TW201350147A - 滅菌組成物 - Google Patents

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Makoto Satake
Hiroaki Kaneko
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Abstract

本發明係提供一種包含蛋白質以及含有該蛋白質之脂肪族聚酯，經放射線滅菌之滅菌組成物。利用該滅菌組成物，可維持蛋白質的構造與功能(活性)。

Description

滅菌組成物
本發明係有關一種藉由被包含於脂肪族聚酯中而維持功能之蛋白質之滅菌組成物。
近年來，天然及合成蛋白質作為藥劑的重要性正日益增大。而使用於醫療用途時，製品必須為經滅菌之狀態。滅菌方法已知有使用高壓滅菌鍋(autoclave)的加熱滅菌、藉由γ射線及電子射線之離子化放射線滅菌、利用氧化乙烯氣體的氣體滅菌、使用過氧化氫之電漿滅菌、使用戊乙醛製劑的化學滅菌劑以及使用過濾器的分離滅菌等。然而，具有生理活性的蛋白質等蛋白質，因熱或放射線的滅菌，而使活性降低。利用氧化乙烯之滅菌，不僅可能因為化學反應而生成副產物，亦存在毒性強的殘留氣體會對人體等造成不良影響之可能性。利用化學滅菌劑之滅菌，存在必須考慮蛋白質對於滅菌劑之耐受性、pH的變化、離子強度的變化或溫度的變化等問題。因此現狀係製造含有、固定蛋白質之醫藥品、醫療品時，製造步驟必須全程在無菌狀態下進行，必須花費莫大的製造成本。
另外，含蛋白質的溶液可藉由過濾器進行分離滅菌，但難以適用於含有大粒子之組成物，或固體或半固體組成物。
EP0437095號公報中揭示，可利用照射γ射線，對與肝素或肝素片段複合的中和氧化纖維素生成物(nORC)進行滅菌。然而該文件並未揭示對與蛋白質結合的ORC或n-ORC進行滅菌。
EP0562864號公報中揭示含有膠原蛋白海綿基質、第二種生物可吸收性聚合物例如氧化再生纖維素(ORC)的分散纖維、及活性劑例如胜肽之治療複合創傷物質。並記載活性劑可含有基質、生物可吸收性聚合物、或含該二種物質，且可包裝該複合海綿物質後進行滅菌。
US5730933中揭示對具有生物學活性的胜肽，利用照射γ射線或電子束卻不使該生物學活性消失之滅菌方法。該方法係包含：形成含有具生物學活性的胜肽與明膠等外來蛋白質之混合物，冷凍或冷凍乾燥該混合物，其次再照射該混合物之步驟之技術，以及記載外來蛋白質的存在係可使胜肽安定化，防止胜肽的活性降低。
國際公開WO2000/033893號公報中記載與由治療胜肽、氧化再生纖維素、中和氧化再生纖維素、以及該等的混合物所成群中選擇之多醣體所形成之複合體。並記載利用離子化放射線滅菌前的胜肽與有效量的多醣體之共同製劑，即使利用離子化放射線進行滅菌，亦不會使胜肽治療劑的生物學活性消失並使其安定化。
然而該等文件並未暗示，脂肪族聚酯可抑制利用離子化放射線進行滅菌時引起的蛋白質凝集等構造變化與失活。
另一方面，特開2011-47089號公報記載含有優異酵素活性的酵素的奈米纖維之製造方法。該方法係將含有酵素與溶解於非水溶媒的聚合物之紡絲液，藉由放電紡絲法進行紡絲，形成酵素前驅奈米纖維後，給予水份後再進行乾燥。然而，該文獻中並無記載有關對含有酵素的奈米纖維進行滅菌之內容。
本發明之目的係提供可維持蛋白質的構造與功能之滅菌組成物。
本發明之團隊為解決前述課題專心研究後，發現令人驚訝地藉由使蛋白質包含於脂肪族聚酯中，可抑制放射線滅菌引起的蛋白質構造變化及功能降低，以及伴隨經放射線滅菌後保存所帶來的變化及降低之任一種情形或該二種情形，而達到本發明之目的。
亦即，本發明係包含蛋白質以及含有該蛋白質之脂肪族聚酯，經放射線滅菌之滅菌組成物。
[圖1]圖1係將分別針對實施例1及實施例2所得之本發明之含凝血酶(thrombin)的薄片狀纖維成形體、實施例3所得之本發明之含凝血酶薄膜、比較例1之含凝血酶粒子以及比較例2所得之含比較凝血酶的薄片狀纖維成形體所測定之凝血酶活性，相對於滅菌前的初期值，經滅菌後時之值以及滅菌後經1個月保存後之值之維持比例(維持率，%)。
[圖2]分別針對實施例4所得之本發明之含纖維蛋白原(fibrinogen)的薄片狀纖維成形體，以及比較例3之含纖維蛋白原粒子所測定之纖維蛋白原凝集體量(%)，於未照射、滅菌後(OM)以及滅菌後經保存1個月後(1M)之情形。
本發明係包含蛋白質以及含有該蛋白質之脂肪族聚酯，經放射線滅菌之滅菌組成物。
並未特別限制使用於本發明之蛋白質。較適合者可列舉例如以纖維蛋白原、凝血酶為代表的止血性蛋白質、以天門冬醯胺酶、過氧化氫酶、超氧化歧化酶、脂肪酶為代表的酵素、以血紅素、血清白蛋白、低密度脂蛋白質為代表的輸送性蛋白質、以肌動蛋白、肌凝蛋白為代表的肌肉蛋白質、以抗體、補體為代表的防禦性蛋白質、以白喉毒素、肉毒桿菌毒素、蛇毒毒素為代表的毒素蛋白質、以胰 島素、增生因子、細胞激素為代表的蛋白質荷爾蒙、以卵清蛋白、儲鐵蛋白為代表的儲藏性蛋白質、以膠原蛋白、角蛋白為代表的構造蛋白質、以表皮生長因子(Epidermal growth factor：EGF)、類胰島素生長因子(Insulin-like growth factor：IGF)、轉化生長因子(Transforming growth factor：TGF)、神經生長因子(Nerve growth factor：NGF)、腦源神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor：BDNF)、血管內皮細胞增殖因子(Vesicular endothelial growth factor：VEGF)、顆粒球群落刺激因子(Granulocyte-colony stimulating factor：G-CSF)、顆粒單核球群落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor：GM-CSF)、血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor：PDGF)、紅血球生成素(Erythropoietin：EPO)、血小板生成素(Thrombopoietin：TPO)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor：bFGF或FGF2)、肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor：HGF)代表的生長因子。其中較佳係酵素、輸送性蛋白質、肌肉蛋白質、防禦性蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質荷爾蒙、儲藏性蛋白質、構造蛋白質以及生長因子。
本發明中使用之蛋白質，可為來自動物或利用基因重組技術而製造者。來自動物者以來源為人類者為佳。利用基因重組技術而製造的蛋白質若為具有相同本質的生物活性，亦可為以其他胺基酸序列取代原有的胺基酸序列之重 組體。另外，亦可使用該等蛋白質經修飾者，以及該等之混合物。
另外，於本發明使用的蛋白質中亦可加入藥學上許可的添加劑。而該等添加劑較佳的例子可舉出由凝血第十三因子、白蛋白、異白胺酸、甘胺酸、精胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、界面活性劑、氯化鈉、糖醇(甘油、甘露糖醇等)、海藻糖、檸檬酸鈉、抑肽酶(Aprotinin)以及氯化鈣所成群中選擇之一種以上。
本發明中使用之蛋白質或蛋白質與添加劑之混合物，可於脂肪族聚酯中以個別的分子的形式分散而存在，但以個別的分子集合為粒子(以下包含與添加劑在一起的混合粒子有時記作「蛋白質粒子」)之形式分散而存在為佳。
本發明中使用之脂肪族聚酯，以生物可吸收性或生物可分解性聚合物為佳。生物可吸收性聚合物之具體例可舉出聚乳酸、聚甘醇酸、聚乳酸-聚甘醇酸共聚合物、聚己內酯、聚乳酸-聚己內酯共聚合物、聚甘油癸二酸、聚羥基羧酸、聚丁烯琥珀酸酯以及該等之衍生物。
其中，較佳係為由聚甘醇酸、聚乳酸、聚己內酯、該等之共聚合物、以及該等之混合物所成群中選擇者，最佳係聚乳酸、聚乳酸-聚甘醇酸共聚合物。亦可使用例如聚L乳酸與聚D乳酸之立體錯合物晶體。
本發明中使用的脂肪族聚酯分子量係1×103~5×106，較佳係1×104~1×106，更佳係5×104~5×105。另外，可任意選擇聚合物的末端構造及聚合物進行聚合時之觸媒。
本發明之滅菌組成物，於不損及其目的之範圍內，可併用其他聚合物及其他化合物。例如聚合物共聚合、聚合體摻合物、化合物混合。
本發明中使用的脂肪族聚酯以高純度為佳，特別係脂肪族聚酯中所含添加劑及可塑劑、殘存觸媒、殘存單體、於成形加工及後加工時使用的殘留溶媒等殘留物愈少愈好。尤其是使用於醫療時，必須降低至未超過安全性的標準值。
本發明中「含有蛋白質」係指蛋白質之至少一部分嵌入脂肪族聚酯的內部中。蛋白質係存在於組成物表面及組成物之空隙中，為與因冷凍乾燥而形成的複合體有所區別之狀態。
本發明之滅菌組成物之形狀並無特別限制，可舉出例如纖維、薄膜、薄片、板狀體、管狀體、線狀體、棒狀體、緩衝材料、發泡體、多孔質體等。製造成形品時之成形方法，若為不會影響蛋白質構造及使活性降低之方法則無特別限制，可採用例如押出成形、射出成形、壓延成形、壓縮成形、吹製成形、真空成形、粉末成形、鑄造成形、注型等適當的成形方法。其中，由於本發明之滅菌組成物適用於纖維以及薄膜形狀，製造該等物品時，亦可採用先前於製造塑膠纖維或薄膜之製造時即採用之任一種方法，可舉出例如吹袋押出成形法、T型機頭押出成形法等押出成形法、壓延成形法、鑄造成形法(casting)等。前述之成形可利用溶融成形而進行，或可利用溶液成形，但 為了防止蛋白質之功能降低，以及使蛋白質容易分散，以溶液成形為佳。
此處纖維形狀係指將獲得之一條或數條纖維進行層積，經由紡織、編織或其他手法而形成的三維的成形體。具體的纖維型態可舉出例如不織布。進而以其為基礎進行加工後之管、網等亦包含於纖維形狀。
具有本發明之纖維形狀之滅菌組成物的平均纖維徑，例如為0.01~50μm，相關業者可因應使用目的適當訂定。
另外，具有本發明纖維形狀的滅菌組成物亦可為由長纖維形成者。長纖維具體而言係指自紡絲至纖維成形體加工完成的步驟中，未加入切斷纖維之步驟而形成的纖維，可利用電紡絲法、熱黏合無紡法、熔噴法等進行成形。該等方法中，以電紡絲法較適合使用。
電紡絲法係藉由對溶解有聚合物的液體施加高壓電，於電極上獲得纖維成形體之方法。步驟係包含：製造溶解有聚合物之紡絲液之步驟、對該溶液施加高壓電之步驟、使該溶液噴出之步驟、使噴出的溶液中的溶媒蒸發後形成纖維成形體之步驟、採用可任意實施之步驟使形成的纖維成形體的電荷消失之步驟、以及因電荷消失而使纖維成形體累積之步驟。
以下，以電紡絲法為例，說明本發明中，具有纖維形狀或不織布形狀之滅菌組成物之製造法。
針對電紡絲法中製造紡絲液之階段進行說明。本發明 中紡絲液並無特別限制，可使用例如由脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質水溶液形成之乳狀液、由脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質粒子形成之懸濁液、由脂肪族聚酯與溶解有蛋白質的有機溶媒溶液，但以使用由脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質粒子形成之懸濁液為佳。
脂肪族聚酯溶液中脂肪族聚酯的濃度以1~30重量%為佳。脂肪族聚酯的濃度低於1重量%時，形成纖維成形體變為困難而不佳。另外，高於30重量%時所得之纖維成形體的纖維徑會變大而不佳。較佳係有機溶媒溶液中，脂肪族聚酯的濃度為2~20重量%。
脂肪族聚酯的溶媒若為可溶解脂肪族聚酯，且於進行紡絲的階段可蒸發，可形成纖維者則無特別限制，可單獨使用一種，亦可組合使用數種溶媒。可舉出例如氯仿、異-丙醇、甲苯、苯、苯甲醇、二氯甲烷、四氯化碳、環己烷、環己酮、三氯乙烷、丁酮、乙酸乙酯、以及該等之混合溶媒。另外，於形成乳狀液之範圍內，亦可含有丙酮、乙醇、甲醇、四氫呋喃、1,4-二氧陸圜、1-丙醇、酚、吡啶、乙酸、甲酸、六氟-2-丙醇、六氟丙酮、N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、乙腈、N-甲基-2-吡咯酮、N-甲基嗎琳-N-氧化物、1,3-二氧環戊烷等溶媒。其中，自操作性及物性以使用二氯甲烷、乙醇為佳。
本發明中，蛋白質可與脂肪族聚酯的有機溶媒溶液以固體、液體、或溶液中之任一狀態進行添加、混合。
本發明中，將由脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質 水溶液形成的乳狀液，作為紡絲液使用時，蛋白質的水性溶媒若為可溶解蛋白質，且與脂肪族聚酯的有機溶媒溶液可形成乳狀液，於進行紡絲的階段可蒸發，可形成纖維者則無特別限制。例如可使用生理食鹽水及各種緩衝液。進而，亦可添加蛋白質的安定劑及添加劑。其中以使用磷酸緩衝液、生理食鹽水為佳。
本發明中並未特別限制使用的蛋白質水溶液中的蛋白質濃度，可因應蛋白質的特性而適當地訂定，例如0.5~50重量%。
調製由脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質水溶液形成的乳狀液時，二者的混合比例，若為可形成安定的乳狀液則無特別限制，可為例如(蛋白質水溶液)/(脂肪族聚酯的有機溶媒溶液)(體積比)為1/100~1/2。該數值較1/2為大時，乳狀液會變為不安定而不佳。
並未特別限制混合脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質水溶液，調製乳狀液的方法，可使用超音波及各種攪拌方法。攪拌方法可使用如均質攪拌機的高速攪拌，或磨碎機、球磨機等攪拌方法。其中以利用超音波處理的分散方法為佳。
另外可於有機溶媒與蛋白質水溶液形成乳狀液後，添加脂肪族聚酯，調製紡絲液。
本發明中，將由脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質形成的懸濁液，作為紡絲液使用時，並未特別限制蛋白質粒子的尺寸，但以落於0.01~100μm之範圍為佳。製作 較0.01μm為小的蛋白質粒子有技術上的困難，而較100μm大時，分散性不佳，會使滅菌組成物變為脆弱而不佳。
混合脂肪族聚酯的有機溶媒溶液與蛋白質粒子時，調製懸濁液的方法，並無特別限制，可使用超音波及各種攪拌方法。攪拌方法可使用如均質攪拌機的高速攪拌，或磨碎機、球磨機等攪拌方法。其中以利用超音波處理的分散方法為佳。
另外，可由有機溶媒與蛋白質粒子形成懸濁液後，添加脂肪族聚酯，調製紡絲液。
於調製懸濁液前，可對蛋白質粒子進行微細處理。微細處理係包含乾式粉碎與濕式粉碎，本發明中可採用任一種方法，亦可組合二者進行處理。
乾式粉碎處理可舉出例如使用球磨機之處理、使用行星式球磨機或震動球磨機之處理、使用研砵藉由研磨棒之磨碎處理、媒介攪拌型研磨機、噴射研磨機、使用石臼之研磨處理等。
另一方面，濕式粉碎處理係可舉出於適當的分散媒中使蛋白質粒子分散之狀態下，藉由高剪斷力之攪拌裝置、混練裝置等之攪拌處理，或於分散於媒體中之狀態下，利用球磨機、珠球磨機處理等。進而亦可使用利用噴灑乾燥所製作之蛋白質粒子。
本發明中使用之滅菌方法係放射線滅菌。可使用之放射線可舉出例如α射線、β射線、γ射線、中子射線、電 子射線以及X射線。其中以γ射線及電子射線為佳，最佳係電子射線。該等滅菌方法並無特別限制，放射線之照射量以10~80kGy為佳，20~30kGy更佳。溫度條件雖未特別限制，但以-80~40℃為佳，-80~30℃更佳。
當α射線、陽離子射線、γ射線、中子射線、電子射線、X射線等放射線照射至物質時會自構成物質的分子、原子中奪取電子。此時分子鍵結被切斷，並產生反應性高的游離基等，與周圍物質進行次級化學反應。
目前已詳知蛋白質因照射放射線而容易失去功能(活性)。原因被認為係因照射而使分子鍵結被切斷，表現功能之根本「構形」(conformation)被破壞所致。進而如本說明書之比較例所示，蛋白質即使於放射線照射後之保存，亦引起構造破壞及失去活性。儘管如此，本發明之包含於脂肪族聚酯中之蛋白質，即使經過放射線照射亦可抑制構造破壞及功能降低，亦抑制了因照射後之保存而造成更進一步的構造破壞及功能降低。其意指於本組成物中保持了活性蛋白質的構形，其係無論蛋白質種類之共通效果。並不認為該效果係穿透脂肪族聚酯的厚度而產生的遮蔽效果，目前尚未確定其抑制機構。
本發明中含放射線滅菌前蛋白質之脂肪族聚酯，亦可進而含有電子、離子捕捉劑、能量轉移劑、游離基捕捉劑、抗氧化劑、可塑劑。電子、離子捕捉劑可舉出例如N,N’-四甲基苯二胺、二苯二胺、芘(pyrene)、醌(quinone)等。能量轉移劑可舉出例如乙烷合萘等。游 離基捕捉劑可舉出例如硫醇、八氫菲、單烷基二苯醚、生育酚、檸檬酸、叔丁基-4-羥基苯甲醚、二丁羥基甲苯、第三丁基醌、沒食子酸丙酯、抗壞血酸衍生物等。抗氧化劑可舉出BHT、亞磷酸三酯、苯系抗老化劑、有機硫酸鹽類等。其中，以使用可安全用於食品及醫藥品與一般公認的添加劑為佳。並未特別限制添加劑之量，以例如於滅菌組成物中相對於脂肪族聚酯，含有0.01~10重量%之添加劑為佳。
滅菌步驟中含蛋白質之脂肪族聚酯，以不含有水份為佳。水份率以10重量%以下為佳，4重量%以下更佳，進而更佳係實質上無水者。
另外，含蛋白質之脂肪族聚酯，亦可使用包裝材料包裝後再進行放射線滅菌。相關的包裝材料以使用如鋁箔等氣體屏蔽性高之材料為佳。另外，可將脫氧劑及乾燥劑一同進行密封包裝、或於去除氣體後經填充惰性氣體之狀態下進行包裝，或可進行全部該二種包裝。相關之脫氧劑及乾燥劑，以使用不對人體造成危害，且於放射線照射時不會失去活性者為佳。
本發明之滅菌組成物，可使用為追求例如蛋白質功能以及滅菌性之醫療用材料。
[實施例]
以下利用實施例說明本發明之實施方式，但本發明之範圍未因該等例示而有所限制。
1.凝血酶(thrombin)活性測定
於Falcon公司製之2008試管中加入20μL之試料，與60μL之50mM Tris-HCl(pH8.5)+50mM NaCl緩衝溶液、20μL之0.1% PLURONIC F-68，並於37℃下進行孵育3分鐘。標準品係使用以相同緩衝液，將純化自人類血漿之α-凝血酶(購自血液技術學公司：HCT-0020)稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.3125U/mL者。於該反應液中添加100μL之試驗組發色基質S-2238(1mM：第一化學藥品工業)後進行攪拌混合，於37℃下進行反應5分鐘後，加入800μL之0.1M檸檬酸溶液停止反應。將200μL之反應液移至96孔微孔盤，使用OD405/650進行測定。
實施例5~7及比較例4以外，使用下述方法進行測定。於BD公司製之聚苯乙烯試管中加入20μL之試料，與80μL之活性測定用稀釋溶液(0.01%之F-68、50mmol/L之NaCl、50mmol/L之Tris-HCl，pH8.4)，並於37℃下進行孵育3分鐘。標準品係使用以相同緩衝液，稀釋基因重組的凝血酶(JPU Thrombin Standard 400U/mL或WHO/US Thrombin Standard 110IU/ml)，使用JPU時，稀釋為4、2、1、0.5、0.25U/mL者，使用IU時，稀釋為6、3、1.5、0.75、0.375IU/mL者。於該反應液中添加100μL之試驗組發色基質S-2238(1mM：第一化學藥品工業)後進行攪拌混合，於37℃下進行反應7分鐘 後，加入800μL之0.1M檸檬酸溶液停止反應。將200μL之反應液移至96孔微孔盤，使用OD405/650進行測定。
2.纖維蛋白原(fibrinogen)凝集體量測定
將薄片切割出Φ 1cm之後，藉由稀釋液萃取出纖維蛋白原，使用高速液相層析儀，測定其凝集體量。
<試驗條件>
檢測器：紫外線吸光光度計：(測定波長：280m)
管柱：Bio Sep-SEC-s4000(7.8×300mm，Phenomenex)
管柱溫度：25℃
收集器溫度：6℃
移動相：0.5mol/L Arg-HCl/50mmol/L磷酸緩衝液
流量：1mL/min
分析時間：20min
3.厚度
成形體係使用高精密度數位式測長儀(股份有限MITUTOYO(三豐)：商品名「LITEMATIC VL-50」)，利用測定力0.01N，n=15，測定成形體之膜厚後，計算出平均值作為成形體之厚度。且本測定中，測定機器使用可提供之最小的測定力進行測定。
4.單位面積之重量
將成形體切割為50mm×100mm並測量其重量，藉由換算，計算出成形體之單位面積之重量。
5.體密度
自上述測定之厚度與單位面積之重量值，計算出成形體之體密度。
6.凝血酶ELISA測定
使5μg/mL之抗人類凝血酶抗體(Affinity Biological公司，No.SAHT-AP)固定於ELISA酵素分析盤(NUNC 468667)之上。使用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨後，於各微孔中添加封閉劑BLOCK ACE(DS Pharma Bioemedical UK-B80)，進行封閉。再使用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨後，添加檢體。使用人類凝血酶(血液技術學公司：HCT-0020)作為標準品，製作檢量線。使用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨後，添加0.1μg/mL之經HRP標誌之抗人類凝血酶抗體(Affinity Biological公司，No.SAHT-HRP)。進行反應後，使用含有0.05% Tween 20之PBS洗淨，添加入TMB試藥(Dako S1599)，靜置10分鐘使其發色。加入1N H2SO4，使發色停止，利用微孔盤測讀機以OD450-650nm進行測定。
7.脂肪酶以及β-葡萄糖苷酶之酵素活性測定
(1)萃取率測定
將成形體切下2cm×2cm，浸漬於1mL的生理食鹽水3分鐘或3小時，使已固定化之酵素溶出。以n=3進行試驗並測定實驗前後之重量變化，利用下式求得計算之萃取率之平均值。固定化酵素理論重量係自組成物之重量、加入之酵素粉末重量%而計算。
萃取比率=減少重量(mg)/固定化酵素理論重量(mg)
(2)酵素活性測定
脂肪酶活性測定係使用連續螢光脂肪酶試驗(Continuous Fluorometric Lipase Test試劑組(PROGEN BIOTECHNIK GMBH製))。利用下述式算出活性回收率。活性酵素量係自活性值換算濃度而計算。每單位面積之固定化酵素理論重量係自加入之酵素粉末重量%與組成物之單位面積之重量而計算。
活性回收率(%)={活性酵素量(mg/cm2)/(每單位面積之固定化酵素理論重量(mg/cm2)×萃取比例)}×100
β-葡萄糖苷酶之酵素活性測定係使用Tokyogreen(註冊商標，下同)-β Glu(積水化學股份有限公司)，並利用螢光測定計行試驗。利用下述式算出活性回收率。固定化酵素理論重量係自加入之酵素粉末重量%與組成物 之重量而計算。
活性回收率(%)={活性酵素量(mg)/(固定化酵素理論重量(mg)×萃取比例)}×100
利用下式計算活性維持率。
活性維持率(%)={滅菌後之活性回收率(%)/滅菌前之活性回收率(%)}×100
實施例1
使含凝血酶粒子(將含有1mg/mL之重組凝血酶(recombinant thrombin)、氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣以及甘露糖醇之pH 7之水溶液經冷凍乾燥者)分散於乙醇中之後，加入二氯甲烷，溶解聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物(Purasorb PDLG5010，Purac公司製)使之成為10重量%，調製含凝血酶粒子/聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物=100(凝血酶為1.69)/100(w/w)之紡絲液。利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。所得之纖維成形體厚度為131μm，單位面積之重量為1.44mg/cm2，體密度為111mg/cm3。將所得之薄片切割直徑為1cm之面積，以200μL的生理食鹽水萃取蛋白質，實施活性測定。其結果活性測定值為26.7U/cm2。將所得之薄片以20kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之凝血酶活性。剛照射電子射線後凝血酶活性，將滅菌前定為100%時，維持率為79%。1個月後的活性維持率為78%，未發現保存中凝血酶活性之降 低。
實施例2
使含凝血酶粒子(將含有1mg/mL之重組凝血酶、氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣以及甘露糖醇之pH 7之水溶液經冷凍乾燥者)，與綠色202號(Quinizarine Green SS)(東京化成)分散於乙醇中之後，加入二氯甲烷，溶解聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物(Purasorb PDLG5010，Purac公司製)之使成為10重量%，調製含凝血酶粒子/聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物=100(凝血酶為1.69)/100(w/w)之紡絲液。利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。將含有獲得之纖維成形體(平均厚度：129μm，單位面積之重量：1.49mg/cm2，體密度：124mg/cm3)之薄片切割直徑為1cm之面積，以200μL的生理食鹽水萃取蛋白質，實施活性測定。其結果，活性測定值為40.2I U/cm2。將所得之薄片以30kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之凝血酶活性。剛照射電子射線後凝血酶活性，將滅菌前定為100%時，維持率為70%。1個月後的活性維持率為74%，未發現保存中凝血酶活性之降低。
實施例3
使含凝血酶粒子(將含有1mg/mL之重組凝血酶、氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣以及甘露糖醇之pH 7之水溶液 經冷凍乾燥者)，分散於乙醇中之後，加入二氯甲烷，溶解聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物(Purasorb PDLG5010，Purac公司製)使之成為10重量%，調製含凝血酶粒子/聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物=100(凝血酶為1.69)/100(w/w)之鑄膜液。使用所得之鑄膜液，利用鑄造法製作薄膜。塗工間隔係127μm，塗工速度為30.1mm/sec。所得之薄片之厚度為58μm，單位面積之重量為2.9mg/cm2，體密度為504mg/cm3。將所得之薄片切割直徑為1cm之面積，以200μL的生理食鹽水萃取蛋白質，實施凝血酶活性測定。其結果，活性測定值為71.1I U/cm2。將所得之薄片以30kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之凝血酶活性。剛照射電子射線後凝血酶活性，將滅菌前定為100%時，維持率為75.7%。1個月後的活性維持率為82%，未發現保存中凝血酶活性之降低。
實施例4
使含纖維蛋白原粒子(將含有10mg/mL之重組纖維蛋白原(recombinant fibrinogen)、精胺酸、氯化鈉以及甘露糖醇之pH 8.5之水溶液經冷凍乾燥者)分散於乙醇中之後，加入二氯甲烷，溶解聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物(Purasorb PDLG5010，Purac公司製)使之成為10重量%，調製含纖維蛋白原粒子/聚甘醇酸-聚乳酸共聚合物=100(纖維蛋白原為50.85)/100(w/w)之紡絲液。利用 電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。所得之纖維成形體厚度為131μm，單位面積之重量為1.44mg/cm2，體密度為110mg/cm3。將所得之薄片切割直徑為1cm之面積，以稀釋液萃取纖維蛋白原之後，利用高速色層分析儀測定凝集體量。其結果，凝集體量係9.79%。將所得之薄片以30kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之凝集體量。剛照射電子射線後之凝集體量係18.81%。1個月後為24.14%。
比較例1
使含凝血酶粒子(將含有1mg/mL之重組凝血酶、氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣以及甘露糖醇之pH 7之水溶液經冷凍乾燥者)，以30kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之凝血酶活性。照射前之凝血酶活性為404.73U/安瓶。剛照射電子射線時之凝血酶活性，若將滅菌前定為100%時，維持率為51.8%。1個月後的活性維持率為17.9%，發現保存中凝血酶活性之降低。
比較例2
使含凝血酶粒子(將含有1mg/mL之重組凝血酶、氯化鈉、檸檬酸鈉、氯化鈣以及甘露糖醇之pH 7之水溶液經冷凍乾燥者)分散於異丙醇(2-propanol)之後，溶解 羥丙基纖維素(2.0-2.9mPa‧s，日本曹達(Nippon Soda)製)使之成為13重量%，調製含凝血酶粒子/羥丙基纖維素=100/100(w/w)之鑄膜液。利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。所得之纖維成形體厚度為204μm，單位面積之重量為2.08mg/cm2，體密度為101mg/cm3。將所得之薄片切割直徑為1cm之面積，以200μL的生理食鹽水萃取蛋白質，實施活性測定。其結果活性測定值為110.3 I U/cm2。將所得之薄片以30kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之凝血酶活性。剛照射電子射線後凝血酶活性，將滅菌前定為100%時，維持率為68.4%。1個月後的活性維持率為54.9%，發現保存中凝血酶活性之降低。
比較例3
使含纖維蛋白原粒子(將含有10mg/mL之重組纖維蛋白原、精胺酸、氯化鈉以及甘露糖醇之pH 8.5之水溶液經冷凍乾燥者)，以30kGy的電子射線照射進行滅菌後，保存於40℃/75%RH環境下，測定1個月後之纖維蛋白原之凝集體量。照射前之凝集體量為6.97%。剛照射電子射線時之凝集體量為18.51%。1個月後的凝集體量54.72%。
將實施例1~3、比較例1~2之結果(於滅菌後以及滅菌後保存後，相對於滅菌前之凝血酶(Th)活性維持 率)示於圖1。
藉由使蛋白質含於脂肪族聚酯中，相對於僅使用含蛋白質粒子之情況(比較例1)，因放射線滅菌而造成的蛋白質之構造變化及功能下降得以被抑制，進而放射線滅菌後之保存伴隨之該等變化及降低，對於不是使用脂肪族聚酯，而是纖維素類(羥丙基纖維素)時(比較例2)，可得知各自被抑制的情況。
實施例4以及比較例3之結果(於滅菌後以及滅菌後保存後，纖維蛋白原之凝集體量)示於圖2。
藉由使蛋白質含於脂肪族聚酯中(實施例4)，可得知相對於僅使用含蛋白質粒子之情況(比較例3)，放射線滅菌後之保存伴隨之蛋白質之構造變化被抑制。
實施例5
使含凝血酶粒子(黏著止血劑(Bolheal)(註冊商標，下同)，組織黏合用：安瓶3)分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸(PL18，Purac Biomaterial製)使之成為10wt%，調製含凝血酶粒子/聚乳酸=40(凝血酶為0.45)/100(w/w)之紡絲液。利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。將所得之薄片以20kGy的電子射線進行滅菌。將所得之薄片切割2cm×2cm之面積，以1mL生理食鹽水萃取蛋白質後，實施活性以及ELISA測定。其結果活性測定值為5.0U/cm2。ELISA測定值為3.4μg/cm2。另一方面，針對未經滅菌處理之薄片實施相 同的活性以及ELISA測定，其結果活性測定值為7.5U/cm2，ELISA測定值為4.35μg/cm2。亦即，相對於未滅菌之薄片，經滅菌之薄片之活性維持率為73%。
實施例6
使含凝血酶粒子(Bolheal組織黏合用：安瓶3)分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸(PL18，Purac Biomaterial製)使之成為10wt%，調製含凝血酶粒子/聚乳酸=70(凝血酶為0.78)/100(w/w)之紡絲液。利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。將所得之薄片以20kGy的電子射線進行滅菌。將所得之薄片切割2cm×2cm之面積，以1mL生理食鹽水萃取蛋白質後，實施活性以及ELISA測定。其結果活性測定值為9.575U/cm2。ELISA測定值為7.0μg/cm2。另一方面，針對未經滅菌處理之薄片實施相同的活性以及ELISA測定，其結果活性測定值為11.15U/cm2，ELISA測定值為7.2μg/cm2。亦即，相對於未滅菌之薄片，經滅菌之薄片之活性維持率為86%。
實施例7
使含凝血酶冷凍乾燥粉末(Bolheal組織黏合用：安瓶3)分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸(PL18，Purac Biomaterial製)使之成為10wt%，調製凝血酶冷凍乾燥粉末/聚乳酸=100(凝血酶為1.1)/100 (w/w)之紡絲液。於溫度22℃、濕度26%環境下，利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。採用噴出噴嘴之內徑為0.8mm、電壓為15kV、紡絲液流量為3.0mL/h，自噴出噴嘴至平板間之距離為25cm。將所得之薄片以20kGy的電子射線進行滅菌。將所得之薄片切割2cm×2cm之面積，以1mL生理食鹽水萃取蛋白質後，實施活性以及ELISA測定。其結果活性測定值為15U/cm2，ELISA測定值為11μg/cm2。另一方面，針對未經滅菌處理之薄片實施相同的活性以及ELISA測定，其結果活性測定值為23U/cm2，ELISA測定值為16μg/cm2。亦即，相對於未滅菌之薄片，經滅菌之薄片之活性維持率為64%。
比較例4
將含凝血酶粒子(Bolheal)以20kGy的電子射線進行滅菌。以1mL生理食鹽水萃取蛋白質後，實施活性以及ELISA測定。其結果活性測定值為22.5U/cm2。ELISA測定值為11.5μg/cm2。另一方面，針對未經滅菌處理之含凝血酶粒子實施相同的活性以及ELISA測定，其結果活性測定值為68.5U/cm2，ELISA測定值為41.5μg/cm2。亦即，相對於未滅菌之薄片，經滅菌之薄片之活性維持率為32%。
實施例8
使脂肪酶粉末(來自豬胰臟，和光純藥製，下同)分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸-甘醇酸共聚合物(PDLG5010，Purac Biomaterial製)使之成為10wt%，調製脂肪酶粉末/聚乳酸-甘醇酸共聚合物=50/100(w/w)之紡絲液。於溫度27℃、濕度25%環境下，利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。採用噴出噴嘴之內徑為0.9mm、電壓為15kV、紡絲液流量為4.0mL/h，自噴出噴嘴至平板間之距離為25cm。獲得薄片之脂肪酶萃取率為79%。將所得之薄片以20kGy的電子射線進行滅菌。將所得之滅菌薄片切割1cm×1cm之面積，利用試劑組中所含之1mL之脂肪酶緩衝液(Lipase buffer)，萃取脂肪酶並實施活性測定。其結果，活性回收率為100%。
實施例9
於脂肪酶粉末中加入二氯甲烷，溶解聚乳酸-甘醇酸共聚合物(PDLG5010，Purac Biomaterial製)使之成為10wt%，調製脂肪酶粉末/聚乳酸=50/100(w/w)之紡絲液。於溫度26℃、濕度25%環境下，利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。採用噴出噴嘴之內徑為0.8mm、電壓為15kV、紡絲液流量為4.0mL/h，自噴出噴嘴至平板間之距離為25cm。獲得薄片之脂肪酶萃取率為63%。將所得之薄片以20kGy的電子射線進行滅菌。將所得之滅菌薄片切割1cm×1cm之面積，利用試劑組中所 含之1mL之脂肪酶緩衝液(Lipase buffer)，萃取脂肪酶並實施活性測定。其結果，活性回收率為92%。
實施例10
使β-葡萄糖苷酶粉末(來自杏仁，東方酵母(Oriental Yeast)工業製，下同)分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸-甘醇酸共聚合物(PDLG5010，Purac Biomaterial製)使之成為10wt%，調製β-葡萄糖苷酶粉末/聚乳酸-甘醇酸共聚合物=38/62(w/w)之紡絲液。於溫度27℃、濕度25%環境下，利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。採用噴出噴嘴之內徑為0.9mm、電壓為15kV、紡絲液流量為4.0mL/h，自噴出噴嘴至平板間之距離為25cm。將所得之薄片切割2cm×2cm之面積後，以20kGy的電子射線進行滅菌。使用1mL之生理食鹽水萃取β-葡萄糖苷酶，再利用Tokyogreen-β Glu實施活性測定。其結果，活性回收率為92%。另一方面，針對未經滅菌處理之薄片實施相同的活性測定，其結果活性回收率為94%。自前述結果，相對於未滅菌纖維成形體，滅菌纖維成形體之活性維持率為98%，可得知未因電子射線滅菌而失去活性。
實施例11
使β-葡萄糖苷酶粉末分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸-聚己內酯共聚合物(PLCA8812，多木化 學製)使之成為10wt%，調製β-葡萄糖苷酶粉末/聚乳酸-聚己內酯共聚合物=38/62(w/w)之紡絲液。於溫度27℃、濕度25%環境下，利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。採用噴出噴嘴之內徑為0.9mm、電壓為15kV、紡絲液流量為3.0mL/h，自噴出噴嘴至平板間之距離為25cm。將所得之薄片切割2cm×2cm之面積後，以20kGy的電子射線進行滅菌。使用1mL之生理食鹽水萃取β-葡萄糖苷酶，再利用Tokyogreen-β Glu實施活性測定。其結果，活性回收率為81%。另一方面，針對未經滅菌處理之薄片實施相同的活性測定，其結果活性回收率為80%。自前述結果，相對於未滅菌纖維成形體，滅菌纖維成形體之活性維持率為101%，可得知未因電子射線滅菌而失去活性。
實施例12
使β-葡萄糖苷酶粉末分散於乙醇後，加入二氯甲烷，溶解聚乳酸(PL18，Purac Biomaterial製)使之成為11wt%，調製β-葡萄糖苷酶粉末/聚乳酸=38/62(w/w)之紡絲液。於溫度27℃、濕度25%環境下，利用電紡絲法進行紡絲，獲得薄片狀之纖維成形體。採用噴出噴嘴之內徑為0.9mm、電壓為15kV、紡絲液流量為3.0mL/h，自噴出噴嘴至平板間之距離為25cm。將所得之薄片切割2cm×2cm之面積後，以20kGy的電子射線進行滅菌。使用1mL之生理食鹽水萃取β-葡萄糖苷酶，再利用 Tokyogreen-β Glu實施活性測定。其結果，活性回收率為62%。另一方面，針對未經滅菌處理之薄片實施相同的活性測定，其結果活性回收率為71%。自前述結果，相對於未滅菌纖維成形體，滅菌纖維成形體之活性維持率為87%，可得知未因電子射線滅菌而失去活性。
比較例5
將脂肪酶粉末以20kGy的電子射線進行滅菌。於1mg粉末中添加1mL之脂肪酶緩衝溶液，並實施活性測定。其結果活性回收率係74%。
比較例6
將β-葡萄糖苷酶粉末以20kGy的電子射線進行滅菌。於2mg粉末中添加1mL之生理食鹽水，再利用Tokyogreen-β Glu實施活性測定。其結果，活性維持率為81%。
[發明的效果]
本發明之滅菌組成物，無論是否經滅菌，可維持蛋白質之構造及功能。
[產業上之可利用性]
本發明之滅菌組成物，可被利用於尋求例如蛋白質之功能以及滅菌性之醫療品之製造業。

Claims (9)

  1. 一種經放射線滅菌之滅菌組成物，其包含蛋白質以及含有該蛋白質之脂肪族聚酯。
  2. 如請求項1之滅菌組成物，其中蛋白質係維持原狀或與藥學上許可的添加物形成混合物，以粒子的形式分散於脂肪族聚酯中。
  3. 如請求項1或2項之滅菌組成物，其中蛋白質係由止血性蛋白質、酵素、輸送性蛋白質、肌肉蛋白質、防禦性蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質荷爾蒙、儲藏性蛋白質、構造蛋白質、生長因子、以及該等之混合物所構成之群組中選擇。
  4. 如請求項1或2項之滅菌組成物，其中蛋白質係止血性蛋白質。
  5. 如請求項1~4項中任一項之滅菌組成物，其中脂肪族聚酯係由聚甘醇酸、聚乳酸、聚己內酯、該等之共聚合物、以及該等之混合物所構成之群組中選擇。
  6. 如請求項1~5項中任一項之滅菌組成物，其係纖維形狀。
  7. 如請求項6之滅菌組成物，其係利用電紡絲法(electrospinning)製造。
  8. 如請求項1~5項中任一項之滅菌組成物，其係薄膜形狀。
  9. 如請求項8之滅菌組成物，其係利用鑄造法(casting)製造。
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