CN101773671A - Periostin基因的shRNA在制备抑制肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Periostin基因的shRNA在制备抑制肿瘤的药物中的应用。该应用为shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauucacguugcuc。本发明将shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒用于肿瘤抑制，取得了非常显著的效果，是通过用shRNA抑制细胞内periostin基因和蛋白的表达实现的，进而证明抑制periostin基因和蛋白的表达可以显著的抑制肿瘤。本发明为治疗和/或预防肿瘤找到了一条新途径，在肿瘤治疗预防领域将有广阔的应用前景。

Description

Periostin基因的shRNA在制备抑制肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及Periostin基因的shRNA在制备抑制肿瘤的药物中的应用。

背景技术

肿瘤是一类常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一。在我国，随着人口老龄化，肿瘤发病率和死亡率都呈增长趋势。近年来细胞外基质蛋白periostin备受关注，多项研究表明其与肿瘤发生存在密切关系。

迄今为止，已发现periostin在众多组织的生理和病理状态下均表达，包括骨，皮肤，牙周膜韧带，损伤肌肉，损伤血管，梗塞心肌，卵巢上皮细胞癌，结直肠癌，以及重构肺血管。此外，在发生纤维化时亦表达增加如支气管哮喘上皮下的纤维化和骨髓纤维化。Periostin的广泛分布说明其作用并不仅局限于促进成骨。随着periostin基因敲除鼠模型的建立，periostin在发育、创伤愈合和疾病发展中的作用开始显现。

骨肉瘤是10-20岁青少年中最常见的病死率及致残率极高的原发性恶性骨肿瘤，进展迅速，早期即出现转移。近年来，新辅助化疗术后辅助化疗联合手术、放疗的应用使近80％患者能保留病肢，骨肉瘤患者的预后有了很大改善。但是，患者的长期生存率不能有效地提高，有半数以上的患者死于骨肉瘤的转移和复发。因此，近些年有许多学者着重研究骨肉瘤的分子发病学，为观察骨肉瘤预后和转移寻找新的指标，也为寻找骨肉瘤新的治疗方法提供理论基础。

尽管在骨肉瘤等恶性肿瘤分子发病学研究方面已取得了很多进展，但这些基因和因子在骨肉瘤等发病及预后中的具体作用还不十分明确；依然需要研究肿瘤相关基因和因子的作用机理，寻找新的肿瘤标志物作为临床预测骨肉瘤等肿瘤患者预后的指标；尝试通过对肿瘤相关基因表达进行选择性地阻断或扩增以抑制骨肉瘤等恶性肿瘤细胞的生长粘附转移能力、促进其凋亡、逆转其耐药。生物调节、免疫、基因治疗等与传统方法结合应用将为骨肉瘤等恶性肿瘤的治疗提供新的希望。

发明内容

本发明的一个目的是提供shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒的新用途。

shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用属于本发明的保护范围；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。

shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞迁移的产品中的应用属于本发明的保护范围；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。

shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的产品中的应用属于本发明的保护范围；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。

shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备促进肿瘤细胞凋亡的产品中的应用属于本发明的保护范围；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。

shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用属于本发明的保护范围；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。

shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备敲减periostin基因表达进行该基因功能实验的试剂中的应用属于本发明的保护范围；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacgugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc。

上述任一所述应用中，所述shRNA的环的序列具体可为ucucuugaa。

上述任一所述应用中，所述shRNA编码基因的核苷酸序列依次为编码所述茎I的DNA序列、编码所述环的DNA序列和编码所述茎II的DNA序列；编码所述茎I的DNA序列为ttcaacattca cgttgctc，编码所述茎II的DNA序列为gagcaacgt gaatgttgaa，编码所述环的DNA序列为ttcaagaga。

氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用、氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备抑制肿瘤细胞迁移的产品中的应用、氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备抑制肿瘤细胞侵袭的产品中的应用或氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备促进肿瘤细胞凋亡的产品中的应用。氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因即为periostin基因。

上述任一所述应用中，所述肿瘤为骨肿瘤，优选为骨肉瘤。所述骨肉瘤细胞具体可为骨肉瘤U-2OS细胞。

本发明将表达shRNA的重组载体转入肿瘤细胞中，同时以PBS组和转入空载体组作对照，进行细胞增殖检测、细胞迁移和侵袭能力检测、细胞凋亡检测，结果表明：

在细胞增殖实验中，转染120h后，转染shRNA组细胞的吸光度值为0.132±0.014，PBS组细胞的吸光度值为0.490±0.051，shRNA对骨肉瘤细胞的增殖抑制率为71.5％；

在细胞迁移实验中，Transwell小室的迁移实验结果可见，经转染抑制质粒48h后结晶紫染色，U2OS细胞的穿膜数明显少于对照组，用10％冰醋酸溶解后测OD值。NC组、PBS组、pGCsi-PN组OD值分别为0.740±0.169、0.776±0.148、0.436±0.051，pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝17.79，P＜0.01)，迁移抑制率为43％，表明periostin基因的表达下调使细胞的迁移能力受到抑制。

在细胞侵袭实验中，Transwell小室的侵袭实验结果可见，经转染抑制质粒48h后结晶紫染色，U2OS细胞的穿膜数明显少于对照组，用10％冰醋酸溶解后测OD值。NC组、PBS组、pGCsi-PN组OD值分别为0.263±0.028、0.282±0.029、0.074±0.015，pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝197.08，P＜0.01)，侵袭抑制率为74％，表明periostin基因的表达下调使细胞的侵袭迁移能力受到抑制。

在细胞周期检测实验中，转染后U2OS细胞的细胞周期变化结果：转染96小时后，FCM检测各组细胞的周期变化情况，NC组、PBS组、pGCsi-PN组细胞DNA合成期(S期)所占的比例分别为32.203±2.138、31.764±1.468、25.488±1.174；pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝47.02，P＜0.001)，S期细胞减少21％。NC组、PBS组、pGCsi-PN组细胞G0-G1期所占的比例分别为58.876±2.718、57.037±3.556、66.189±4.859(F＝14.50，P＜0.001)。处于DNA合成期的细胞比例减少，即要分裂增殖的细胞比例减少，表明U2OS细胞的增殖受到抑制。

在细胞凋亡情况检测中，转染后U2OS细胞的凋亡变化：转染48小时后，FCM检测各组细胞的凋亡变化情况，pGCsi-PN组、NC组、PBS组早期凋亡细胞所占比例分别为10.402±4.316，2.011±1.022，2.728±0.855；pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝28.69，P＜0.001)，早期凋亡率增加417％。pGCsi-PN组、NC组、PBS组晚期凋亡和坏死细胞所占比例分别为3.690±0.664，1.021±0.554，0.791±0.519；pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝68.86，P＜0.001)，晚期凋亡和坏死细胞比例增加262％。表明，质粒pGCsi-PN促进了U2OS细胞的凋亡。

同时实验还证明，转染shRNA组细胞中periostin的mRNA及蛋白表达量显著降低。

综合以上实验证明，本发明将shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒用于肿瘤抑制，取得了非常显著的效果，是通过用shRNA抑制细胞内periostin基因和蛋白的表达实现的，进而证明抑制periostin基因和蛋白的表达可以显著的抑制肿瘤。本发明为治疗和/或预防肿瘤找到了一条新途径，在肿瘤治疗预防领域将有广阔的应用前景。

附图说明

图1为双链oligo DNA电泳图。

图2为shRNA载体PCR鉴定结果图。

图3为转染24h后显微镜下观察U2OS绿色荧光蛋白表达×200.

图4为转染后U2OS细胞periostin表达的RT-PCR结果.

图5为转染后U2OS细胞periostin蛋白表达的Western blot结果图。

图6为转染后U2OS细胞的增殖曲线。

图7为Transwell迁移实验结晶紫染色示穿膜U2OS细胞×100。

图8为Transwell侵袭实验结晶紫染色示穿膜U2OS细胞×100。

图9为转染后U2OS细胞FCM检测细胞周期变化情况。

图10为转染后U2OS细胞FCM检测细胞凋亡情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中用到的试剂等来源如下：

胎牛血清(FBS)	HyClone，美国
		DMEM(高糖型培养基)	GIBCO-BRL公司，美国
Opti-MEM培养基	GIBCO-BRL公司，美国
		NaHCO3	北京北化精细化学品有限责任公司
青霉素-链霉素	华北制药厂，中国
		MTT	Sigma，美国
DMSO(细胞冻存用)	Sigma，美国
		Trizol RNA提取试剂盒	Invitrogen，美国
RT-PCR试剂盒	Invitrogen，美国
		焦炭酸二乙酯(DEPC)	Sigma，美国；
胰蛋白酶	GIBICO，美国
		琼脂糖	Biowest，西班牙
溴化乙锭	Sigma，美国
		溴酚蓝	Genview，美国
二甲苯青FF	Sigma，美国
		Tris碱	罗氏公司，美国
EDTA.Na.2H2O	Genview，美国
		引物合成	上海生物工程技术有限公司，中国
periostin多克隆抗体(目录号ab14041)	Abcam，英国

胎牛血清(FBS)	HyClone，美国
		100bp marker I	北京普博欣生物技术有限公司，中国
HEPES	DNN公司
		甘氨酸	BBI，加拿大
periostin过表达质粒	本实验室构建
		Lipofectamine LTX and PLUS(目录号15338-100)	Invitrogen，美国
Annexin V-FITC凋亡试剂盒	Keygen，中国南京
		细胞周期检测试剂盒	Keygen，中国南京
pGCsi载体	上海吉凯基因公司，中国
		BamHI、HindIII限制性内切酶酶	New England Biolabs公司
大肠杆菌感受态细胞DH5a	Promega，美国
		质粒抽提试剂盒	Promega，美国
结合缓冲液(Binding buffer)	上海麦莎生物科技有限公司，中国
		Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit	eBioscience，美国
LI-COR IRDye 800CW抗体(羊抗兔二抗)	LI-COR，美国
		蛋白定量试剂盒(BCA法)	普利莱公司，北京

1.胎牛血清(FBS)：用前置56℃灭活30min。

2.不完全DMEM培养基，按照如下方法配制：DMEM 13.4g(DMEM本身含HEPES2.38g、L-G 0.2g、丙酮酸钠0.33g)，加NaHCO₃ 3.7g，加纯水至1000ml，搅拌2～6h，用1mol/l的HCl或NaOH调节PH值为7.0左右，滤过除菌(Ф0.22μm)，分装后-20℃保存，备用。

DMEM购自GIBCO公司(USA)，产品目录号为12100-038，批号为720593。L-G为L-glutamine，即左旋谷酰胺。

3.双抗液(青霉素-链霉素)：超净台内，青霉素80万U加入4ml高温灭菌水；链霉素100万U加入5ml高温灭菌水后取出4ml；混合二者为8ml，过滤，分装入1ml的EP管中，-20℃保存、备用。

4.完全DMEM培养基：900ml不完全DMEM培养基+100ml胎牛血清+青霉素和链霉素(终浓度均为100u/ml)。

5.细胞培养用0.01M PBS(PH7.0-7.2)：磷酸二氢钠(2H₂O)0.2g，氯化钠8.5g，磷酸氢二钠(12H₂O)3.12g，加纯水至1000ml。

6.MTT工作液：MTT(sigma)250mg，纯水50ml，充分搅拌，使其溶解；过滤分装，-20℃保存，备用。

7.DEPC水：DEPC 1ml，双蒸水1000ml，室温过夜，15磅高压15min。

8.1.0％琼脂糖胶制备：琼脂糖0.30g，0.5×TAE(用5×TAE稀释30.0ml，EB(10ug/ul)3ul。

9.LB培养液1000ml：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加适量去离子水溶解，1M NaOH调pH值至7.0，去离子水定容至1000ml。

10、1L无青链霉素含10％FBS培养基组成：900ml不完全DMEM培养基+100ml胎牛血清。

11.0.1％FBS培养基组成：499.5ml不完全DMEM培养基+0.5ml胎牛血清。

12、10％FBS培养基组成：900ml不完全DMEM培养基+10ml胎牛血清。

实施例1、人骨肉瘤细胞的抑制

实验分三组：实验组(转染shRNA质粒组，记作pGCsi-PN组)，阴性对照组(转染空载体组，记作NC组)和空白对照组(用PBS缓冲液代替等量的质粒，记作PBS组)，每组细胞每次实验设3个重复，实验重复3次。

一、骨肉瘤细胞系U2OS的培养

人骨肉瘤细胞U-2OS(U2OS)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCHu 88。

将细胞接种于含10％胎牛血清的完全DMEM培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。每日用显微镜观察细胞生长情况，每2-3d换液一次，当细胞生长至70-80％时，以0.25％胰蛋白酶溶液消化，1∶3传代。

二、重组细胞的构建

(一)pGCsi-PN质粒的构建

shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacgugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauuc acguugcuc；所述shRNA的环的序列为ucucuugaa。

(1)构建双链DNA oligo片段

人工合成DNA oligo片段的一条链的序列为GATCCCgaGAGCAACGTGAATGTTGAATTCAAGAGA TTCAACATTCACGTTGCTCtc TTTTTGGAT；另一条链的序列为AGCTATCCAAAAAgaGAGCAACGTGAATGTTGAA TCTCTTGAA TTCAACATTCACGTTGCTCtc GG(其中编码shRNA的茎I的序列为ttcaacattca cgttgctc，编码shRNA的茎II的序列为gagcaacgtgaatgttgaa，编码shRNA的环的序列为ttcaagaga)，然后在如下条件下退火合成双链DNA oligo片段：

反应体系如下：

DNA oligo(正义链)(1μg/μl)    5μl

DNA oligo(反义链)(1μg/μl)    5μl

5×Universal Buffer            20μl

ddH₂O                          70μl

                                          

Total                          100μl

将体系混匀，90℃温育4分钟，70℃温育10分钟，缓慢冷却至室温。得到双链DNA oligo片段。

12％PAEG非变性PAGE凝胶检测双链形成效率，结果如图1所示(A表示双链DNA，B表示单链DNA，其中第1泳道为单链DNA对照，第2泳道为双链DNA对照，第5泳道为本实验中构建的双链DNA)，

表明，双链结构正确，可以准备连接。

(2)重组载体构建

用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切pGCsi载体(上海吉凯生物技术有限公司)，回收目的载体片段，酶切反应体系如下：

酶切反应体系20μl：纯化的DNA质粒(1μg/μl)1ul，10×buffer(10×)2μl，ddH2O 15μl，BamH I(10U/μl)1ul，Hind III(10U/μl)1μl。将上述混合的反应物置于37℃，1h；加入0.5mol/L EDTA(pH8.0)使终浓度达10mmol/L，终止反应。

将上述酶切后的载体与步骤(1)中合成的双链DNA oligo片段进行连接，连接反应体系表1(其中，对照1指没有加退火的DNA片段的连接，用来判断载体的自连情况，对照2指没有加载体DNA，应该是没有克隆形成的，以判断体系是否有污染。)；于4℃，12小时连接反应，制备克隆连接液，准备转化。

表1、连接反应体系

将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a，挑选阳性克隆；用菌液PCR法对阳性克隆进行鉴定，所用的引物序列为：Up：5’-GTGTCACTAGGCGGGAACAC-3’，Down：5’-TTATTCCCATGCGACGGTATC-3’，以空载体pGCsi为阴性对照，以NC载体为阳性对照(克隆如果条带大小和阳性对照一致，则说明已构建进入载体。)，挑选出含有DNAoligo片段的阳性克隆；提取阳性质粒，测序(Invitrogen公司进行377型测序仪进行测序分析)，测得的序列如序列表中SEQ ID №.1所示(自5’末端第224-289位核苷酸与oligoDNA的序列相符)，结果表明，得到了正确插入DNA oligo片段的阳性质粒，备用，将阳性重组质粒记作pGCsi-PN。

PCR检测结果如图2所示(泳道1表示ddH₂O阴性对照；泳道2表示marker：5，3，2，1.5，1Kb，750，500，250，100bp)；泳道3表示空载体阴性对照；泳道4表示NC载体阳性对照；泳道5-9表示本发明构建的重组载体)。

(3)质粒提取

操作步骤参照Qiagen公司的质粒中量抽提试剂盒。

1)将4ml步骤(2)得到的阳性克隆菌液转入100ml含氨苄青霉素的LB培养基，37℃摇床300rmp，16h；2)收集菌液，4℃6,000rpm离心15min；3)加入4ml BufferP1(含Lyseblue)重悬，充分混匀；4)加入4ml Buffer P2颠倒混匀4-6次，室温放置5min；5)加入4ml预冷的Buffer P3立即混匀，用力颠倒十余次，冰上15min，出现白色沉淀，溶液变清亮；6)4℃12000rpm离心30min，迅速取上清放入离心管；7)4℃12000rpm离心15min，再次离心；8)加4mlBuffer QBT到Qiagentip排空气体；9)将步骤7中的上清快速置入Qiagentip中，过柱；10)用10mlBuffer QC加入Qiagentip中洗涤两次；11)用5mlBuffer QF加入Qiagen tip，洗脱DNA；12)收集含DNA的洗脱液，加入3.5ml室温异丙醇，混匀，4℃13000rmp离心30min；13)用2ml室温70％乙醇洗DNA沉淀物，4℃15000rmp离心10min，小心去上清液；14)风干沉淀物5-10min，每管用灭菌三蒸水约60μl溶解DNA；15)利用紫外分光光度计测提取的质粒样品的OD260和OD280的值，计算两者的比值，利用公式OD260×50(μg/ml)×稀释倍数计算样品中质粒的浓度；16)将重组质粒用限制性内切酶BamHI进行酶切，反应条件如下：质粒8μl；BamH I 1μl；10XHBuffer2μl；ddH₂O8μl；混合后37℃水浴2h。取5μl酶切产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，阳性克隆经北京诺赛生物工程技术服务有限公司自动测序仪进行。测序结果表明，得到的质粒中基因插入顺序及基因序列正确。将得到的阳性质粒记作pGCsi-PN，空载体pGCsi记作NC质粒。

(二)利用Lipofectamine LTX和PLUS Reagents瞬时转染U2OS细胞

Lipofectamine LTX and PLUS Reagents转染试剂购自Invitrogen公司，产品目录号为Cat.No.15338-100。

具体实验步骤为：1.取生长良好、融合度在80-90％的U2OS细胞，弃去培养基上清液，加2ml PBS洗两次，去除细胞碎片和细胞生长代谢物；2.加入1ml胰酶(0.25％)室温消化，光学显微镜下观察，细胞回缩变圆，透过性增强，即可终止消化；3.弃去胰酶，加3-4ml完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)小心吹打均匀，注意吹打力度不能伤及细胞。收集培养基，800rmp离心5min，倾去上清液，用无青链霉素含10％FBS培养基重新悬浮细胞；4.将细胞接种于直径为60mm的细胞培养皿中，每个培养皿细胞数接种数为5×10⁶；培养基为完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)。5.接种的细胞培养24h，使其融合度达70-80％；6.按Invitrogen公司的Lipofectamine LTX and PLUS Reagents染试剂的说明书转染细胞，转染复合物配制如下：无血清无双抗的100μl DMEM培养基中加入质粒(分别为pGCsi-PN、NC质粒，空白对照用等量的PBS代替)6.25μg，PLUS Reagents 6.25μl，室温孵育5min；加入Lipofectamine LTX 15.6μl，室温下孵育30min；7.将孵育好的转染复合物缓慢滴加入培养皿中，边滴加边晃动培养皿，使复合物分布均匀；8.将细胞重新送入培养箱中培养，6h后将无血清的培养基换成完全培养基，继续培养，24h荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，拍照，估计转染效率。转染效率高于70％者再进行后续实验。

质粒(包括pGCsi-PN组和NC组)转染24h后，荧光显微镜下观察，可见在胞核胞浆中大量的绿色荧光蛋白表达，转染效率大约为70％-80％左右，而PBS组则未见绿色荧光蛋白表达。如图3(A.pGCsi-PN组普通视野下，B.pGCsi-PN组荧光显微镜下，C.NC组普通视野下，D.NC组荧光显微镜下)。

三、重组细胞中periostin mRNA及蛋白的表达

(一)半定量RT-PCR检测periostin mRNA表达

1.转染细胞总RNA提取：将转染24h后的60mm培养皿的细胞平均重铺于六孔板的3个孔中，再培养24h后提取细胞总RNA，步骤如下：①六孔板中每孔加入Trizol1ml，反复抽吸使细胞完全裂解，冰上孵育5min；每ml Trizol加0.35ml氯仿，冰上放置3min，出现明显分层；②4℃，12000rpm离心10min，取上清；③加0.5ml异丙醇，-20℃放置15min，4℃12000rpm离心10min，离心后出现白色沉淀，弃上清；④加75％乙醇1ml振荡混匀，悬浮沉淀。4℃12000rpm离心5min，尽量弃尽上清；⑤超净台内于冰上干燥5-10min，加入30-50μl DEPC水溶解RNA沉淀；⑥紫外分光光度计测定(260/280)nm吸光值以估算RNA样品的浓度及纯度；⑦RNA浓度(μg/ml)＝OD260值×40μg/ml×稀释倍数；以上操作均在冰上进行。

2.甲醛变性胶电泳

制备1％琼脂糖凝胶50ml：将10×甲醛变性胶缓冲液高压消毒。将5g琼脂糖与5ml的10×甲醛变性胶缓冲液和36ml消毒纯水，混匀；加热，边加热边观察，全溶解后(无丝状物)，冷却至60℃，沿瓶壁加入9ml甲醛(慢加紧摇)；铺至胶盒(50ml都用掉)；

按如下比例配制加样液，上样：

RNA             3.5μl

10×MOPS        2μl

甲醛            4μl

甲酰胺          10μl

10×上样缓冲液  3μl

常规电泳、EB染色后，紫外灯下观察18S和28S条带确定提取RNA的质量。

3.反转录反应

反应体系如下：

dNTPs            1μl

MMLV             1μl

5×MMLV buffer   4μl

Oligod(T)        1μl

Rasin            0.4μl

RNA              5μg

补DEPC水至       20μl

37℃水浴2h，95℃热变性5min，-20℃存放，备用。

4.PCR反应

反应体系如下：

逆转录产物(cDNA)    0.5μl

10×buffer          2.5μl

dNTPs(10mmol/l)     0.5μl

上下游引物混合      1μl

Taq DNA聚合酶(1U)   0.2μl

补足去离子水至      25μl

表2、引物

基因	正向引物(5’-3’)	反向引物(5’-3’)
			Periostin	CTGCAACGGAGAGACTCAAGA	ACGGTCAATGACATGGACAAC
GAPDH	GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA	GAAGATGGTGATGGGATTTC

Periostin及内参基因GAPDH的反应条件如表3：

表3、periostin、GAPDH的PCR反应条件

PCR产物凝胶电泳分析：每一反应管取10μl产物在1×TAE缓冲液中用1.5％琼脂糖凝胶电泳，100v，约20min。电泳结束后，在紫外灯下观察到特异条带在预定位置。利用凝胶成像分析系统扫描每个目的条带的紫外光吸收量。测算每个标本扩增的目的条带的紫外光吸收量值与其相应内参照基因(GAPDH)条带的紫外光吸收量值的比值(R)，代表该样本细胞目的基因mRNA的相对表达量。

重组细胞的periostin mRNA的表达结果：转染后48h，RT-PCR的结果如图4(图4中，1表示pGCsi-PN组，2表示PBS组，3表示NC组)，PBS组和NC组可见periostin mRNA表达明显，通过凝胶成像系统分析比较，pGCsi-PN组periostin的表达较NC组明显减少(图4)，PBS组、NC组、pGCsi-PN的R值分别是0.5925±0.0473、0.5601±0.0367、0.0997±0.0072(F＝564.71，P＜0.001)，抑制率为46.03％，有显著性差异，PBS组和NC组无差异。GAPDH表达在各组中没有显著性差异，说明pGCsi-PN质粒对periostin的抑制作用是特异的。

(二)periostin蛋白水平的检测

转染48h后，U2OS细胞提取蛋白检测periostin。

NP-40购自invitrogen，产品目录号为Cat.No.FNN0021；

1、蛋白样品的制备：①弃去60mm培养皿中的培养基，用预冷的PBS(pH值7.2)清洗细胞两次；②培养皿中加入预冷的RIPA裂解液(1×PBS，10g/L NP-40，10g/L脱氧胆酸钠，10g/LSDS)，按1∶100体积比加入磷酸蛋白酶抑制剂，用细胞刮刀将细胞从培养皿中刮下；③将刮起的细胞连同裂解液一同转移到EP管中，冰上放置30min，期间每隔5min用振荡器振荡30秒；④4℃，12000rmp离心10min，取上清液，即为所需的总蛋白；⑤参照蛋白定量试剂盒说明书给蛋白定量(BCA法)，计算样品的蛋白浓度，按5∶1体积比加入6×蛋白上样缓冲液，100℃煮10min；⑥用1×蛋白上样缓冲液调整蛋白浓度为2μg/μl，分装，-20℃保存备用。

2.BCA法蛋白定量：参照试剂盒说明进行。①配制2.0，1.5，1.0，0.75，0.5，0.25，0.125，0.025μg/μl系列浓度梯度BSA标准品；②准备工作液：按样所需量配制总工作液，试剂A和试剂B体积比为50∶1；③取按一定倍数稀释的待测样品或标准品10μl分别加入96孔板；④待测样品及标准品每孔加入200μl工作液，混匀，振荡30秒；⑤盖好96孔板，37℃孵育30min；⑥取出96孔板静置至室温；⑦酶标仪测定570nm处光密度值(OD)；⑧以OD值为横坐标，浓度值为纵坐标绘制标准曲线；⑨根据标准曲线换算待测样品相应的浓度。

(三)蛋白免疫印迹实验

1、样品的SDS-PAGE分离：取实验(二)中制备的蛋白样品进行如下电泳实验。

具体步骤：①安装Bio-rad电泳槽；②制备10％分离胶和5％的浓缩胶；③上样；④电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液后开始电泳。开始电泳时，电压为100V，待样品进入分离胶后，增加电压至120V。继续电泳至溴酚蓝达分离胶底部，切断电源；⑤取下胶板，小心去除一侧玻璃板，切去浓缩胶和分离胶无样品部分。

2、蛋白质转膜：①精确测量剩余胶的大小，按该尺寸剪取一张硝酸纤维素膜和六张滤纸。②硝酸纤维素膜在电转缓冲液中浸泡3min。③在湿转的转移槽中从阳极到阴极按下列顺序依次安放：(1)海绵、(2)电转移缓冲液浸湿的滤纸3张、(3)硝酸素纤维膜、(4)电转移缓冲液浸湿的滤纸3张、(5)海绵。④接通电源，250mA恒流，150min。

3、封闭：将转膜后的硝酸纤维素膜在TBS中漂洗一下，放入装有5％脱脂奶粉的平皿中，室温下轻摇1h。

4、一抗结合：将硝酸纤维素膜放入小皿中，加入适量的按1∶1000稀释的PN一抗(即periostin多克隆抗体，液体加入量按0.1ml/cm²)，置4℃摇动过夜。

5、二抗结合和红外荧光扫描显影：取出硝酸纤维素膜，用TBST漂洗膜三次，每次5min；将硝酸纤维素膜重新放入小皿中，加入适量的按1∶10000稀释的LI-COR IRDye800CW抗体(液体加入量按0.1ml/cm²)，室温下避光水平摇动1h；取出硝酸纤维素膜用TBST避光下漂洗3次，每次10min；取出膜置于odyssey成像系统中在800μm光下扫描成像，分析各条带的灰度值，同时各组设GAPDH作为内参。以PN灰度值/GAPDH的灰度值作为目的蛋白的相对表达量做统计。

转染后48h，Western blot的结果如图5(1.NC组，2.PBS组，3.pGCsi-PN组)，PBS组和NC组可见periostin蛋白表达明显，通过凝胶成像系统分析比较，PBS组、NC组、pGCsi-PN组分别是0.198±0.008、0.193±0.014、0.082±0.008；pGCsi-PN组periostin的表达较NC组明显减少(F＝341.51，P＜0.001)，抑制率为57.5％；PBS组和NC组无差异。GAPDH表达在各组中没有显著性差异，说明目的质粒pGCsi-PN对periostin的蛋白表达有特异的抑制作用。

四、重组细胞的性能检测

(一)MTT测细胞的增殖

1、接种细胞：三组分别取处于对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化，用完全培养基配成单个细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度为2×10⁴/ml，96孔板每孔加入200μl，使细胞数为4×10³，每组设三个重复，每个重复设六个平行复孔。2、将96孔板重新送入37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，每隔24小时各组取出一个96孔板加入MTT用以测各孔的光吸收度，共四天。3、MTT加入：培养1-4d，每孔加MTT溶液(5mg/ml，PBS配制)20μl，继续培养4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。4、比色：在酶标仪上选择490nm波长，测各孔光吸收值(A值)，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。以只加培养基不加细胞的空白对照孔调零。

从细胞转染48小时后开始检测各组细胞增殖情况，从48小时起三组间增殖情况出现差异，pGCsi-PN组出现抑制现象，如图6(*与NC比较P＜0.05)，表5。结果表明，periostin基因的表达下调使U2OS细胞的增殖受到抑制。

表5、转染后U2OS细胞的增殖变化

*与NC组相比P＜0.01

(二)细胞侵袭和迁移能力测定

FBS购自hyclone，产品目录号为SH30088.03。

转染后48h内检测：1.0.25％胰酶消化细胞，离心，用0.1％FBS培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为5×10⁵/ml。2.用于侵袭实验，ECM胶和无血清培养基按1∶1(体积比)混合，60μl体积加入Transwell(膜上孔径为8μm)上室中，置37℃培养箱4h，使胶完全凝固；(迁移实验不需ECM胶故省去此项)。3.实验前一小时，Transwell上室加入200μl 0.1％FBS培养基，下室加600μl的10％FBS培养基置培养箱中水化胶。4.水化完后，小心吸去上室150μl培养基，每孔加如1中的细胞悬液100μl，下室用10％FBS培养基趋化。5.培养箱中培养20h后，PBS洗膜三次，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗三次，每次3min；擦去上室一侧未穿过去的细胞；(迁移实验培养12h，侵袭实验培养20h)。6.室温下自然风干膜，0.1％结晶紫染膜30min；光学显微镜下观察。7.用10％冰醋酸溶液200μl溶解膜上结晶紫混合物，震荡使混合物充分溶解。8.比色：在酶标仪上选择590nm波长，测各孔光吸收值(A值)。以只加冰醋酸为空白对照孔调零。以OD值间接代表细胞的侵袭能力。转染后的侵袭抑制率＝(1-pGCsi-PN组OD值/NC组OD值)x100％。

U2OS细胞的迁移力变化结果：Transwell小室的迁移实验结果可见，经转染抑制质粒48h后结晶紫染色，U2OS细胞的穿膜数明显少于对照组(图7中，箭头所示即为穿膜的细胞，A NC组 B PBS组 C pGCsi-PN组)，用10％冰醋酸溶解后测OD值。NC组、PBS组、pGCsi-PN组OD值分别为0.740±0.169、0.776±0.148、0.436±0.051，pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝17.79，P＜0.01)，迁移抑制率为43％，表明periostin基因的表达下调使细胞的迁移能力受到抑制。

U2OS细胞的侵袭力变化结果：Transwell小室的侵袭实验结果可见，经转染抑制质粒48h后结晶紫染色，U2OS细胞的穿膜数明显少于对照组(图8中箭头所示即为穿膜的细胞，A NC组 B PBS组 C pGCsi-PN组)，用10％冰醋酸溶解后测OD值。NC组、PBS组、pGCsi-PN组OD值分别为0.263±0.028、0.282±0.029、0.074±0.015，pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝197.08，P＜0.01)，侵袭抑制率为74％，表明periostin基因的表达下调使细胞的侵袭迁移能力受到抑制。

(三)细胞周期检测

转染96h后，检测细胞周期，步骤如下：

1.细胞密度约为80％时，0.25％胰酶消化细胞，2000rpm，离心5min收集细胞；2.PBS洗涤细胞一次，2000rpm，离心5min，收集并调整细胞浓度为1×10⁶/ml；3.制备的单细胞悬液用70％乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液(如需要，细胞悬液用200目筛网过滤一次)；4.加100μl RNaseA 37℃水浴30min；5.再加入400μl PI染色混匀，4℃避光30min；6.流式细胞仪检测标本，用细胞周期分析软件记录每组细胞的G₀/G₁期、S期和G₂/M期所占的百分比。

转染后U2OS细胞的细胞周期变化结果：转染96小时后，FCM检测各组细胞的周期变化情况，NC组、PBS组、pGCsi-PN组细胞S期所占的比例分别为32.203±2.138、31.764±1.468、25.488±1.174(图9，A NC组 B PBS组 C pGCsi-PN组)；pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝47.02，P＜0.001)，S期细胞减少21％。NC组、PBS组、pGCsi-PN组细胞G0-G1期所占的比例分别为58.876±2.718、57.037±3.556、66.189±4.859(F＝14.50，P＜0.001)。表明：处于DNA合成期的细胞比例减少，即要分裂增殖的细胞比例减少，说明U2OS细胞的增殖受到抑制。

(四)KFb转染了periostin siRNA质粒后的凋亡变化

Annexin V-APC凋亡试剂盒购自eBioscience，产品目录号为88-8007。

转染48h后，检测细胞凋亡情况，步骤如下：

1.细胞密度约为80％时，0.25％胰酶消化细胞，2000rpm，离心5min收集细胞。2.PBS洗涤细胞一次，2000rpm，离心5min，收集并调整细胞浓度为1×10⁶/ml。3.取1ml细胞悬液，1000r/min，4℃离心10min，弃上清。4.加1ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。5.1000r/min，4℃离心10min，弃上清。6.重复3、4步一次。7.将细胞重悬与500μl Binding buffer。8.加10μlAnnexin V-APC，轻轻混匀，避光室温反应15min。8.再加入5μl PI。9.用流式细胞仪检测标本，自带的分析软件分析AnnexinV阳性并且PI阴性细胞所占百分比。

转染后U2OS细胞的凋亡变化：转染48小时后，FCM检测各组细胞的凋亡变化情况，pGCsi-PN组、NC组、PBS组早期凋亡细胞所占比例分别为10.402±4.316，2.011±1.022，2.728±0.855(图10，A NC组 B PBS组 C pGCsi-PN组)；pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝28.69，P＜0.001)，早期凋亡率增加417％。pGCsi-PN组、NC组、PBS组晚期凋亡和坏死细胞所占比例分别为3.690±0.664，1.021±0.554，0.791±0.519；pGCsi-PN组与NC组比较具有显著性差异(F＝68.86，P＜0.001)，晚期凋亡和坏死细胞比例增加262％。表明，pGCsi-PN质粒促进了U-2OS细胞的凋亡。

以上各实验的统计学分析：数据以“均数±标准差”表示，数据两两比较方差齐时，用SAS 8.0软件做单因素方差分析，LSD法两两比较；P＜0.01时差异有统计学意义。

序列表

<110>北京大学第三医院

 

<120>Periostin基因的shRNA在制备抑制肿瘤的药物中的应用

 

<160>1

 

<210>1

 

<211>984

 

<212>DNA

 

<220>

 

<223>

 

<400>1

 

cttcatattt gcatatacga tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg     60

taaacacaaa gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt    120

ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt    180

atttcgattt cttgggttta tatatcttgt ggaaaggacg cgggatcccg agagcaacgt    240

gaatgttgaa ttcaagagat tcaacattca cgttgctctc tttttggata gcttaagttt    300

aaaccgctga tcagcctcga ctgtgccttc taaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt    360

tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg    420

accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc    480

aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc    540

agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg    600

gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat    660

ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg    720

tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag    780

tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtattactc cgccccattg    840

acgcaatggg cggtaggcgt gtacgggtgg gaggtctata tcagcagagc tggtttagtg    900

aaacgtcaga tccgctagcg ctacggtcgc cacatggcca gcaagggctg agagcttgtt    960

tcaaccggac gtgatgctca tgcc                                           984

Claims (10)

1.shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauucacguugcuc 。

2.shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞迁移的产品中的应用；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauucacguugcuc。

3.shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备抑制肿瘤细胞侵袭的产品中的应用；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauucacguugcuc。

4.shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备促进肿瘤细胞凋亡的产品中的应用；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauucacguugcuc。

5.shRNA、shRNA编码基因、表达shRNA的重组载体或表达shRNA的表达盒在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；所述shRNA为由茎I、环和茎II形成茎环结构的单链RNA；所述茎I的序列为gagcaacg ugaauguugaa，所述茎II的序列为uucaacauucacguugcuc。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述shRNA的环的序列为ucucuugaa。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述shRNA编码基因的核苷酸序列依次为编码所述茎I的DNA序列、编码所述环的DNA序列和编码所述茎II的DNA序列；编码所述茎I的DNA序列为ttcaacattca cgttgctc，编码所述茎II的DNA序列为gagcaacgt gaatgttgaa，编码所述环的DNA序列为ttcaagaga；

和/或，所述表达shRNA的重组载体是将所述shRNA编码基因插入pGCsi载体的BamH I和Hind III酶切位点间得到的。

8.氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备抑制肿瘤细胞增殖的产品中的应用、氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备抑制肿瘤细胞迁移的产品中的应用、氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备抑制肿瘤细胞侵袭的产品中的应用、氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备促进肿瘤细胞凋亡的产品中的应用或氨基酸序列如GenBank No.NM_006475所示的蛋白或其编码基因在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为骨肿瘤，优选为骨肉瘤。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述骨肉瘤细胞为骨肉瘤U-20S细胞。

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