表I中所列之原發癌標靶。方案設計提出如以下實例所評定之效力，包括(但不限於)原發性或轉移性病變之腫瘤塊減小、無進展存活時間增加、總體存活率增加、患者健康狀況改善、疾病穩定以及能夠減少標準化學治療劑及其他生物劑之常用劑量。此等劑量減少藉由降低化學治療劑或生物劑之劑量相關毒性，允許進行額外療法及/或長期治療。在若干輔助臨床試驗中使用CD37 ADC與化學治療劑或抗贅生物劑組合。
II.)單一療法：關於在腫瘤單一療法中使用CD37 ADC，在無化學治療劑或抗贅生物劑之情況下向患者投與CD37 ADC。在一個實施例中，臨床上對疾病廣泛轉移的末期癌症患者進行單一療法。方案設計提出如以下實例所評定之效力，包括(但不限於)原發性或轉移性病變之腫瘤塊減小、無進展存活時間增加、總體存活率增加、患者健康狀況改善、疾病穩定以及能夠減少標準化學治療劑及其他生物劑之常用劑量。
劑量
可調節給藥方案以提供最佳所要反應。舉例而言，可投與單次劑量；可隨時間投與若干分次劑量；或可根據治療情況之緊急程度所指示按比例降低或增加劑量。尤其宜將非經腸組合物調配成單位劑型，以易於投藥及使劑量均一。如本文中所用之單位劑型係指適合作為單位劑量用於待治療之哺乳動物個體的物理個別單元；各單元含有 經計算將產生所要治療效果之預定量的活性化合物與所需醫藥載劑締合。在一些實施例中，本發明單位劑型之規格由以下來規定且直接取決於：(a)抗體及/或ADC之獨特特徵及待實現之特定治療或預防效果；及(b)混配此類用於治療個體敏感性之活性化合物之技術中所固有的限制。
根據本發明組合投與之CD37 ADC之治療有效量的一例示性非限制性範圍為約0.5至約10mg/kg、約1至約5mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg或至少4mg/kg。其他例示性非限制性範圍為例如約0.5至約5mg/kg或例如約0.8至約5mg/kg，或例如約1至約7.5mg/kg。本發明之高劑量實施例係指大於10mg/kg之劑量。應注意，劑量值可隨待減輕之病狀的類型及嚴重程度而變化，且可包括單劑量或多劑量。應進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個體需要及投藥或監督組合物投藥之人士的專業判斷而隨時間加以調整，且本文所述之劑量範圍僅為例示性的，而不意欲限制所主張之組合物的範疇或實施。
臨床開發計劃(CDP)
CDP遵循且開發有關輔助療法或單一療法的CD37 ADC治療。試驗初步顯示安全性且此後以重複劑量證實效力。試驗為比較標準化學療法與標準療法加CD37 ADC之開放性標記。應瞭解，關於招募患者可利用之一個非限制性準則為如活組織檢查所測定之其腫瘤中之CD37表現量。
如同基於蛋白質或抗體輸注之任何療法，安全性問題主要與以下有關：(i)細胞激素釋放症候群，亦即低血壓、發燒、發抖、寒戰；(ii)對該物質產生免疫原性反應(亦即，患者對抗體療法產生人類抗體，或HAMA反應)；及(iii)對表現CD37之正常細胞之毒性。利用標準測試及跟訪來監測此等安全性問題中之每一者。發現CD37 ADC對 人類投藥安全。
實例8 藉由IHC偵測癌症患者樣品中之CD37蛋白質
藉由免疫組織化學測試來自非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及多發性骨髓瘤(「MM」)患者之腫瘤樣品中CD37蛋白質之表現。簡言之，將福馬林(formalin)固定之石蠟包埋之組織切割為四(4)微米切片且安裝於玻璃載片上。將該等切片脫蠟、再水合且在EZ-Retriever微波(Biogenex,San Ramon,CA)中用Citra抗原修復溶液(Biogenex,San Ramon,CA)在95℃下處理45分鐘。接著該等切片用3%過氧化氫溶液處理以不活化內源性過氧化酶活性。在與單株小鼠抗-CD37抗體或同型對照物一起培育之前，用不含血清之蛋白阻斷劑(block)(Dako,Carpenteria,CA)抑制非特異性結合。接著，該等切片用Super SensitiveTM聚合物-辣根過氧化酶(HRP)偵測系統處理，其係由在Super EnhancerTM試劑中培育，接著與聚合物-HRP二級抗體結合物(BioGenex,San Ramon,CA)一起培育組成。接著該等切片使用DAB套組(BioGenex,San Ramon,CA)顯影，細胞核用蘇木精染色且藉由明視野顯微術(bright field microscopy)進行分析。使用CD37免疫反應性抗體在患者樣品中偵測到特異性染色，如由棕色染色指示(參見圖10(A)及10(C))。相比之下，對照抗體未將患者樣品染色(參見圖10(B)及10(D))。
結果顯示CD37在NHL及MM之腫瘤細胞中表現。該等結果表明CD37表現於人類NHL及MM中且針對此抗原之抗體(例如HvCD37-6b15.1.1)及稱為HvCD37-6b15.1.1vcMMAE之抗體藥物結合物適用於診斷及治療目的(圖10)。
實例9 HvCD37-6b15.1.1 Mab與源自患者之樣品的結合
在來自患有急性淋巴細胞性白血病之患者的周邊血液的PBMC樣品中，在骨髓(AML)、白血病幹細胞(LSC)、T細胞及B淋巴細胞細胞群體中評定HvCD37-6b15.1.1 MAb之結合。
A. FACS結合材料及方法
在此實驗中，使用NHS LC生物素(Thermo Scientific,Rockford,IL)對HvCD37-6b15.1.1及同型匹配之對照抗體進行生物素標記。在同意及批准後自急性骨髓性白血病患者獲得周邊血液細胞(PBMC)之菲科帕克(Ficoll-Paque)(GE Healthcare,Pittsburg,PA)分離物。將新鮮解凍之PBMC與混合之CD45、CD33、CD 38(BD Biosciences,San Jose,CA)、CD34、CD3(Beckman Coulter,Brea,CA)及HvCD37-6b15.1.1-生物素(抗CD37)或同型生物素mAb一起培育。用抗生蛋白鏈菌素-PE(SAv-PE)(BD Biosciences,San Jose,CA)偵測試劑製備螢光減一(FMO)對照混合物且用於對細胞群體設門。經生物素標記之HvCD37-6b15.1.1及同型mAb之二級偵測係使用SAv-PE或SAv-PC5。使用LSRII流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)進行資料採集。將淋巴細胞關於CD45+(白細胞共同抗原)群體設門，從而定義四(4)種獨特群體：CD33+/3-/20-(骨髓母細胞)、CD33+/3-/34+/38-(LSC)、CD33-/3+(T淋巴細胞)及CD33-/20+(B淋巴細胞)。用FlowJo 9.5.4版軟體(Tri Star,Ashland,OR)進行分析。藉由HvCD37-6b15.1.1 MFI除以匹配之同型MFI計算各AML樣品之MFIR。
B.結果
藉由HvCD37-6b15.1.1 MFI除以匹配之同型對照MFI獲得幾何平均值及平均螢光強度比(MFIR)。表VIII中關於AML患者樣品所述之結果展示HvCD37-6b15.1.1 MAb結合至所有測試樣品之骨髓、LSC、T及B細胞群體。
另外，如表IX中所示，所有測試樣品之MFIR分佈圖展示在LSC 及B細胞群體中具有高變化率，而骨髓母細胞及T細胞之MFIR變化較小。骨髓母細胞之平均MFIR為約八十五(85)，其中所有樣品中均存在結合，而LCS之平均MFIR為一百二十六(126)，其中三個樣品展示高水準之HvCD37-6b15.1.1結合。對於所有群體，B細胞上之HvCD37-6b15.1.1染色為最高，其平均MFIR為1548，而平均T細胞結合(MFIR 246)低於B細胞。(參見表IX)。
另外，如表X中所示，患者淋巴細胞之細胞群體分佈展示大多數為CD33+(骨髓)陽性，此為AML之特徵。亦觀察到少量LSC(VD34+/38-)、T(CD3+)及B細胞(CD20+)。如由HvCD37-6b15.1.1結合所確認，所有四種群體均為CD37陽性。
表VIII、IX及X中所述之全部結果展示HvCD37-6b15.1.1 MAb特異性結合至源自患者之表現AML、LSC及T及B細胞淋巴細胞之組織。
在本申請案中，參考多個網站資料內容、公開案、專利申請案及專利。(藉由網站之統一資源定位器(Uniform Resource Locator)或URL(在全球資訊網上之位址)來參考網站)。此等參考文獻中之每一者之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。
本發明之範疇不侷限於本文中所揭示之實施例，該等實施例意欲單獨說明本發明之個別態樣，且任何功能相等物均在本發明之範疇內。除本文所描述外，根據以上描述及教示，熟習此項技術者將顯而易知對本發明之模型及方法之各種修改，且同樣意欲該等修改在本發明之範疇內。可在不背離本發明之真實範疇及精神的情況下實施該等修改或其他實施例。
表
表V.分別藉由Kabat、Chothia及Contact方案鑑別之CDR-L1、CDR-
注意：*所有MFR比率均使用同型對照作為參考來計算，除Granta-519、KG-1及Hel 92.1以外，在該等細胞株中由於高同型對照背景結合而使用第二偵測作為參考。
‧對於包含小於0.1%總樣品之群體不計算HvCD37-6b15.1.1MFIR值。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
1.食品工業發展研究所；103年11月07日；BCRC 960492
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
1.美國；American Type Culture Collection(ATCC)；2013年07月09日；PTA-120464
<110> 丹尼爾 梭沙 皮瑞拉
<120> 結合至CD37蛋白質之抗體藥物結合物(ADC)
<130> 511582008900
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 61/861,321
<151> 2013-08-01
<160> 12
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
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<223> 重鏈人類IgG2恆定區
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 12

Claims (19)

  1. 一種抗體藥物結合物，其包含結合至單甲基奧瑞他汀E(monomethyl auristatin E；MMAE)之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或片段包含：重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO：7所述之重鏈可變區序列中之CDR的胺基酸序列的互補決定區(CDR)；及輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO：8所述之輕鏈可變區序列中之CDR的胺基酸序列的互補決定區(CDR)。
  2. 如請求項1之抗體藥物結合物，其中該抗體包含由SEQ ID NO：7之第1號Q至第115號S範圍內之胺基酸序列組成的重鏈及由SEQ ID NO：8之第1號D至第106號R範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈。
  3. 如請求項1或2之抗體藥物結合物，其中該抗體包含重鏈，其由SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內之胺基酸序列組成；及輕鏈，其由SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成。
  4. 一種抗體藥物結合物，其包含結合至單甲基奧瑞他汀E(MMAE)之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或片段包含：重鏈可變區，其包含由寄存在美國菌種保藏中心(ATCC)寄存編號PTA-120464下之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體的重鏈可變區之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含由寄存在ATCC寄存編號PTA-120464下之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體的輕鏈可變區之胺基酸序列。
  5. 如請求項4之抗體藥物結合物，其中該抗體包含：重鏈，其由寄存在ATCC寄存編號PTA-120464下之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生之抗體的重鏈之胺基酸序列組成，及輕鏈，其由寄存在ATCC寄存編號PTA-120464下之中國倉鼠卵巢(CHO)產生之抗體的輕鏈 之胺基酸序列組成。
  6. 如請求項1、2、4及5中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體及片段為片段Fab、F(ab')2、Fv或scFv片段。
  7. 如請求項1、2、4及5中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體為完全人類抗體。
  8. 如請求項1、2、4及5中任一項之抗體藥物結合物，其中該抗體或片段以重組方式產生。
  9. 一種包含如請求項1至8之抗體藥物結合物、呈人類單位劑型之醫藥組合物。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中該組合物係用於癌症治療。
  11. 如請求項10之醫藥組合物，其中該癌症為非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma；NHL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)或多發性骨髓瘤(MM)。
  12. 如請求項9之醫藥組合物，其中該組合物與輻射或化學治療劑組合投與。
  13. 如請求項9之醫藥組合物，其呈人類單位劑型，包含如請求項1之抗體藥物結合物及化學治療劑。
  14. 一種如請求項1至8之抗體藥物結合物用於製造供治療癌症用之藥物的用途。
  15. 一種如請求項1至8之抗體藥物結合物與輻射之組合用於製造供治療癌症用之藥物的用途。
  16. 一種如請求項1至8之抗體藥物結合物與化學治療劑之組合用於製造供治療癌症用之藥物的用途。
  17. 一種包含結合至單甲基奧瑞他汀E(MMAE)之抗體或其抗原結合片段之抗體藥物結合物，其中該抗體或片段藉由包含以下之方法產生：培養宿主細胞以使抗體或抗原結合片段表現，其中該 宿主細胞選自由以下(a)至(d)組成之群：(a)用包含以下之表現載體轉形之宿主細胞：包含編碼由SEQ ID NO：7之第1號Q至第115號S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸及包含編碼由SEQ ID NO：8之第1號D至第106號R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；(b)用以下轉形之宿主細胞：表現載體，其含有包含編碼由SEQ ID NO：7之第1號Q至第115號S範圍內之胺基酸序列組成之重鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；及表現載體，其含有包含編碼由SEQ ID NO：8之第1號D至第106號R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸(c)用包含以下之表現載體轉形之宿主細胞：包含編碼由SEQ ID NO：7之第1號Q至第115號S範圍內胺基酸序列組成之重鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸；及(d)用包含以下之表現載體轉形之宿主細胞：包含編碼由SEQ ID NO：8之第1號D至第106號R範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈可變區的鹼基序列的聚核苷酸。
  18. 一種包含結合至單甲基奧瑞他汀E(MMAE)之抗體或其抗原結合片段的抗體藥物結合物，其中該抗體或片段藉由包含以下之方法產生：培養宿主細胞以使抗體或片段表現，其中該宿主細胞選自由以下(a)至(d)組成之群：(a)用包含以下之表現載體轉形之宿主細胞：包含編碼由SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈的鹼基序列的聚核苷酸及包含編碼由SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈的鹼基序列的聚核苷酸； (b)用以下轉形之宿主細胞：表現載體，其含有包含編碼由SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內之胺基酸序列組成之重鏈的鹼基序列的聚核苷酸；及表現載體，其含有包含編碼由SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈的鹼基序列的聚核苷酸(c)用包含以下之表現載體轉形之宿主細胞：包含編碼由SEQ ID NO：7之第1號Q至第441號K範圍內胺基酸序列組成之重鏈的鹼基序列的聚核苷酸；及(d)用包含以下之表現載體轉形之宿主細胞：包含編碼由SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成之輕鏈的鹼基序列的聚核苷酸。
  19. 一種包含結合至單甲基奧瑞他汀E(MMAE)之抗體之抗體藥物結合物，其中該抗體包含由SEQ ID NO：7之第1號Q至第440號G範圍內之胺基酸序列組成的重鏈，其中該第1號Q修飾為焦麩胺酸酯；及由SEQ ID NO：8之第1號D至第212號C範圍內之胺基酸序列組成的輕鏈。
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