MX2014013818A - Composicion esteril. - Google Patents

Abstract

Una composición estéril que comprende una proteína y un poliéster alifático que contiene la proteína y se esteriliza con radiación. En esta composición estéril, se conservan la estructura y la función (actividad) de la proteína.

Description

COMPOSICION ESTERIL CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a una composición estéril de una proteina que conserva su función, ya que está contenida en un poliéster alifático.

TÉCNICA ANTERIOR Las proteínas naturales y sintéticas son cada vez más y más importantes como fármacos. Cuando se utilizan para aplicaciones médicas, sus productos deben ser esterilizados. Como medio de esterilización, se conocen la esterilización por calor en un autoclave, la esterilización con radiación ionizante tal como un rayo g o haz de electrones, la esterilización por gas con un gas de óxido de etileno, esterilización por plasma con peróxido de hidrógeno, y la esterilización por separado usando un esterilizante químico que comprende una formulación de glutaraldehído o un filtro. Sin embargo, las actividades de las proteínas tales como proteínas bioactivas se reducen mediante esterilización con calor o radiación. La esterilización con óxido de etileno tiene posibilidades de que un subproducto puede ser producido por una reacción química y que un gas residual altamente tóxico puede afectar negativamente el cuerpo humano. La esterilización con un esterilizante químico tiene un problema en cuanto a la resistencia a un esterilizante de una proteina y cambios en el pH, la intensidad de iones y la temperatura debe ser tomada en consideración. Entonces, para la fabricación de productos farmacéuticos y médicos que contienen o inmovilizan una proteina, sus procesos de producción deben ser totalmente llevados a cabo en condiciones estériles y se requiere una gran cantidad de costos de producción.

Aunque una solución que contiene una proteina se somete a esterilización separada con un filtro, es difícil aplicar esta esterilización separada a una composición que contiene partículas grandes o una composición sólida o semisólida.

La patente EP0437095 enseña que un producto de celulosa oxidado neutralizado en combinación con heparina o un fragmento de heparina (NORC) se puede esterilizar por irradiación con rayos gamma. Sin embargo, este documento no enseña la esterilización de ORC o n-ORC al cual se une una proteína.

La patente EP0562864 describe una sustancia para el cuidado de la herida compuesta que contiene una matriz de esponja de colágeno, un segundo polímero bioabsorbible, tal como una fibra dispersada de celulosa regenerada oxidada (ORC) y un agente activo como el péptido. Este documento enseña que el agente activo puede estar contenido en la matriz, el polímero bioabsorbible o ambos de ellos y que la sustancia de esponja de material compuesto se pu^de esterilizar mientras está empacado.

La patente US5730933 describe un método de esterilización péptido biológicamente activo con rayos gamma o irradiación con haz de electrones sin la pérdida de la actividad biológica del péptido. Este método es una teenología que comprende las etapas de formar una mezcla de péptido biológicamente activo y una proteína extraña tal como la gelatina, la congelación o liofilización de esta mezcla, y la irradiación de la misma. Este documento enseña que la existencia de la proteína extraña estabiliza el péptido y evita la reducción de la actividad del péptido.

La patente W02000/033893 da a conocer un complejo de péptido terapéutico y un polisacárido seleccionado del grupo que consiste en celulosa regenerada oxidada, celulosa regenerada oxidada neutralizada y mezclas de los mismos. Este documento enseña que cuando el péptido se formula junto con una cantidad eficaz del polisacárido antes de la esterilización con radiación ionizante, la actividad biológica del agente terapéutico de péptido no se pierde y se estabiliza si el péptido se esteriliza con radiación ionizante.

Sin embargo, estos documentos no sugieren que el cambio estructural tal como la agregación y la desactivación de una proteína que se producen durante la esterilización cpon radiación ionizante pueden ser suprimidos por un poliéster alifático.

Mientras tanto, el documento JP-A 2011-47089 da a conocer un procedimiento para producir una nanofibra que contiene una enzima que tiene una excelente actividad de la enzima. En este proceso, una solución de centrifugación que contiene una enzima y un polímero disuelto en un disolvente no acuoso se hace girar por un método de centrifugación electrostática para formar una nanofibra de zimógeno que se imparte a continuación con agua y se seca. Sin embargo, este documento no dice nada acerca de la esterilización de la nanofibra que contiene la enzima.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición estéril que conserva la estructura y la función de una proteína.

Los inventores de la presente invención realizaron estudios intensivos para resolver el problema anterior y encontraron que, sorprendentemente, cuando una proteína está contenida en un poliéster alifático, se pueden suprimir el cambio estructural y el deterioro funcional de la proteína causado por la esterilización con radiación y, o bien uno o ambos del cambio anterior y el deterioro causado por encima de almacenamiento después de la esterilización con radiación.

La presente invención se realizó basándose en e$te descubrimiento.

Es decir, la presente invención es una composición estéril que comprende una proteína y un poliéster alifático que contiene la proteína y se esteriliza con radiación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra cada una de las actividades de trombina obtenidas mediante la medición de los cuerpos moldeados de fibra en forma de lámina de la presente invención obtenidos en los Ejemplos 1 y 2 que contiene trombina, la película que contiene trombina de la presente invención obtenida en el Ejemplo 3, la partícula que contiene trombina de Ejemplo Comparativo 1 y el cuerpo comparativo que contiene trombina similar a una lámina de fibra moldeada obtenida en el Ejemplo Comparativo 2 como los indices de retención (%) de un valor después de la esterilización y un valor después de 1 mes de almacenamiento después de la esterilización sobre la base de un valor inicial antes de la esterilización; y La Figura 2 muestra las cantidades de agregados de fibrinógeno obtenidas por la medición de la carrocería de fibra en forma de lámina que contiene fibrinógeno moldeado de la presente invención obtenido en el Ejemplo 4 y la partícula que contiene fibrinógeno del Ejemplo Comparativo 3 cuando,no se irradian, después de que se esterilizan (OM) y después de 1 mes de almacenamiento después de la esterilización (1M).

MEJOR MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN La presente invención es una composición estéril que comprende una proteína y un poliéster alifático que contiene la proteína y se esteriliza con radiación.

La proteína usada en la presente invención no es particularmente limitada. Los ejemplos preferidos de la proteína incluyen proteínas hemostáticas tipificadas por el fibrinógeno y la trombina, enzimas tipificados por asparaginasa, catalasa, superóxido dismutasa y lipasa, proteínas de transporte tipificadas por la hemoglobina, albúmina de suero y lipoproteínas de baja densidad, las proteínas musculares tipificadas por actina y miosina, proteínas de defensa tipificadas por anticuerpos y complementos, proteínas de toxina tipificadas por toxina de la difteria, toxina botulínica y veneno de serpiente, hormonas de proteínas tipificadas por insulina, factores de crecimiento y citoquinas, proteínas de almacenamiento tipificadas por ovoalbúmina y ferritina, proteínas estructurales tipificadas por colágeno y queratina, y factores de crecimiento tipificadas por factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de granulocitos-macrófagos estimulante de colonias (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (TPO), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF o FGF2) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). De estos, las enzimas, proteínas de transporte, proteínas musculares, proteínas de defensa, proteínas de toxinas, hormonas proteicas, proteínas de almacenamiento, proteínas estructurales y factores de crecimiento son particularmente preferidas.

La proteína utilizada en la presente invención puede ser de origen animal o fabricada por una téenica de recombinación genética. Si es de origen animal, es preferiblemente de origen humano. La proteína fabricada por la técnica de recombinación genética puede ser una variante obtenida por la sustitución de la secuencia de aminoácidos a otra secuencia de aminoácidos si la bioactividad esencial es la misma. También se pueden usar las proteínas obtenidas mediante la modificación de estas proteínas y mezclas de los mismos Para la proteína usada en la presente invención, se pueden añadir aditivos que son farmacéuticamente aceptables.

I Los ejemplos preferidos de los aditivos incluyen el factoride coagulación de la sangre XIII, albúmina, isoleucina, glicina, arginina, ácido glutámico, fenilalanina, histidina, agentes agente tensioactivos, cloruro de sodio, alcoholes de azúcar (tales como glicerol, manitol, etc.), trehalosa, citrato de sodio, aprotinina y cloruro de calcio. Se utiliza al menos uno seleccionado del grupo de éstos.

La proteina utilizada en la presente invención o una mezcla de la proteína y aditivos puede dispersarse en un poliéster alifático como moléculas pero preferiblemente como partículas formadas por la agregación de las moléculas (puede ser denominado como "partículas de proteína", incluyendo partículas mezcladas con el aditivo).

El poliéster alifático usado en la presente invención es preferiblemente un polímero bioabsorbiblei o biodegradable. Los ejemplos del polímero bioabsorbible incluyen ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímero de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, policaprolactoijia, copolímero de ácido poliláctico-policaprolactona, poliglicerol de ácido sebácico, ácido polihidroxi alcanoico, succinato de polibutileno y derivados de los mismos.

De estos, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, policaprolactona, se prefieren los copolímeros de los mismos y mezclas de los mismos, y los más preferidos son el ácido poliláctico y copolímero de ácido poliláctico-ácxdo glicólico. Por ejemplo, puede utilizarse un estereocomplejo de ácido poli-L- láctico y ácido poli-D-láctico.

El peso molecular del poliéster alifático usado :en la presente invención es de 1 x 103 a 5 x 106, preferiblemente de 1 x 104 a 1 x 106, mucho más preferiblemente de 5 x 104 a 5 x 105. Se puede seleccionar arbitrariamente la estructura de la terminal del polímero y un catalizador para polimerizar el polímero.

En la composición estéril de la presente invención, otro polímero u otro compuesto se pueden utilizar en combinación, siempre que el objeto de la presente invención no se vea afectado. Ejemplos de estos incluyen copolímeros, mezclas de polímeros y mezclas de compuestos.

El poliéster alifático usado en la presente invención preferiblemente tiene alta pureza. Especialmente, el contenido de aditivos y plastificante contenidos en el poliéster alifático y residuos tales como catalizador residual, monómeros residuales y el disolvente residual utilizado para el moldeo y post-procesamiento es preferiblemente tan bajo como sea posible. Especialmente cuando la composición se usa con fines médicos, es necesario reducir estos contenidos a valores por debajo de las normas de seguridad.

En la presente invención, la expresión que contiene la proteína" significa que al menos parte de la proteína entra en el interior del poliéster alifático. Eáte estado se distingue del estado de un complejo liofilizado en el que la proteína es existente en la superficie de la composición o en los vacíos de la composición.

La forma de la composición estéril de la presente invención no está particularmente limitada, y la composición puede estar en forma de una fibra, película, lámina, cuerpo en forma de placa, cuerpo similar a un tubo, cuerpo lineal, cuerpo en forma de varilla, material amortiguador, espuma o cuerpo poroso. El método de moldeo para producir un producto moldeado no está particularmente limitado si es un método en el que se suprimen el cambio estructural y la reducción de la actividad de la proteína. Por ejemplo, se pueden emplear las téenicas de moldeo adecuadas, tales como moldeo por extrusión, moldeo por inyección, moldeo por calandrado, moldeo por compresión, moldeo por soplado, conformación al vacío, moldeo en polvo, moldeo por colado y colado. La composición estéril de la presente invención es adecuada pata la producción de fibras y películas, y se pueden emplear cualquiera de las técnicas de moldeo que se han empleado para la producción de fibras o películas de plástico. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de moldeo por extrusión tales coifio moldeo por extrusión mediante inflación y moldeo pdr extrusión de boquilla en T, y las téenicas de calandrado y colado. El moldeo anterior puede ser moldeo por fusión o moldeo por solución, de los cuales el moldeo por solución :se prefiere con el fin de facilitar la dispersión de la proteína en cuanto a prevenir el deterioro funcional de la proteína.

La forma de fibra, como se usa aquí, se refiere a un cuerpo moldeado en 3-D formado por la laminación, tejido, tricotado u otra técniga de una o una pluralidad de fibras. La forma de la fibra es, por ejemplo, una tela no tejida. Además, un tubo y una malla obtenida mediante el procesamiento de la tela no tejida se incluyen en la forma de fibra.

El diámetro promedio de la fibra de la composición estéril que tiene una forma de fibra de la presente invención es, por ejemplo, 0.01 a 50 mm y puede determinarse adecuadamente por una persona experta en la técnica de acuerdo con el uso previsto.

La composición estéril que tiene una forma de fibra de la presente invención puede estar en la forma de una fibra larga. La fibra larga es una fibra formada sin la adición |de la etapa de cortar una fibra en el transcurso de la transición desde la centrifugación hasta el procesamiento de un cuerpo de fibra moldeada. Puede estar formada por electrocentrifugado, adhesión duradera y métodos de fundición por soplado. De estos, se prefiere el método ¡de electrocentrifugado.

El método electrocentrifugado es un método en el que se obtiene un cuerpo moldeado de fibra en un electrodo mediante la aplicación de un alto voltaje a una solución que contiene un polímero. El procedimiento comprende las etapas de preparar una solución de centrifugación que contiene un polímero, aplicando un alto voltaje a la solución, corriente en chorro de la solución, formando un cuerpo moldeado de fibra por evaporación del disolvente de la solución de hidromasaje, eliminando la carga del cuerpo moldeado por fibra formada como un paso opcional, y acumulando el cuerpo moldeado de fibra por la pérdida de carga.

Se da una descripción posteriormente del proceso para producir una composición estéril que tiene una forma de fibra o una forma de tela no tejida de la invención, tomando como ejemplo el método de electrocentrifugado.

Se explicará la etapa de preparar una solución de centrifugación en el método de electrocentrifugado. Aunque la solución de centrifugación en la presente invención no ps particularmente limitada, una emulsión que contiene una solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático y una solución acuosa de una proteína, una suspensión que contiene una solución de disolvente orgánico de un partículas de poliéster y proteínas alifáticos, o un orgánico solución de disolvente que contiene un poliéster alifático y una proteina puede ser usada como la solución de centrifugaciójn. De estos, se prefiere una suspensión que contiene Una solución de disolvente orgánico de partículas de poliéster alifáticas y proteínas.

La concentración del poliéster alifático en la solución de poliéster alifático es preferiblemente de 1 a 30% en peso. Cuando la concentración del poliéster alifático es menor que 1% en peso, es difícil formar un cuerpo de fibra moldeada de manera desventajosa. Cuando la concentración es mayor que 30% en peso, el diámetro de la fibra del cuerpo de fibra moldeado obtenido se convierte en gran manera desventajosa. La concentración del poliéster alifático contenido en la solución de disolvente orgánico es más preferentemente de 2 a 20% en peso. ; El disolvente para el poliéster alifático no está particularmente limitado si se puede disolver el poliéster alifático, se evapora en la etapa de centrifugación y pueden formar una fibra. Se pueden utilizar sólo un disolvente o una combinación de dos o más disolventes. Los ejemplos dél disolvente incluyen cloroformo, 2-propanol, tolueno, benceno, alcohol bencílico, diclorometano, tetracloruro de carbono, ciclohexano, ciclohexanona, tricloroetano, metil etil cetoná, acetato de etilo y mezclas de los mismos. Para formar una emulsión, puede estar contenido un disolvente tal como acetona, etanol, metanol, tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, 1-propanol, fenol, piridina, acido acetico, acido forango, hexafluoro-2-propanol, hexafluoroacetona, N, N-dimetilformamida, N, N-dimetilacetamida, acetonitrilo, N-metil-2-pirrolidinona, N-óxido de N-metilmorfolina o 1,3-dioxolano. De estos, se usan preferiblemente diclorometano o etanol desde los puntos de vista de facilidad de manejo y propiedades físicas.

La proteína en la presente invención puede añadirse a, y se mezcla con, una solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático en una forma sólida, líquida o solución.

En la presente invención, cuando se utiliza la emulsión que contiene una solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático y una solución acuosa de una proteína como la solución de centrifugación, el disolvente acuoso para la proteína no está particularmente limitada si se puede disolver la proteína, forma una emulsión con la solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático, se evapora en la etapa de centrifugación y puede formar una fibra. Por ejemplo, se pueden usar soluciones salinas y de tampjón fisiológicas. Además, se puede añadir un estabilizador pgra la proteína y aditivos. De estos, se utiliza preferiblemente una solución tampón de ácido fosfórico o solución salina fisiológica.

La concentración de la proteína en la solución acuosa de la proteína usada en la presente invención no e^tá particularmente limitada y puede determinarse adecuadamente de acuerdo con las propiedades características de la proteína. Es, por ejemplo, de 0.5 a 50% en peso.

Para preparar una emulsión de una solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático y una solución acuosa de una proteína, la proporción de mezcla de estas soluciones no es particularmente limitada si forman una emulsión estable. Por ejemplo, la (solución acuosa de proteína) (solución de disolvente orgánico de poliéster alifático)/(relación de volumen) es de 1/100 a 1/2. Cuando este valor es mayor que 1/2, la emulsión se vuelve desventajosamente inestable.

Aunque el método de preparación de una emulsión mezclando una solución de disolvente orgánico de un poliéstjer alifático y una solución acuosa de una proteína no esjtá particularmente limitada, se pueden usar las ondas ultravioleta o medios de agitación. Como los medios de agitación, pueden ser utilizados los medios de agitación de alta velocidad tal como un homogeneizador o medios de agitación tal como un molino de bolas o dispositivo de abrasión. D Dee eessttooss,, se prefiere dispersión con ondas ultrasónicas.

Además, la solución de centrifugación se pu preparar mediante la adición de un poliéster alifático después de que se forma una emulsión a partir de un disolvente orgánico y una solución acuosa de una proteína.

En la presente invención, cuando se utiliza una suspensión que contiene una solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático y una proteína como la solución de centrifugación, los tamaños de partículas de proteína no ise limitan particularmente, pero preferiblemente de 0.01 a ?00 pm. Es téenicamente difícil de fabricar partículas de proteínas que tienen un tamaño de partícula menor de 0.01 mm, y cuando el tamaño de las partículas es mayor que 100 mm, se degrada la dispersabilidad y la composición estéril se vuelve desventajosamente frágil. ¡ Aunque el método de preparación de una suspensión j mediante la mezcla de una solución de disolvente orgánico de un poliéster alifático y partículas de proteínas no está particularmente limitado, se pueden utilizar las onceas ultravioleta o medios de agitación. Como los medios ide agitación, se pueden usar los medios de agitación de aljta velocidad tal como un homogeneizador o medios de agitación tal como un molino de bolas o degradador. De estos, se prefiere dispersión con ondas ultrasónicas.

Además, la solución de centrifugación se puede preparar mediante la adición de un poliéster alifático después de una suspensión se forma a partir de un disolvente y partículas de proteínas orgánicas.

Antes de la preparación de la suspensión, las partículas de proteína pueden ser microfabricadas. Para ;la microfabricación, hay molienda en seco y molienda en húmedo tanto de que se puede emplear y también se pueden combinar en la presente invención.

La molienda en seco se puede llevar a cabo por molienda con un molino de bolas, molino planetario o jun molino oscilante, golpeando en un mortero con una mano de mortero, o por molienda con un medio de agitación del tipo :de pulverizador, molino de chorro o molino de piedra.

Mientras tanto, la molienda en húmedo se lleva a cabo mediante agitación con un agitador o amasadora que tieine una alta fuerza de esfuerzo cortante mientras que las partículas de proteína se dispersan en un medio de dispersión adecuado, o mediante el uso de un molino de bolas o molino de perlas mientras que las partículas de proteina se dispersan en un medio. Además, también se pueden usar partículas de proteína producidos por un secador de rociado.

El método de esterilización utilizado en la presente invención es la esterilización por radiación. X.os ejemplos de la radiación en uso incluyen rayos alfa, ra^os beta, rayos gamma, rayos de neutrones, rayos de electrones y rayos-X. De estos, se prefieren los rayos gamma y haces 'de electrones, y son los haces de electrones más preferidos. Aunque el método de esterilización no se limita particularmente, la dosis de la radiación es 10 a 80 kCjSy, preferiblemente de 20 a 30 kGy. Aunque la condición :de temperatura no está particularmente limitada, es -80 a 40 ° C, preferiblemente de -80 a 30 ° C.

La radiación tal como rayos alfa, positrones, rayos gamma, rayos de neutrones, haces de electrones o rayos1X tiras de un electrón a partir de moléculas o átomos que constituyen una sustancia cuando se aplica a la sustancia. Un enlace molecular se rompe en esto, y se produce un radiqal i altamente reactivo y reacciona químicamente con una sustanqia que rodea secundariamente.

Es bien sabido que una proteína tiende a perder su funcilón (actividad) después de la exposición a la radiación. Esto ¡se considera que es debido a la destrucción de "una estructura de orden superior", que es una fuente de desarrollar u(na función por la rotura de una unión molecular por ¡la exposición. Además, como se muestra en los Ejempljos Comparativos de la especificación de la presente solicitujd, la destrucción estructural o desactivación de una proteí¡na también se produce por el almacenamiento después de ¡la exposición a la radiación. Sin embargo, la destrucción estructural y el deterioro funcional de la proteina contenida en el poliéster alifático en la presente invención ¡se suprimen incluso cuando la proteína está expuesta a radiación, y también la destrucción estructural y deterioro funcional por el almacenamiento después de la exposición se suprimen. Esto significa que la estructura de orden superior de la proteína es retenida en la composición, que es un efecto común independientemente del tipo de la proteína. No se considera a partir del espesor del poliéster i alifático a través del cual se transmite la radiación <¾ue este efecto es debido a la detección, y no se conoce el mecanismo de control.

! El poliéster alifático que contiene la proteína antes de la esterilización por radiación en la presente invención puede contener además un eliminador de electrones/iones, agente de transferencia de energía, eliminador de radicales, antioxidantes y plastificante. Ejemplos del eliminador de electrones/iones incluyen N, tetrametil fenilendiamina, difenilendiamina, pireno |y quinona. Ejemplos del agente de transferencia de enercjía incluyen acenafteno. Ejemplos del eliminador de radicales incluyen mercaptanos, octahidrofenantreno, monoalquil éteajes de difenilo, tocoferol, ácido cítrico, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, t-butil hidroquinona, galato de propilo y derivados de ácido ascórbico. Ejemplios del antioxidante incluyen BHT, triésteres de fosfito, agentes antienvejecimiento fenólico y sales de tio ácidos orgánicos.

Se prefieren los aditivos que son generalmente aceptados cómo ! seguros para su uso en alimentos y productos farmacéuticos. La cantidad del aditivo que no está particularmente limitado es, por ejemplo, de 0.01 a 10% en peso basado en el poliéster alifático en la composición estéril.

El poliéster alifático que contiene la proteina :en la etapa de esterilización contiene preferiblemente nada ;de agua. El contenido de agua del poliéster alifático es preferiblemente no más de 10% en peso, más preferiblemente :no más de 4% en peso, mucho más preferiblemente, sustancialmeñte 0% en peso.

El poliéster alifático que contiene la proteina puede ser envuelto en un material de empaque para esterilizar con radiación. Como el material de empaque, se utiliza preferiblemente un material que tiene propiedades de barrara con alto contenido de gases tales como aluminio. El poliéster alifático puede ser sellado herméticamente y se empaca jurito con un desoxidante o desecante o mientras un gas inerte ¡se introduce en el empaque después de desgasificación, o amibos métodos pueden combinarse entre si. Como el desoxidante y el desecante, se prefieren los que no hacen daño al cuerpo humano y no se desactivan tras la exposición a la radiaciónj, La composición estéril de la presente invención j puede ser utilizada como un material médico que requiere la función y la esterilidad de una proteina.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar adicionalmente la presente invención, pero de ninguna manera se toman como limitantes. 1. Medición de la actividad de la trombina 20 ml de una muestra, 60 ml de un 50 mM tris-HCl (pH 8.5) + NaCl 50 mM tampón y 20 m? de 0.1% de Pluronic F+68 se añadieron al tubo 2008 de FALCON Corporación que ¡se incubaron a 37 °C durante 3 minutos. La a-trombina humána derivada de plasma purificado (adquirido de Technologies, Inc.: HCT-0020) diluido con el tampón anterior a 5, 2,5, 1.25, 0.625 y 0.3125 U/ l se utilizó como estándar.100 m? del equipo de prueba de sustrato cromogénico S-2238 (1 rtiM: Daiichi Puré Chemicals Co., Ltd.) se añadieron y se mezclaron con la solución de reacción obtenida bajo agitación para llevar a cabo una reacción a 37 °C durante 5 minutos, y ise i añadió 800 m? de una solución de ácido cítrico 0.1 M pira terminar la reacción.200 m? de la solución de reacción ¡se transfirió a placas de 96 pocilios para medir OD405/650.

El siguiente método se utilizó para medir ¡la actividad de la trombina en los Ejemplos y Ejemplos Comparativos, excepto para los Ejemplos 5 a 7 y el Ejemplo Comparativo 4.20 m? de una muestra y 80 m? de una solución diluida para la medición de la actividad (0.01% F- 68, !50 mol/1 de NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.4) se añadieron al tubo de poliestireno de BD que se incubaron a 37 °C durar 3 minutos. Trombina recombinante (JPU Thrombin Standard <100 U/mL o WHC/US Thrombin Standard 110 IU/mL) diluida con el tampón anterior a 4, 2», 1, 0.5 y 0.25 U/ml en el caso de JTPU y 6, 3, 1.5, 0.75 y 0.375 IU/ml en el caso de Iü fue utilizado como un estándar.100 DL del equipo de prueba 'de sustrato cromogénico S-2238 (1 mM: Daiichi Puré Chemic ls Co., Ltd.) se añadieron y se mezclaron con la solución de reacción obtenida bajo agitación para llevar a cabo una reacción a 37 °C durante 7 minutos, y luego se añadió 800 'ml de una solución de ácido cítrico 0.1 M para terminar jla reacción. 200 ml de la solución de reacción se ! placas de 36 pocilios para medir OD405/650. I 2. Medición de la cantidad de agregado I Después de que la lámina se cortó a un diámetro |de I 1 cm, el fibrinógeno se extrajo con una solución de dilucijón para medir la cantidad de su agregado por cromatografía líquida de alta velocidad.

Condiciones de Prueba \ í Detector: Fotómetro de absorción ultravioleta (longitud de onda de medición: 280 m) Columna: Bio-Sep SEC-S4000 (7.8 x 300 mpi Phenomenex) Temperatura de la columna: 25 °C Temperatura de muestreador: 6 °C Fase de transferencia: Solución Tampón 0.5 mol/1 Arg-HCl/ ácido fosfórico 50 mmol/L tampón de /L de Velocidad de flujo: 1 ml/min Tiempo de análisis: 20 min 3. Espesor Los espesores de 15 cuerpos moldeados se midieron con una fuerza de medición de 0.01 N por medio de una unidad de medición de alta resolución digimática ((LITEMATIC VLt50 de Mitutoyo Corporation) para calcular el valor medio como[el espesor del cuerpo moldeado. Esta medición se llevó a c$bo i con la fuerza medida mínima que podría ser utilizado por !la unidad de medición. 4 . Peso ; El cuerpo moldeado se cortó a un tamaño de 50 mm x 100 m p^ra medir su peso con el fin de calcular el peso del cuefpo ¡ moldeado. | 5. Densidad aparente La densidad aparente del cuerpo moldeado se calculó a partir del espesor medición anterior y el valor de peso. 6. Medición de la trombina ELISA 5 ng/ml de un anticuerpo antihumano de tromb:ina (No. SAHT-AP of Affinity Biologicals Inc.) se inmovilizó a una placa ELISA (Nunc 468667). Después de que se lavó con pBS que contenia 0.05% de Tween 20, Block Ace (UK-B80 de DS Biomedical Pharma Co., Ltd.) se añadió a cada pocilio pára llevar a cabo el enmascaramiento. Después de lavar con IpBS que contenia 0.05% de Tween 20, se añadió un cuerpo de prueba. La trombina humana (HCT-0020 of Haetoloqic Technologies, Inc.) fue utilizado como un estándar para formar una curva de calibración. Después de lavar con PBS que contenia 0.05% de Tween 20, 0.1 mg/ml de un anticuerpo trombina antihumano marcado con HRP se añadió (núm SAHT-¿RP de Affinity Biologicals, Inc.). Después de una reacción, el producto de reacción se lavó con PBS que contenía 0.05% Ide Tween 20, se añadió un reactivo TMB (DAKO S1599), y la mezcla resultante se dejó durante 10 minutos para desarrollar colór. 1 N se añadió H2SO4 para detener el desarrollo de color a fin de medir OD450-650 nm con un lector de microplacas. 7. Medición de la actividad de las enzimas !de lipasa y b-glucosidasa (1) Medición de la velocidad de extracción El cuerpo moldeado se cortó a un tamaño de 2 cm x 2 cm y se sumergió en 1 mi de solución salina fisiológica durante 3 minutos o 3 horas para eluir una enzima inmovilizada. Este proceso se llevó a cabo en tres cuerpos moldeados para medir sus cambios de peso con el fin |de obtener el valor promedio de la velocidad de extracción calculada a partir de la siguiente ecuación. El peso teór co de la enzima inmovilizada se calculó a partir del peso de la composición y el% en peso del polvo de enzima cargada.

Tasa de extracción = pérdida de peso teórico (mg) de enzima inmovilizada i (2) Medición de la actividad de la enzima Un kit de ensayo de lipasa fluorométrico contiguo (fabricado por PROGEN BIOTECHNIK GMBH) se utilizó para medir la actividad de la lipasa. La velocidad de recuperación de la actividad se calculó a partir de la siguiente ecuación, La cantidad de la enzima activa se calcula en términos de concentración del valor de la actividad. El peso teórico de la zona de enzima inmovilizada por unidad se calcula a partjir de% en peso del polvo de enzima cargado y el peso de la composición.

Tasa de recuperación de la actividad (%) ¡= {cantidad de enzima activa (mg/cm2)/peso teórico de enzijma inmovilizada por unidad de área (mg/cm2) x velocidad iIde extracción)} x 100 Medición fluorescente que usa Tokyogreen (matea registrada, el mismo se aplicará en adelante)~PGlu (de Sekisui Medical Co., Ltd.) se utilizó para medir la actividad i de b-glucosidasa . La velocidad de recuperación de la I actividad se calculó a partir de la siguiente ecuación. ¡El i peso teórico de la enzima inmovilizada se calcula a partir de% en peso del polvo de enzima cargado y el peso de jla composición.

Tasa de recuperación de la actividad (%) | = {cantidad de enzima activa (mg)/peso teórico de enzima inmovilizada (mg) x velocidad de extracción)} x 100 La velocidad de retención de la actividad se calculó a partir de la siguiente ecuación.

Tasa de retención de la actividad (%) {velocidad de recuperación de la actividad después de la esterilización (%)/velocidad de recuperación de la actividad antes de la esterilización (%))} x 100 Ejemplo 1 Después de que las partículas que contieáen trombina (preparada por liofilización de una solución acuosa que contiene 1 mg/ml de trombina recombinante, cloruro de sodio, citrato de sodio, cloruro de calcio y manitol y ti^ne un pH de 7) se dispersaron en etanol, se añadió diclorometáno a la dispersión resultante y un copolímero de ácido ! poliláctico-ácido poliglicólico (PURASORB PDLG5010 de PURAC) j se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% ¡en peso para preparar una solución de centrifugación que tiéne una relación de partículas que contiene trombina/poliglicólico-ácido poliláctico copolímero de ácido de 100 (1.69 como trombina)/100 (p/p). La centrifugación se lleva a cabo mediante un método de electrocentrifugado para obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. El cuerpo moldeado de fibra obtenido tenía un espesor de 131 miti, un peso de 1.44 mg/cm2 y una densidad aparente de 111 mg/cln3. La lámina obtenida se cortó a un diámetro de 1 cm, y la proteína se extrajo con 200 ml de solución salina fisiológica para medir su actividad. Como resultado, el valor de medición de la actividad fue de 26.7 U/cm2. La lámina obtenida se esteriliza por exposición a un haz de electrones 20 kGy y se i mantuvo a 40 ° C y 75% de HR durante 1 mes para medir la actividad de la trombina. Cuando la actividad de la trombina antes de la esterilización fue de 100%, la velocidad ide retención de la actividad de la trombina a la derecha después de la exposición al haz de electrones fue del 79%. La velocidad de retención de la actividad después de 1 mes fue del 78%, y no se observó reducción en la actividad de !la trombina durante el almacenamiento.

Ejemplo 2 | Después de que las partículas que contienen trobina (preparada por liofilización de una solución acuósa que contiene 1 mg/ml de trombina recombinante, cloruro de sodio, citrato de sodio, cloruro de calcio y manitol y tiene un pH de 7) y Quinizarina SS Verde (de Tokyo Chemi<f:al Industry Co., Ltd.) se dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a la dispersión resultante, y un copolímero de ácido poliláctico-ácido poliglicólico (PURASORB PDLG5010 de PURAC) se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% en peso para preparar una solución de centrifugación <jjue tienen una relación de partículas que contienen trombina/copolímero de ácido poliglicólico-ácidopoliláct^co j de 100 (1.69 como trombina)/100 (p/p). La centrifugación |se lleva a cabo por el método de electrocentrifugado p£ra obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina,iLa lámina obtenida que contiene el cuerpo moldeado de fibra (espesor medio: 129 mm, peso: 1.49 mg/cm2, densidad aparente: 124 mg/cm3) se cortó a un diámetro de 1 cm, y la proteína se extrajo con 200 ml de solución salina fisiológica para medir la actividad de la trombina. Como resultado, el valor de medición de la actividad fue 40.2 IU/cm2. La lámina obtenida se esteriliza por exposición a un haz de electrones 30 kG^ y se mantuvo a 40 °C y 75% de HR durante 1 mes para medir ila actividad de la trombina. Cuando la actividad de la trombina antes de la esterilización fue de 100%, la velocidad ¡de retención de la actividad de la trombina justo después de :1a exposición a un haz de electrones fue de 70%. La velocidad |de retención de la actividad después de 1 mes fue del 74%, y ¡no se observó reducción en la actividad de la trombina durarite el almacenamiento.

Ejemplo 3 Después de que las partículas que contienen trombina (preparada por liofilización de una solución acuosa que contiene 1 mg/ml de trombina recombinante, cloruro ¡de sodio, citrato de sodio, cloruro de calcio y manitol y tiene i un pH de 7) se dispersaron en etanol, se añadió diclorometaíno a la dispersión resultante y un copolimero de ác|do poliláctico-ácido poliglicólico (PURASORB PDLG5010 de PURC) se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% en peso para preparar una solución contaminada que tiene vjna proporción de partículas que contiene trombina/copolímero ¡de ácido poliglicólico-ácido poliláctico de 100 (1.69 cómo trombina)/100 (p/p). La solución contaminada obtenida ; utilizó para formar una película por un metodo de colado. intervalo de recubrimiento fue de 127 mm, y la velocidad de I recubrimiento fue de 30.1 mm/seg. La lámina obtenida teníaiun i espesor de 58 mm, un peso de 2.9 mg/cm2 y una densidad aparente de 504 mg/cm3. La lámina obtenida se cortó a un diámetro de 1 cm, y la proteína se extrajo con 200 ml ¡de solución salina fisiológica para medir la actividad de ila trombina. Como resultado, el valor de medición de la actividad fue 71.1 IU/cm2. La lámina obtenida se esteriliza por exposición a un haz de electrones 30 kGy y se mantuve* a 40 °C y 75% de HR durante 1 mes para medir la actividad de ¡la trombina. Cuando la actividad de la trombina antes de ¡la esterilización fue de 100%, la velocidad de retención de ¡la actividad de la trombina justo después de la exposición a ¡un haz de electrones era 75.7%. La velocidad de retención de ¡la actividad después de 1 mes fue del 82%, y no se observó reducción en la actividad de la trombina durante el almacenamiento.

Ejemplo 4 Después de que las partículas que contienjen fibrinógeno (preparada por liofilización de una soluci|ón acuosa que contiene 10 mg/ml de fibrinógeno recombinant , arginina, cloruro de sodio y manitol y tiene un pH de 8.5) íse dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a la dispersión resultante y una poliglicólico copolímero de ácido poliláctico-ácido (PURASORB PDLG5010 de PURAC) se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% en peso p4ra preparar una solución de centrifugación que tiene Una proporción de partículas que contiene fibrinógeno/ copolíméro de ácido poliglicólico-ácido poliláctico de 100 (50.85 cpmo fibrinógeno)/100 (p/p). La centrifugación se lleva a cabo por el método de electrocentrifugado para obtener un cueripo moldeado de fibra en forma de lámina. El cuerpo moldeado ide fibra obtenido tenía un espesor de 131 mm, un peso de 1.44 mg/cm2 y una densidad aparente de 110 mg/cm3. La lámina obtenida se cortó a un diámetro de 1 cm, y el fibrinógeno ¡se extrajo con una solución de dilución para medir la cantidad de su agregado por cromatografía de alta velocidad. CoRio resultado, la cantidad del agregado era 9.79%. La lámina obtenida se esteriliza por exposición a un haz de electrónjes 30 kGy y se mantuvo a 40 °C y 75% de HR durante 1 mes para medir la cantidad del agregado. La cantidad de la derecha agregada después de la exposición a un haz de electrones era 18.81%. El peso del agregado después de 1 mes fue 24.14%.

Ejemplo Comparativo 1 Después de que se aplicó un haz de electrones ¡30 kGy a las partículas que contiene trombina (preparadas por liofilización de una solución acuosa que contiene | trombina recombinante, cloruro de sodio, citrato cloruro de calcio y manitol y tiene un pH de 7) para esterilizarlos, las partículas que contiene trombina se I mantuvieron a 40 °C y 75% de HR durante 1 mes para medir |la actividad de la trombina. La actividad de trombina antes ¡de la exposición fue 404.73 U/vial. Cuando la actividad de la trombina antes de la esterilización fue de 100%, la velocidad de retención de la actividad de la trombina justo después ¡de la exposición a un haz de electrones era 51.8%. La velocidad de retención de la actividad después de 1 mes fue de 17.9%,!y se observó una reducción en la actividad de la trombipa durante el almacenamiento.

Ejemplo Comparativo 2 Después de que las partículas que confieneh trombina (preparadas por liofilización de una solución acuosa que contiene 1 mg/ml de trombina recombinante, cloruro tie sodio, citrato de sodio, cloruro de calcio y manitol y tiepe un pH de 7) se dispersaron en 2-propanol, hidroxipropil celulosa (2.0- 2.9 mPas, fabricado por Nippon Soda Co., Ltdh) se disolvieron en la dispersión resultante a upa concentración de 13% en peso para preparar una solución <jie dopado que tiene una proporción de partículas <jle celulosa/hidroxipropil que contiene trombina de 100/1f0 (p/p). La centrifugación se lleva a cabo por el método de electrocentrifugado para obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. El cuerpo moldeado de fibra obtenido tenia un espesor de 204 mm, un peso de 2.08 mg/cm2 y üna densidad aparente de 101 mg/cm3. La lámina obtenida se coijtó a un diámetro de 1 cm, y la proteína se extrajo con 200 ml jde solución salina fisiológica para medir su actividad. Ccjmo j resultado, el valor de medición de la actividad fue lioj.3 IU/cm2. La lámina obtenida se esteriliza por exposición a |un haz de electrones 30 kGy y se mantuvo a 40 °C y 75% de ¡HR durante 1 mes para medir la actividad de la trombina. Cuanjdo la actividad de la trombina antes de la esterilización fue ¡de j 100%, la velocidad de retención de la actividad de ¡la trombina justo después de la exposición a un haz ¡de t electrones fue de 68.4%. La velocidad de retención de ¡la actividad después de 1 mes fue de 54.9% y se observó una reducción en la actividad de la trombina durante el almacenamiento.

Ejemplo comparativo 3 Después de que se aplicó un haz de electrones 30 kGy a las partículas que contienen fibrinógeno (preparada pjor liofilización de una solución acuosa que contiene 10 mg/ml íde fibrinógeno recombinante, arginina, cloruro de sodio ¡y anitol y tiene un pH de 8.5) para esterilizar ellos, el qjue I contiene trombina las partículas se mantuvieron a 40 °C y 75 de HR durante 1 mes para medir la cantidad de un agregado |de fibrinógeno. La cantidad de la suma antes de la exposición fue de 6.97%. El importe de la derecha agregada después de ila exposición a un haz de electrones fue 18.51%. La cantidad ¿el agregado después de 1 mes fue de 54.72%.

Los resultados (las velocidades de retención de ¡la actividad de la trombina (Th) después de la esterilización y después del almacenamiento después de la esterilización !en función del valor antes de la esterilización) de los Ejemplos 1 a 3 y Ejemplos Comparativos 1 y 2 se muestran en la Fig. ¡1.

Se entiende que cuando la proteína está contenida en el poliéster alifático, se suprimen el cambio estructural y el deterioro funcional de la proteína causados por jla esterilización por radiación, en comparación con un caso en el que sólo se utilizan partículas que contienen proteínas (Ejemplo Comparativo 1) y, además, que el cambio y jel deterioro causados por el almacenamiento después de ¡la esterilización por radiación se suprimen en comparación don un caso en el que no se utiliza el poliéster alifático p^ro si una celulosa (hidroxipropil celulosa) (Ejemplo Comparatijvo Los resultados (la cantidad del agregado de fibrinógeno después de la esterilización y después del almacenamiento después de la esterilización) del Ejemplo y el Ejemplo Comparativo 3 se muestran en la Fig.2.

Se entiende que cuando la proteina está conten en el poliéster alifático (Ejemplo 4), se suprime el cambio estructural de la proteina causada por el almacenamiento después de la esterilización por radiación, en comparación con un caso en el que se utilizan partículas de proteína que contienen sólo (Ejemplo Comparativo 3). í Ejemplo 5 Después de que las partículas que contiene trombiha (Bolheal, (marca comercial registrada, el mismo se aplica5á en adelante), adhesivo tisular: Vial 3) se dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a la dispersión resultante,iy i ácido poliláctico (PL18 de Purac Bíomateriales) se disolvjÍó en la dispersión a una concentración de 10% en peso patia preparar una solución de centrifugación que tiene u a proporción de partículas que contiene poliláctico de 40 (0.45 como trombina) centrifugación se lleva a cabo por el método electrocentrifugado para obtener un cuerpo moldeado de fibia en forma de lámina. La lámina obtenida se esterilizó con ún haz de electrones 20 kGy. La lámina obtenida se cortó a un tamaño de 2 cm x 2 cm, y la proteína se extrajo con 1 mi cjle solución salina fisiológica para medir su actividad y ELISA.

Como resultado el valor de medición de la actividad fue jde 5.0 U/cm2, y el valor de medición ELISA fue de 3.4 mg/c](i2. Cuando se hicieron mediciones de la actividad y ELISA en una lámina sin esterilizar Asimismo, el valor de medición de la actividad fue de 7.5 U/cm2 y el valor de medición ELISA fue 4.35 pg/cm2. Es decir, la velocidad de retención de ila actividad de la lámina esterilizada fue del 73% de la de la lámina no esterilizado.

Ejemplo 6 Después de que las partículas que contienen trombina (adhesivo tisular Bolheal: Vial 3) se dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a la dispersión resultante,: y ácido poliláctico (PL18 de Purac Biomateriales) se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% en peso p^ra 1 preparar una girar solución que tiene una relación jde partículas que contiene trombina/ácido poliláctico de 70 (0.78 como trombina)/100 (p/p). La centrifugación se llevq a cabo por el método de electrocentrifugado para obtener ;un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. La lámdjna obtenida se esterilizó con un haz de electrones 20 kGy. La lámina obtenida se cortó a un tamaño de 2 cm x 2 cm, y 'la proteína se extrajo con 1 mi de solución salina fisiológica para medir su actividad y ELISA. Como resultado, el valor de medición de la actividad era 9.575 U/cm2, y el valor de medición ELISA fue de 7.0 mV/ah2. Cuando se hicieron i mediciones de la actividad y ELISA en una lámina qin esterilizar Asimismo, el valor de medición de la actividad fue 11.15 U/cm2 y el valor de medición ELISA fue 7.2 mV/o^h2. Es decir, la velocidad de retención de la actividad de la lámina esterilizada fue del 86% de la de la lámina ino esterilizado.

Ejemplo 7 Después de que los polvos de trombina liofilizáda (Bolheal adhesivo tisular: Vial 3) se dispersaron en etanpl, se añadió diclorometano a la dispersión resultante, y ácido poliláctico (PL18 de Purac Biomaterials) se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% en peso para preparar un centrifugación solución que tiene una relación de trombina liofilizada en polvo/ácido poliláctico de 100 (1.1 como trombina)/100 (p/p). La centrifugación se lleva a cabo por jel método de electrocentrifugado a una temperatura de 22 °Ci y una humedad de no más del 26% para obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. El diámetro interior de úna boquilla de chorro fue de 0.8 mm, la tensión era 15 kV, la velocidad de flujo de la solución de centrifugación fue |de 3.0 ml/h, y la distancia desde la boquilla de chorro a ijina i placa plana era 25 cm. La lámina obtenida se esterilizó pon un haz de electrones 20 kGy. La lámina obtenida se cortó a^un tamaño de 2 cm x 2 cm, y la proteína se extrajo con solución salina fisiológica para medir su actividad Como resultado, el valor de medición de la actividad fue jde 15 U/cm2, y el valor de medición ELISA era 11 mg/cm2. Cuarjdo se hicieron mediciones de la actividad y ELISA en una lámina sin esterilizar Asimismo, el valor de medición de tía actividad fue de 23 U/cm2 y el valor de medición ELISA era ¡16 pg/cm2. Es decir, la velocidad de retención de la activicfad de la lámina esterilizada era 64% de la de la lámina no esterilizada.

Ejemplo Comparativo 4 I Las partículas que contiene trombina fueron esterilizadas con un haz de electrones 2 ¡ I proteína se extrajo con 1 mi de solución salina fisiológijca para medir su actividad y ELISA. Como resultado, el valor Ide medición de la actividad fue de 22.5 U/cm2 y el valor de medición de ELISA fue 11.5 pg/cm2. Cuando la actividad y l,as mediciones de ELISA se realizaron en partículas que contiene trombina no esterilizadas del mismo modo, el valor jde medición de la actividad fue de 68.5 U/cm2 y el valor de medición de ELISA fue 41.5 pg/cm2. Es decir, la velocidad ¡de i retención de la actividad de la lámina esterilizada era 3(% de la de la lámina no esterilizada.

Ejemplo 8 Después de que los polvos de lipasa (derivada páncreas de cerdo, fabricada por Wako Puré Chemical Industries, Ltd., el mismo se aplicará más adelante) :se dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a ;la dispersión resultante, y un copolimero de ácido láctico-ácido glicólico poliláctico (PDLG5010 de Purac biomateriales) se disolvió en la dispersión a una concentración de 10% en peso para preparar una solución de centrifugación tiene ujna relación de polvo de lipasa/ copolimero de ácido poliláctico-ácido glicólico de 50/100 (p/p). La centrifugación se lleva;a cabo por el método de electrocentrifugado a una temperatura de 27 °C y una humedad de no más del 25% para obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. El diámetro interior de una boquilla de chorro fue de 0.9 rnm, la tensión fue 15 kV, la velocidad de flujo de la solución de centrifugación fue de 4.0 ml/h, y la distancia desde jla boquilla de chorro a una placa plana fue de 25 cm. 'La velocidad de extracción de la lámina de lipasa obtenida ftue de 79%. La lámina obtenida se esterilizó con un haz electrones 20 kGy. La lámina esterilizada obtenida se cortó¡a i un tamaño de 1 c x 1 cm, y la lipasa se extrajo con 1 mi Üe un tampón de lipasa contenidos en un kit para medir ¡su actividad. Como resultado, la velocidad de recuperación de lia actividad fue de 100%.

Ejemplo 9 Se añadió diclorometano a los polvos de lipasa, y se disolvió un copolimero poliláctico-ácido glicólico de ácido (PDLG5010 de Purac Biomateriales) en la mezpla resultante a una concentración de 10% en peso para prepaiíar una solución de centrifugación que tiene una relación de ácido polvo de lipasa/poliláctico de 50/100 (p/p). 'La centrifugación se lleva a cabo por el método :de electrocentrifugado a una temperatura de 26 °C y una humedad de no más del 25% para obtener un cuerpo moldeado de fibra ien forma de lámina. El diámetro interior de una boquilla de chorro fue de 0.8 mm, la tensión fue de 15 kV, la velocidjad t de flujo de la solución de centrifugación fue de 4.0 ml/h, y la distancia desde la boquilla de chorro a una placa plaína era 25 cm. La velocidad de extracción de la lámina de lipa a obtenida fue de 63%. La lámina obtenida se esterilizó con mh I haz de electrones 20 kGy. La lámina esterilizada obtenida se cortó a un tamaño de 1 cm x 1 cm, y la lipasa se extrajo con 1 mi de un tampón de lipasa contenidos en un kit para medi !r su actividad. Como resultado, la velocidad de recuperación (de la actividad fue de 92%.

Ejemplo 10 ¡ Después de que los polvos b-glucosidasa (derivados de almendra, fabricado por Oriental Yeast Co., Ltd, el mismo se aplicará en adelante) se dispersaron en etanol, se añacjió diclorometano a la dispersión resultante, y se disolvió un copolimero de ácido láctico-ácido glicólico poliláctico (PDLG5010 de Purac biomateriales) en la dispersión a i)na concentración de 10% en peso para preparar una solución de centrifugación que tiene una relación en polvo p-glucosidasa/ copolimero de ácido poliláctico-ácido glicólico de 38/62 (p/p). La centrifugación se llevó a cabo por el método ¡de electrocentrifugado a una temperatura de 27 °C y una humedad de no mayor del 25% para obtener un cuerpo moldeado de filara en forma de lámina. El diámetro interior de una boquilla de chorro fue de 0.9 mm, la tensión era 15 kV, la velocidad de flujo de la solución de centrifugación fue de 4.0 ml/h, y la distancia desde la boquilla de chorro a una placa plana fue de 25 cm. Después de la lámina obtenida se cortó a un tamaño de 2 cm x 2 cm, se esterilizó con un haz de electrones i I20 kGy. La b-glucosidasa se extrajo con 1 mi de solución salina fisiológica para medir su actividad con Tokyogreen-pGlu. Cómo resultado, la velocidad de recuperación de la actividad fue de 92%. Cuando medición de la actividad se hizo en una lámina sin esterilizar la misma manera, la velocidad de recuperación de la actividad fue del 94%. Se entendió desde antes que ;la velocidad de retención de la actividad del cuerpo moldeado jde fibra esterilizada fue del 98% de la del cuerpo moldeado de fibra no esterilizado y que b-glucosidasa no fue desactívela por la esterilización de haz de electrones.

Ejemplo 11 Después de que los polvos b-glucosidasa ¡se dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a la dispersión resultante, y se disolvió un copolímero de ácido poliláctico-caprolactona (PLCA8812 de Taki Chemical Cp., Ltd.) en la dispersión a una concentración de 10% en péso i para preparar una solución de centrifugación que tiene pna relación en polvo b-glucosidasa/ácido poliláctipo-caprolactona copolímero de 38/62 (p/p). La centrifugación se llevó a cabo por el método de electrocentrifugado a Lina temperatura de 27 °C y una humedad de no más del 25% ppra obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. ¡El diámetro interior de una boquilla de chorro fue de 0.9 mm, la tensión era 15 kV, la velocidad de flujo de la solución de centrifugación fue de 3.0 ml/h, y la distancia desde la boquilla de chorro a una placa plana fue de 25 cm. Después ¡de la lámina obtenida se cortó a un tamaño de 2 cm x 2 cm, |se esterilizó con un haz de electrones 20 kGy. La b-glucosidasa se extrajo con 1 mi de solución salina fisiológica para medir su actividad con Tokyogreen^Glu . Como resultado, 'la velocidad de recuperación de la actividad fue de 81%. Cuando medición de la actividad se realizó sobre la lámina sin esterilizar, asi mismo, la velocidad de recuperación de la actividad fue de 80%. Se entendió desde arriba que la velocidad de retención de la actividad del cuerpo moldeado ¡de fibra esterilizada era 101% de la del cuerpo moldeado de fibra no esterilizado y que b-glucosidasa no fue desactiv4da por la esterilización de haz de electrones.

Ejemplo 12 Después de polvos b-glucosidasa se dispersaron en etanol, se añadió diclorometano a la dispersión resultante, y se disolvió ácido poliláctico (PL18 de Purac Biomateriales) en la dispersión a una concentración de 11% en peso paira preparar una solución de centrifugación que tiene un polvo b-glucosidasa/ácido poliláctico de 38/62 (p/p). ;La centrifugación se llevó a cabo por el método de electrocentrifugado a una temperatura de 27 °C y una humedlad | de no más del 25% para obtener un cuerpo moldeado de fibra en forma de lámina. El diámetro interior de una boquilla de chorro fue de 0.9 m, la tensión era 15 kV, la velocidad de flujo de la solución de centrifugación fue de 3.0 ml/h, y la distancia desde la boquilla de chorro a una placa plana e|ra 25 era. Después de la lámina obtenida se cortó a un tamaño de 2 cm x 2 cm, se esterilizó con un haz de electrones 20 kGy. b-glucosidasa se extrajo con 1 mi de solución salina fisiológica para medir su actividad con Tokyogreen-pGlu. Coíno resultado, la velocidad de recuperación de la actividad fue de 62%. Cuando medición de la actividad se realizó sobre ¡la lámina sin esterilizar asi mismo, la velocidad 'de recuperación de la actividad fue de 71%. Se entendió deáde arriba que la velocidad de retención de la actividad del cuerpo moldeado de fibra esterilizada fue del 87% de la del cuerpo moldeado de fibra no esterilizado y que b-glucosidása no fue desactivada por la esterilización de haz de electrones.

Ejemplo comparativo 5 Los polvos de lipasa se esterilizaron con un haz ¡de electrones 20 kGy.1 mi de un tampón de lipasa se añadió a 1 mg de los polvos para medir la actividad de la lipasa. Como resultado, la velocidad de recuperación de la actividad í}ue de 74%.

Ejemplo comparativo 6 Los polvos de b-glucosidasa se esterilizaron con haz de electrones 20 kGy.2 mg de los polvos se disolvió mi de solución salina fisiológica para medir la actividad de b-glucosidasa con Tokyogreen-^Glu. Como resultado, Ila velocidad de retención de la actividad fue de 81%.

Efecto de la invención La composición estéril de la presente invención retiene la estructura y función de una proteina a pesar de que se esteriliza.

Viabilidad Industrial La composición estéril de la presente invención se utiliza en la industria de fabricación de productos médicos que requieren la función y la esterilidad de una proteina.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1.- Una composición estéril que comprende una proteína y un poliéster alifático que contiene la proteíná y se esteriliza con radiación.

2.- La composición estéril de acuerdo con ¡la reivindicación 1, en la que la proteina se dispersa en forma de partículas en el poliéster alifático directamente o ccjwno una mezcla con aditivos que son farmacéuticamente aceptables.

3.- La composición estéril de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína se selecciona ¿el grupo que consiste de proteínas hemostáticas, enzimas, proteínas de transporte, proteínas musculares, proteínas de defensa, proteínas de toxinas, hormonas proteicas, proteínas de almacenamiento, proteínas estructurales, factores de crecimiento y sus mezclas.

4 . - La composición estéril de acuerdo con ;la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína es una proteína hemostática.

5.- La composición estéril de acuerdo qon cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que |el poliéster alifático se selecciona entre el grupo constituido por ácido políglicólico, ácido poliláctico, policaprolactona, copolímeros de los mismos y mezclas de los mismos.

6.- La composición estéril de acuerdo ton cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en foirma de fibra. !

7.- La composición estéril de acuerdo con la reivindicación 6, que se produce por un método :de electrocentrifugado.

8.- La composición estéril de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que está en forma de película.

9.- La composición estéril de acuerdo con la reivindicación 8, que se produce por un método de colado. RESUMEN Una composición estéril que comprende una prote y un poliéster alifático que contiene la proteína y ise esteriliza con radiación En esta composición estéril, se conservan la estructura y la función (actividad) de la proteina. I