JPWO2013172468A1 - 滅菌組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
また、蛋白質を含む溶液はフィルターにより分離滅菌しているが、大きい粒子を含む組成物、または固体もしくは半固体組成物には適用が困難であった。
EP0437095号にはヘパリンまたはヘパリンフラグメントと複合する中和酸化セルロース生成物(nORC)をガンマ線照射で滅菌できることが示されている。しかし、この文献には蛋白質が結合しているORCまたはn−ORCを滅菌することは示されていない。
EP0562864号にはコラーゲンスポンジマトリックス、第二の生体吸収性ポリマー例えば酸化再生セルロース(ORC)の分散繊維、および活性剤例えばペプチドを含む複合傷手当物質が示されている。活性剤はマトリックス、生体吸収性ポリマー、またはそれらの両方に含むことができ、該複合スポンジ物質をパッケージして滅菌できることが記載されている。
US5730933号には生物学的に活性なペプチドをその生物学的活性を消失することなくガンマ線または電子ビーム照射で滅菌する方法が示されている。この方法は、生物学的に活性なペプチドとゼラチン等の外来蛋白質を含む混合物を形成し、この混合物を凍結または凍結乾燥し、次にこの混合物を照射する工程を含む技術であり、外来蛋白質の存在がペプチドを安定化してペプチドの活性低下を防ぐと記載されている。
国際公開WO2000/033893号には治療ペプチドと、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体が記載されている。そして電離放射線で滅菌する前にペプチドを有効量のポリサッカライドと共に製剤することにより、電離放射線で滅菌してもペプチド治療剤の生物学的活性は消失しないで安定化すると記載されている。
しかし、これらの文献は、電離放射線で滅菌する際に起る、蛋白質の凝集等の構造変化や失活を脂肪族ポリエステルが抑制できることは示唆していない。
一方、特開2011−47089号公報には酵素活性に優れる酵素含有ナノファイバーの製造方法が記載されている。この方法は、酵素と非水溶媒に溶解したポリマーとを含有する紡糸液を、静電紡糸法により紡糸して酵素前駆ナノファイバーを形成後、水を付与し乾燥するものである。しかし、この文献には酵素含有ナノファイバーを滅菌することに関する記述はない。
本発明の発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下、および放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下のうち、いずれかまたは両方を抑制できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、蛋白質および該蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物である。
図2は、実施例4で得られた本発明のフィブリノゲン含有シート状繊維成形体および比較例3のフィブリノゲン含有粒子のそれぞれについて測定したフィブリノゲン凝集体量(%)を、未照射、滅菌後(OM)および滅菌後1ヶ月保存後(1M)について、示したものである。
本発明に用いられる蛋白質は特に限定されない。好ましいものとしては、例えばフィブリノゲンやトロンビンに代表される止血性蛋白質、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドデスムターゼ、リパーゼに代表される酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、低密度リポ蛋白質に代表される輸送蛋白質、アクチン、ミオシンに代表される筋肉蛋白質、抗体、補体に代表される防御蛋白質、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ヘビ毒に代表される毒素蛋白質、インスリン、増殖因子、サイトカインに代表される蛋白質ホルモン、卵アルブミン、フェリチンに代表される貯蔵蛋白質、コラーゲン、ケラチンに代表される構造蛋白質、上皮成長因子(Epidermal growth factor:EGF)、インスリン様成長因子(Insulin−like growth factor:IGF)、トランスフォーミング成長因子(Transforming growth factor:TGF)、神経成長因子(Nerve growth factor:NGF)、脳由来神経栄養因子(Brain−derived neurotrophic factor:BDNF)、血管内皮細胞増殖因子(Vesicular endothelial growth factor:VEGF)、顆粒球コロニー刺激因子(Granulocyte−colony stimulating factor:G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte−macrophage−colony stimulating factor:GM−CSF)、血小板由来成長因子(Platelet−derived growth factor:PDGF)、エリスロポエチン(Erythropoietin:EPO)、トロンボポエチン(Thrombopoietin:TPO)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor:bFGFまたはFGF2)、肝細胞増殖因子(Hepatocyte growth factor:HGF)に代表される成長因子が挙げられる。なかでも好ましいのは、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、および成長因子である。
本発明において使用される蛋白質は、動物由来のものでも遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来であればヒト由来が好ましい。また、遺伝子組み換え技術により作製された蛋白質は、本質的な生物活性が同様であればアミノ酸配列を別のアミノ酸配列に置換した改変体でもよい。また、これらの蛋白質を修飾したもの、およびこれらの混合物を用いることもできる。
また、本発明で用いられる蛋白質には、薬学的に許容しうる添加剤を加えてもよい。そのような添加剤の好ましい例としては、血液凝固第XIII因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール(グリセロール、マンニトール等)、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。
本発明で用いられる蛋白質又は蛋白質と添加剤との混合物は、脂肪族ポリエステル中に、それぞれ分子として分散して存在してもよいが、それぞれ分子が集まった粒子(以下添加剤との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。)として分散して存在することが好ましい。
本発明において使用される脂肪族ポリエステルは、生体吸収性または生分解性ポリマーであることが好ましい。生体吸収性ポリマーの具体例としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネート、およびこれらの誘導体が例示できる。
これらの中でも、好ましくはポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましいのはポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体である。例えばポリL乳酸とポリD乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。
また、本発明で用いる脂肪族ポリエステルの分子量は1×103〜5×106であり、好ましくは1×104〜1×106、より好ましくは5×104〜5×105である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
本発明の滅菌組成物においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
本発明で用いる脂肪族ポリエステルは高純度であることが好ましく、とりわけ脂肪族ポリエステル中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成形加工や後加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ない方が好ましい。特に、医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
本発明において「蛋白質を含有する」とは、蛋白質の少なくとも一部分が脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる状態をいう。蛋白質が組成物表面や組成物の空隙に存在する凍結乾燥による複合体と区別される状態である。
本発明の滅菌組成物の形状は特に限定されるものではなく、例えば繊維、フィルム、シート、板状体、管状体、線状体、棒状体、クッション材、発泡体、多孔質体等が挙げられる。成形品を製造する際の成形方法は、蛋白質の構造変化や活性低下が抑制される方法であれば特に制限されず、例えば押出成形、射出成形、カレンダー成形、圧縮成形、ブロー成形、真空成形、粉末成形、流延成形、注型などの適当な成形方法を採用することができる。その中でも、本発明の滅菌組成物は繊維およびフィルム形状が適しており、それらの製造に当たってはプラスチック繊維またはフィルムの製造に従来から採用されているいずれの方法も採用でき、例えばインフレーション押出成形法、Tダイ押出成形法などの押出成形法、カレンダー法、流延法(キャスト法)などを挙げることができる。前記成形は、溶融成形によって行っても、または溶液成形によって行ってもよいが、蛋白質の機能低下を防ぐべく蛋白質を容易に分散させるためには溶液成形が好ましい。
ここで繊維形状とは、得られた一本または複数本の繊維が積層され、織り、編まれ、もしくはその他の手法により形成された3次元の成形体をいう。具体的な繊維の形態としては、例えば不織布が挙げられる。さらに、それをもとに加工したチューブ、メッシュなども繊維形状に含まれる。
本発明の繊維形状を有する滅菌組成物の平均繊維径は、例えば0.01〜50μmであるが、当業者であれば使用目的に応じて適宜定めることができる。
また、本発明の繊維形状を有する滅菌組成物は長繊維よりなるものであってもよい。長繊維とは、具体的には紡糸から繊維成形体への加工に至る工程の中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される繊維をいい、エレクトロスピニング法、スパンボンド法、メルトブロー法などで形成することができる。これらのうち、エレクトロスピニング法が好ましく用いられる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーが溶解している液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、ポリマーが溶解している紡糸液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
以下、エレクトロスピニング法を例にとり、本発明のうち、繊維形状または不織布形状を有する滅菌組成物の製造法を説明する。
エレクトロスピニング法における、紡糸液を製造する段階について説明する。本発明における紡糸液は、特に限定されるものではなく、例えば脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からなるエマルション、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液、脂肪族ポリエステルと蛋白質が溶解した有機溶媒溶液を使用することができるが、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子からなる懸濁液を使用することが好ましい。
脂肪族ポリエステル溶液における脂肪族ポリエステルの濃度は1〜30重量%であることが好ましい。脂肪族ポリエステルの濃度が1重量%より低いと繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、30重量%より高いと得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり好ましくない。より好ましい有機溶媒溶液中の脂肪族ポリエステルの濃度は2〜20重量%である。
脂肪族ポリエステルの溶媒は、脂肪族ポリエステルを溶解可能で、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されず、一種を単独で用いても複数の溶媒を組み合わせてもよい。例えばクロロホルム、2−プロパノール、トルエン、ベンゼン、ベンジルアルコール、ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、シクロヘキサノン、トリクロロエタン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。また、エマルションを形成する範囲内においてアセトン、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサン、1−プロパノール、フェノール、ピリジン、酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ−2−プロパノール、ヘキサフルオロアセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、N−メチル−2−ピロリジノン、N−メチルモルホリン−N−オキシド、1,3−ジオキソラン等の溶媒を含んでいてもよい。これらの中でも、取り扱い性や物性から、ジクロロメタン、エタノールを用いることが好ましい。
本発明における蛋白質は、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液に固体、液体、または溶液のいずれの状態で添加、混合してもよい。
本発明において、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からなるエマルションを紡糸液として使用する場合、蛋白質の水性溶媒は、蛋白質を溶解可能で、かつ脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液とエマルションを形成し、紡糸する段階で蒸発し、繊維を形成可能なものであれば特に限定されない。例えば、生理食塩水や各種緩衝液を使用することができる。さらには、蛋白質の安定剤や添加剤を加えてもよい。なかでもリン酸緩衝液、生理食塩水を用いることが好ましい。
本発明で用いられる蛋白質の水溶液における蛋白質の濃度は特に限定されず、蛋白質の特性に応じて適宜定められるが、例えば0.5〜50重量%である。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からエマルションを調製する場合、両者の混合割合としては、安定なエマルションさえ形成しさえすれば特に限定されるものではないが、例えば(蛋白質の水溶液)/(脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液)(体積比)が1/100〜1/2である。この値が1/2より大きいとエマルションが不安定となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液を混合し、エマルションを調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質の水溶液とでエマルションを形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
本発明において、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質からなる懸濁液を紡糸液として使用する場合、蛋白質粒子のサイズは特に限定されるものではないが、0.01〜100μmの範囲にあることが好ましい。0.01μmよりも小さい蛋白質粒子を作製することは技術的に困難であり、100μmよりも大きいと分散性が悪く、滅菌組成物が脆弱となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子を混合し、懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
また、懸濁液を調製する前に蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においては、いずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。
乾式粉砕処理としては、例えばボールミルを用いた処理、遊星ミルや振動ミルを用いた処理、乳鉢を用い乳棒によりすり潰す処理、媒体攪拌型粉砕機、ジェットミル、石臼を用いてすりつぶす処理等が挙げられる。
一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に蛋白質粒子を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。さらには、スプレードライヤーにより作製した蛋白質粒子を使用することもできる。
本発明で用いる滅菌方法は、放射線滅菌である。用いられる放射線としては、例えばアルファ線、ベータ線、ガンマ線、中性子線、電子線、およびエックス線が挙げられる。なかでもガンマ線あるいは電子線が好ましく、最も好ましいのは電子線である。これらの滅菌方法は、特に限定されるものではないが、放射線の照射量としては10〜80kGy、好ましくは20〜30kGyである。温度条件としては、特に限定されるものではないが−80〜40℃、好ましくは−80〜30℃である。
アルファ線、陽電子線、ガンマ線、中性子線、電子線、エックス線などの放射線は、物質に当たると物質を構成する分子・原子から電子をはぎ取る。この際に分子結合が切断され、反応性の高いラジカル等が生じ、周辺物質と2次的に化学反応する。
蛋白質は放射線照射により機能(活性)を失いやすいことがよく知られている。これは照射により分子結合が切れ、機能発現の根源である「高次構造」が壊されることによるものと考えられる。さらに、本願明細書の比較例に示されているように、蛋白質は放射線照射後の保存によっても構造破壊や失活が起こる。しかしながら、本発明における脂肪族ポリエステルに含有された蛋白質は放射線照射しても構造破壊や機能低下が抑制され、照射後の保存によるさらなる構造破壊や機能低下も抑制されている。これは本組成物中では、性蛋白質の高次構造が保持されていることを意味し、これは蛋白質の種類によらず共通の効果である。この効果は透過する脂肪族ポリエステルの厚みから考えて遮蔽によるものとは考えられず、抑制機構は定かではない。
本発明における放射線滅菌前の蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、さらに電子・イオン捕捉剤、エネルギー移動剤、ラジカル捕捉剤、酸化防止剤、可塑剤を含んでもよい。電子・イオン捕捉剤としては、例えばN,N’−テトラメチルフェニレンジアミン、ジフェニレンジアミン、ピレン、キノン等が挙げられる。エネルギー移動剤としては、例えばアセナフテン等が挙げられる。ラジカル捕捉剤としては、例えばメルカプタン、オクタヒドロフェナントレン、モノアルキルジフェニルエーテル、トコフェロール、クエン酸、ブチル化ヒドロキシアンソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、t−ブチルヒドロキノン、没食子酸プロピル、アスコルビン酸誘導体等が挙げられる。酸化防止剤としては、BHT、亜リン酸トリエステル、フェノール系老化防止剤、有機チオ酸塩類等が挙げられる。なかでも食品や医薬品に使用するのに安全であると一般に認められている添加剤が好ましい。添加剤の量は特に限定されるものではないが、例えば滅菌組成物における脂肪族ポリエステルに対して0.01〜10重量%の添加剤を含むことができる。
滅菌工程における蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、水分を含んでいないことが好ましい。水分率は10重量%以下が好ましく、より好ましくは4重量%以下、さらに好ましくは実質的に無水のものである。
また、蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、包装材に包装して放射線滅菌してもよい。かかる包装材料としては、アルミニウムのようなガスバリア性の高い材料を使用することが好ましい。また、脱酸素剤や乾燥剤と共に密封包装しても、脱気後に不活性ガスを充填した状態で包装しても、これら両方を行ってもよい。かかる脱酸素剤および乾燥剤は、人体に害がなく、放射線照射時に失活しないものが好ましい。
本発明の滅菌組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療用材料として使用できる。
1.トロンビン活性測定
ファルコン社製2008チューブに試料20μLと50mM Tris−HCl (pH8.5)+50mM NaClバッファー60μL、0.1% PLURONIC F−68を20μL加え、37℃で3分インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α―トロンビン(ヘマトロジックテクノロジー社から購入:HCT−0020)を同バッファーで5、2.5、1.25、0.625、0.3125U/mLに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質S−2238(1mM:第一化学薬品工業)を100μL添加して攪拌混合し、37℃で5分間の反応後、0.1Mクエン酸溶液を800μL加えて反応を停止した。反応液200μLを96ウェルプレートに移し、OD405/650を測定した。
なお、実施例5〜7及び比較例4以外においては以下の方法で測定した。BD社製ポリスチレンチューブに試料20μLと活性測定用希釈溶液(0.01% F−68、50mmol/L NaCl、50mmol/L Tris−HCl、pH8.4)80μL加え、37℃で3分インキュベーションした。標準品として組換トロンビン(JPU Thrombin Standard 400U/mLまたはWHO/US Thrombin Standard、110IU/mL)を同バッファーでJPUの場合、4、2、1、0.5、0.25U/mL、IUの場合、6、3、1.5、0.75、0.375IU/mLに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質S−2238(1mM:第一化学薬品工業)を100μL添加して攪拌混合し、37℃で7分間の反応後、0.1Mクエン酸溶液を800μL加えて反応を停止した。反応液200μLを96ウェルプレートに移し、OD405/650を測定した。
2.フィブリノゲン凝集体量測定
シートをΦ1cmに切り出した後、希釈液によりフィブリノゲンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーでその凝集体量を測定した。
<試験条件>
検出器:紫外吸光光度計(測定波長:280m)
カラム:Bio Sep−SEC−s4000(7.8×300mm、Phenomenex)
カラム温度:25℃
サンプラー温度:6℃
移動相:0.5mol/L Arg−HCl/50mmol/L リン酸バッファー
流量:1mL/min
分析時間:20min
3.厚さ
成形体を高精度デジタル測長機(株式会社ミツトヨ:商品名「ライトマチックVL−50」)を用いて測定力0.01Nによりn=15にて成形体の膜厚を測定した平均値を算出し成形体の厚さとした。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
4.目付
成形体を、50mm×100mmにカットしその重量を測定し換算することで成形体の目付を算出した。
5.嵩密度
上記測定した厚さと目付の値から成形体の嵩密度を算出した。
6.トロンビンELISA測定
ELISAプレート(NUNC 468667)に抗ヒトトロンビン抗体(Affinity Biological社、No.SAHT−AP)を5μg/mLで固定化した。0.05%Tween20を含むPBSで洗浄後、ブロックエース(DSファーマバイオメディカル UK−B80)を各ウェルに添加し、マスキングを行った。0.05%Tween20を含むPBSで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトトロンビン(ヘマトロジックテクノロジー社:HCT−0020)を用い、検量線を作成した。0.05%Tween20を含むPBSで洗浄後、HRP標識抗ヒトトロンビン抗体((Affinity Biological社、No.SAHT−HRP)を0.1μg/mLで添加した。反応後、0.05%Tween20を含むPBSで洗浄し、TMB試薬(DaKo S1599)を添加し、10分間静置して発色させた。1N H2SO4を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでOD450−650nmを測定した。
7.リパーゼ及びβ―グルコシダーゼの酵素活性測定
(1)抽出率測定
成形体を2cm×2cmに切り出し、1mLの生理食塩水に3分間若しくは3時間浸漬して、固定化した酵素を溶出させた。n=3にて前後の重量変化を測定し、以下の式により算出した抽出率の平均値を求めた。固定化酵素理論重量は、組成物の重量、仕込み酵素粉末重量%から算出した。
抽出割合=重量減少(mg)/固定化酵素理論重量(mg)
(2)酵素活性測定
リパーゼの活性測定にはContinuous Fluorometric Lipase Testキット(PROGEN BIOTECHNIK GMBH製)を使用した。以下の式により活性回収率を算出した。活性酵素量は、活性値から濃度換算して算出した。単位面積当たり固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量%と組成物の目付けから算出した。
活性回収率(%)={活性酵素量(mg/cm2)/(単位面積当たり固定化酵素理論重量(mg/cm2)×抽出割合)}×100
β‐グルコシダーゼの活性測定にはTokyogreen(登録商標、以下同じ。)−βGlu(積水メディカル株式会社)を用いた蛍光測定により行った。以下の式により活性回収率を算出した。固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量%と組成物の重量から算出した。
活性回収率(%)={活性酵素量(mg)/(固定化酵素理論重量(mg)×抽出割合)}×100
以下の式により活性保持率を算出した。
活性保持率(%)={滅菌後の活性回収率(%)/滅菌前の活性回収率(%)}×100
実施例1
エタノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有pH7の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(トロンビンとして1.69)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは131μm、目付けは1.44mg/cm2、嵩密度111mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は26.7U/cm2であった。得られたシートは、20kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、79%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は78%であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
実施例2
エタノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有pH7の水溶液を凍結乾燥したもの)とキニザリングリーンSS(東京化成)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(トロンビンとして1.69)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体(平均厚み:129μm、目付:1.49mg/cm2、嵩密度:124mg/cm3)を含むシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は40.2IU/cm2であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、70%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は74%であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
実施例3
エタノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するpH7の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(トロンビンとして1.69)/100(w/w)のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は127μmで、塗工速度は30.1mm/secであった。得られたシートの厚さは58μm、目付2.9mg/cm2、嵩密度504mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は71.1IU/cm2であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、75.7%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は82%であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
実施例4
エタノールにフィブリノゲン含有粒子(リコンビナントフィブリノゲン10mg/mL、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するpH8.5の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、フィブリノゲン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(フィブリノゲンとして50.85)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは131μm、目付けは1.44mg/cm2、嵩密度110mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、希釈液にてフィブリノゲンを抽出して高速クロマトグラフィーにより凝集体量を測定した。その結果、凝集体量は9.79%であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後の凝集体量を測定した。電子線照射直後の凝集体量は、18.81%であった。1ヵ月後は24.14%であった。
比較例1
トロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するpH7の水溶液を凍結乾燥したもの)に30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。照射前のトロンビン活性は、404.73U/バイアルであった。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、51.8%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は17.9%であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
比較例2
2−プロパノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するpH7の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、13重量%になるようにヒドロキシプロピルセルロース(2.0−2.9mPa・s 日本曹逹製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ヒドロキシプロピルセルロース=100/100(w/w)のドープ液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは204μm、目付けは2.08mg/cm2、嵩密度101mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は110.3IU/cm2であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、68.4%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は54.9%であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
比較例3
フィブリノゲン含有粒子(リコンビナントフィブリノゲン10mg/mL、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するpH8.5の水溶液を凍結乾燥したもの)に30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のフィブリノゲンの凝集体量を測定した。照射前の凝集体量は、6.97%であった。電子線照射直後の凝集体量は、18.51%であった。1ヵ月後は54.72%であった。
実施例1〜3、比較例1〜2の結果(滅菌後及び滅菌後保存後の、滅菌前に対するトロンビン(Th)活性保持率)を図1に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、蛋白含有粒子のみの場合(比較例1)に対し、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下が抑制され、さらには放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下が、脂肪族ポリエステルでなくセルロース類(ヒドロキシプロピルセルロース)である場合(比較例2)に対し、それぞれ抑制されていることがわかる。
実施例4および比較例3の結果(滅菌後及び滅菌後保存後の、フィブリノゲンの凝集体量)を図2に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有(実施例4)させることにより、蛋白含有粒子のみの場合(比較例3)に対し、放射線滅菌後の保存に伴う蛋白質の構造変化が抑制されていることがわかる。
実施例5
エタノールにトロンビン含有粒子(ボルヒール(登録商標、以下同じ)組織接着用:バイアル3)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリ乳酸=40(トロンビンとして0.45)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られたシートを2cm×2cmに切断し、1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は5.0U/cm2、ELISA測定値は3.4μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は7.5U/cm2、ELISA測定値は4.35μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は73%であった。
実施例6
エタノールにトロンビン含有粒子(ボルヒール組織接着用:バイアル3)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリ乳酸=70(トロンビンとして0.78)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られたシートを2cm×2cmに切断し、1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は9.575U/cm2、ELISA測定値は、7.0μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は11.15U/cm2、ELISA測定値は7.2μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は86%であった。
実施例7
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末(ボルヒール組織接着用:バイアル3)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末/ポリ乳酸=100(トロンビンとして1.1)/100(w/w)の紡糸液を調製した。温度22℃、湿度26%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は15kV、紡糸液流量は3.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られたシートを2cm×2cmに切断して、1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は15U/cm2、ELISA測定値は11μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は23U/cm2、ELISA測定値は16μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は64%であった。
比較例4
トロンビン含有粒子(ボルヒール)を20kGyで電子線滅菌した。1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は22.5U/cm2、ELISA測定値は11.5μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないトロンビン含有粒子についても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は68.5U/cm2、ELISA測定値は41.5μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は32%であった。
実施例8
エタノールにリパーゼ粉末(ブタ膵臓由来、和光純薬製、以下同じ)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体(PDLG5010 Purac Biomaterial製)を溶解し、リパーゼ粉末/ポリ乳酸−グリコール酸共重合体=50/100(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は4.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は79%であった。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを1cm×1cmに切断し、キットに含まれるLipase buffer 1mLでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は100%であった。
実施例9
リパーゼ粉末にジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体(PDLG5010 Purac Biomaterial製)を溶解し、リパーゼ粉末/ポリ乳酸=50/100(w/w)の紡糸液を調製した。温度26℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は15kV、紡糸液流量は4.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は63%であった。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを1cm×1cmに切断し、キットに含まれるLipase buffer 1mLでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は92%であった。
実施例10
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末(アーモンド由来、オリエンタル酵母工業製、以下同じ)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体(PDLG5010 Purac Biomaterial製)を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末/ポリ乳酸−グリコール酸共重合体=38/62(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は4.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを2cm×2cmに切断後、20kGyで電子線滅菌した。生理食塩水1mLでβ‐グルコシダーゼを抽出してTokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は92%であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は94%であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は98%であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
実施例11
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−カプロラクトン共重合体(PLCA8812多木化学製)を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末/ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体=38/62(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は3.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを2cm×2cmに切断後、20kGyで電子線滅菌した。生理食塩水1mLでβ‐グルコシダーゼを抽出してTokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は81%であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は80%であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は101%であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
実施例12
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、11wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末/ポリ乳酸=38/62(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は3.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを2cm×2cmに切断後、20kGyで電子線滅菌した。生理食塩水1mLでβ‐グルコシダーゼを抽出してTokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は62%であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は71%であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は87%であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
比較例5
リパーゼ粉末を20kGyで電子線滅菌した。粉末1mgに1mLのLipase bufferを添加して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は74%であった。
比較例6
β‐グルコシダーゼ粉末を20kGyで電子線滅菌した。粉末2mgを1mLの生理食塩水に溶解させ、Tokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性保持率は81%であった。
発明の効果
本発明の滅菌組成物は、滅菌されているにもかかわらず蛋白質の構造や機能が保持されている。
また、蛋白質を含む溶液はフィルターにより分離滅菌しているが、大きい粒子を含む組成物、または固体もしくは半固体組成物には適用が困難であった。
特許文献2にはコラーゲンスポンジマトリックス、第二の生体吸収性ポリマー例えば酸化再生セルロース(ORC)の分散繊維、および活性剤例えばペプチドを含む複合傷手当物質が示されている。活性剤はマトリックス、生体吸収性ポリマー、またはそれらの両方に含むことができ、該複合スポンジ物質をパッケージして滅菌できることが記載されている。
特許文献3には生物学的に活性なペプチドをその生物学的活性を消失することなくガンマ線または電子ビーム照射で滅菌する方法が示されている。この方法は、生物学的に活性なペプチドとゼラチン等の外来蛋白質を含む混合物を形成し、この混合物を凍結または凍結乾燥し、次にこの混合物を照射する工程を含む技術であり、外来蛋白質の存在がペプチドを安定化してペプチドの活性低下を防ぐと記載されている。
特許文献4には治療ペプチドと、酸化再生セルロース、中和酸化再生セルロース、およびこれらの混合物からなる群から選択されるポリサッカライドとの複合体が記載されている。そして電離放射線で滅菌する前にペプチドを有効量のポリサッカライドと共に製剤することにより、電離放射線で滅菌してもペプチド治療剤の生物学的活性は消失しないで安定化すると記載されている。
一方、特許文献5には酵素活性に優れる酵素含有ナノファイバーの製造方法が記載されている。この方法は、酵素と非水溶媒に溶解したポリマーとを含有する紡糸液を、静電紡糸法により紡糸して酵素前駆ナノファイバーを形成後、水を付与し乾燥するものである。しかし、この文献には酵素含有ナノファイバーを滅菌することに関する記述はない。
本発明の発明者らは前記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下、および放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下のうち、いずれかまたは両方を抑制できることを見出し、本発明に到達した。
本発明に用いられる蛋白質は特に限定されない。好ましいものとしては、例えばフィブリノゲンやトロンビンに代表される止血性蛋白質、アスパラギナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドデスムターゼ、リパーゼに代表される酵素、ヘモグロビン、血清アルブミン、低密度リポ蛋白質に代表される輸送蛋白質、アクチン、ミオシンに代表される筋肉蛋白質、抗体、補体に代表される防御蛋白質、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ヘビ毒に代表される毒素蛋白質、インスリン、増殖因子、サイトカインに代表される蛋白質ホルモン、卵アルブミン、フェリチンに代表される貯蔵蛋白質、コラーゲン、ケラチンに代表される構造蛋白質、上皮成長因子(Epidermal growth factor:EGF)、インスリン様成長因子(Insulin−like growth factor:IGF)、トランスフォーミング成長因子(Transforming growth factor:TGF)、神経成長因子(Nerve growth factor:NGF)、脳由来神経栄養因子(Brain−derived neurotrophic factor:BDNF)、血管内皮細胞増殖因子(Vesicular endothelial growth factor:VEGF)、顆粒球コロニー刺激因子(Granulocyte−colony stimulating factor:G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(Granulocyte−macrophage−colony stimulating factor:GM−CSF)、血小板由来成長因子(Platelet−derived growth factor:PDGF)、エリスロポエチン(Erythropoietin:EPO)、トロンボポエチン(Thrombopoietin:TPO)、塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth factor:bFGFまたはFGF2)、肝細胞増殖因子(Hepatocyte growth factor:HGF)に代表される成長因子が挙げられる。なかでも好ましいのは、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、および成長因子である。
また、本発明で用いられる蛋白質には、薬学的に許容しうる添加剤を加えてもよい。そのような添加剤の好ましい例としては、血液凝固第XIII因子、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール(グリセロール、マンニトール等)、トレハロース、クエン酸ナトリウム、アプロチニンおよび塩化カルシウムからなる群から選択される一種以上が挙げられる。
本発明で用いられる蛋白質又は蛋白質と添加剤との混合物は、脂肪族ポリエステル中に、それぞれ分子として分散して存在してもよいが、それぞれ分子が集まった粒子(以下添加剤との混合粒子を含めて「蛋白質粒子」と記載する場合がある。)として分散して存在することが好ましい。
これらの中でも、好ましくはポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択され、最も好ましいのはポリ乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体である。例えばポリL乳酸とポリD乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。
また、本発明で用いる脂肪族ポリエステルの分子量は1×103〜5×106であり、好ましくは1×104〜1×106、より好ましくは5×104〜5×105である。また、ポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。
本発明の滅菌組成物においては、その目的を損なわない範囲で、他のポリマーや他の化合物を併用してもよい。例えば、ポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
本発明において「蛋白質を含有する」とは、蛋白質の少なくとも一部分が脂肪族ポリエステル内部に入り込んでいる状態をいう。蛋白質が組成物表面や組成物の空隙に存在する凍結乾燥による複合体と区別される状態である。
本発明の繊維形状を有する滅菌組成物の平均繊維径は、例えば0.01〜50μmであるが、当業者であれば使用目的に応じて適宜定めることができる。
エレクトロスピニング法は、ポリマーが溶解している液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。工程としては、ポリマーが溶解している紡糸液を製造する工程と、該溶液に高電圧を印加する工程と、該溶液を噴出させる工程と、噴出させた溶液から溶媒を蒸発させて繊維成形体を形成させる工程と、任意に実施しうる工程として形成された繊維成形体の電荷を消失させる工程と、電荷消失によって繊維成形体を累積させる工程を含む。
以下、エレクトロスピニング法を例にとり、本発明のうち、繊維形状または不織布形状を有する滅菌組成物の製造法を説明する。
脂肪族ポリエステル溶液における脂肪族ポリエステルの濃度は1〜30重量%であることが好ましい。脂肪族ポリエステルの濃度が1重量%より低いと繊維成形体を形成することが困難となり好ましくない。また、30重量%より高いと得られる繊維成形体の繊維径が大きくなり好ましくない。より好ましい有機溶媒溶液中の脂肪族ポリエステルの濃度は2〜20重量%である。
本発明における蛋白質は、脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液に固体、液体、または溶液のいずれの状態で添加、混合してもよい。
本発明で用いられる蛋白質の水溶液における蛋白質の濃度は特に限定されず、蛋白質の特性に応じて適宜定められるが、例えば0.5〜50重量%である。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液からエマルションを調製する場合、両者の混合割合としては、安定なエマルションさえ形成しさえすれば特に限定されるものではないが、例えば(蛋白質の水溶液)/(脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液)(体積比)が1/100〜1/2である。この値が1/2より大きいとエマルションが不安定となり好ましくない。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質の水溶液を混合し、エマルションを調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質の水溶液とでエマルションを形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
脂肪族ポリエステルの有機溶媒溶液と蛋白質粒子を混合し、懸濁液を調製する方法としては、特に限定されないが、超音波や各種攪拌方法を用いることができる。攪拌方法としては、ホモジナイザーのような高速攪拌やアトライター、ボールミル等の攪拌方法も使用することができる。なかでも超音波処理による分散方法が好ましい。
また、有機溶媒と蛋白質粒子とで懸濁液を形成した後、脂肪族ポリエステルを添加して紡糸液を調製することも可能である。
また、懸濁液を調製する前に蛋白質粒子を微細処理することができる。微細処理としては、乾式粉砕と湿式粉砕とがあり、本発明においては、いずれの方式も採用することができ、両者を組み合わせることもできる。
一方、湿式粉砕処理としては、適当な分散媒に蛋白質粒子を分散させた状態で、高い剪断力の攪拌装置、混練装置等により攪拌する処理や、媒体中に分散した状態でのボールミル、ビーズミル処理等が挙げられる。さらには、スプレードライヤーにより作製した蛋白質粒子を使用することもできる。
アルファ線、陽電子線、ガンマ線、中性子線、電子線、エックス線などの放射線は、物質に当たると物質を構成する分子・原子から電子をはぎ取る。この際に分子結合が切断され、反応性の高いラジカル等が生じ、周辺物質と2次的に化学反応する。
滅菌工程における蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルは、水分を含んでいないことが好ましい。水分率は10重量%以下が好ましく、より好ましくは4重量%以下、さらに好ましくは実質的に無水のものである。
本発明の滅菌組成物は、例えば蛋白質の機能および滅菌性が求められる医療用材料として使用できる。
ファルコン社製2008チューブに試料20μLと50mM Tris−HCl (pH8.5)+50mM NaClバッファー60μL、0.1% PLURONIC F−68を20μL加え、37℃で3分インキュベーションした。標準品としてヒトプラズマ由来精製α―トロンビン(ヘマトロジックテクノロジー社から購入:HCT−0020)を同バッファーで5、2.5、1.25、0.625、0.3125U/mLに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質S−2238(1mM:第一化学薬品工業)を100μL添加して攪拌混合し、37℃で5分間の反応後、0.1Mクエン酸溶液を800μL加えて反応を停止した。反応液200μLを96ウェルプレートに移し、OD405/650を測定した。
なお、実施例5〜7及び比較例4以外においては以下の方法で測定した。BD社製ポリスチレンチューブに試料20μLと活性測定用希釈溶液(0.01% F−68、50mmol/L NaCl、50mmol/L Tris−HCl、pH8.4)80μL加え、37℃で3分インキュベーションした。標準品として組換トロンビン(JPU Thrombin Standard 400U/mLまたはWHO/US Thrombin Standard、110IU/mL)を同バッファーでJPUの場合、4、2、1、0.5、0.25U/mL、IUの場合、6、3、1.5、0.75、0.375IU/mLに希釈したものを用いた。その反応液にテストチーム発色基質S−2238(1mM:第一化学薬品工業)を100μL添加して攪拌混合し、37℃で7分間の反応後、0.1Mクエン酸溶液を800μL加えて反応を停止した。反応液200μLを96ウェルプレートに移し、OD405/650を測定した。
シートをΦ1cmに切り出した後、希釈液によりフィブリノゲンを抽出し、高速液体クロマトグラフィーでその凝集体量を測定した。
検出器:紫外吸光光度計(測定波長:280m)
カラム:Bio Sep−SEC−s4000(7.8×300mm、Phenomenex)
カラム温度:25℃
サンプラー温度:6℃
移動相:0.5mol/L Arg−HCl/50mmol/L リン酸バッファー
流量:1mL/min
分析時間:20min
成形体を高精度デジタル測長機(株式会社ミツトヨ:商品名「ライトマチックVL−50」)を用いて測定力0.01Nによりn=15にて成形体の膜厚を測定した平均値を算出し成形体の厚さとした。なお、本測定においては測定機器が使用可能な最小の測定力で測定を行った。
成形体を、50mm×100mmにカットしその重量を測定し換算することで成形体の目付を算出した。
上記測定した厚さと目付の値から成形体の嵩密度を算出した。
ELISAプレート(NUNC 468667)に抗ヒトトロンビン抗体(Affinity Biological社、No.SAHT−AP)を5μg/mLで固定化した。0.05%Tween20を含むPBSで洗浄後、ブロックエース(DSファーマバイオメディカル UK−B80)を各ウェルに添加し、マスキングを行った。0.05%Tween20を含むPBSで洗浄後、検体を添加した。標準品としてヒトトロンビン(ヘマトロジックテクノロジー社:HCT−0020)を用い、検量線を作成した。0.05%Tween20を含むPBSで洗浄後、HRP標識抗ヒトトロンビン抗体((Affinity Biological社、No.SAHT−HRP)を0.1μg/mLで添加した。反応後、0.05%Tween20を含むPBSで洗浄し、TMB試薬(DaKo S1599)を添加し、10分間静置して発色させた。1N H2SO4を加え、発色を停止し、マイクロプレートリーダーでOD450−650nmを測定した。
成形体を2cm×2cmに切り出し、1mLの生理食塩水に3分間若しくは3時間浸漬して、固定化した酵素を溶出させた。n=3にて前後の重量変化を測定し、以下の式により算出した抽出率の平均値を求めた。固定化酵素理論重量は、組成物の重量、仕込み酵素粉末重量%から算出した。
抽出割合=重量減少(mg)/固定化酵素理論重量(mg)
リパーゼの活性測定にはContinuous Fluorometric Lipase Testキット(PROGEN BIOTECHNIK GMBH製)を使用した。以下の式により活性回収率を算出した。活性酵素量は、活性値から濃度換算して算出した。単位面積当たり固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量%と組成物の目付けから算出した。
活性回収率(%)={活性酵素量(mg/cm2)/(単位面積当たり固定化酵素理論重量(mg/cm2)×抽出割合)}×100
β‐グルコシダーゼの活性測定にはTokyogreen(登録商標、以下同じ。)−βGlu(積水メディカル株式会社)を用いた蛍光測定により行った。以下の式により活性回収率を算出した。固定化酵素理論重量は、仕込み酵素粉末重量%と組成物の重量から算出した。
活性回収率(%)={活性酵素量(mg)/(固定化酵素理論重量(mg)×抽出割合)}×100
以下の式により活性保持率を算出した。
活性保持率(%)={滅菌後の活性回収率(%)/滅菌前の活性回収率(%)}×100
エタノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有pH7の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(トロンビンとして1.69)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは131μm、目付けは1.44mg/cm2、嵩密度111mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は26.7U/cm2であった。得られたシートは、20kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、79%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は78%であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
エタノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトール含有pH7の水溶液を凍結乾燥したもの)とキニザリングリーンSS(東京化成)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(トロンビンとして1.69)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体(平均厚み:129μm、目付:1.49mg/cm2、嵩密度:124mg/cm3)を含むシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は40.2IU/cm2であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、70%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は74%であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
エタノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するpH7の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(トロンビンとして1.69)/100(w/w)のドープ液を調製した。得られたドープ液を用い、流延法によりフィルムを作製した。塗工間隔は127μmで、塗工速度は30.1mm/secであった。得られたシートの厚さは58μm、目付2.9mg/cm2、嵩密度504mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出してトロンビン活性測定を実施した。その結果、活性測定値は71.1IU/cm2であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、75.7%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は82%であり、保存中のトロンビン活性の低下は見られなかった。
エタノールにフィブリノゲン含有粒子(リコンビナントフィブリノゲン10mg/mL、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するpH8.5の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10重量%になるようにポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体(Purasorb PDLG5010、Purac社製)を溶解し、フィブリノゲン含有粒子/ポリグリコール酸−ポリ乳酸共重合体=100(フィブリノゲンとして50.85)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは131μm、目付けは1.44mg/cm2、嵩密度110mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、希釈液にてフィブリノゲンを抽出して高速クロマトグラフィーにより凝集体量を測定した。その結果、凝集体量は9.79%であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後の凝集体量を測定した。電子線照射直後の凝集体量は、18.81%であった。1ヵ月後は24.14%であった。
2−プロパノールにトロンビン含有粒子(リコンビナントトロンビン1mg/mL、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム及びマンニトールを含有するpH7の水溶液を凍結乾燥したもの)を分散させた後、13重量%になるようにヒドロキシプロピルセルロース(2.0−2.9mPa・s 日本曹逹製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ヒドロキシプロピルセルロース=100/100(w/w)のドープ液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られた繊維成形体の厚さは204μm、目付けは2.08mg/cm2、嵩密度101mg/cm3であった。得られたシートを直径1cmに切り出し、200μLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性測定を実施した。その結果、活性測定値は110.3IU/cm2であった。得られたシートは、30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のトロンビン活性を測定した。電子線照射直後のトロンビン活性は、滅菌前を100%とした時、68.4%の保持率であった。1ヵ月後の活性保持率は54.9%であり、保存中のトロンビン活性の低下が見られた。
フィブリノゲン含有粒子(リコンビナントフィブリノゲン10mg/mL、アルギニン、塩化ナトリウム及びマンニトールを含有するpH8.5の水溶液を凍結乾燥したもの)に30kGyの電子線を照射し滅菌後、40℃/75%RHで保存し、1ヶ月後のフィブリノゲンの凝集体量を測定した。照射前の凝集体量は、6.97%であった。電子線照射直後の凝集体量は、18.51%であった。1ヵ月後は54.72%であった。
実施例1〜3、比較例1〜2の結果(滅菌後及び滅菌後保存後の、滅菌前に対するトロンビン(Th)活性保持率)を図1に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有させることにより、蛋白含有粒子のみの場合(比較例1)に対し、放射線滅菌による蛋白質の構造変化や機能低下が抑制され、さらには放射線滅菌後の保存に伴うこれら変化や低下が、脂肪族ポリエステルでなくセルロース類(ヒドロキシプロピルセルロース)である場合(比較例2)に対し、それぞれ抑制されていることがわかる。
実施例4および比較例3の結果(滅菌後及び滅菌後保存後の、フィブリノゲンの凝集体量)を図2に示す。
蛋白質を脂肪族ポリエステルに含有(実施例4)させることにより、蛋白含有粒子のみの場合(比較例3)に対し、放射線滅菌後の保存に伴う蛋白質の構造変化が抑制されていることがわかる。
エタノールにトロンビン含有粒子(ボルヒール(登録商標、以下同じ)組織接着用:バイアル3)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリ乳酸=40(トロンビンとして0.45)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られたシートを2cm×2cmに切断し、1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は5.0U/cm2、ELISA測定値は3.4μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は7.5U/cm2、ELISA測定値は4.35μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は73%であった。
エタノールにトロンビン含有粒子(ボルヒール組織接着用:バイアル3)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、トロンビン含有粒子/ポリ乳酸=70(トロンビンとして0.78)/100(w/w)の紡糸液を調製した。エレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られたシートを2cm×2cmに切断し、1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は9.575U/cm2、ELISA測定値は、7.0μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は11.15U/cm2、ELISA測定値は7.2μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は86%であった。
エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末(ボルヒール組織接着用:バイアル3)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、トロンビン凍結乾燥粉末/ポリ乳酸=100(トロンビンとして1.1)/100(w/w)の紡糸液を調製した。温度22℃、湿度26%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は15kV、紡糸液流量は3.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られたシートを2cm×2cmに切断して、1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は15U/cm2、ELISA測定値は11μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は23U/cm2、ELISA測定値は16μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は64%であった。
トロンビン含有粒子(ボルヒール)を20kGyで電子線滅菌した。1mLの生理食塩水で蛋白質を抽出して活性およびELISA測定を実施した。その結果、活性測定値は22.5U/cm2、ELISA測定値は11.5μg/cm2であった。一方で、滅菌処理していないトロンビン含有粒子についても同様に活性およびELISA測定を実施した結果、活性測定値は68.5U/cm2、ELISA測定値は41.5μg/cm2であった。すなわち、未滅菌シートに対しての滅菌シートの活性保持率は32%であった。
エタノールにリパーゼ粉末(ブタ膵臓由来、和光純薬製、以下同じ)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体(PDLG5010 Purac Biomaterial製)を溶解し、リパーゼ粉末/ポリ乳酸−グリコール酸共重合体=50/100(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は4.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は79%であった。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを1cm×1cmに切断し、キットに含まれるLipase buffer 1mLでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は100%であった。
リパーゼ粉末にジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体(PDLG5010 Purac Biomaterial製)を溶解し、リパーゼ粉末/ポリ乳酸=50/100(w/w)の紡糸液を調製した。温度26℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.8mm、電圧は15kV、紡糸液流量は4.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートのリパーゼ抽出率は63%であった。得られたシートを20kGyで電子線滅菌した。得られた滅菌シートを1cm×1cmに切断し、キットに含まれるLipase buffer 1mLでリパーゼを抽出して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は92%であった。
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末(アーモンド由来、オリエンタル酵母工業製、以下同じ)を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−グリコール酸共重合体(PDLG5010 Purac Biomaterial製)を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末/ポリ乳酸−グリコール酸共重合体=38/62(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は4.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを2cm×2cmに切断後、20kGyで電子線滅菌した。生理食塩水1mLでβ‐グルコシダーゼを抽出してTokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は92%であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は94%であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は98%であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、10wt%になるようにポリ乳酸−カプロラクトン共重合体(PLCA8812 多木化学製)を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末/ポリ乳酸−カプロラクトン共重合体=38/62(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は3.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを2cm×2cmに切断後、20kGyで電子線滅菌した。生理食塩水1mLでβ‐グルコシダーゼを抽出してTokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は81%であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は80%であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は101%であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
エタノールにβ‐グルコシダーゼ粉末を分散させた後、ジクロロメタンを加え、11wt%になるようにポリ乳酸(PL18 Purac Biomaterial製)を溶解し、β‐グルコシダーゼ粉末/ポリ乳酸=38/62(w/w)の紡糸液を調製した。温度27℃、湿度25%以下でエレクトロスピニング法により紡糸を行い、シート状の繊維成形体を得た。噴出ノズルの内径は0.9mm、電圧は15kV、紡糸液流量は3.0mL/h、噴出ノズルから平板までの距離は25cmであった。得られたシートを2cm×2cmに切断後、20kGyで電子線滅菌した。生理食塩水1mLでβ‐グルコシダーゼを抽出してTokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性回収率は62%であった。一方で、滅菌処理していないシートについても同様に活性測定を実施した結果、活性回収率は71%であった。以上のことから、未滅菌繊維成形体に対しての滅菌繊維成形体の活性保持率は87%であり、電子線滅菌により失活していないことがわかった。
リパーゼ粉末を20kGyで電子線滅菌した。粉末1mgに1mLのLipase bufferを添加して活性測定を実施した。その結果、活性回収率は74%であった。
β‐グルコシダーゼ粉末を20kGyで電子線滅菌した。粉末2mgを1mLの生理食塩水に溶解させ、Tokyogreen−βGluで活性測定を実施した。その結果、活性保持率は81%であった。
Claims (9)
- 蛋白質および該蛋白質を含有する脂肪族ポリエステルを含む、放射線滅菌された滅菌組成物。
- 蛋白質がそのまままたは薬学的に許容しうる添加物との混合物として脂肪族ポリエステル中に粒子として分散している請求項1記載の滅菌組成物。
- 蛋白質が止血性蛋白質、酵素、輸送蛋白質、筋肉蛋白質、防御蛋白質、毒素蛋白質、蛋白質ホルモン、貯蔵蛋白質、構造蛋白質、成長因子、およびそれらの混合物からなる群から選択される請求項1または2に記載の滅菌組成物。
- 蛋白質が止血性蛋白質である請求項1または2に記載の滅菌組成物。
- 脂肪族ポリエステルがポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、それらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される請求項1から4のいずれかに記載の滅菌組成物。
- 繊維形状にある請求項1から5のいずれかに記載の滅菌組成物。
- エレクトロスピニング法で製造された請求項6に記載の滅菌組成物。
- フィルム形状にある請求項1から5のいずれかに記載の滅菌組成物。
- 流延法で製造された請求項8に記載の滅菌組成物。
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