TW201431559A - 抗-her3抗體之組合療法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於抗-HER3抗體與某些抗-HER抗體之組合療法。
Description
本發明係關於抗-HER3抗體與某些抗-HER抗體之組合療法。
人類HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受體酪胺酸蛋白激酶erbB-3、SEQ ID NO:17)編碼受體酪胺酸激酶之表皮生長因子受體(EGFR)家族的成員,該家族亦包括HER1(亦稱為EGFR)、HER2及HER4(Kraus,M.H.等人,PNAS 86(1989)9193-9197;Plowman,G.D.等人,PNAS 87(1990)4905-4909;Kraus,M.H.等人,PNAS 90(1993)2900-2904)。如同典型表皮生長因子受體一樣,跨膜受體HER3係由胞外配體結合結構域(ECD)、ECD內之二聚體化結構域、跨膜結構域、胞內蛋白質酪胺酸激酶結構域(TKD)及C-末端磷酸化結構域組成。此膜結合蛋白具有在胞外結構域內但非活性激酶結構域內之HER3神經生長因子(HRG)結合結構域。因此,其可結合此配體,但不能藉助蛋白質磷酸化將信號傳送至細胞中。然而,其與具有激酶活性之其他HER家族成員形成異源二聚體。異源二聚體化導致受體介導之信號傳導途徑之激活及其胞內結構域之反式磷酸化。HER家族成員之間之二聚體形成擴展HER3之信號轉導潛力且係用於信號多樣化以及信號放大之方式。舉例而言,HER2/HER3異源二聚體在HER家族成員之間經由PI3K及AKT途徑誘導最重要之促有絲分裂信號中之一者(Sliwkowski M.X.等人,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665;
AlimandiM等人,Oncogene.10(1995)1813-1821;Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261;Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274;Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。
已在許多癌症(包括前列腺腫瘤、膀胱腫瘤及乳房腫瘤)中報告此基因之表現及/或其蛋白質之表現。已經表徵編碼不同亞型之交替轉錄剪接變體。一種亞型缺少膜間區且係在細胞外部分泌。此形式用以調節膜結合形式之活性。亦已報告其他剪接變體,但該等尚未經充分表徵。
WO 97/35885係關於HER3抗體。WO 2003/013602係關於HER活性之抑制劑,包括HER抗體。WO 2007/077028、WO 2008/100624、WO2011076683、WO2011044311、WO2011136911、WO2012019024、WO2012022814、WO2012031198、WO2012044612、WO2012052230、WO2012059858係關於HER3抗體。
人類HER2係指185-kDa生長因子受體,其亦稱為neu及c-erbB-2(Slamon等人,Science 235(1987)177-182;Swiss-Prot P04626),其功能涉及人類乳癌細胞中之腫瘤性轉化。已在20-30%乳癌患者中鑑別出此蛋白質之過表現,其中其與區性加重之疾病、增加之腫瘤復發之可能性以及降低之患者存活相關聯。多達30-40%之患有胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌或結腸直腸癌之患者亦展現此蛋白質之過表現。
HER受體通常將包含胞外結構域,其可結合HER配體;親脂性跨膜結構域、保守之胞內酪胺酸激酶結構域及具有若干可經磷酸化之酪胺酸殘基之羧基末端信號傳導結構域。HER2之胞外結構域包含四個結構域,即結構域I(自約1至195之胺基酸殘基)、結構域II(自約196至320之胺基酸殘基)、結構域III(自約321至488之胺基酸殘基)及結構
域IV(自約489至632之胺基酸殘基)(殘基編號沒有信號肽)。參見Garrett等人,Mol.Cell.11(2003)495-505,Cho等人,Nature 421(2003)756-760,Franklin等人,Cancer Cell 5(2004)317-328或Plowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.90(1993)1746-1750及WO 2006/007398。
曲妥珠單抗(Trastuzumab)(以商品名Herceptin®出售)係重組人類化抗-HER2單株抗體,其用於治療HER2過表現/HER2基因擴增之轉移性乳癌。曲妥珠單抗與鼠科動物抗-HER2抗體4D5(Hudziak等人,Mol.Cell.BioL 9(1989)1165-1172中所闡述)一樣特異性結合至HER2之表位。曲妥珠單抗係鼠科動物抗-HER2抗體4D5之重組人類化型式(稱為rhuMAb 4D5或曲妥珠單抗)且已患有HER2過表現轉移性乳癌且已接受廣泛先前抗癌療法之患者中顯示臨床有效。(Baselga等人,J.Clin.Oncol.14(1996)737-744)。曲妥珠單抗及其製備方法闡述於US 5,821,337中。
帕妥珠單抗(Pertuzumab)(Omnitarg®)係用於治療HER2陽性癌症之另一種重組人類化抗-HER2單株抗體。帕妥珠單抗特異性結合至2C4表位,一個在HER2之胞外結構域上與曲妥珠單抗不同之表位。帕妥珠單抗係新類型HER2二聚抑制劑(HDI)中之第一者。藉助其結合至HER2胞外結構域,帕妥珠單抗抑制HER2(與其他HER家族成員)之二聚化,由此抑制與腫瘤生長及進展相關聯之下游信號傳導途徑及細胞過程(Franklin,M.C.等人.Cancer Cell 5(2004)317-328及Friess,T等人,Clin Cancer Res 11(2005)5300-5309)。帕妥珠單抗係鼠科動物抗-HER2抗體2C4之重組人類化型式(稱為rhuMAb 2C4或帕妥珠單抗)且其與其各別製備方法一起闡述於WO 01/00245及WO 2006/007398中。
「表位2C4」係抗體2C4所結合之HER2之胞外結構域中之區。為篩選結合至2C4表位之抗體,可實施常規交叉阻斷分析,例如闡述於
「Ed.Harlow及David Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)」中者。另一選擇為,可實施表位映射以評價抗體是否結合至HER2之2C4表位(例如,在自HER2之約殘基22至約殘基584且包括殘基22及殘基584之區中之任一或多個殘基)。表位2C4包含來自HER2之胞外結構域中之結構域II之殘基。2C4及帕妥珠單抗在結構域I、II及III之接點處結合至HER2之胞外結構域。亦參見Franklin等人,Cancer Cell 5(2004)317-328。
人類HER1(亦稱為r Erb-B1或人類表皮生長因子受體(EGFR)(SEQ ID NO:19)係由c-erbB原致癌基因編碼之170kDa跨膜受體,並展現固有酪胺酸激酶活性(Modjtahedi,H.等人,Br.J.Cancer 73(1996)228-235;Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt數據庫登錄號P00533提供EGFR之序列。亦存在EGFR之亞型及變體(例如替代性RNA轉錄物、截短形式、多型態等),包括(但不限於)彼等由SwissProt數據庫登錄號P00533-1、P00533-2、P00533-3及P00533-4鑑別者。已知EGFR結合包括以下在內之配體:表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、雙調蛋白、肝素結合EGF(HB-EGF)、β細胞調節素及表皮調節素(Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611;Mendelsohn,J.及Baselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。EGFR經由酪胺酸激酶介導之信號轉導途徑調整許多細胞過程,包括(但不限於)控制細胞增殖、分化、細胞存活、細胞凋亡、血管形成、促有絲分裂及轉移之信號轉導途徑之激活(Atalay,G.等人,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363;Tsao,A.S.及Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9;Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611;Modjtahedi,H.等人,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。
HER1之過表現已在許多人類惡性病狀中報告,包括膀胱癌、
腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌及腎癌。(Atalay,G.等人,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363;Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611;Modjtahedi,H.等人,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。在許多該等病狀中,EGFR之過表現與患者之差預後有關係或與其相關聯。(Herbst R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611;Modjtahedi,H.等人,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。HER1亦在正常組織、尤其皮膚、肝臟及胃腸道之上皮組織之細胞中表現,儘管表現程度通常低於在惡性細胞中之表現(Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002),1593-1611)。
WO 2006/082515涉及衍生自大鼠單株抗體ICR62之人類化抗-EGFR單株抗體以及其用於癌症療法之糖基工程化形式。
本發明提供抗-HER3抗體與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體或與結合至HER1之抗體之組合療法,其中結合至人類HER1之抗體之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體之特徵進一步在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
在本發明之一個態樣中係結合至人類HER3之抗體,其與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合用於治療癌症,其中該癌症係HER2正常型癌症。
在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區或SEQ ID NO:7之CDR1L區。
在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為重鏈可變結構域,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
在一個實施例中,上文所述結合至人類HER3之抗體之特徵進一步在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
在一個實施例中,結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體係帕妥珠單抗。
在一個實施例中,癌症之特徵在於HER3表現。
在一個實施例中,癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或頭頸癌乳癌。
令人驚訝地,已發現上文所述抗-HER3抗體與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體之組合療法顯示強的HER2正常表現癌症之腫瘤生長抑制,甚至在結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體當單獨投與時僅顯示低至中等腫瘤生長抑制之腫瘤中。
本發明之另一態樣係結合至人類HER3之抗體,其與結合至人類HER1之抗體組合用於治療癌症,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體中之至少一者之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體及結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
在一個實施例中,結合至人類HER3之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
在一個實施例中,結合至人類HER1之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:20;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:21。
在一個實施例中,該癌症之特徵在於HER3表現。
在一個實施例中,該癌症之特徵進一步在於HER1表現。
在一個實施例中,該癌症係肺癌或乳癌、結腸直腸癌或頭頸癌(在一個實施例中,特徵在於HER3及HER1表現)。
令人驚訝地,已發現抗-HER3抗體上文所述與結合至人類HER1之抗體之組合療法顯示強的腫瘤生長抑制,甚至在結合至人類HER1之抗體當單獨投與時僅顯示低至中等腫瘤生長抑制之腫瘤中,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體中之至少一者之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
圖1A及1B:在不同濃度下在MCF7細胞中抗-HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)。
圖1C 在不同濃度下在Mel-Juso細胞中抗-HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)。
圖2 利用Mab 205(10mg/kg q7dx3,i.p.)進行治療使得頭頸癌FaDu SCCHN經移植之異種移植物之腫瘤停滯。
圖3 利用Mab 205(10mg/kg q7d,i.p.)進行治療使得HER2正常之MAXF449乳癌經移植之異種移植物之腫瘤停滯。
圖4 利用Mab 205(25mg/kg q7d,i.p.)進行治療使得7177 NSCLC經移植之異種移植物之腫瘤停滯。
圖5 利用Mab 205.10.2與帕妥珠單抗組合治療HER2正常乳癌細胞ZR-75-1異種移植物使腫瘤生長抑制。
圖6 RG7116在具有BxPC3人類胰腺癌皮下異種移植物之SCID灰棕色小鼠中(n=10/組)中之活體內效能。(A)小鼠在第24天開始每週五次i.p.用多個劑量之RG7116進行治療並藉由卡尺量測腫瘤大小。0.3mg/kg及以上之RG7116高度有效且顯著抑制腫瘤生長。在第56天將小鼠殺死並藉由西方墨點法(Western blotting)檢查外植腫瘤組織之HER3及pHER3之表現(B)及藉由免疫組織化學檢查HER3表現(C)。有效劑量之RG7116抑制HER3磷酸化且下調膜HER3含量。
圖7 由HER3信號抑制介導之腫瘤生長抑制。(A)在SCID灰棕色或Balb/c裸小鼠(n=10/組)中建立NSCLC細胞系或源自患者之腫瘤組織片段作為s.c.異種移植物並每週4-6次以多個劑量之RG7116(10-25mg/kg)進行治療。在顯示為黑色條(包括在一半所檢查之異種移植物模型中完全消退)之鱗狀肺模型中及顯示為灰色條(*指示c-Met高度過表現模型,†指示KRAS-突變體模型)之腺癌模型中看到實質TGI。(B)源自患者之鱗狀上皮腫瘤異種移植物(LXFE772)中之一者之時程,其中利用22mg/kg RG7116之6個循環達成完全消退。在第95天檢測不到腫瘤。RG7116與其他抗-HER抗體組合增強效能。當RG7116在s.c.頭頸異種移植物模型(FaDu細胞;圖7C)中與GA201(糖基工程化抗-HER1抗體(EGFR))組合且在s.c.源自患者之乳癌腫瘤異種移植物模型
MAXF 449(圖7D)中與帕妥珠單抗(抗-HER2)時,達成完全腫瘤衰退。
本發明包含結合至人類HER3之抗體,其特徵在於重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區或SEQ ID NO:7之CDR1L區,其用於本文所述之組合療法中。
本發明進一步包含根據本發明之抗體,其特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11;或其人類化型式,其用於本文所述之組合療法中。
本發明進一步包含根據本發明之抗體,其特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11,其用於本文所述之組合療法中。
在一個實施例中,根據本發明之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區,其用於本文所述之組合療法中。
在一個實施例中,根據本發明之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11,其用於本文所述之組合療法中。
在一個實施例中,根據本發明之抗體之特徵在於包含SEQ ID
NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區,其用於本文所述之組合療法中。
在一個實施例中,根據本發明之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10,其用於本文所述之組合療法中。
在一個實施例中,該抗體係單株抗體。在一個實施例中,該抗體係人類化或人類抗體。在一個實施例中,該抗體係IgG1或IgG4亞類。在一個實施例中,該抗體係IgG1亞類之單株人類化抗體。在一個實施例中,該抗體之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
本發明包含具有其各別VH及VL或CDR之人類化抗體Mab 205.10.1、Mab 205.10.2及Mab 205.10.3,其用於本文所述之組合療法中。
在一個實施例中,該等抗體包含人類來源(例如SEQ ID NO:12-16、較佳地SEQ ID NO:12-13)之恆定區。
術語「抗體」涵蓋各種形式之抗體結構,包括(但不限於)全抗體及抗體片段。本發明之抗體較佳為人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或進一步經基因改造之抗體,只要保持本發明之特性即可。
「抗體片段」包含全長抗體之一部分、較佳其可變結構域或至少其抗原結合位點。抗體片段之實例包括自抗體片段形成之雙抗體(diabody)、單鏈抗體分子及多特異性抗體。scFv抗體闡述於(例如)Huston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-88中。另外,抗體片段包含單鏈多肽,其具有VH結構域之特徵,即能夠與VL結構域一起組裝;或具有結合至各別抗原之VL結構域之特徵,即能夠與VH結構域一起組裝成功能性抗原結合位點且藉此提供本發明抗體之性質。
本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。
術語「嵌合抗體」係指包含來自小鼠之可變區(即,結合區)及至少一部分源自不同來源或物種之恆定區之單株抗體,其通常係藉由重組DNA技術來製備。包含小鼠可變區及人類恆定區之嵌合抗體尤其佳。該等小鼠/人類嵌合抗體係所表現免疫球蛋白基因之產物,該等基因包含編碼大鼠免疫球蛋白可變區之DNA片段及編碼人類免疫球蛋白恆定區之DNA片段。本發明所涵蓋之其他形式「嵌合抗體」係彼等類別或亞類相對於原始抗體經修飾或改變者。該等「嵌合」抗體亦稱為「類別轉換抗體」。產生嵌合抗體之方法涉及現已為熟習此項技術者所熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如,參見Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855;US 5,202,238及US 5,204,244。
術語「人類化抗體」或「抗體之人類化型式」係指框架區或
「互補決定區」(CDR)經修飾以包含與親代免疫球蛋白相比具有不同特異性之免疫球蛋白CDR之抗體。在較佳實施例中,將VH及VL之CDR接枝於人類抗體之框架區以製備「人類化抗體」。參見例如,Riechmann,L.等人,Nature 332(1988)323-327;及Neuberger,M.S.等人,Nature 314(1985)268-270。重鏈及輕鏈可變框架區可源自相同或不同的人類抗體序列。人類抗體序列可為天然存在之人類抗體之序列。人類重鏈及輕鏈可變框架區列示於(例如)Lefranc,M.-P.,Current Protocols in Immunology(2000)-Appendix 1P A.1P.1-A.1P.37中且可經由IMGT,the international ImMunoGeneTics information system®(http://imgt.cines.fr)或經由http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk獲得。視情況,框架區可藉由其他突變來修飾。尤其佳之CDR對應於識別以上針對嵌合抗體所提及抗原之代表性序列。較佳地,該人類化型式係與人類恆定區(參見例如,序列SEQ ID NO:12-16)嵌合。本文所用術語「人類化抗體」亦包含在恆定區中經修飾以產生本發明之性質之該等抗體,尤其關於C1q結合及/或FcR結合,藉由(例如)「類別轉換」,即,改變Fc部分或使其突變(例如,自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變)。
本文所用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體已為當前業內所熟知(van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人類抗體亦可在當進行免疫時能夠在不產生內源性免疫球蛋白之情況下產生人類抗體之所有族群或選擇之轉基因動物(例如,小鼠)中產生。人類生殖細胞系免疫球蛋白基因陣列該等生殖細胞系突變小鼠中之轉移在抗原挑戰時將導致產生人類抗體(參見例如,Jakobovits,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555;Jakobovits,A.等人,Nature 362(1993)255-258;Brueggemann,
M.D.等人,YearImmunol.7(1993)33-40)。人類抗體亦可在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom,H.R.及Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388;Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole,A.等人及Boerner,P.等人之技術亦可用於製備人類單株抗體(Cole,A.等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Liss,A.L.,p.77(1985);及Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。如已針對根據本發明之人類化抗體所提及,本文所用術語「人類抗體」亦包含在恆定區中經修飾以產生本發明之性質之該等抗體,尤其關於C1q結合及/或FcR結合,藉由(例如)「類別轉換」,即,改變Fc部分或使其突變(例如,自IgG1至IgG4及/或IgG1/IgG4突變)。
本文所用術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體,例如自諸如NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)分離之抗體或使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈重排形式之可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已進行活體內體細胞超突變。因此,儘管重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係源自人類生殖細胞系VH及VL序列之序列,但可能並非天然存在於活體內人類抗體生殖細胞系族群中。
如本文所用,術語「其結合至人類HER3」、「其特異性結合至人類HER3」或「抗-HER3抗體」可互換且係指以在25℃下KD值為1.0×10-8mol/l或更低、在一個實施例中在25℃下KD值為1.0×10-9mol/l或更低之結合親和力特異性結合至人類HER3抗原之抗體。結合親和力係利用標準結合分析在25℃下測定,例如表面電漿共振技術(BIAcore®,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)。測定結合親和力之KD值之方法闡述於實例2b中。因此,本文所用之「結合至人類HER3之抗體」係指以在25℃下KD為1.0×10-8mol/l或更低(在一個實施例中,
KD為1.0×10-8mol/l至1.0×10-13mol/l)之結合親和力特異性結合至人類HER3抗原之抗體。
如本文所用,術語「其結合至人類HER2」、「其特異性結合至人類HER2」或「抗-HER2抗體」可互換且係指以在25℃下KD值為1.0×10-8mol/l或更低、在一個實施例中在25℃下KD值為1.0×10-9mol/l或更低之結合親和力特異性結合至人類HER2抗原之抗體。結合親和力係利用標準結合分析在25℃下測定,例如表面電漿共振技術(BIAcore®,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)。測定結合親和力之KD值之方法闡述於實例2b中。因此,本文所用之「結合至人類HER2之抗體」係指以在25℃下KD為1.0×10-8mol/l或更低(在一個實施例中,KD為1.0×10-8mol/l至1.0×10-13mol/l)之結合親和力特異性結合至人類HER2抗原之抗體。
細胞表面上HER受體之配對稱為二聚。HER2與HER家族之其他成員(包括HER1、HER3及HER4)二聚;據信HER2:HER3二聚產生最強促有絲分裂信號傳導並激活調整細胞存活及生長之2個關鍵途徑(促有絲分裂激活之蛋白質激酶(MAPK)途徑及磷酸肌醇3-激酶(PI3K)途徑)。如本文所用,術語「結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體」係指特異性結合至人類HER2抗原且抑制/阻斷HER2與HER1、HER3及HER4之配體依賴性異源二聚體化、且尤其抑制HER2/HER3二聚之抗-HER2抗體(參見例如PERJETA Prescribing Information.Genentech公司,2012年6月.Baselga J等人;N Engl J Med.2012;366:109-119;Baselga J等人Nat Rev Cancer.2009;9:463-475;Hynes NE等人Nat Rev Cancer.2005;5:341-354;Yarden Y等人,Nat Rev Mol Cell Biol.2001;2:127-137;Hsieh AC等人,Br J Cancer.2007;97:453-457;Soltoff SP等人,Mol Cell Biol.1994;14:3550-3558)。抑制HER2二聚之該等抗-HER2抗體之實例闡述於(例如)WO
01/00245及WO 2006/007398中,其中闡述帕妥珠單抗(稱為rhuMAb 2C4或帕妥珠單抗)作為一個實例。
如本文所用,術語「其結合至人類HER1」、「其特異性結合至人類HER1」或「抗-HER1抗體」可互換且係指以在25℃下KD值為1.0×10-8mol/l或更低、在一個實施例中在25℃下KD值為1.0×10-9mol/l或更低之結合親和力特異性結合至人類HER1抗原之抗體。結合親和力係利用標準結合分析在25℃下測定,例如表面電漿共振技術(BIAcore®,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)。測定結合親和力之KD值之方法闡述於實例2b中。因此,本文所用之「結合至人類HER2之抗體」係指以在25℃下KD為1.0×10-8mol/l或更低(在一個實施例中,KD為1.0×10-8mol/l至1.0×10-13mol/l)之結合親和力特異性結合至人類HER2抗原之抗體。
人類HER3(ErbB-3、ERBB3、c-erbB-3、c-erbB3、受體酪胺酸蛋白激酶erbB-3、SEQ ID NO:17,包括信號肽)編碼受體酪胺酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)家族的成員,其亦包括HER1(亦稱為EGFR)、HER2及HER4(Kraus,M.H.等人,PNAS 86(1989),9193-9197;Plowman,G.D.等人,PNAS 87(1990),4905-4909;Kraus,M.H.等人,PNAS 90(1993),2900-2904)。如同典型表皮生長因子受體一樣,跨膜受體HER3係由胞外配體結合結構域(ECD)、ECD內之二聚體化結構域、跨膜結構域、胞內蛋白質酪胺酸激酶結構域(TKD)及C-末端磷酸化結構域組成。此膜結合蛋白具有在胞外結構域內但非活性激酶結構域內之HER3 a神經生長因子(HRG)結合結構域。因此,其可結合此配體,但不能藉助蛋白質磷酸化將信號傳送至細胞中。然而,其與具有激酶活性之其他HER家族成員形成異源二聚體。異源二聚體化導致受體介導之信號傳導途徑之激活及其胞內結構域之反式磷酸化。HER家族成員之間之二聚體形成擴展HER3之信號轉導潛力且係用於
信號多樣化以及信號放大之方式。舉例而言,HER2/HER3異源二聚體經由HER家族成員之間之PI3K及AKT途徑誘導最重要促有絲分裂信號中之一者(Sliwkowski,M.X.等人,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665;Alimandi,M.等人,Oncogene 10(1995)1813-1821;Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-421561;Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274;Schaefer,K.L.,Neoplasia 8(2006)613-622)。
HER3抗體Mab205.10.1、Mab205.10.2及Mab205.10.3顯示與配體神經生長因子(HRG)競爭結合至HER3。
已在許多癌症(包括前列腺腫瘤、膀胱腫瘤及乳房腫瘤)中報告此基因之表現及/或其蛋白質之表現。已經表徵編碼不同亞型之交替轉錄剪接變體。一種亞型缺少膜間區且係在細胞外部分泌。此形式用於調節膜結合形式之活性。亦已報告其他剪接變體,但該等尚未經充分表徵。
根據本發明,術語「人類HER2」係指185-kDa生長因子受體,其亦稱為neu及c-erbB-2(Slamon等人,Science 235(1987)177-182;Swiss-Prot P04626;SEQ ID NO:18,包括信號肽),其功能涉及人類乳癌細胞中之腫瘤性轉化。HER受體通常將包含胞外結構域,其可結合HER配體;親脂性跨膜結構域、保守之胞內酪胺酸激酶結構域及具有若干可經磷酸化之酪胺酸殘基之羧基末端信號傳導結構域。HER2之胞外結構域包含四個結構域,即結構域I(自約1至195之胺基酸殘基)、結構域II(自約196至320之胺基酸殘基)、結構域III(自約321至488之胺基酸殘基)及結構域IV(自約489至632之胺基酸殘基)(殘基編號沒有信號肽)。參見Garrett等人,Mol.Cell.11(2003)495-505,Cho等人,Nature 421(2003)756-760,Franklin等人,Cancer Cell 5(2004)317-328或Plowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.90(1993)1746-1750及
WO 2006/007398。
帕妥珠單抗(Omnitarg®)係用於治療HER2陽性癌症之另一重組人類化抗-HER2單株抗體。帕妥珠單抗特異性結合至2C4表位,一個在HER2之胞外結構域上與曲妥珠單抗不同之表位。帕妥珠單抗係新類型HER二聚抑制劑(HDI)中之第一者。藉助其結合至HER2胞外結構域,帕妥珠單抗抑制HER2之二聚(尤其與其他HER家族成員之配體激活之異源二聚體化),由此抑制與腫瘤生長及進展相關聯之下游信號傳導途徑及細胞過程(Franklin,M.C.等人.Cancer Cell 5(2004)317-328及Friess,T等人,Clin Cancer Res 11(2005)5300-5309)。帕妥珠單抗係鼠科動物抗-HER2抗體2C4之重組人類化型式(稱為rhuMAb 2C4或帕妥珠單抗)且其與其各別製備方法一起闡述於WO 01/00245及WO 2006/007398中。
「表位2C4」係抗體2C4所結合之HER2之胞外結構域中之區。為篩選結合至2C4表位之抗體,可實施常規交叉阻斷分析,例如闡述於「Ed.Harlow及David Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)」中者。另一選擇為,可實施表位映射以評價抗體是否結合至HER2之2C4表位(例如,在自HER2之約殘基22至約殘基584且包括殘基22及殘基584之區中之任一或多個殘基)。表位2C4包含來自HER2之胞外結構域中之結構域II之殘基。2C4及帕妥珠單抗在結構域I、II及III之接點處結合至HER2之胞外結構域。亦參見Franklin等人,Cancer Cell 5(2004)317-328。
術語「人類HER1」(亦稱為r Erb-B1或人類表皮生長因子受體(EGFR)(SEQ ID NO:19,包括信號肽)係由c-erbB原致癌基因編碼之170kDa跨膜受體,並展現固有酪胺酸激酶活性(Modjtahedi,H.等人,Br.J.Cancer 73(1996)228-235;Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611)。SwissProt數據庫登錄號P00533提供EGFR之序
列。亦存在HER1之亞型及變體(例如替代性RNA轉錄物、截短形式、多型態等),包括(但不限於)彼等由SwissProt數據庫登錄號P00533-1、P00533-2、P00533-3及P00533-4鑑別者。已知HER1結合包括以下在內之配體:表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、雙調蛋白、肝素結合EGF(HB-EGF)、β細胞調節素及表皮調節素(Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611;Mendelsohn,J.及Baselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。HER1經由酪胺酸激酶介導之信號轉導途徑調整許多細胞過程,包括(但不限於)控制細胞增殖、分化、細胞存活、細胞凋亡、血管形成、促有絲分裂及轉移之信號轉導途徑之激活(Atalay,G.等人,Ann.Oncology 14(2003)1346-1363;Tsao,A.S.及Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9;Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611;Modjtahedi,H.等人,Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。
WO 2006/082515涉及源自大鼠單株抗體ICR62之人類化抗-HER1單株抗體以及其糖用於癌症療法之基工程化形式。源自大鼠單株抗體ICR62之該等人類化糖基工程化抗體之一個實例係GA201(闡述於WO 2006/082515中)。GA201係糖基工程化抗-HER1抗體,其特徵在於包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列(重鏈可變結構域VH,人類化<EGFR>ICR62-I-HHD)作為重鏈可變結構域VH及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列(輕鏈可變結構域VL,人類化<EGFR>ICR62-I-KC)作為輕鏈可變結構域VL且進一步特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
術語「表位」包括能夠特異性結合至抗體之任一多肽決定簇。在某些實施例中,表位決定簇包括分子之化學活性表面基團(例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基),且在某些實施例中可具有特異性三維結構特性及/或特異性電荷特性。表位係抗原由抗體結合之區。
本文所用之「本發明抗體之可變結構域」(輕鏈可變結構域(VL)、重鏈可變區(VH))表示直接參與抗體至抗原之結合的輕鏈及重鏈結構域對中之每一者。輕鏈及重鏈可變結構域具有相同的一般結構,且每一結構域包含四個序列高度保守之框架區(FR),其經由三個「超變區」(或互補決定區,CDR)連接。框架區採用β-板狀構象且CDR可形成連結β-板狀結構之環。每一鏈中之CDR藉由框架區保持其三維結構並與另一鏈中之CDR一起形成抗原結合位點。抗體之重鏈及輕鏈CDR3區在本發明抗體之結合特異性/親和力方面具有特別重要之作用,且由此提供本發明之又一目的。
術語「抗體之抗原結合部分」在用於本文中時係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。抗體之抗原結合部分包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。術語本發明抗體之「抗原結合部分」含有六個以不同程度有助於結合位點對抗原之親和力之互補決定區(CDR)。存在三個重鏈可變結構域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及三個輕鏈可變結構域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。術語「CDRH1」表示根據Kabat計算之重鏈可變區的CDR1區。CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及CDRL3意味著來自重鏈(H)或輕鏈(L)之各別區。CDR及框架區(FR)之範圍係藉由與胺基酸序列之編譯數據庫相比較來確定,其中該等區已根據序列間之可變性根據Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)定義。
抗體之「Fc部分」並不直接參與抗體至抗原之結合,但展現各種效應子功能。「抗體之Fc部分」係熟悉此項技術者熟知且基於抗體之木瓜蛋白酶溶解定義之術語。視其重鏈之恆定區的胺基酸序列而定,抗體或免疫球蛋白分為以下類型:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM,且該等中之若干可進一步分成亞類(亞型),例如,IgG1、IgG2、
IgG3、及IgG4、IgA1及IgA2。根據重鏈恆定區,免疫球蛋白之該等不同類型分別稱為α、β、ε、γ及μ。抗體之Fc部分基於補體激活、C1q結合及Fc受體結合直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC(補體依賴性細胞毒性)。術語「補體依賴性細胞毒性(CDC)」表示由補體因子C1q結合至大多數IgG抗體亞類之Fc部分引發之過程。C1q至抗體之結合係藉由在所謂的結合位點之經定義蛋白質-蛋白質相互作用引起的。該等結合位點已為此項技術習知且已由(例如)Boackle,R.J.等人,Nature 282(1979)742-743,Lukas,T.J.等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560,Brunhouse,R.及Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917,Burton,D.R.等人,Nature 288(1980)338-344,Thommesen,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004,Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184,Hezareh,M.等人,J.Virology 75(2001)12161-12168,Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324,EP 0 307 434闡述。該等結合位點係(例如)L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat編號之EU索引,E.A.,參見下文)。亞類IgG1、IgG2及IgG3之抗體通常展示補體激活及C1q及C3結合,而IgG4並不激活補體系統且不會結合C1q及C3。
在一個實施例中,根據本發明之抗體包含源自人類來源之Fc部分且較佳地人類恆定區之所有其他部分。如本文所用,術語「源自人類來源之Fc部分」表示為亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之人類抗體之Fc部分的Fc部分,例如,來自人類IgG1亞類之Fc部分、來自人類IgG1亞類之突變Fc部分(較佳地在L234A+L235A上具有突變)、來自人類IgG4亞類之Fc部分或來自人類IgG4亞類之突變Fc部分(較佳地在S228P上具有突變)。較佳者係SEQ ID NO:13(人類IgG1亞類)、SEQ ID NO:14(具有突變L234A及L235A之人類IgG1亞類)之人類重鏈恆定
區。
在一個實施例中,根據本發明之抗體係人類IgG1亞類或人類IgG3亞類。在一個實施例中,根據本發明之抗體係人類IgG1亞類。
在一個實施例中,根據本發明之抗體之特徵在於恆定鏈具有人類來源。該等恆定鏈已為此項技術熟知且(例如)由Kabat,E.A.闡述(參見例如,Johnson,G.及Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。舉例而言,有用之人類重鏈恆定區包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列。舉例而言,有用之人類輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:12之κ-輕鏈恆定區之胺基酸序列。
本申請案內所用之術語「胺基酸」表示天然存在之羧基α-胺基酸群,其包含丙胺酸(三字母代碼:ala,單字母代碼:A)、精胺酸(arg,R)、天冬醯胺(asn,N)、天冬胺酸(asp,D)、半胱胺酸(cys,C)、麩胺醯胺(gln,Q)、麩胺酸(glu,E)、甘胺酸(gly,G)、組胺酸(his,H)、異白胺酸(ile,I)、白胺酸(leu,L)、離胺酸(lys,K)、甲硫胺酸(met,M)、苯丙胺酸(phe,F)、脯胺酸(pro,P)、絲胺酸(ser,S)、蘇胺酸(thr,T)、色胺酸(trp,W)、酪胺酸(tyr,Y)及纈胺酸(val,V)。
本文所用術語「核酸」或「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈DNA,但較佳為雙鏈DNA。當核酸與另一核酸具有功能性關係時,該核酸係「可操作連接」。舉例而言,若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白,則該前序列或分泌前導序列之DNA可操作連接至該多肽之DNA;若啟動子或增強子可影響編碼序列之轉錄,則該啟動子或增強子可操作連接至該編碼序列;或若核糖體結合位點之定位有助於轉譯,則該核糖體結合位點可操作連接至該編碼序列。通常,「可操作連接」意指所連接DNA序列共線,且在分泌前導序列情況下鄰接且位於閱讀框內。然而,增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接合
可完成連接。若不存在該等位點,則根據習用慣例使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。如本文所用,表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用,且所有該等名稱皆包括子代。因此,詞語「轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物,而不考慮轉移次數。亦應瞭解,所有子代之DNA含量可能由於有意或無意突變而不精確地相同。包括最初轉化細胞中經篩選具有相同功能或生物活性之變體子代。
本文所述之抗-HER3抗體之特徵較佳在於恆定鏈係人類來源。該等恆定鏈已為此項技術熟知並由(例如)Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)闡述。舉例而言,有用之人類輕鏈恆定區包含SEQ ID NO:12之κ-輕鏈恆定區之胺基酸序列。舉例而言,有用之人類重鏈恆定區包含SEQ ID NO:13至16。
在另一態樣中,提供用於各別組合療法之抗-HER3抗體,其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一個實施例中,抗體分別包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:10中之VH及VL序列;且具有一或多個以下性質(在如實例3及2中所述之分析中測定):
- 抗-HER3抗體抑制腫瘤細胞中HER3磷酸化,例如MCF7細胞、FaDu細胞或Mel-Juso細胞(在一個實施例中,抗-HER3抗體在1.0μg/ml之濃度下展示抑制MCF7細胞中HER3磷酸化達至少80%(在一個實施例中,至少90%);在一個實施例中,抗-HER3抗體在0.1μg/ml之濃度下展示抑制FaDu細胞中HER3磷酸化達至少80%(在一個實施例中,至少90%);在一個實施例中,抗-HER3抗體在0.1μg/ml之濃度下展示抑制Mel-Juso細胞中HER3磷酸化達至少60%(在一個實施例中,至少70%))
- 抗-HER3抗體抑制腫瘤細胞(例如Mel-Juso細胞)中AKT磷酸化(在一個實施例中,抗-HER3抗體以小於0.50μg/ml之IC50值、在一個實施例中以小於0.35μg/ml之IC50值抑制Mel-Juso細胞中AKT磷酸化)
- 抗-HER3抗體抑制腫瘤細胞(例如MDA-MB-175細胞)之增殖(在一個實施例中,抗-HER3抗體以小於10μg/ml之IC50值抑制MDA-MB-175細胞之增殖)
- 抗-HER3抗體以小於5.0×10-9M之KD值、在一個實施例中小於3.0×10-9M之KD值結合至HER3。
在另一態樣中,用於各別組合療法之抗-HER3抗體係雙特異性抗-HER3/抗-HER1抗體,如US 2010/0255010中所闡述。在一個實施例中,雙特異性抗-HER3/抗-HER1抗體之特徵在於包含US 2010/0255010中所揭示之特有的胺基酸序列,即A)(a)包含胺基酸序列LSGDWIH之HVR-H1;(b)包含胺基酸序列VGEISAAGGYTD之HVR-H2;及(c)包含胺基酸序列ARESRVSFEAAMDY之HVR-H3;及(d)包含胺基酸序列NIATDVA之HVR-L1;(e)包含胺基酸序列SASF之HVR-L2;及(f)包含胺基酸序列SEPEPYT之HVR-L3,或B)(a)具有US2010/0255010中所揭示之SEQ ID NO:30之胺基酸序列之重鏈可變結構域;(b)具有US2010/0255010中所揭示之SEQ ID NO:29之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。
術語「抗體依賴性細胞毒性(ADCC)」係指在效應細胞之存在下人類靶細胞由根據本發明之抗體溶解。ADCC較佳地係在效應細胞(例如新分離的PBMC或來自膚色血球層之經純化效應細胞,如單核細胞或天然殺手(NK)細胞或永久生長之NK細胞系)之存在下藉由用根據本發明之抗體處理表現HER3之細胞之製劑來量測。
細胞介導之效應子功能(例如單株抗體之ADCC)可藉由工程化其寡糖組份來增強,如Umana,P.等人,Nature Biotechnol.17(1999)
176-180及US 6,602,684中所闡述。IgG1型抗體(最常用之治療性抗體)係在每一CH2結構域中在Asn297處具有保守N連接糖基化位點之糖蛋白。附接至Asn297之兩種複雜二支鏈寡糖包埋於CH2結構域之間,與多肽骨架形成廣泛接觸,且其存在對於抗體介導諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)等效應子功能是必需的(Lifely,M.R.等人,Glycobiology 5(1995)813-822;Jefferis,R.等人,Immunol.Rev.163(1998)59-76;Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15(1997)26-32)。Umana,P.等人,Nature Biotechnol.17(1999)176-180及WO 99/54342顯示,在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中β(1,4)-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(「GnTIII」)(一種催化形成二等分型(bisected)寡糖之糖基轉移酶)之過表現顯著增加抗體之活體外ADCC活性。Asn297碳水化合物組成中之改變或其消除亦影響至FcγR及C1q之結合(Umana,P.等人,Nature Biotechnol.17(1999)176-180;Davies,J.等人,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294;Mimura,Y.等人,J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547;Radaev,S.等人,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483;Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604;Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740;Simmons,L.C.等人,J.Immunol.Methods 263(2002)133-147)。
經由糖基工程化增強單株抗體之細胞介導之效應子功能已報告於(例如)WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO2007/031875、Umana,P.等人,Nature Biotechnol.17(1999)176-180、WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835及WO 2000/061739中或於(例如)Niwa,R.等人,J.Immunol.Methods 306(2005)151-160;Shinkawa,T.
等人,J Biol Chem,278(2003)3466-3473;WO 03/055993及US 2005/0249722中。
在本發明之一個實施例中,根據本發明之抗體經非岩藻糖基化,此意味著抗體在Asn297處經糖鏈糖基化(若其包含IgG1或IgG3亞類之Fc部分),藉此該糖鏈中岩藻糖之量為80%或更低(根據Kabat編號),例如,介於80%與1%之間。在另一實施例中,該糖鏈內岩藻糖之量為65%或更低,在一個實施例中介於5%與65%之間,在一個實施例中自0%至65%,且在一個實施例中,該糖鏈內岩藻糖之量為0%。該等抗體在下文中稱為「非岩藻糖基化抗體(afucosylated antibody或non-fucosylated antibody)」。該等非岩藻糖基化抗體顯示增強之ADCC,同時其他抗體性質保持實質上不受影響。
在其他實施例中,N-羥乙醯基神經胺酸(NGNA)在該糖鏈內之量為1%或更低及/或N-末端α-1,3-半乳糖之量為1%或更低。糖鏈較佳地顯示附接至以重組方式於CHO細胞中表現之抗體之Asn297之N-連接聚糖的特性。
根據本發明,「Asn297」意指位於Fc區中大約位置297處之胺基酸天冬醯胺。基於抗體之微小序列變化,Asn297亦可位於位置297之上游或下游一些胺基酸處(通常不超過±3個胺基酸),即,在位置294與300之間。
術語「糖鏈顯示附接至以重組方式於CHO細胞中表現之抗體之Asn297之N-連接聚糖的特性」表示根據本發明之抗體在全長母體之Asn297處之糖鏈除岩藻糖殘基以外具有與在未經修飾之CHO細胞中表現之相同抗體(例如,如彼等WO 2006/103100中所報告者)相同結構及糖殘基序列。
如本申請案中所用,術語「NGNA」表示糖殘基N-羥乙醯基-神經胺酸。
人類IgG1或IgG3之糖基化發生在Asn297處,其作為核心岩藻糖基化二支鏈複雜寡糖糖基化,末端為最多2個Gal殘基。IgG1或IgG3亞類之人類恆定重鏈區詳細報告於Kabat,E.,A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)及Brueggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361;Love,T.W.等人,Methods Enzymol.178(1989)515-527中。該等結構端視末端Gal殘基數表示為G0、G1(α-1,6-或α-1,3-)或G2聚糖殘基(Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗體Fc部分之CHO型糖基化闡述於(例如)Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207中。以重組方式在未經糖基修飾之CHO宿主細胞中表現之抗體通常在Asn297處以至少85%之量經岩藻糖基化。全長母體抗體之經修飾寡糖可為雜合物或複合物。較佳地,二等分型、減小/非岩藻糖基化寡糖係雜合物。在另一實施例中,二等分型、減小/非岩藻糖基化寡糖係複合物。
根據本發明,「岩藻糖之量」意指該糖在糖鏈內在Asn297處之量,其係相對於附接至Asn297之所有糖基結構(例如,複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和且藉由MALDI-TOF質譜(例如,在LC/MS系統中)量測並計算為平均值(參見例如WO 2008/077546)。岩藻糖之相對量係藉由MALDI-TOF含岩藻糖結構相對於在經N-糖苷酶F處理試樣中鑑別之所有糖基結構(例如分別,複雜、雜合及寡-及高甘露糖結構)之百分數。
本發明之抗體較佳係藉由重組方式來產生。該等方法已在此項技術領域中廣泛熟知且包含於原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後分離抗體多肽且通常將其純化至醫藥上可接受之純度。就蛋白質表現而言,藉由標準方法將編碼輕鏈及重鏈或其片段之核酸插入表現載體中。在適宜原核或真核宿主細胞(例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細
胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞)中進行表現,且自該等細胞(上清液或細胞溶解後)回收抗體。抗體之重組產生已為此項技術所熟知且闡述於(例如)以下綜述文章中:Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。該等抗體可存在於完整細胞中,存在於細胞溶解物中,或以部分純化或基本純淨之形式存在。藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組份或其他污染物,例如其他細胞核酸或蛋白質,該等標準技術包括管柱層析及此項技術熟知之其他方法(參見Ausubel,F.等人編輯之Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York (1987))。在NS0細胞中之表現闡述於(例如)以下文獻中:Barnes,L.M.等人,Cytotechnology 32(2000)109-123;Barnes,L.M.等人,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬時表現闡述於(例如)Durocher,Y.等人,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可變結構域之選殖闡述於以下文獻中:Orlandi,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837;Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289;Norderhaug,L.等人,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。較佳瞬時表現系統(HEK 293)闡述於Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.於Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger,E.-J.於J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中。藉由習用免疫球蛋白純化程序適當自培養基分離單株抗體,該等純化程序系(例如)蛋白質A-瓊脂糖法、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序容易地分離及測序。可使用雜交瘤細胞作為此DNA及RNA之來源。分離後,可將DNA立即插入表現載體中,隨後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如HEK 293細胞、
CHO細胞或骨髓瘤細胞)中,以在宿主細胞中實現重組單株抗體之合成。可自該等細胞系獲得之抗體系本發明之較佳實施例。非岩藻糖基化抗體較佳地如上所述經由糖基工程化來製備。
將本發明之重鏈及輕鏈可變結構域與啟動子、轉譯起始、恆定區、3'非轉譯區、聚腺苷酸化及轉錄終止之序列組合以形成表現載體構建體。可將重鏈及輕鏈表現構建體組合成單一載體,共轉染、連續轉染或單獨轉染至宿主細胞中,隨後融合以形成表現兩條鏈之單一宿主細胞。
在本發明之一個態樣中,組合之抗體係作為包含各別抗體之醫藥組合物投與。在另一態樣中,本發明提供組合物,例如,含有與醫藥載劑一起調配之本發明之抗體之醫藥組合物。
如本文所用,「醫藥載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗覆劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及生理上相容之類似試劑。較佳地,載劑適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如,藉由注射或輸注)。
本發明之組合物可藉由此項技術中熟知之多種方法投與。如熟習此項技術者應瞭解,投藥途徑及/或方式應視所期望結果而變化。為藉由某些途徑投與本發明化合物,可能需要用材料包覆該化合物或與該化合物共投與以防止其失活。舉例而言,化合物可於適當載劑(例如脂質體)或稀釋劑中投與給個體。醫藥上可接受之稀釋劑包括生理鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。該等介質及試劑用於醫藥活性物質之用途已為此項技術已知。
本文所用之片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」意指除經腸及局部投與以外之投與方式,通常係藉由注射且包含(但不限於)經靜脈內、經肌內、經動脈內、經鞘內、經莢膜內、經眼窩內、
經心臟內、經皮內、經腹膜腔內、經氣管、經皮下、經表皮下、經關節內、經囊下、經蛛網膜下、經脊柱內、經硬膜外及經胸骨內注射及輸注。
本文所用術語「癌症」可為(例如)肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、枝氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸直腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、淋巴瘤、淋巴球性白血病,包括任一上述癌症之難治型式或一或多種上述癌症之組合。
本發明之另一態樣係根據本發明之抗-HER3-抗體,其與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合用於治療癌症,其中該癌症係HER2正常型癌症。本發明之另一態樣係結合至人類HER3之抗體之用途,其用於製造用於與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合治療癌症之醫藥,其中該癌症係HER2正常型癌症。本發明之另一態樣係治療患有癌症之患者的方法,其藉由將根據本發明之抗-HER3抗體與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合投與給需要該治療之患者來實施,其中該癌症係HER2正常型癌症。在一個實施例中,a)該用於此組合之抗-HER3抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列作為VH及SEQ ID NO:10之胺基酸序列作為VL,b)該用於此組合之抗-HER2抗體係帕妥珠單抗,且c)該癌症係乳癌、
卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或頭頸癌(或在一個實施例中乳癌)。
本發明之另一態樣係本發明之抗-HER3抗體,其與結合至人類HER1之抗體組合用於治療癌症,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。本發明之另一態樣係結合至人類HER3之抗體之用途,其用於製造用於與結合至人類HER1之抗體組合治療癌症之醫藥,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。本發明之另一態樣係治療患有癌症之患者的方法,其藉由將根據本發明之抗-HER3抗體與結合至人類HER1之抗體組合投與給需要該治療之該患者來實施,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。在一個實施例中,a)用於此組合之抗-HER3抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列作為VH及SEQ ID NO:10之胺基酸序列作為VL,b)用於此組合之抗-HER1抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列作為VH及SEQ ID NO:21之胺基酸序列作為VL,及c)該癌症係肺癌、乳癌、結腸直腸癌或頭頸癌。
在本發明之一較佳實施例中,以上所提及之所有該癌症之特徵進一步在於HER3表現。HER3表現係指HER3蛋白質及/或基因表現(擴增)。HER3之表現位準可藉由免疫組織化學方法檢測,而該HER3基因擴增狀態可利用原位雜交方法(例如螢光原位雜交技術(FISH))來量測。用於蛋白質表現分析以及基因擴增之檢測之相應分析及套組已為此項技術熟知。另一選擇為,可使用其他方法(例如qRT-PCR)來檢測HER3基因表現之位準。HER3之表現位準尤其可藉由免疫組織化學方
法來檢測。該等方法已為此項技術熟知(參見例如,下文針對HER2表現位準之類似方法及測試)。
在一較佳實施例中,癌症之特徵在於高(增加)pHER3/HER3比率(藉由例如新鮮冷凍之腫瘤組織之IHC分析;在臨床前環境中,西方墨點標準SDS-PAGE及西方墨點法係使用磷光體-HER3抗體(α磷酸-HER3純系21D3[Tyr1289];Cell Signaling Technologies,編號4791)或抗-HER3抗體(αHER3純系C-17;Santa Cruz,編號sc-285)實施。例如,可使用電致化學發光(Amersham,RPN2209)檢測信號並測試針對每一濃度之HER3抗體計算之HER3受體磷酸化之抑制百分數。為分析腫瘤中之HER3磷酸化,製備腫瘤溶解物及等量(20μg/泳道)並在SDS PAGE上分離。HER3及磷酸化HER3(pHER3)之西方墨點法係如上實施。
在HER3抗體與抗-HER2抗體(該抗-HER2抗體抑制HER2二聚)之組合療法之上下文中,本文所用之術語「HER2正常型癌症」係指包含具有正常含量之HER2之癌細胞之癌症/腫瘤組織等,此意味著其不具有HER2過表現(如針對HER2陽性癌所定義),或其對於HER2表現不為陰性。出於本發明之目的,「HER2正常型癌症」之免疫組織化學(IHC)得分為2+且原位雜交(ISH)擴增比率<2.0(即,為ISH陰性)或免疫組織化學(IHC)得分為1+且原位雜交(ISH)擴增比率<2.0(即,為ISH陰性)。因此,若在自患者獲得之樣品(例如乳房組織活體組織切片或乳房組織切除片)或在源自轉移位點之組織中發現低(IHC 1+)或中等(IHC 2+)HER2(蛋白質)表現位準(藉由免疫組織化學方法檢測)且無HER2基因擴增(藉由原位雜交檢測)(ISH陰性,如HER2基因拷貝4個HER2基因拷貝/腫瘤細胞或HER2基因拷貝之數量對CEP17之信號之數量之比率<2.0),則呈現HER2正常型癌症。在一個實施例中,「HER2正常型癌症」定義為HER2(2+)之免疫組織化學(IHC)得分及ISH陰性
或HER2(1+)之免疫組織化學(IHC)得分且ISH陰性(IHC 1+/ISH陰性或IHC 2+/ISH陰性)。
HER2之表現位準可藉由免疫組織化學方法檢測,而該HER2基因擴增狀態可利用原位雜交方法(例如螢光原位雜交技術(FISH))來量測。用於蛋白質表現分析以及基因擴增之檢測之相應分析及套組已為此項技術熟知。另一選擇為,可使用其他方法(例如qRT-PCR)來檢測HER2基因表現之位準。
HER2之表現位準尤其可藉由免疫組織化學方法來檢測。該等方法已為此項技術熟知且可購得相應市售套組。根據本發明可使用之實例性套組尤其係由公司Dako生產及分配之HerceptTestTM或稱為Ventana PathwayTM之測試。HER2蛋白質表現之位準可藉由使用由HercepTestTM所提供之試劑及以下方案來評價。熟悉此項技術者應知道藉由免疫組織化學方法測定HER2之表現位準之其他方式及方法;參見例如WO 2005/117553。因此,HER2之表現位準可容易地且可再現地由熟悉此項技術者測定,而無過度負擔。然而,為確保精確及可再現之結果,測試必須在專門實驗室中進行,此可確保測試程序之確認。
HER2之表現位準可分為低表現位準、中等表現位準及高表現位準。在本發明之上下文中,較佳地HER2正常之疾病係由低或弱HER2之表現位準(例如,HER2(1+或2+),藉由IHC)及陰性ISH結果來定義,例如在癌症患者之樣品中所測定。因此,使用免疫組織化學及原位雜交之平行測試係較佳的。
用於評估乳癌中之IHC染色模式之推薦評分系統(其反應本文所表示之HER2之表現位準HER2(0)、HER2(+)、HER2(++)及HER2(+++))係如下:
推薦以下IHC染色模式用於測定乳癌中之HER2狀態(參見Dako
Herceptest包裝說明書)。
以上IHC染色模式通常係用於測定乳癌中之HER2狀態。本文所用之術語HER2(+)、HER2(++)及HER2(+++)等效於術語HER2(1+)、HER2(2+)及HER2(3+)。本發明之上下文中所用之「正常HER2蛋白質表現位準」對應於1+得分(根據本文以上所述表,「陰性評價」)及2+得分「弱陽性」。如本文以上詳細闡述,蛋白質表現位準之評估(即,表中所顯示之評分系統)係基於藉由免疫組織化學方法獲得之結果。作為標準或常規,因此,HER-2狀態係藉由免疫組織化學利用兩個FDA批准之市售套組;即Dako HerceptestTM及Ventana PathwayTM中之一者來實施。該等係半定量分析,其將表現位準分級為0(<20,000個受體/細胞,藉由IHC染色無可見表現)、1+(約100,000個受體/細胞,部分膜染色,<10%之細胞過表現HER-2)、2+(約500,000個受體/細胞,輕至中等完全膜染色,>10%之細胞過表現HER-2)及3+(約2,000,000個受體/細胞,強完全膜染色,>10%之細胞過表現HER-2)。
另一選擇為,可使用其他用於評估HER2之蛋白質表現位準之方法,例如,西方墨點法、基於ELISA之檢測系統等等。
推薦以下IHC染色圖案用於測定胃癌中之HER2狀態(參見Dako Herceptest包裝說明書):
HER2正常型疾病係由低或弱之HER2之表現位準(例如,HER2(1+或2+),藉由IHC)及陰性ISH結果定義。
根據以上,欲評價之樣品可來自患有如上所定義之HER2正常型癌症之患者(自其獲得)。舉例而言,樣品可自腫瘤組織、腫瘤獲得,且因此係懷疑具有HER2表現之腫瘤(例如,乳房腫瘤)之腫瘤細胞或腫瘤組織。熟悉此項技術者有責任使用此項技術中已知之標準技術及本文所揭示之方法鑑別該等腫瘤及/或患有相應癌症之個體/患者。通常,該腫瘤細胞或癌細胞可自任一生物來源/有機體、尤其任一患有上述癌症之生物來源/有機體獲得。在本發明之上下文中,尤其有用之細胞較佳係人類細胞。該等細胞可自(例如)活體組織切片或自生物樣品獲得。腫瘤/癌症/腫瘤細胞/癌細胞係實體腫瘤/癌症/腫瘤細胞/癌細胞。根據上述,癌症/腫瘤細胞可為乳癌/腫瘤細胞或該樣品包含癌
症/腫瘤細胞,例如乳癌/腫瘤細胞。與上述一致,該腫瘤/癌症可為乳房腫瘤/癌症。
在抗-HER3抗體與抗-HER1抗體之組合療法之上下文中,其中該結合至人類HER3之抗體及結合至人類HER1之抗體之兩者(或至少一者)之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低,HER1表現係指HER1蛋白質及/或基因表現(擴增)。HER1之表現位準可藉由免疫組織化學方法檢測,而該HER1基因擴增狀態可利用原位雜交方法(例如螢光原位雜交技術(FISH))來量測。用於蛋白質表現分析以及基因擴增之檢測之相應分析及套組已為此項技術熟知。另一選擇為,可使用其他方法(例如qRT-PCR)來檢測HER1基因表現之位準。HER1之表現位準尤其可藉由免疫組織化學方法來檢測。該等方法已為此項技術熟知(參見例如,上述針對HER2表現位準之類似方法及測試)。本文所述抗體之組合物亦可包含佐劑,例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由滅菌程序(見上文)及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如,對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者可確保防止微生物存在。該等組合物中亦期望包含等滲劑,例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外,可藉由納入吸收延遲之試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之長效吸收。
無論所選之投與途徑如何,藉由熟悉此項技術者已知之習用方法將可以適宜水化形式使用之本發明之化合物及/或本發明之醫藥組合物調配成醫藥上可接受之劑型。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量量可變化以便獲得有效達成對特定患者之期望治療反應之量的活性成份、組合物及投與方式,而對患者無毒。所選劑量量將取決於各種藥代動力學因素,包括本發明所用特定組合物之活性、投與路徑、投與時間、所用特定化
合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康狀況及先前病史及醫學領域熟知的類似因素。
組合物必須係無菌的且流動達組合物可藉由注射器遞送之程度。除水以外,載劑較佳地係等滲緩衝鹽水溶液。
可(例如)藉由以下各項來維持合適流動性:使用諸如卵磷酯等塗覆材料,若為分散液則藉由維持所需粒徑,以及使用表面活性劑。在許多情形中,組合物中較佳包括等滲劑,例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)及氯化鈉。
除非另外指明,否則本文所用術語「治療」意指在患者中可部分或完全逆轉、減輕、抑制腫瘤生長、腫瘤轉移或其他致癌或贅瘤性細胞之進展或部分或完全預防該進展。除非另外指明,否則本文所用術語「治療」係指治療作用。
片語「治療方法」或其等效詞在用於(例如)癌症時係指經設計以減少或清除患者中癌細胞之數量或減輕癌症症狀之活動的程序或過程。癌症或另一增殖病症之「治療方法」並不一定意指實際上將消除癌細胞或其他病症,實際上將減少細胞數量或病症,或實際上將減輕癌症或其他病症之症狀。通常,將實施之癌症治療方法甚至具有低成功可能性,但考慮到患者之病史及估計之存活平均壽命,認為該方法仍引發總體有益之作用過程。
不言而喻,抗體係以治療有效量投與患者,治療有效量係目標化合物或組合將引發研究者、獸醫、醫師或其他臨床醫師所尋求之組織、系統、動物或人類之生物學或醫學反應之量。
術語「與...組合」係指除投與抗-HER2抗體(或分別地抗-HER1抗體)以外「共同投與(co-administration或co-administering)」抗-HER3抗體。「共同投與」意指同時或依序投與第一抗體加上第二抗體。共同
投與可同時或以任一順序依序實施,其中兩種(或所有)活性劑較佳在一段時間內同時發揮其生物活性。當同時投與兩種抗體時,劑量係在同一天在一次投與中投與,例如,在一次連續輸注期間。當依序投與兩種抗體時,劑量係在同一天在兩次分開的投與(例如,兩次分開的連續輸注)中投與,或一種抗體係在第一天投與且第二抗體在第2天至第7天、較佳地在第2天至第4天投與。若治療循環適用於兩種抗體,則術語「共同投與」關於第一抗體及第二抗體之維持劑量意指該等維持劑量可(例如)在一次連續輸注期間同時投與。或者,維持劑量可在一天或數天內依序投與,例如,第一抗體之維持劑量係每3週投與,且第二抗體之維持劑量係每2週投與。而且,兩種抗體亦可使用其他治療循環/通常1至4週、較佳地2至3週。
抗體共投與之量及共投與之時間將取決於所治療患者之類型(物種、性別、年齡、體重等)及狀況以及所治療疾病或病況之嚴重程度。通常使用典型劑量抗體。舉例而言,根據本發明抗體之投與劑量可為約1μg/kg至50mg/kg(例如,0.1mg/kg至20mg/kg)之抗體,藉由一或多次分開投與或藉由連續輸注投與。典型日劑量可在自約1μg/kg至約100mg/kg之範圍內。在較佳態樣中,抗體係以自約1mg/kg至約15mg/kg範圍內之劑量每2週至3週投與。曲妥珠單抗之較佳劑量係4mg/kg之負荷劑量(作為連續輸注投與)及隨後每週3次輸注2mg/kg至6mg/kg、較佳地2mg/kg(作為連續輸注投與),直至檢測到疾病進展為止。
在本發明之上下文中,在本發明之組合治療中可使用額外的其他細胞毒性劑、化學治療劑或抗癌症劑或增強該等藥劑效應之化合物。該等藥劑包括(例如):烷基化試劑或具有烷基化作用之試劑,例如環磷醯胺(CTX;例如cytoxan®)、苯丁酸氮芥(CHL;例如leukeran®)、順鉑(CisP;例如platinol®)、白消安(busulfan)(例如
myleran®)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、鏈脲黴素、曲他胺(TEM)、絲裂黴素C及諸如此類;抗代謝物,例如胺甲喋呤(MTX)、依託泊苷(etoposide)(VP16;例如vepesid®)、6-巰嘌呤(6MP)、6-硫鳥嘌呤(6TG)、阿糖胞苷(Ara-C)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)(例如Xeloda®)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)及諸如此類;抗生素,例如放線菌素D、多柔比星(doxorubicin)(DXR;例如adriamycin®)、柔紅黴素(道諾黴素(daunomycin))、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)及諸如此類;生物鹼,例如長春花生物鹼,例如長春新鹼(VCR)、長春花鹼及諸如此類;及其他抗腫瘤劑,例如紫杉醇(例如taxol®)及紫杉醇衍生物、細胞生長抑制劑、糖皮質激素(例如地塞米松(dexamethasone)(DEX;例如decadron®))及皮質類固醇(例如潑尼松(prednisone))、核苷酶抑制劑(例如羥基脲)、胺基酸清除酶(例如天冬醯胺酶)、甲醯四氫葉酸及其他葉酸衍生物、及類似的不同抗腫瘤劑。亦可使用以下藥劑作為額外藥劑:胺磷汀(arnifostine)(例如ethyol®)、更生黴素(dactinomycin)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)(氮芥(nitrogen mustard))、鏈脲菌素(streptozocin)、環磷醯胺、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、多柔比星脂質體(例如doxil®)、吉西他濱(gemcitabine)(例如gemzar®)、柔紅黴素脂質體(例如daunoxome®)、丙卡巴肼(procarbazine)、絲裂黴素、多西他賽(例如taxotere®)、阿地白介素(aldesleukin)、卡鉑、奧利沙鉑(oxaliplatin)、克拉屈濱(cladribine)、喜樹鹼、CPT 11(伊立替康(irinotecan))、10-羥基7-乙基-喜樹鹼(SN38)、氟尿苷、氟達拉濱(fludarabine)、異環磷醯胺、伊達比星(idarubicin)、美司鈉(mesna)、干擾素β、干擾素α、米托蒽醌(mitoxantrone)、托撲替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖、巰嘌呤、普卡黴素(plicamycin)、米托坦
(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡黴素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、睾內酯、硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥。在一個實施例中,本發明之組合治療不使用該等額外的細胞毒性劑、化學治療劑或抗癌症劑或增強該等藥劑效應之化合物。
在本發明之上下文中,本發明之組合治療中可使用抗激素劑。如本文所用,術語「抗激素劑」包括用於調整或抑制激素對腫瘤之作用的天然或合成的有機或肽化合物。抗激素劑包括(例如):類固醇受體拮抗劑、抗雌性激素劑,例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶之4(5)-咪唑、其他芳香酶抑制劑、42-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奧那司酮(onapristone)、及托瑞米芬(toremifene)(例如,Fareston®);抗雄性激素劑,例如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林及戈舍瑞林(goserelin);及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物;糖蛋白激素之激動劑及/或拮抗劑,例如促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及)促黃體生成激素(LH)及LHRH(促黃體生成激素釋放激素);LHRH激動劑,乙酸戈舍瑞林,作為Zoladex®(AstraZeneca)自市場購得;LHRH拮抗劑,D-丙胺醯胺N-乙醯基-3-(2-萘基)-D-丙胺醯基-4-氯-D-苯基丙胺醯基-3-(3-吡啶基)-D-丙胺醯基-L-絲胺醯基-N6-(3-吡啶基羰基)-L-離胺醯基-N6-(3-吡啶基-羰基)-D-離胺醯基-L-白胺醯基-N6-(1-甲基乙基)-L-離胺醯基-L-脯胺酸(例如Antide®),Ares-Serono;LHRH拮抗劑,乙酸加尼瑞克(ganirelix acetate);類固醇抗雄性激素劑,乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)(CPA)及乙酸甲地孕酮(megestrol acetate),作為Megace®(Bristol-Myers Oncology)自市場購得;非類固醇抗雄性激素劑,氟他
米特(flutamide)(2-甲基-N-[4,20-硝基-3-(三氟甲基)苯基丙醯胺),作為Eulexin®(Schering公司)自市場購得;非類固醇抗雄性激素劑,尼魯米特(5,5-二甲基-3-[4-硝基-3-(三氟甲基-4’-硝基苯基)-4,4-二甲基-咪唑啶-二酮);及用於其他非受納受體之拮抗劑,例如用於RAR(視黃酸受體)、RXR(類視色素X受體)、TR(甲狀腺素受體)、VDR(維生素-D受體)及諸如此類之拮抗劑。在一個實施例中,本發明之組合治療不使用該等額外的抗激素劑。
在化學治療劑方案中上文所述細胞毒性劑及其他抗癌劑之使用在癌症療法技術通常已充分表徵,且在本文中其使用係出於監測耐受性及功效以及用於控制投與途徑及劑量之相同考慮因素,其中有一些調整。舉例而言,細胞毒性劑之實際劑量可視藉由使用組織培養方法所確定之患者培養細胞反應而變化。通常,該劑量應低於不存在其他額外藥劑時所用之量。
有效細胞毒性劑之典型劑量可在製造商推薦之範圍內,且如由活體外反應或動物模型中之反應所指示,則濃度或量可降低最多約一個數量級。因此,基於初始培養之惡性細胞或組織培養之組織樣品之活體外反應性或在適宜動物模型中觀察到之反應,實際劑量將取決於醫師之判斷、患者之狀況以及治療方法之功效。
在本發明之上下文中,本發明之組合治療中可使用額外的抗增殖劑,包括(例如):酶法呢基(farnesyl)蛋白轉移酶之抑制劑及受體酪胺酸激酶PDGFR之抑制劑,包括美國專利第6,080,769號、第6,194,438號、第6,258,824號、第6,586,447號、第6,071,935號、第6,495,564號、第6,150,377號、第6,596,735號及第6,479,513號及國際專利公開案WO 01/40217中所揭示及主張之化合物。在一個實施例中,本發明之組合治療不使用該等額外的抗增殖劑。
在本發明之上下文中,除本發明之組合治療以外,可實施有效
量之電離輻射及/或可使用放射性醫藥。放射源可在所治療患者活體外或活體內。當放射源位於患者體外時,該療法稱為體外束放射療法(EBRT)。當放射源位於患者體內時,該治療稱為近距放射療法(BT)。在本發明之上下文中使用之放射性原子可選自包括(但不限於)以下之群:鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鍀-99、碘-123、碘-131及銦-111。在本發明之EGFR激酶抑制劑係抗體之情況下,亦可用該等放射性同位素對抗體進行標記。在一個實施例中,本發明之組合治療不使用該等額外的電離輻射。
放射療法係控制不可切除或不能手術之腫瘤及/或腫瘤轉移灶之標準治療方法。當放射療法與化學療法結合時觀察到改良之結果。放射療法係基於以下原理:向靶區遞送之高劑量放射將導致腫瘤及正常組織二者中之生殖細胞死亡。通常根據放射吸收劑量(Gy)、時間及分級來界定放射劑量方案,且必須由腫瘤學家謹慎界定。患者所接受之放射量將取決於多個考慮因素,但最重要的兩個考慮因素係腫瘤相對於身體其他重要結構或器官之位置及腫瘤擴散之程度。進行放射治療之患者之典型治療過程將為經歷1至6週內之治療排程,其中每週5天以約1.8 Gy至2.0 Gy之每日單一部分向患者投與介於10 Gy與80 Gy之間之總劑量。在本發明之較佳實施例中,在利用本發明之組合治療及放射治療人類患者之腫瘤時,存在協同作用。換言之,當與放射、視情況與額外化學治療劑或抗癌劑組合時,可增強包含本發明組合或單一療法之藥劑對腫瘤生長之抑制。輔助性放射療法之參數包含於(例如)國際專利公開案WO 99/60023中。
根據已知方法,藉由一次注射靜脈內投與或藉由一段時間連續輸注方式,以肌內、腹膜腔內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內或鞘內途徑來將抗體投與患者。抗體之靜脈內或皮下投與較佳。
本發明進一步提供製造物件,其包含容器、該容器內包含抗-
HER3抗體之組合物及包裝說明書,該包裝說明書指示組合物之使用者以將該抗-HER3抗體與抑制HER2之二聚之抗-HER2抗體組合投與給患有HER2正常型癌症之患者。
本發明進一步提供製造物件,其包含容器、該容器內包含抗-HER3抗體之組合物及包裝說明書,該包裝說明書指示組合物之使用者使用者以將該抗-HER3抗體與抑制HER2之二聚之抗-HER2抗體組合投與給患有癌症之患者。
本發明進一步提供製造物件,其包含容器、該容器內包含抗-HER3抗體之組合物及包裝說明書,該包裝說明書指示組合物之使用者以將該抗-HER3抗體與抗-HER1抗體組合投與給患有癌症之患者,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
術語「包裝說明書」係指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書,其可包括關於適應症、用法、劑量、投與、禁忌症及/或關於該等治療產品之使用之警告的資訊。
在一個實施例中,製造物件容器可進一步包括醫藥上可接受之載劑。製造物件可進一步包括無菌稀釋劑,其較佳儲存於分開的額外容器中。
在下文中列舉一系列本發明之實施例:
1.一種結合至人類HER3之抗體,其與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合用於治療癌症,其中該癌症係HER2正常型癌症。
2.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區,且該輕鏈可變結構域包含SEQ
ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區或SEQ ID NO:7之CDR1L區。
3.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11;或其人類化型式。
4.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區。
5.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11。
6.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
7.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
8.如實施例1至中任一實施例之抗體7,其中該結合至人類HER3
之抗體之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
9.如實施例1至8中任一實施例之抗體,其中該結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體係帕妥珠單抗。
10.如實施例1至中任一實施例之抗體9,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
11.如實施例1至10中任一實施例之抗體,其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或頭頸癌乳癌。
在下文中列舉本發明之另一系列實施例:
1.一種結合至人類HER3之抗體之用途,其用於製造用於與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合治療癌症之醫藥,其中該癌症係HER2正常型癌症。
2.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區或SEQ ID NO:7之CDR1L區。
3.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11;或其人類化型式。
4.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為重鏈可變結構域,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6
之CDR1L區。
5.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11。
6.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
7.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
8.如實施例1至7中任一實施例之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
9.如實施例1至8中任一實施例之用途,其中該結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體係帕妥珠單抗。
10.如實施例1至9中任一實施例之用途,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
11.如實施例1至10中任一實施例之用途,其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或頭頸癌乳癌。
在下文中列舉本發明之另一系列實施例:
1.一種治療患有HER2正常型癌症之患者的方法,其中該方法包含共同投與結合至人類HER3之抗體與結合至人類HER2且抑制HER2
之二聚之抗體之組合。
2.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區或SEQ ID NO:7之CDR1L區。
3.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11;或其人類化型式。
4.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區。
5.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:9,或該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:11。
6.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
7.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在
於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
8.如實施例1至7中任一實施例之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
9.如實施例1至8中任一實施例之方法,其中該結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體係帕妥珠單抗。
10.如實施例1至9中任一實施例之方法,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
11.如實施例1至10中任一實施例之方法,其中該癌症係乳癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌或頭頸癌乳癌。
在下文中列舉本發明之另一系列實施例:
1.一種結合至人類HER3之抗體,其與結合至人類HER1之抗體組合用於治療癌症,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體中之至少一者之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
2.如實施例1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
3.如實施例1至2中任一實施例之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
4.如實施例1至2中任一實施例之抗體,其中該結合至人類HER3
之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
5.如實施例3至4中任一實施例之抗體,其中該結合至人類HER1之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:20;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:21。
6.如實施例1至5中任一實施例之抗體,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
7.如實施例6之抗體,其中該癌症之特徵在於HER1表現。
8.如實施例1至8中任一實施例之抗體,其中該癌症係肺癌、乳癌、結腸直腸癌或頭頸癌。
在下文中列舉本發明之另一系列實施例:
1.一種結合至人類HER3之抗體之用途,其用於製造用於與結合至人類HER1之抗體組合治療癌症之醫藥,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體中之至少一者之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
2.如實施例1之用途,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
3.如實施例1至2中任一實施例之用途,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
4.如實施例1至2中任一實施例之用途,其中該結合至人類HER3
之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
5.如實施例3至4中任一實施例之用途,其中該結合至人類HER1之抗體之特徵在於
該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:20;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:21。
6.如實施例1至5中任一實施例之用途,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
7.如實施例6之用途,其中該癌症之特徵在於HER1表現。
8.如實施例1至8中任一實施例之用途,其中該癌症係肺癌、乳癌、結腸直腸癌或頭頸癌。
在下文中列舉本發明之另一系列實施例:
1.一種治療患有癌症之患者之方法,其中該方法包含共同投與結合至人類HER3之抗體與結合至人類HER1之抗體之組合,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體中之至少一者之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
2.如實施例1之方法,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
3.如實施例1至2中任一實施例之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為該重鏈可變結構域,且該輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
4.如實施例1至2中任一實施例之方法,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
5.如實施例3至4中任一實施例之方法,其中該結合至人類HER1之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:20;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:21。
6.如實施例1至5中任一實施例之方法,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
7.如實施例6之方法,其中該癌症之特徵在於HER1表現。
8.如實施例1至8中任一實施例之方法,其中該癌症係肺癌、乳癌、結腸直腸癌或頭頸癌。
提供以下實例、序列表及圖以幫助理解本發明,本發明之實際範圍係陳述於隨附申請專利範圍中。應瞭解,可對所述程序作出多種修改而不偏離本發明之精神。
SEQ ID NO:1 重鏈CDR3H,Mab 205.10
SEQ ID NO:2 重鏈CDR2H,Mab 205.10
SEQ ID NO:3 重鏈CDR1H,Mab 205.10
SEQ ID NO:4 輕鏈CDR3L,Mab 205.10
SEQ ID NO:5 輕鏈CDR2L,Mab 205.10
SEQ ID NO:6 輕鏈CDR1L(變體1),Mab 205.10
SEQ ID NO:7 輕鏈CDR1L(變體2),Mab 205.10
SEQ ID NO:8 重鏈可變結構域VH,Mab 205.10
SEQ ID NO:9 輕鏈可變結構域VL,Mab 205.10.1
SEQ ID NO:10 輕鏈可變結構域VL,Mab 205.10.2
SEQ ID NO:11 輕鏈可變結構域VL,Mab 205.10.3
SEQ ID NO:12 人類κ輕鏈恆定區
SEQ ID NO:13 源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO:14 源自IgG1且在L234A及L235A上突變之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO:15 源自IgG4之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO:16 源自IgG4且在S228P上突變之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO:17 人類HER3(包括信號肽)
SEQ ID NO:18 人類HER2(包括信號肽)
SEQ ID NO:19 人類HER1(包括信號肽)
SEQ ID NO:20 抗-HER1抗體GA201之重鏈可變結構域VH
SEQ ID NO:21 抗-HER1抗體GA201之輕鏈可變結構域VL
將NMRI小鼠利用hHER3-ECD(自身)進行免疫並利用hu-HER3-ECD加強。藉由針對HER1/2/3-ECD-ELISA測試血清樣品來監測免疫反應。將來自小鼠具有足夠抗-HER3免疫球蛋白滴度之脾細胞冷凍,隨後藉由與小鼠骨髓瘤細胞系P3X63 Ag8.653融合永生化。實施一次融合且選擇藉由HER1/2/-ECD-ELISA所篩選顯示無交叉反應性、但結合至HER3-ECD及抗-HER3選擇性融合瘤之融合瘤上清液、藉由單細胞FACS分選來選殖相關融合瘤。在活體外培養來自不同融合瘤之單細胞純系以在組織培養基中產生抗體用於表徵。藉由測定其抑制MDA-MB-175細胞之HER3磷酸化、AKT磷酸化及腫瘤細胞增殖之能力來選擇抗體(參見下文實例)。自所獲得抗體,可進一步人類化以給
出以下具有其各別VH及VL或CDR之抗體Mab 205.10.1、Mab 205.10.2及Mab 205.10.3。
在一個實施例中,該等抗體係使用人類來源(例如,SEQ ID NO:12-13)之恆定區來製備。
鏈黴親和素板上捕獲融合至鏈黴親和素結合蛋白(SBP)之可溶性人類HER3胞外結構域。為界定抗體至SPB-CDCP1之最佳結合,MicroCoat(Bernried,Germany)(ID-No.1734776-001)供應之384孔聚苯乙烯板(NUNC,經鏈黴親和素塗覆)已經純淨且逐步稀釋之HEK293上清液(於BSA/IMDM緩衝液中:100mg/ml BSA Fraction V,Roche 10735078001,溶解於Iscove改良之杜貝克氏(Dulbeccos)培養基)塗覆。使用嵌合205抗體之小鼠校準曲線,鑑別相對於微量滴定板之鏈黴親和素結合能力而言HEK293上清液之最佳稀釋因子。對於標準塗
覆,將含有SBP-HER3之HEK293上清液稀釋(介於1:15與1:40之間),並於2-80℃下培育過夜(25μl/孔)。微量滴定板需要充分洗滌以移除剩餘之未結合SBP-HER3。
測試經未稀釋或使用12步稀釋獲得之本發明抗體。將12.5μl/孔之每一樣品於室溫下培育90分鐘。在使用PBS-T(0.1%吐溫(Tween)20於PBS中)充分洗滌之後,添加25μl用於人類抗體之與HRP偶合之山羊抗-人類IgG抗體(Jackson ImmunoResearch,代碼號:109-036-098,以1:10000稀釋),並培育1小時。在充分洗滌之後,用ABTS錠劑(Roche Diagnostics GmbH,目錄編號:1112422)檢測抗體之結合。使用標準分光光度計量測於405nm/492nm下之吸光度。
該表顯示不同抗體之相對結合比率。
對於親和力量測,於SPR儀器(Biacore T100)上藉由標準胺偶合及阻斷化學將30μg/ml抗Fcγ抗體(來自山羊,Jackson Immuno Research)偶合至CM-5感測器晶片之表面。偶聯之後,將抗-HER3抗體於25℃下以5μL/min之流速注射,隨後以30μL/min注射連續稀釋(0nM至1000nM)之人類HER3 ECD。作為結合實驗之運行緩衝液,使用PBS/0.1%BSA。然後,用10mM甘胺酸-HCl(pH 2.0)溶液之60秒脈衝使晶片再生。
使用朗繆爾(Langmuir)1:1結合模型計算熱力學參數(KD,對HER3之結合常數)之計算。
在競爭性結合分析(Biacore)中,Mab205.10.1、Mab205.10.2及Mab205.10.3所有均顯示結合至相同表位。在此分析中研究於WO 2007/077028中闡述之抗-HER3抗體U1-7、U-53及U1-59及於WO 2008/100624闡述之Ab#6,並且揭露與抗體Mab205.10.1、Mab205.10.2及Mab205.10.3結合至不同表位。
根據以下方案於MCF7及FaDu細胞中實施分析:以500,000個細胞/孔將細胞接種於經聚-D-離胺酸塗覆之6孔板中之具有10% FCS之RPMI1640培養基中。培育24小時。藉由抽吸移除培養基,在500μl/孔具有0.5%FCS之RPMI 1640之情況下培育過夜。將抗體添加於500μl具有0.5%FCS之RPMI 1640中。培育1小時。添加HRG-1b(最終濃度500ng/ml)達10分鐘。為溶解細胞,移除培養基並添加80μl冰冷的曲拉通(Triton)-X-100細胞溶解緩衝液並於冰上培育5分鐘。在將溶解物轉移至1.5ml反應管並以14000rpm於4℃下離心15分鐘後,將上清液轉移至新的反應管中。將於SDS加載緩衝液中含有等量之蛋白質之樣品在SDS PAGE上分離並藉由使用半乾式西方墨點法來點樣至硝酸纖維素膜。藉由1xNET-緩衝液+0.25%明膠將膜封阻1小時並分別藉由抗體α磷酸-HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3),Cell Signaling,編號4791檢測
pHER3,並藉由抗體αErbB3(C-17),Santa Cruz,編號sc-285檢測HER3。在洗滌並藉由POD偶合之二級抗體檢測信號之後,以密度儀方式掃描條帶。研究抗-HER3抗體Mab205.10.1、Mab205.10.2及Mab205.10.3以及WO 2007/077028中所闡述之抗-HER3抗體U1-7、U-53及U1-59及WO 2008/100624中所闡述之Ab#6。下文及圖1A中顯示在MCF7細胞中抗-HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)。
MCF7細胞中HER3磷酸化之抑制%
在其他實驗中,研究抗-HER3抗體Mab205.10.2以及WO 97/35885中闡述之抗-HER3-抗體8B8.2D9及WO 2003/013602中闡述之1B4C3及2D1D12。在下文及圖1B中顯示MCF7細胞中抗-HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)。
MCF7細胞中HER3磷酸化之抑制%
在下文中顯示FaDu細胞中抗-HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)。
FaDu細胞中HER3磷酸化之抑制%
在其他實驗中,在Mel-Juso細胞中研究抗-HER3抗體Mab205.10.2以及WO 97/35885中闡述之抗-HER3-抗體8B8.2D9及WO 2003/013602中闡述之1B4C3及2D1D12及105.5(Millipore,Cat編號05-47,在WO 2003/013602中稱為α-HERECD)。根據上述關於MCF7及FaDu細胞之方案實施Mel-Juso細胞中之分析。使細胞數目及培養基體積適於12孔板。在下文及圖1C中顯示Mel-Juso細胞中抗-HER3抗體對受體磷酸化之抑制百分數(%)。
Mel-Juso細胞中HER3磷酸化之抑制%
根據以下方案於MCF7細胞中實施分析:以30000個細胞/孔將MCF7細胞接種於經聚-D-離胺酸塗覆之96孔板中之具有10% FCS之
RPMI1640培養基中並培育24小時。藉由在乾淨紙巾上輕拍移除培養基,利用200μl無血清培養基仔細洗滌,與100μl/孔具有0.5% FCS之RPMI 1640一起培育過夜。如上所述移除培養基;將抗體添加於100μl具有0.5% FCS之RPMI 1640中並培育1.5小時。添加HRG-1b(最終濃度5ng/ml)達10分鐘。如上所述移除培養基。為溶解細胞,於冰上添加100μl冰冷的細胞溶解緩衝液並藉由用移液管吸取約5次重新懸浮。將板以3000rpm於4℃離心10分鐘,並將80μl上清液(或等份試樣)轉移至新的聚丙烯板中,並在LN2中急速冷凍。儲存於-80℃下直至分析為止。
AKT1,2(磷酸-Ser473)EIA套組分析設計編號900-162:將樣品(1:10稀釋)添加至經特異性針對AKT N末端之小鼠MAB塗覆之板。於RT在搖動的同時培育1小時。洗滌5次,於RT下在搖動的同時與生物素化之抗-磷酸-AKT(Ser473)一起培育1小時。洗滌5次,於RT下在搖動的同時與鏈黴親和素-HRP偶聯物一起培育30分鐘。洗滌5次,於RT下在搖動的同時與TMB受質一起培育30分鐘。停止並於450nm下讀取。
Mab 205.10.2顯示AKT磷酸化抑制之IC50為0.06μg/ml。
在如針對MCF7細胞所述於Mel-Juso細胞中實施之pAKT ELISA中,Mab 205.10.2顯示AKT磷酸化抑制之IC50為0.28μg/ml,所有其他分析物抗體顯示IC50高於(>)50。
Mel-Juso細胞中AKT磷酸化抑制%
使用MDA-MB-175細胞(VII人類乳癌細胞,ATCC目錄編號HTB-25)在細胞增殖分析中評價HER3抗體Mab205.10.1、Mab205.10.2及Mab205.10.3之抗-腫瘤效能。將20,000細胞/孔接種於具有含有10% FCS之DMEM/F12細胞培養基之無菌96孔組織培養板中並在37℃±1℃下與5%±1% CO2一起培育1天。該等細胞係緩慢生長之細胞,其中倍增時間為約1.5天。將抗-HER3抗體以稀釋系列添加,並再培育6天。然後使用阿爾瑪藍(alamarBlue)®讀出評價細胞存活力。若細胞存活力降低至對照之超過50%,則針對每一抗體濃度使用一式三份平均值計算IC50;否則,若在最高濃度下細胞存活力之抑制%低於50%,則不可計算IC50,且其指示IC50[μg/ml]高於(>)最高濃度。亦研究闡述於WO 2007/077028中之抗-HER3-抗體U1-59及闡述於WO 2008/100624中之Ab#6。
在其他實驗中,研究WO 97/35885中闡述之抗-HER3抗體8B8.2D9及WO 2003/013602中闡述之1B4C3。
在指數生長期中用胰蛋白酶/EDTA(Gibco編號25300-054)收集靶細胞KPL4(ADCC),乳癌,於RPMI1640+2mM L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸+10%FCS中培養)。在洗滌步驟並檢查細胞數目及存活力之後,於37℃下在細胞培養箱中用鈣黃綠素(Invitrogen編號C3100MP;將1個小瓶重新懸浮於50μl DMSO中用於5ml培養基中之5百萬(Mio)個細胞)標記所需等份試樣30分鐘。然後,將細胞用AIM-V培養基洗滌3次,檢查細胞數目及存活力,並將細胞數目調節至0.3百萬/ml。
同時,藉由密度梯度離心(Histopaque-1077,Sigma編號H8889)依照製造商的方案(洗滌步驟在400g下1次及350g下2次,各10分鐘)製備PBMC(外周血單個核細胞)作為效應細胞。檢查細胞數目及存活力,並將細胞數目調整至15百萬/ml。
將100μl經鈣黃綠素染色之靶細胞置於圓底96孔板中,添加50μl稀釋之非岩藻糖基化抗體(Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3,製備見下文)及50μl效應細胞。在一些實驗中,將靶細胞與Redtaiune ® NF液體(ZLB Behring)以10mg/ml Redimune之濃度混合。
當充當對照時,藉由在沒有抗體之情況下共培養靶細胞及效應細胞測定自發溶解並藉由僅靶細胞之1%曲拉通X-100溶解測定最大溶解。將板於37℃下於濕潤的細胞培養箱中培育4小時。
使用細胞毒性檢測套組(LDH檢測套組,Roche編號1 644 793)根據製造商之說明書藉由量測來自受損傷細胞之LDH(乳酸脫氫酶)釋放評價靶細胞之殺傷。簡言之,將100μl來自每一孔之上清液在透明平底96孔板中與來自套組之100μl受質混合。在ELISA讀取器中於490nm下測定受質之顏色反應之Vmax值至少10分鐘。特異性抗體介導之殺傷的百分數係如下計算:((A-SR)/(MR-SR)×100,其中A係特異性抗體濃度之Vmax的平均值,SR係自發釋放之Vmax的平均值,且MR係最大釋放之Vmax的平均值。
作為額外的讀出,藉由以下評估完整靶細胞之鈣黃綠素保留:於硼酸鹽緩衝液(5mM硼酸鈉+0.1%曲拉通)中溶解剩餘之靶細胞,並在螢光板讀取器中量測鈣黃綠素螢光。Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3顯示約40-60%之ADCC[KPL-4](以1μg/ml特異性溶解計)。
藉由分別在HEK293或CHO細胞中用4種質粒(兩種用於抗體表現,一種用於融合GnTIII多肽表現(GnT-III表現載體),及一種用於甘露糖苷酶II表現(高爾基甘露糖苷酶(Golgi mannosidase)II表現載體))以4:4:1:1之比率共轉染來製備非岩藻糖基化抗體(Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3)。
將完整的抗體重鏈及輕鏈DNA序列在MPSV啟動子的控制下且在合成polyA位點之上游亞選殖於哺乳動物表現載體(一種用於輕鏈,且一種用於重鏈)中,每一載體攜帶EBV OriP序列。使用磷酸鈣轉染方法藉由用抗體重鏈及輕鏈表現載體共轉染HEK293-EBNA細胞或CHO細胞產生抗體。藉由磷酸鈣方法轉染指數生長之HEK293-EBNA細
胞。對於糖工程化抗體之產生而言,分別用4種質粒(兩種用於抗體表現,一種用於融合GnTIII多肽表現(GnT-III表現載體),及一種用於甘露糖苷酶II表現(高爾基甘露糖苷酶II表現載體))以4:4:1:1之比率共轉染細胞。使用補充有10% FCS之DMEM培養基使細胞在T燒瓶中以黏附單層培養物形式生長,且當該等細胞在介於50%與80%鋪滿之間時實施轉染。對於T150燒瓶之轉染而言,在轉染前24小時將1500萬個細胞接種於25ml補充有FCS(最終濃度為10% V/V)之DMEM培養基中,並將細胞置於具有5% CO2氣氛之37℃培育箱中過夜。對於欲產生之每一抗體,藉由混合188μg總質粒載體DNA(4種載體,兩種用於抗體表現(一種用於輕鏈且一種用於重鏈),一種用於融合GnTIII多肽表現(GnT-III表現載體),及一種用於甘露糖苷酶II表現(高爾基甘露糖苷酶II表現載體),比率分別為4:4:1:1)、終體積938μl的水及938μl之1M CaCl2溶液製備DNA、CaCl2及水之溶液。向此溶液加添加1876μl 50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na2HPO4溶液(pH 7.05),立即混合10 sec並在室溫下靜置20 sec。用46ml補充有2% FCS之DMEM稀釋懸浮液,並分至兩個T150燒瓶中代替現有培養基。
將細胞於37℃、5% CO2下培育約17至20小時,隨後用25ml DMEM(10% FCS)替代培養基。轉染後7天藉由在210 x g下離心15min來收穫條件化培養基,將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)並添加最終濃度為0.01% w/v之疊氮化鈉,且保持在4℃下。
純化分泌之非岩藻糖基化抗體,並(例如)藉由MALDI/TOF-MS(如於例如WO 2008/077546中所闡述)分析附著於抗體之Fc區的寡糖。對於此分析,藉由PNGaseF消化自抗體以酶方式釋放寡糖,其中抗體固定於PVDF膜上或在溶液中。將所得含有經釋放寡糖之消化溶液直接製備用於MALDI/TOF-MS分析或用EndoH糖苷酶進一步消化,隨後製備試樣用於MALDI/TOF-MS分析。糖鏈內Asn297處的岩藻糖之分
析量係50-20%。
抗體Mab205.10.1、Mab205.10.2、Mab205.10.3之活體內抗腫瘤效能可在對SCID灰棕色小鼠或裸小鼠上移植之各種腫瘤起源(例如,肺癌、SCCHN、乳癌及胰腺癌)之基於細胞及片段之模型中檢測。作為實例,顯示SCCHN異種移植物模型FaDu(基於細胞系)、乳癌模型MAXF449(基於片段)及NSCLC模型7177(基於片段)之數據。
提供來自Roche,Penzberg,Germany之非岩藻糖基化Mab205.10.2(在圖2、3、4中稱作Mab205)作為儲積溶液。抗體緩衝液包括組胺酸。抗體溶液在注射前自儲液於緩衝液中適當稀釋。
FaDu人類HNSCC細胞初始係自ATCC獲得。將腫瘤細胞系在補充有10%胎牛血清、2mML-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉及0.1mM NEAA之MEM鷹氏(Eagle)培養基中於37℃在水飽和之氣氛中於5% CO2下常規培養。用胰蛋白酶/EDTA 1×實施培養傳代,每三天分離一次。
腫瘤片段初始係自患者獲得並s.c.移植至供體裸小鼠。隨後將腫瘤片段在活體內連續傳代。對於臨床前研究,自供體小鼠生成小的腫瘤片段,並s.c.放置於其他裸鼠(MAXF449,7177)上。
雌性SCID灰棕色小鼠或裸小鼠購自育種者(例如,Charles River,Sulzfeld,Germany)並在無特定病原體條件下以12小時光照/12小時黑暗之每日循環根據承諾之準則(GV-Solas;Felasa;TierschG)維持。實驗研究方案得到地方政府審閱並批准。在運抵後,將動物在動物設施
之隔離部分中維持一週以適應新環境並進行觀察。定期實施連續健康監測。可隨意獲得規定食物(Provimi Kliba 3337)及水(酸化,pH 2.5-3)。
每天針對臨床症狀對動物進行控制並檢測副反應。對於貫穿整個實驗之監測,記錄動物之體重。
在動物隨機化後在細胞或片段移植後,當中值腫瘤大小為約100-150mm3時開始動物治療。將抗體作為單一藥劑以10或25mg/kg i.p.q7d每週一次投與,視模型而定持續3-6周。在同一天投與相應的媒劑。
自研究第14天至第35天用抗體Mab205.10.2治療攜帶FaDu HNSCC(頭頸部鱗狀細胞癌)異種移植物之小鼠。結果,用Mab205.10.2抗體治療顯示顯著抗腫瘤效能,伴有s.c.FaDu異種移植物之腫瘤停滯。腫瘤生長抑制(TGI)經計算為98%。
利用Mab 205(10mg/kg q7dx3,i.p.)進行治療使得移植FaDu HNSCCHN之異種移植物之腫瘤停滯(參見圖2)。
自研究第64天至第91天用抗體Mab205.10.2治療攜帶MAXF449乳癌異種移植物之小鼠。結果,用Mab205.10.2抗體治療顯示顯著抗腫瘤效能,伴有MAXF449異種移植物之腫瘤停滯。腫瘤生長抑制(TGI)超過100%。
利用Mab 205(10mg/kg q7d,i.p.)進行治療使得MAXF449乳癌經移植之異種移植物之腫瘤停滯(參見圖3)。
自研究第28天至第56天用抗體Mab205.10.2治療攜帶7177 NSCLC異種移植物之小鼠。結果,用Mab205.10.2抗體治療顯示顯著抗腫瘤效能,伴有7177 NSCLC異種移植物之腫瘤停滯。腫瘤生長抑制(TGI)超過100%。
利用Mab 205(25mg/kg q7d,i.p.)進行治療使得7177 NSCLC經移植之異種移植物之腫瘤停滯(參見圖4)。
將為HER2正常型癌症細胞系且表現HER3之人類乳癌細胞系ZR-75-1皮下(s.c.)接種於雌性Balb/c裸小鼠(5×106細胞/動物)之右側。動物全身性補充17β-雌二醇丸劑並在整個研究期中s.c.以一週一次時間間隔投與抗生素頭孢維星(cefocein)(20mg/kg)。
在腫瘤細胞接種後第40天,將動物隨機化並分配至3個治療組及一個媒劑組,使得所有組中之中值腫瘤體積為約100mm3。在隨機化當天,藉由腹膜腔內投與Mab205.10.2(10mg/kg)、帕妥珠單抗(30mg/kg首次劑量(loading dose),隨後15mg/kg維持劑量)、Mab205.10.2加帕妥珠單抗之組合以一週一次之時間間隔開始治療。在第81天將動物殺死,此係在開始治療後41天且最後一次(6th)藥物治療後6天。
根據NCI方案(TV=(長度×寬度2)/2)計算原發腫瘤體積(TV),其中「長度」及「寬度」係腫瘤團塊之長及短直徑(以mm計)(Corbett等人,1997)。自分級(腫瘤接種後第40天)直至研究終止(腫瘤接種後第81天)執行計算。
為計算治療期間腫瘤生長抑制(TGI)之百分數,將每一治療組與其相應媒劑對照相比較。TV 第z天 代表個體動物在界定研究當天之腫瘤體積且TV 第x天 代表個體動物在分級當天(第x天)之腫瘤體積。
應用以下公式:
第81天對腫瘤體積之治療結果/效能
使用人類腫瘤細胞系(BxPC3、QG56、A549、NCI-H322M、NCI-H1975、HCC827、HCC827GR、NCI-H441、FaDu)或藉由人類腫瘤組織片段移植產生皮下異種移植物模型。基於高pHER3/HER3比率(藉由西方墨點法分析)選擇細胞系及片段。所有實驗均根據德國動物福祉法案(the German Animal Welfare Act)(Tierschutzgesetz)來實施。
對於基於細胞系之異種移植物模型,將細胞(5-10×106個細胞)皮下(s.c.)注射於雌性SCID/灰棕色小鼠(BxPC3、QG56、A549、NCI-H322M、NCI-H441、FaDu)或Balb/c裸小鼠(HCC827、HCC827GR、NCI-H1975)(二者均來自Charles River,Germany)中。在治療開始之後,在第21至24天(取決於模型)針對原發腫瘤大小將小鼠(n=10/組)隨機分層。經腹膜腔內(i.p.)一週一次給予Mab205.10.2(在此實例中簡寫為RG7116)治療(劑量10-25mg/kg)(n=2-5劑量)。使用生理鹽水作為媒劑對照。藉由卡尺一週一次量測腫瘤體積(½(長度×(寬度)2))並如補充材料中所述計算與對照動物相比之腫瘤生長抑制百分數(TGI)。
藉由將小的人類腫瘤片段移植至NMRI裸小鼠上在Oncontest
GmbH(Freiburg,Germany)或Experimental Pharmacology & Oncology Berlin-Buch GmbH(Berlin,Germany)上評估源自患者之腫瘤皮下異種移植物模型(PDX)。將小鼠隨機化(n=10/組)並類似於基於細胞之模型實施療法。
使用基於細胞系之正位異種移植物小鼠模型評價ADCC之貢獻。因此,將HER3重組A549-B34轉染細胞i.v.(3×106細胞)注射於雌性SCID灰棕色小鼠(Taconics)中。在第23天當偵測動物中證實肺中腫瘤生長之跡象時,將小鼠隨機化(n=15/組)。小鼠接受每週10-13次i.p.注射25mg/kg RG7116或非糖基工程化RG7116或生理鹽水對照。終止準則係患上運動障礙疾病。終止存活定義為當群組中至少50%動物被殺死時之實驗天數。使用Kaplan-Meier曲線呈現存活數據且借助成對對數秩測試(Pairwise Log-Rank test)比較每一治療組之間之終止存活之差異。
使用呈現不同腫瘤實體(胰腺、TNBC、SSCHN及NSCLC)之皮下小鼠異種移植物模型研究RG7116之活體內活性。所有模型表現顯著磷酸化之HER3,此指示在該等模型中HER3被激活;因此,細胞生長可依賴於HER3信號傳導。由於皮下異種移植物模型在腫瘤之位點處缺少免疫效應細胞,因此該等模型僅反映經由HER3信號傳導抑制介導之抗腫瘤效能;沒有來自ADCC之貢獻。
RG7116已BxPC3小鼠異種移植物模型在證實劑量依賴性TGI(圖6A)。RG7116在0.3mg/kg至25mg/kg範圍內之腹膜腔內劑量係高度有效的且與對照小鼠相比導致TGI>90%。0.1mg/kg之劑量僅達成部分TGI。在研究結束時(第56天),將小鼠殺死並檢查外植腫瘤組織是否存儲HER3及pHER3。與對照動物相比,在經單一試劑RG7116以0.3mg/kg至25mg/kg之劑量治療之小鼠中pHER3之含量明顯降低(圖
4B)。僅RG7116之非有效劑量(0.1mg/kg)未能完全抑制HER3磷酸化。檢查當藉由免疫組織化學檢查外植組織時,與利用媒劑對照及0.1mg/kg RG7116治療之腫瘤外植體相比,有效劑量之RG7116顯得下調膜HER3之含量(圖4C),同時如利用西方墨點法所看到具有相同動力學。
在HER3陽性人類NSCLC(腺癌及鱗狀)模型(基於細胞系及片段)中,單一試劑RG7116誘導有效TGI(圖7)。利用RG7116以10-25mg/kg之劑量一週一次治療4至6個循環在5/6鱗狀NSCLC模型(包括在3/6中腫瘤停滯或完全消退)中導致強TGI(圖7A)。圖5B顯示其中達成完全消退之實例鱗狀NSCLC模型(LXFE722)。在其中單一試劑RG7116並未抑制腫瘤生長之LXFE646模型中,當RG7116與HER1靶向療法組合時達成腫瘤停滯(數據未顯示)。在5/10腺癌NSCLC異種移植物模型中觀察到實質TGI(>50%)(圖7A)。
已知所有NSCLC腫瘤模型之c-Met表現狀態及KRAS突變狀態。在三個過表現c-Met之腺癌細胞系(HCC827、Lu7397及NCI-H441)中由HER3信號抑制介導之RG7116之效能降低,而在兩個KRAS-突變體模型(A549及LXFA983)中觀察到TGI>50%。亦過表現c-Met之第三KRAS突變細胞系(NCI-H441)中未觀察到TGI。
而且,在其中HER1(FaDu細胞,表現HER1)或HER2(MAXF449細胞,HER2正常型癌細胞)分別係較佳異源二聚體化配對物之模型中,RG7116當與靶向HER1(RG7160[GA201];圖7C)或HER2(帕妥珠單抗;圖7D)之抗體組合時,其效能增強。在兩種情況只能夠,組合治療均導致長效及完全腫瘤衰退。
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<120> 抗-HER3抗體之組合療法
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<223> 抗-HER1抗體GA201之輕鏈可變結構域VL
<400> 21
Claims (16)
- 一種結合至人類HER3之抗體,其係與結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體組合用於治療癌症,其中該癌症係HER2正常型癌症。
- 如請求項1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:6之CDR1L區或SEQ ID NO:7之CDR1L區。
- 如請求項1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為重鏈可變結構域,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
- 如請求項1之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其中該結合至人類HER2且抑制HER2之二聚之抗體係帕妥珠單抗(pertuzumab)。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
- 如請求項1至4中任一項之抗體,其中該癌症係乳癌、卵巢癌、 胃癌、前列腺癌、胰腺癌或頭頸癌乳癌。
- 一種結合至人類HER3之抗體,其係與結合至人類HER1之抗體組合用於治療癌症,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體中之至少一者之特徵在於該抗體在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
- 如請求項9之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體及該結合至人類HER1之抗體二者之特徵在於在Asn297處經糖鏈糖基化,藉此該糖鏈中岩藻糖之量為65%或更低。
- 如請求項9或10之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於包含SEQ ID NO:1之CDR3H區、SEQ ID NO:2之CDR2H區及SEQ ID NO:3之CDR1H區作為重鏈可變結構域,且輕鏈可變結構域包含SEQ ID NO:4之CDR3L區、SEQ ID NO:5之CDR2L區及SEQ ID NO:7之CDR1L區。
- 如請求項9或10之抗體,其中該結合至人類HER3之抗體之特徵在於重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:8;且輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:10。
- 如請求項11之抗體,其中該結合至人類HER1之抗體之特徵在於該重鏈可變結構域VH係SEQ ID NO:20;且該輕鏈可變結構域VL係SEQ ID NO:21。
- 如請求項9或10之抗體,其中該癌症之特徵在於HER3表現。
- 如請求項14之抗體,其中該癌症之特徵在於HER1表現。
- 如請求項9或10之抗體,其中該癌症係肺癌或乳癌、結腸直腸癌或頭頸癌。
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