TW201517916A - Ｖｅｇｆｒ１抗體之治療用途 - Google Patents

Ｖｅｇｆｒ１抗體之治療用途 Download PDF

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Abstract

本發明係關於使用VEGFR1抗體治療慢性腎病之方法。

Description

VEGFR1抗體之治療用途
本發明係關於醫學領域。更特定言之，本發明係關於可適用於治療具有VEGFR1抗體之患者之慢性腎病(CKD)及/或更特定言之糖尿病腎病(diabetic nephropathy，亦稱為diabetic kidney disease)之方法。
血管內皮生長因子受體-1(VEGFR-1，亦稱為Flt-1，SEQ ID NO：1)為VEGF族蛋白之三種酪胺酸激酶受體(VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3)中之一者。VEGF族由包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PlGF)之一組結構上相關之醣蛋白組成。VEGF蛋白藉由選擇性地結合至三種VEGF受體之細胞外免疫球蛋白樣結構域而起多種生物學及病理學作用。VEGF-A對於VEGFR1及VEGFR2二者均具有高親和力，而VEGF-B及PlGF選擇性地結合至VEGFR1。分別作為配位體及受體之VEGF-A/VEGFR2在血管-血管生成生物路徑之信號傳導中起主要作用。一些研究小組已提出VEGFR1及VEGFR1之可溶形式(亦稱為sFlt-1)起誘餌受體的作用、隔離VEGF-A且阻止其與其更具促血管生成性的搭配物VEGFR2結合。
VEGF信號傳導對血小管生成、血管生成、血管穩態、發炎至關重要，且因此與包括癌症、糖尿病併發症、心血管疾病及慢性發炎在內之若干人類疾病有關。VEGF系統亦在維持腎功能中起關鍵作用。儘管已在一些研究中顯示VEGF-A對腎具有保護作用，但亦顯示腎對VEGF-A之作用極其敏感。已顯示當VEGF-A含量經人體內之VEGF-A單株抗體抑制時(Eremina等人.(2008)NEJM 358：1129)，以及當過表 現VEGF-A之小鼠之腎小球中VEGF-A含量較高時(Veron等人(2010)Kidney Intl 77：989，及Hakroush等人(2009)Am J Pathol 175：1883)出現腎損傷。
自VEGF-A之生物研究已表明用VEGF-A治療對於具有糖尿病、動脈粥樣硬化或敗血症之患者可能為有害的；此等為作為CKD之病因或併發症的所有病症。增加之VEGF-A含量亦與糖尿病腎病相關(Cha等人(2000)Kidney Intl Supp 77：S104及Hovind等人(2000)Kidney Intl Supp 75：S56)。在2型糖尿病小鼠模型中顯示用VEGF-A抗體減少VEGF-A改善腎小球肥大及白蛋白尿，二者均為糖尿病腎病之標誌物(de Vriese等人(2001)J AM Soc Nephol 12：993及Flyvbjerg等人(2002)Diabetes 51：3090)。
sFlt-1為由VEGFR1基因之剪接變體產生之VEGFR1之分泌形式。sFlt-1保存了配位體結合活性，且與可用於經由VEGFR-2信號傳導之VEGF-A之量相關聯。已研究糖尿病腎病中活性sFlt-1之量，但結果不一致。
CKD之特徵為腎功能之漸進性喪失。糖尿病腎病為一種類型之CKD，且為糖尿病之慢性併發症。白蛋白尿增加及腎功能之逐步、漸進性喪失為人類糖尿病腎病中之主要表現。腎功能降低導致血肌酐及血尿素氮(BUN)增加。糖尿病、高血壓及絲球體腎炎為CKD之最常見病因。CKD患者隨時間推移經歷白蛋白尿、蛋白尿、血清肌酐及腎組織病理學病變之增加。對於許多患者，惡化之CKD發展為末期腎病(ERSD)，需要透析或腎移植。已估計約45%之ERSD患者之CKD之病因為2型糖尿病。使用腎小球濾過率(GFR)來對患者之CKD之嚴重程度進行分類，較低GFR對應於較嚴重CKD。預期減小患者GFR降低之速率可延遲或預防ESRD發展。血管收縮素轉化酶抑制劑或血管收縮素II受體拮抗劑係用作當前用以減緩CKD進展為ERSD的護理標準， 但已顯示此等手段不足以阻止最終進展至透析。
WO2006/055809揭示VEGFR1抗體在多個癌症異種移植模型中之活性。亦揭示針對某些非贅生性、血管生成疾病，諸如胰島素依賴型糖尿病及自身免疫性腎炎之活性。然而，迄今為止，未教示或提出用於針對糖尿病腎病或其他形式之漸進性CKD之治療用途的靶向VEGFR1之抗體。
仍需要提供治療CKD之替代方法。特定言之，仍需要提供治療糖尿病腎病之方法。
因此，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向患者投與有效量之VEGFR1抗體。在另一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病係由糖尿病造成。更特定言之，本發明之方法係為處於慢性腎病之第3期或第4期之患者提供。
在一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為糖尿病腎病。在另一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為局灶性節段性腎小球硬化。
在一實施例中，本發明提供一種降低患者之蛋白尿之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。在另一實施例中，本發明提供一種降低患者之蛋白尿之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
在一實施例中，本發明提供一種降低患者之白蛋白尿之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。在另一實施例中，本發明提供一種降低患者之白蛋白尿之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中白蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
在一實施例中，本發明提供一種降低患者由血清肌酐增加反映之腎小球濾過率(GFR)降低的方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種使患者防禦組織病理學病變之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供一種減緩患者之血尿素氮(BUN)之增加速率之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供一種減緩患者進展至ESRD之速率之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種延緩患者進展至ESRD之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中使進展至ESRD延緩至少12個月。在一實施例中，本發明提供一種延緩患者進展至ESRD之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中使進展至ESRD延緩至少24個月。在一實施例中，本發明提供一種減緩患者之血清肌酐加倍之時間之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種延長患者GFR減少30%所需之時間之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供減少游離(未結合)sFLt-1之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者具有慢性腎病。在一實施例中，本發明提供降低sFLt-1信號傳導及/或結合其他蛋白質之能力之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者具有慢性腎病。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病係由糖尿病造成。更特定言之，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病係處於第3期或第4 期。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為糖尿病腎病。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中該慢性腎病為局灶性節段性腎小球硬化。
在一實施例中，本發明提供一種用於減少蛋白尿之VEGFR1抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於減少蛋白尿之VEGFR1抗體，其中蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
在一實施例中，本發明提供一種用於減少白蛋白尿之VEGFR1抗體。在另一實施例中，本發明提供一種用於減少白蛋白尿之VEGFR1抗體，其中白蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
在一實施例中，本發明提供一種用於減少由血清肌酐增加反映之腎小球濾過率(GFR)降低之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種用於防禦腎組織病理學病變之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供一種用於減緩血尿素氮(BUN)之增加速率之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供一種用於減緩進展至ESRD之速率之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種用於延緩進展至ESRD之VEGFR1抗體，其中使進展至ESRD延緩至少12個月。在一實施例中，本發明提供一種用於延緩進展至ESRD之VEGFR1抗體，其中使進展至ESRD延緩至少24個月。在一實施例中，本發明提供一種用於減緩血清肌酐加倍之時間之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種用於延長GFR減少30%所需之時間之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供一種用於減少游離(未結合)sFLt-1之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種用於降低sFLt-1信號傳導及/或結合其他蛋白質之能力之VEGFR1抗體。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於治療慢性腎病之藥劑之用途。在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於治療慢性腎病之藥劑之用途，其中慢性腎病係由糖尿病造成。更特定言之，本發明提供VEGFR1抗體製造用於治療慢性腎病之藥劑之用途，其中慢性腎病係處於第3期或第4期。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於治療慢性腎病之藥劑之用途，其中慢性腎病係由糖尿病腎病造成。在另一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於治療慢性腎病之藥劑之用途，其中慢性腎病係由局灶性節段性腎小球硬化造成。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減少蛋白尿之藥劑之用途。在另一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減少蛋白尿之藥劑之用途，其中蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減少白蛋白尿之藥劑之用途。在另一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減少白蛋白尿之藥劑之用途，其中白蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減小由血清肌酐增加反映之腎小球濾過率(GFR)降低之藥劑之用途。在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於防禦腎組織病理學病變之藥劑之用途。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減緩血尿素氮(BUN)之增加速率之藥劑之用途。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減緩進展至ESRD之速率之藥劑之用途。在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於延緩進展至ESRD之藥劑之用途，其中使進展至ESRD延緩至少12個月。在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於延緩進展至ESRD之藥劑之用途，其中使進展至ESRD延緩至少24個月。在 一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減緩血清肌酐加倍之時間之藥劑之用途。在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於延長GFR減少30%所需之時間之藥劑之用途。
在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於減少游離(未結合)sFLt-1之藥劑之用途。在一實施例中，本發明提供VEGFR1抗體製造用於降低sFLt-1信號傳導及/或結合其他蛋白質之能力之藥劑之用途。
本發明亦提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含以同時或依序形式與護理標準組合投與如本文中所述之VEGFR1抗體。本發明亦提供用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，包含以同時或依序形式與護理標準組合投與。
本發明亦提供一種治療患者之糖尿病腎病之方法，包含以同時或依序形式與護理標準組合投與如本文中所述之VEGFR1抗體。本發明亦提供用於治療糖尿病腎病之VEGFR1抗體，包含以同時或依序形式與護理標準組合投與。護理標準包括(且不限於)血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑或血管緊張素II受體(ARB)拮抗劑。
如本文中所述及所用之VEGFR1抗體可以同時或依序方式與護理標準組合投與。護理標準包括(且不限於)血管收縮素轉化酶(ACE)抑制劑或血管緊張素II受體(ARB)拮抗劑。
在一實施例中，本發明之方法及用途包含VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體具有如在25℃下藉由表面電漿子共振所測定小於80pM之對VEGFR1之KD。如實例2中所述，Kd值係藉由25℃下之結合平衡確立。在一實施例中，本發明之方法及用途包含VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體以小於2.0nM之IC50中和活體外VEGF-A與VEGFR1之結合。在一實施例中，本發明之方法及用途包含VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體以小於2.0nM之IC50中和活體外PlGF與VEGFR1之結合。 如實例4中所述確立中和值(參見表4b)。在一實施例中，本發明之方法及用途包含VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體具有如在25℃下藉由表面電漿子共振所測定小於80pM之對VEGFR1之KD、以小於2.0nM之IC50中和活體外VEGF-A與VEGFR1之結合及/或以小於2.0nM之IC50中和活體外PlGF與VEGFR1之結合。
在一實施例中，本發明提供治療方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者之VEGFR2磷酸化增加。在一實施例中，本發明提供治療方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者之PlGF含量增加。在一實施例中，本發明提供治療方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者之VEGF-A含量增加。在一實施例中，本發明提供治療方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者之sFLt-1含量增加。在一實施例中，本發明提供治療方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中患者之VEGF-B含量增加。在實施例中，本發明提供治療方法，其中PlGF含量、VEGF-A含量、sFLt-1含量及VEGF-B含量係藉由ELISA量測。
在一實施例中，本發明提供一種在VEGFR2磷酸化增加時使用之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種在PLGF含量增加時使用之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種在VEGF-A含量增加時使用之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種在sFLt-1含量增加時使用之VEGFR1抗體。在一實施例中，本發明提供一種在VEGF-B含量增加時使用之VEGFR1抗體。在實施例中，本發明提供一種用於其中藉由ELISA量測PlGF含量、VEGF-A含量、sFLt-1含量及VEGF-B含量之用途之VEGFR1抗體。
本發明提供一種VEGFR1抗體，咸信其引起人類蛋白尿減少並且疾病進展隨之減少。此外，本發明提供一種VEGFR1抗體，咸信其在 治療人類之慢性腎病方面有效。此外，本發明提供一種VEGFR1抗體，咸信其在治療人類之糖尿病腎病方面有效。本發明提供一種VEGFR1抗體，咸信其引起人類白蛋白尿減少並且疾病進展隨之減少。本發明提供一種VEGFR1抗體，咸信其引起人類血清肌酐減少並且疾病進展隨之減少。
在一實施例中，本發明之方法及用途包含較佳VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體為包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體，其中LCVR包含互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中LCDR1為RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：8)之多肽，LCDR2為GASSRAT(SEQ ID NO：9)之多肽，LCDR3為QQYGSSPLT(SEQ ID NO：10)之多肽，HCDR1為GFAFSSYGMH(SEQ ID NO：2)之多肽，HCDR2為VIWYDGSNKYYADSVRG(SEQ ID NO：3)之多肽，且HCDR3為DHYGSGVHHYFYYGLDV(SEQ ID NO：4)之多肽。
在一實施例中，本發明之方法及用途包含較佳VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體為包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體，且其中LCVR為SEQ ID NO：11之多肽，且HCVR為SEQ ID NO：5之多肽。
在一實施例中，本發明之方法及用途包含較佳VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中LC為SEQ ID NO：12之多肽，且HC為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明之方法及用途包含VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中LC為SEQ ID NO：12之多肽，且HC為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明之方法及用途包含較佳VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明之方法及用途包含較佳VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為糖尿病腎病，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為糖尿病腎病，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為局灶性節段性腎小球硬化，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為局灶性節段性腎小球硬化，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩 條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為糖尿病腎病，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為糖尿病腎病，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為局灶性節段性腎小球硬化，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療慢性腎病之VEGFR1抗體，其中慢性腎病為局灶性節段性腎小球硬化，且其中VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
本發明另外提供一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向患者投與有效量之VEGFR1拮抗劑。
較佳地，VEGFR1拮抗劑為VEGFR1抗體。
「抗體」之通用結構在此項技術中為極其熟知的。對於IgG型抗 體，存在4條經由鏈內及鏈間二硫鍵交聯之胺基酸鏈(兩條「重」鏈及兩條「輕」鏈)。對於抗體，一條重鏈與一條輕鏈形成鏈間二硫鍵，且另一條重鏈與另一條輕鏈形成鏈間二硫鍵，且一條重鏈與另一條重鏈形成兩個鏈間二硫鍵。
當於特定生物系統中表現時，抗體具有於Fc區中糖基化之人類Fc序列。抗體亦可於其他位置糖基化。熟習此項技術者將瞭解本發明之抗體可含有該種糖基化。通常，糖基化出現在抗體Fc區中之高度保守N-糖基化位點。N-聚糖通常附接至天冬醯胺。
抗體I包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每條輕鏈由SEQ ID NO：12之多肽組成且每條重鏈由SEQ ID NO：6之多肽組成。抗體II包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每條輕鏈由SEQ ID NO：12之多肽組成且每條重鏈由SEQ ID NO：7之多肽組成。編碼抗體I之每條重鏈之特定DNA分子為SEQ ID NO：13，且編碼抗體I之每條輕鏈之特定DNA分子為SEQ ID NO：15。編碼抗體II之每條重鏈之特定DNA分子為SEQ ID NO：14，且編碼抗體II之每條輕鏈之特定DNA分子為SEQ ID NO：15。
抗體I及抗體II為針對人類VEGFR1之抗體；抗體I具有IgG1 Fc，且抗體II具有IgG4 Fc。抗體III為針對小鼠VEGFR1之大鼠IgG1抗體，且抗體IV為具有大鼠可變區及小鼠IgG1 Fc之針對小鼠VEGFR1之嵌合抗體。
可使用在此項技術中熟知之技術，例如重組技術、噬菌體呈現技術、合成技術或此類技術之組合或此項技術中易於知曉之其他技術製備用於本發明之方法及用途之抗體。製造及純化抗體之方法在此項技術中為熟知的且可發現於例如Harlow及Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York，第5-8章及第15章，ISBN 0-87969-314-2中。
「有效量」意謂將引發研究人員、醫師或其他臨床醫師所搜尋 之組織、系統、動物、哺乳動物或人類之生物或醫學反應或所需治療效果的用於本發明之方法及用途之抗體或包含用於本發明之方法及用途之抗體之醫藥組合物之量。抗體之有效量可根據諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重以及抗體引發個體之所要反應之能力的因素而變化。有效量亦為治療學上有益的作用超過抗體之任何毒性或有害作用的量。有效量可包含每單次(例如團式)、多次或連續投與約0.001至20mg/kg之量。在一些情況下，低於前述範圍之下限之劑量含量可為超足量，而在其他情況下可採用較大劑量。
術語「治療(treatment/treat/treating)」及其類似者意欲包括減緩或逆轉病症之進展。此等術語亦包括緩解、改善、減弱、消除或減輕病症或病況之一或多種症狀，即使病症或病況未實際上消除及即使病症或病況之進展本身未減緩或逆轉。患者係指具有將受益於抑制VEGFR1活性之疾病、病症或病況之哺乳動物、較佳為人類。
CKD之第3期或第4期已定義為患者的估計GFR(eGFR)在15與59ml/min/1.73m2之間。其他情況對CKD患者不使用病期定義，而是如下用患者之eGFR定義患者：正常>80、輕度50-80、中度30-50及重度<30。
可藉由非經腸途徑(例如皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內或經皮)投與本發明之方法及用途之抗體或包含其之醫藥組合物。可向患者以單或多劑量形式單獨或與醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑組合投與用於本發明之方法及用途之抗體。可藉由此項技術中熟知之方法(例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995),A.Gennaro等人，Mack Publishing Co)製備用於本發明之方法及用途之醫藥組合物且包含如本文所揭示之抗體及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
實例1：抗體表現及純化
重鏈及輕鏈之可變區之多肽、抗體I-IV之完整重鏈及輕鏈胺基酸序列及編碼其之核苷酸序列列於下文標題為「胺基酸及核苷酸序列」之部分中。另外，輕鏈及重鏈CDR多肽示於表1中。
用於本發明之方法及用途之VEGFR1抗體包括(但不限於)抗體I及II，其可基本上如下進行製備及純化。可用使用最佳預定HC：LC載體比的分泌抗體之表現系統或編碼HC及LC二者之單一載體系統短暫或穩定地轉染適當宿主細胞，諸如HEK 293 EBNA或CHO。可使用多種常用技術中之任一者純化澄清培養基(抗體已分泌於其中)。舉例而言，培養基可便利地塗覆至已用相容緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.4)平衡之用於Fab片段之MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GE Healthcare)。可洗滌管柱以移除非特異性結合組分。可例如藉由pH梯度(諸如20mM Tris緩衝液pH 7至10mM檸檬酸鈉緩衝液pH 3.0，或磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.4至100mM甘胺酸緩衝液pH 3.0)溶離經結合之抗體。可諸如藉由SDS-PAGE偵測抗體溶離份接著可進行合併。視預期用途而定，視情況進行進一步純化。可使用常用技術濃縮及/或無菌過濾抗體。可藉由常用技術，包括尺寸排阻、疏水相互作用、離子交換、多元或羥基磷灰石層析有效地移除可溶性聚集體及多聚體。產物可立即於-70℃下冷凍或可凍乾。
實例2：VEGFR1抗體之結合動力學、親和力及特異性
可藉由使用表面電漿子共振(SPR)生物感測器，諸如BIAcore® 2000、BIAcore® 3000或BIAcore® T100(GE HealthCare)根據此項技術中已知之方法測定用於本發明之方法及用途之抗體對人類VEGFR1以及人類VEGFR2及人類VEGFR3之結合動力學、親和力及選擇性。結合動力學、親和力及特異性可用於分析中以展示所揭示之針對小鼠VEGFR1之抗體在活體外與所揭示之針對人類VEGFR1之抗體類似地起作用。
抗體與各物種之VEGF受體之結合親和力、特異性、動力學及化學計量可在用HBS-EP操作緩衝液(GE Healthcare編號BR-1006-69)預塗之Biacore器具上使用SPR分析測定且分析溫度可設定於25℃或37℃。可使用標準NHS-EDC胺偶合於兩個或全部四個流動池(Fc)產生含有固定山羊抗-(人類或小鼠)κ(κ鏈特異性)或蛋白A之CM4晶片(於37℃用於T100之S系列)且可用於採用捕捉法。可藉由稀釋至操作緩衝液中來製備濃度範圍在1與10μg/mL之間的抗體樣品或VEGF-Fc受體。可製備不同濃度(濃度範圍200nM至0.078nM，2倍稀釋增量)之VEGFR1-His、抗體II或抗體IV。各分析週期可由以下組成：(1)將抗體樣品捕捉於各別流動池(Fc2、Fc3及Fc4)上之固定蛋白A或抗-(人類或小鼠)κ(κ鏈特異性)上，(2)對所有Fc以50μL/min注射250μL(300秒)之His-標記受體、抗體II-Fab或抗體IV，(3)回至緩衝液流動20分鐘以監測解離期，(4)藉由注射25μL(30秒)甘胺酸(pH 1.5)再生晶片表面，(5)藉由注射25μL(30秒)HBS-EP平衡晶片表面。可使用標準雙參考處理 數據且使用Biacore評估軟體4.1版(對於Biacore 2000)及2.0.3版(對於Biacore T100)擬合於1：1結合模型以測定締合速率(k on ，M-1s-1單位)、解離速率(k off ，s-1單位)及R max (RU單位)。平衡解離常數(K D)可由關係式K D=k off /k on 計算。
在基本上如本實例2中所述進行之實驗中，抗體I、II、III及IV以類似高結合親和力(KD)結合其對應物種之VEGFR1(參見表2)。抗體II及IV均顯示對VEGFR1之良好選擇性，在高達200nM之受體情況下不結合VEGFR2及VEGFR3。抗體II對人類及獼猴VEGFR1受體具有緊密皮莫耳親和力。在37℃下抗體II對人類VEGFR1之K D為740+/-34pM(n=3)且對獼猴VEGFR1之K D為554+/-29pM(n=3)。
(a)自各個別實驗按K D=k off /k on 計算且最終值藉由對若干獨立K D值取平均值獲得。nd=未測定，因為在高達約200nM之受體濃度未觀測到結合
實例3：在表現嵌合人類VEGFR1/EpoR或小鼠VEGFR1/小鼠EpoR受 體之培養細胞中抗體II及抗體IV對VEGFR1之內化
可藉由量測表現嵌合小鼠VEGFR1/小鼠EpoR或人類VEGFR1/小鼠EpoR受體之細胞中VEGFR1之內化來測定VEGFR1抗體內化隨後降解VEGFR1之能力。分析中可使用VEGFR1內化來證明所揭示之針對小鼠VEGFR1之抗體在活體外與所揭示之針對人類VEGFR1之抗體類似地起作用。當表現嵌合VEGFR1/Epo受體時，BaF3細胞在不存在IL-3之情況下存活。抗體介導之內化作用減少細胞表面嵌合VEGFR1/EpoR導致細胞死亡。
可使人類及小鼠VEGFR1細胞外域及跨膜域與Epo受體之細胞內域融合。嵌合受體可選殖至pMSCV puro反轉錄病毒載體(Clontech，目錄號634401)中。可藉由反轉錄病毒感染產生BaF3-小鼠VEGFR1-小鼠EpoR細胞及BaF3-人類VEGFR1-小鼠EpoR細胞。可藉由分別用小鼠VEGFR1/小鼠EpoR或人類VEGFR1/小鼠EpoR轉染Phoenix Eco反轉錄病毒封裝細胞(ATCC)來製備反轉錄病毒。反轉錄病毒粒子可用於轉導BaF3細胞。BaF3-VEGFR1-EpoR細胞可培養於RPMI-1640(Thermo Scientific，編號SH30255.01)、10%(v/v)FBS(Invitrogen，編號10082)、1mM丙酮酸鈉(Thermo Scientific，編號SH30239.01)、100U/500mL青黴素G及100μg/500mL鏈黴素(Thermo Scientific，編號SV30079.01)、2μg/mL嘌呤黴素(Calbiochem編號540411)；5ng/mL鼠IL-3(R & D編號403-ML-CF)中。
為進行內化分析，可用20mL無IL-3之培養基洗滌經轉導之BaF3細胞3次以洗出IL-3。可添加100μl無IL-3之培養基中之細胞至白色/透明96孔組織培養盤(BD編號353377)之各孔中以達成1-2×104個細胞/孔。可用無IL-3之培養基連續稀釋VEGFR1及同型對照抗體以達成待測試之最終濃度的2倍，接著可添加100μl 2×抗體溶液至各孔中。盤可隨後在95%相對濕度及5%(v/v)CO2下於37℃下培育。在培養六天之 後，可藉由CellTiter-Glo發光細胞活力分析(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega編號G757l)測定活細胞之數目。可使盤及CellTiter-Glo基質平衡至室溫30分鐘。可添加100μl CellTiter-Glo至各孔。可將盤在定軌震盪器上震盪2分鐘以混合內容物且繼續在室溫下培育10分鐘以使發光信號穩定。可由Wallac Victor3TM 1420多標記技術儀(Multilable Counter)(PerkinElmer Precisely)記錄發光。可藉由與無抗體處理之BaF3細胞相比較來計算VEGFR1及對照IgG抗體處理組中之細胞變化性之百分比。各劑量之一式三份處理之平均值可用作平均值且用於標準誤差計算。可使用T-測試來比較相同劑量下VEGFR1與對照抗體的數據。小於0.05之P值可視為統計學上顯著的。
在基本上如此實例3中所述進行且培育不同劑量之抗體II之實驗中，抗體抑制BaF3-小鼠VEGFR1-小鼠EpoR細胞增殖，如藉由相比於人類IgG4對照抗體活力顯著降低來展示(表3)。類似地，在不同劑量之抗體IV之情況下培育六天之後，BaF3-小鼠VEGFR1-小鼠EpoR細胞相比於小鼠IgG1對照抗體顯示較多細胞死亡(表3)。此等結果展示細胞表面VEGFR1受體經抗體II及IV二者內化。另外，結果表明抗體II及IV與BaF3細胞上之嵌合VEGFR1之結合並不刺激受體活化及細胞增殖。
數據顯示一式三份處理之平均值及標準誤差且代表兩個實驗。
實例4：藉由固相ELISA及基於細胞之VEGFR1磷酸化分析量測之抗體II對人類VEGF-A及PlGF與人類VEGFR1之結合的中和作用
可藉由固相ELISA及基於細胞之VEGFR1磷酸化分析量測VEGFR1抗體與VEGFR1結合及中和VEGF-A及PlGF與VEGFR1之結合之能力。分析中可使用VEGF-A及PlGF中和作用來證明所揭示之針對小鼠VEGFR1之抗體在活體外與所揭示之針對人類VEGFR1之抗體類似地起作用。
對於固相ELISA，可用1μg/mL含hVEGFR1-Fc(R&D 321-fl 050/cf)之PBS以50微升/孔塗佈96孔盤，接著於4℃下培育隔夜。隨後可自孔移除溶液，接著可在室溫下用100μl 1%酪蛋白將孔阻斷1小時。抗體(包括對照Ron抗體(R&D MAB691))可於微量滴定盤中相對於PBSt(含有Tween 20之PBS)以50μg/mL起始，且以1：3稀釋度稀釋至0.023μg/mL(參見表4a)來滴定。可用PBSt洗滌ELISA盤3次，接著可添加50微升/孔之預滴定抗體。在37℃下培育一小時之後，可添加50μl生物素標記配位體(2nM hPLGF1(Pepro Tech編號AF-100 06)或2nM hVEGFA-165(R&D編號293-VE)至各孔中，且在37℃下繼續培育30分鐘。可用PBSt洗滌盤3次，接著可添加50微升/孔之NA-AP(1：1000稀釋度)，在室溫下培育15分鐘。在再洗滌三次之後，可添加100微升/孔之PMP(以1：35稀釋於水中)。隨後可使盤顯影30分鐘且在OD560下進行讀取。
對於基於細胞之VEGFR1磷酸化分析，可將表現人類VEGFR1之PAE-R1細胞以100,000細胞/孔接種至24孔組織培養盤中，且用5% CO2在37℃下培養隔夜。隨後可將培養基改為500μl饑餓培養基(含有0.1% BSA之DMEM/F12)，且培養隔夜。隨後可添加抗體至培養基中，且培養細胞30分鐘。隨後可添加人類VEGF-A165(R&D目錄號293-VE)或人類PlGF(R&D目錄號264-PG)且再培育細胞10分鐘。可使用 ELISA(R&D Duo Set IC ELISA顯影套組，編號DYC4170-2)測定磷酸化人類VEGFR1。
數據可表示為平均值+/-標準誤差。可用使用JMP8進行ANOVA分析，接著進行鄧尼特比較(Dunnett's comparison)。可使用GraphPad Prism第4版計算IC50。小於0.05之P值可視為統計學上顯著的。
在基本上如上文此實例4中所述進行之實驗中，抗體II中和人類VEGF-A及PlGF與VEGFR1之結合，且亦抑制人類VEGF-A及PlGF刺激之VEGFR1磷酸化。抗體II分別以0.43nM及0.14nM之IC50中和PlGF及VEGF-A與VEGFR1之結合(表4a)。
需要在低抗體濃度下之數據點來精確計算IC50。因此，在以5μg/mL起始且以1：3稀釋度稀釋至0.0023μg/mL之抗體濃度重複實驗。實驗程序可如下所述。
對於固相ELISA，可用1μg/mL含hVEGFR1-Fc(R&D 321-fl 050/cf)之PBS以50微升/孔塗佈96孔盤，接著於4℃下培育隔夜。隨後可自孔移除溶液，接著可在室溫下用100μl 1%酪蛋白將孔阻斷1小時。抗體(包括對照Ron抗體(R&D MAB691))可於微量滴定盤中相對於PBSt(含有Tween 20之PBS)以5μg/mL起始，且以1：3稀釋度稀釋至0.0023μg/mL(參見表4b)來滴定。可用PBSt洗滌ELISA盤3次，接著可添加50微升/孔之預滴定抗體。在37℃下培育一小時之後，可添加50μl生物素標記配位體(4nM hPLGF1(R&D目錄號264-PG-010)或2nM hVEGFA-165(R&D編號293-VE)至各孔中，且在37℃下繼續培育30分鐘。可用PBSt洗滌盤3次，接著可添加50微升/孔之NA-AP(1：1000稀釋度)，在室溫下培育15分鐘。在再洗滌三次之後，可添加100微升/孔之PMP(以1：35稀釋於水中)。隨後可使盤顯影30分鐘且在OD560下進行讀取。
數據可表示為平均值+/-標準誤差。可使用JMP8進行ANOVA分析，接著進行鄧尼特比較。可使用GraphPad Prism第6版計算IC50。小 於0.05之P值可視為統計學上顯著的。
在基本上如上文所述進行之重複實驗中，抗體II中和人類VEGF-A及PlGF與VEGFR1之結合，且亦抑制人類VEGF-A及PlGF刺激之VEGFR1磷酸化。抗體II分別以0.31nM及1.02nM之IC50中和PlGF及VEGF-A與VEGFR1之結合(表4b)。
如表5中所見，抗體II在活體外阻斷VEGF及PlGF刺激之VEGFR1磷酸化。
P<0.001。使用鄧尼特方法與對照組(SFM)進行比較。
實例5：抗體II及IV減弱sFlt1對VEGF-A介導之ERK磷酸化之抑制作用
可在培養之hUVEC及bEnd3細胞中量測VEGFR1抗體減弱sFlt1對VEGF-A介導之ERK磷酸化之抑制的能力。分析中可使用對VEGF-A介導之ERK磷酸化之抑制來證明所揭示之針對小鼠VEGFR1之抗體在活體外與所揭示之針對人類VEGFR1之抗體類似地起作用。
對於在bEnd3細胞中量測，bEnd3細胞可購自ATCC(編號CRL-2299)。可將bEnd3細胞在含有抗/抗(Thermo編號SV30079.01)及10%胎牛血清(Invitrogen編號10082-147)之DMEM/高葡萄糖培養基(HyClone編號SH30243.01)中再懸浮至3×105個細胞/毫升。可添加0.5mL再懸浮bEnd.3細胞(含有大約1.5×105個細胞)至24孔微量滴定盤(Costar編號3524)之各孔中且在37℃、5% CO2下培育24小時。隨後可抽吸培養基，接著可在37℃、5% CO2下於500微升/孔含有抗/抗及0.1%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma編號A7979)之DMEM/高葡萄糖培養基中使細胞饑餓15小時。在添加VEGF-A、sFlt1及/或VEGFR1抗體之前，可將培養基改為具有0.1% BSA之新鮮饑餓培養基。
對於VEGF-A治療，可添加50μL 10×濃度之小鼠VEGF164(最終8ng/mL)(R&D編號493-MV/CF)至各孔中且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。對於VEGF-A加sFlt1處理，可將30μL 20×濃度之小鼠VEGF164(最終8ng/mL)與30μL小鼠sFlt1(最終40ng/mL，R&D編號471-F1)在37℃下預混30分鐘，隨後可添加50μL混合物至各孔中且將細胞在37℃、5% CO2下培育10分鐘。對於VEGF-A加sFlt1及抗體IV，可將20μL 30×濃度之抗體IV(最終500ng/mL)與小鼠sFlt1(最終40ng/mL，R&D 471-F1)在37℃下預混30分鐘。接下來，可添加40μL 30×濃度之小鼠VEGF164(最終8ng/mL)至抗體IV及sFlt1之混合物中。可添加50μL最終混合物至各孔中且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。對於無血清培養基對照組，可添加具有0.1% BSA之50μL饑餓培 養基至各孔中且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。
對於在hUVE細胞中量測，可將hUVE細胞在具有補充劑(Lonza編號CC-4176)之EGM-2培養基(Lonza編號CC-3156)中再懸浮至3×105個細胞/毫升。可添加0.5mL再懸浮hUVE細胞至24孔微量滴定盤(Costar編號3524)之各孔中(1.5×105個細胞/孔)且在37℃、5% CO2下培育24小時。隨後可將培養基改為500微升/孔含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma編號A7979)之EGM-2培養基，在37℃、5% CO2下饑餓15小時。在添加治療化合物之前，可將培養基改為具有0.1% BSA之新鮮饑餓培養基。對於VEGF-A處理，可添加50μL 10×濃度之人類VEGF165(最終1.5ng/mL)(R&D 293-VE)且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。對於VEGF-A加sFlt1，可將30μL 20×濃度之人類VEGF165(最終1.5ng/mL)與人類sFlt1(最終40ng/mL，R&D 321-FL/CF)在37℃下混合30分鐘。隨後可添加50μl混合物至孔中且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。對於VEGF-A加sFlt1及抗體II，可將20μL 30×濃度之抗體II(最終73μg/mL)與人類sFlt1(最終40ng/mL)在37℃下預混30分鐘，隨後可添加40μL 30×濃度之人類VEGF165(最終1.5ng/mL)至VEGF-A及sFlt1之混合物中。可添加50μL最終混合物至孔中且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。對於無血清培養基對照組，可添加具有0.1% BSA之50μL饑餓培養基至各孔中且在37℃、5% CO2下培育細胞10分鐘。
對於細胞溶解物製備，可將10mL Tris溶解緩衝液(MSD)與200μL蛋白酶抑制劑溶液(50×儲備物)、100μL磷酸酶抑制劑I(100×儲備物)、100μL磷酸酶抑制劑II(100×儲備物)、40μL含苯基甲烷磺醯氟(PMSF)之DMSO(250×儲備物)及100μL SDS(10%儲備物)混合。可在使用之前立即添加PMSF及SDS。在移除處理培養基之後，可添加50μL細胞溶解緩衝液至各孔中。可用溶解緩衝液在冰上培育細胞10分 鐘接著在4℃下震盪30分鐘。可使用Pierce BCA蛋白分析套組，目錄號23227測定溶解物之蛋白質濃度。
對於ERK1/2磷酸化分析，可遵循MSD開發之夾心免疫分析之方案測定磷酸化ERK1/2(磷酸基-ERK1/2(Thr202/Tyr204；Thr185/Tyr187)分析全細胞溶解物套組(Whole Cell Lysate Kit)；MSD編號K151DWD-1)。該分析可使用預塗佈有針對磷酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204；Thr185/Tyr187)之捕捉抗體之盤。在添加樣品之後，可添加含有與電化學發光化合物(MSD SULFO-TAG標記)結合之偵測抗體，即抗總ERK1/2之溶液。可使用MSD SECTOR成像儀來量測與樣品中之磷酸化ERK1/2含量相關之發射光之強度。捕捉及偵測抗體二者均與人類及小鼠全細胞溶解物交叉反應。
數據可表示為平均值+/-標準誤差。可使用JMP8進行ANOVA分析，接著進行鄧尼特比較。
在基本上如此實例5中所述進行之實驗中，抗體II及抗體IV分別減弱了培養之hUVEC及bEnd3細胞中之sFlt1活性(表6)。在與小鼠VEGF-A164混合之前用抗體IV預培育sFlt1顯著阻止sFlt1對bEnd3細胞中VEGF-A刺激之ERK1/2磷酸化之抑制作用。研究中抗體IV之最終濃度為500ng/mL。類似於抗體IV，在與人類VEGF-A165混合之前用抗體II預培育sFlt顯著降低hUVE細胞中VEGF-A165刺激之ERK1/2磷酸化。研究中抗體II之最終濃度為73μg/mL。此等結果證明抗體II及IV二者均阻斷VEGF-A之Flt1捕捉，由此可使得VEGF-A對VEGFR2之可接近性增加。
實例6：抗體III及IV在殘腎小鼠模型中減少白蛋白尿且改善腎組織病理學病變
可在殘腎小鼠模型活體內量測VEGFR1抗體改善白蛋白尿及腎組織病理學病變(二者均為CKD之指示)之潛能(Leelahavanichkul等人(2010)Kidney Int.78(11)：1136-1153)。
可藉由以手術方式移除大約8週齡之小鼠腎質量之四分之三來產生殘腎模型。該模型類似發生白蛋白尿、高血壓及包括腎小球膜擴張、腎小球硬化及間質纖維化在內之腎病變之人類慢性腎病(CKD)。可在8-9週齡之129S6/SvEvTac雄性小鼠中進行殘腎手術。可使用減少總腎質量之四分之三之改良一步式程序，其中可使用燒灼法切除一個腎之兩極，接著對第二腎進行腎切除。可在手術後一週移除外科封縫釘。小鼠可個別地圈養於維持在75℉、12小時光/暗循環及濕度50%下之房間中微隔離器籠框、鋪墊鋸屑之富集巢中之高密度支架上。小鼠可自由獲取瓶裝水及Purina 5008膳食。圈養水可為經由逆滲透過濾且經氯化、pH值為6.5-7之自來水。可由基線時尿ACR及手術後2週之體重對殘腎小鼠進行隨機分組。
對於尿液收集及尿白蛋白及肌酐量測，可藉由將單一動物置放於96孔Corning編號3359聚丙烯微量滴定盤上來收集點尿樣。譜萊玻璃(plexiglas)圈養室(housing chamber)可固定於小鼠及盤上方。可使用 微量移液管將尿液轉移至冰上之1.5mL Eppendorf管中，且在10,000rpm下離心5分鐘。可使用內部驗證之分析量測尿白蛋白且可使用酶法量測尿肌酐。
對於腎病變，可根據標準方法在研究結束時收集腎、固定於福馬林(formalin)中且經處理以進行石蠟切片。病理學家可評估腎切片之腎病變。可使用以下量表半定量地對腎小球膜基質、腎小球纖維化及間質纖維化進行評分：無(0)、極少(1)、輕微(2)、中度(3)、顯著(4)及嚴重(5)。可使用H&E及PAS染色切片對腎小球膜基質擴張及基底膜增厚進行評分。可評估腎之梅森氏三色染色法(Masson's trichrome)染色切片以確定纖維化(間質及腎小球)之程度。
對於收縮血壓之量測，可使用尾套法(tail cuff method)(Coda System,Kent Scientific)量測血壓，在該方法中可藉由在實際量測前3-5天將小鼠置放於附接有尾套之小鼠固持器中、每日持續5分鐘來使其適應限制。可升高設備室溫至75℉以在血壓收集過程期間提供額外暖度。可對小鼠進行選擇並隨機分組。可將小鼠置放於固持器/限制器中且安置於Coda升溫墊單元(31-33℃)頂部上。可將尾部置放成穿過尾套且可將各小鼠限制大約30分鐘。尾套可經充氣，足夠緊地壓縮尾部以即刻中斷動脈血流量，接著藉由放氣而逐漸鬆開以觀測動脈脈衝之回復。在動脈脈衝回復時，該套可經完全放氣。對一隻小鼠重複量測所得之平均值可用作該小鼠之收縮血壓水準。
數據可呈現為平均值+/-SE。可使用GraphPad Prism或JMP進行ANOVA或不成對t-檢驗分析。對於分析，可將尿ACR數據轉化為對數值。可使用GraphPad Prism或JMP進行ANOVA分析，接著進行鄧尼特多重比較檢驗。小於0.05之P值可考慮為統計學上顯著的。
在基本上如此實例6中所述進行之實驗中，進行三個研究。對於研究1，包括六組：(1)PBS，每週三次(tiw)，n=12；(2)10mg/kg之小 鼠IgG1，tiw，n=12；(3)10mg/kg之抗體IV，tiw，n=12；(4)3mg/kg之抗體IV，tiw，n=12；(5)3mg/kg之抗體IV，每週一次(qw)，n=12；及(6)1mg/kg之抗體IV，tiw，n=12。以上文所指示之劑量及時間間隔皮下(sc)注射0.2mL測試或對照化合物，持續十六週。在基線時(在處理之前)且又在給藥第3週、第6週、第10週、第12週及第16週收集點尿樣及體重。在給藥第16週收集收縮血壓。在研究八週結束時收集之樣品包括EDTA抗凝全血及腎。EDTA血漿係用於量測BUN、肌酐及其他參數。將冠狀切片殘腎之一半固定於10% nBF(中性緩衝福馬林)中以供組織病理學檢驗之用，另一半殘腎速凍於-80℃下以供未來分析之用。
對於研究2，在此研究中包括五組：(1)假對照組(n=4，不作處理)；(2)PBS對照組(n=10)；(3)10mg/kg之大鼠IgG1(n=10)；(4)10mg/kg之抗體III(n=10)；及(5)3mg/kg之抗體III(n=10)。所有組係以0.2毫升/小鼠之量腹膜內(i.p.)每週三次給藥，持續八週。在隨機分組(基線)時且又在第4週、第6週及第8週收集點尿樣並量測體重。在給藥第4週及第8週收集收縮血壓。使用尾套法測定血壓。端點樣品收集與研究1中所述相同。
對於研究3，包括九組：(1)假手術組，無處理，n=4；(2)PBS對照組，tiw，n=6；(3)30mg/kg之大鼠IgG1，每週兩次(biw)，n=10；(4)30mg/kg之抗體III，biw，n=10；(5)10mg/kg之抗體III，tiw，n=10；(6)10mg/kg之抗體III，qw，n=10；(7)3mg/kg之抗體III，tiw，n=10；(8)3mg/kg之抗體III，qw，n=10；及(9)1mg/kg之抗體III，qw，n=10。以0.2毫升/小鼠之量皮下注射化合物，持續六週。在基線時(在處理之前)及給藥第2週、第4週及第6週收集點尿樣及體重。使用尾套法在給藥第6週收集收縮血壓。端點樣品收集與研究1中所述相同。
研究1、2及3證明相比於對應時間點之對照組，抗體III(3及10mg/kg)及抗體IV(1、3及10mg/kg)在殘腎小鼠中顯著減少白蛋白尿(如由尿白蛋白/肌酐(ACR)量測)(表7-9)。10mg/kg、30mg/kg及3mg/kg(tiw)給藥組之抗體III及抗體IV亦在殘腎小鼠中改善腎組織病理學評分(如由腎小球纖維化、間質纖維化及梅森氏評分量測)(表10-11)。
數據呈現為平均值+/-SE
數據呈現為平均值+/-SE
數據呈現為平均值+/-SE
實例7：抗體III在糖尿病db/db及單側腎切除db/db小鼠中減少白蛋白尿且改善腎組織學病變
可在糖尿病db/db及單側腎切除db/db小鼠中活體內量測VEGFR1抗體改善白蛋白尿及腎組織學病變(二者均為CKD之指示)之潛能。db/db小鼠為發生類似於人類糖尿病腎病之白蛋白尿及腎組織病理學病變之2型糖尿病小鼠模型(Sharma等人.(2003)Am J Physiol Renal Physiol 284：F1138)。單側腎切除db/db小鼠比未經單側腎切除之db/db小鼠發生較多白蛋白尿及嚴重腎結構病變(Ninichuk等人(2007)Eur J Med Res 12：351)。
對於尿液收集及尿白蛋白及肌酐量測，可藉由將單一動物置放於96孔Corning編號3359聚丙烯微量滴定盤上收集點尿樣。譜萊玻璃圈養室可固定於小鼠及盤上方。可使用微量移液管將尿液轉移至冰上之1.5mL Eppendorf管中，且在10,000rpm下離心5分鐘。可使用內部驗證之分析量測尿白蛋白且可使用酶法量測尿肌酐。
對於腎病變，可根據標準方法在研究結束時收集腎、固定於福馬林中且經處理以進行石蠟切片。病理學家可評估腎切片之腎病變。可使用以下量表半定量地對腎小球膜基質、腎小球纖維化及間質纖維化進行評分：無(0)、極少(1)、輕微(2)、中度(3)、顯著(4)及嚴重(5)。可使用H&E及PAS染色切片對腎小球膜基質擴張及基底膜增厚進行評分。可評估腎之梅森氏三色染色法染色切片以確定纖維化(間質及腎小球)之程度。
數據可呈現為平均值+/-SE。可使用GraphPad Prism或JMP進行ANOVA分析，接著進行鄧尼特多重比較檢驗。小於0.05之P值可考慮為統計學上顯著的。
在基本上如此實例7中所述進行之實驗中，進行兩個研究。在研究4中，雄性db/db雄性小鼠(BKS.Cg-+ Lepr db /+ Lepr db /OlaHsd)係購自Harlan實驗室(Indianapolis,IN)，且在7週齡時經隨機分組以分別接受PBS、10mg/kg之對照大鼠IgG1、10mg/kg之抗體III及3mg/kg之抗體III，每週三次，持續六週。小鼠數除PBS組為八隻小鼠外，各組均為十隻。測定處理第4週及第6週收集之點尿樣中之白蛋白/肌酐(ACR)。在六週研究結束時檢驗血參數及腎組織學。
在研究5中，根據IACUC及其制度化指導原則在4週齡之db/db小鼠(BKS.Cg-+ Lepr db/+ Lepr db/OlaHsd)中進行單側腎切除手術。小鼠在大約8-9週齡時進行隨機分組。研究中包括7組：(1)PBS對照組，n=6；(2)30mg/kg之大鼠IgG1，biw，n=10；(3)30mg/kg之抗體III， biw，n=10；(4)10mg/kg之抗體III，tiw，n=10；(5)10mg/kg之抗體III，qw，n=10；(6)3mg/kg之抗體III，qw，n=10；及(7)1mg/kg之抗體III，qw，n=10。以0.2毫升/注射對動物進行皮下給藥，持續6週。如表13及15中所指示，定期檢驗血糖、體重、點尿樣ACR。在六週研究結束時檢驗血肌酐、BUN及腎組織學。
在研究4及5中，對於db/db小鼠中之10mg/kg，tiw及3mg/kg，tiw劑量及單側腎切除db/db小鼠中之所有測試劑量(30mg/kg，tiw；10mg/kg，tiw；10mg/kg，qw；3mg/kg，tiw；3mg/kg，qw及1mg/kg，qw)，相比於對照抗體，抗體III顯著減少尿白蛋白/肌酐(ACR)(表12-13)。抗體III亦改善如由腎小球膜基質評分(Mesangial Matrix Score)量測之腎組織病理學評分，且減少單側腎切除db/db小鼠中之血尿素氮(BUN)(表14及15)。
實例8：抗體IV在糖尿病db/db-eNOS缺陷小鼠中減少白蛋白尿、阻止血清肌酐增加且減小死亡率
可在糖尿病db/db-eNOS缺陷小鼠活體內測量VEGFR1抗體改善白蛋白尿及腎功能(二者為CKD之指標)之潛能。db/db-eNOS基因剔除小鼠為類似於較晚期人類糖尿病腎病之糖尿病腎損傷模型。該等小鼠發生高血糖症、白蛋白尿、小動脈透明變性、GBM增厚、腎小球膜擴張、腎小球膜溶解、局灶性節段性及早期節狀腎小球硬化以及腎小球濾過率(GFR)降低(Zhao等人(2006)J Am Soc Nephrol 17：2664)。在不處理之情況下，小鼠在16-20週齡之後展現高死亡率。
對於尿液收集及尿白蛋白及肌酐測量，可藉由將單一動物置放 於96孔Corning編號3359聚丙烯微量滴定盤上收集點尿樣。譜萊玻璃圈養室可固定於小鼠及盤上方。可使用微量吸管將尿液轉移至冰上之1.5mL Eppendorf管中，且以10,000rpm離心5分鐘。可使用內部驗證分析測量尿白蛋白且可使用酶法測量尿肌酐。
在基本上如本實例8中所述進行之實驗中，在糖尿病db/db-eNOS基因剔除小鼠中進行檢驗抗體IV功效之兩個研究(研究6及研究7)。
對於研究6，將8至22週齡之db/db-eNOS基因剔除小鼠(BKS.Cg-Lepr<db>-Nos3<tm1Unc/Rhrs>)隨機分為兩組：由接受10mg/kg之小鼠IgG1之6隻雄性及5隻雌性小鼠組成之對照組及由接受10mg/kg之抗體IV之6隻雄性及4隻雌性小鼠組成之處理組。以0.2毫升/注射之量每週三次(tiw)皮下(sc)投與抗體12週。在研究結束時測量血清肌酐。
對於研究7，將db/db-eNOS基因剔除小鼠隨機分為三組以分別接受PBS、10mg/kg之對照小鼠IgG1及10mg/kg之抗體IV。PBS組由包括5隻雄性及6隻雌性小鼠之11隻小鼠組成。對照IgG1組由包括6隻雄性及5隻雌性小鼠之11隻小鼠組成。抗體IV組由在開始處理時之7隻雄性及5隻雌性小鼠組成。抗體IV及對照試劑每週三次(tiw)皮下(sc)投與12週。在基線時及第2週、第4週、第6週、第6週、第10週及第12週測量點尿樣ACR含量。在基線時及第6週及第12週檢測血清肌酐。
相比於對應時間點之對照組，抗體IV在db/db-eNOS基因剔除小鼠中顯著減少白蛋白尿(如由尿白蛋白/肌酐(ACR)量測)(表16)。抗體IV亦改善腎功能(如由防止糖尿病db/db-eNOS基因剔除小鼠中之血清肌酐增加所量測)(表16)。在存活至研究結束之小鼠中，對照組(PBS+IgG1，n=13)中之69%血清肌酐增加大於50%，與抗體IV組(n=10；P=0.016，卡方檢驗(chi-square test))中之10%相對。另外，對照組中之30%小鼠之血清肌酐加倍，而抗體IV組中無小鼠如此。抗體IV處理減少db/db-eNOS基因剔除小鼠之死亡率(表17)。
實例9：抗體II及III對猴及小鼠之血液PlGF含量的影響
可在猴及小鼠中量測VEGFR1抗體影響活體內血液PlGF含量之能力。對於猴血漿中之PlGF之量測，可使用PlGF ELISA分析(R&D Systems編號DPG00)。對於小鼠血液中之PlGF之量測，可使用PlGF ELISA分析(R&D Systems，Quantikine小鼠PlGF-2免疫分析；目錄號MP200)。血清及血漿樣品可在分析之前於校準稀釋劑(calibrator diluent)(R&D Systems編號RD5-17)中稀釋2-20倍。標準曲線可在23.4至1500pg/ml範圍內(對於小鼠PlGF)，及15.6至1000pg/ml範圍內(對於猴PlGF)。數據可呈現為平均值+/-SE；且可使用GraphPad Prism 4進行數據分析。
在食蟹獼猴研究中，可使用自2.5-4.5歲齡之四組猴(各組由4隻雄性及4隻雌性猴組成)收集之血漿量測血液PlGF對抗體II之活體內反應。猴可每週一次接受0、3、20或65mg/kg劑量之抗體II，持續13週。可在研究結束時收集血液樣品。
在小鼠研究中，可使用自殘腎小鼠或單側腎切除db/db小鼠收集之血液量測血液PlGF對抗體III之活體內反應。在殘腎小鼠研究中，抗體III可以10mg/kg及3mg/kg給藥，每週三次，持續八週。在單側腎切除db/db研究中，抗體III可以30mg/kg biw、10mg/kg tiw、10mg/kg qw、3mg/kg qw及1mg/kg qw投與，持續6週。可在研究結束時收集血漿樣品。
在基本上如此實例9中所述進行之實驗中，抗體II在3、20及65mg/kg，每週一次，持續13週之劑量下顯著提昇食蟹獼猴之血漿PlGF含量(表18)。抗體III以劑量依賴性方式增加殘腎及單側腎切除小鼠二者之血液PlGF(表19)。
相對於媒劑組，P<0.01
P<0.01
實例10：小鼠及猴腎中之腎VEGFR2磷酸化
可在猴及小鼠之腎中量測VEGFR1抗體影響腎VEGFR2磷酸化之能力。
猴腎可收集自食蟹獼猴研究，其中2.5-4.5歲齡之四組猴(各組由4之雄性及4隻雌性猴組成)可分別用抗體II以0、3、20及65mg/kg每週一次，持續13週之劑量進行處理。劑量0組中之猴可接受媒劑(PBS，pH 7.4)注射。可在研究結束時收集且冷凍腎樣品。
可使用QIAGEN組織研磨機(TissueLyser)製備猴腎勻漿，其中可將大約150μg猴腎組織置放於冰上之2ml QIAGEN管中接著添加500μL樣品緩衝液(Sample Buffer)(MSD磷光體-VEGFR2目錄號K151DJD-1)。可在QIAGEN組織研磨機上用不鏽鋼珠(5mm，QIAGEN編號69989)以6.5速度震盪該管60秒。可將管在冰上培育5分鐘，接著在4℃下旋轉管30分鐘。隨後可在4℃及8,000rpm下將管離心10分鐘。可將清液層移至新Eppendorf管。可使用BCA分析(Pierce BCA蛋白分析套組目錄號23227)測定1：100稀釋勻漿中之蛋白質濃度。樣品可儲存於-80℃下。
可使用磷酸基-VEGFR-2(Tyr1054)分析全細胞溶解物套組(MSD編號K151DJD-1)測定磷酸化VEGFR2含量。可將含有400μg總蛋白之猴腎勻漿裝載至各孔中。
小鼠腎可收集自如實例6中所述之殘腎研究、如實例7中所述之單側腎切除db/db小鼠研究或收集於正常129小鼠。在129小鼠研究中，可將來自Taconic農場之雄性129S6/SvEvTac小鼠在大約10週齡時隨機分組為兩組以接受抗體III或對照大鼠IgG1抗體。抗體III及對照IgG1抗體二者均可以10mg/kg，每週三次，皮下投與，持續16週。可在16週研究結束時收集腎。
可藉由添加大約50μg小鼠腎至300μL樣品緩衝液(MSD小鼠磷酸基-KDR(Tyr1175)中來製備小鼠腎勻漿。可將管置於冰上且在FastPrep上以6.5速度震盪40秒。在冰上培育5分鐘之後，可使用FastPrep破壞組織。管可在4℃下旋轉30分鐘，接著在4℃及8,000rpm下離心10分 鐘。可將清液層移至新鮮Eppendorf管。可使用BCA方法(Pierce BCA蛋白分析套組目錄號23227)測定1：100稀釋勻漿中之蛋白質濃度。樣品可儲存於-80℃下。
可使用小鼠磷酸基-KDR(Tyr1175)分析全細胞溶解物套組(MSD訂單號N45CA-1)測定磷酸化小鼠VEGFR2。可將含有400μg總蛋白之小鼠腎勻漿裝載至各孔中。可使用SECTOR成像儀讀取OD。
在基本上如此實例10中所述進行之實驗中，抗體II在接受20mg/kg、qw劑量持續13週之食蟹獼猴中增加腎VEGFR2磷酸化(表20)。類似地，抗體III在接受六週之抗體III處理之殘腎小鼠(表21)中、在接受六週之抗體III處理之單側腎切除db/db小鼠(表22)中以及在接受16週之抗體III處理之129小鼠(表23)中增加腎VEGFR2磷酸化。
P<0.05
藉由ANOVA及鄧尼特比較，相對於rIgG1對照組，P<0.003
藉由ANOVA及鄧尼特比較，相對於對照IgG1組，P<0.0005
表23：抗體III增加129S6/SvEvTac小鼠腎中之腎VEGFR2磷酸化
相對於對照IgG1組，P<0.001。
胺基酸及核苷酸序列
SEQ ID NO：1 (hVEGFR1)
SEQ ID NO：2 (HCDR1-抗體1及2)GFAFSSYGMH
SEQ ID NO：3 (HCDR2-抗體1及2) VIWYDGSNKYYADSVRG
SEQ ID NO：4 (HCDR3-抗體1及2)DHYGSGVHHYFYYGLDV
SEQ ID NO：5 (HCVR-抗體1及2)
SEQ ID NO：6 (HC-抗體1)
SEQ ID NO：7 (HC-抗體2)
SEQ ID NO：8 (LCDR1-抗體1及2)RASQSVSSSYLA
SEQ ID NO：9 (LCDR2-抗體1及2)GASSRAT
SEQ ID NO：10 (LCDR3-抗體1及2) QQYGSSPLT
SEQ ID NO：11 (LCVR-抗體1及2)
SEQ ID NO：12 (LC-抗體1及2)
SEQ ID NO：13 (HC DNA-抗體1)
SEQ ID NO：14 (HC DNA-抗體2)
SEQ ID NO：15 (LC DNA-抗體1及2)
SEQ ID NO：16 (HC-抗體3)
SEQ ID NO：17 (LC-抗體3)
SEQ ID NO：18 (HC-抗體4)
SEQ ID NO：19 (LC-抗體4)
<110> 美國禮來大藥廠
<120> VEGFR1抗體之治療用途
<130> X19929
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1338
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 2
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4
<210> 5
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 5
<210> 6
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 6
<210> 7
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 7
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 8
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 10
<210> 11
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 11
<210> 12
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
<210> 13
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 13
<210> 14
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 14
<210> 15
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 15
<210> 16
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 16
<210> 17
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 17
<210> 18
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 18
<210> 19
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 19

Claims (38)

  1. 一種治療患者之慢性腎病之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
  2. 如請求項1之方法，其中該慢性腎病係由糖尿病造成。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該患者係處於慢性腎病之第3期或第4期。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該慢性腎病為糖尿病腎病或局灶性節段性腎小球硬化。
  5. 一種減少患者之蛋白尿之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
  6. 如請求項5之方法，其中該蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
  7. 一種減少患者之白蛋白尿之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
  8. 如請求項7之方法，其中該白蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
  9. 一種降低患者由血清肌酐增加所反映之腎小球濾過率損失的方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
  10. 一種保護患者免於腎組織病理學病變之方法，包含向有需要之患者投與有效量之VEGFR1抗體。
  11. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體具有對VEGFR1之KD小於80pM，如表面電漿子共振所測定。
  12. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體以小於2.0nM之IC50中和活體外VEGF-A與VEGFR1之結合。
  13. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體以小於2.0nM之IC50中和活體外PlGF與VEGFR1之結合。
  14. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體為 包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體，其中該LCVR包含互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中該LCDR1為RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：8)之多肽，該LCDR2為GASSR AT(SEQ ID NO：9)之多肽，該LCDR3為QQYGSSPLT(SEQ ID NO：10)之多肽，該HCDR1為GFAFSSYGMH(SEQ ID NO：2)之多肽，該HCDR2為VIWYDGSNKYYADSVRG(SEQ ID NO：3)之多肽，且該HCDR3為DHYGSGVHHYFYYGLDV(SEQ ID NO：4)之多肽。
  15. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體包含LCVR，其為SEQ ID NO：11之多肽；及HCVR，其為SEQ ID NO：5之多肽。
  16. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC為SEQ ID NO：12之多肽，且該HC為SEQ ID NO：6之多肽。
  17. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC為SEQ ID NO：12之多肽，且該HC為SEQ ID NO：7之多肽。
  18. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。
  19. 如請求項1、2及5至10中任一項之方法，其中該VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
  20. 一種VEGFR1抗體，其用於治療慢性腎病。
  21. 如請求項20之VEGFR1抗體，其中該慢性腎病係由糖尿病造成。
  22. 如請求項20或21之VEGFR1抗體，其中該慢性腎病係處於第3期或第4期。
  23. 如請求項20或21之VEGFR1抗體，其中該慢性腎病為糖尿病腎病或局灶性節段性腎小球硬化。
  24. 一種VEGFR1抗體，其用於減少蛋白尿。
  25. 如請求項24之VEGFR1抗體，其中該蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
  26. 一種VEGFR1抗體，其用於減少白蛋白尿。
  27. 如請求項26之VEGFR1抗體，其中該白蛋白尿係由糖尿病腎病造成。
  28. 一種VEGFR1抗體，其用於減少由血清肌酐增加所反映之腎小球濾過率損失。
  29. 一種VEGFR1抗體，其用於保護免於腎組織病理學病變。
  30. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體具有對VEGFR1之KD小於80pM，如表面電漿子共振所測定。
  31. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體以小於2.0nM之IC50中和活體外VEGF-A與VEGFR1之結合。
  32. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體以小於2.0nM之IC50中和活體外PlGF與VEGFR1之結合。
  33. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體為包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體，其中該LCVR包含互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中 該LCVR包含互補決定區(CDR)LCDR1、LCDR2及LCDR3，且該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中該LCDR1為RASQSVSSSYLA(SEQ ID NO：8)之多肽，該LCDR2為GASSR AT(SEQ ID NO：9)之多肽，該LCDR3為QQYGSSPLT(SEQ ID NO：10)之多肽，該HCDR1為GFAFSSYGMH(SEQ ID NO：2)之多肽，該HCDR2為VIWYDGSNKYYADSVRG(SEQ ID NO：3)之多肽，且該HCDR3為DHYGSGVHHYFYYGLDV(SEQ ID NO：4)之多肽。
  34. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體為包含LCVR為SEQ ID NO：11之多肽及HCVR為SEQ ID NO：5之多肽之抗體。
  35. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體為包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)之抗體，其中該LC為SEQ ID NO：12之多肽，且該HC為SEQ ID NO：6之多肽。
  36. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體為包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)之抗體，其中該LC為SEQ ID NO：12之多肽，且該HC為SEQ ID NO：7之多肽。
  37. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：6之多肽。
  38. 如請求項20、21及24至29中任一項之VEGFR1抗體，其中該VEGFR1抗體包含兩條輕鏈及兩條重鏈，其中各輕鏈為SEQ ID NO：12之多肽，且各重鏈為SEQ ID NO：7之多肽。
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