TW201343668A - 成骨細胞特異因子（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）基因之表現抑制核酸分子、成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法及其用途 - Google Patents

成骨細胞特異因子（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）基因之表現抑制核酸分子、成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法及其用途 Download PDF

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Shigeo Yoshida
Tomohiro Hamasaki
Keijiro Ishikawa
Takayuki Mizutani
Tatsuro Ishibashi
Tadaaki Ohgi
Takahito NAKAMA
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Univ Kyushu Nat Univ Corp
Aqua Therapeutics Co Ltd
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Abstract

本發明提供一種抑制成骨細胞特異因子基因之表現的新分子。成骨細胞特異因子基因之表現抑制核酸分子特徵在於：包含由序列編號1~19中任一鹼基序列所構成之核苷酸來作為成骨細胞特異因子基因之表現抑制序列。依據本發明之表現抑制核酸分子，由於可抑制成骨細胞特異因子基因之表現的緣故，而可使用於諸如以成骨細胞特異因子基因之表現為成因之眼部疾病，具體來說則可使用於增生性糖尿病視網膜病變及黃斑部病變等之治療。

Description

成骨細胞特異因子(PERIOSTIN)基因之表現抑制核酸分子、成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法及其用途 發明領域
本發明係關於為眼部疾病之成因的成骨細胞特異因子基因之表現抑制核酸分子、成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法，及其用途。
發明背景
近年，伴隨著糖尿病患者的增加，合併症之一的糖尿病視網膜病變(Diabetic Retinopathy：DR)患者正在增加。糖尿病視網膜病變，依病期被分類為單純型糖尿病視網膜病變、前增殖型糖尿病視網膜病變及增生型糖尿病視網膜病變(Proliferative Diabetic Retinopathy：PDR)。其中，增生型糖尿病視網膜病變不單是視力的降低，恐有致失明之虞。
還有，作為眼部疾病，同樣地老年性黃斑部病變(Age-related Macular Degeneration：AMD)等黃斑部病變亦成為問題。黃斑部病變係起因於老化及壓力等而造成黄斑變性而視力降低的疾病。此疾病在重症的狀況時亦有致失明之虞。
此等眼部疾病係肇因於脈絡膜視網膜陷入缺氧 狀態等，而為了補充氧，而在視網膜上下形成新生血管。由於新生血管脆弱，容易破裂而出血，而因出血的血液遮住光路等而視力降低。還有，前述新生血管進展成被稱為增殖組織的纖維性膜，此甚有導致發生牽引性視網膜剝離。然後，要是因這樣的狀態被維持且反覆發生而重症化的話，則恐有造成失明之虞(專利文獻1)。因此，關於此等眼部疾病，需求可能成為治療藥之新候選物質的提供。
就此等眼部疾病來說，報告成骨細胞特異因子基因之表現係參與其中(非專利文獻1)。
先行技術文獻 專利文獻
專利文獻1 日本特開2011-220969號公報
非專利文獻
非專利文獻1 S. Yoshida et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011, Vol.52, No.8
發明概要
於是，本發明之目的係在於提供抑制成骨細胞特異因子基因之表現的新分子，並提供使用有其之表現抑制方法，以及眼部疾病的治療方法等用途。
為達成前述目的，本發明之成骨細胞特異因子基因的表現抑制核酸分子特徵係在於包含下述(as1)、(as2)或 (as3)的核苷酸作為成骨細胞特異因子基因的表現抑制序列。
(as1)由序列編號1~19中任一鹼基序列構成之核苷酸；(as2)由前述(as1)之鹼基序列中有1或數個鹼基缺失、取代及/或附加的鹼基序列所構成，且具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能的核苷酸；(as3)由與前述(as1)之鹼基序列具有90%以上之相同性的鹼基序列所構成，且具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能的核苷酸。
本發明之組成物特徵在於包含本發明之前述表現抑制核酸分子。
本發明之眼部疾病用醫藥品特徵在於包含本發明之前述表現抑制核酸分子。
本發明之抑制方法係一成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法，特徵在於：使用本發明之前述表現抑制核酸分子。
本發明之眼部疾病之治療方法特徵在於包含：對患者投予本發明之前述表現抑制核酸分子之步驟。
依據本發明之表現抑制核酸分子，可抑制成骨細胞特異因子基因的表現。因此，本發明對於成骨細胞特異因子基因之表現為成因之眼部疾病，例如增生型糖尿病視網膜病變或黃斑部病變等各種眼部疾病的治療係有效的。
[圖1]圖1(A)、(B)係顯示本發明核酸分子之一例的示意圖。
[圖2]圖2(A)、(B)係顯示本發明核酸分子之其他例的示意圖。
[圖3]圖3(A)、(B)係顯示本發明核酸分子之其他例的示意圖。
[圖4]圖4(A)~(D)係顯示本發明核酸分子之其他例的示意圖。
[圖5]圖5係顯示在本發明實施例1中之在活體外(in vitro)中的成骨細胞特異因子基因表現量相對值的圖。
[圖6]圖6係本發明實施例2的結果，(A)係顯示小鼠眼之纖維性增殖組織體積的圖，(B)係顯示小鼠眼之新生血管體積的圖。
[圖7]圖7係顯示在本發明實施例3中之活體外(in vitro)中的成骨細胞特異因子基因表現量相對值的圖。
[圖8]圖8係顯示在本發明實施例4中之活體外(in vitro)中的成骨細胞特異因子基因表現量相對值的圖。
[圖9]圖9係顯示在本發明實施例4中之活體外(in vitro)中的成骨細胞特異因子基因表現量相對值的圖。
[圖10]圖10係顯示在本發明實施例5中之活體外(in vitro)中的成骨細胞特異因子基因表現量相對值的圖。
用以實施發明之形態
在本說明書使用的用語只要未特別言及，可以此 技術領域中通常使用的意思來使用。
<表現抑制核酸分子>
本發明之表現抑制核酸分子(以下亦稱為「本發明之核酸分子」)，如前所述，係抑制表現用的核酸分子，特徵係在於包含下述(as1)、(as2)或(as3)的核苷酸作為成骨細胞特異因子基因之表現抑制序列。
(as1)由序列編號1~19之任一鹼基序列構成之核苷酸；(as2)由在前述(as1)之鹼基序列中，有1或數個鹼基經缺失、取代及/或附加之鹼基序列構成，且具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能的核苷酸；(as3)由具有與前述(as1)之鹼基序列90%以上之相同性的鹼基序列構成，且具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能的核苷酸。
以下，將前述(as1)、(as2)或(as3)之核苷酸稱為as核苷酸，並分別稱為as1核苷酸、as2核苷酸及as3核苷酸。
在本發明中，成骨細胞特異因子基因之表現的抑制，並未被特別限制，例如，可為基因轉錄本身的抑制，亦可為藉由將基因之轉錄產物予以分解所致之抑制。還有，成骨細胞特異因子基因之表現的抑制，例如，可為具有本來的機能之成骨細胞特異因子蛋白質之表現的抑制，而當蛋白質表現的狀況時，前述蛋白質，例如，可係前述機能受阻礙的蛋白質，亦可為已缺失前述機能的蛋白質。
前述表現抑制序列，例如，可為由前述as核苷酸構成之序列，亦可為包含前述as核苷酸之序列。
前述表現抑制序列之長度未被特別限制，例如為18~32個鹼基長，較佳係19~30個鹼基長，更佳係19、20、21個鹼基長。在本發明中，舉例來說，鹼基數的數值範圍，係揭示屬於該範圍之所有正整數，舉例來說，「1~4個鹼基」的記載係意指揭示「1、2、3、4個鹼基」全部(以下相同)。
將前述as1核苷酸序列顯示於以下。再者，亦有分別將由前述序列編號1~19之鹼基序列構成的核苷酸、由前述核苷酸構成的表現抑制序列、包含前述核苷酸之表現抑制序列，以及包含前述核苷酸的核酸分子，以顯示於以下的名稱(序列編號之前的名稱)來表示。
NI-0079(序列編號1)
5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC-3’
NI-0080(序列編號2)
5’-GAAGUAUUUCUUUUUGGUG-3’
NI-0081(序列編號3)
5’-AAUCUGGUUCCCAUGGAUG-3’
NI-0082(序列編號4)
5’-UUUCUAGGACACCUCGUGG-3’
NI-0083(序列編號5)
5’-UUGUUUGGCAGAAUCAGGA-3’
NI-0084(序列編號6)
5’-UCAAUAACUUGUUUGGCAG-3’
NI-0085(序列編號7)
5’-AGCUCAAUAACUUGUUUGG-3’
NI-0086(序列編號8)
5’-UUGCUGUUUUCCAGCCAGC-3’
NI-0087(序列編號9)
5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC-3’
NI-0088(序列編號10)
5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG-3’
NI-0091(序列編號11)
5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC-3’
NI-0092(序列編號12)
5’-UACUGUUAUACUGUCACCG-3’
NI-0093(序列編號13)
5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC-3’
NI-0094(序列編號14)
5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG-3’
NI-0095(序列編號15)
5’-AUCAGAUCGUUGAUUUAGG-3’
NI-0096(序列編號16)
5’-UUCAGGAUAUUAGUGACUC-3’
NI-0097(序列編號17)
5’-UCCUUUCUAGGACACCUCG-3’
NI-0098(序列編號18)
5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC-3’
NI-0099(序列編號19)
5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG-3’
在前述as2核苷酸中，「1或數個」並未被特別限制。「1或數個」舉例來說係1~7個，以1~5個為佳，較佳係1~4個，更佳係1個、2個或3個。前述as2核苷酸舉例來說係具有與前述as1核苷酸相同之機能即可，更詳細地說，具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能即可。所謂「及/或」係至少任一的意思，亦可表示「選自由...構成之群組中之至少一個」(以下相同)。
在前述as3核苷酸中，相同性舉例來說係90%以上，較佳係93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上。前述as3核苷酸，舉例來說，具有與前述as1核苷酸相同之機能即可，更詳細地說，具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能即可。前述相同性，例如，可使用BLAST、FASTA等分析軟體，透過預設的參數來算出(以下相同)。
前述表現抑制序列，如前所述，可係由前述as核苷酸構成之序列，亦可係包含前述as核苷酸之序列。在後者的情況下，前述表現抑制序列，例如，可舉進一步具有突出之形態。在前述表現抑制序列中，前述突出，例如，可附加於前述as核苷酸之3’末端及5’末端之至少一者，較佳係附加於前述3’末端。
前述突出未被特別限制，例如，長度及序列皆未被特別限制。前述突出，例如，可以(N)n表示。N係鹼基，例如，可為天然的鹼基，亦可為人工鹼基。前述天然鹼基，例如，可舉A、C、G、U及T。前述n係正整數，表示突出的鹼基長。前述突出(N)n之長度(n)，例如係1、2、3個鹼基 長，較佳係1或2個鹼基長，更佳係2個鹼基長。當前述突出(N)n之長度為2個鹼基長以上的狀況時(n≧2)，連續之鹼基(N)，例如，可為相同的鹼基，亦可為不同的鹼基。前述突出(N)n的序列，例如，可應用siRNA之反意股(antisense)的突出。前述(N)n，例如，始自3’端側或5’端側，可例示UU、CU、UC、GA、AG、GC、UA、AA、CC、GU、UG、CG、AU、TT等。
當前述表現抑制序列具有前述突出的狀況時，前述表現抑制序列，例如，可舉前述as1核苷酸與前述突出經連結的序列。作為具體例，可舉由前述as1核苷酸與前述突出經連結的之序列編號20~38之任一鹼基序列(n係正整數)構成之核苷酸。在以下序列中，(N)n係突出，並未被特別限制，如前述，其長度(n)較佳係2個鹼基長。還有，在各序列的旁邊顯示突出之一例(記載為5’-3’方向)，但本發明未被限定於此。還有，在下述序列中，除(N)n之外之區域，亦可係前述as2核苷酸或前述as3核苷酸。
NI-0079(序列編號20)
TT 5’-AAGUAUUUCUUUUUGGUGC(N)n-3’
NI-0080(序列編號21)
TT 5’-GAAGUAUUUCUUUUUGGUG(N)n-3’
NI-0081(序列編號22)
TT 5’-AAUCUGGUUCCCAUGGAUG(N)n-3’
NI-0082(序列編號23)
TT 5’-UUUCUAGGACACCUCGUGG(N)n-3’
NI-0083(序列編號24)
TT 5’-UUGUUUGGCAGAAUCAGGA(N)n-3’
NI-0084(序列編號25)
TT 5’-UCAAUAACUUGUUUGGCAG(N)n-3’
NI-0085(序列編號26)
TT 5’-AGCUCAAUAACUUGUUUGG(N)n-3’
NI-0086(序列編號27)
TT 5’-UUGCUGUUUUCCAGCCAGC(N)n-3’
NI-0087(序列編號28)
TT 5’-UGGUUUGCUGUUUUCCAGC(N)n-3’
NI-0088(序列編號29)
TT 5’-GAUGCCAAGCCUAAUUGGG(N)n-3’
NI-0091(序列編號30)
AG 5’-UGAUUCGAGCACAAUUAAC(N)n-3’
NI-0092(序列編號31)
UC 5’-UACUGUUAUACUGUCACCG(N)n-3’
NI-0093(序列編號32)
AU 5’-UAAGCACACGGUCAAUGAC(N)n-3’
NI-0094(序列編號33)
GU 5’-UAAUUGGGCUACCAGGUCG(N)n-3’
NI-0095(序列編號34)
AU 5’-AUCAGAUCGUUGAUUUAGG(N)n-3’
NI-0096(序列編號35)
CG 5’-UUCAGGAUAUUAGUGACUC(N)n-3’
NI-0097(序列編號36)
UG 5’-UCCUUUCUAGGACACCUCG(N)n-3’
NI-0098(序列編號37)
GU 5’-AUCCUUUCUAGGACACCUC(N)n-3’
NI-0099(序列編號38)
CU 5’-UUUGCUGUUUUCCAGCCAG(N)n-3’
本發明之核酸分子，進一步，以具有與前述表現抑制序列黏合(annealing)之互補序列為佳。前述互補序列，舉例來說，包含相對於在前述表現抑制序列中之前述as核苷酸係互補的核苷酸(以下稱為互補核苷酸)。前述互補序列，可為包含前述互補核苷酸之序列，亦可係由前述互補核苷酸構成之序列。
前述互補序列，舉例來說可與前述表現抑制序列相黏合即可。在前述互補序列中之前述互補核苷酸，與在前述表現抑制序列中之前述as核苷酸之互補性，例如，係90%以上，以93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上為佳，較佳係100%。再者，就前述表現抑制序列與前述互補序列，舉例來說，以前者之as核苷酸與後者之互補核苷酸，兩者顯示前述的互補性為佳，而前者之as核苷酸以外之區域及後者之互補核苷酸以外之區域，可為互補的，亦可為非互補的。於對準前述表現抑制序列與前述互補序列之際，前者之as核苷酸以外之區域以及後者之互補核苷酸以外之區域，例如，可存在對應之序列，亦可不存在對應之序列。作為具體例，前者 之as核苷酸以外之區域以及後者之互補核苷酸以外之區域，例如，可舉前述突出。即，於對準前述表現抑制序列與前述互補序列之際，成為前述表現抑制序列在3’端側(或5’端側)突出有突出之形狀，亦可成為前述互補序列在5’端側(或3’端側)突出有突出之形狀。
前述互補的核苷酸，例如，可舉下述(s1)(s2)或(s3)的核苷酸。
(s1)由與前述(as1)之鹼基序列互補之鹼基序列構成的核苷酸；(s2)由與前述(as2)之鹼基序列互補之鹼基序列構成的核苷酸；(s3)由與前述(as3)之鹼基序列互補之鹼基序列構成的核苷酸。
於以下將前述(s1)、(s2)或(s3)的核苷酸稱為s核苷酸，並分別稱為s1核苷酸、s2核苷酸、s3核苷酸。
前述互補序列，例如，可為由前述s核苷酸構成之序列，亦可為包含前述s核苷酸之序列。
前述互補序列的長度並未被特別限制，例如，係18~32個鹼基長，較佳係19~30個鹼基長，更佳係19、20、21個鹼基長。
於以下顯示前述s1核苷酸序列的具體例。前述序列編號39~57之序列，分別係完全互補於由前述序列編號1~19之鹼基序列構成之as1核苷酸。再者，亦有將由前述序列編號39~57之鹼基序列構成之核苷酸、由前述核苷酸構成 之表現抑制序列、包含前述核苷酸之表現抑制序列，以及包含前述核苷酸之核酸分子分別以顯示於以下的名稱(序列編號之前的名稱)來表示。
NI-0079(序列編號39)
5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU-3’
NI-0080(序列編號40)
5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC-3’
NI-0081(序列編號41)
5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU-3’
NI-0082(序列編號42)
5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA-3’
NI-0083(序列編號43)
5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA-3’
NI-0084(序列編號44)
5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA-3’
NI-0085(序列編號45)
5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU-3’
NI-0086(序列編號46)
5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA-3’
NI-0087(序列編號47)
5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA-3’
NI-0088(序列編號48)
5’-CCCAAUUAGGCUUGGCAUC-3’
NI-0091(序列編號49)
5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA-3’
NI-0092(序列編號50)
5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA-3’
NI-0093(序列編號51)
5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA-3’
NI-0094(序列編號52)
5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA-3’
NI-0095(序列編號53)
5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU-3’
NI-0096(序列編號54)
5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA-3’
NI-0097(序列編號55)
5’-CGAGGUGUCCUAGAAAGGA-3’
NI-0098(序列編號56)
5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU-3’
NI-0099(序列編號57)
5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA-3’
前述互補序列，如前所述，可為由前述互補核苷酸構成之序列，亦可為包含前述互補核苷酸之序列。在後者的情況下，前述互補序列，例如，可舉進一步具有突出之形態。就前述互補序列而言，前述突出，例如，可附加於前述互補核苷酸之3’末端及5’末端之至少一者，而較佳係附加於前述3’末端。
前述突出，未被特別限制，可引用在前述表現抑 制序列中的記載。在前述互補序列中之前述突出(N)n的序列，例如，可應用siRNA之正意股的突出。前述(N)n，例如，自5’端側或3’端側可例示UU、CU、UC、CA、AC、GA、AG、GC、UA、AA、CC、UG、GU、CG、AU、TT、GG等。
當前述互補序列具有前述突出之狀況時，前述互補序列，例如，可舉前述s1核苷酸與前述突出經連結之序列。作為具體例，可舉由經連結前述s核苷酸與前述突出之序列編號58~76之任一鹼基序列(n係正整數)構成之核苷酸。於以下序列中，(N)n係突出，未被特別限制，如前所述，其長度(n)較佳係2個鹼基長。還有，在各序列的旁邊，顯示突出之一例，但本發明並未被限定於此。還有，在下述序列中，除(N)n以外之區域，亦可為前述s2核苷酸或前述s3核苷酸。
NI-0079(序列編號58)
5’-GCACCAAAAAGAAAUACUU(N)n-3’ TT
NI-0080(序列編號59)
5’-CACCAAAAAGAAAUACUUC(N)n-3’ TT
NI-0081(序列編號60)
5’-CAUCCAUGGGAACCAGAUU(N)n-3’ TT
NI-0082(序列編號61)
5’-CCACGAGGUGUCCUAGAAA(N)n-3’ TT
NI-0083(序列編號62)
5’-UCCUGAUUCUGCCAAACAA(N)n-3’ TT
NI-0084(序列編號63)
5’-CUGCCAAACAAGUUAUUGA(N)n-3’ TT
NI-0085(序列編號64)
5’-CCAAACAAGUUAUUGAGCU(N)n-3’ TT
NI-0086(序列編號65)
5’-GCUGGCUGGAAAACAGCAA(N)n-3’ TT
NI-0087(序列編號66)
5’-GCUGGAAAACAGCAAACCA(N)n-3’ TT
NI-0088(序列編號67)
5’-CCCAAUUAGGCUUGGCAUC(N)n-3’ TT
NI-0091(序列編號68)
5’-GUUAAUUGUGCUCGAAUCA(N)n-3’ UC
NI-0092(序列編號69)
5’-CGGUGACAGUAUAACAGUA(N)n-3’ AA
NI-0093(序列編號70)
5’-GUCAUUGACCGUGUGCUUA(N)n-3’ CA
NI-0094(序列編號71)
5’-CGACCUGGUAGCCCAAUUA(N)n-3’ GG
NI-0095(序列編號72)
5’-CCUAAAUCAACGAUCUGAU(N)n-3’ UU
NI-0096(序列編號73)
5’-GAGUCACUAAUAUCCUGAA(N)n-3’ GA
NI-0097(序列編號74)
5’-CGAGGUGUCCUAGAAAGGA(N)n-3’ UC
NI-0098(序列編號75)
5’-GAGGUGUCCUAGAAAGGAU(N)n-3’ CA
NI-0099(序列編號76)
5’-CUGGCUGGAAAACAGCAAA(N)n-3’ CC
於以下，例示前述as核苷酸與前述s核苷酸的組合。本發明並未受限於此等例示。還有，在下述序列中，as核苷酸及s核苷酸，可分別於3’末端具有(N)n之突出，或是於5’末端具有(N)n之突出，而前述(N)n係以2個鹼基長為佳。
本發明之核酸分子的構成單位，未被特別限制，例如，可舉核苷酸殘基。前述核苷酸殘基，例如，可舉核 糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基。前述核苷酸殘基，例如，可舉未經修飾之非修飾核苷酸殘基及業經修飾之修飾核苷酸殘基。
本發明之核酸分子，例如，係RNA分子。本發明之核酸分子，例如，可為僅由核糖核苷酸殘基構成之RNA分子，亦可為除核糖核苷酸殘基之外包含去氧核糖核苷酸殘基及/或非核苷酸殘基之RNA分子。
本發明之核酸分子，例如，可為前述雙股核酸分子，亦可為前述單股核酸分子。於以下，針對本發明之核酸分子，舉前述雙股核酸分子及前述單股核酸分子為例進行說明。
(1)雙股核酸分子
當本發明之核酸分子為雙股核酸分子的狀況時，包含兩條單股核酸，其中之一單股核酸具有前述表現抑制序列即可。前述雙股核酸分子，例如，可舉所謂的siRNA或是siRNA之前驅物等。前述雙股核酸分子，例如，以其中之一單股核酸，即，其反意股具有前述表現抑制序列，而另一單股核酸，即，其正意股具有前述互補序列為佳。前述反意股，例如，可為由前述表現抑制序列構成之單股核酸，亦可為包含前述表現抑制序列之單股核酸。前述正意股，例如，可為由前述互補序列構成之單股核酸，亦可為包含前述互補序列之單股核酸。
在前述雙股核酸分子中，各單股核酸之長度，未被特別限制。前述反意股，例如，係18~32個鹼基長，較佳 係19~30個鹼基長，更佳係19、20、21個鹼基長。前述正意股，例如，係18~32個鹼基長，較佳係19~30個鹼基長，更佳係19、20、21個鹼基長。
前述反意股及前述正意股，以分別於3’末端及5’末端之至少一者具有突出為佳。前述突出之長度，舉例來說，例如，係1、2、3個鹼基長，較佳係1或2個鹼基長，更佳係2個鹼基長。前述突出之序列，未被特別限制，例如，可舉前述之例示。
(2)單股核酸分子
當本發明之核酸分子為單股核酸分子的狀況時，具有前述表現抑制序列即可，其他形態則未被特別限制。
前述核酸分子，例如，係由1條之單股所構成之單股核酸分子，例如，在可能黏合的方向上具有前述表現抑制序列與前述互補序列。
前述表現抑制序列與前述互補序列之連結順序未被特別限制，例如，可連結前述表現抑制序列之3’末端與前述互補序列之5’末端，亦可連結前述表現抑制序列之5’末端與前述互補序列之3’末端，較佳係前者。前述單股核酸分子，舉例來說，前述表現抑制序列與前述互補序列可係直接地連結，亦可間接地連結。前述直接的連結，例如，可舉利用磷酸二酯鍵之連結。前述間接的連結，例如，可舉透過連結區域的連結。
前述連結區域，例如，可為由核苷酸殘基所構成，亦可為由非核苷酸殘基所構成，亦可為由前述核苷酸 殘基及非核苷酸殘基所構成。前述核苷酸殘基，例如，可舉核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基。
於以下，作為前述單股核酸分子之具體例，例示藉由分子內黏合而於1處具有迴圈之第1形態，以及於2處具有迴圈之第2形態。本發明並未受限於此。
(2-1)第1形態
作為前述單股核酸分子的第1形態，可舉5’端側區域及3’端側區域相互黏合而形成雙股結構(主幹結構)之分子。此亦可說是shRNA(小髮夾RNA(small hairpin RNA)或是短髮夾型RNA(short hairpin RNA))的形態。shRNA係形成髮夾結構，一般來說，具有一個主幹區域與一個迴圈區域。
本形態之核酸分子，例如，包含區域(X)，連結區域(Lx)及區域(Xc)，可舉在前述區域(X)與前述區域(Xc)之間，係經前述連結區域(Lx)連結之結構。而且，前述區域(Xc)以與前述區域(X)互補為佳，具體來說，以前述區域(X)及前述區域(Xc)中之一者包含前述表現抑制序列而另一者包含前述互補序列為佳。由於述區域(X)與前述區域(Xc)分別具有前述表現抑制序列及前述互補序列之任一者，因此前述核酸分子，例如，可藉由分子內黏合而在前述區域(X)與前述區域(Xc)之間形成主幹結構，而前述連結區域(Lx)則成為迴圈結構。
前述核酸分子，例如，可自5’端側至3’端側，依序具有前述區域(Xc)、前述連結區域(Lx)及前述區域(X)，亦可自3’端側至5’端側，依序具有前述區域(Xc)、前述連結 區域(Lx)及前述區域(X)。前述表現抑制序列，例如，可配置於前述區域(X)與前述區域(Xc)之任一者，而以配置於前述互補序列之上游側，即，配置於較前述互補序列更5’端側為佳。
將本形態核酸分子之一例顯示於圖1的示意圖。圖1(A)係顯示在前述核酸分子中之各區域之順序概要的示意圖，圖1(B)係顯示前述核酸分子在前述分子內形成雙股之狀態的示意圖。如於圖1(B)顯示的，前述核酸分子，在前述區域(Xc)與前述區域(X)之間形成雙股，前述Lx區域則係因應其長度形成迴圈結構。圖1，僅係用於顯示前述區域之連結順序及形成雙股之各區域的位置關係，舉例來說，各區域的長度、前述連結區域(Lx)之形狀等，並未受限於此。
在前述核酸分子中，前述區域(Xc)及前述區域(X)之鹼基數，未被特別限制。於以下例示各區域之長度，但本發明未受限於此。
於前述核酸分子中，前述區域(X)之鹼基數(X)與前述區域(Xc)之鹼基數(Xc)之關係，例如，係滿足下述(3)或(5)的條件，在前者的情況下，具體來說，例如，係滿足下述(11)的條件。
X>Xc...(3)
X-Xc=1~10，較佳係1、2或3，更佳係1或2...(11)
X=Xc...(5)
當前述區域(X)或是前述區域(Xc)包含前述表現 抑制序列的狀況時，前述區域，例如，可為僅由前述表現抑制序列構成之區域，亦可為包含前述表現抑制序列的區域。前述表現抑制序列的鹼基數，例如，係如前述。包含前述表現抑制序列的區域，舉例來說，亦可在前述表現抑制序列之5’端側及/或3’端側進一步具有附加序列。前述附加序列的鹼基數，舉例來說係1~31個鹼基，較佳係1~21個鹼基，更佳係1~11個鹼基。
前述區域(X)的鹼基數未被特別限制。當前述區域(X)包含前述表現抑制序列狀況時，其下限，舉例來說係19個鹼基。其上限，舉例來說係50個鹼基，較佳係30個鹼基，更佳係25個鹼基。前述區域(X)之鹼基數的具體例，舉例來說係19~50個鹼基，較佳係19~30個鹼基，更佳係19~25個鹼基。
前述區域(Xc)之鹼基數未被特別限制。其下限，舉例來說係19個鹼基，較佳係20個鹼基，更佳係21個鹼基。其上限，舉例來說係50個鹼基，較佳係40個鹼基，更佳係30個鹼基。
前述連結區域(Lx)，以於其本身之區域內部不會發生自我黏合之結構為佳。前述連結區域(Lx)，例如，如前所述，可為由前述核苷酸殘基所構成，亦可為由前述非核苷酸殘基所構成，亦可包含前述兩者。
當前述連結區域(Lx)包含前述核苷酸殘基的狀況時，其長度未被特別限制。前述連結區域(Lx)，舉例來說，係以前述區域(X)與前述區域(Xc)能形成雙股之長度為 佳。前述連結區域(Lx)之鹼基數，其下限，舉例來說係1個鹼基，較佳係2個鹼基，更佳係3個鹼基；其上限，舉例來說係100個鹼基，較佳係80個鹼基，更佳係50個鹼基、40個鹼基、30個鹼基、20個鹼基、10個鹼基。
前述核酸分子之全長未被特別限制。在前述核酸分子中，前述鹼基數的合計(全長之鹼基數)，下限，舉例來說係38個鹼基，以42個鹼基為佳，較佳係50個鹼基，更佳係51個鹼基，特佳係52個鹼基；其上限，舉例來說係300個鹼基，以200個鹼基為佳，較佳係150個鹼基，更佳係100個鹼基，特佳係80個鹼基。在前述核酸分子中，除前述連結區域(Lx)之外之鹼基數的合計，下限，舉例來說係38個鹼基，以42個鹼基為佳，較佳係50個鹼基，更佳係51個鹼基，特佳係52個鹼基；上限，舉例來說係300個鹼基，以200個鹼基為佳，較佳係150個鹼基，更佳係100個鹼基，特佳係80個鹼基。
(2-2)第2形態
作為前述單股核酸分子的第2形態，可舉5’端側區域及3’端側區域，分別個別地進行分子內黏合，而形成2個雙股結構(主幹結構)的分子。此，例如，可引用國際公開WO2012/005368號公報及WO2012/017979的揭示。
本形態之核酸分子，例如，可舉從5’端側至3’端側依序包含5’端側區域(Xc)、內部區域(Z)及3’端側區域(Yc)的結構。較佳地係，前述內部區域(Z)由內部5’端側區域(X)及內部3’端側區域(Y)連結所構成，且前述5’端側區域(Xc) 係與前述內部5’端側區域(X)互補，而前述3’端側區域(Yc)係與前述內部3’端側區域(Y)互補。然後，較佳地係前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之至少一者，包含前述表現抑制序列。
在前述核酸分子中，前述5’端側區域(Xc)係與前述內部5’端側區域(X)互補，而前述3’端側區域(Yc)係與前述內部3’端側區域(Y)互補。因此，在5’端側中，前述區域(Xc)係朝向前述區域(X)回折，而前述區域(Xc)與前述區域(X)係藉由自我黏合而可形成雙股；還有，在3’端側中，前述區域(Yc)係朝向前述區域(Y)回折，而前述區域(Yc)與前述區域(Y)係藉由自我黏合而可形成雙股。
前述內部區域(Z)，如前所述，係前述內部5’區域(X)與前述內部3’區域(Y)呈連結。前述區域(X)與前述區域(Y)，舉例來說，係直接地連結而於其間不具有介入序列。前述內部區域(Z)，為了表示前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之序列關係，而表記成「係由前述內部5’端側區域(X)與前述內部3’端側區域(Y)連結所構成的」，且於前述內部區域(Z)中，舉例來說，前述內部5’端側區域(X)與前述內部3’端側區域(Y)，在使用前述核酸分子時，並未限定為個別獨立的區域。即，舉例來說，當前述內部區域(Z)具有前述表現抑制序列時，在前述內部區域(Z)中，前述表現抑制序列亦可跨前述區域(X)與前述區域(Y)作配置。
在前述核酸分子中，舉例來說前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)可直接連結，亦可間接地連 結。在前者的情況下，直接的連結，例如，可舉利用磷酸二酯鍵之連結。在後者的情況下，例如可舉：在前述區域(Xc)與前述區域(X)之間具有連結區域(Lx)，且前述區域(Xc)與前述區域(X)透過前述連結區域(Lx)而連結之形態。
在前述核酸分子中，舉例來說前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)可直接連結，亦可間接地連結。在前者的情況下，直接的連結，例如，可舉利用磷酸二酯鍵之連結。在後者的情況下，例如可舉：在前述區域(Yc)與前述區域(Y)之間具有連結區域(Ly)，且前述區域(Yc)與前述區域(Y)透過前述連結區域(Ly)而連結之形態。
前述核酸分子，例如，可具有前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)兩者，亦可具有任一者。在後者的情況下，例如，可舉在前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間具有前述連結區域(Lx)，且前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間不具有前述連結區域(Ly)，就是說，前述區域(Yc)與前述區域(Y)係直接連結之形態。還有，在後者的情況下，例如，可舉在前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間具有前述連結區域(Ly)，且在前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間不具有前述連結區域(Lx)，就是說，前述區域(Xc)與前述區域(X)係直接連結的形態。
前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)，以分別在本身之區域內部，不發生自我黏合之結構為佳。前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)，舉例來說，如前所述，可 為由前述核苷酸殘基所構成，亦可為由前述非核苷酸殘基所構成，亦可包含前述兩者。
針對本形態之核酸分子，將不具有前述連結區域之一例顯示於圖2的示意圖。圖2(A)係針對前述核酸分子，顯示自5’端側朝3’端側之各區域之順序概要的示意圖；圖2(B)係顯示前述核酸分子在前述分子內形成雙股之狀態的示意圖。如於圖2(B)所示，前述核酸分子，前述5’端側區域(Xc)回折而在前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間形成雙股，前述3’端側區域(Yc)回折而在前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間形成雙股。圖2，僅係用於顯示各區域之連結次序及形成雙股之各區域之位置關係，舉例來說，各區域的長度等並不受此限制。
針對前述核酸分子，將具有前述連結區域之一例顯示於圖3的示意圖。圖3(A)係針對前述核酸分子，顯示自5’端側朝向3’端側之各區域之順序概要的示意圖；圖3(B)係顯示前述核酸分子在前述分子內形成雙股之狀態之示意圖。如於圖3(B)所示，前述核酸分子，在前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間，以及在前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)之間，形成雙股，而前述Lx區域及前述Ly區域成為迴圈結構。圖3僅係用於顯示各區域之連結次序及形成雙股之各區域的位置關係，舉例來說，各區域之長度等並不受此限制。
在前述核酸分子中，前述5’端側區域(Xc)、前述內部5’端側區域(X)、前述內部3’端側區域(Y)及前述3’端側 區域(Yc)之鹼基數未被特別限制。於以下例示各區域的長度，但本發明並未受限於此。
前述5’端側區域(Xc)如前所述，舉例來說，可為與前述內部5’端側區域(X)的全區域互補。當為此狀況時，舉例來說，前述5’端側區域(Xc)較佳係與前述內部5’端側區域(X)為相同鹼基長，且係由與前述內部5’端側區域(X)自5’末端至3’末端之全區域互補的鹼基序列構成。更佳係前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)為相同鹼基長，並且，前述5’端側區域(Xc)之全部的鹼基係與前述內部5’端側區域(X)之全部鹼基互補，就是說，舉例來說，以完全互補為佳。再者，並不受限於此，舉例來說，亦可如前所述，有1或數個鹼基為非互補的。
還有，前述5’端側區域(Xc)，如前所述，例如，可與前述內部5’端側區域(X)之部分區域互補。當為此狀況時，舉例來說，前述5’端側區域(Xc)較佳係與前述內部5’端側區域(X)之部分區域相同鹼基長，即，由較前述內部5’端側區域(X)短1鹼基以上之鹼基長的鹼基序列構成。更佳係前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之前述部分區域相同鹼基長，且，前述5’端側區域(Xc)之全部鹼基係與前述內部5’端側區域(X)之前述部分區域的全部鹼基互補，就是說，例如，以完全互補為佳。舉例來說，前述內部5’端側區域(X)之前述部分區域，較佳係由在前述5’端側區域(X)中自5’末端之鹼基(第1個鹼基)起連續的鹼基序列構成之區域(片段)。
前述3’端側區域(Yc)，如前所述，舉例來說，可係與前述內部3’端側區域(Y)之全區域互補。當為此狀況時，舉例來說，前述3’端側區域(Yc)較佳係與前述內部3’端側區域(Y)為相同鹼基長，且係由與前述區域(Y)自5’末端至3’末端之全區域互補的鹼基序列構成。更佳係前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)為相同鹼基長，並且，前述3’端側區域(Yc)之全部鹼基係與前述內部3’端側區域(Y)之全部鹼基互補，就是說，舉例來說，以完全互補為佳。再者，並不受限於此，舉例來說，亦可如前所述，有1或數個鹼基係非互補的。
還有，前述3’端側區域(Yc)，如前所述，例如，可係與前述內部3’端側區域(Y)之部分區域互補。當為此狀況時，舉例來說，前述3’端側區域(Yc)較佳係與前述內部3’端側區域(Y)之部分區域相同鹼基長，即，由較前述內部3’端側區域(Y)短1鹼基以上之鹼基長的鹼基序列構成。更佳係前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之前述部分區域相同鹼基長，並且，前述3’端側區域(Yc)之全部鹼基係與前述內部3’端側區域(Y)之前述部分區域之全部鹼基互補，就是說，例如，以完全互補為佳。舉例來說，前述內部3’端側區域(Y)之前述部分區域，較佳係由在前述內部3’端側區域(Y)中自3’末端之鹼基(第1個鹼基)起連續的鹼基序列構成之區域(片段)。
在前述核酸分子中，前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)，與前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)以及前述內部 3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)的關係，以及前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)，與前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)以及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的關係，舉例來說係滿足下述式(1)及(2)的條件。
Z=X+Y...(1)
Z≧Xc+Yc...(2)
在前述核酸分子中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)之長度的關係未被特別限制，舉例來說，亦可滿足下述式之任一條件。
X=Y...(19)
X<Y...(20)
X>Y...(21)
在前述核酸分子中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)、前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)以及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的關係，舉例來說係滿足下述(a)~(d)中之任一條件。
(a)滿足下述式(3)及(4)之條件。
X>Xc...(3)
Y=Yc...(4)
(b)滿足下述式(5)及(6)之條件。
X=Xc...(5)
Y>Yc...(6)
(c)滿足下述式(7)及(8)之條件。
X>Xc...(7)
Y>Yc...(8)
(d)滿足下述式(9)及(10)之條件。
X=Xc...(9)
Y=Yc...(10)
在前述(a)~(d)中，前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)的差，以及前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)與前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的差，舉例來說，以滿足下述條件為佳。
(a)滿足下述式(11)及(12)之條件。
X-Xc=1~10，較佳係1、2、3或4，更佳係1、2或3...(11)
Y-Yc=0...(12)
(b)滿足下述式(13)及(14)之條件。
X-Xc=0...(13)
Y-Yc=1~10，較佳係1、2、3或4，更佳係1、2或3...(14)
(c)滿足下述式(15)及(16)之條件。
X-Xc=1~10，較佳係1、2或3，更佳係1或2...(15)
Y-Yc=1~10，較佳係1、2或3，更佳係1或2...(16)
(d)滿足下述式(17)及(18)之條件。
X-Xc=0...(17)
Y-Yc=0...(18)
茲就在前述(a)~(d)之核酸分子，將各自結構之一例顯示於圖4之示意圖。圖4係包含前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之核酸分子，(A)係前述(a)之核酸分子之 例，(B)係前述(b)之核酸分子之例，(C)係前述(c)之核酸分子之例，(D)係前述(d)之核酸分子之例。在圖4中，虛線表示因自我黏合而形成雙股的狀態。圖4之核酸分子，係將前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)以前述式(20)之「X<Y」形式來表示，但並不限於此，如前所述，可為前述式(19)之「X=Y」，亦可為前述式(21)之「X>Y」。還有，圖4僅係用於顯示前述內部5’端側區域(X)與前述5’端側區域(Xc)之關係以及前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)之關係的示意圖，舉例來說，各區域之長度及形狀等則未受限於此，還有，連結區域(Lx)及連結區域(Ly)之有無亦不受限於此。
舉例來說，前述(a)~(c)之核酸分子藉由前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)以及前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)分別形成雙股，而為在前述內部區域(Z)中，前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)均具有無法對準(alignment)之鹼基的結構，亦可稱為具有無法形成雙股之鹼基的結構。在以下將在前述內部區域(Z)中前述無法對準之鹼基(亦稱為不形成雙股之鹼基)稱為「游離鹼基」。在圖4中，將前述游離鹼基的區域以「F」表示。前述區域(F)的鹼基數，未被特別限制。前述區域(F)的鹼基數(F)，例如，當為前述(a)之核酸分子的狀況時，係「X-Xc」之鹼基數；當為前述(b)之核酸分子的狀況時，係「Y-Yc」之鹼基數；當為前述(c)之核酸分子的狀況時，係「X-Xc」之鹼基數與「Y-Yc」之鹼基數的合計數。
另一方面，前述(d)之核酸分子，舉例來說呈現前述內部區域(Z)之全區域與前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)對準之結構，亦可說係前述內部區域(Z)之全區域形成雙股之結構。再者，在前述(d)之核酸分子中，前述5’端側區域(Xc)之5’末端與前述3’端側區域(Yc)之3’末端係未連結。
茲就前述核酸分子，於以下例示各區域之長度，但本發明並未受限於此。
在前述5’端側區域(Xc)、前述3’端側區域(Yc)及前述內部區域(Z)中之前述游離鹼基(F)之鹼基數的合計，例如，會成為前述內部區域(Z)的鹼基數。因此，前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之長度，舉例來說，可因應前述內部區域(Z)之長度、前述游離鹼基之個數(F)及其位置來適宜決定。
前述內部區域(Z)的鹼基數，舉例來說係19個鹼基以上。前述鹼基數的下限，舉例來說係19個鹼基，較佳係20個鹼基，更佳係21個鹼基。前述鹼基數的上限，舉例來說係50個鹼基，較佳係40個鹼基，更佳係30個鹼基。前述內部區域(Z)之鹼基數的具體例，舉例來說係19個鹼基、20個鹼基、21個鹼基、22個鹼基、23個鹼基、24個鹼基、25個鹼基、26個鹼基、27個鹼基、28個鹼基、29個鹼基或是30個鹼基。
當前述內部區域(Z)包含前述表現抑制序列的狀況時，舉例來說，前述內部區域(Z)可為係僅由前述表現抑 制序列所構成之區域，亦可為包含前述表現抑制序列的區域。前述表現抑制序列之鹼基數，舉例來說，係如前述。當前述內部區域(Z)包含前述表現抑制序列的狀況時，於前述表現抑制序列之5’端側及/或3’端側，亦可進一步具有附加序列。前述附加序列之鹼基數，舉例來說係1~31個鹼基，以1~21個鹼基為佳，較佳係1~11個鹼基，更佳係1~7個鹼基。
在前述內部區域(Z)中，前述表現抑制序列的位置未被特別限制，如前所述，可係前述內部5’端側區域(X)，亦可係前述內部3’端側區域(Y)，亦可跨前述內部5’區域(X)與前述內部3’端側區域(Y)作配置。前述核酸分子，舉例來說，當具有前述互補序列的狀況時，其之位置亦未被特別限制，例如，可係對應於前述內部5’端側區域(X)之前述5’端側區域(Xc)，亦係在相對於前述內部3’端側區域(Y)之前述3’端側區域(Yc)。還有，當前述表現抑制序列係跨前述內部5’區域(X)與前述內部3’端側區域(Y)作配置的狀況時，舉例來說，前述互補序列，亦可分斷在前述5’端側區域(Xc)與前述3’端側區域(Yc)。當前述互補序列分斷為2的狀況時，舉例來說，可為相應於前述游離鹼基之處缺失的序列。
前述5’端側區域(Xc)的鹼基數，舉例來說係1~29個鹼基，以1~11個鹼基為佳，較佳係1~7個鹼基，更佳係1~4個鹼基，特佳係1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。當前述內部區域(Z)或是前述3’端側區域(Yc)包含前述表現抑制序列的狀況時，舉例來說以這樣的鹼基數為佳。作為具體例，當前述內部區域(Z)的鹼基數係19~30個鹼基(例如，19個鹼基) 的狀況時，前述5’端側區域(Xc)的鹼基數，舉例來說係1~11個鹼基，以1~9個鹼基、1~7個鹼基為佳，較佳係1~4個鹼基，更佳係1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。
當前述5’端側區域(Xc)包含前述表現抑制序列的狀況時，前述5’端側區域(Xc)，舉例來說可為僅由前述表現抑制序列所構成之區域，亦可為包含前述表現抑制序列之區域。前述表現抑制序列的長度，舉例來說係如前所述。當前述5’端側區域(Xc)包含前述表現抑制序列的狀況時，可在前述表現抑制序列5’端側及/或3’端側進一步具有附加序列。前述附加序列之鹼基數，舉例來說係1~11個鹼基，較佳係1~7個鹼基。
前述3’端側區域(Yc)的鹼基數，舉例來說係1~29個鹼基，以1~11個鹼基為佳，較佳係1~7個鹼基，更佳係1~4個鹼基，特佳係1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。當前述內部區域(Z)或是前述5’端側區域(Xc)包含前述表現抑制序列的狀況時，舉例來說係以這樣的鹼基數為佳。作為具體例，當前述內部區域(Z)的鹼基數係19~30個鹼基(例如，19個鹼基)的狀況時，前述3’端側區域(Yc)的鹼基數，舉例來說係1~11個鹼基，以1~9個鹼基、1~7個鹼基為佳，較佳係1~4個鹼基，更佳係1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基。
當前述3’端側區域(Yc)包含前述表現抑制序列的狀況時，前述3’端側區域(Yc)，舉例來說可為僅由前述表現抑制序列所構成之區域，亦可為包含前述表現抑制序列之區域。前述表現抑制序列之長度，舉例來說係如前述。 當前述3’端側區域(Yc)包含前述表現抑制序列的狀況時，可於前述表現抑制序列之5’端側及/或3’端側進一步具有附加序列。前述附加序列的鹼基數，舉例來說係1~11個鹼基，較佳係1~7個鹼基。
如前所述，前述內部區域(Z)、前述5’端側區域(Xc)及前述3’端側區域(Yc)的鹼基數，例如，可以前述式(2)之「Z≧Xc+Yc」來表示。作為具體例，「Xc+Yc」的鹼基數，例如，與前述內部區域(Z)相同，或是小於前述內部區域(Z)。在後者的情況下，「Z-(Xc+Yc)」，舉例來說係1~10，較佳係1~4，更佳係1、2或3。前述「Z-(Xc+Yc)」，舉例來說係相當於在前述內部區域(Z)中之前述游離鹼基之區域(F)的鹼基數(F)。
在前述單股核酸分子中，前述5’端側區域(Xc)之末端與前述3’端側區域(Yc)之末端，舉例來說，在經分子內黏合之狀態下，相對於前述內部區域(Z)，以位置於5’端側或3’端側為佳。在前者的情況下，前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)與前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)係Xc<Yc之關係。然後，鹼基數(Xc)，舉例來說係1~11個鹼基，以1~9個鹼基為佳，較佳係1~7個鹼基，更佳係1~4個鹼基，特佳係1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基；前述5’端側區域(Xc)與前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)的關係(Xc/Z)，舉例來說係1/50~1/2，較佳係1/40~1/3，更佳係1/30~1/4。在後者的情況下，前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)與前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)係Xc>Yc的關係。然後，鹼基數(Yc)，舉 例來說係1~11個鹼基，以1~9個鹼基為佳，較佳係1~7個鹼基，更佳係1~4個鹼基，特佳係1個鹼基、2個鹼基、3個鹼基；前述3’端側區域(Yc)與前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)之關係(Yc/Z)，舉例來說，例如係1/50~1/2，較佳係1/40~1/3，更佳係1/30~1/4。
前述連結區域(Lx)及(Ly)，以分別在本身之區域內部，不發生自我黏合之結構為佳。前述連結區域(Lx)及(Ly)，例如，如前所述，可為由前述核苷酸殘基所構成，亦可為由前述非核苷酸殘基所構成，亦可包含前述兩者。
當前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)如前述般包含核苷酸殘基的狀況時，其長度未被特別限制。前述連結區域(Lx)，舉例來說係以前述內部5’端側區域(X)與前述5’端側區域(Xc)可形成雙股之長度為佳；前述連結區域(Ly)，舉例來說係以前述內部3’端側區域(Y)與前述3’端側區域(Yc)可形成雙股之長度為佳。前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)之長度，例如，可為相同亦可為不同，還有，其鹼基序列亦可為相同亦可為不同。前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)的鹼基數，其之下限，舉例來說係1個鹼基，較佳係2個鹼基，更佳係3個鹼基；其之上限，舉例來說係100個鹼基，較佳係80個鹼基，更佳係50個鹼基、40個鹼基、30個鹼基、20個鹼基、10個鹼基。前述各連結區域之鹼基數，作為具體例，例如，可例示1~50個鹼基、1~30個鹼基、1~20個鹼基、1~10個鹼基、1~7個鹼基、1~4個鹼基等，但並未受限於此。
前述核酸分子的全長未被特別限制。就前述核酸分子來說，前述鹼基數的合計(全長之鹼基數)下限，舉例來說係38個鹼基，以42個鹼基為佳，較佳係50個鹼基，更佳係51個鹼基，特佳係52個鹼基；其上限，舉例來說係300個鹼基，以200個鹼基為佳，較佳係150個鹼基，更佳係100個鹼基，特佳係80個鹼基。就前述核酸分子來說，除前述連結區域(Lx)及連結區域(Ly)外之鹼基數的合計，下限舉例來說係38個鹼基，以42個鹼基為佳，較佳係50個鹼基，更佳係51個鹼基，特佳係52個鹼基；上限舉例來說係300個鹼基，以200個鹼基為佳，較佳係150個鹼基，更佳係100個鹼基，特佳係80個鹼基。
本形態之核酸分子，例如，5’末端與3’末端可結合亦可未結合。在前者的情況下，本形態之核酸分子係環狀的單股核酸分子。在後者的情況下，本形態的核酸分子，例如，由於可維持兩末端未結合，以5’末端為非磷酸根為佳。
(2-3)第3形態
作為前述單股核酸分子的第3形態，可舉前述連結區域係非核苷酸結構之分子。此係可引用，例如，國際公開WO2012/005368號公報及WO2012/017979之揭示。
本形態的核酸分子，除在前述第1形態及前述第2形態的核酸分子中，前述連結區域(Lx)及/或前述連結區域(Ly)具有非核苷酸結構以外，可引用前述的說明。
前述非核苷酸結構未被特別限制，例如，可舉吡 咯啶骨架、哌啶骨架、聚烯烴二醇等。前述聚烯烴二醇，例如，可舉聚乙二醇。
前述吡咯啶骨架，例如，可為構成吡咯啶之5員環之碳，有1個以上經取代之吡咯啶衍生物之骨架，被取代的狀況時，例如，以C-2碳以外之碳原子為佳。前述碳，例如，可被氮、氧或硫所取代。前述吡咯啶骨架，例如，在吡咯啶之5員環內，舉例來說亦可包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。在前述吡咯啶骨架中，構成吡咯啶之5員環之碳及氮，例如，亦可鍵結氫，亦可鍵結如後述之取代基。舉例來說，前述連結區域(Lx)與前述區域(X)及前述區域(Xc)，以及前述連結區域(Ly)與前述區域(Y)及前述區域(Yc)，可係透過前述吡咯啶骨架之任一基來鍵結，較佳係前述5員環之任1個碳原子與氮，較佳係前述5員環之2位的碳(C-2)與氮。作為前述吡咯啶骨架，例如，可舉脯胺酸骨架、脯胺醇骨架等。前述脯胺酸骨架及脯胺醇骨架等，舉例來說，由於係生體內物質及其還原物，因此在安全性上亦係優異的。
前述哌啶骨架，例如，可為構成哌啶之6員環的碳有1個以上經取代之哌啶衍生物的骨架，當被取代的狀況時，例如，以C-2之碳以外的碳原子為佳。前述碳，舉例來說，亦可被氮、氧或硫所取代。前述哌啶骨架，例如，在哌啶之6員環內，例如，亦可包含碳-碳雙鍵或是碳-氮雙鍵。在前述哌啶骨架中，構成哌啶之6員環之碳及氮，例如，亦可鍵結氫基，亦可鍵結如後述之取代基。舉例來說，前述連結區域(Lx)與前述區域(X)及前述區域(Xc)，以及前述連 結區域(Ly)與前述區域(Y)及前述區域(Yc)，亦可透過前述哌啶骨架之任一基鍵結，較佳係前述6員環之任1個碳原子與氮，更佳係前述6員環之2位的碳(C-2)與氮。
前述連結區域，例如，可為僅包含由前述非核苷酸結構構成之非核苷酸殘基，亦可包含由前述非核苷酸結構構成之非核苷酸殘基與核苷酸殘基。
前述連結區域，舉例來說以下述式(I)所表示。
前述式(I)中，舉例來說，X1及X2各自獨立為H2、O、S或NH；Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O或S；R3係鍵結至環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基，L1係由n個原子構成之伸烷基鏈，於此處，伸烷基碳原子上之氫原子，係可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或是SRa所取代亦可未被取代，或是，L1係前述伸烷基鏈之一個以上的碳原子業以氧原子所取代之聚醚鏈，惟，當Y1係NH、O或S的狀況時，鍵結至Y1之L1的原子 係碳，而鍵結至OR1之L1的原子係碳，且氧原子彼此不鄰接；L2係由m個原子構成之伸烷基鏈，於此處，伸烷基碳原子上之氫原子，可被OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc所取代亦可未被取代，或者是，L2係前述伸烷基鏈之一個以上的碳原子業以氧原子所取代之聚醚鏈，惟當Y2係NH、O或S的狀況時，鍵結至Y2之L2之原子係碳，而鍵結至OR2之L2的原子係碳，且氧原子彼此不鄰接；Ra、Rb、Rc及Rd，各自獨立為取代基或是保護基；l係1或2；m係範圍在0~30之整數；n係範圍在0~30之整數；就環A來說，前述環A上之C-2以外的1個碳原子，亦可被氮、氧、硫所取代，在前述環A內，亦可包含碳-碳雙鍵或是碳-氮雙鍵，前述區域(Xc)及前述區域(X)，各自係透過-OR1-或-OR2-來鍵結至前述連結區域(Lx)，前述區域(Yc)及前述區域(Y)，各自係透過-OR1-或-OR2-來鍵結至前述連結區域(Ly)，於此處，R1及R2可存在亦可不存在，當存在時，R1及R2各自獨立為核苷酸殘基或前述結構(I)。
前述式(I)中，X1及X2，例如，各自獨立為H2、O、S或NH。在前述式(I)中，X1為H2則係意指X1與和X1鍵結合之碳原子一起形成CH2(亞甲基)。就X2來說亦相同。
前述式(I)中，Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O或S。
前述式(I)中，在環A中，l係1或2。當為l=1的狀況時，環A係5員環，舉例來說為前述吡咯啶骨架。前述吡咯啶骨架，例如，可舉脯胺酸骨架、脯胺醇骨架等，可例示此等的二價結構。當l=2的狀況時，環A為6員環，舉例來說係前述哌啶骨架。就環A來說，環A上之C-2以外的1個碳原子亦可被氮、氧或硫所取代。還有，就環A來說，在環A內亦可包含碳-碳雙鍵或碳-氮雙鍵。環A，舉例來說可為L型及D型之任一種。
前述式(I)中，R3係鍵結至環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基。當R3為前述取代基的狀況時，取代基R3可為1個亦可為複數，可存在亦可不存在，當為複數的狀況時，可為相同亦可為不同。
取代基R3，舉例來說係鹵素、OH、OR4、NH2、NHR4、NR4R5、SH、SR4或側氧基(=O)等。
R4及R5，舉來說如，各自獨立為取代基或保護基，且可為相同亦可為不同。前述取代基，例如，可舉鹵素、烷基、烯基、炔基、鹵烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、環烷基、環烯基、環烷基烷基、環基烷基(cyclylalkyl)、羥烷基、烷氧基烷基、胺烷基、雜環基烯基、雜環基烷基、雜芳基烷基、矽基、矽氧基烷基等。以下係相同。取代基R3亦可為此等列舉的取代基。
前述保護基，舉例來說係將反應性高的官能基更 換為惰性的官能基，可舉已知的保護基等。前述保護基，例如，可引用文獻(J.F.W.McOmie,「Protecting Groups in Organic Chemistry」Prenum Press,London and New York,1973)的記載。前述保護基未被特別限制，例如可舉：三級丁基二甲基矽基(TBDMS)、雙(2-乙醯氧基乙基氧基)甲基(bis(2-acetoxyethyloxy)methyl)(ACE)、三異丙基矽基氧基甲基(triisopropylsilyloxymethyl group)(TOM)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(1-(2-cyanoethoxy)ethyl)(CEE)、2-氰基乙氧基甲基(CEM)以及甲苯基磺醯基乙氧基甲基(TEM)、二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)(DMTr)等。當R3為OR4的狀況時，前述保護基未被特別限制，例如，可舉TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基及TEM基等。其他亦可舉，含矽基之基。以下相同。
前述式(I)中，L1係由n個原子構成之伸烷基鏈。前述伸烷基碳原子上之氫原子，例如，可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa所取代，亦可未被取代。或者是，L1亦可係前述伸烷基鏈之1個以上的碳原子業以氧原子所取代之聚醚鏈。前述聚醚鏈，舉例來說可為聚乙二醇。再者，當Y1係NH、O或S的狀況時，鍵結至Y1之L1的原子係碳，而鍵結至OR1之L1的原子係碳，且氧原子彼此不鄰接。就是說，例如，當Y1為O的狀況時，其之氧原子不與L1之氧原子鄰接，且OR1之氧原子不與L1之氧原子鄰接。
前述式(I)中，L2係由m個原子構成之伸烷基鏈。前述伸烷基碳原子上之氫原子，例如，可被OH、ORc、NH2、 NHRc、NRcRd、SH或是SRc所取代，亦可未被取代。或者是，L2亦可係前述伸烷基鏈之1個以上的碳原子業以氧原子所取代之聚醚鏈。再者，當Y2為NH、O或S的狀況時，鍵結至Y2之L2的原子係碳，鍵結至OR2之L2的原子係碳，且氧原子彼此不鄰接。就是說，例如，當Y2為O的狀況時，其之氧原子不與L2之氧原子鄰接，且OR2之氧原子不與L2之氧原子鄰接。
L1之n及L2之m，未被特別限制，下限分別，舉例來說係0，上限亦未被特別限制。n及m，例如，可因應前述連結區域(Lx)或(Ly)之所期望之長度來適宜設定。n及m，例如，從製造成本及產率等之點來看，分別以0~30為佳，較佳係0~20，更佳係0~15。n與m可為相同(n=m)亦可不同。n+m，舉例來說係0~30，較佳係0~20，更佳係0~15。
Ra、Rb、Rc及Rd，舉例來說各自獨立為取代基或保護基。前述取代基及前述保護基，舉例來說係與前述相同。
在前述式(I)中，氫原子，舉例來說，各自獨立且可被取代為Cl、Br、F及I等鹵素。
舉例來說，分別地，前述區域(Xc)及前述區域(X)係透過-OR1-或-OR2-鍵結至前述連結區域(Lx)，而前述區域(Yc)及前述區域(Y)係透過-OR1-或-OR2-鍵結至前述連結區域(Ly)。於此處，R1及R2可存在亦可不存在。當R1及R2存在時，R1及R2各自獨立為核苷酸殘基或前述式(I)之結構。當R1及/或R2為前述核苷酸殘基的狀況時，前述連結區域(Lx) 及前述連結區域(Ly)，舉例來說係由除核苷酸殘基R1及/或R2外之前述式(I)之結構構成之前述非核苷酸殘基，與前述核苷酸殘基所形成。當R1及/或R2為前述式(I)之結構的狀況時，舉例來說前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)，係經連結2個以上由前述式(I)之結構構成之前述非核苷酸殘基所得之結構。前述式(I)之結構，例如，亦可包含1個、2個、3個或4個。如此，當包含複數前述結構的狀況時，前述(I)之結構，例如，可係直接連結，亦可透過前述核苷酸殘基來結合。另一方面，當不存在R1及R2的狀況時，舉例來說前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)，係僅由前述式(I)之結構構成之前述非核苷酸殘基所形成。
前述區域(Xc)及前述區域(X)，以及前述區域(Yc)及前述區域(Y)，以及前述-OR1-及-OR2-之結合的組合，未被特別限制，例如，可舉以下任一條件。
條件(1)
前述區域(Xc)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合，前述區域(X)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合，且前述區域(Yc)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合，前述區域(Y)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合。
條件(2)
前述區域(Xc)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合，前述區域(X)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合，且前述區域(Yc)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合，前述區域(Y)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合。
條件(3)
前述區域(Xc)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合，前述區域(X)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合，且前述區域(Yc)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合，前述區域(Y)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合。
條件(4)
前述區域(Xc)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合，前述區域(X)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合，且前述區域(Yc)係透過-OR2-與前述式(I)之結構結合，前述區域(Y)係透過-OR1-與前述式(I)之結構結合。
前述式(I)之結構，例如，可例示下述式(I-1)~式(I-9)，在下述式來說，n及m係與前述式(I)相同。在下述式中，q係0~10的整數。
在前述式(I-1)~(I-9)中，n、m及q未被特別限制，如前所述。作為具體例，可舉在前述式(I-1)中，n=8；在前述(I-2)中，n=3；在前述式(I-3)中，n=4或8；在前述(I-4)中，n=7或8；在前述式(I-5)中，n=3且m=4；在前述(I-6)中，n=8且m=4；在前述式(I-7)中，n=8且m=4；在前述(I-8)中，n=5且m=4；在前述式(I-9)中，q=1且m=4。將前述式(I-4)之一例(n=8)顯示於下述式(I-4a)，而將前述式(I-8)之一例(n=5，m=4)顯示於下述式(I-8a)。
[化3]
在前述核酸分子中，前述連結以外之區域的構成單位，分別以前述核苷酸殘基為佳。前述各區域，舉例來說係以下述(1)~(3)之殘基所構成。
(1)非修飾核苷酸殘基；(2)修飾核苷酸殘基；(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基。
在前述核酸分子中，前述連結區域的構成單位未被特別限制，例如，可舉前述核苷酸殘基及前述非核苷酸殘基。前述連結區域，例如，可為僅由前述核苷酸殘基所構成，亦可僅由前述非核苷酸殘基所構成，亦可由前述核苷酸殘基與前述非核苷酸殘基所構成。前述連結區域，例如，可以下述(1)~(7)之殘基所構成。
(1)非修飾核苷酸殘基；(2)修飾核苷酸殘基；(3)非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基；(4)非核苷酸殘基； (5)非核苷酸殘基及非修飾核苷酸殘基；(6)非核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基；(7)非核苷酸殘基、非修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基。
當前述核酸分子具有前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)兩者的狀況時，例如，兩者之構成單位可相同亦可不同。作為具體例，例如，可舉兩者之連結區域的構成單位係前述核苷酸殘基之形態、兩者之連結區域的構成單位係前述非核苷酸殘基之形態，以及其中一區域之構成單位係前述核苷酸殘基，而另一者之連結區域的構成單位係非核苷酸殘基之形態等。
作為前述單股核酸分子之具體例，於以下顯示前述第2形態之核酸分子(以下亦稱為NK)及前述第3形態之核酸分子(以下亦稱為PK)。
將前述NK之具體例顯示於以下。各NK係以5’末端往3’末端方向的序列來顯示，5’端側之以四角形所包圍之區域係前述連接子(Lx)，3’端側之以四角形所包圍之區域係前述連接子(Lx)，而劃底線部分為前述as核苷酸。在核序列中，前述連接子(Lx)及前述連接子(Ly)之序列未被特別限制，以在各區域內不發生黏合之序列，就是說會形成迴圈之序列為佳。就各NK來說，例示將前述連接子(Lx)及前述連接子(Ly)以任意的n表示之序列，以及以具體之鹼基表示的序列。n，舉例來說係a、c、g或u(以下相同)。再者，此等係例示，而非限定本發明者。
將前述PK之具體例顯示於以下。各PK係以5’末端往3’末端方向的序列來顯示，5’端側之以四角形所包圍之區域係前述連接子(Lx)，3’端側之以四角形所包圍之區域係前述連接子(Lx)，而劃底線部分係前述as核苷酸。在核序列中，前述連接子(Lx)及前述連接子(Ly)之結構未被特別限制，可舉如前所述之吡咯啶骨架、哌啶骨架之結構。再者，此等係例示，而非限定本發明者。
針對NK-0144(序列編號84)、NK-0145(序列編號86)、NK-0146(序列編號88)、NK-0147(序列編號90)及NK-0148(序列編號92)，還有PK-0076(序列編號93)、PK-0077(序列編號94)、PK-0078(序列編號95)、PK-0079(序列編號96)、PK-0080(序列編號97)，將形成主幹與形成迴圈之狀態顯示於以下。在下述序列中，箭頭係表示5’末端與3’末端並未結合，5’係表示5’末端。還有，在下述序列中，劃底線部分係前述as核苷酸。
於以下顯示在前述NK及PK中之前述as核苷酸的種類。
本發明之核酸分子，例如，可舉僅由前述核苷酸殘基所構成之分子，以及在前述核苷酸殘基之外包含前述非核苷酸殘基之分子等。在本發明之核酸分子中，前述核苷酸殘基，如前所述，例如，可僅為前述非修飾核苷酸殘基，亦可僅為前述修飾核苷酸殘基，亦可為前述非修飾核苷酸殘基及前述修飾核苷酸殘基兩者。當前述核酸分子包含前述非修飾核苷酸殘基與前述修飾核苷酸殘基的狀況時，前述修飾核苷酸殘基之個數未被特別限制，舉例來說係「1或數個」，具體來說，舉例來說係1~5個，以1~4個為佳，較佳係1~3個，最佳係1或2個。當本發明之核酸分子包含前述非核苷酸殘基的狀況時，前述非核苷酸殘基之個數未被特別限制，舉例來說係「1或數個」，具體來說，舉例來說係1~8個、1~6個、1~4個、1、2或3個。
當前述核酸分子，例如，在前述非修飾核糖核苷酸殘基之外包含前述修飾核糖核苷酸殘基的狀況時，前述 修飾核糖核苷酸殘基之個數未被特別限制，舉例來說係「1或數個」，具體來說，舉例來說係1~5個，以1~4個為佳，較佳係1~3個，最佳係1或2個。相對於前述非修飾核糖核苷酸殘基之前述修飾核糖核苷酸殘基，例如，可為核糖殘基經取代為去氧核糖殘基之前述去氧核糖核苷酸殘基。當前述核酸分子，例如，在前述非修飾核糖核苷酸殘基之外包含前述去氧核糖核苷酸殘基的狀況時，前述去氧核糖核苷酸殘基的個數未被特別限制，舉例來說係「1或數個」，具體來說，舉例來說係1~5個，以1~4個為佳，較佳係1~3個，最佳係1或2個。
前述核苷酸殘基，例如，包含糖、鹼基及磷酸作為構成要素。前述核苷酸殘基，如前所述，例如，可舉核糖核苷酸殘基及去氧核糖核苷酸殘基。前述核糖核苷酸殘基，例如，具有核糖殘基作為糖，具有腺嘌呤(A)、鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)作為鹼基，而前述去氧核糖殘基，例如，具有去氧核糖殘基作為糖，具有腺嘌呤(A)、鳥糞嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)作為鹼基。
前述核苷酸殘基，可舉未修飾核苷酸殘基及修飾核苷酸殘基。就前述未修飾核苷酸殘基來說，前述各構成要素，例如，係與天然存在者相同或實質上相同，較佳係與在人體中天然存在者相同或實質上相同。
前述修飾核苷酸殘基，舉例來說係將前述未修飾核苷酸殘基予以修飾後之核苷酸殘基。前述修飾核苷酸殘基，例如，亦可係前述未修飾核苷酸殘基之構成要素之任 一者被修飾。在本發明中，「修飾」，舉例來說係前述構成要素的取代、附加及/或缺失，係在前述構成要素中之原子及/或官能基的取代、附加及/或缺失，而能「改變」。前述修飾核苷酸殘基，例如，可舉天然存在的核苷酸殘基、經人工修飾之核苷酸殘基等。前述源自天然的修飾核苷酸殘基，例如，可參照林巴赫等人(Limbach et al.，1994，Summary：the modified nucleosides of RNA，Nucleic Acids Res.22：2183~2196)。還有，前述修飾核苷酸殘基，例如，亦可係前述核苷酸之代替物的殘基。
前述核苷酸殘基之修飾，例如，可舉核糖-磷酸骨架(以下稱為核糖磷酸(ribophosphate)骨架)的修飾。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，可修飾核糖殘基。前述核糖殘基，例如，可修飾2’位碳，具體來說，例如，可將鍵結至2’位碳之羥基取代為氫或氟等鹵素。藉由將前述2’位碳之羥基取代為氫，而可將核糖殘基取代為去氧核糖。前述核糖殘基，例如，可取代為立體異構物，例如，亦可取代為阿拉伯糖殘基。
前述核糖磷酸骨架，例如，亦可取代為具有非核糖殘基及/或非磷酸之非核糖磷酸骨架。前述非核糖磷酸骨架，例如，可舉前述核糖磷酸骨架的非荷電體。經取代為前述非核糖磷酸骨架之前述核苷酸的代替物，例如，可舉啉基、環丁基、吡咯啶等。前述代替物，其他例如，可舉人工核酸單體殘基。作為具體例，例如，可舉PNA(肽核酸)、LNA(鎖核酸(Locked Nucleic Acid))、ENA(2’-O,4’-C- 乙烯橋接核酸(2’-O,4’-C-Ethylenebridged Nucleic Acid))等，較佳係PNA。
在前述核糖磷酸骨架中，例如，可將磷酸根予以修飾。在前述核糖磷酸骨架中，最與糖殘基鄰接之磷酸根稱為α磷酸根。前述α磷酸根，帶負電，其電荷係跨非鍵結至糖殘基的2個氧原子而均勻分布。在前述α磷酸根中之4個氧原子之中，就核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵來說，非與糖殘基鍵結之2個氧原子，以下亦稱為「非鍵結(non-linking)氧」。另一方面，在前述核苷酸殘基間之磷酸二酯鍵來說，與糖殘基鍵結的2個氧原子，以下稱為「鍵結(linking)氧」。前述α磷酸根，例如，較佳係進行呈非帶電之修飾，或者是進行使前述非鍵結氧中電荷分布呈非對稱型的修飾。
前述磷酸根，例如，亦可將前述非鍵結氧作取代。前述氧，例如，可以S(硫)、Se(硒)、B(硼)、C(碳)、H(氫)、N(氮)及OR(R係烷基或芳基)之任一原子來取代，較佳係以S所取代。前述非鍵結氧，例如，以兩者皆被取代為佳，較佳係兩者均被S所取代。前述修飾磷酸根，例如，可舉硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenate)、硼烷磷酸鹽(Boranophosphate)、硼烷磷酸酯(Boranophosphate ester)、氫膦酸酯、磷醯胺酸酯(phosphoroamidate)、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯等，其中以前述2個非鍵結氧兩者皆被S所取代之二硫代磷酸酯為佳。
前述磷酸根，例如，亦可將前述鍵結氧作取代。 前述氧，例如，可以S(硫)、C(碳)及N(氮)中之任一原子來取代，前述修飾磷酸根，例如，可舉業以N取代之交聯磷醯胺酸酯，業以S取代之交聯硫代磷酸酯，以及業以C取代之交聯亞甲基膦酸酯(bridged methylene phosphonate)等。前述鍵結氧的取代，例如，較佳係於本發明核酸分子之5’末端核苷酸殘基及3’末端核苷酸殘基之至少一者中進行，且在5’端側時，以C作取代為佳，在3’端側時，則以N作取代為佳。
前述磷酸根，例如，亦可取代為前述未含磷之連接子(linker)。前述連接子，舉例來說係包含矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺甲酸酯(carbamate)、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛(thioformacetal)、甲縮醛(formacetal)、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基(methylene methylimino)、亞甲基亞肼基(methylene hydrazo)、亞甲基二甲基亞肼基(methylene dimethyl hydrazo)，及亞甲基氧基甲基亞胺基(methylene oxymethyl imino)等，以包含亞甲基羰基胺基(methylenecarbonyl amino)及亞甲基甲基亞胺基為佳。
本發明之核酸分子，例如，亦可3’末端及5’末端之至少一者之核苷酸殘基被修飾。前述修飾，例如，可為3’末端及5’末端之任一者，亦可為兩者。前述修飾，例如，如前所述，較佳係對末端的磷酸根進行為佳。前述磷酸根，例如，可係將全體作修飾，亦可將前述磷酸根中之1個以上的原子作修飾。在前者的情況下，例如，可為磷酸根全體的取代，亦可為缺失。
前述末端之核苷酸殘基的修飾，例如，可舉附加其他分子。前述其他分子，例如，可舉後述的標識物質、保護基等機能性分子。前述保護基，例如，可舉含S(硫)、Si(矽)、B(硼)、酯之基等。前述標識物質等機能性分子，例如，可利用於本發明之核酸分子的檢測等。
前述其他分子，例如，可附加至前述核苷酸殘基的磷酸根，亦可透過間隔子(spacer)而附加至前述磷酸根或前述糖殘基。前述間隔子之末端原子，例如，可對前述磷酸根的前述鍵結氧，或是糖殘基之O、N、S或是C作附加或取代。前述糖殘基之鍵結部位，例如，以3’位的C或是5’位的C或是鍵結至該等的原子為佳。前述間隔子舉例來說亦可對前述PNA等核苷酸代替物的末端原子作附加或取代。
前述間隔子未被特別限制，例如，可包含-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無鹼基糖、醯胺、羧基、胺、氧基胺、氧基亞胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺醯胺，及啉基等，還有生物素試劑及螢光素試劑等。在前述式中，n係正整數，以n=3或6為佳。
附加至前述末端之分子，於此等之外，例如，可舉色素、插入劑(例如，吖啶)、交聯劑(例如，補骨脂內酯(Psoralen)、絲裂霉素C)、紫質(TPPC4、泰克薩菲瑞(Texaphyrin)、薩菲林(Sapphyrin))、多環芳香烴(例如，啡、二氫啡)、人工內核酸酶(例如，EDTA)、親油性載體(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固 酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或啡)及肽複合物(例如，黑腹果蠅觸足肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷基化劑、磷酸、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代烷基、放射線標識標記、酵素、半抗原(例如，生物素)、輸送/吸收促進劑(例如，阿司匹靈、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇(imidazole cluster)、吖啶-咪唑複合物，及四氮雜大環(tetraaza macrocycle)之Eu3+複合物)等。
本發明之核酸分子，例如，前述5’末端亦可以磷酸根或磷酸根類似物作修飾。前述磷酸根，例如，可舉5’單磷酸((HO)2(O)P-O-5’)、5’二磷酸((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’三磷酸((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-鳥苷帽(7-甲基化或非甲基化，7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’-腺苷帽(Appp)、任意之修飾或非修飾核苷酸帽結構(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)、5’一硫代磷酸(硫代磷酸酯：(HO)2(S)P-O-5’)、5’一二硫代磷酸(二硫代磷酸酯：(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-磷硫醇酸(phosphorothiol)((HO)2(O)P-S-5’)、經硫取代之單磷酸、二磷酸及三磷酸(例如，5’-α-硫代三磷酸、5’-γ-硫代三磷酸等)、5’-氮代磷酸酯(phosphoramidate)((HO)2(O)P-NH-5’、 (HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、R係烷基(例如，甲基、乙基、異丙基、丙基等))、5’-烷基醚膦酸(例如，RP(OH)(O)-O-5’、R係烷基醚(例如，甲氧基甲基、乙氧基甲基等))等。
在前述核苷酸殘基中，前述鹼基未被特別限制。前述鹼基，例如，可為天然鹼基亦可為非天然鹼基。前述鹼基，例如，可源自天然亦可為合成品。前述鹼基，例如，可使用一般的鹼基及其修飾類似物等。
前述鹼基，例如，可舉腺嘌呤及鳥糞嘌呤等嘌呤鹼基，胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶等嘧啶鹼基。前述鹼基，於此之外，可舉肌苷、胸腺嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、nubularine、isoguanisine、殺結核菌素(tubercidine)等。前述鹼基，例如，可舉2-胺基腺嘌呤、6-甲基化嘌呤等烷基衍生物；2-丙基化嘌呤等烷基衍生物；5-鹵代尿嘧啶及5-鹵代胞嘧啶(halocytosine)；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶(azouracil)、6-偶氮胞嘧啶(azocytosine)及6-偶氮胸腺嘧啶(azothymine)；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、5-(2-胺基丙基)尿嘧啶、5-胺基烯丙基尿嘧啶；8-鹵化、胺化、硫醇化、硫烷基化(thioalkylated)、羥化及其他的8-取代嘌呤；5-三氟甲基化及其他之5-取代嘧啶；7-甲基鳥糞嘌呤；5-取代嘧啶；6-氮雜嘧啶(azapyrimidine)；N-2、N-6及O-6取代嘌呤(包含2-胺基丙基腺嘌呤)；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；二氫尿嘧啶； 3-去氮-5-氮雜胞嘧啶(3-deaza-5-azacytosine)；2-胺基嘌呤；5-烷基尿嘧啶；7-烷基鳥嘌呤；5-烷基胞嘧啶；7-脫氮腺嘌呤；N6,N6-二甲基腺嘌呤；2,6-二胺基嘌呤；5-胺基-烯丙基-尿嘧啶；N3-甲基尿嘧啶；取代1,2,4-三唑；2-吡啶酮；5-硝基吲哚；3-硝基吡咯；5-甲氧基尿嘧啶；尿嘧啶-5-氧乙酸；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶；5-甲胺基甲基-2-硫尿嘧啶；3-(3-胺基-3-羧丙基)尿嘧啶；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N4-乙醯胞嘧啶；2-硫胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；N6-異戊基腺嘌呤；2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤；N-甲基鳥糞嘌呤；O-烷基化鹼基等。還有，嘌呤及嘧啶包含：例如，美國專利第3,687,808號「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」，第858~859頁，克羅修比茲J.I.氏(Kroschwitz J.I.)編，John Wiley & Sons，1990，及英格利修氏等人(Englisch等人)，Angewandte Chemie，International Edition，1991，第30卷，p.613所揭示之物。
前述修飾核苷酸殘基，除此等之外，例如，亦可含缺失鹼基之殘基，即，無鹼基的核糖磷酸骨架。還有，前述修飾核苷酸殘基，例如，可使用美國臨時申請案第60/465,665號(提申日：2003年4月25日)及國際出願第PCT/US04/07070號(提申日：2004年3月8日)所記載的殘基，本發明可引用此等文獻。
本發明之核酸分子，例如，包含標識物質，亦可藉由前述標識物質而受到標識化。前述標識物質，未被特 別限制，例如，可舉螢光物質、色素、同位素等。前述標識物質，例如可舉：芘、TAMRA、螢光素、Cy3色素、Cy5色素等螢光團，前述色素例如可舉：，Alexa488等Alexa色素等。前述同位素，例如，可舉穩定同位素及放射性同位素，較佳係穩定同位素。前述穩定同位素，例如，暴露於輻射的危險性少，亦無需專門設備而具優異的處理性，再者，亦可降低成本。還有，例如，經前述穩定同位素標識之化合物的物性無變化，而作為示蹤劑的性質亦優異。前述穩定同位素，未被特別限制，例如，可舉2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S及36S。
本發明之核酸分子，如前所述，可抑制成骨細胞特異因子基因的表現。因此，本發明之核酸分子，例如，可使用作為成骨細胞特異因子基因之表現為成因之眼部疾病的治療劑。在本發明中，「治療」，舉例來說包含前述眼部疾病之予防、前述眼部疾病之改善、前述眼部疾病預後之改善的意思，可為其中任一者。
前述眼部疾病，未被特別限制，可舉視網膜病變、黃斑部病變、翼狀翳肉、結膜炎、眼內血管新生、眼睛手術後之纖維瘢痕等；前述視網膜病變，例如，可舉增生性糖尿病視網膜病變、增殖型玻璃體視網膜病變等增生性視網膜病變等。
本發明之核酸分子的使用方法，未被特別限制，例如，對前述投藥對象投藥前述核酸分子即可。
前述投藥對象，例如，可舉細胞、組織或器官。 前述投藥對象，例如可舉人、除人外之非人動物。前述非人動物，例如可舉小鼠、大鼠、兔、羊、牛、馬、狗等非人哺乳類動物等。前述投藥，例如，可為活體內(in vivo)亦可為活體外(in vitro)。
前述細胞未被特別限制，例如，可舉人及小鼠等之ARPE-19等視網膜色素上皮細胞及NIH3T3等纖維母細胞等各種培養細胞、ES細胞、造血幹細胞等幹細胞、初代培養細胞等自活體分離出的細胞等。前述細胞，舉例來說，人類受精卵，以及人類胚胎及人類個體內的細胞除外。
關於本發明之核酸分子，可參照後述之本發明組成物、眼部疾病用醫藥、成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法及眼部疾病之治療方法等的記載。
本發明之核酸分子，如前所述，因為可抑制成骨細胞特異因子基因之表現，因此，舉例來說作為眼部疾病用醫藥係有用的。
<表現載體>
本發明之表現載體之特徴在於包含編碼有本發明之核酸分子之DNA。本發明之表現載體特徴係包含前述DNA，其他的構成則未受任何限制。本發明之表現載體，舉例來說，在載體中以可表現之方式插入有前述DNA。插入前述DNA之載體，未被特別限制，例如，可使用一般的載體，可舉病毒載體及非病毒載體等。前述非病毒載體，例如，可舉質體載體。
依據本發明之載體，例如，藉由在活體內(in vivo) 或活體外(in vitro)之投藥而可在經投藥之對象內表現本發明之表現抑制核酸分子。
<組成物>
本發明的組成物特徵在於包含本發明之表現抑制核酸分子。本發明之組成物特徵係包含前述本發明之表現抑制核酸分子，其他的構成則未受任何限制。
依據本發明之組成物，由於可抑制成骨細胞特異因子基因之表現，本發明之組成物，舉例來說亦可稱為抑制用試劑。依據本發明，舉例來說，透過對存在成骨細胞特異因子基因之對象，特別係成骨細胞特異因子基因之表現相對地高的對象，以及被預測成骨細胞特異因子基因之表現會相對地高的對象進行投藥，而可抑制成骨細胞特異因子基因之表現。投藥對象，舉例來說係如前述。
還有，本發明之表現抑制核酸分子，如前所述，由於可使用於治療眼部疾病，因此本發明之組成物亦可稱為眼部疾病用的藥學組成物、眼部疾病的治療藥、眼部疾病用醫藥。
依據本發明，例如，藉由對眼部疾病的患者投藥，來抑制成骨細胞特異因子基因之表現而可治療前述眼部疾病。前述眼部疾病，例如，如前所述，可舉增生型糖尿病視網膜病變、老年性黃斑部病變等黃斑部病變等。在本發明中，「治療」如前所述，包含例如，前述眼部疾病之予防、前述眼部疾病之改善、前述眼部疾病預後之改善的意思，亦可為任一者。
前述投藥方法，未被特別限制，例如，可因應投藥對象適宜決定。前述投藥對象，當為自活體分離之細胞等的狀況時，例如，可舉使用轉染試劑之方法、電穿孔法、奈米氣泡法等。當前述投藥對象為活體的狀況時，例如，可舉非經口投藥、口服投藥等。非經口投藥，例如，可舉局部投藥、靜脈注射等。對前述眼部疾病之投藥部位，例如，可舉眼、血管等。當直接對眼投藥的狀況時，其投藥方法未被特別限制，例如，可舉：點眼、點入、玻璃體內注射、結膜下注射、眼球筋膜下注射(sub-Tenon's capsule injection)、眼前房投藥等。本發明之組成物的投藥條件，舉例來說，投藥次數、投藥量等未被特別限制。
本發明組成物之形態，未被特別限制，舉例來說係注射液、靜脈滴注液、點眼液、眼軟膏等。
在本發明之組成物中，前述表現抑制核酸分子之摻合量未被特別限制。前述表現抑制核酸分子之投藥條件未被特別限制。當為玻璃體注射的狀況時，例如，對人類成人男子之眼球1個每1次的投藥量(合計)，舉例來說係0.01~10mg，較佳係0.1~1mg；投藥次數，舉例來說係2週~8週1次。在本發明之組成物中，前述核酸分子之摻合量，較佳係含有可實現例示之投藥條件的濃度。
本發明之組成物，舉例來說可僅包含本發明之表現抑制核酸分子，亦可進一步包含其他的添加物。前述添加物的摻合量，只要不妨礙前述表現抑制核酸分子之機能者則未被特別限制。前述添加物未被特別限制，舉例來說， 以藥學上可容許之添加物為佳。前述添加物的種類未被特別限制，例如，可因應投藥對象的種類來適宜選擇。
在本發明的組成物中，前述添加物，舉例來說，以與前述表現抑制核酸分子形成錯合物為佳。此狀況時，前述添加物，例如，亦可稱為錯化劑。在本發明的組成物中，藉由將前述表現抑制核酸分子作成錯合物，例如，可效率佳地傳送前述表現抑制核酸分子。前述表現抑制核酸分子與前述錯化劑之結合未被特別限制，例如，可舉非共價鍵結。前述錯合物，例如，可舉內包錯合物(inclusion complex)。
前述錯化劑，未被特別限制，可舉聚合物、環糊精、金剛烷胺等。前述環糊精，例如，可舉線性環糊精共聚物、線性氧化環糊精共聚物等。
前述添加劑，其他還可舉，例如，載體、往目標細胞之結合物質、縮合劑、融合劑、賦形劑、基劑、穩定劑、防腐劑等。
<成骨細胞特異因子基因之表現抑制方法>
本發明之抑制方法，如前所述，係抑制成骨細胞特異因子基因之表現的方法，該抑制方法特徵係在於使用前述本發明之表現抑制核酸分子、前述本發明之組成物或前述眼部疾病用醫藥。本發明的抑制方法，特徵係使用本發明之表現抑制核酸分子，其他的步驟及條件則未受任何限制。
本發明之抑制方法，例如，包含對存在成骨細胞特異因子基因之對象，特別係成骨細胞特異因子基因之表 現相對地高之對象或是成骨細胞特異因子基因之表現被預測會相對地高之對象，投藥前述表現抑制核酸分子之步驟。藉由前述投藥步驟，例如，使前述表現抑制核酸分子接觸於前述投藥對象。前述投藥對象，例如，可舉如前所述之細胞、組織或器官。前述投藥對象，例如，與前述相同地可舉：人、前述非人動物。前述投藥，例如，可為活體內(in vivo)亦可為活體外(in vitro)。
本發明之抑制方法，例如，可單獨投藥前述表現抑制核酸分子，亦可投藥包含前述表現抑制核酸分子之前述本發明的組成物。前述投藥方法，未被特別限制，例如，可因應投藥對象的種類來適宜選擇，可引用前述之記載。
<治療方法>
本發明之眼部疾病的治療方法，如前所述，特徵係在於包含對患者投藥本發明之表現抑制核酸分子之步驟。本發明之治療方法特徴係將本發明之表現抑制核酸分子使用於眼部疾病之治療，其他之步驟及條件則未受任何限制。本發明作為對象之眼部疾病，舉例來說係如前所述，可舉增生型糖尿病視網膜病變等視網膜病變、老年性黃斑部病變等黃斑部病變等。
本發明之治療方法，例如，可引用前述本發明之抑制方法等。前述投藥方法未被特別限制，例如，如前所述，可為非經口投藥及口服投藥之任一者。
<表現抑制核酸分子的使用>
本發明之表現抑制核酸分子，係用以抑制成骨細胞特 異因子基因之表現或成骨細胞特異因子蛋白質之機能的核酸分子，或者係用以治療眼部疾病的核酸分子。還有，本發明之表現抑制核酸分子，係用以製造成骨細胞特異因子基因之表現抑制劑或眼部疾病用醫藥的核酸分子。
以下，藉由實施例等詳細說明本發明，但本發明並非受限於此等者。
[實施例]
(實施例1)
合成siRNA，確認到在活體外(in vitro)之人類成骨細胞特異因子基因的表現抑制。
(1)siRNA
合成下述序列之雙股RNA作為實施例的siRNA。在各雙股RNA中，令上方的序列為正意股，下方之序列為反意股。正意股之3’末端的突出及反意股之3’末端的突出兩者皆n=2且令為TT。
還有，作為陰性控制組，使用將反意股之鹼基序列予以拌碼(scramble)之下述雙股RNA。
[表8]NI-0000(序列編號77)5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUU-3’(序列編號78)3’-UUAUGAUAAGCUGUGCGCUUC-5’
(2)成骨細胞特異因子基因之表現量的測定細胞係使用人類視網膜色素上皮細胞株ARPE-19(American Type Culture Collection：ATCC)。令培養條件為37℃且於5%CO2下。培養基係使用包含10%FBS之DMEM(Invitrogen)。
首先，在前述培養基中培養細胞，將其之培養液以400μL分別注入24孔盤而成為5×104細胞/孔，進一步將前述孔中的細胞培養24小時後，使用轉染試劑RNAiMAX(Invitrogen)，依照所附規程來轉染前述雙股RNA。具體來說，前述每孔添加前述雙股RNA與前述轉染試劑之錯合物100μl、前述細胞的懸浮液400μl(5×104細胞)，令全量為500μl且前述雙股RNA的最終濃度為10nmol/L。
轉染後將前述孔中的細胞培養24小時。然後，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)並依照所附的規程來回收RNA。其次，使用逆轉錄酶(商品名SuperScript III，Invitrogen)依照所附的規程，自前述RNA合成cDNA。然後，以所獲得之cDNA作為模板進行PCR，測定成骨細胞特異因子基因之表現量以及為內部基準之β-肌動蛋白基因之表現量。前述 成骨細胞特異因子基因之表現量已藉由前述β-肌動蛋白基因之表現量來修正。在前述PCR中，成骨細胞特異因子基因及β-肌動蛋白的擴增分別係使用以下的引子組。表現量，將無添加雙股RNA之非添加細胞群令為1來進行相對地比較。
成骨細胞特異因子基因擴增用引子組
5’-TGCCCAGCAGTTTTGCCCAT-3’(序列編號79)
5’-CGTTGCTCTCCAAACCTCTA-3’(序列編號80)
β-肌動蛋白基因擴增用引子組
5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’(序列編號81)
5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’(序列編號82)
再者，對無添加前述雙股RNA及前述轉染試劑之細胞，亦測定基因表現量(-)作為控制組1。還有，在轉染中，對令前述雙股RNA為未添加且而僅添加有前述轉染試劑之細胞，亦測定基因表現量(mock)作為控制組2。
(3)結果
將此等之結果顯示於圖5。圖5係顯示成骨細胞特異因子基因表現量之相對值的圖，縱軸係相對基因表現量。如於圖5顯示般，由於前述實施例之雙股RNA顯示低於控制組(-及mock)及陰性控制組之值的緣故，任一狀況皆可確認到具有表現抑制活性。其中，NI-0079、NI-0082、NI-0083、NI-0084、NI-0085係顯示極強的表現抑制活性。
(實施例2)
使用脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization：CNV)的模式小鼠，確認到藉由本發明之核酸分子，新生血管及纖維性增殖組織的形成受到抑制。
(1)核酸分子
使用前述實施例1之NI-0079作為實施例之siRNA。還有，使用以下所示之NK-0144及PK-0076作為實施例之單股核酸分子。在NK-0144及PK-0076中，以劃底線來表示與前述siRNA之反意股相同之序列編號1的as1核苷酸。
在前述PK-0076中，連接子(Lx)與連接子(Ly)之結構係令為顯示於前述(I-8a)之下述結構。
陰性控制組係使用與前述實施例1相同之NI-0000。
(2)模式小鼠之製作
以體積比9：1來混合克太拉(Ketalar)(登錄商標)注射液(50mg/mL)與Celactal(登錄商標)2%注射液，將此混合液以未添加鈣及鎂之PBS(-)來稀釋5倍。將所獲得之麻醉用稀釋溶液以170μL/隻之條件透過注射器來注射至小鼠(C57BL/6JJcl，雄，6-8週齡，日本CLEA)的腹腔而進行全身麻醉。對前述小鼠，點眼1滴每瞳令(Mydrin)(登錄商標)P並散瞳，接著，點眼1滴隱形眼鏡用之為角膜安裝助劑之scopisol眼用液。然後，對麻醉下之小鼠的眼睛以下述條件照射雷射。
機器
ZEISS 30 SL-M
設定
power：100mW
spot size：75μm
duration：0.1sec，4shots/眼
(3)核酸分子的投藥
對業經照射雷射之日及照射第7日的小鼠，點眼1滴每瞳令(登錄商標)P並散瞳，接著以與前述相同的條件將前述麻醉用稀釋溶液注射至前述小鼠來全身麻醉。然後，將調製為0.1nmol/μL之前述核酸分子注入至前述小鼠之玻璃體內成為0.1nmol/eye。前述注入係使用附33G針之漢密爾頓氏 注射器(□701)，一邊以手術用顯微鏡來觀察眼球內。然後，對前述小鼠點眼1滴抗菌點眼藥可樂必妥點眼液(Cravit Ophthalmic Solution)(商品名)0.5%。
(4)藥效評價
將經投藥前述核酸分子之前述小鼠於遮光條件下，飼養指定期間(21日間)之後藉由過麻醉來使之安樂死。自前述小鼠摘除眼球，以4%PFA(多聚甲醛)進行1小時固定處理。自經固定之眼球採取脈絡膜並浸漬於前述PBS(-)。然後，對前述脈絡膜按照常法進行Flat Mount免疫染色來染色異凝集素B4及膠原蛋白I型。使用螢光顯微鏡，進行藉由異凝集素B4之染色所致之新生血管的形成確認及藉由膠原蛋白I型之染色所致之纖維性增殖組織的形成確認，再使用共聚焦雷射掃描顯微鏡，自立體構築圖像將新生血管及纖維性增殖組織的體積予以定量化。在定量化來說，使用NIS-Elemen作為定量化軟體。
將此等之結果顯示於圖6。在圖6中，(A)係顯示纖維性增殖組織之體積的圖，(B)係顯示新生血管之體積的圖，縱軸分別表示體積(μm3)。
如於圖6所示，與NI-0000之控制組相比較，實施例之NI-0079、NK-0144及PK-0076任一者纖維性增殖組織體積及新生血管體積均減少，在實施例之中，NK-0144係較佳，而PK-0076顯示更佳之結果。由此等之結果來看，了解到藉由實施例之核酸分子，可抑制纖維性增殖組織及新生血管的增加。
(實施例3)
合成siRNA，確認到在活體外(in vitro)中之人類成骨細胞特異因子基因之表現抑制。
合成下述序列之雙股RNA作為實施例之siRNA。在各雙股RNA中，令上方之序列為正意股，下方之序列為反意股。正意股之3’末端的突出及反意股之3’末端的突出任一者皆係令n=2。然後，除使用此等siRNA以外與前述實施例1相同地進行並測定相對基因表現量。
將此等之結果顯示於圖7。圖7係顯示成骨細胞特異因子基因表現量之相對值的圖，縱軸係相對基因表現量。如圖7所顯示般，由於前述實施例之雙股RNA顯示較控制組(-及mock)及陰性控制組來得低之值的緣故，任一者皆可確認到具有表現抑制活性。
(實施例4)
合成單股核酸分子，確認到在活體外(in vitro)之人類成骨細胞特異因子基因的表現抑制。
合成出下述序列之單股RNA(NK及PK)作為實施例之單股核酸分子。在下述序列中，劃底線表示前述as1核苷酸。還有，在為單股RNA之各PK之中，連接子(Lx)及連接子(Ly)之結構，分別係令為前述實施例1記載之前述(I-8a)之結構。然後，除使用此等單股核酸分子以外，係與前述實施例1相同地進行並測定相對基因表現量。
將此等之結果顯示於圖8及9。圖8係顯示在經使用單股RNA(NK)之狀況下成骨細胞特異因子基因表現量之相對值的圖；圖9係顯示在經使用單股RNA(PK)之狀況下成骨細胞特異因子基因表現量之相對值的圖；在兩圖中，縱軸係相對基因表現量。如於圖8及圖9所示般，由於前述實施例之單股RNA任一者均顯示較控制組(-及mock)及陰性控制組來得低之值的緣故，而任一者皆可確認到具有表現抑制活性。
(實施例5)
合成siRNA，確認到在活體外(in vitro)中之小鼠成骨細胞特異因子基因的表現抑制。
使用NI-0079~NI-0088及NI-0094~NI-0099作為實施例的siRNA。然後，除使用小鼠纖維母細胞株NIH3T3作為細胞，使成為4×104細胞/孔來使用於培養之外，與前述實施例1相同地進行，測定相對基因表現量。
將此等之結果顯示於圖10。圖10係顯示成骨細胞特異因子基因表現量之相對值的圖，縱軸係相對基因表現量。如於圖10所示般，由於前述實施例之siRNA任一者均顯示較控制組(-及mock)及陰性控制組來得低之值的緣故，任一者皆確認到具有表現抑制活性。
以上，參照實施形態說明本發明，但本發明並未被限定於上述實施形態。本發明的構成及詳細內容在本發明之範疇內可進行熟習此藝者能夠理解之種種變更。
此申請案係主張基於2012年3月29日提申之日本申請特願2012-78114之優先權，將其之揭示全部納入於此。
產業上之可利用性
依據本發明之核酸分子，可抑制成骨細胞特異因子基因之表現或是抑制成骨細胞特異因子蛋白質的機能。因此，本發明對於成骨細胞特異因子基因的表現或成骨細胞特異因子蛋白質為成因之眼部疾病，具體來說，例如，增生型糖尿病視網膜病變及老年性黃斑部病變等黃斑部病變的治療係有效的。
<110> 國立大學法人九州大學 AQUA療法股份有限公司
<120> 成骨細胞特異因子(PERIOSTIN)基因之表現抑制核酸分子、成骨細胞特異因子 基因之表現抑制方法及其用途
<130> TF13008TW
<150> JP 2012-078114
<151> 2012-03-29
<160> 97
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
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Claims (34)

  1. 一種成骨細胞特異因子(Periostin)基因之表現抑制核酸分子，其特徵在於包含下述(as1)、(as2)或(as3)核苷酸作為成骨細胞特異因子基因之表現抑制序列：(as1)由序列編號1~19之任一鹼基序列構成之核苷酸；(as2)由前述(as1)之鹼基序列中有1或數個鹼基缺失、取代及/或附加之鹼基序列所構成，且具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能的核苷酸；(as3)由與前述(as1)之鹼基序列具有90%以上相同性的鹼基序列所構成，且具有成骨細胞特異因子基因之表現抑制機能的核苷酸。
  2. 如申請專利範圍第1項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制核酸分子係單股核酸分子，且自5’端側至3’端側依序包含5’端側區域(Xc)、內部區域(Z)及3’端側區域(Yc)；前述內部區域(Z)係由內部5’端側區域(X)及內部3’端側區域(Y)連結而構成者；前述5’端側區域(Xc)係與前述內部5’端側區域(X)互補；前述3’端側區域(Yc)係與前述內部3’端側區域(Y)互補；並且，前述內部區域(Z)包含前述表現抑制序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之表現抑制核酸分子，其在前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)之間具有連結區域(Lx)，且前述5’端側區域(Xc)與前述內部5’端側區域(X)係透過前述連結區域(Lx)連結；並且，在前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)之間具有連結區域(Ly)，且前述3’端側區域(Yc)與前述內部3’端側區域(Y)係透過前述連結區域(Ly)連結。
  4. 如申請專利範圍第3項之表現抑制核酸分子，其中前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)係由核苷酸殘基所構成。
  5. 如申請專利範圍第3或4項之表現抑制核酸分子，其中前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)係由非核苷酸殘基所構成。
  6. 如申請專利範圍第5項之表現抑制核酸分子，其中前述非核苷酸殘基包含吡咯啶骨架及哌啶骨架中之至少一者。
  7. 如申請專利範圍第5或6項之表現抑制核酸分子，其中前述連結區域(Lx)及前述連結區域(Ly)係以下述式(I)表示： 前述式中，X1及X2各自獨立為H2、O、S或NH；Y1及Y2各自獨立為單鍵、CH2、NH、O或S；R3係鍵結至環A上之C-3、C-4、C-5或C-6之氫原子或取代基；L1係由n個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原子上之氫原子可經OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或是SRa取代亦可不經取代，或者L1係前述伸烷基鏈之1個以上的碳原子業經氧原子取代之聚醚鏈；惟，當Y1為NH、O或S時，鍵結至Y1之L1的原子為碳，鍵結至OR1之L1的原子為碳，且氧原子彼此不鄰接；L2係由m個原子構成之伸烷基鏈，於此，伸烷基碳原子上之氫原子可經OH、ORc、NH2、NHRc、NRcRd、SH或SRc取代亦可未經取代，或者L2係前述伸烷基鏈之1個以上的碳原子經氧原子取代之聚醚鏈；惟，當Y2為NH、O或S時，鍵結至Y2之L2的原子為碳，鍵結至OR2之L2的原子為碳，且氧原子彼此不鄰接；Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立為取代基或保護基；l為1或2；m係範圍在0~30的整數；n係範圍在0~30的整數；於環A中，前述環A上之C-2以外的1個碳原子可經氮、氧或硫取代，前述環A內亦可包含碳-碳雙鍵或是碳-氮雙鍵；前述區域(Xc)及前述區域(X)分別透過-OR1-或 -OR2-而鍵結至前述連結區域(Lx)；於此，R1及R2可存在亦可不存在，且存在時R1及R2各自獨立為核苷酸殘基或前述結構(I)。
  8. 如申請專利範圍第2至7項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述內部區域(Z)之鹼基數(Z)、前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)、前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)、前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)及前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)係滿足下述式(1)及(2)之條件：Z=X+Y...(1) Z≧Xc+Yc...(2)。
  9. 如申請專利範圍第8項之表現抑制核酸分子，其中前述內部5’端側區域(X)之鹼基數(X)與前述5’端側區域(Xc)之鹼基數(Xc)之差，以及前述內部3’端側區域(Y)之鹼基數(Y)與前述3’端側區域(Yc)之鹼基數(Yc)的差滿足下述條件：(a)滿足下述式(11)及(12)之條件：X-Xc=1、2或3...(11) Y-Yc=0...(12)(b)滿足下述式(13)及(14)之條件：X-Xc=0...(13) Y-Yc=1、2或3...(14)(c)滿足下述式(15)及(16)之條件：X-Xc=1、2或3...(15) Y-Yc=1、2或3...(16) (d)滿足下述式(17)及(18)之條件：X-Xc=0...(17) Y-Yc=0...(18)。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制序列的長度係18~32個鹼基長。
  11. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制核酸分子之序列係選自於由序列編號83~97所構成群組中之至少1個鹼基序列。
  12. 如申請專利範圍第1項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制序列進一步具有突出序列，且前述突出序列係附加於前述核苷酸之3’末端。
  13. 如申請專利範圍第1或12項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制序列係一核苷酸，該核苷酸包含前述(as1)核苷酸，且由序列編號20~38中之任一鹼基序列(n為正整數)所構成。
  14. 如申請專利範圍第1、12及13項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制序列之長度係18~32個鹼基長。
  15. 如申請專利範圍第1及12至14項中任一項之表現抑制核酸分子，其進一步具有會與前述表現抑制序列黏合(annealing)之互補序列，且前述互補序列包含與前述表現抑制序列中之前述(as1)、(as2)或(as3)之核苷酸互補的核苷酸。
  16. 如申請專利範圍第15項之表現抑制核酸分子，其中前述 互補序列中之前述核苷酸係下述(s1)(s2)或(s3)之核苷酸：(s1)由與前述(as1)之鹼基序列互補之鹼基序列所構成的核苷酸；(s2)由與前述(as2)之鹼基序列互補之鹼基序列所構成的核苷酸；(s3)由與前述(as3)之鹼基序列互補之鹼基序列所構成的核苷酸。
  17. 如申請專利範圍第16項之表現抑制核酸分子，其中前述(s1)之核苷酸係由序列編號39~57中之任一鹼基序列所構成之核苷酸。
  18. 如申請專利範圍第15至17項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述互補序列進一步具有突出序列，且前述突出序列係附加於前述核苷酸的5’末端。
  19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述互補序列係一核苷酸，該核苷酸包含前述(s1)核苷酸，且由序列編號58~76中之任一鹼基序列(n係正整數)所構成。
  20. 如申請專利範圍第12至19項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述突出序列係1~3個鹼基長。
  21. 如申請專利範圍第12至20項中任一項之表現抑制核酸分子，其中前述表現抑制核酸分子係由2個單股所構成的雙股核酸分子，且其反意股具有前述表現抑制序列，其正意股則具有前述互補序列。
  22. 一種組成物，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1至21項中任一項之表現抑制核酸分子。
  23. 一種眼部疾病用醫藥品，其特徵在於：包含如申請專利範圍第1至21項中任一項之表現抑制核酸分子。
  24. 如申請專利範圍第23項之眼部疾病用醫藥品，其中前述眼部疾病係選自於由視網膜病變、黃斑部病變、翼狀翳肉、結膜炎、眼內血管新生及眼部纖維瘢痕所構成群組中之至少1種疾病。
  25. 如申請專利範圍第24項之眼部疾病用醫藥品，其中前述視網膜病變係增生型糖尿病視網膜病變或增殖性玻璃體視網膜病變。
  26. 一種抑制成骨細胞特異因子基因之表現的方法，其特徵在於：使用如申請專利範圍第1至21項中任一項之表現抑制核酸分子。
  27. 如申請專利範圍第26項之抑制方法，其包含：將前述表現抑制核酸分子投予細胞、組織或器官之步驟。
  28. 如申請專利範圍第26或27項之抑制方法，其係在活體內(in vivo)或活體外(in vitro)投予前述表現抑制核酸分子。
  29. 一種眼部疾病之治療方法，其特徵在於包含：將如申請專利範圍第1至21項中任一項之表現抑制核酸分子投予患者之步驟。
  30. 如申請專利範圍第29項之治療方法，其中前述眼部疾病係選自於由視網膜病變、黃斑部病變、翼狀翳肉、結膜 炎、眼內血管新生及眼部纖維瘢痕所構成群組中之至少1種疾病。
  31. 如申請專利範圍第30項之治療方法，其中前述視網膜病變係增生型糖尿病視網膜病變或增殖性玻璃體視網膜病變。
  32. 如申請專利範圍第1至21項中任一項之表現抑制核酸分子，其係供用於眼部疾病之治療者。
  33. 如申請專利範圍第32項之表現抑制核酸分子，其中前述眼部疾病係選自於由視網膜病變、黃斑部病變、翼狀翳肉、結膜炎、眼內血管新生及眼部纖維瘢痕所構成群組中之至少1種疾病。
  34. 如申請專利範圍第33項之表現抑制核酸分子，其中前述視網膜病變係增生型糖尿病視網膜病變或增殖性玻璃體視網膜病變。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3047852A1 (en) * 2013-09-27 2016-07-27 Aqua Therapeutics Co., Ltd. Drug for disease caused by expression of periostin except eye disease, and use thereof
WO2017026496A1 (ja) * 2015-08-10 2017-02-16 株式会社アクアセラピューティクス ペリオスチン遺伝子の発現抑制核酸分子、ペリオスチン遺伝子の発現抑制方法、およびその用途
WO2018030451A1 (ja) * 2016-08-09 2018-02-15 学校法人大阪医科薬科大学 癒着治療薬、癒着の治療方法、術後癒着マーカー、および術後癒着の罹患の可能性を試験する方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
PT2284266E (pt) * 2002-11-14 2013-12-17 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc Siarn contra tp53
US20070179100A1 (en) * 2003-04-09 2007-08-02 Muthiah Manoharan Protected monomers
JPWO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2008-06-19 株式会社アルファジェン Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
CN101450216B (zh) * 2008-11-28 2012-03-14 北京大学第三医院 一种用于抑制过度增生性瘢痕成纤维细胞增殖的药物
US20100291188A1 (en) * 2008-12-04 2010-11-18 Musc Foundation For Research Development Periostin Inhibitory Compositions for Myocardial Regeneration, Methods of Delivery, and Methods of Using Same
CN101773671A (zh) * 2010-03-04 2010-07-14 北京大学第三医院 Periostin基因的shRNA在制备抑制肿瘤的药物中的应用
JP5555940B2 (ja) 2010-04-14 2014-07-23 国立大学法人佐賀大学 増殖糖尿病網膜症の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法
US8785121B2 (en) * 2010-07-08 2014-07-22 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule for controlling gene expression
ES2670017T3 (es) 2010-07-08 2018-05-29 Bonac Corporation Molécula de ácido nucleico de cadena simple para el control de la expresión de genes
US8691782B2 (en) * 2010-08-03 2014-04-08 Bonac Corporation Single-stranded nucleic acid molecule having nitrogen-containing alicyclic skeleton
CN103052711B (zh) * 2010-08-03 2016-08-03 株式会社博纳克 具有含氮脂环式骨架的单链核酸分子
JP2012035720A (ja) 2010-08-06 2012-02-23 Etsuji Sato 曲がり外板の受けピン

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