KR20150119161A - Vegfr1 항체에 대한 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만성 신장 질환 치료를 위해 VEGFR1 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

VEGFR1 항체에 대한 치료 용도 {THERAPEUTIC USES FOR VEGFR1 ANTIBODIES}

본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 VEGFR1 항체를이용하여 만성 신장 질환 (CKD), 및/또는 더욱 특히 당뇨병성 신병증 (이는 또한 당뇨병성 신장 질환으로도 알려져 있다)을 치료하는데 유용할 수 있는 방법에 관한 것이다.

혈관 내피 성장 인자 수용체-1 (VEGFR-1, 이는 또한 Fit-1로도 알려져 있음, 서열 1)은 VEGF 패밀리 단백질에 대한 3가지 티로신 키나제 수용체 (VEGFR1, VEGFR2, 및 VEGFR3) 중 하나이다. VEGF 패밀리는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 태반 성장 인자 (PlGF)를 비롯한, 구조적으로 관련된 당단백질 군으로 이루어진다. VEGF 단백질은 3가지 VEGF 수용체의 세포외 이뮤노글로불린-유사 도메인에 선택적으로 결합함으로써 다중의 생물학적 및 병리학적 역할을 한다. VEGF-A는 VEGFR1 및 VEGFR2, 둘 모두에 대하여 높은 친화도를 갖는 반면, VEGF-B 및 PlGF는 VEGFR1에 선택적으로 결합한다. VEGF-A/VEGFR2는 각각 리간드 및 수용체로서 혈관-혈관신생 생물학적 경로의 신호 전달에서 중요한 역할을 한다. VEGFR1 및 가용성 형태의 VEGFR1 (이는 또한 sFlt-1로도 알려져 있다)은 VEGF-A를 격리시키고, 그가 그의 더 많은 전혈관신생 파트너인 VEGFR2에 결합하지 못하도록 막으면서, 데코이 수용체로서의 역할을 한다고 일부 그룹에 의해 제안되었다.

VEGF 신호 전달은 혈관형성, 혈관신생, 혈관 항상성, 염증에 필수적이며, 따라서, 암, 당뇨병성 합병증, 심혈관 질환, 및 만성 염증을 비롯한, 수개의 인간 질환과 연관되어 있다. VEGF 시스템은 또한 신장 기능을 유지하는 데에도 중요한 역할을 한다. 일부 연구에서 VEGF-A는 신장에 대해 보호 효과를 미치는 것으로 밝혀졌지만, 신장은 또한 VEGF-A의 효과에 대하여 극도로 감수성인 것으로도 밝혀졌다. 신장 손상은, 인간에서 VEGF-A 수준이 VEGF-A 모노클로날 항체로 억제되었을 때 (Eremina et al. (2008) NEJM 358:1129), 및 또한 신장 사구체에서 VEGF-A를 과다발현하는 마우스에서 VEGF-A 수준이 상승되었을 때에도 ([Veron et al. (2010) Kidney Intl 77:989], 및 [Hakroush et al. (2009) Am J Pathol 175:1883]) 발생하는 것으로 밝혀졌다.

VEGF-A를 이용한 치료는 당뇨병, 아테롬성동맥경화증, 또는 패혈증 (이들은 모든 CKD의 원인이거나, 또는 그의 합병증인 상태임) 환자에게 유해할 수 있다는 것이 VEGF-A에 대한 생물학적 연구로부터 제안되었다. VEGF-A 수준 증가 또한 당뇨병성 신병증과 관련이 있었다 ([Cha et al. (2000) Kidney Intl Supp 77:S104] 및 [Hovind et al. (2000) Kidney Intl Supp 75:S56]). 2형 당뇨병 마우스 모델에서 VEGF-A 항체를 이용하여 VEGF-A를 감소시킨 결과, 둘 모두가 당뇨병성 신병증의 마커인, 사구체 비대증 및 알부민뇨가 개선된 것으로 나타났다 ([de Vriese et al. (2001) J AM Soc Nephol 12:993] 및 [Flyvbjerg et al. (2002) Diabetes 51:3090]).

sFlt-1은 VEGFR1 유전자의 스플라이싱 변이체로부터 발생한 분비된 형태의 VEGFR1이다. sFlt-1은 리간드 결합 활성을 보존하고, VEGFR-2를 통한 신호 전달에 이용가능한 양의 VEGF-A에 연계되어 있다. 당뇨병성 신병증에서의 활성 sFlt-1의 양이 연구된 바 있지만, 그 결과는 일관성이 없었다.

CKD는 신장 기능의 점진적인 손실을 특징으로 한다. 당뇨병성 신병증 (이는 또한 당뇨병성 신장 질환으로도 알려져 있다)은 CKD의 한 유형이며, 이는 진성 당뇨병의 만성 합병증이다. 알부민뇨의 증가, 및 신장 기능의 단계적이고, 점진적인 손실이 인간 당뇨병성 신병증에서 1차 소견이다. 신장 기능이 감소하면, 혈중 크레아티닌 및 혈중 요소 질소 (BUN)가 증가된다. 진성 당뇨병, 고혈압, 및 사구체신염은 CKD의 가장 일반적인 원인이다. CKD 환자는 시간이 경과함에 따라 알부민뇨, 단백뇨, 혈청 크레아티닌, 및 신장 조직병리학적 병변의 증가를 경험하게 된다. 많은 환자의 경우, CKD 악화는 말기 신장 질환 (ERSD)으로 진화하게 되고, 투석 또는 신장 이식을 필요로 한다. ERSD 환자 중 약 45%는 그의 CKD의 원인으로서 2형 진성 당뇨병을 앓는 것으로 추정되었다. 사구체 여과율 (GFR)은 환자의 CKD 중증도를 분류하는데 사용되며, GFR이 낮을수록, CKD의 중증도는 더욱 커지는 것에 상응한다. 환자에서 GFR 하락율을 감소시키면, ESRD의 발생은 지연되거나, 또는 예방될 것으로 기대된다. 안지오텐신 전환 효소 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 길항제가 CKD의 ERSD로의 진행을 저속화시키는 현 표준 치료법으로서 사용되지만, 이는 최종적으로 투석으로 진행되는 것을 중단시키는 데에는 부적절한 것으로 밝혀졌다.

WO2006/055809에는 다발성 암 이종이식편 모델에서의 VEGFR1 항체의 활성이 개시되어 있다. 특정 비-신생물성, 혈관신생 질환, 예컨대, 인슐린-의존성 진성 당뇨병 및 자가면역 신장염에 대한 활성이 개시되었다. 그러나, 현재까지 당뇨병성 신병증 또는 다른 형태의 진행성 CKD에 대한 치료 용도로 VEGFR1을 표적화하는 항체가 교시되거나, 또는 제안된 적은 없다.

CKD를 치료하기 위한 대안 방법을 제공하는 것이 여전히 요구되고 있다. 특히, 당뇨병성 신병증을 치료하기 위한 대안 방법을 제공하는 것이 여전히 요구되고 있다.

따라서, 본 발명은 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환은 진성 당뇨병에 의해 유발되는 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 더욱 특히, 본 발명의 방법은 3기 또는 4기의 만성 신장 질환의 환자에게 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환은 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환은 초점성 분절성 사구체경화증에 의해 유발되는 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환은 신증후군에 의해 유발되는 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 단백뇨는 만성 신장 질환에 의해 유발되는 것인, 환자에서 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 단백뇨는 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 환자에서 단백뇨를 감소시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 알부민뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 알부민뇨는 만성 신장 질환에 의해 유발되는 것인, 환자에서 알부민뇨를 감소시키는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 알부민뇨는 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 환자에서 알부민뇨를 감소시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 사구체 여과율 (GFR) 손실 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈청 크레아티닌 증가에 의해 반영되는 사구체 여과율 (GFR) 손실을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신장 조직병리학적 병변에 대한 보호를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 신장 조직병리학적 병변에 대해 보호하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혈중 요소 질소 (BUN) 증가 속도 저속화를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈중 요소 질소 (BUN) 증가 속도를 저속화시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행 속도 저속화를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 ESRD로의 진행 속도를 저속화시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행 지연을 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 ESRD로의 진행이 12개월 이상 지연되는 것인, 환자에서 ESRD로의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행 지연을 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 ESRD로의 진행이 24개월 이상 지연되는 것인, 환자에서 ESRD로의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 혈청 크레아티닌의 배가 시간 저속화를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈청 크레아티닌의 배가 시간을 저속화시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 GFR을 30% 감소시키는데 소요되는 시간을 연장시키는 것을 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 GFR을 30% 감소시키는데 소요되는 시간을 연장시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 유리 (비결합) sFLt-1 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 만성 신장 질환을 앓는 환자인 것인, 유리 (비결합) sFLt-1을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신호 전달하고/거나, 다른 단백질에 결합할 수 있는 sFLt-1의 능력을 감소시키는 것을 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 만성 신장 질환을 앓는 환자인 것인, 신호 전달하고/거나, 다른 단백질에 결합할 수 있는 sFLt-1의 능력을 감소시키는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환은 진성 당뇨병에 의해 유발되는 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 더욱 특히, 본 발명은 만성 신장 질환이 3기 또는 4기인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 초점성 분절성 사구체경화증인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 신증후군인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨가 만성 신장 질환에 의해 유발되는 것인, 단백뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 단백뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 알부민뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 알부민뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혈청 크레아티닌 증가에 의해 반영되는 사구체 여과율 (GFR) 손실을 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신장 조직병리학적 병변에 대해 보호하는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혈중 요소 질소 (BUN) 증가 속도를 저속화시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행 속도를 저속화시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행이 12개월 이상 지연되는 것인, ESRD로의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행이 24월 이상 지연되는 것인, ESRD로의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 혈청 크레아티닌의 배가 시간을 저속화시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 GFR을 30% 감소시키는데 소요되는 시간을 연장시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 유리 (비결합) sFLt-1을 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신호 전달하고/거나, 다른 단백질에 결합할 수 있는 sFLt-1의 능력을 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환 치료용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환은 진성 당뇨병에 의해 유발되는 것인, 만성 신장 질환 치료용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 더욱 특히, 본 발명은 만성 신장 질환이 3기 또는 4기인 것인, 만성 신장 질환 치료용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증인 것인, 만성 신장 질환 치료용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 초점성 분절성 사구체경화증인 것인, 만성 신장 질환 치료용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 신증후군인 것인, 만성 신장 질환 치료용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨 감소용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨가 만성 신장 질환에 의해 유발되는 것인, 단백뇨 감소용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 단백뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 단백뇨 감소용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨 감소용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨가 만성 신장 질환에 의해 유발되는 것인, 알부민뇨 감소용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 알부민뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인, 알부민뇨 감소용 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혈청 크레아티닌 증가에 의해 반영되는 사구체 여과율 (GFR) 손실을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신장 조직병리학적 병변에 대해 보호하기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혈중 요소 질소 (BUN) 증가 속도를 저속화시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행 속도를 저속화시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행이 12개월 이상 지연되는 것인, ESRD로의 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 ESRD로의 진행이 24개월 이상 지연되는 것인, ESRD로의 진행을 지연시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 혈청 크레아티닌의 배가 시간을 저속화시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 GFR을 30% 감소시키는데 소요되는 시간을 연장시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 유리 (비결합) sFLt-1을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 신호 전달하고/거나, 다른 단백질에 결합할 수 있는 sFLt-1의 능력을 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한 VEGFR1 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 VEGFR1 항체를 표준 치료법과 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 표준 치료법과 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 VEGFR1 항체를 표준 치료법과 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 당뇨병성 신병증을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 표준 치료법과 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신병증의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 표준 치료법은 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 (ARB) 길항제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 기술되고, 사용되는 VEGFR1 항체는 표준 치료법과 함께 병용하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 표준 치료법은 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제 또는 안지오텐신 II 수용체 (ARB) 길항제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 25℃에서의 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에, VEGFR1에 대한 K_D가 80 pM 미만인 것인, VEGFR1 항체를 포함한다. Kd 값은 실시예 2에 기술된 바와 같이 25℃에서의 결합 평형에 의해 확립된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 VEGF-A의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 VEGFR1 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 VEGFR1 항체를 포함한다. 중화 값은 실시예 4에 기술된 바와 같이 확립된다 (표 4b 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는, 25℃에서의 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에, VEGFR1에 대한 K_D가 80 pM 미만이고/거나, 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 VEGF-A의 VEGFR1에의 결합을 중화시키고/거나, 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 VEGFR1 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 VEGFR2 인산화 증가를 갖는 것인, 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 PlGF 수준 증가를 갖는 것인, 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 VEGF-A 수준 증가를 갖는 것인, 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 sFLt-1 수준 증가를 갖는 것인, 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 환자는 VEGF-B 수준 증가를 갖는 것인, 치료 방법을 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 PlGF 수준, VEGF-A 수준, sFLt- 1 수준, 및 VEGF-B 수준이 ELISA에 의해 측정되는 것인, 치료 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 VEGFR2 인산화가 증가되었을 때 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 PLGF 수준이 증가되었을 때 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 VEGF-A 수준이 증가되었을 때 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 sFLt-1 수준이 증가되었을 때 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 VEGF-B 수준이 증가되었을 때 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 PlGF 수준, VEGF-A 수준, sFLt-1 수준, 및 VEGF-B 수준이 ELISA에 의해 측정되는 것인, 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

본 발명은 인간에서 질환 진행을 감소시킴과 동시에 단백뇨를 감소시키는 것으로 간주되는 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가로, 본 발명은 인간에서 만성 신장 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 간주되는 VEGFR1 항체를 제공한다. 추가로, 본 발명은 인간에서 당뇨병성 신병증을 치료하는데 효과적인 것으로 간주되는 VEGFR1 항체를 제공한다. 본 발명은 인간에서 질환 진행을 감소시킴과 동시에 알부민뇨를 감소시키는 것으로 간주되는 VEGFR1 항체를 제공한다. 본 발명은 인간에서 질환 진행을 감소시킴과 동시에 혈청 크레아티닌을 감소시키는 것으로 간주되는 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 VEGFR1 항체가 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 바람직한 VEGFR1 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 VEGFR1 항체가 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 서열 11의 폴리펩티드이고, HCVR은 서열 5의 폴리펩티드인 것인, 바람직한 VEGFR1 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 VEGFR1 항체가 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, LC가 서열 12의 폴리펩티드이고, HC가 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 바람직한 VEGFR1 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 VEGFR1 항체가 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, LC가 서열 12의 폴리펩티드이고, HC가 서열 7의 폴리펩티드인 것인, VEGFR1 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 VEGFR1 항체가 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 바람직한 VEGFR1 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 용도는 VEGFR1 항체가 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 바람직한 VEGFR1 항체를 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환이 초점성 분절성 사구체경화증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 만성 신장 질환이 초점성 분절성 사구체경화증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 초점성 분절성 사구체경화증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 만성 신장 질환이 초점성 분절성 사구체경화증이고, 여기서 VEGFR1 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체를 제공한다.

본 발명은 추가로 환자에게 유효량의 VEGFR1 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

바람직하게, VEGFR1 길항제는 VEGFR1 항체이다.

"항체"의 일반 구조는 관련 기술분야에 잘 널리 공지되어 있다. IgG 유형의 항체의 경우, 쇄내 및 쇄간 이황화 결합을 통해 가교된 4개의 아미노산 쇄 (2개의 "중쇄" 및 2개의 "경쇄")가 존재한다. 항체의 경우, 중쇄 중 하나는 경쇄 중 하나와 쇄간 이황화 결합을 형성하고, 나머지 다른 한 중쇄는 나머지 다른 한 경쇄와 쇄간 이황화 결합을 형성하고, 중쇄 중 하나는 나머지 다른 한 중쇄와 2개의 쇄간 이황화 결합을 형성한다.

특정 생물학적 시스템에서 발현될 때, 인간 Fc 서열을 갖는 항체는 Fc 영역에서 당화된다. 항체는 또한 다른 위치에서도 당화될 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명의 항체는 상기 당화를 함유할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 전형적으로, 당화는 항체의 Fc 영역 중 고도로 보존되는 N-당화 부위에서 발생한다. N-글리칸은 전형적으로 아스파라긴에 부착된다.

항체 I는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드로 이루어지고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드로 이루어진다. 항체 II는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드로 이루어지고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드로 이루어진다. 항체 I의 각 중쇄를 코딩하는 특정 DNA 분자는 서열 13이고, 항체 I의 각 경쇄를 코딩하는 특정 DNA 분자는 서열 15이다. 항체 II의 각 중쇄를 코딩하는 특정 DNA 분자는 서열 14이고, 항체 II의 각 경쇄를 코딩하는 특정 DNA 분자는 서열 15이다.

항체 I 및 항체 II는 인간 VEGFR1에 대한 항체이고; 항체 I는 IgG1 Fc를 가지고, 항체 II는 IgG4 Fc를 가진다. 항체 III은 마우스 VEGFR1에 대한 래트 IgG1 항체이고, 항체 IV는 래트 가변 영역 및 마우스 IgG1 Fc를 가지는, 마우스 VEGFR1에 대한 키메라 항체이다.

본 발명의 방법 및 용도를 위한 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 기법, 예컨대, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 합성 기술, 또는 상기 기술과, 관련 기술분야에서 쉽게 알 수 있는 다른 기술의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 항체를 제조하고 정제하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2]에서 살펴볼 수 있다.

"유효량"이란, 연구원, 의사, 또는 다른 임상의가 추구하는, 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간에 미치는 생물학적 또는 의학적 반응 또는 원하는 치료학적 효과를 유도하는, 본 발명의 방법 및 용도를 위한 항체 또는 본 발명의 방법 및 용도를 위한 항체를 포함하는 제약 조성물의 양을 의미한다. 항체의 유효량은 인자, 예컨대, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 개체에서 원하는 반응을 유도할 수 있는 항체의 능력에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료학상 유익한 효과가 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 것이다. 유효량은 1회 (예컨대, 볼루스), 다회 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 20 mg/kg의 양을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 범위의 하한 미만의 투여량 수준은 적절한 것 그 이상일 수 있지만, 다른 경우에는 더욱더 많은 용량이 사용될 수 있다.

"치료," "치료하는"이라는 용어 등은 장애 진행을 저속화시키거나, 또는 역전시키는 것을 포함하는 것으로 한다. 상기 용어는 또한 비록 장애 또는 상태를 실질적으로 제거하기 못하더라도, 및 비록 장애 또는 상태의 진행 그 자체를 저속화시키거나, 또는 역전시키지 못하더라고, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 완화시키거나, 호전시키거나, 약화시키거나, 제거하거나, 또는 감소시키는 것을 포함한다. 환자란 VEGFR1 활성 억제가 도움이 되는 질환, 장애, 또는 상태를 앓는 포유동물, 바람직하게, 인간을 의미한다.

3기 또는 4기의 CKD는 환자의 GFR 추정치 (eGFR)가 15 내지 59 ml/min/1.73 ㎡인 것으로 정의되었다. CKD 환자의 병기를 정의하는데 다른 것은 사용되지 않고, 하기와 같이 그의 eGFR에 의해 환자가 정의된다: 정상 > 80, 경미 50-80, 중간 정도 30-50, 및 중증 < 30.

본 발명의 방법 및 용도를 위한 항체, 또는 상기를 포함하는 제약 조성물은 비경구 경로 (예컨대, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 경피)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도를 위한 항체는 환자에게 단독으로, 또는 제약상 허용되는 담체 및/또는 희석제와 함께 조합하여 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 및 용도를 위한 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있고 (예컨대, 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19^thed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.]), 본원에 개시된 항체, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함한다.

실시예 1: 항체 발현 및 정제

항체 I-IV의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 폴리펩티드, 완전한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열, 및 상기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기 "아미노산 및 뉴클레오티드 서열"이라는 표제하의 섹션에 열거되어 있다. 추가로, 경쇄 및 중쇄 CDR 폴리펩티드는 하기 표 1에 제시되어 있다.

항체 I 및 II를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 발명의 방법 및 용도를 위한 VEGFR1 항체는 본질적으로 하기와 같이 제조되고, 정제될 수 있다. 미리 결정된 최적의 HC:LC 벡터 비, 또는 HC 및 LC, 둘 모두를 코딩하는 단일 벡터 시스템을 사용하여 항체를 분비하기 위한 발현 시스템으로 적절한 숙주 세포, 예컨대, HEK 293 EBNA 또는 CHO를 일시적으로 또는 안정적으로 형질감염시킬 수 있다. 일반적으로 사용되는 다수의 기법들 중 임의의 것을 사용하여 항체가 분비된, 정화된 배지를 정제할 수 있다. 예를 들어, 통상 배지를 Fab 단편을 위해 화합성 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수 (pH 7.4)로 평형화된, 맙셀렉트(MabSelect) 칼럼 (GE 헬스케어(GE Healthcare)), 또는 카파셀렉트(KappaSelect) 칼럼 (GE 헬스케어)에 적용시킬 수 있다. 칼럼을 세척하여 비특이 결합 성분을 제거할 수 있다. 결합된 항체를 예를 들어, pH 구배 (예컨대, 20 mM 트리스(Tris) 완충제 pH 7에서 10 mM 시트르산 나트륨 완충제 pH 3.0, 또는 포스페이트 완충처리된 염수 pH 7.4에서 100 mM 글리신 완충제 pH 3.0)에 의해 용리시킬 수 있다. 항체 분획을 예컨대, SDS-PAGE에 의해 검출한 후, 풀링할 수 있다. 추가 정제는 사용 목적에 따라 임의적이다. 통상의 기법을 사용하여 항체를 농축시키고/거나, 멸균 여과시킬 수 있다. 크기 배제, 소수성 상호작용, 이온 교환, 다중 모드, 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 비롯한, 통상의 기법에 의해 가용성 응집체 및 다량체를 효과적으로 제거할 수 있다. 생성물을 즉시 -70℃에서 냉동시킬 수 있거나, 동결 건조시킬 수 있다.

[표 1]

서열 번호

실시예 2: VEGFR1 항체의 결합 동역학적 성질, 친화도, 및 특이성

본 발명의 방법 및 용도를 위한 항체의 인간 VEGFR1 뿐만 아니라, 인간 VEGFR2 및 인간 VEGFR3에 대한 결합 동역학적 성질, 친화도, 및 선택성은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 바이오센서, 예컨대, BIA코어(BIAcore)® 2000, BIA코어® 3000, 또는 BIA코어® T100 (GE 헬스케어)을 사용하여 측정될 수 있다. 결합 동역학적 성질, 친화도, 및 특이성은 마우스 VEGFR1에 대한 개시된 항체가 시험관내에서 인간 VEGFR1에 대한 개시된 항체와 유사하게 기능을 수행한다는 것을 입증하는 분석에서 사용될 수 있다.

다양한 종의 VEGF 수용체에 대한 항체의 결합 친화도, 특이성, 동역학적 성질 및 화학량론은 HBS-EP 전개용 완충제 (GE 헬스케어 #BR-1006-69)로 프라이밍된 비아코어(Biacore) 장치 상에서 SPR 검정법을 사용하여 측정될 수 있고, 분석 온도는 25℃ 또는 37℃로 설정될 수 있다. 유동 셀 (Fc) 2개, 또는 4개 모두의 상에서의 표준 NHS-EDC 아민 커플링을 사용하여 고정화된 염소 항-(인간 또는 마우스) 카파 (κ 쇄 특이) 또는 단백질 A를 함유하는 CM4 칩 (37℃에서 T100에 대한 S 시리즈)을 생성할 수 있고, 이를 사용하여 포획 방법을 사용할 수 있다. 전개용 완충제에 희석함으로써 항체 샘플 또는 VEGF-Fc 수용체를 1 내지 10 ㎍/mL 농도 범위로 제조할 수 있다. VEGFR1-His, 항체 II 또는 항체 IV를 상이한 농도로 제조할 수 있다 (농도 범위: 2배 희석 증분량으로 200 nM 내지 0.078 nM). 각 분석 사이클은 (1) 별개의 유동 셀 (Fc2, Fc3, 및 Fc4) 상의 고정화된 단백질 A 또는 항-(인간 또는 마우스) 카파 (κ 쇄 특이) 상에 항체 샘플을 포획시키고, (2) 모든 Fc 상에 250 ㎕ (300-sec)의 His-태깅된 수용체, 항체 II-Fab 또는 항체 IV를 50 ㎕/min으로 주입하고, (3) 20 min 동안 완충제 유동을 복귀시켜 해리 단계를 모니터링하고, (4) 글리신 (pH 1.5)을 25 ㎕ (30-sec) 주입하여 칩 표면을 재생시키고, (5) HBS-EP를 25 ㎕ (30-sec) 주입하여 칩 표면을 평형화시키는 것으로 이루어질 수 있다. 표준 이중-참조를 사용하여 데이터를 프로세싱하고, 비아코어 2000의 경우, 비아코어 평가 소프트웨어, 버전 4.1을, 및 비아코어 T100의 경우, 2.0.3을 사용하여 1:1 결합 모델로 피팅하여 회합 속도 (k _on, M^-1s^-1 단위), 해리 속도 (k _off, s^-1 단위), 및 R _max (RU 단위)를 측정할 수 있다. 평형 해리 상수 (K _D )는 하기 관계식 K _D = k _off/k _on으로부터 계산될 수 있다.

본질적으로 본 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 I, II, III, 및 IV는 유사하게 높은 결합 친화도 (K_D)로 그의 상응하는 종의 VEGFR1에 결합하였다 (하기 표 2 참조). 항체 II 및 IV, 둘 모두는 최대 200 nM의 수용체까지 VEGFR2 및 VEGFR3에는 결합하지 않음으로써 VEGFR1에 대하여 우수한 선택성을 보였지다. 항체 II는 인간 및 시노몰구스 VEGFR1 수용체에 대하여 긴밀한 피코몰의 친화도를 가졌다. 인간 VEGFR1에 대한 항체 II의 K _D 는 37℃에서 740 ± 34 pM (n=3)이고, 시노몰구스 VEGFR1에 대한 것은 37℃에서 554 ± 29 pM (n=3)이었다.

[표 2]

표면 플라즈몬 공명 ( SPR )을 사용한, 다양한 종의 VEGFR1 , VEGFR2 또는 VEGFR3 수용체에 대한 항체 I, II, III, 및 IV의 시험관내 결합 파라미터

(a)는 각각의 개별 실험으로부터 K _D = k _off/k _on으로 계산된 것이고, 최종 값은 수개의 독립 K _D 값의 평균값을 구함으로써 얻은 값이다. nd = 수용체 농도 최대 ~200 nM까지 어떤 결합도 관찰되지 않았기 때문에, 비측정된 것이다.

실시예 3: 키메라 인간 VEGFR1 / EpoR 또는 마우스 VEGFR1 / 마우스EpoR 수용체를 발현하는 배양된 세포에서의 항체 II 및 항체 IV에 의한 VEGFR1의 내재화

키메라 마우스 VEGFR1/마우스 EpoR 또는 인간 VEGFR1/ 마우스 EpoR 수용체를 발현하는 세포에서 VEGFR1의 내재화를 측정함으로써 VEGFR1을 내재화시키고, 이어서, 분해시킬 수 있는 VEGFR1 항체의 능력을 측정할 수 있다. VEGFR1 내재화는 마우스 VEGFR1에 대한 개시된 항체가 시험관내에서 인간 VEGFR1에 대한 개시된 항체와 유사하게 기능을 수행한다는 것을 입증하는 분석에서 사용될 수 있다. BaF3 세포는 키메라 VEGFR1/Epo 수용체를 발현할 때 IL-3의 부재하에서 생존하게 된다. 항체 매개화된 내재화에 의해 세포 표면 키메라 VEGFR1/EpoR을 감소시키면, 세포는 사멸한다.

인간 및 마우스 VEGFR1 세포외 도메인 및 막횡단 도메인을 Epo 수용체의 세포내 도메인과 융합시킬 수 있다. 키메라 수용체를 pMSCV 퓨로 레트로바이러스 벡터 (클론테크(Clontech), 카탈로그 번호 634401)로 클로닝할 수 있다. 레트로바이러스 감염에 의해 BaF3-마우스VEGFR1-마우스EpoR 세포 및 BaF3-인간VEGFR1-마우스EpoR 세포를 생성할 수 있다. 피닉스 에코(Phoenix Eco) 레트로바이러스 패키징 세포 (ATCC)를 각각 마우스 VEGFR1/마우스EpoR 또는 인간 VEGFR1/마우스EpoR로 형질감염시켜 레트로바이러스를 생산할 수 있다. 레트로바이러스 입자를 사용하여 BaF3 세포를 형질도입시킬 수 있다. BaF3-VEGFR1-EpoR 세포를 RPMI-1640 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), #SH30255.01), 10% (v/v) FBS (인비트로겐(Invitrogen), #10082), 1 mM 피루브산 나트륨 (써모 사이언티픽, #SH30239.01), 100 U/500 mL 페니실린 G, 및 100 ㎍/500 mL 스트렙토마이신 (써모 사이언티픽, #SV30079.01), 2 ㎍/mL 퓨로마이신 (칼바이오켐(Calbiochem) #540411); 5 ng/mL 뮤린 IL-3 (R & D #403-ML-CF) 중에서 배양할 수 있다.

내재화 검정법을 수행하기 위해, 형질도입된 BaF3 세포를 IL-3을 함유하지 않는 20 mL의 배양 배지로 3회에 걸쳐 세척하여 IL-3을 세척해 낼 수 있다. IL-3을 함유하지 않는 배양 배지 중 100 ㎕의 세포를 흰색/투명 96-웰 조직 배양 플레이트 (BD #353377)의 각 웰에 첨가하여 1-2x10⁴개의 세포/웰을 달성할 수 있다. VEGFR1 및 이소형 대조군 항체를 IL-3을 함유하지 않는 배양 배지로 일련으로 희석하여 시험하고자 하는 2X 최종 농도를 수득한 후, 100 ㎕의 2X 항체 용액을 각 웰에 첨가할 수 있다. 이어서, 플레이트를 95% 상대 습도 및 5% (v/v) CO₂하에 37℃에서 인큐베이션시킬 수 있다. 6일 동안 배양한 후, 셀타이터-글로 루미네슨트 셀 바이어빌리티 어세이(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay) (프로메가(Promega) #G7571)에 의해 생존가능한 세포의 수를 측정할 수 있다. 플레이트 및 셀타이터-글로 기질을 30분 동안 실온으로 평형화시킬 수 있다. 100 ㎕의 셀타이터-글로를 각 웰에 첨가할 수 있다. 플레이트를 궤도 진탕기 상에서 2분 동안 진탕시켜 내용물을 혼합하고, 실온에서 10분 동안 계속해서 인큐베이션시켜 발광 신호를 안정화시킬 수 있다. 왈락 빅토르3TM 1420 멀티레이블 카운터(Wallac Victor3TM 1420 Multilable Counter) (퍼킨엘머 프리싸이즐리(PerkinElmer Precisely))에 의해 발광성을 기록할 수 있다. 항체 비처리 BaF3 세포와 비교함으로써 VEGFR1 및 대조군 IgG 항체 처리군에서의 세포 생존률(%)을 계산할 수 있다. 각 용량의 3중 처리의 평균값을 평균으로서 및 표준 오차 계산을 위해 사용할 수 있다. T-검정을 사용하여 같은 용량의 VEGFR1과 대조군 항체 사이의 데이터를 비교할 수 있다. 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 상이한 용량의 항체 II를 인큐베이션시켰을 때, 항체는 인간 IgG4 대조군 항체와 비교하였을 때 생존률을 유의하게 감소시킨 것으로 나타난 바와 같이, BaF3-마우스VEGFR1-마우스EpoR 세포 증식을 억제시켰다 (하기 표 3). 유사하게, 상이한 용량의 항체 IV를 6일 동안 인큐베이션시킨 후, BaF3-마우스 VEGFR1-마우스 EpoR 세포는 마우스 IgG1 대조군 항체와 비교하였을 때, 더욱 많은 세포 사멸을 보였다. 이러한 결과는 항체 II 및 IV, 둘 모두에 의한 세포 표면 VEGFR1 수용체의 내재화를 입증하는 것이다 (표 3). 추가로, 본 결과는 BaF3 세포 상의 키메라 VEGFR1에의 항체 II 및 IV의 결합이 수용체 활성화 및 세포 증식을 자극하지 않는다는 것을 시사한다.

[표 3]

항체 II 및 IV는 키메라 마우스 및 인간 VEGFR1 / EpoR을 발현하는 BaF3 세포에서 세포 생존률을 감소시킨다

데이터는 3중 처리의 평균값 및 표준 오차를 제시하고, 이는 두 실험을 나타내는 것이다.

실시예 4: 고체상 ELISA 및 세포 기반 VEGFR1 인산화 검정법에 의해 측정된, 항체 II에 의한 인간 VEGF -A 및 PlGF의 인간 VEGFR1에의 결합 중화

VEGFR1에 결합할 수 있고, VEGF-A 및 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시킬 수 있는 VEGFR1 항체의 능력을 고체상 ELISA 및 세포-기반 VEGFR1 인산화 검정법에 의해 측정할 수 있다. VEGF-A 및 PlGF 중화는 마우스 VEGFR1에 대한 개시된 항체가 시험관내에서 인간 VEGFR1에 대한 개시된 항체와 유사하게 기능을 수행한다는 것을 입증하는 분석에서 사용될 수 있다.

고체상 ELISA를 위해, 96-웰 플레이트를 50 ㎕/웰로 PBS 중 1 ㎍/mL의 hVEGFR1-Fc (R&D 321-fl 050/cf)를 이용하여 코팅한 후, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 용액을 웰로부터 제거한 후, 웰을 실온에서 1시간 동안 100 ㎕의 1% 카제인으로 차단시킬 수 있다. 항체 (대조군 Ron 항체 (R&D MAB691) 포함)를 마이크로타이터 플레이트 중에서, 50 ㎍/mL에서 출발하여, 0.023 ㎍/mL까지 1:3 희석율로 희석된 PBSt (트윈(Tween) 20 함유 PBS)에 대하여 적정할 수 있다 (하기 표 4a 참조). ELISA 플레이트를 PBSt로 3회에 걸쳐 세척한 후, 50 ㎕/웰의 미리 적정된 항체를 첨가할 수 있다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 50 ㎕의 비오티닐화된 리간드 (2 nM hPLGF1 (페프로 테크(Pepro Tech) #AF-100 06) 또는 2 nM hVEGFA-165 (R&D #293-VE)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 계속해서 인큐베이션시킬 수 있다. 플레이트를 PBSt로 3회에 걸쳐 세척한 후, 50 ㎕/웰의 NA-AP (1:1,000 희석율)를 첨가하고, 실온에서 15 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 3회 더 세척한 후, 100 ㎕/웰의 PMP (물 중 1:35로 희석)를 첨가할 수 있다. 이어서, 30 min 동안 플레이트를 발색시킬 수 있고, OD₅₆₀에서 판독할 수 있다.

세포-기반 VEGFR1 인산화 검정법을 위해, 인간 VEGFR1을 발현하는 PAE-R1 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트에 100,000개의 세포/웰로 시딩하고, 5% CO₂하에 37℃에서 밤새도록 배양할 수 있다. 이어서, 배양 배지를 500 ㎕의 고갈(starvation) 배지 (0.1 BSA 함유 DMEM/F12)로 교체하고, 밤새도록 배양할 수 있다. 이어서, 항체를 배지에 첨가하고, 세포를 30분 동안 배양할 수 있다. 이어서, 인간 VEGF-A 165 (R&D 카탈로그 번호 293-VE) 또는 인간 PlGF (R&D 카탈로그 번호 264-PG)를 첨가하고, 세포를 추가로 10분 동안 인큐베이션시킬 수 있다. ELISA (R&D 듀오 세트 IC ELISA(R&D Duo Set IC ELISA) 발색용 키트, #DYC4170-2)를 사용하여 인산화된 인간 VEGFR1을 측정할 수 있다.

데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시할 수 있다. ANOVA 분석 후, 던네트(Dunnett) 비교를 위해 JMP8을 사용할 수 있다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 4를 사용하여 IC₅₀을 계산할 수 있다. 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 II는 인간 VEGF-A 및 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시켰고, 이는 또한 인간 VEGF-A 및 PlGF 자극 VEGFR1 인산화를 억제시켰다. 항체 II는 PlGF 및 VEGF-A의 VEGFR1에의 결합을 각각 IC₅₀ = 0.43 nM 및 0.14 nM으로 중화시켰다 (표 4a 참조).

IC₅₀을 정확하게 계산하기 위해서는 저농도 항체의 데이터 점이 필요하였다. 따라서, 5 ㎍/mL에서 출발하여, 0.0023 ㎍/mL까지 1:3 희석율로 희석된 항체 농도에서 본 실험을 반복하였다. 실험 방법은 하기와 같이 기술될 수 있다.

고체상 ELISA를 위해, 96-웰 플레이트를 50 ㎕/웰로 PBS 중 1 ㎍/mL의 hVEGFR1-Fc (R&D 321-fl 050/cf)를 이용하여 코팅한 후, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 용액을 웰로부터 제거한 후, 웰을 실온에서 1시간 동안 100 ㎕의 1% 카제인으로 차단시킬 수 있다. 항체 (대조군 Ron 항체 (R&D MAB691) 포함)를 마이크로타이터 플레이트 중에서, 5 ㎍/mL에서 출발하여, 0.0023 ㎍/mL까지 1:3 희석율로 희석된 PBSt (트윈 20 함유 PBS)에 대하여 적정할 수 있다 (하기 표 4b 참조). ELISA 플레이트를 PBSt로 3회에 걸쳐 세척한 후, 50 ㎕/웰의 미리 적정된 항체를 첨가할 수 있다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 50 ㎕의 비오티닐화된 리간드 (4 nM hPLGF1 (R&D 카탈로그 번호 264-PG-010) 또는 2 nM hVEGFA-165 (R&D #293-VE)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30 min 동안 계속해서 인큐베이션시킬 수 있다. 플레이트를 PBSt로 3회에 걸쳐 세척한 후, 50 ㎕/웰의 NA-AP (1:1,000 희석율)를 첨가하고, 실온에서 15 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 3회 더 세척한 후, 100 ㎕/웰의 PMP (물 중 1:35로 희석)를 첨가할 수 있다. 이어서, 30 min 동안 플레이트를 발색시킬 수 있고, OD₅₆₀에서 판독할 수 있다.

데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시할 수 있다. ANOVA 분석 후, 던네트 비교를 위해 JMP8을 사용할 수 있다. 그래프패드 프리즘 버전 6을 사용하여 IC₅₀을 계산할 수 있다. 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주할 수 있다.

본질적으로 상기 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 II는 인간 VEGF-A 및 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시켰고, 이는 또한 인간 VEGF-A 및 PlGF 자극 VEGFR1 인산화를 억제시켰다. 항체 II는 PlGF 및 VEGF-A의 VEGFR1에의 결합을 각각 IC₅₀ = 0.31 nM 및 1.02 nM으로 중화시켰다 (표 4b 참조).

항체 II는 하기 표 5에 제시된 바와 같이, 시험관내에서 VEGF 및 PlGF 자극 VEGFR1 인산화, 둘 모두를 차단하였다.

[표 4a] 인간 VEGF -A 및 PlGF 결합 중화

[표 4b] 인간 VEGF -A 및 PlGF 결합 중화

[표 5]

인간 VEGFR1을 발현하는 배양된 PAE -R1 세포에서의 인산화

P < 0.001. 던네트 방법을 사용하여 대조군 (SFM)과 비교.

실시예 5: 항체 II 및 IV는 sFlt1이 VEGF -A 매개 ERK 인산화에 미치는 억제 효과를 약화시킨다

배양된 hUVEC 및 bEnd3 세포에서 sFlt1에 의한 VEGF-A 매개 ERK 인산화 억제를 약화시킬 수 있는 VEGFR1 항체의 능력을 측정할 수 있다. VEGF-A 매개 ERK 인산화 억제는 마우스 VEGFR1에 대한 개시된 항체가 시험관내에서 인간 VEGFR1에 대한 개시된 항체와 유사하게 기능을 수행한다는 것을 입증하는 분석에서 사용될 수 있다.

bEnd3 세포에서 측정하기 위해, bEnd3 세포를 ATCC (#CRL-2299)로부터 구입할 수 있다. bEnd3 세포를, 안티(Anti)/안티 (써모(Thermo) #SV30079.01) 및 10% 우태아 혈청 (인비트로겐 #10082-147)을 함유하는 DMEM/고 글루코스 배지 (하이클론(HyClone) #SH30243.01) 중에 3x10⁵개의 세포/mL로 재현탁시킬 수 있다. 0.5 mL의 재현탁된 bEnd.3 세포 (대략 1.5x10⁵개의 세포 함유)를 24-웰 마이크로타이터 플레이트 (코스타(Costar) #3524)의 각 웰에 첨가할 수 있고, 5% CO₂하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 배지를 흡인시키고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 15시간 동안 안티/안티 및 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) (시그마(Sigma) #A7979)을 함유하는 500 ㎕/웰의 DMEM/고 글루코스 배지 중에서 고갈시킬 수 있다. VEGF-A, sFlt1, 및/또는 VEGFR1 항체를 첨가하기 전, 배지를 0.1% BSA 함유의 새 고갈 배지로 교체할 수 있다.

VEGF-A 처리를 위해, 50 ㎕의 10X 농도의 마우스 VEGF164 (최종 8 ng/mL) (R&D #493-MV/CF)를 각 웰에 첨가할 수 있고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. VEGF-A + sFlt1 처리를 위해, 37℃에서 30 min 동안 30 ㎕의 20X 농도의 마우스 VEGF164 (최종 8 ng/mL)를 30 ㎕의 마우스 sFlt1 (최종 40 ng/mL, R&D #471-F1)과 함께 미리 혼합한 후, 50 ㎕의 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. VEGF-A + sFlt1 및 항체 IV의 경우, 37℃에서 30 min 동안 20 ㎕의 30X 농도의 항체 IV (최종 500 ng/mL)를 마우스 sFlt1 (최종 40 ng/mL, R&D 471-F1)과 함께 미리 혼합할 수 있다. 이어서, 40 ㎕의 30X 농도의 마우스 VEGF164 (최종 8 ng/mL)를 항체 IV 및 sFlt1의 혼합물에 첨가할 수 있다. 50 ㎕의 최종 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 무혈청 배지 대조군의 경우, 0.1% BSA 함유 50 ㎕의 고갈 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다.

hUVE 세포에서의 측정을 위해, hUVE 세포를, 보충제 (론자(Lonza) # CC-4176)를 함유하는 EGM-2 배지 (론자 # CC-3156) 중에 3x10⁵개의 세포/mL로 재현탁시킬 수 있다. 0.5 mL의 재현탁된 hUVE 세포를 24-웰 마이크로타이터 플레이트 (코스타 #3524)의 각 웰에 첨가할 수 있고 (1.5x10⁵개의 세포/웰), 5% CO₂하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 이어서, 5% CO₂하에 37℃에서 15시간 동안 고갈시키기 전에, 배지를 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) (시그마 #A7979)을 함유하는 500 ㎕/웰 EGM-2 배지로 교체할 수 있다. 처리 화합물을 첨가하기 전, 배지를 0.1% BSA 함유 새 고갈 배지로 교체할 수 있다. VEGF-A 처리를 위해, 50 ㎕의 10X 농도의 인간 VEGF165 (최종 1.5 ng/mL) (R&D 293-VE)를 첨가하고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. VEGF-A + sFlt1의 경우, 37℃에서 30 min 동안 30 ㎕의 20X 농도의 인간 VEGF165 (최종 1.5 ng/mL)를 인간 sFlt1 (최종 40 ng/mL, R&D 321-FL/CF)과 함께 미리 혼합할 수 있다. 이어서, 50 ul의 혼합물을 각 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. VEGF-A + sFlt1 및 항체 II의 경우, 37℃에서 30 min 동안 20 ㎕의 30X 농도의 항체 II (최종 73 ㎍/mL)를 인간 sFlt1 (최종 40 ng/mL)과 함께 미리 혼합한 후, 이어서, 40 ㎕의 30X 농도의 인간 VEGF165 (최종 1.5 ng/mL)를 VEGF-A 및 sFlt1의 혼합물에 첨가할 수 있다. 50 uL의 최종 혼합물을 웰에 첨가하고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 무혈청 배지 대조군의 경우, 0.1% BSA를 함유하는 50 ㎕의 고갈 배지를 각 웰에 첨가할 수 있고, 세포를 5% CO₂하에 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션시킬 수 있다.

세포 용해물 제조를 위해, 10 mL의 트리스 라이시스(Tris Lysis) 완충제 (MSD)를 200 ㎕ 프로테아제 억제제 용액 (50x 스톡), 100 ㎕ 포스파타제 억제제 I (100x 스톡), 100 ㎕ 포스파타제 억제제 II (100x 스톡), DMSO 중 40 ㎕ 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF) (250x 스톡), 및 100 ㎕ SDS (10% 스톡)와 혼합할 수 있다. PMSF 및 SDS를 사용 직전에 첨가할 수 있다. 처리 배지를 제거한 후, 50 ㎕의 세포 용해 완충제를 각 웰에 첨가할 수 있다. 세포를 얼음상에서 10 min 동안 용해 완충제와 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, 30 min 동안 4℃에서 진탕시킬 수 있다. 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트, 카탈로그 번호 23227를 사용하여 용해물의 단백질 농도를 측정할 수 있다.

ERK1/2 인산화 검정을 위해, MSD에 의해 개발된 샌드위치 면연검정법 (포스포-ERK1/2 (Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187) 어세이 호울 셀 라이세이트 키트(Assay Whole Cell Lysate Kit); MSD #K151DWD-1) 프로토콜에 따라 인산화된 ERK1/2를 측정할 수 있다. 상기 검정법은 인산화된 ERK1/2 (Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187)를 위해 포획 항체로 미리 코팅된 플레이트를 사용할 수 있다. 샘플을 첨가한 후, 검출 항체, 전기화학발광성 화합물 (MSD 술포-태그(SULFO-TAG) 표지)이 접합된 항-전체 ERK1/2를 함유하는 용액을 첨가할 수 있다. 샘플 중 인산화된 ERK1/2 수준과 상관 관계가 있는 방출광의 강도를 측정하는데 MSD 섹터 이미저(SECTOR Imager)를 사용할 수 있다. 포획 및 검출 항체, 둘 모두 인간 및 마우스 전세포 용해물과 교차 반응한다.

데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시할 수 있다. ANOVA 분석 후, 던네트 비교를 위해 JMP8을 사용할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 II 및 항체 IV는 각각 배양된 hUVEC 및 bEnd3 세포에서 sFlt1 활성을 약화시켰다 (하기 표 6 참조). 마우스 VEGF-A164와 함께 혼합하기 전, sFlt1을 항체 IV와 함께 미리 인큐베이션시킨 결과, bEnd3 세포에서 VEGF-A 자극 ERK1/2 인산화에 미치는 sFlt1의 억제 효과를 유의하게 막을 수 있었다. 본 연구에서 항체 IV의 최종 농도는 500 ng/mL였다. 항체 IV와 유사하게, 인간 VEGF-A165와 함께 혼합하기 전, sFlt를 항체 II와 함께 미리 인큐베이션시킨 결과, hUVE 세포에서 VEGF-A165 자극 ERK1/2 인산화를 유의하게 감소시킬 수 있었다. 본 연구에서 항체 II의 최종 농도는 73 ㎍/mL였다. 본 결과를 통해 항체 II 및 IV, 둘 모두가, VEGF-A의 VEGFR2에의 접근가능성을 증가시킬 수 있는 VEGF-A의 Flt1 포획을 차단시킨다는 것이 입증되었다.

[표 6]

항체 II 및 IV가 bEnd3 및 hUVE 세포에서 sFlt1 활성을 약화시킨다

*p<0.01, **p<0.001. 던네트 방법을 사용하여 대조군 (SFM)과 비교.

실시예 6: 항체 III 및 IV는 잔여 신장 마우스 모델에서 알부민뇨를 감소시키고, 신장 조직병리학적 병변을 개선시킨다 .

둘 모두가 CKD의 지표인 알부민뇨 및 신장 조직병리학적 병변을 개선시킬 수 있는 VEGFR1 항체의 잠재능은 잔여 신장 마우스 모델에서 생체내에서 측정할 수 있다 (Leelahavanichkul, et al. (2010) Kidney Int. 78(11): 1136-1153).

잔여 신장 모델은 대략 8주령째에 마우스 신장 매스의 ¾을 외과적으로 절제함으로써 생성할 수 있다. 모델은 알부민뇨, 고혈압, 및 혈관 사이 확장, 사구체경화증, 및 간질성 섬유증을 비롯한 신장 병변이 발병되는 인간 만성 신장 질환 (CKD)과 유사하다. 잔여 신장 수술은 8-9주령된 129S6/SvEvTac 수컷 마우스에서 수행될 수 있다. 소작술을 사용하여 한쪽 신장의 두 극을 정제한 후, 또 다른 신장의 신장절제술을 수행하는, 전체 신장 매스의 ¾을 감소시키기 위한 변형된 1단계 방법이 사용될 수 있다. 수술 후 1주 경과하였을 때, 수술용 스테이플을 제거할 수 있다. 마우스를 12시간 명기/암기 주기로 75°F에서 습도 50%로 유지되는 실내에서 소규모 격리실 케이징 내의 질을 높이기 위해 톱밥으로 된 바닥 깔개가 있는 보금자리에서 개별적으로 하우징시킬 수 있다. 마우스는 물통에 있는 물 및 퓨리나(Purina) 5008 사료에 자유롭게 접근할 수 있다. 하우스 물은 역삼투를 통해 여과되고, 염소 처리된 수돗물 (pH 6.5-7)일 수 있다. 잔여 신장 마우스를 수술 후 2주째에 기준선 뇨 ACR 및 체중에 의해 무작위화할 수 있다.

뇨 수집 및 뇨 알부민 및 크레아티닌 측정을 위해, 96 웰 코닝(Corning) #3359 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 위에 동물 1마리를 놓고 일회뇨를 수집할 수 있다. 마우스 및 플레이트 상에 플렉시글라스 하우징 챔버를 고정시킬 수 있다. 뇨를 마이크로피펫을 이용하여 얼음 상에서 1.5 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 옮기고, 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리할 수 있다. 뇨 알부민은 사내 내부에서 입증된 검정법을 사용하여 측정할 수 있고, 뇨 크레아티닌은 효소 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

신장 병리를 위해, 신장을 연구 종료시에 수집하고, 포르말린 중에서 고정시키고, 표준 방법에 따라 파라핀 절편화를 위해 프로세싱할 수 있다. 병리학자가 신장 절편을 신장 병변에 대하여 평가할 수 있다. 혈관 사이 기질, 사구체 섬유증, 및 간질성 섬유증을 하기: 없음 (0), 아주 적음 (1), 경미함 (2), 중간 정도 (3), 현저함 (4) 및 중증 (5)이라는 등급을 이용하여 반정량적으로 점수화할 수 있다. 사구체 혈관 사이 기질 확장 및 기저막 비후를 H&E 및 PAS 염색된 절편을 사용하여 점수화할 수 있다. 신장의 메이슨(Masson's) 트리크롬 염색된 절편을 평가하여 섬유증 (간질성 섬유증 및 사구체 섬유증) 정도를 측정할 수 있다.

수축기 혈압 측정을 위해, 실제로 측정하기 3-5일 전에 마우스를 꼬리 커프가 부착된 마우스 홀더에 매일 5분 동안 놓음으로써 마우스가 움직임을 제한하는 구속 장치에 순응하도록 할 수 있는 꼬리 커프 방법 ((코다 시스템(Coda System), 켄트 사이언티픽(Kent Scientific))을 이용하여 혈압을 측정할 수 있다. 장비의 실내 온도를 75°F로 승온시켜 혈압 수집 프로세스 동안 추가로 가온시킬 수 있다. 마우스를 선택하고 무작위화할 수 있다. 마우스를 홀더/구속 장치에 놓고, 코다 가온 패드 유닛 (31-33℃) 상부에 세팅할 수 있다. 꼬리 커프를 통과하도록 꼬리를 놓고, 각 마우스를 대략 30분 동안 구속하여 움직임을 제한시킬 수 있다. 꼬리 커프를 팽창시켜 동맥성 혈류를 일시적으로 차단시키기에 충분한 정도로 꽉 꼬리를 압박시킨 후, 수축시켜 서서히 느슨하게 풀어줌으로써 동맥파가 회복되는 것을 관찰할 수 있다. 동맥파가 회복시, 커프를 완전하게 수축시킬 수 있다. 1마리의 마우스로부터 반복 측정된 측정치의 평균값을 상기 마우스에 대한 수축기 혈압 수준으로 사용할 수 있다.

데이터는 평균 ± SE로 제시될 수 있거나, ANOVA 또는 독립(unpaired) t 검정을 위해 그래프패드 프리즘 또는 JMP를 사용할 수 있다. 분석을 위해, 뇨 ACR 데이터를 로그 값으로 변환시킬 수 있다. ANOVA 분석 후, 던네트 다중 비교 검정을 위해 그래프패드 프리즘 또는 JMP를 사용할 수 있다. 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 3개의 연구를 수행하였다. 연구 1을 위해, (1) PBS, 주 3회 (tiw), n = 12; (2) 10 mg/kg의 마우스 IgG1, tiw, n = 12; (3) 10 mg/kg의 항체 IV, tiw, n = 12; (4) 3 mg/kg의 항체 IV, tiw, n = 12; (5) 3 mg/kg의 항체 IV, qw, n = 12; 및 (6) 1 mg/kg의 항체 IV, tiw, n = 12인 6개의 군을 포함하였다. 0.2 mL의 시험 또는 대조군 화합물을 16주 동안 상기 명시된 용량 및 간격으로 피하 (sc)로 주사하였다. 기준선 (처리 이전) 및 투약 후 3, 6, 10, 12 및 16주째에 다시 일회뇨 및 체중을 수집하였다. 투약 16주째에 수축기 혈압을 수집하였다. 8주간의 연구 종료시에 수집된 샘플은 EDTA-항응고화된 전혈 및 신장을 포함하였다. EDTA 혈장을 사용하여 BUN, 크레아티닌, 및 다른 파라미터를 측정하였다. 관상으로 절개된 잔여 신장 중 절반부를 조직병리학적 검사를 위해 10% nBF (중성 완충처리된 포르말린) 중에서 고정시키고, 잔여 신장의 나머지 다른 절반부를 추가 분석을 위해 -80℃에서 급속 냉동시켰다.

연구 2를 위해, 본 연구에서는 (1) 모의 대조군 (n = 4, 비처리); (2) PBS 대조군 (n = 10); (3) 10 mg/kg의 래트 IgG1 (n = 10); (4) 10 mg/kg의 항체 III (n = 10); 및 (5) 3 mg/kg의 항체 III (n = 10)인 5개의 군을 포함한다. 모든 군에 8주 동안 0.2 mL/마우스의 부피로 주 3회에 걸쳐 (tiw) 복강내로 (i.p.) 투약하였다. 무작위화시 (기준선) 및 투약 후 4, 6 및 8주째에 다시 일회뇨를 수집하고, 체중을 측정하였다. 투약 후 4, 및 8주째에 수축기 혈압을 수집하였다. 혈압을 꼬리 커프를 사용하여 측정하였다. 종료점 샘플 수집은 연구 1에 기술된 것과 동일하였다.

연구 3을 위해, (1) 모의 조작군 (비처리), n = 4; (2) PBS 대조군, tiw, n = 6; (3) 30 mg/kg의 래트 IgG1, biw, n = 10; (4) 30 mg/kg의 항체 III, biw, n = 10; (5) 10 mg/kg의 항체 III, tiw, n = 10; (6) 10 mg/kg의 항체 III, qw, n = 10; (7) 3 mg/kg의 항체 III, tiw, n = 10; (8) 3 mg/kg의 항체 III, qw, n = 10; 및 (9) 1 mg/kg의 항체 III, qw, n = 10인 9개의 군을 포함하였다. 화합물을 6주 동안 0.2 mL/마우스의 부피로 피하로 (sc) 주사하였다. 기준선 (처리 이전) 및 투약 후 2, 4 및 6주째에 일회뇨 및 체중을 수집하였다. 꼬리 커프 방법을 사용하여 투약 6주째에 수축기 혈압을 수집하였다. 종료점 샘플 수집은 연구 1에 기술된 것과 동일하였다.

연구 1, 2, 및 3을 통해 항체 III (3 및 10 mg/kg) 및 항체 IV (1, 3, 및 10 mg/kg)는 잔여 신장 마우스에서 뇨 알부민/크레아티닌 (ACR)에 의해 측정된 바, 상응하는 시점에서의 대조군과 비교하였을 때, 알부민뇨를 유의하게 감소시킨다는 것이 입증되었다 (하기 표 7-9). 10 mg/kg, 30 mg/kg, 및 3 mg/kg (tiw) 투약군에서 항체 III 및 항체 IV는 또한 잔여 신장 마우스에서 신장 사구체 섬유증, 간질성 섬유증, 및 메이슨 점수(Masson's scores)에 의해 측정된 바, 신장 조직병리학적 점수를 개선시켰다 (하기 표 10-11).

[표 7]

항체 IV는 잔여 신장 마우스에서 ACR을 감소시킨다 (연구 1)

데이터는 평균 ± SE로 제시되어 있다.

[표 8]

항체 III은 잔여 신장 마우스에서 ACR을 감소시킨다 (연구 2)

데이터는 평균 ± SE로 제시되어 있다.

[표 9]

항체 III은 잔여 신장 마우스에서 ACR을 감소시킨다 (연구 3)

데이터는 평균 ± SE로 제시되어 있다.

[표 10]

잔여 신장 마우스에서의 신장 조직병리학적 점수 (연구 2)

[표 11]

잔여 신장 마우스에서의 신장 조직병리학적 점수 (연구 3)

실시예 7: 항체 III은 당뇨병성 db/db 및 신장 절제된 db/db 마우스에서 알부민뇨을 감소시키고, 신장 조직학적 병변을 개선시킨다 .

둘 모두가 CKD의 지표인 알부민뇨 및 신장 조직학적 병변을 개선시킬 수 있는 VEGFR1 항체의 잠재능은 당뇨병성 db/db 및 신장 절제된 db/db 마우스에서 생체내에서 측정할 수 있다. db/db 마우스는 인간 당뇨병성 신병증과 유사한 알부민뇨 및 신장 조직병리학적 병변이 발생하는 2형 당뇨병성 마우스 모델을 나타낸다 (Sharma et al. (2003) Am J Physiol Renal Physiol 284: F1138). 신장 절제된 db/db 마우스에서는 신장절제술을 받지 않은 db/db 마우스보다 더 많은 알부민뇨 및 더욱 중증인 신장 구조상의 병변이 발생한다 (Ninichuk et al. (2007) Eur J Med Res 12:351).

뇨 수집 및 뇨 알부민 및 크레아티닌 측정을 위해, 96 웰 코닝 #3359 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 위에 동물 1마리를 놓고 일회뇨를 수집할 수 있다. 마우스 및 플레이트 상에 플렉시글라스 하우징 챔버를 고정시킬 수 있다. 뇨를 마이크로피펫을 이용하여 얼음 상에서 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고, 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리할 수 있다. 뇨 알부민은 사내 내부에서 입증된 검정법을 사용하여 측정할 수 있고, 뇨 크레아티닌은 효소 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

신장 병리를 위해, 신장을 연구 종료시에 수집하고, 포르말린 중에서 고정시키고, 표준 방법에 따라 파라핀 절편화를 위해 프로세싱할 수 있다. 병리학자가 신장 절편을 신장 병변에 대하여 평가할 수 있다. 혈관 사이 기질, 사구체 섬유증, 및 간질성 섬유증을 하기: 없음 (0), 아주 적음 (1), 경미함 (2), 중간 정도 (3), 현저함 (4) 및 중증 (5)이라는 등급을 이용하여 반정량적으로 점수화할 수 있다. 사구체 혈관 사이 기질 확장 및 기저막 비후를 H&E 및 PAS 염색된 절편을 사용하여 점수화할 수 있다. 신장의 메이슨 트리크롬 염색된 절편을 평가하여 섬유증 (간질성 섬유증 및 사구체 섬유증) 정도를 측정할 수 있다.

데이터는 평균 ± SE로 제시될 수 있다. ANOVA 분석 후, 던네트 다중 비교 검정을 위해 그래프패드 프리즘 또는 JMP를 사용할 수 있다. 0.05 미만의 P 값을 통계학상 유의한 것으로 간주할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 2개의 연구를 수행하였다. 연구 4에서, 수컷 db/db 수컷 마우스 (BKS.Cg-+ Lepr ^db /+ Lepr ^db /OlaHsd)를 할란 라보라토리즈(Harlan Laboratories: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 구입하고, 7주령째에 6주 동안 주 3회 (tiw)에 걸쳐 각각 PBS, 10 mg/kg의 대조군 래트 IgG1, 10 mg/kg의 항체 III, 및 3 mg/kg의 항체 III을 받은 것으로 무작위화하였다. 각 군의 마우스의 마리수는 10마리로 하되, 단, 예외적으로 PBS 군의 마우스는 8마리였다. 처리 4 및 6주째에 수집된 일회뇨에서 알부민/크레아티닌 (ACR)을 측정하였다. 6주간의 연구 종료시 혈액 파라미터 및 신장 병리를 검사하였다.

연구 5에서, 4주령째인 db/db 마우스 (BKS.Cg-+ Lepr db/+ Lepr db/OlaHsd)에서 IACUC 및 그의 기관의 가이드라인에 따라 신장 절제 수술을 수행하였다. 마우스를 대략 8-9주령째에 무작위화하였다. 본 연구는 (1) PBS 대조군, n = 6; (2) 30 mg/kg의 래트 IgG1, biw, n = 10; (3) 30 mg/kg의 항체 III, biw, n = 10; (4) 10 mg/kg의 항체 III, tiw, n = 10; (5) 10 mg/kg의 항체 III, qw, n = 10; (6) 3 mg/kg의 항체 III, qw, n = 10; 및 (7) 1 mg/kg의 항체 III, qw, n = 10인 7개의 군을 포함하였다. 동물에게 6주 동안 0.2 mL/주사로 피하로 (sc) 투약하였다. 하기 표 13 및 15에 명시된 바와 같이 주기적으로 혈당, 체중, 일회뇨 ACR을 검사하였다. 6주간의 연구 종료시 혈중 크레아티닌, BUN, 및 신장 조직을 검사하였다.

연구 4 및 5에서, 항체 III은 db/db 마우스에서 10 mg/kg, tiw, 및 3 mg/kg, tiw 용량, 둘 모두의 경우, 및 신장 절제된 db/db 마우스에서 모는 시험 용량 (30 mg/kg, tiw; 10 mg/kg, tiw; 10 mg/kg, qw; 3mg/kg, tiw; 3mg/kg, qw, 및 1 mg/kg, qw)의 경우, 대조군 항체와 비교하였을 때, 뇨 알부민/크레아티닌 (ACR)을 유의하게 감소시켰다 (하기 표 12-13). 항체 III은 또한 신장 절제된 db/db 마우스에서 혈관 사이 기질 점수에 의해 측정된 바 신장 조직병리학적 점수를 개선시키고, 혈중 요소 질소 (BUN)를 감소시켰다 (하기 표 14 및 15).

[표 12]

항체 III은 db/db 마우스에서 ACR을 감소시킨다 (연구 4)

[표 13]

항체 III은 신장 절제된 db/db 마우스에서 ACR을 감소시킨다 (연구 5)

[표 14]

항체 III은 신장 절제된 db/db 마우스에서 신장 조직학적 병변을 개선시킨다

[표 15]

항체 III이 신장 절제된 db/db 마우스에서 체중, 글루코스 , 콜레스테롤, BUN, 및 FFA에 미치는 효과

실시예 8: 항체 IV는 당뇨병성 db/db- eNOS 결핍 마우스에서 알부민뇨를 감소시키고, 혈청 크레아티닌 증가를 막고, 사망률을 감소시킨다

둘 모두가 CKD의 지표인 알부민뇨 및 신장 기능을 개선시킬 수 있는 VEGFR1 항체의 잠재능은 당뇨병성 db/db-eNOS 결핍 마우스에서 생체내에서 측정할 수 있다. db/db-eNOS 녹아웃 마우스는 병기가 더욱 진행된 인간 당뇨병성 신병증과 유사한 당뇨병성 신장 손상 모델을 나타낸다. 마우스에서는 과혈당증, 알부민뇨, 세동맥 유리질증, GBM 비후(thickness), 혈관 사이 확장, 사구체간질융해, 초점성 분절성 및 초기 소결절성 사구체경화증 뿐만 아니라, 사구체 여과율 (GFR)의 하락이 발생한다 (Zhao et al. (2006) J Am Soc Nephrol 17:2664). 치료하지 않을 경우, 마우스는 16-20주령 이후에 높은 사망률을 보인다.

뇨 수집 및 뇨 알부민 및 크레아티닌 측정을 위해, 96 웰 코닝 #3359 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트 위에 동물 1마리를 놓고 일회뇨를 수집할 수 있다. 마우스 및 플레이트 상에 플렉시글라스 하우징 챔버를 고정시킬 수 있다. 뇨를 마이크로피펫을 이용하여 얼음 상에서 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 옮기고, 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리할 수 있다. 뇨 알부민은 사내 내부에서 입증된 검정법을 사용하여 측정할 수 있고, 뇨 크레아티닌은 효소 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 8에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 당뇨병성 db/db-eNOS 녹킹-아웃 마우스에서 항체 IV 효능을 조사하는 2개의 연구를 수행하였다 (연구 6 및 연구 7).

연구 6을 위해, 8 내지 22주령된 db/db-eNOS 녹아웃 마우스 (BKS.Cg-Lepr<db>-Nos3<tm1Unc/Rhrs>)를, 10 mg/kg의 마우스 IgG1을 받는 6마리의 수컷 및 5마리의 암컷 마우스로 이루어진 대조군, 및 10 mg/kg의 항체 IV를 받는 6마리의 수컷 및 4마리의 암컷 마우스로 이루어진 처리군인 2개의 군으로 무작위화하였다. 항체를 12주 동안 0.2 mL/주사 부피로 주 3회 (tiw)에 걸쳐 피하로 (sc) 투여하였다. 연구 종료시 혈청 크레아티닌을 측정하였다.

연구 7을 위해, db/db-eNOS 녹아웃 마우스를 각각 PBS, 10 mg/kg의 대조군 마우스 IgG1, 및 10 mg/kg의 항체 IV를 받는 3개의 군으로 무작위화하였다. PBS 군은 5마리의 수컷 및 6마리의 암컷 마우스를 포함하는 11마리의 마우스로 이루어졌다. 대조군 IgG1 군은 6마리의 수컷 및 5마리의 암컷 마우스를 포함하는 11마리의 마우스로 이루어졌다. 항체 IV 군은 처리 초반에는 7마리의 수컷 및 5마리의 암컷 마우스로 이루어졌다. 항체 IV 및 대조군 시약을 12주 동안 주 3회 (tiw)에 걸쳐 sc로 투여하였다. 기준선 및 처리 2, 4, 6, 6, 10, 및 12주째에 일회뇨 ACR 수준을 측정하였다. 기준선 및 처리 6주째 및 12주째에 혈청 크레아티닌을 조사하였다.

상응하는 시점에서의 대조군과의 비교로 뇨 알부민/크레아티닌 (ACR)에 의해 측정된 바, 항체 IV는 db/db-eNOS 녹아웃 마우스에서 알부민뇨를 유의하게 감소시켰다 (하기 표 16). 항체 IV 또한 당뇨병성 db/db-eNOS 녹아웃 마우스에서 혈청 크레아티닌 증가 방지로 측정된 바, 신장 기능을 개선시켰다 (표 16). 연구 종료점까지 생존한 마우스 중에서, 항체 IV 군 (n=10; 카이 제곱 검정에서 P=0.016)에서는 10%인 것에 반해, 대조군 중 69% (PBS+IgG1, n=13)는 혈청 크레아티닌을 50% 초과로 증가시켰다. 추가로, 대조군에서 30%의 마우스는 혈청 크레아티닌을 배가시킨 반면, 항체 IV 군 중에서는 어떤 마우스도 배가시키지 않았다. 항체 IV 처리는 db/db-eNOS 녹아웃 마우스에서 사망률을 감소시켰다 (하기 표 17).

[표 16]

항체 IV는 당뇨병성 db/db- eNOS 결핍 마우스에서 ACR을 감소시킨다

[표 17]

항체 IV 및 대조군 항체 처리된 당뇨병성 db/db- eNOS 녹아웃 마우스에서의 생존률(%) (연구 6 및 7)

실시예 9: 원숭이 및 마우스에서 항체 II 및 III이 혈중 PlGF 수준에 미치는 효과

원숭이 및 마우스에서 VEGFR1 항체가 생체내에서 혈중 PlGF 수준에 영향을 미칠 수 있는 능력을 측정할 수 있다. 원숭이 혈장 중 PlGF 측정을 위해, PlGF ELISA 검정법 (R&D 시스템즈(R&D Systems) #DPG00)을 사용할 수 있다. 마우스 혈액 중 PlGF 측정을 위해, PlGF ELISA 검정법 (R&D 시스템즈, 콴티카인(Quantikine) 마우스 PlGF-2 면역검정법; 카탈로그 번호 MP200)을 사용할 수 있다. 검정 이전에 혈청 및 혈장 샘플을 교정계 희석제 (R&D 시스템즈 #RD5-17)로 2-20배로 희석시킬 수 있다. 표준 곡선은 마우스 PlGF의 경우, 23.4 내지 1,500 pg/ml 범위일 수 있고, 원숭이 PlGF의 경우, 15.6 내지 1,000 pg/ml 범위일 수 있다. 데이터는 평균 ± SE로 제시될 수 있고; 데이터 분석을 위해 그래프패드 프리즘 4를 사용할 수 있다.

시노몰구스 원숭이 연구에서, 2.5-4.5세의 (각 군은 4마리의 수컷 및 4마리의 암컷 원숭이로 이루어진) 4개의 원숭이 군으로부터 수집된 혈장을 사용하여 항체 II에 대한 혈중 PlGF의 생체내 반응을 측정할 수 있다. 원숭이는 항체 II를 0, 3, 20, 또는 65 mg/kg의 용량으로 13주 동안 주 1회 (qw)에 걸쳐 받을 수 있다. 혈액 샘플 중 연구 종료시에 수집할 수 있다.

마우스 연구에서, 잔여 마우스 또는 신장 절제된 db/db 마우스로부터 수집된 혈액을 사용하여 항체 III에 대한 혈중 PlGF의 생체내 반응을 측정할 수 있다. 잔여 신장 마우스 연구에서, 항체 III을 10 mg/kg 및 3 mg/kg으로 8주 동안 주 3회 (tiw)에 걸쳐 투여할 수 있다. 신장 절제된 db/db 연구에서, 항체 III을 6주 동안 30 mg/kg biw, 10 mg/kg tiw, 10 mg/kg qw, 3 mg/kg qw, 및 1 mg/kg qw로 투여할 수 있다. 연구 종료시 혈장 샘플을 수집할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 9에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 II는 13주 동안 3, 20, 및 65 mg/kg의 용량으로 주 1회에 걸쳐 투여받은 시노몰구스 원숭이에서 혈장 PlGF 수준을 유의하게 증가시켰다 (하기 표 18). 항체 III은 잔여 신장 및 신장 절제된 마우스, 둘 모두에서 혈중 PlGF를 용량에 의존하는 방식으로 증가시켰다 (하기 표 19).

[표 18]

13주 동안 항체 II로 처리된 시노몰구스 원숭이에서의 혈중 PlGF

P < 0.01 (비히클 군과의 비교)

[표 19]

항체 III으로 처리된 마우스에서의 혈중 PlGF

P < 0.01

실시예 10: 마우스 및 원숭이 신장에서의 신장 VEGFR2 인산화

신장 VEGFR2 인산화에 영향을 줄 수 있는 VEGFR1 항체의 능력을 원숭이 및 마우스의 신장에서 측정할 수 있다.

2.5-4.5세의 (각 군은 4마리의 수컷 및 4마리의 암컷 원숭이로 이루어진) 4개의 원숭이 군을 13주 동안 주 1회에 걸쳐 (qw) 각각 0, 3, 20, 및 65 mg/kg 용량의 항체 II로 처리할 수 있는 시노몰구스 원숭이 연구로부터 원숭이 신장을 수집할 수 있다. 용량 0인 원숭이 군은 비히클 (PBS, pH 7.4) 주사를 맞을 수 있다. 연구 종료시 신장 샘플을 수집하고, 냉동시킬 수 있다.

원숭이 신장 균질액은, 얼음 상의 2 ml 퀴아젠 튜브에 대략 150 ㎍의 원숭이 신장 조직을 넣은 후, 500 ㎕ 샘플 완충제 (MSD 포스포르-VEGFR2 카탈로그 번호 K151DJD-1)를 첨가할 수 있는, 퀴아젠 티슈라이서(QIAGEN TissueLyser)를 사용하여 제조할 수 있다. 퀴아젠 티슈라이서 상에서 튜브를 스테인리스강 비드 (5 mm, 퀴아젠 #69989)와 함께 60초 동안 6.5 속도로 진탕시킬 수 있다. 튜브를 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 4℃에서 30분 동안 튜브를 회전시킬 수 있다. 이어서, 튜브를 4℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리할 수 있다. 상청액을 새 에펜도르프 튜브로 옮길 수 있다. BCA 검정법 (피어스 BCA 단백질 검정 키트 카탈로그 번호 23227)을 사용하여 1:100으로 희석된 균질액 중 단백질 농도를 측정할 수 있다. 샘플을 -80℃에서 보관할 수 있다.

포스포-VEGFR-2 (Tyr1054) 검정 전세포 용해물 키트 (MSD #K151DJD-1)를 사용하여 인산화된 VEGFR2 수준을 측정할 수 있다. 400 ㎍의 총 단백질을 함유하는 원숭이 신장 균질액을 각 웰에 로딩할 수 있다.

실시예 6에 기술된 바와 같은 잔여 신장 연구로부터, 실시예 7에 기술된 바와 같은 신장 절제된 db/db 마우스 연구로부터, 또는 129마리의 정상 마우스에서 마우스 신장을 수집할 수 있다. 129마리의 마우스 연구에서, 타코닉 팜(Taconic Farm)으로부터의 수컷 129S6/SvEvTac 마우스를 대략 10주령째에 항체 III 또는 대조군 래트 IgG1 항체를 받는 2개의 군으로 무작위화할 수 있다. 항체 III 및 대조군 IgG1 항체 둘 모두 10 mg/kg으로 16주 동안 주 3회 (tiw)에 걸쳐 피하로 투여될 수 있다. 16주간의 연구 종료시에 신장을 수집할 수 있다.

대략 50 ㎍의 마우스 신장을 300 ㎕의 샘플 완충제 (MSD 마우스 포스포-KDR(Tyr1175)에 첨가함으로써 마우스 신장 균질액을 제조할 수 있다. 튜브를 얼음 상에 놓고, 패스트프렙(FastPrep) 상에서 40초 동안 6.5 속도로 진탕시킬 수 있다. 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션시킨 후, 패스트프렙을 사용하여 조직을 파괴시킬 수 있다. 튜브를 4℃에서 30분 동안 회전시킨 후, 4℃에서 8,000 rpm으로 10분 동안 원심분리할 수 있다. 상청액을 새 에펜도르프 튜브로 옮길 수 있다. BCA 방법 (피어스 BCA 단백질 검정 키트 카탈로그 번호 23227)을 사용하여 1:100으로 희석된 균질액 중 단백질 농도를 측정할 수 있다. 샘플을 -80℃에서 보관할 수 있다.

마우스 포스포-KDR (Tyr1175) 검정 전세포 용해물 키트 (MSD 커스텀 번호 N45CA-1)를 사용하여 인산화된 마우스 VEGFR2를 측정할 수 있다. 400 ㎍의 총 단백질을 함유하는 마우스 신장 균질액을 각 웰에 로딩할 수 있다. 섹터 이미저를 사용하여 OD를 판독할 수 있다.

본질적으로 본 실시예 10에 기술된 바와 같이 수행된 실험에서, 항체 II는 13주 동안 20 mg/kg, qw 용량을 받은 시노몰구스 원숭이에서 신장 VEGFR2 인산화를 증가시켰다 (하기 표 20). 유사하게, 항체 III은 6주 동안 항체 III 처리를 받은 잔여 신장 마우스에서 (하기 표 21), 6주 동안 항체 III 처리를 받은 신장 절제된 db/db 마우스에서 (하기 표 22) 뿐만 아니라, 16주 동안 항체 III 처리를 받은 129마리의 마우스에서 (하기 표 23) 신장 VEGFR2 인산화를 증가시켰다.

[표 20]

항체 II 처리 이후의 원숭이 신장에서의 VEGFR2 인산화

P < 0.05

[표 21]

항체 III은 잔여 마우스 신장에서 신장 VEGFR2 인산화를 증가시킨다

ANOVA 및 던네트 비교에 의한, P < 0.003 (rIgG1 대조군과의 비교)

[표 22]

항체 III은 신장 절제된 db/db 마우스 신장에서 VEGFR2 인산화를 증가시킨다

ANOVA 및 던네트 비교에 의한, P < 0.0005 (대조군 IgG1 군과의 비교)

[표 23]

항체 III은 129S6 / SvEvTac 마우스 신장에서 신장 VEGFR2 인산화를 증가시킨 다

P < 0.001 (대조군 IgG1 군과의 비교)

아미노산 및 뉴클레오티드 서열

서열 1 (hVEGFR1)

서열 2 (HCDR1 - 항체 1 및 2)

서열 3 (HCDR2 - 항체 1 및 2)

서열 4 (HCDR3 - 항체 1 및 2)

서열 5 (HCVR - 항체 1 및 2)

서열 6 (HC - 항체 1)

서열 7 (HC - 항체 2)

서열 8 (LCDR1 - 항체 1 및 2)

서열 9 (LCDR2 - 항체 1 및 2)

서열 10 (LCDR3 - 항체 1 및 2)

서열 11 (LCVR - 항체 1 및 2)

서열 12 (LC - 항체 1 및 2)

서열 13 (HC DNA- 항체 1)

서열 14 (HC DNA- 항체 2)

서열 15 (LC DNA- 항체 1 및 2)

서열 16 (HC - 항체 3)

서열 17 (LC - 항체 3)

서열 18 (HC - 항체 4)

서열 19 (LC - 항체 4)

SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> Therapeutic Uses for VEGFR1 Antibodies <130> X19929 <150> 61/788870 <151> 2013-03-15 <150> PCT/US2014/022925 <151> 2014-03-11 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1338 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro 20 25 30 Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr 35 40 45 Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro 50 55 60 Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala 65 70 75 80 Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr 85 90 95 Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val 100 105 110 Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile 115 120 125 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 130 135 140 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 145 150 155 160 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 165 170 175 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 180 185 190 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 195 200 205 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 210 215 220 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val 225 230 235 240 Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr 245 250 255 Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys 260 265 270 Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His 275 280 285 Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys 290 295 300 Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys 305 310 315 320 Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val 325 330 335 Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser 340 345 350 Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val 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gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc 1260 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtccc cgggtaaa 1368 <210> 14 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 caggcgcagg tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagt ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt cgccttcagt agctacggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca attccgagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gagagatcac 300 tatggttcgg gggtgcacca ctatttctac tacggtctgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttcccgct agcgccctgc 420 tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 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Leu Gln Ser Asp Leu 165 170 175 Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 180 185 190 Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 210 215 220 Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 225 230 235 240 Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 245 250 255 Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 260 265 270 Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 275 280 285 Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 290 295 300 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 305 310 315 320 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 325 330 335 Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 340 345 350 Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 355 360 365 Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 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Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims (36)

1. 만성 신장 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VEGFR1 항체는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 만성 신장 질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 만성 신장 질환이 진성 당뇨병에 의해 유발되는 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 환자가 만성 신장 질환 3기 또는 4기인 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증 또는 초점성 분절성 사구체경화증인 방법.
5. 단백뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VEGFR1 항체는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 단백뇨를 감소시키는 방법.
6. 제5항에 있어서, 단백뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인 방법.
7. 알부민뇨 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 여기서 VEGFR1 항체는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 알부민뇨를 감소시키는 방법.
8. 제7항에 있어서, 알부민뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인 방법.
9. 사구체 여과율 손실 감소를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VEGFR1 항체는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 혈청 크레아티닌 증가에 의해 반영되는 사구체 여과율 손실을 감소시키는 방법.
10. 신장 조직병리학적 병변에 대한 보호를 필요로 하는 환자에게 유효량의 VEGFR1 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 VEGFR1 항체는 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 환자에서 신장 조직병리학적 병변에 대해 보호하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1에 대한 VEGFR1 항체의 K_D가 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에, 80 pM 미만인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 VEGF-A의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 것인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 서열 11의 폴리펩티드인 LCVR, 및 서열 5의 폴리펩티드인 HCVR을 포함하는 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, 여기서 LC는 서열 12의 폴리펩티드이고, HC는 서열 6의 폴리펩티드인 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하고, 여기서 LC는 서열 12의 폴리펩티드이고, HC는 서열 7의 폴리펩티드인 방법.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 방법.
18. 제1항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 방법.
19. 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 만성 신장 질환의 치료에서 사용하기 위한 VEGFR1 항체.
20. 제19항에 있어서, 만성 신장 질환이 진성 당뇨병에 의해 유발되는 것인 VEGFR1 항체.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 만성 신장 질환이 3기 또는 4기인 VEGFR1 항체.
22. 제19항 또는 제21항에 있어서, 만성 신장 질환이 당뇨병성 신병증 또는 초점성 분절성 사구체경화증인 VEGFR1 항체.
23. 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 단백뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체.
24. 제23항에 있어서, 단백뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인 VEGFR1 항체.
25. 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 알부민뇨를 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체.
26. 제25항에 있어서, 알부민뇨가 당뇨병성 신병증에 의해 유발되는 것인 VEGFR1 항체.
27. 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 혈청 크레아티닌 증가에 의해 반영되는 사구체 여과율 손실을 감소시키는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체.
28. 경쇄 가변 영역 (LCVR) 및 중쇄 가변 영역 (HCVR)을 포함하는 항체이고, 여기서 LCVR은 상보성 결정 영역 (CDR)인 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고, HCVR은 CDR인 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하고, 여기서 LCDR1은 RASQSVSSSYLA (서열 8)의 폴리펩티드이고, LCDR2는 GASSRAT (서열 9)의 폴리펩티드이고, LCDR3은 QQYGSSPLT (서열 10)의 폴리펩티드이고, HCDR1은 GFAFSSYGMH (서열 2)의 폴리펩티드이고, HCDR2는 VIWYDGSNKYYADSVRG (서열 3)의 폴리펩티드이고, HCDR3은 DHYGSGVHHYFYYGLDV (서열 4)의 폴리펩티드인 것인, 신장 조직병리학적 병변에 대해 보호하는데 사용하기 위한 VEGFR1 항체.
29. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1에 대한 VEGFR1 항체의 K_D가 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정시에, 80 pM 미만인 VEGFR1 항체.
30. 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 VEGF-A의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 것인 VEGFR1 항체.
31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2.0 nM 미만의 IC₅₀으로 시험관내에서 PlGF의 VEGFR1에의 결합을 중화시키는 것인 VEGFR1 항체.
32. 제19항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 서열 11의 폴리펩티드인 LCVR, 및 서열 5의 폴리펩티드인 HCVR을 포함하는 항체인 VEGFR1 항체.
33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하는 항체이고, 여기서 LC는 서열 12의 폴리펩티드이고, HC는 서열 6의 폴리펩티드인 VEGFR1 항체.
34. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 경쇄 (LC) 및 중쇄 (HC)를 포함하는 항체이고, 여기서 LC는 서열 12의 폴리펩티드이고, HC는 서열 7의 폴리펩티드인 VEGFR1 항체.
35. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 6의 폴리펩티드인 VEGFR1 항체.
36. 제19항 내지 제32항 또는 제34항 중 어느 한 항에 있어서, VEGFR1 항체가 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하고, 여기서 각 경쇄는 서열 12의 폴리펩티드이고, 각 중쇄는 서열 7의 폴리펩티드인 VEGFR1 항체.