TW201302797A - 結合ｖｅｇｆ及ａｎｇ２之雙特異性結合分子 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示結合VEGF與Ang2之雙特異性結合分子，其較佳呈如VHH及域抗體之免疫球蛋白單可變域的形式；含有該等分子之醫藥組合物及其於治療與VEGF及/或Ang2介導之對血管生成的作用相關之疾病中之用途。此外，本發明亦描述編碼雙特異性結合分子之核酸，宿主細胞及其製備方法。

Description

結合VEGF及ANG2之雙特異性結合分子
本發明係關於人類療法、詳言之癌症療法之領域及適用於該療法之藥劑及組合物。
當腫瘤達到約1 mm3之臨界尺寸時，其變得依賴於血管生成以維持氧及營養物之血液供應以允許進一步生長。抗血管生成療法已變成針對若干類型之腫瘤的重要治療選擇。此等療法集中於藉由中和VEGF(阿瓦斯丁(Avastin))或其受體(蘇登特(Sutent)及索拉菲尼(Sorafinib))來阻斷VEGF路徑(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov.2004年5月；3(5)：391-400。)。對小鼠之最新研究已顯示，血管生成素2(Angiopoietin2，Ang2)(Tie2受體之配體)藉由實現其他血管生成因子(諸如VEGF)之功能來控制血管重塑。Ang2主要由內皮細胞表現，強烈地受低氧及其他血管生成因子誘導且已顯示可調控腫瘤血管可塑性，從而使得血管可對VEGF及FGF2有反應(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009年3月；10(3)：165-77。)。與此作用一致，Ang2之缺失或抑制可導致血管生成減少(Gale等人，Dev Cell.2002年9月；3(3)：302-4。)(Falcón等人，Am J Pathol.2009年11月；175(5)：2159-70。)。已報導患有結腸直腸癌、NSCLC及黑色素瘤之患者的Ang2血清濃度升高(Goede等人，Br J Cancer.2010年10月26日；103(9)：1407-14)，(Park等人，Chest.2007年7月；132(1)：200-6。)，(Helfrich等人， Clin Cancer Res.2009年2月15日；15(4)：1384-92。)。在CRC癌中，Ang2血清含量與對抗VEGF療法之治療反應有關。
Ang-Tie系統由2種受體(Tie1及Tie2)及3種配體(Ang1、Ang2及Ang4)組成(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009年3月；10(3)：165-77。)。Tie2、Ang1及Ang2為此家族中研究最透徹的成員，Tie1為孤兒受體且Ang4對於血管重塑之作用仍需闡明。Ang2及Ang1對Tie2結合及活化介導相反功能。Ang2介導之Tie2活化導致內皮細胞活化、周細胞解離、血管滲漏及誘導血管萌生(vessel sprouting)。與Ang2相反，Ang1信號傳導藉由募集周細胞，藉此維持內皮細胞靜止來維持血管完整性。
血管生成素2(Ang2)為Tie2受體酪胺酸激酶之分泌型66 kDa配體(Augustin等人，Nat Rev Mol Cell Biol.2009年3月；10(3)：165-77。)。Ang2由N端捲曲螺旋域及C端血纖維蛋白原樣域組成，後者為Tie2相互作用所需。Ang2主要由內皮細胞表現且強烈地受低氧及其他血管生成因子(包括VEGF)誘導。Tie2見於內皮細胞、造血幹細胞及腫瘤細胞上。已顯示Ang2-Tie2可調控腫瘤血管可塑性，從而使得血管可對VEGF及FGF2有反應。
已顯示在活體外Ang2充當人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中之適度有絲分裂原、化學引誘劑及管形成誘導劑。Ang2誘導纖維母細胞中異位表現之Tie2的酪胺酸磷酸化且促進下游信號傳導事件，諸如HUVEC中ERK-MAPK、AKT及 FAK之磷酸化。已描述Ang2在Ang1誘導性內皮細胞反應中之拮抗作用。
已顯示Ang2缺乏會導致小鼠嚴重的淋巴成型缺陷。儘管缺失Ang2對於胚胎血管發育並不重要，但缺乏Ang2的小鼠在視網膜及腎中具有永久性血管缺陷。此等發現連同在血管生成部位(例如卵巢)Ang2表現之動態模式一起指示Ang2藉由實現其他血管生成因子(諸如VEGF)之功能來控制血管重塑。
Ang2-Tie2系統在腫瘤血管生成之血管生成開關及稍後階段期間發揮關鍵作用。在腫瘤相關內皮中Ang2表現大幅上調。當植入缺乏Ang2之小鼠中時，尤其在腫瘤生長早期，觀察到腫瘤生長之減少。用Ang2 mAb治療性阻斷Ang2已在多種腫瘤異種移植模型中顯示廣泛功效。已描述Ang2 mAb與VEGFR2之抑制劑(mAb及小分子量抑制劑)之累加效應。
如例如US2008/0014196及WO2008/101985中所述，血管生成與許多病症之發病機制有關，包括實體腫瘤及轉移以及眼病。最重要的促血管生成因子之一為血管內皮生長因子(VEGF)，其亦稱為VEGF-A或血管滲透性因子(VPF)。VEGF屬於包括胎盤生長因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及VEGF-F在內之基因家族。人類VEGF之單一基因之mRNA的替代性拼接可產生至少六種同功異型物(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206)，VEGF165為最豐富的同功異型物。
已鑑別出兩種與VEGF相互作用之VEGF酪胺酸激酶受體(VEGFR)，亦即VEGFR-1(亦稱為FIt-1)及VEGFR-2(亦稱為KDR或FIK-1)。VEGFR-1對於VEGF具有最高親和力，而VEGFR-2對於VEGF具有微低的親和力。Ferrara(Endocrine Rev.2004,25：581-611)提供VEGF之詳細描述，與其受體之相互作用及其在正常及病理過程中之功能可見於Hoeben等人Pharmacol.Rev.2004,56：549-580中。
已報導VEGF為正常血管生成與異常血管生成之關鍵調控因子(Ferrara及Davis-Smyth,Endocrine Rev.1997,18：4-25；Ferrara J.MoL Med.1999,77：527-543)。與有助於血管形成過程之其他生長因子相比，VEGF之獨特之處在於其對於血管系統中之內皮細胞具有高特異性。
VEGF mRNA由大多數人類腫瘤過表現。在腫瘤生長之情況下，血管生成對於自增生轉變成瘤形成及向腫瘤生長及轉移提供營養似乎至關重要(Folkman等人，1989,Nature 339-58)，使得腫瘤細胞與正常細胞相比獲得生長優勢。因此，抗血管生成療法已變成針對若干類型之腫瘤的重要治療選擇。此等療法集中於阻斷VEGF路徑(Ferrara等人，Nat Rev Drug Discov.2004年5月；3(5)：391-400)。
VEGF亦與眼病有關。眼液中之VEGF濃度與患有糖尿病及其他局部缺血相關視網膜病之患者體內存在血管活躍增生高度相關。此外，最新研究已證明在受年齡相關黃斑變性(AMD)影響之患者中VEGF定位於脈絡膜新生血管膜中。VEGF之上調亦已在各種發炎病症中觀察到。VEGF與 類風濕性關節炎之發病機制有關，類風濕性關節炎為血管生成起顯著作用之發炎性疾病。
對VEGF及其在血管生成及不同過程中之作用的闡明已提供治療性干預之潛在新目標。VEGF之功能受阻斷或防止VEGF受體酪胺酸激酶活化(Schlaeppi及Wood,1999,Cancer Metastasis Rev.,18：473-481)且因而干擾VEGF受體信號轉導路徑之小分子抑制。含有細菌或植物毒素之細胞毒性結合物可抑制VEGF對腫瘤血管生成之刺激作用。舉例而言，VEGF-DT385毒素結合物(白喉毒素域與VEGF165融合或以化學方式結合)有效地抑制活體內腫瘤生長。腫瘤生長抑制亦可藉由由反轉錄病毒傳遞FIk-1突變體或可溶性VEGF受體來達成。
已開發阻斷VEGF結合其受體之VEGF中和抗體(諸如A4.6.1及MV833)且其已顯示臨床前抗腫瘤活性(Kim等人Nature 1993,362：841-844；Folkman Nat.Med.1995,1：27-31；Presta等人Cancer Res.1997,57：4593-4599；Kanai等人Int.J.Cancer 1998,77：933-936；Ferrara及Alitalo Nat.Med.1999,5：1359-1364；320,340)。關於治療性抗VEGF方法試驗之評述，參見Campochiaro及Hackett(Oncogene 2003,22：6537-6548)。
已使用亦稱為貝伐單抗(bevacizumab)之A4.6.1(Avastin®；Genentech,San Francisco,CA)獲得大部分臨床經驗。
WO2008/101985描述來自駱駝類之結合VEGF的免疫球蛋白單可變域(如本文所定義之VHH或「Nanobodies®」)， 及其於治療特徵為過度及/或病理學血管生成或新血管生成之病狀及疾病中的用途。
本發明之一目的在於提供用於人類療法之新穎抗血管生成結合分子。
本發明之另一目的在於提供預防、治療、減輕及/或診斷該等疾病、病症或病狀之方法，包括使用及/或投與該等結合分子及包含其之組合物。詳言之，本發明之一目的在於提供該等藥理學活性結合分子、組合物及/或方法，其提供與當前所用及/或此項技術中已知之藥劑、組合物及/或方法相比的優點。此等優點包括改良之治療性及/或藥理學性質及/或其他有利性質，例如用於製造目的，尤其與如上述各者之習知抗體或其片段相比。
根據第一態樣，提供雙特異性結合分子，較佳為雙特異性免疫球蛋白，較佳為如VHH及域抗體之免疫球蛋白單可變域，其在單一分子中包含至少一個VEGF結合組分及至少一個Ang2結合組分。較佳地，該等雙特異性結合分子進一步包含血清白蛋白結合組分。
更特定言之，本發明之雙特異性結合分子基本上包含(i)特異性結合Ang2之至少一個抗原決定基的Ang2結合組分及(ii)特異性結合VEGF之至少一個抗原決定基的VEGF結合組分，其中該等組分以使其同時結合Ang2與VEGF或其一次結合Ang2或VEGF之方式彼此連接。
根據本發明之較佳態樣，兩種組分包含一或多個免疫球 蛋白單可變域，其可彼此獨立地為VHH或域抗體，及/或如本文所定義之任何其他類別的免疫球蛋白單可變域(諸如VL域)，其限制條件為此等免疫球蛋白單可變域各將分別結合抗原，亦即Ang2或VEGF。
根據一較佳實施例，免疫球蛋白單可變域為相同類型，詳言之，所有免疫球蛋白單可變域均為VHH或域抗體。
根據一尤其較佳實施例，所有免疫球蛋白單可變域均為VHH，較佳為人類化(或如本文所定義之「序列最佳化」)VHH。因此，本發明係關於雙特異性結合分子，其包含(視情況人類化或序列最佳化)抗Ang2 VHH及(視情況人類化或序列最佳化)抗VEGF VHH。
然而，熟習此項技術者應清楚，本文教示可類似地應用於雙特異性結合分子，包括其他抗Ang2或抗VEGF免疫球蛋白單可變域，諸如域抗體。
在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明之雙特異性結合分子的核酸以及含有其之宿主細胞。
本發明進一步係關於一種產物或組合物，其含有或包含至少一種本發明之雙特異性結合分子及視情況存在之該等組合物之一或多種其他組分。
本發明進一步係關於製備或產生本文所述之雙特異性結合分子、核酸、宿主細胞、產物及組合物的方法。
本發明進一步係關於本文所述之雙特異性結合分子、核酸、宿主細胞、產物及組合物的應用及用途，以及預防及/或治療可藉由抑制Ang2來調節之疾病及病症的方法。
已發現本發明之雙特異性結合分子的Ang2結合組分結合並拮抗Ang2之效力為結合Ang1或Ang4之效力的至少5,000倍、較佳10,000倍。由此將大大地避免阻斷Ang1介導性信號傳導之活化，其將對抗所欲之抗血管生成作用。
另外已發現，本發明之雙特異性結合分子的VEGF結合組分結合VEGF-A之親和力為結合VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PLGF之親和力的至少1,000倍、較佳至少5,000倍、更佳至少10,000倍。由於高度優先結合VEGF-A，故調節淋巴液血管生成之VEGFR3的信號傳導不受干擾。
在一較佳實施例中，提供呈連接VHH域形式之本發明之雙特異性結合分子。該等分子顯著小於習知抗體且因此具有與該等習知抗體相比更深地滲入腫瘤中之潛力。此益處由本文所揭示之特定序列在去除糖基化位點之後進一步突顯。
此外，由於雙特異性性質(一個分子中之VEGF結合組分及Ang2結合組分)，兩種官能基之腫瘤滲透必將相等，由此將確保將在腫瘤滲透之整個深度中提供VEGF與Ang2之組合拮抗的有益作用。此為相較於抵抗此等目標之個別拮抗劑的組合之優點，因為個別拮抗劑之滲透深度總會發生一定程度的變化。
本發明之較佳雙特異性結合分子的另一優點為其歸因於血清白蛋白結合組分(諸如本文所述之血清白蛋白結合分子)之血清半衰期延長。
本發明之此等及其他態樣、實施例、優點及應用將由下 文的進一步描述而變得清楚。
定義
除非另外指示或定義，否則所有所用術語均具有其在此項技術中之常見含義，此將為熟習此項技術者所清楚。例如參考標準手冊，諸如Sambrook等人，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Lewin,「Genes IV」,Oxford University Press,New York,(1990)，及Roitt等人，「Immunology」(第2版)，Gower Medical Publishing,London,New York(1989)；以及本文所列舉之一般背景技術；此外，如熟習此項技術者所清楚，除非另外指示，否則未特別詳細描述之所有方法、步驟、技術及操作均可以本身已知之方式進行並已以本身已知之方式進行。再例如參考標準手冊，上文所提及之一般背景技術及其中所列舉之其他參考文獻。
術語「雙特異性結合分子」係指包含至少一個Ang2結合分子(或「Ang2結合組分」及至少一個VEGF結合分子(或「VEGF結合組分」)的分子。雙特異性結合分子可含有一個以上Ang2結合分子及/或一個以上VEGF結合分子，亦即在雙特異性結合分子含有雙互補位(如下文所定義)Ang2結合分子及/或雙互補位VEGF結合分子之情況下，在該分子結合Ang2或VEGF之部分中，亦即分別在其「Ang2結合組分」(或抗Ang2組分)或「VEGF結合組分」(或抗VEGF組分)中。然而，在此情形下，詞語「雙特異性」不應解釋 為雙特異性結合分子不包括除VEGF及Ang2外對分子具有結合特異性之其他結合組分。該等其他結合組分之非限制性實例為結合血清白蛋白之結合組分。
除非另外指示，否則術語「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白序列」無論本文是用於指重鏈抗體或習知4鏈抗體均用作通用術語以包括全尺寸抗體、其個別鏈以及其所有部分、域或片段(包括(但不限於)抗原結合域或片段，分別諸如VHH域或VH/VL域)。另外，除非上下文需要更有限制的解釋，否則如本文中所使用(例如在如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「(單)可變域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」之術語中)，術語「序列」一般應理解為包括相關胺基酸序列以及編碼其之核酸序列或核苷酸序列。
如本文中所使用，術語(多肽或蛋白質之)「域」係指能夠獨立於蛋白質之其餘部分保持其三級結構的摺疊蛋白質結構。一般，域負責蛋白質之個別功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白質而不損失該蛋白質之其餘部分及/或該域的功能。
如本文中所使用，術語「免疫球蛋白域」係指抗體鏈(例如習知4鏈抗體或重鏈抗體之鏈)之球狀區域，或基本上由該球狀區域組成之多肽。免疫球蛋白域之特徵在於其保持抗體分子之免疫球蛋白摺疊特徵，其由配置成兩個β片之約7個反平行β股的雙層夾層組成，視情況由保守性二硫鍵穩定。免疫球蛋白域包含(a)可變域，亦即一或多個免疫 球蛋白可變域。
如本文中所使用，術語「免疫球蛋白可變域」意謂基本上由以下組成之免疫球蛋白域：四個「構架區」，其在此項技術中及下文分別稱為「構架區1」或「FR1」；「構架區2」或「FR2」；「構架區3」或「FR3」；及「構架區4」或「FR4」；該等構架區間雜有三個「互補決定區」或「CDR」，其在此項技術中及下文分別稱為「互補決定區1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」；及「互補決定區3」或「CDR3」。因此，免疫球蛋白可變域之一般結構或序列可如下指示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。其為因帶有抗原結合位點而賦予抗體對抗原之特異性的免疫球蛋白可變域。在本發明之情形下，如VHH及域抗體之免疫球蛋白單可變域為較佳。
如本文中所使用，術語「免疫球蛋白單可變域」意謂能夠特異性結合抗原之抗原決定基而不與另一免疫球蛋白可變域配對之免疫球蛋白可變域。在本發明之含義中免疫球蛋白單可變域之一個實例為「域抗體」，諸如免疫球蛋白單可變域VH及VL(VH域及VL域)。免疫球蛋白單可變域之另一實例為來自駱駝類之「VHH域」(或簡稱為「VHH」)，如下文所定義。
鑒於上述定義，習知4鏈抗體(諸如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；此項技術中已知)或源自該習知4鏈抗體之Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段(諸如二硫鍵鍵聯之Fv或scFv片段)或雙功能抗體(全部為此項技術中已知)之抗原結合域 通常將不視為免疫球蛋白單可變域，因為在此等情況下，結合抗原之各別抗原決定基通常將不由一個(單一)免疫球蛋白域進行，而由一對(締合的)免疫球蛋白域(諸如輕鏈及重鏈可變域)進行，亦即由共同結合於各別抗原之抗原決定基的免疫球蛋白域之VH-VL對進行。
「VHH域」，亦稱為VHH、VHH域、VHH抗體片段及VHH抗體最初被描述為「重鏈抗體」(亦即「無輕鏈抗體」之抗原結合免疫球蛋白(可變)域；Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R.：「Naturally occurring antibodies devoid of light chains」；Nature 363,446-448(1993))。選擇術語「VHH域」以使此等可變域區別於存在於習知4鏈抗體中之重鏈可變域(其在本文中稱為「VH域」或「VH域」)及存在於習知4鏈抗體中之輕鏈可變域(其在本文中稱為「VL域」或「VL域」)。VHH域可在無另一抗原結合域之情況下特異性結合抗原決定基(與習知4鏈抗體中之VH或VL域相反，在該情況下抗原決定基由VL域以及VH域識別)。VHH域為由單一免疫球蛋白域形成之小、穩固且有效的抗原識別單元。
在本發明之情形下，術語VHH域、VHH、VHH域、VHH抗體片段、VHH抗體，以及「Nanobody®」及「Nanobody®域」(「Nanobody」為Ablynx N.V.公司之商標；Ghent；Belgium)可互換使用且表示免疫球蛋白單可變域(具有結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4且特異性結合抗原 決定基而不需要存在第二免疫球蛋白可變域)，且其由所謂的「標誌性殘基」而區別於VH域，如例如WO2009/109635圖1中所定義。
免疫球蛋白單可變域(例如VHH)之胺基酸殘基係根據Kabat等人(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD，出版號91)提供之用於VH域之通用編號來編號，如應用於來自駱駝類之VHH域，如例如Riechmann and Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)之圖2中所示。根據此編號，- FR1包含位置1-30之胺基酸殘基，- CDR1包含位置31-35之胺基酸殘基，- FR2包含位置36-49之胺基酸，- CDR2包含位置50-65之胺基酸殘基，- FR3包含位置66-94之胺基酸殘基，- CDR3包含位置95-102之胺基酸殘基，且- FR4包含位置103-113之胺基酸殘基。
然而，應注意，如此項技術中對於VH域及對於VHH域所熟知，各CDR中之胺基酸殘基總數可變化且可能不對應於由Kabat編號所指示之胺基酸殘基總數(亦即，根據Kabat編號之一或多個位置可能不存在於實際序列中，或實際序列可能含有比Kabat編號所允許之數目多的胺基酸殘基)。此意謂根據Kabat之編號一般可能或可能不對應於實際序列中之胺基酸殘基的實際編號。
此項技術已知對VH域之胺基酸殘基編號的替代性方法，該等方法亦可以類似方式應用於VHH域。然而，在本發明描述、申請專利範圍及圖中，除非另外指示，否則將按照根據Kabat且如上文所述應用於VHH域之編號。
VHH域中之胺基酸殘基總數通常將在110至120之範圍內，常常在112與115之間。然而，應注意較小及較長序列亦可適合於本文所述之目的。
根據本發明之較佳實施例，免疫球蛋白單可變域(例如VHH及域抗體)具有許多獨特結構特徵及功能性質，使其極適合作為功能性抗原結合分子用於療法中。詳言之，但不限於，VHH域(其天生「設計」成在不與輕鏈可變域配對的情況下功能性結合抗原)可充當單一、相對小的功能性抗原結合結構單元。
由於其獨特性質，如本文所定義之如VHH或VH(或VL)的免疫球蛋白單可變域單獨或作為較大多肽(例如雙互補位分子)之一部分可提供許多顯著優點：●僅需要單一域以高親和力且以高選擇性結合抗原，因此不需要存在兩個各別域，亦不需要確保此兩個域以正確空間構形及組態存在(亦即經由使用經特別設計之連接子，如同scFv一般)；●免疫球蛋白單可變域可由單一核酸分子表現且不需要任何轉譯後修飾(如糖基化)；●免疫球蛋白單可變域可容易地經工程改造為多價及多特異性格式(如本文進一步論述)； ●免疫球蛋白單可變域對於其目標具有高特異性及親和力、低固有毒性且可經由除輸注或注射外之替代性途徑投與；●免疫球蛋白單可變域對於熱、pH值、蛋白酶及其他變性劑或條件高度穩定，且因此可在不使用冷凍裝置的情況下製備、儲存或運輸；●免疫球蛋白單可變域可容易且相對廉價地以小規模與製造規模製備。舉例而言，免疫球蛋白單可變域可使用微生物醱酵(例如如下文進一步所述)產生且不需要使用哺乳動物表現系統，如同例如習知抗體一般；●與習知4鏈抗體及其抗原結合片段相比，免疫球蛋白單可變域相對較小(約15 kDa，或為習知IgG之1/10)，且因此顯示向組織(包括(但不限於)實體腫瘤及其他緻密組織)中之(較)高滲透且可以比該等習知4鏈抗體及其抗原結合片段高的劑量投與；●VHH具有特定的所謂「空腔結合性質」(尤其由於其與來自4鏈抗體之VH域相比延長之CDR3環)且因此亦可接近習知4鏈抗體及其抗原結合片段不易接近之目標及抗原決定基；●VHH具有特定優點，即其高度可溶且極穩定，不易於聚集(如同由Ward等人，Nature 341：544-546(1989)所述之源自小鼠之抗原結合域一般)。
本發明之免疫球蛋白單可變域在獲得其之特定生物來源或特定製備方法方面並不受限制。舉例而言，獲得VHH可 包括以下步驟：(1)分離天然存在重鏈抗體之VHH域；或篩選包含重鏈抗體或VHH之文庫且自其分離VHH；(2)表現編碼具有天然存在序列之VHH的核酸分子；(3)使具有天然存在序列之VHH「人類化」(如本文所述)，視情況在親和力成熟後，或表現編碼該人類化VHH之核酸；(4)使來自動物物種、尤其哺乳動物物種(諸如來自人類)之天然存在抗體的免疫球蛋白單可變重域「駱駝化」(如下文所述)，或表現編碼該駱駝化域之核酸分子；(5)使VH「駱駝化」，或表現編碼該駱駝化VH之核酸分子；(6)使用技術以合成或半合成方式製備蛋白質、多肽或其他胺基酸序列；(7)使用核酸合成技術製備編碼VHH域之核酸分子，隨後表現由此獲得之核酸；(8)對重鏈抗體或VHH進行親和力成熟、突變誘發(例如隨機突變誘發或定點突變誘發)及/或任何其他技術以增加VHH之親和力及/或特異性；及/或(9)上述步驟之組合或選擇。
適合於進行上述步驟之方法及技術為此項技術所已知且為熟習此項技術者所清楚。舉例而言，獲得結合特定抗原或抗原決定基之VHH域的方法已描述於WO2006/040153及WO2006/122786中。
根據特定實施例，本發明之免疫球蛋白單可變域或存在於本發明多肽中之免疫球蛋白單可變域為如下VHH域，其胺基酸序列基本上對應於天然存在VHH域之胺基酸序列，但已經「人類化」或「序列最佳化」(視情況在親和力成熟後)，亦即藉由用存在於來自人類之習知4鏈抗體之可變重域中的相應位置之一或多個胺基酸殘基置換該天然存在VHH序列之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基。此可使用此項技術中已知之方法進行，該等方法可由熟習此項技術者常規使用。
人類化VHH域可含有一或多個完全人類構架區序列，且在一甚至更特定實施例中，可含有源自人類生殖系Vh3序列DP-29、DP-47、DP-51或其部分或與其高度同源之人類構架區序列，視情況與諸如JH5之JH序列組合。因此，人類化方案可包含用生殖系VH基因(諸如DP 47、DP 29及DP 51)之相應構架1、2及3(FR1、FR2及FR3)殘基單獨或組合置換任一VHH殘基。本發明之免疫球蛋白單可變域的適合構架區(FR)可選自如例如WO2006/004678中所述者且特定包括所謂「KERE」及「GLEW」種類。實例為在大約位置44至47具有胺基酸序列G-L-E-W的免疫球蛋白單可變域及其各別人類化對應物。人類化VHH域可含有一或多個完全人類構架區序列。
舉例而言，屬於103 P,R,S組及/或GLEW組(如下文所定義)之對於VHH之人類化取代為108Q取代為108L。使免疫球蛋白單可變域人類化之方法為此項技術所已知。
鑒於治療性應用性質得以改良，例如親和力增強或免疫原性降低之結合性免疫球蛋白單可變域可藉由此項技術中已知之技術自個別結合分子獲得，該等技術諸如為親和力成熟(例如以合成、隨機或天然存在的免疫球蛋白序列為起始物)、CDR移植、人類化、組合源自不同免疫球蛋白序列之片段、使用重疊引子之PCR組裝及熟習此項技術者熟知之工程改造免疫球蛋白序列的類似技術；或上述任一者之任何適合組合，亦稱為如本文所述之「序列最佳化」。例如參考標準手冊，以及其他描述及實例。
適當時，親和力增加之結合分子可藉由另一結合分子之親和力成熟獲得，後者相對於親和力成熟分子為「親本」結合分子。
先前已描述獲得結合特異性抗原或抗原決定基之VHH的方法，例如WO2006/040153及WO2006/122786中。亦如其中詳細描述，源自駱駝類之VHH域可藉由用存在於來自人類之習知4鏈抗體之VH域中的相應位置之一或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基來「人類化」(本文中亦稱為「序列最佳化」，除人類化外，「序列最佳化」可涵蓋另一藉由為VHH提供改良性質之一或多個突變修飾序列，諸如移除潛在轉譯後修飾位點)。人類化VHH域可含有一或多個全人類構架區序列，且在一甚至更特定實施例中，可含有源自DP-29、DP-47、DP-51或其部分之人類構架區序列，視情況與諸如JH5之JH序列組合。
域抗體，亦稱為「Dab」及「dAb」(術語「域抗體」及「dAb」由GlaxoSmithKline公司集團用作商標)已描述於例如Ward,E.S.等人：「Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli」；Nature 341：544-546(1989)；Holt,L.J.等人：「Domain antibodies：proteins for therapy」；TRENDS in Biotechnology 21(11)：484-490(2003)；及WO2003/002609中。
域抗體基本上對應於來自非駱駝類哺乳動物之抗體(尤其人類4鏈抗體)的VH或VL域。為了以單一抗原結合域形式結合抗原決定基，亦即不分別與VL或VH域配對，需要對該等抗原結合性質進行特定選擇，例如藉由使用人類單一VH或VL域序列之文庫。
如VHH，域抗體之分子量為約13 kDa至約16 kDa，且若源自完全人類序列，則對於例如人類治療性用途不需要人類化。如在VHH域之情況下，其在原核表現系統中亦表現良好，從而使得總製造成本顯著降低。
此外，熟習此項技術者亦應清楚，有可能將一或多個上文所提及之CDR「移植」於其他「骨架」(包括(但不限於)人類骨架或非免疫球蛋白骨架)上。適合之骨架及用於該CDR移植之技術為此項技術所已知。
可互換使用之術語「抗原決定基」及「抗原決定子」係指由抗原結合分子(諸如習知抗體或本發明之多肽)且更特定言之由該等分子之抗原結合位點識別的大分子(諸如多 肽)之一部分。抗原決定基定義免疫球蛋白之最小結合位點，且因此表示免疫球蛋白之特異性目標。
可「結合」或「特異性結合」某一抗原決定基、抗原或蛋白質(或其至少一部分、片段或抗原決定基)，「對其具有親和力」及/或「對其具有特異性」之多肽(諸如免疫球蛋白、抗體、本發明之免疫球蛋白單可變域或一般抗原結合分子或其片段)被稱為「針對(against)」或「針對(directed against)」該抗原決定基、抗原或蛋白質或為該抗原決定基、抗原或蛋白質之「結合」分子。在此情形下，VEGF結合組分亦可稱為「VEGF中和」。
一般，術語「特異性」係指特定抗原結合分子或抗原結合蛋白(諸如本發明之免疫球蛋白單可變域)分子可結合之不同類型的抗原或抗原決定基之數目。抗原結合分子之特異性可基於其親和力及/或親合力來測定。由抗原與抗原結合蛋白之解離平衡常數(KD)表示之親和力為抗原決定基與抗原結合蛋白上之抗原結合位點之間的結合強度之量度：KD值愈小，抗原決定基與抗原結合分子之間的結合強度愈強(或者，親和力亦可以親和力常數(KA)表示，其為1/KD)。如熟習此項技術者所清楚(例如基於本文其他揭示內容)，親和力可以本身已知之方式測定，此視所關注之特異性抗原而定。親合力為抗原結合分子(諸如免疫球蛋白、抗體、免疫球蛋白單可變域或含有其之多肽)與相關抗原之間的結合強度之量度。親合力與抗原決定基與抗原結合分子上之其抗原結合位點之間的親和力及抗原結合 分子上存在之相關結合位點的數目有關。
抗原結合分子中識別抗原決定基的部分稱為互補位。
除非另外指示，否則術語「VEGF結合分子」或「Ang2結合分子」包括如本文所定義之抗VEGF或抗Ang2抗體、抗VEGF抗體或抗Ang2抗體片段、「抗VEGF抗體樣分子」或「抗Ang2抗體樣分子」，及與此等任一者之結合物。抗體包括(但不限於)單株抗體及嵌合單株抗體。術語「抗體」涵蓋完整免疫球蛋白，如藉由在宿主細胞中重組表現所產生之單株抗體，以及抗體片段或「抗體樣分子」，包括單鏈抗體及線性抗體，所謂「SMIP」(「小模組免疫藥劑」)，如例如WO2002/056910中所述；抗體樣分子包括如本文所定義之免疫球蛋白單可變域。抗體樣分子之其他實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。
「Ang2結合分子」或「VEGF結合分子」分別係指單價目標結合分子(亦即結合各別目標之一個抗原決定基的分子)以及二價或多價結合分子(亦即結合一個以上抗原決定基之結合分子，例如如下文所定義之「雙互補位」分子)。含有一個以上Ang2(或VEGF)結合免疫球蛋白單可變域之Ang2(或VEGF)結合分子亦稱為「格式化」結合分子，其在目標結合組分中除免疫球蛋白單可變域外亦可包含連接子及/或具有效應功能之部分，例如半衰期延長部分，如結合白蛋白之免疫球蛋白單可變域；及/或融合搭配物，如血清白蛋白及/或連接聚合物(如PEG)。
如本文中所使用，術語「雙互補位Ang2(或VEGF)，結合 分子」或「雙互補位免疫球蛋白單可變域」應意謂包含如本文所定義之第一免疫球蛋白單可變域及第二免疫球蛋白單可變域之結合分子，其中該兩個分子結合各別抗原之兩個不重疊抗原決定基。雙互補位結合分子由對於抗原決定基具有不同特異性之免疫球蛋白單可變域構成。抗原結合分子(諸如抗體或本發明之免疫球蛋白單可變域)中識別抗原決定基之部分稱為互補位。
格式化結合分子亦可(儘管次佳)包含識別同一或重疊抗原決定基或其各別抗原之兩個相同免疫球蛋白單可變域或兩個不同免疫球蛋白單可變域。在此情況下，關於VEGF，兩個免疫球蛋白單可變域可結合形成VEGF二聚體之兩個單體每一者中的同一或重疊抗原決定基。
通常，本發明之結合分子的結合解離常數(KD)為：10E-5至10E-14莫耳/公升(M)或更小，且較佳為10E-7至10E-14莫耳/公升(M)或更小，更佳為10E-8至10E-14莫耳/公升，且甚至更佳為10E-11至10E-13(如例如Biacore或Kinexa分析中所量測)，及/或締合常數(KA)為至少10E7 ME-1，較佳為至少10E8 ME-1，更佳為至少10E9 ME-1，諸如至少10E11 ME-1。任何大於10E-4 M之KD值一般視為指示非特異性結合。
較佳地，本發明之多肽將結合所需抗原(亦即VEGF或Ang2)的KD分別小於500 nM，較佳小於200 nM，更佳小於10 nM，諸如小於500 pM。抗原結合蛋白與抗原或抗原決定基之特異性結合可以本身已知之任何適合方式測定，包 括例如本文所述之分析、史卡查分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)及夾層競爭分析，及此項技術中本身已知之其不同變化形式。
胺基酸殘基將根據標準三字母或單字母胺基酸碼來指示，如此項技術中一般已知且同意。當比較兩個胺基酸序列時，術語「胺基酸差異」係指與第二序列相比在參考序列之某一位置指定數目之胺基酸殘基之插入、缺失或取代。在取代之情況下，該(等)取代較佳將為保守性胺基酸取代，此意謂胺基酸殘基經具有類似化學結構且對多肽之功能、活性或其他生物性質具有極小影響或基本上無影響之另一胺基酸殘基置換。該等保守性胺基酸取代為此項技術所熟知，例如自WO1998/49185已知，其中保守性胺基酸取代較佳為以下各組(i)-(v)中之一個胺基酸經同一組中之另一胺基酸殘基取代：(i)小脂族、非極性或輕微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)極性、帶負電殘基及其(不帶電)醯胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)極性、帶正電殘基：His、Arg及Lys；(iv)大脂族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族殘基：Phe、Tyr及Trp。尤其較佳之保守性胺基酸取代如下：Ala變為Gly或變為Ser；Arg變為Lys；Asn變為Gln或變為His；Asp變為Glu；Cys變為Ser；Gln變為Asn；Glu變為Asp；Gly變為Ala或變為Pro；His變為Asn或變為Gln；Ile變為Leu或變為Val；Leu變為Ile或變為Val；Lys變為Arg、變為Gln或變為 Glu；Met變為Leu、變為Tyr或變為Ile；Phe變為Met、變為Leu或變為Tyr；Ser變為Thr；Thr變為Ser；Trp變為Tyr；Tyr變為Trp或變為Phe；Val變為Ile或變為Leu。
多肽或核酸分子視為「(呈)基本上分離(形式)」，例如與其天然生物來源及/或獲得其之反應介質或培養基相比，當其已與在該來源或培養基中其通常所締合之至少一種其他組分(諸如另一蛋白質/多肽、另一核酸、另一生物組分或大分子或至少一種污染物、雜質或次要組分)分離時。詳言之，當多肽或核酸分子純化至少2倍，尤其至少10倍，更尤其至少100倍，且至多1000倍或更多時，其視為「基本上分離」。「呈基本上分離形式」之多肽或核酸分子較佳為基本上均質的，如使用適合之技術所測定，諸如適合之層析技術，諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳。
兩個VEGF結合分子序列之間或兩個Ang2結合分子序列之間的「序列一致性」指示該等序列之間一致的胺基酸百分比。其可如WO2008/020079之第49頁及第50頁的段落f)中所述計算或測定。「序列相似性」指示一致或表示保守性胺基酸取代之胺基酸百分比。
此項技術已知對VH域之胺基酸殘基編號的替代性方法，該等方法亦可以類似方式應用於VHH域。然而，在本發明描述、申請專利範圍及圖中，除非另外指示，否則將按照根據Kabat且如上文所述應用於VHH域之編號。
「親和力成熟」VEGF結合分子或Ang2結合分子、尤其VHH或域抗體在一或多個CDR中具有一或多個變化，其使 得與各別親本VEGF結合分子或Ang2結合分子相比對於VEGF或Ang2之親和力得到改良。本發明之親和力成熟VEGF結合分子或Ang2結合分子可藉由此項技術中已知之方法來製備，例如如以下文獻所述：Marks等人，1992,Biotechnology 10：779-783，或Barbas等人，1994,Proc.Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995,Gene 169：147-155；Yelton等人，1995,Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins,「Affinity maturation of antibodies using phage display」,Oxford University Press 1996。
對於本發明，若未另外規定，則「SEQ ID NO：x之胺基酸序列」：包括與各別SEQ ID NO：x所示之序列100%一致的胺基酸序列；a)與各別SEQ ID NO：x所示之序列具有至少80%胺基酸一致性之胺基酸序列；b)與各別SEQ ID NO：x所示之序列具有3、2或1個胺基酸差異之胺基酸序列。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常以不受調控之細胞生長/增殖為特徵之生理學病狀。待用本發明之雙特異性結合分子治療之癌症的實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。如US 2008/0014196中提出用VEGF拮抗劑治療的癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺 癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、腸胃癌、胰臟癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤及各種類型之頭頸部癌。血管生成之失調可導致許多病症，其可由本發明之組合物及方法治療。此等病症包括非贅生性病狀與贅生性病狀。贅生病包括(但不限於)上述各者。
如US2008/0014196中提出用VEGF拮抗劑治療的非贅生性病症包括(但不限於)不當或異常肥大、關節炎、類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬、牛皮癬性斑、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性及其他增生性視網膜病(包括早產兒視網膜病)、晶狀體後纖維組織增生、新生血管性青光眼、年齡相關黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥反應、視網膜/脈絡膜新血管生成、角新血管生成(虹膜紅變)、眼睛新生血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括格雷氏病(Grave's disease))、角膜及其他組織移植、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺動脈高壓、惡性肺積液、腦水腫(例如與急性中風/閉合性頭部損傷/創傷相關)、滑液炎症、RA血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨關節炎(OA)、難治性腹水、多囊性卵巢病、子宮內膜異位症、第三間隙液疾病(胰腺炎、間 隔室症候群、灼傷、腸病)、子宮肌瘤、早產、諸如IBD(克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎)之慢性炎症、腎同種異體移植排斥反應、發炎性腸病、腎病症候群、不當或異常組織大量生長(非癌症)、嗜血性關節、肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、奧-偉二氏症候群(Osier-Weber syndrome)、膿性肉芽腫、晶狀體後纖維組織增生、硬皮病、沙眼、血管黏著、滑膜炎、皮膚炎、子癇前期、腹水、心包積液(諸如與心包炎相關者)及肋膜積液。
在第一態樣中，本發明係關於一種包含至少一個Ang2結合組分及至少一個VEGF結合組分之雙特異性結合分子。
在一較佳實施例中，本發明係關於一種包含至少一個VEGF結合組分及至少一個Ang2結合組分之雙特異性結合分子，其進一步包含至少另一結合組分，較佳血清白蛋白結合組分(血清白蛋白結合分子)。
在一較佳實施例中，本發明之結合分子的血清白蛋白結合組分為經分離之免疫球蛋白單可變域或含有該等免疫球蛋白單可變域中之一或多者的多肽，其中該免疫球蛋白單可變域由四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區組成，且其中該CDR3具有選自SEQ ID NO：257、260、263、266、269、272或275所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
更佳地，血清白蛋白結合組分之該一或多個免疫球蛋白單可變域含有 a. CDR3，其具有選自SEQ ID NO：257、260、263、266、269、272或275所示之第一組胺基酸序列的胺基酸序列；b. CDR1，其具有選自SEQ ID NO：255、258、261、264、267、270或273所示之第二組胺基酸序列的胺基酸序列；c. CDR2，其具有選自SEQ ID NO：256、259、262、265、268、271或274所示之第二組胺基酸序列的胺基酸序列。
在一更佳實施例中，血清白蛋白結合組分之該一或多個免疫球蛋白單可變域為VHH，較佳具有SEQ ID NO：98或254所示之胺基酸序列。
根據較佳實施例，該Ang2結合組分及該VEGF結合組分分別包含至少一個結合Ang2之免疫球蛋白單可變域及至少一個結合VEGF之免疫球蛋白單可變域。
在一較佳態樣中，該Ang2結合組分及該VEGF結合組分各分別包含至少一個結合VEGF之免疫球蛋白單可變域及至少一個結合Ang2之免疫球蛋白單可變域，其中該等免疫球蛋白單可變域各具有四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區。
因此，本發明之雙特異性結合分子中所含的抗Ang2及/或抗VEGF組分可分別包括兩個(或兩個以上)抗Ang2(或抗VEGF)免疫球蛋白單可變域，其中該免疫球蛋白單可變域係針對Ang2(或VEGF)目標中之不同抗原決定基。因此，雙特異性結合分子中之兩個免疫球蛋白單可變域將具有不 同抗原特異性且因此具有不同CDR序列。
該等二價結合分子分別亦稱為「雙互補位單域抗體構築體」(若免疫球蛋白單可變域由單域抗體組成或基本上由其組成)或「雙互補位VHH構築體」(若免疫球蛋白單可變域由VHH組成或基本上由其組成)，因為兩個免疫球蛋白單可變域將包括兩個不同互補位。
在本發明之雙特異性結合分子中，結合分子中之一者或兩者可為二價的；例如VEGF結合組分可為雙互補位的且Ang2結合組分可為一個免疫球蛋白單可變域，或VEGF結合組分可為一個免疫球蛋白單可變域且Ang2結合組分可為雙互補位的。
在本發明之雙特異性結合分子中，VEGF結合組分較佳含有結合VEGF之二價免疫球蛋白單可變域，例如雙互補位VHH。
該結合VEGF之免疫球蛋白單可變域可為兩個或兩個以上結合VEGF之VHH，其為a.相同VHH，其能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用或b.不同VHH，其結合VEGF之不重疊抗原決定基，其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用且其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷該相互作用。
VEGF結合組分至少包含具有四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區的可變域，其中該 CDR3具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr，其中位置5之Xaa為Gly或Ala；位置7之Xaa為Ser或Gly；位置12之Xaa為Gly、Ala或Pro；位置13之Xaa為Asp或Gly；位置16之Xaa為Asp或Glu；且其中該VEGF結合組分能夠以60%之抑制率阻斷人類重組VEGF165與人類重組VEGFR-2之相互作用。
根據較佳實施例，位置5之Xaa為Gly，位置7之Xaa為Ser，位置12之Xaa為Ala，且位置13之Xaa為Asp。
詳言之，該CDR3具有選自以下之序列：SEQ ID NO：2 SRAYGSSRLRLGDTYDY；SEQ ID NO：3 SRAYGSSRLRLADTYDY；SEQ ID NO：4 SRAYGSSRLRLADTYEY；SEQ ID NO：5 SRAYGSGRLRLADTYDY；SEQ ID NO：6 SRAYASSRLRLADTYDY；SEQ ID NO：7 SRAYGSSRLRLPDTYDY；SEQ ID NO：8 SRAYGSSRLRLPGTYDY。
根據某些實施例，VEGF結合組分包含一或多個免疫球蛋白單可變域，其各含有a. CDR3，其具有選自SEQ ID NO：2至8所示之第一組序列的胺基酸序列； b. CDR1及CDR2，其具有如表3中所指示含於選自SEQ ID NO：9至46所示之第二組胺基酸序列的序列中之胺基酸序列，其中該第二序列含有根據a)選擇之各別CDR3。
根據較佳實施例，免疫球蛋白單可變域為VHH。
根據特定實施例，VHH具有選自SEQ ID NO：9-46所示之序列的胺基酸序列。
根據另一特定實施例，VHH具有選自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：25之胺基酸序列。
本發明亦關於藉由上文所定義之VHH的親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之VEGF結合組分，例如藉由具有SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列的VHH之序列最佳化所獲得之VHH。實例為具有選自SEQ ID NO：47-57所示之序列的胺基酸序列之VHH。
根據某些實施例，本發明之VEGF結合域可如本文所定義經格式化，例如其可為雙互補位的或包含兩個相同免疫球蛋白單可變域。該等VEGF結合組分可包含兩個或兩個以上VHH，其為a)相同VHH，其能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用或b)不同VHH，其結合VEGF之不重疊抗原決定基，其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用且其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷該相互作用。以60%或60%之抑制率阻斷該相互作用的百分比分別 係指如藉由如實例中所用之增強型發光近接勻相分析(AlphaScreen®)、競爭ELISA、基於電漿子共振(SPR)之分析(Biacore®)所測定之抑制率。
在下文中，根據a)之VHH的能力亦稱為「受體阻斷性」，而根據b)之VHH的能力亦稱為「非受體阻斷性」。
較佳地，受體阻斷性VHH之抑制率80%、更佳90%；最佳VHH為完全受體阻斷劑，亦即抑制率為100%。
VEGF結合組分可含有兩個或兩個以上相同VHH a)，其選自具有SEQ ID NO：9-46所示之胺基酸序列的VHH或藉由該VHH之親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之VHH。VHH可選自具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：47-57所示之胺基酸的VHH。
根據較佳實施例，格式化VEGF結合組分包含兩個各具有SEQ ID NO：57所示之胺基酸序列的VHH。
在包含兩個不同VHH之格式化VEGF結合組分中，a)抑制率60%之該一或多個VHH係選自i.具有選自SEQ ID NO：9-46所示之胺基酸序列的胺基酸序列之VHH或ii.藉由該等VHH之親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之VHH，且其中b)抑制率60%之該一或多個VHH係選自i. SEQ ID NO：58-124或ii.藉由該VHH之親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之VHH。
根據較佳實施例，兩個VHH含於具有SEQ ID NO：128-168所示之胺基酸序列的多肽中，由如表15中所指示之連接子序列分隔。
在較佳VEGF結合組分中，VHH a)i.具有SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列且VHH b)i.具有SEQ ID NO：64所示之胺基酸序列。
在其他較佳VEGF結合組分中，根據a)ii.之VHH選自具有SEQ ID NO：47-57所示之胺基酸序列的VHH且根據b)ii.之VHH選自具有SEQ ID NO：125-127所示之胺基酸序列的VHH。
尤其較佳為包含兩個VHH之雙互補位VEGF結合組分，其中之一者具有SEQ ID NO：57所示之胺基酸且其中之一者具有SEQ ID NO：127所示之胺基酸。
Ang2結合組分至少包含具有四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區的可變域，其中該CDR3具有選自SEQ ID NO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
在第二態樣中，該Ang2結合組分為經分離之免疫球蛋白單可變域或含有該等免疫球蛋白單可變域中之一或多者的多肽，其中該免疫球蛋白單可變域由四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區組成，且其中該CDR3具有選自SEQ ID NO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示之胺基酸序列的胺基酸序 列。
在另一態樣中，Ang2結合組分之該免疫球蛋白單可變域含有a. CDR3，其具有選自SEQ ID NO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253(亦參見表49)所示之第一組胺基酸序列的胺基酸序列；b. CDR1，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A中所指示作為部分序列含於選自SEQ ID NO：224、227、230、233、236、239、242、245、248或251(亦參見表49)所示之第二組胺基酸序列的序列中之胺基酸序列；c. CDR2，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A中所指示作為部分序列含於選自SEQ ID NO：225、228、231、234、237、240、243、246、249或252(亦參見表49)所示之第二組胺基酸序列的序列中之胺基酸序列。
較佳地，Ang2結合組分之免疫球蛋白單可變域為VHH，較佳具有選自SEQ ID NO：214、215、216、217、218、219、220、221、222或223所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
在另一較佳實施例中，Ang2結合組分之免疫球蛋白單可變域藉由如本文所述之免疫球蛋白單可變域的親和力成熟或人類化獲得。
類似地，本發明亦關於一種藉由如本文所述之Ang2結合組分之VHH的親和力成熟或人類化所獲得之VHH。
因此，本發明亦關於一種結合Ang2之VHH，其具有選自 SEQ ID NO：214、215、216、217、218、219、220、221、222或223所示之酸序列的胺基酸序列。
舉例而言，適合於親和力成熟之親本Ang2結合組分為具有SEQ ID NO：214、215、216、217、218或219所示之胺基酸序列的上述VHH。
因此，本發明亦關於藉由上文所定義之VHH的親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之Ang2結合分子，例如藉由具有SEQ ID NO：217、218、219、220、221、222或223所示之胺基酸序列之VHH的序列最佳化所獲得之VHH。用於產生在先VHH之「源」胺基酸序列如SEQ ID NO：214、215或216所示。又，此等胺基酸序列為可應用於本發明之結合分子中的適合之Ang2結合組分。
如本文所述，本發明之結合分子較佳包含至少一個血清白蛋白結合組分。因此，尤其較佳結合之分子具有至少一個VEGF結合組分、至少一個Ang2結合組分及至少一個血清白蛋白結合組分。此三個結合組分之次序可為任何可能的次序，諸如表36-B、38-B、40、41-B、42、43、45-B、46-A或47-A或圖20、23、27或30中所示之次序，例如VEGF結合組分、Ang2結合組分或血清白蛋白結合組分可處於N端或C端。應注意，如上述各表及圖之圖例中所提及的「1D01」(SEQ ID No：214)、「11B07」、「00027」(SEQ ID No：216)、「00908」、「7G08」(SEQ ID No：215)、「00919」、「00921」(SEQ ID No：220)、「00928」(SEQ ID No：221)、「00932」、「00933」、「00934」、「00935」、 「00936」、「00937」、「00938」(SEQ ID No：222)或「00956」(SEQ ID No：223)表示Ang2結合組分，而「00038」表示VEGF結合組分且「ALB11」表示血清白蛋白結合組分。其均不應解釋為特定序列，但一般而言，當在本發明之結合分子的可能設置情形下使用時，表示Ang2結合組分、VEGF結合組分及血清白蛋白結合組分。
然而，較佳地，血清白蛋白結合組分位於VEGF結合組分與Ang2結合組分之間(或反之亦然)，而尤其較佳地，至少一個VEGF結合組分處於N端，隨後為至少一個血清白蛋白結合組分，隨後為C端之至少一個Ang2結合組分。此設置顯示特別適用。
因此，在一較佳態樣中，本發明係關於包含至少一個VEGF結合組分、至少一個Ang2結合組分及至少一個血清白蛋白結合組分的結合分子，其具有選自SEQ ID NO：180-213所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
當本文中使用時，「至少一個」結合組分(VEGF、Ang2或血清白蛋白)包括本發明之結合分子可含有一個、兩個、三個、四個或五個VEGF結合組分、Ang2結合組分及/或血清白蛋白結合組分(亦即實體/單元)，其較佳由如本文所述之免疫球蛋白單可變域表示。
鑒於治療性應用性質得以改良，例如親和力增強或免疫原性降低之VEGF結合組分及/或Ang2結合組分可藉由諸如以下之此項技術中已知之技術自本發明之個別VEGF結合組分或Ang2結合組分獲得：親和力成熟(例如以合成、隨 機或天然存在的免疫球蛋白序列為起始物)、CDR移植、人類化、組合源自不同免疫球蛋白序列之片段、使用重疊引子之PCR組裝及熟習此項技術者熟知之工程改造免疫球蛋白序列的類似技術；或上述任一者之任何適合組合，亦稱為如上文所述之「序列最佳化」。例如參考標準手冊，以及其他描述及實例。
適當時，親和力增加之本發明之VEGF結合組分或Ang2結合組分可藉由另一VEGF結合組分或Ang2結合組分之親和力成熟來獲得，後者相對於親和力成熟分子為「親本」VEGF結合組分。
在以EVQ開始之本發明之VEGF或Ang2 VHH中，N端E可經D置換(其通常為序列最佳化之結果)或其可丟失(對於VHH在大腸桿菌中表現)。對於格式化VEGF結合組分，此通常僅應用於位於N端之VHH。
屬於103 P,R,S組及/或GLEW組(如下文所定義)之對於VEGF VHH域之較佳但非限制性的人類化取代為108Q取代為108L。使免疫球蛋白單可變域人類化之方法為此項技術所已知。
根據另一實施例，免疫球蛋白單可變域為如本文所定義之域抗體。
在另一實施例中，本發明之結合VEGF及/或Ang2之免疫球蛋白單可變域類別中的代表性實例具有對應於天然存在VH域之胺基酸序列的胺基酸序列，其已經「駱駝化」，亦即藉由用存在於重鏈抗體之VHH域中的相應位置之一或多 個胺基酸殘基置換來自習知4鏈抗體之天然存在可變重鏈之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基。此可以熟習此項技術者所清楚的本身已知之方式進行，且另外參考WO1994/04678。該駱駝化可優先在存在於VH-VL界面及所謂駱駝科(Camelidae)標誌性殘基處之胺基酸位置進行(亦參見例如WO1994/04678)。該等「人類化」及「駱駝化」技術及與其一致之較佳構架區序列的詳細描述可另外得自例如WO2006/040153之第46頁及第98頁及WO2006/122786之第107頁。
本發明之VEGF結合組分(例如免疫球蛋白單可變域)對VEGF具有特異性，因為其包含特異性結合VEGF分子中之一或多個抗原決定基的一或多個免疫球蛋白單可變域。本發明之Ang2結合組分亦如此。
VEGF結合組分與其抗原VEGF之特異性結合可以本身已知之任何適合方式來測定，包括例如本文所述之分析、史卡查分析及/或競爭性結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夾層競爭分析，及此項技術中本身已知之其不同變化形式。Ang2結合組分當結合其抗原時亦如此。
關於抗原VEGF，本發明之VEGF結合組分(例如免疫球蛋白單可變域)在物種方面不受限制。因此，若欲用於人類治療性目的，則本發明之免疫球蛋白單可變域較佳結合人類VEGF。然而，結合來自另一哺乳動物物種之VEGF的免疫球蛋白單可變域亦在本發明之範疇內。結合一個物種 形式之VEGF的本發明之免疫球蛋白單可變域可與來自一或多個其他物種之具有不同於人類VEGF的序列之VEGF交叉反應。舉例而言，結合人類VEGF之本發明之免疫球蛋白單可變域可展現與來自一或多個其他物種之靈長類動物的VEGF及/或與來自一或多個物種之動物的VEGF之交叉反應性，該一或多個物種之動物用於疾病動物模型(例如猴、小鼠、大鼠、兔、豬、狗)中且尤其在與VEGF介導之對血管生成的作用相關之疾病及病症動物模型中(諸如本文所提及之物種及動物模型)。顯示該交叉反應性之本發明之免疫球蛋白單可變域適於研究及/或藥物開發，因為其允許在公認疾病模型(諸如猴，尤其食蟹獼猴或恆河猴，或小鼠及大鼠)中測試本發明之免疫球蛋白單可變域。
較佳地，鑒於與來自除人類外欲在開發治療性VEGF拮抗劑期間用作動物模型之物種的一或多個VEGF分子之交叉反應性，VEGF結合組分識別所關注之VEGF中與人類VEGF具有高度一致性之區域中的抗原決定基。
本發明之免疫球蛋白單可變域識別完全或部分位於VEGF中與結合其受體(尤其VEGFR-2)有關之區域中的抗原決定基，已顯示該受體為活化與腫瘤之新血管生成有因果關係的受體。根據較佳態樣，本發明之免疫球蛋白單可變域至少部分、較佳實質上且最佳完全阻斷VEGF受體活化、尤其VEGFR-2活化。
如上文所述，VEGF結合組分阻斷VEGF與其受體、尤其 VEGFR-2之間的相互作用之能力可藉由如實例中所述之增強型發光近接勻相分析(AlphaScreen®)、競爭ELISA或基於電漿子共振(SPR)之分析(Biacore®)來測定。
較佳地，本發明之免疫球蛋白單可變域結合VEGF之親和力小於500 nM，較佳小於200 nM，更佳小於10 nM，諸如小於500 pM(如藉由如實例5.7中所述之表面電漿子共振分析所測定)。本發明之免疫球蛋白單可變域結合血管生成素亦如此。
較佳地，本發明之免疫球蛋白單可變域在如實例5.1.中所述之競爭ELISA分析中所量測的IC50值在10-6至10-10莫耳/公升或更小之範圍內，更佳在10-8至10-10莫耳/公升或更小之範圍內且甚至更佳在10-9至10-10莫耳/公升或更小之範圍內。
根據本發明之一非限制性但較佳之實施例，本發明之結合VEGF之免疫球蛋白單可變域結合VEGF的解離常數(KD)為10-5至10-12莫耳/公升(M)或更小，且較佳為10-7至10-12莫耳/公升(M)或更小且更佳為10-8至10-12莫耳/公升(M)，及/或締合常數(KA)為至少107 M-1，較佳為至少108 M-1，更佳為至少109 M-1，諸如至少1012 M-1；且尤其KD小於500 nM，較佳小於200 nM，更佳小於10 nM，諸如小於500 pM。可測定本發明之免疫球蛋白單可變域針對VEGF的KD及KA值。本發明之結合Ang2之免疫球蛋白單可變域亦如此。
包含兩個或兩個以上免疫球蛋白單可變域之雙互補位 VEGF結合組分基本上由以下組成或包含以下：(i)特異性結合VEGF之第一抗原決定基的第一免疫球蛋白單可變域及(ii)特異性結合VEGF之第二抗原決定基的第二免疫球蛋白單可變域，其中VEGF之第一抗原決定基及VEGF之第二抗原決定基不為相同抗原決定基。換言之，本發明之該多肽包含針對VEGF中存在之至少兩個不重疊抗原決定基之兩個或兩個以上免疫球蛋白單可變域或基本上由其組成，其中該等免疫球蛋白單可變域以使其能夠同時結合VEGF之方式彼此連接。在此意義上，本發明之多肽亦可視為「二價」或「多價」免疫球蛋白構築體，且尤其視為「多價免疫球蛋白單可變域構築體」，因為多肽含有針對VEGF之至少兩個結合位點。(該等構築體亦稱為「格式化」VEGF結合分子，例如「格式化」VHH)。雙互補位Ang2結合組分亦如此，加以必要的變更。
本發明之該VEGF結合組分或Ang2結合組分分別包括(至少)兩個抗VEGF或抗Ang2免疫球蛋白單可變域，其中(該)兩個免疫球蛋白單可變域分別較佳針對VEGF分子或血管生成素分子中之不重疊抗原決定基。因此，此兩個免疫球蛋白單可變域將具有不同抗原特異性且因此具有不同CDR序列。為此，本發明之該等多肽在本文中亦將分別稱為「雙互補位多肽」或「雙互補位域抗體構築體」(若免疫球蛋白單可變域由域抗體組成或基本上由其組成)或「雙互補位VHH構築體」(若免疫球蛋白單可變域由VHH組成或基本上由其組成)，因為兩個免疫球蛋白單可變域將包 括兩個不同互補位。
若本發明之多肽為如本文所定義之雙互補位分子，則至少一個免疫球蛋白單可變域組分結合抗原決定基以使得重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用以80%之抑制率受到阻斷。如本發明之實驗中已展示，某些格式化分子含有兩個皆以80%之抑制率阻斷VEGFR2受體之VHH。本發明之某些VHH以100%之抑制率阻斷VEGFR-2，亦即其為完全阻斷劑。
在兩種情況下，其他序列及部分可存在於本發明之VEGF結合組分中，例如N端、C端或位於兩個免疫球蛋白單可變域之間，例如連接子序列及提供效應功能之序列，如本文更詳細闡述。
根據另一(儘管次佳)實施例，本發明之VEGF結合組分可包括兩個以上抗VEGF免疫球蛋白單可變域，亦即三個、四個或甚至更多抗VEGF VHH。在此情況下，至少兩個抗VEGF免疫球蛋白單可變域係針對VEGF分子中之不重疊抗原決定基，其中任何其他免疫球蛋白單可變域可結合兩個不重疊抗原決定基中之任一者及/或VEGF分子中存在之另一抗原決定基。
根據本發明，兩個或兩個以上免疫球蛋白單可變域可彼此獨立地為VHH或域抗體，及/或如本文所定義之任何其他類別的免疫球蛋白單可變域(諸如VL域)，其限制條件為此等免疫球蛋白單可變域將分別結合抗原，亦即VEGF或血管生成素。
主要針對VEGF結合組分提供結合組分之詳細描述。然而，本文對於VEGF結合組分所概述之所有特點及選擇在加以必要的變更的情況下亦等同地適用於Ang2結合組分。
根據較佳實施例，存在於雙特異性結合分子中之結合分子(Ang2結合組分中之Ang2結合分子或VEGF結合組分中之VEGF結合分子或兩個相鄰Ang2結合組分及VEGF結合組分)可直接(亦即不使用連接子)或經由連接子彼此連接。該連接子較佳為連接肽且將經選擇以使得兩個不同結合分子結合目標之不重疊抗原決定基的每一者，該等抗原決定基位於同一個目標分子中或兩個不同分子中。
在雙互補位結合分子之情況下，Ang2結合組分或VEGF結合組分中之連接子的選擇將尤其視抗原決定基且尤其免疫球蛋白單可變域所結合之目標上的抗原決定基之間的距離而定，且熟習此項技術者基於本文揭示內容，視情況在有限程度之常規實驗後將清楚。
兩個結合分子(兩個VHH或域抗體或VHH及域抗體)或兩個結合組分可分別經由另一VHH或域抗體彼此連接(在該等結合分子中，兩個或兩個以上免疫球蛋白單可變域可直接連接於該另一免疫球蛋白單可變域或經由適合之連接子連接)。該另一VHH或域抗體可例如為使得半衰期延長之VHH或域抗體。舉例而言，後一VHH或域抗體可為能夠結合(人類)血清蛋白(諸如(人類)血清白蛋白或(人類)轉鐵蛋白)之VHH或域抗體。
或者，結合各別目標之兩個或兩個以上免疫球蛋白單可 變域可串聯連接(直接或經由適合之連接子)且另一VHH或域抗體(其可使得半衰期延長)可直接或經由連接子連接於此兩個或兩個以上上述免疫球蛋白序列中之一者。
適合之連接子在本文中結合本發明之特定多肽加以描述且可例如(但不限於)包含胺基酸序列，該胺基酸序列之長度較佳為9個或9個以上胺基酸，更佳為至少17個胺基酸，諸如約20至40個胺基酸。然而，上限並非關鍵，只是出於例如該等多肽之生物藥物生產方便的原因而選擇。
連接子序列可為天然存在之序列或非天然存在之序列。若用於治療性目的，則連接子較佳在投與本發明之雙特異性結合分子的個體體內無免疫原性。
一組適用之連接子序列為如WO1996/34103及WO1994/04678中所述之源自重鏈抗體之鉸鏈區的連接子。
其他實例為聚-丙胺酸連接子序列，諸如Ala-Ala-Ala。
連接子序列之其他較佳實例為具有不同長度之Gly/Ser連接子，諸如(glyxsery)z連接子，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3及(gly3ser2)3。
連接子之一些非限制性實例含於表15(SEQ ID NO 128-168)中所示之本發明之雙特異性結合分子中，例如以下連接子：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(35GS；SEQ ID NO：169)；GGGGSGGGS(9GS；SEQ ID NO：170)；GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGS(40GS；SEQ ID NO：171)。
若藉由連接聚合物(例如聚乙二醇PEG(聚乙二醇)部分)來修飾本發明之格式化雙特異性結合分子，則連接子序列較佳包括諸如半胱胺酸或離胺酸之胺基酸殘基，從而允許連接區中發生該修飾(例如聚乙二醇化)。
適用於聚乙二醇化之連接子的實例為：GGGGCGGGS(「GS9,C5」，SEQ ID NO：172)；GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(「GS25,C5」，SEQ ID NO：173)，GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG(「GS27,C14」，SEQ ID NO：174)，GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(「GS35,C15」，SEQ ID NO：175)，及GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(「GS35,C5」，SEQ ID NO：176)。
此外，連接子亦可為聚(乙二醇)部分，如例如WO2004/081026中所示。
在另一實施例中，免疫球蛋白單可變域經由另一部分(視情況經由一或兩個連接子)彼此連接，諸如另一多肽，在一較佳但非限制性實施例中，其可為如上文所述之另一免疫球蛋白單可變域。該部分可基本上無活性或可具有生物作用，諸如改良多肽之所需性質或可賦予多肽以一或多種其他所需性質。舉例而言，但不加以限制，該部分可改良蛋白質或多肽之半衰期，及/或可降低其免疫原性或改 良任何其他所需性質。
根據一較佳實施例，本發明之雙特異性結合分子尤其在欲用作或用作治療劑時包括可延長本發明之多肽在患者之血清或其他體液中的半衰期之部分。術語「半衰期」定義為活體內(經修飾)多肽之血清濃度例如因多肽降解及/或藉由天然機制清除及/或螯合而降低50%所用之時間。
更特定言之，該半衰期延長部分可共價連接於免疫球蛋白單可變域或與其融合且可為(但不限於)Fc部分、白蛋白部分、白蛋白部分之片段、白蛋白結合部分(諸如抗白蛋白免疫球蛋白單可變域)、轉鐵蛋白結合部分(諸如抗轉鐵蛋白免疫球蛋白單可變域)、聚氧伸烷基分子(諸如聚乙二醇分子)、白蛋白結合肽或羥乙基澱粉(HES)衍生物。
在另一實施例中，本發明之雙特異性結合分子包含結合血液中存在之抗原的部分，藉此賦予所得本發明之多肽以延長之活體內半衰期，該等抗原諸如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、血纖維蛋白原或轉鐵蛋白。根據一特別較佳實施例，該部分為結合白蛋白之免疫球蛋白且尤其較佳為結合白蛋白之免疫球蛋白單可變域，諸如結合白蛋白之VHH域。
若欲用於人類用途，則該結合白蛋白之免疫球蛋白單可變域較佳結合人類血清白蛋白且較佳為結合白蛋白之人類化VHH域。
結合人類血清白蛋白之免疫球蛋白單可變域為此項技術所已知且更詳細描述於例如WO2006/122786中。具體而 言，適用的結合白蛋白之VHH為ALB 1及其人類化對應物，ALB 8(WO2009/095489)。然而，亦可使用以上專利公開案中所提及之其他結合白蛋白之VHH域。
特定適用的結合白蛋白之VHH域為ALB 8，其由SEQ ID NO：98或254所示之胺基酸序列組成或含有該胺基酸序列。
根據本發明之另一實施例，較佳在VHH中，兩個免疫球蛋白單可變域可與血清白蛋白分子融合，諸如例如WO2001/79271及WO2003/59934中所述。如例如WO2001/79271中所述，融合蛋白可藉由習知重組技術獲得：將編碼血清白蛋白之DNA分子或其片段連接於編碼雙特異性結合分子之DNA，將所獲得之構築體插入適合於在所選宿主細胞(例如酵母細胞，如甲醇酵母(Pichia pastoris)，或細菌細胞)中表現之質體中，接著用融合之核苷酸序列轉染宿主細胞並在適合之條件下生長。適用HSA之序列如SEQ ID NO：99所示。
根據另一實施例，本發明之多肽的半衰期延長修飾(該修飾亦降低多肽之免疫原性)包含連接適合之藥理學上可接受之聚合物，諸如線性或分枝聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(諸如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般，可使用任何適合形式之聚乙二醇化，諸如此項技術中用於抗體及抗體片段(包括(但不限於)域抗體及scFv)之聚乙二醇化；例如參考：Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese及Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456 (2003)；Harris及Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.2(2003)；及WO2004/060965。
使多肽聚乙二醇化之各種試劑亦可購得，例如購自Nektar Therapeutics,USA，或NOF Corporation,Japan，諸如Sunbright® EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，諸如Sunbright® ME-100MA、Sunbright® ME-200MA及Sunbright® ME-400MA。
較佳地，使用定點聚乙二醇化，尤其經由半胱胺酸殘基(參見例如Yang等人，Protein Engineering 16,761-770(2003))。舉例而言，出於此目的，PEG可連接於天然存在於本發明之多肽中的半胱胺酸殘基，本發明之多肽可經修飾以適當地引入一或多個半胱胺酸殘基以供連接PEG，或包含一或多個半胱胺酸殘基以供連接PEG的胺基酸序列可與本發明之多肽的N端及/或C端融合，均使用熟習此項技術者本身已知之蛋白質工程改造技術。
較佳地，對於本發明之多肽，所用PEG之分子量大於5 kDa、諸如大於10 kDa且小於200 kDa、諸如小於100 kDa；例如在20 kDa至80 kDa之範圍內。
關於聚乙二醇化，應注意本發明一般亦涵蓋已在一或多個胺基酸位置較佳以使得達成如下結果之方式經聚乙二醇化之任何雙特異性結合分子：該聚乙二醇化(1)延長活體內半衰期；(2)降低免疫原性；(3)提供對於聚乙二醇化本身已知之一或多種其他有益性質；(4)不本質上影響多肽對於其目標之親和力(例如不使該親和力降低超過50%，且更佳 不降低超過10%，如藉由此項技術中所述之適合分析所測定)；及/或(4)不影響本發明之雙特異性結合分子的任何其他所需性質。適合之PEG基團及以特異性或非特異性方式連接其之方法為熟習此項技術者所清楚。使多肽聚乙二醇化之各種試劑亦可購得，例如購自Nektar Therapeutics,USA，或NOF Corporation,Japan，諸如Sunbright® EA系列、SH系列、MA系列、CA系列及ME系列，諸如Sunbright® ME-100MA、Sunbright® ME-200MA及Sunbright® ME-400MA。
根據本發明之一尤其較佳實施例，本發明之聚乙二醇化多肽包括分子量為40 kDa或60 kDa之線性PEG的一個PEG部分，其中該PEG部分在連接區且特別在如下Cys殘基處連接於多肽：在如SEQ ID NO：93所示之GS9-連接肽的位置5、在如SEQ ID NO：95所示之GS27-連接肽的位置14、或在如SEQ ID NO：96所示之GS35-連接肽的位置15、或在如SEQ ID NO：97所示之35GS-連接肽的位置5。
本發明之雙特異性結合分子可用如上文所提及之PEG試劑中之一者進行聚乙二醇化，諸如如以下化學式所示之「Sunbright® ME-400MA」：
含有連接子及/或半衰期延長官能基之雙特異性結合分 子如SEQ ID NO：81及圖48中所示。
根據另一實施例，免疫球蛋白單可變域為如本文所定義之域抗體。
本發明之雙特異性結合分子中存在之免疫球蛋白單可變域亦可具有對應於天然存在VH域之胺基酸序列的序列，其已經「駱駝化」，亦即藉由用存在於重鏈抗體之VHH域中的相應位置之一或多個胺基酸殘基置換來自習知4鏈抗體之天然存在可變重鏈之胺基酸序列中的一或多個胺基酸殘基。此可以熟習此項技術者所清楚之本身已知之方式進行，且另外參考WO1994/04678。該駱駝化可優先在存在於VH-VL界面及所謂駱駝科標誌性殘基處之胺基酸位置進行(亦參見例如WO1994/04678)。該等「人類化」及「駱駝化」技術及與其一致之較佳構架區序列的詳細描述可另外得自例如WO2006/040153之第46頁及第98頁及WO2006/122786之第107頁。
結合組分分別對Ang2或VEGF具有特異性，因為在一較佳實施例中其包含分別特異性結合Ang2分子或VEGF分子中之一或多個抗原決定基的一或多個免疫球蛋白單可變域。
結合組分與其抗原Ang2或VEGF之特異性結合可以本身已知之任何適合方式來測定，包括例如本文所述之分析、史卡查分析及/或競爭性結合分析，諸如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA及ELISA)及夾層競爭分析，及此項技術中本身已知之其不同變化形式。
關於抗原Ang2或VEGF，免疫球蛋白單可變域在物種方面分別不受限制。因此，若欲用於人類治療性目的，則免疫球蛋白單可變域較佳分別結合人類Ang2或人類VEGF。然而，分別結合來自另一哺乳動物物種之Ang2或VEGF的免疫球蛋白單可變域或含有其之多肽亦在本發明之範疇內。結合一個物種形式之Ang2或VEGF的免疫球蛋白單可變域可與來自一或多個其他物種之各別抗原交叉反應。舉例而言，結合人類抗原之免疫球蛋白單可變域可展現與來自一或多個其他物種之靈長類動物的各別抗原及/或與來自一或多個物種之動物的抗原之交叉反應性，該一或多個物種之動物用於疾病動物模型(例如猴(尤其食蟹獼猴或恆河猴)、小鼠、大鼠、兔、豬、狗或)中且尤其在可藉由抑制Ang2來調節之疾病及病症動物模型中(諸如本文所提及之物種及動物模型)。顯示該交叉反應性之本發明之免疫球蛋白單可變域適於研究及/或藥物開發，因為其允許在公認疾病模型(諸如猴，尤其食蟹獼猴或恆河猴，或小鼠及大鼠)中測試本發明之免疫球蛋白單可變域。
又，抗原結合組分不限於其所針對之抗原的特定域或抗原決定子或由其定義。較佳地，鑒於與來自除人類外欲在開發治療性Ang2/VEGF拮抗劑期間用作動物模型之物種的一或多個抗原分子之交叉反應性，結合組分識別各別抗原之與人類抗原具有高度一致性之區域中的抗原決定基。舉例而言，鑒於使用小鼠模型，本發明之雙特異性結合分子中所含的抗Ang2免疫球蛋白單可變域識別完全或部分位於 Ang2之FLD-2域中的抗原決定基，其顯示人類與小鼠之間的高一致性。
較佳地，VEGF結合組分結合VEGF同功異型物VEGF165及/或VEGF121。
在另一態樣中，本發明係關於編碼本發明之雙特異性結合分子的核酸分子。該等核酸分子在本文中亦將稱為「本發明之核酸」且亦可呈如本文所定義之基因構築體形式。本發明之核酸可為基因組DNA、cDNA或合成DNA(諸如具有特別適用於在所欲宿主細胞或宿主生物體中表現之密碼子使用的DNA)。根據本發明之一個實施例，本發明之核酸呈如下文所定義之基本上經分離形式。
本發明之核酸亦可呈載體(例如質體、黏質體或YAC)形式，可存在於載體(例如質體、黏質體或YAC)中及/或可為載體(例如質體、黏質體或YAC)之一部分。載體可尤其為表現載體，亦即可使得雙特異性結合分子在活體外及/或活體內(亦即在適合之宿主細胞、宿主生物體及/或表現系統中)表現之載體。該表現載體一般包含可操作地連接於一或多種適合之調控元件的至少一種本發明之核酸，該等調控元件諸如啟動子、強化子、終止子及其類似物。鑒於特定序列在特定宿主中之表現，該等元件及其選擇為熟習此項技術者之常識。適用於表現本發明之雙特異性結合分子或為表現本發明之雙特異性結合分子所必需的調控元件及其他元件(諸如啟動子、強化子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報導基因及其類似物)之特定實 例例如揭示於WO2006/040153之第131頁至第133頁。
本發明之核酸可基於本文所提供之關於本發明多肽的胺基酸序列之資訊，以本身已知之方式(例如藉由自動DNA合成及/或重組DNA技術)製備或獲得，及/或可自適合之天然來源分離。
在另一態樣中，本發明係關於表現或能夠表現一或多種本發明之雙特異性結合分子的宿主細胞；及/或含有本發明之核酸的宿主細胞。根據一尤其較佳之實施例，該等宿主細胞為細菌細胞；其他適用細胞為酵母細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。
適合之細菌細胞包括來自以下之細胞：革蘭氏陰性(gram-negative)細菌菌株，諸如大腸桿菌(Escherichia coli)、變形桿菌屬(Proteus)及綠膿桿菌屬(Pseudomonas)之菌株；及革蘭氏陽性(gram-positive)細菌菌株，諸如芽胞桿菌屬(Bacillus)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)及乳球菌屬(Lactococcus)之菌株。適合之真菌細胞包括來自木黴屬(Trichoderma)、鏈孢黴屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)之物種的細胞。適合之酵母細胞包括來自酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如甲醇酵母(Pichia pastoris)及甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)之物種的細胞。
適合之哺乳動物細胞包括例如CHO細胞、BHK細胞、海拉細胞(HeLa cell)、COS細胞及其類似細胞。然而，亦可使用兩棲動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞及此項技術中用於表現異源蛋白質之任何其他細胞。
本發明進一步提供製造本發明之雙特異性結合分子的方法，該等方法一般包含以下步驟：-在允許本發明之雙特異性結合分子表現的條件下培養包含能夠編碼雙特異性結合分子之核酸的宿主細胞；及-自培養物回收或分離由該等宿主細胞表現之多肽；及-視情況進一步純化及/或修飾及/或調配本發明之雙特異性結合分子。
對於工業規模產生，較佳之宿主生物體包括大腸桿菌、甲醇酵母及釀酒酵母之菌株，其適合於大規模表現、產生及醱酵，且尤其適合於大規模藥物表現、產生及醱酵。
特定表現系統之選擇將部分地視某些轉譯後修飾、更尤其糖基化之要求而定。需要糖基化之本發明之雙特異性結合分子的產生將要求使用能夠使所表現之蛋白質糖基化的哺乳動物表現宿主。就此而言，熟習此項技術者應清楚，所獲得之糖基化模式(亦即所連接殘基之種類、數目及位置)將視用於表現之細胞或細胞株而定。
本發明之雙特異性結合分子可在細胞內在如上文所述之細胞內(例如在細胞溶質中、在胞間質中或在包涵體中)產生，接著自宿主細胞分離且視情況進一步純化；或其可在細胞外(例如在培養宿主細胞之培養基中)產生，接著自培 養基分離並視情況進一步純化。
用於重組產生多肽之方法及試劑為此項技術所已知，諸如特定適合之表現載體、轉型或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白質表現之方法、培養條件及其類似物。類似地，適用於製造本發明之多肽的方法中之蛋白質分離及純化技術為熟習此項技術者所熟知。
在另一態樣中，本發明係關於一種具有含於具有分別選自SEQ ID NO：9至57或SEQ ID NO：58-127所示之序列的胺基酸序列之抗VEGF-VHH中的CDR3之胺基酸序列的肽，及編碼該肽之核酸分子。
此等肽對應於源自本發明之VHH的CDR3。其，尤其編碼其之核酸分子適用於CDR移植以置換免疫球蛋白鏈中之CDR3，或適用於插入非免疫球蛋白骨架中，例如蛋白酶抑制劑、DNA結合蛋白、細胞色素b562、螺旋束蛋白、二硫鍵橋接肽、脂質運載蛋白或抗運載蛋白，由此賦予該骨架以目標結合性質。CDR移植方法為此項技術所熟知且已得到廣泛使用，例如用於使抗體人類化(其通常包含將來自齧齒動物抗體之CDR移植於人類抗體之Fv構架上)。
為獲得含有本發明之CDR3的免疫球蛋白或非免疫球蛋白骨架，編碼該分子之DNA可根據標準分子生物學方法獲得，例如藉由基因合成、藉由寡核苷酸黏接或藉助於重疊PCR片段，如例如Daugherty等人，1991,Nucleic Acids Research，第19卷，9,2471-2476所述。將VHH CDR3插入非免疫球蛋白骨架中之方法已由Nicaise等人，2004, Protein Science,13,1882-1891描述。
本發明進一步係關於一種產物或組合物，其含有或包含至少一種本發明之雙特異性結合分子及視情況存在之該等組合物的本身已知之一或多種其他組分，亦即視組合物之所欲用途而定。
對於藥物用途，本發明之雙特異性結合分子可調配為醫藥製劑或組合物，其包含至少一種本發明之雙特異性結合分子及至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑及/或佐劑，及視情況存在之一或多種其他醫藥活性多肽及/或化合物。藉助於非限制性實例，該調配物可呈適合於以下之形式：經口投藥、非經腸投藥(諸如藉由靜脈內、肌肉內或皮下注射或靜脈內輸注)、局部投藥、藉由吸入、藉由皮膚貼片、藉由植入物、藉由栓劑投藥等。該等適合之投藥形式(其可為固體、半固體或液體，視投藥方式而定)以及用於製備其之方法及載劑為熟習此項技術者所清楚且在本文中進一步描述。
因此，在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其含有至少一種雙特異性結合分子、尤其一種本發明之免疫球蛋白單可變域及至少一種適合之載劑、稀釋劑或賦形劑(亦即適合於藥物用途)，及視情況存在之一或多種其他活性物質。
本發明之雙特異性結合分子可以本身已知之任何適合方式調配及投與：尤其對於免疫球蛋白單可變域，例如參考WO2004/041862、WO2004/041863、WO2004/041865、 WO2004/041867及WO2008/020079，以及標準手冊，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company,USA(1990)，Remington,the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams and Wilkins(2005)；或Handbook of Therapeutic Antibodies (S.Dubel編)，Wiley,Weinheim,2007(參見例如第252-255頁)。
舉例而言，本發明之免疫球蛋白單可變域可以本身已知用於習知抗體及抗體片段(包括ScFv及雙功能抗體)及其他醫藥活性蛋白質之任何方式調配及投與。該等調配物及用於製備其之方法為熟習此項技術者所清楚，且例如包括適合於非經腸投藥(例如靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、管腔內、動脈內或鞘內投藥)或用於局部(亦即經皮或皮內)投藥之製劑。
用於非經腸投藥之製劑可例如為適合於輸注或注射之無菌溶液、懸浮液、分散液或乳液。適合於該等製劑之載劑或稀釋劑例如包括(但不限於)無菌水及醫藥學上可接受之水性緩衝液及溶液，諸如磷酸鹽緩衝生理鹽水或林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及亨克氏溶液(Hank's solution)；水油；甘油；乙醇；二醇，諸如丙二醇；以及礦物油、動物油及植物油，例如花生油、大豆油；以及適合之混合物。通常，水性溶液或懸浮液將為較佳。
因此，本發明之雙特異性結合分子可與醫藥學上可接受之媒劑(諸如惰性稀釋劑或可吸收可食用載劑)組合全身投 與，例如經口。對於經口治療性投藥，本發明之雙特異性結合分子可與一或多種賦形劑組合且以可攝取錠劑、頰內錠劑、糖衣錠、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片及其類似物之形式使用。該等組合物及製劑應含有至少0.1%本發明之結合分子。當然，其在組合物及製劑中之百分比可改變且宜為既定單位劑型重量的約2%至約60%。該等治療上適用之組合物中之本發明之雙特異性結合分子的量使得將獲得有效劑量。
錠劑、丸劑、膠囊及其類似物亦可含有黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑及甜味劑或芳香劑，例如WO2008/020079之第143-144頁所提及者。當單位劑型為膠囊時，除上述類型之物質外，其可含有液體載劑，諸如植物油或聚乙二醇。多種其他物質可以包衣形式存在或另外改變固體單位劑型之物理形式。舉例而言，錠劑、丸劑或膠囊可塗有明膠、蠟、蟲膠或糖及其類似物。糖漿或酏劑可含有本發明之結合分子、作為甜味劑之蔗糖或果糖、作為防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、染料及調味劑(諸如櫻桃或橙子調味劑)。當然，用於製備任何單位劑型之任何物質應為醫藥學上可接受的且在所用量下實質上無毒。另外，本發明之雙特異性結合分子可併入持續釋放製劑及裝置中。
用於經口投藥之製劑及調配物亦可具備腸溶衣，其將允許本發明之構築體抵抗胃環境並進入腸道。更一般而言，用於經口投藥之製劑及調配物可適當地調配用於傳遞至胃 腸道之任何所需部分。另外，適合之栓劑可用於傳遞至胃腸道中。
本發明之雙特異性結合分子亦可藉由輸注或注射經靜脈內或腹膜內投與，如WO2008/020079之第144及145頁進一步描述。
對於本發明之雙特異性結合分子的局部投藥，一般將需要將其與皮膚可接受之載劑組合以組合物或調配物形式投與皮膚，該載劑可為固體或液體，如WO2008/020079之第145頁進一步描述。
一般，本發明之雙特異性結合分子在液體組合物(諸如洗劑)中之濃度將為0.1-25重量%，較佳約0.5-10重量%。在半固體或固體組合物(諸如凝膠或散劑)中之濃度將為約0.1-5重量%，較佳約0.5-2.5重量%。
用於治療所需之本發明之雙特異性結合分子的量將不僅隨所選特定結合分子而變，而且隨投藥途徑、待治療之病狀性質及患者之年齡及情況而變，並最終將由主治醫師或臨床醫師酌定。又，本發明之結合分子的劑量視目標細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而變化。所需劑量宜以單次劑量或以適當時間間隔投與之分次劑量提供，例如每天兩次、三次、四次或四次以上次劑量。次劑量自身可進一步分成例如許多個別時間間隔較長之投藥；諸如自吹入器多次吸入或藉由將複數滴施用於眼中。
投藥方案可包括長期每天治療。「長期」意謂至少兩週且較佳數週、數月或數年之持續時間。在此劑量範圍內之 必要調節可由一般技術者僅使用本文教示所提供之常規實驗來判定。參見Remington's Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.第4版)，Mack Publishing Co.,Easton,PA。劑量亦可由個別醫師在任何併發症之情況下進行調整。
根據另一實施例，本發明係關於雙特異性結合分子(例如免疫球蛋白單可變域)用於治療性目的之用途，諸如- 用於預防、治療及/或減輕病症、疾病或病狀(尤其人類之病症、疾病或病狀)，該病症、疾病或病狀與VEGF介導及/或Ang2介導之對血管生成的作用相關或可藉由用本發明之雙特異性結合分子調節Notch信號傳導路徑及/或Tie2信號傳導路徑來預防、治療或減輕；- 用於需要該療法之患者的治療方法中，該方法包含向有需要之個體投與醫藥活性量之至少一種本發明之雙特異性結合分子(例如免疫球蛋白單可變域或含有其之醫藥組合物)；- 用於製備供預防、治療或減輕與VEGF介導及/或Ang2介導之對血管生成的作用相關之病症、疾病或病狀的藥劑；- 用作用於以上目的之醫藥組合物或藥劑中的活性成分。
根據一特定態樣，該病症、疾病或病狀為如本文所定義之癌症或癌性疾病。
根據另一態樣，疾病為與VEGF介導及/或Ang2介導之對血管生成的作用相關或可藉由用雙特異性結合分子調節Notch信號傳導路徑來治療或減輕之眼病。
視待治療之癌性疾病而定，本發明之雙特異性結合分子可單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用，該等治療劑尤其選自化學治療劑，如抑制癌細胞中之血管生成、信號轉導路徑或有絲分裂檢查點的DNA損傷劑或治療活性化合物。
其他治療劑可視情況作為同一醫藥製劑之組分與結合分子之投與同時投與，或在其投與之前或之後投與。
在某些實施例中，其他治療劑可為(但不限於)(且在受體情況下，包括各別配體)一或多種選自以下之群的抑制劑：EGFR、VEGFR、HER2-neu、Her3、AuroraA、AuroraB、PLK及PI3激酶、FGFR、PDGFR、Raf、Ras、KSP、PDK1、PTK2、IGF-R或IR之抑制劑。
其他治療劑之其他實例為CDK、Akt、src/bcr abl、cKit、cMet/HGF、c-Myc、Flt3、HSP90之抑制劑，刺蝟信號傳導路徑拮抗劑(hedgehog antagonist)，JAK/STAT、MEK、mTor、NFB、蛋白酶體、Rho之抑制劑，wnt信號傳導之抑制劑或泛素化路徑之抑制劑或Notch信號傳導路徑之另一抑制劑。
Aurora抑制劑之實例為(但不限於)PHA-739358、AZD-1152、AT 9283、CYC-116、R-763、VX-680、VX-667、MLN-8045、PF-3814735。
PLK抑制劑之一實例為GSK-461364。
raf抑制劑之實例為BAY-73-4506(亦為VEGFR抑制劑)、PLX 4032、RAF-265(另外亦為VEGFR抑制劑)、索拉非尼 (sorafenib)(另外亦為VEGFR抑制劑)及XL 281。
KSP抑制劑之實例為伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、GSK 246053A、GSK-923295、MK-0731及SB-743921。
src及/或bcr-abl抑制劑之實例為達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、博舒替尼(bosutinib)、XL 228(亦為IGF-1R抑制劑)、尼洛替尼(nilotinib)(亦為PDGFR及cKit抑制劑)、伊馬替尼(imatinib)(亦為cKit抑制劑)及NS-187。
PDK1抑制劑之一實例為BX-517。
Rho抑制劑之一實例為BA-210。
PI3激酶抑制劑之實例為PX-866、BEZ-235(亦為mTor抑制劑)、XL 418(亦為Akt抑制劑)、XL-147及XL 765(亦為mTor抑制劑)。
cMet或HGF之抑制劑的實例為XL-184(亦為VEGFR、cKit、Flt3之抑制劑)、PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦為VEGFR之抑制劑)、MGCD-265(亦為VEGFR、Ron、Tie2之抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102及AV-299。
c-Myc抑制劑之一實例為CX-3543。
Flt3抑制劑之實例為AC-220(亦為cKit及PDGFR之抑制劑)、KW 2449、來他替尼(lestaurtinib)(亦為VEGFR、PDGFR、PKC之抑制劑)、TG-101348(亦為JAK2之抑制劑)、XL-999(亦為cKit、FGFR、PDGFR及VEGFR之抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR及cKit之抑 制劑)及坦度替尼(tandutinib)(亦為PDGFR及cKit之抑制劑)。
HSP90抑制劑之實例為坦螺旋黴素(tanespimycin)、阿螺旋黴素(alvespimycin)、IPI-504及CNF 2024。
JAK/STAT抑制劑之實例為CYT-997(亦與微管蛋白相互作用)、TG 101348(亦為Flt3之抑制劑)及XL-019。
MEK抑制劑之實例為ARRY-142886、PD-325901、AZD-8330及XL 518。
mTor抑制劑之實例為替羅莫司(temsirolimus)、AP-23573(其亦充當VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus)(另外為VEGF抑制劑)、XL-765(亦為PI3激酶抑制劑)及BEZ-235(亦為PI3激酶抑制劑)。
Akt抑制劑之實例為哌立福新(perifosine)、GSK-690693、RX-0201及曲西立濱(triciribine)。
cKit抑制劑之實例為AB-1010、OSI-930(亦充當VEGFR抑制劑)、AC-220(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑)、坦度替尼(亦為Flt3及PDGFR之抑制劑)、阿西替尼(axitinib)(亦為VEGFR及PDGFR之抑制劑)、XL-999(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR、FGFR之抑制劑)、舒尼替尼(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR之抑制劑)及XL-820(亦充當VEGFR及PDGFR抑制劑)、伊馬替尼(亦為bcr-abl抑制劑)、尼洛替尼(亦為bcr-abl及PDGFR之抑制劑)。
刺蝟信號傳導路徑拮抗劑之實例為IPI-609及CUR-61414。
CDK抑制劑之實例為塞利西立(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK-CDK(亦抑制VEGFR2及PDGFR)、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509及AG 024322。
蛋白酶體抑制劑之實例為硼替佐米(bortezomib)、卡菲佐米(carfilzomib)及NPI-0052(亦為NFB之抑制劑)。
NFB路徑抑制劑之一實例為NPI-0052。
泛素化路徑抑制劑之一實例為HBX-41108。
在較佳實施例中，其他治療劑為抗血管生成劑。
抗血管生成劑之實例為FGFR、PDGFR及VEGFR或各別配體之抑制劑(例如VEGF抑制劑，如哌加他尼(pegaptanib)或抗VEGF抗體貝伐單抗)、EGFL7抑制劑(諸如抗EGFL7MAb)、血管生成素1/2抑制劑(諸如AMG386)及沙力度胺(thalidomide)，該等藥劑係選自(但不限於)貝伐單抗、莫替沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、KRN-951、ZK-CDK(亦為CDK之抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、IMiD(免疫調節藥物)、沙力度胺衍生物CC-4047、來那度胺、ENMD 0995、IMC-D11、Ki 23057、布立尼布(brivanib)、西地尼布(cediranib)、XL-999(亦為cKit及Flt3之抑制劑)、1B3、CP 868596、IMC 3G3、R-1530(亦為Flt3之抑制劑)、舒尼替尼(亦為cKit及Flt3之抑制劑)、阿西替尼(亦為cKit之抑制劑)、來他替尼(亦為Flt3及PKC之抑制劑)、凡塔藍尼(vatalanib)、坦度替尼(亦為Flt3及cKit之抑制劑)、帕唑帕尼(pazopanib)、GW 786034、PF- 337210、IMC-1121B、AVE-0005、AG-13736、E-7080、CHIR 258、甲苯磺酸索拉非尼(亦為Raf之抑制劑)、RAF-265(亦為Raf之抑制劑)、範得它尼(vandetanib)、CP-547632、OSI-930、AEE-788(亦為EGFR及Her2之抑制劑)、BAY-57-9352(亦為Raf之抑制劑)、BAY-73-4506(亦為Raf之抑制劑)、XL 880(亦為cMet之抑制劑)、XL-647(亦為EGFR及EphB4之抑制劑)、XL 820(亦為cKit之抑制劑)及尼洛替尼(亦為cKit及brc-abl之抑制劑)。
其他治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗EGFR抗體之實例(但不限於)為西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)；小分子EGFR抑制劑之一實例為吉非替尼(gefitinib)。EGFR調節劑之另一實例為EGF融合毒素。
適用於與本發明之雙特異性結合分子組合的EGFR及Her2抑制劑有拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼、埃羅替尼(erlotinib)、西妥昔單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮妥木單抗(zalutumumab)、範得它尼(亦為VEGFR之抑制劑)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647、HKI-272、BMS-599626 ARRY-334543、AV 412、mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為VEGFR之抑制劑)、ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab。
宜在療法中與本發明之雙特異性結合分子組合的其他藥劑為托西莫單抗(tositumumab)及替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(兩種經放射性標記之抗CD20抗體)、阿來組單抗 (alemtuzumab)(抗CD52抗體)、狄諾塞麥(denosumab)(破骨細胞分化因子配體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab)(CD80拮抗劑)、奧伐木單抗(ofatumumab)(CD20抑制劑)、紮木單抗(zanolimumab)(CD4拮抗劑)、SGN40(CD40配體受體調節劑)、利妥昔單抗(CD20抑制劑)、馬帕木單抗(mapatumumab)(TRAIL-1受體促效劑)、REGN421(SAR153192)或OMP-21M18(D114抑制劑)。
可與本發明之雙特異性結合分子組合使用的其他化學治療藥物係選自(但不限於)激素、激素類似物及抗激素劑(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、乙酸環妊酮(cyproterone acetate)、非那雄安(finasteride)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、奧曲肽(octreotide)、阿佐昔芬(arzoxifene)、帕西瑞肽(pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、利阿唑(liarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、福美司坦(formestane))、LHRH促效劑及拮抗劑(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙立德(leuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、地洛瑞林(deslorelin)、組胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代謝物(例 如抗葉酸物，如甲胺喋呤(methotrexate)、培美曲唑(pemetrexed)、嘧啶類似物(如5氟尿嘧啶)、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、奈拉濱(nelarabine)及吉西他濱(gemcitabine)；嘌呤及腺苷類似物，諸如巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、克拉屈濱(cladribine)及噴司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine))；抗腫瘤抗生素(例如蒽環黴素(anthracycline)，如阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)及艾達黴素(idarubicin)、絲裂黴素C(mitomycin-C)、博萊黴素(bleomycin)、更生黴素(dactinomycin)、普卡黴素(plicamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、匹克生瓊(pixantrone)、鏈佐星(streptozocin))；鉑衍生物(例如順鉑(cisplatin)、奧賽力鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、洛鉑(lobaplatin)、沙鉑(satraplatin))；烷基化劑(例如雌莫司汀(estramustine)、氮芥、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、氮烯唑胺(dacarbazine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、羥脲(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲(nitrosourea)(諸如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、塞替派(thiotepa))；抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼，如長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)及長春新鹼(vincristine)；及紫杉烷，如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多 西紫杉醇(docetaxel)及其調配物、拉洛他賽(larotaxel)、司莫紫杉醇(simotaxel)及埃坡黴素(epothilone)(如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹龍(patupilone))、ZK-EPO)；拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素，如依託泊苷(etoposide)及凡畢複(etopophos))、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))及雜項化學治療劑，諸如胺磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干擾素α、丙卡巴肼(procarbazine)、米托坦(mitotane)及卟吩姆(porfimer)、貝沙羅汀(bexarotene)、塞內昔布(celecoxib)。
本發明之雙特異性結合分子或多肽及包含其之組合物的功效可使用任何適合之活體外分析、基於細胞之分析、活體內分析及/或本身已知之動物模型或其任何組合來測試，視所關注之特定疾病或病症而定。適合之分析及動物模型為熟習此項技術者所清楚，且例如包括本文所述及以下實例中所用之分析，例如增殖分析。
本發明之實驗中所獲得之資料證實本發明之雙特異性結合分子具有優於先前技術之結合分子的性質。該等性質有對VEGF165-VEGFR2相互作用之完全抑制及低IC50，如可例如得自圖1及表5之ELISA資料以及如圖3、17、18及表7中所示VHH在AlphaScreen分析中之IC50(nM)值；及表格9、10及圖5中之經純化之VHH對重組人類VEGF及小鼠VEGF的親和力KD(nM)。又，如表13中所示，本發明之VEGF結合劑在HUVEC增殖分析中具有高效力，亦即在毫 微莫耳以下之範圍內。由此指示本發明之雙特異性結合分子為在與VEGF介導之對血管生成的作用相關之疾病及病症(諸如癌症)中具有治療功效之有前途候選者。
根據本發明之另一實施例，提供一種藉由如下步驟診斷疾病之方法：a)使樣品與如上文所定義之本發明之結合分子接觸，及b)偵測該結合分子與該樣品之結合，及c)將步驟(b)中所偵測之結合與標準進行比較，其中關於該樣品之結合差異可診斷與VEGF及/或Ang2介導之對血管生成的作用相關之疾病或病症。
出於此及其他用途，進一步修飾本發明之雙特異性結合分子可為有用的，諸如藉由引入作為特異性結合對(諸如生物素-抗生物素蛋白(鏈菌素)結合對)中之一個部分的官能基。可使用該官能基將本發明之結合分子連接於結合該結合對之另一半的另一蛋白質、多肽或化合物，亦即經由形成結合對。舉例而言，本發明之雙特異性結合分子可與生物素結合，且連接於與抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素結合之另一蛋白質、多肽、化合物或載體。舉例而言，該結合之本發明之雙特異性結合分子可用作報導因子，例如在產生可偵測信號之藥劑與抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素結合的診斷系統中。
材料與方法 a)VEGF109之產生及功能性測試
將編碼人類血管內皮生長因子同功異型物VEGF165 (GenBank：AAM03108.1；AA殘基27-135)之受體結合域的cDNA選殖至pET28a載體(Novagen,Madison,WI)中且在大腸桿菌(BL21 Star DE3)中過表現為標記His之不溶性蛋白質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現且在37℃下持續4小時。藉由離心收集細胞且藉由音波處理細胞集結粒來溶解。藉由離心分離包涵體。用1% Triton X 100(Sigma-Aldrich)之洗滌步驟後，使用7.5 M胍鹽酸鹽溶解蛋白質且藉由使用含6 M至0 M之遞減脲濃度的緩衝液進行連續數輪隔夜透析來再摺疊。藉由使用MonoQ5/50GL(Amersham BioSciences)管柱進行離子交換層析，隨後用Superdex75 10/300 GL管柱(Amersheim BioSciences)進行凝膠過濾來純化再摺疊蛋白質。蛋白質之純度及均質性由SDS-PAGE及西方墨點法(Westen blot)證實。另外，與VEGFR1、VEGFR2及貝伐單抗(Bevacizumab)之結合活性由ELISA監測。為此，在4℃下將1 μg/mL重組人類VEGF109固定於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中隔夜。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。將VEGFR1、VEGFR2或貝伐單抗之連續稀釋液添加至塗有VEGF109之盤中且使用結合鹼性磷酸酶(AP)之Fc特異性山羊抗人類IgG(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.,West Grove,PA,USA)偵測結合，隨後在受質PNPP(對硝基苯基磷酸酯)(Sigma-Aldrich)存在下進行酶促反應。VEGF109可結合VEGFR1、VEGFR2及貝伐單抗，從而指示所產生之VEGF109具有活性。
b)VEGF165之KLH結合及結合KLH之VEGF165的功能性測試
根據製造商之說明書，使用具有mcKLH之Imject Immunogen EDC套組(Pierce,Rockford,IL,USA)，使重組人類VEGF165(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)與海水養殖匙孔螺血氰蛋白(mcKLH)結合。多肽與mcKLH之有效結合藉由SDS-PAGE證實。結合蛋白質之功能性藉由ELISA檢查：在4℃下將2 μg/mL結合KLH之VEGF165固定於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中隔夜。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。添加VEGFR1或VEGFR2之連續稀釋液且使用結合辣根過氧化酶(HRP)之Fc特異性山羊抗人類IgG(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.,West Grove,PA,USA)偵測結合，隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行酶促反應。結合KLH之蛋白質仍可與VEGFR1、VEGFR2及貝伐單抗相互作用，從而證實仍可到達VEGF165上之相關抗原決定基。
實例1 用不同VEGF格式免疫接種誘導美洲駝之體液免疫反應 1.1免疫接種
在獲得獸醫學院倫理委員會(Ethical Committee of the faculty of Veterinary Medicine)(University Ghent,Belgium)批准後，根據標準方案，用重組人類VEGF109之6次肌肉內注射(每劑100或50 μg，每週一次)對4隻美洲駝(稱為第264號、第265號、第266號、第267號)進行免疫接種。第0天的首次注射液用完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant)(Difco,Detroit,MI,USA)調配，而後續注射液用不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's Adjuvant)(Difco,Detroit,MI,USA)調配。另外，根據以下方案對四隻美洲駝(稱為第234號、第235號、第280號及第281號)進行免疫接種：使用結合KLH之人類VEGH165進行5次肌肉內注射(每劑100或50 μg，每兩週一次)，隨後使用人類VEGF109進行4次肌肉內注射(首次劑量為100 μg，接下來2週後三次每劑50 μg，每週一次)。
1.2美洲駝之VEGF誘導性免疫反應的評估
為監測VEGF特異性血清效價，設置ELISA分析，其中在4℃下將2 μg/mL重組人類VEGF165或VEGF109固定於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中隔夜。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。添加血清稀釋液後，使用結合辣根過氧化酶(HRP)之山羊抗美洲駝免疫球蛋白(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,TX,USA)偵測結合之總IgG，隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行酶促反應。對於美洲駝264、265、266及267，進行另一ELISA，其中評估針對VEGF165及VEGF109之同型特異性反應。依序使用特異性識別習知美洲駝IgG1及僅含重鏈之美洲駝IgG2及IgG3的小鼠mAb[Daley等人(2005).Clin.Diagn.Lab.Imm.12：380-386]及兔抗小鼠-HRP結合物(DAKO)偵測同型特異性反應。使用TMB作為發色受質對ELISA進行顯影且在450 nm下量測吸光度。各美洲駝之血清效價描述於表1中。
實例2 僅含重鏈之抗體片段譜系的選殖及噬菌體之製備
在最後一次免疫原注射後，自經免疫接種之美洲駝收集免疫組織作為產生重鏈抗體之B細胞來源。通常，在最後一次抗原注射後4及8天每隻動物收集兩個150 ml血液樣品，且在最後一次抗原注射後4天每隻動物收集一個淋巴結生檢樣品。根據製造商之說明書(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)，使用葡聚糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)自血液樣品製備周邊血液單核細胞(PBMC)。如WO2005/044858中所述，自PBMC及淋巴結生檢樣品萃取總RNA，其用作RT-PCR之起始物質以擴增編碼VHH之 DNA區段。對於每一經免疫接種之美洲駝，藉由混合自所收集之該動物的所有免疫組織分離之總RNA構築文庫。簡言之，經由特異性限制性位點將經PCR擴增之VHH譜系選殖至設計成有助於VHH文庫之噬菌體呈現的載體中。該載體源自pUC119且含有LacZ啟動子、M13噬菌體gIII蛋白質編碼序列、安比西林(ampicillin)或卡本西林(carbenicillin)之抗性基因、多個選殖位點及雜交gIII-pelB前導序列(pAX050)。與VHH編碼序列同框，載體編碼C端c-myc標記及His6標記。根據標準方案製備噬菌體且在過濾滅菌後儲存於4℃下以供進一步使用。
實例3 經由噬菌體呈現選擇VEGF特異性VHH
將VHH噬菌體文庫用於應用多種選擇條件之不同選擇策略中。變數包括i)VEGF蛋白質格式(rhVEGF165、rhVEGF109或rmVEGF164)；ii)抗原呈現方法(固相：直接塗佈或經由生物素標記塗佈於塗有中性鏈親和素之盤上；溶液相：在溶液狀態下培育，隨後捕捉於塗有中性鏈親和素之盤上)；iii)抗原濃度；及iv)溶離方法(胰蛋白酶或使用VEGFR2之競爭性溶離)。所有選擇均在Maxisorp 96孔盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中進行。
如下進行選擇：在室溫下將噬菌體文庫與可變濃度之VEGF抗原在溶液狀態下或在固定於固體載體上之情況下一起培育。培育2小時且激底洗滌後，溶離結合之噬菌體。在使用胰蛋白酶進行噬菌體溶離之情況下，立刻藉由 添加0.8 mM蛋白酶抑制劑AEBSF中和蛋白酶活性。使用顯示相對於背景富集之噬菌體輸出物感染大腸桿菌。使用受感染之大腸桿菌細胞製備噬菌體以進行下一輪選擇(噬菌體救援)或將受感染之大腸桿菌細胞塗於瓊脂盤(LB+amp+葡萄糖2%)上以進行個別VHH純系之分析。為篩選用於特異性結合劑之選擇輸出物，自瓊脂盤挑取單一群落且在1 mL 96深孔盤中生長。藉由添加IPTG(最終0.1-1 mM)誘導lacZ控制之VHH表現。根據標準方法製備周質萃取物(體積為約80 μL)。
實例4 結合VEGF之VHH及阻斷VEGF受體之VHH的鑑別
藉由ELISA測試周質萃取物與人類VEGF165之結合。簡言之，在4℃下將2 μg/mL重組人類VEGF165固定於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。用酪蛋白溶液(1%)阻斷各孔。添加周質萃取物之通常10倍稀釋液後，使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠HRP結合物(DAKO)偵測VHH結合。將顯示高於背景>3倍之ELISA信號的純系視為結合VEGF之VHH。
另外，在人類VEGF165/人類VEGFR2 AlphaScreen分析(增強型發光近接勻相分析)中篩選周質萃取物以評估VHH之阻斷能力。使用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce,Rockford,IL,USA)對人類VEGF165進行生物素標記。根據製造商之說明書(Perkin Elmer,Waltham,MA,US)，使用與接受體珠粒偶合之抗人類Fc VHH捕捉人類VEGFR2/Fc嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)。為評估VHH之中和能力，周質萃取物用含有0.03% Tween 20(Sigma-Aldrich)之PBS緩衝液以1/25稀釋且在室溫(RT)下與0.4 nM生物素標記之人類VEGF165一起預培養15分鐘。向此混合物中添加接受體珠粒(10 μg/ml)及0.4 nM VEGFR2-huFc且在室溫下在黑暗中進一步培育1小時。隨後添加供體珠粒(10 μg/ml)，接著在室溫下在黑暗中培育1小時。藉由在Envision Multi label盤讀取器(Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)上，使用680 nm之激發波長及介於520 nm與620 nm之間的發射波長讀取盤來量測螢光。使用含有不相關VHH之周質萃取物作為陰性對照組。將能夠使螢光信號相對於陰性對照組之信號減少超過60%的含有抗VEGF165 VHH之周質萃取物鑑別為命中物(hit)。在競爭ELISA中證實AlphaScreen中所鑑別之所有命中物。為此，將1 μg/mL人類VEGFR2嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)塗佈於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在於含有0.1%酪蛋白及0.05% Tween 20(Sigma-Aldrich)之PBS緩衝液中的固定濃度(4 nM)之生物素標記之人類VEGF165存在下培育周質萃取物之五倍稀釋液。使用結合辣根過氧化酶(HRP)之extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)偵測此等VHH/bio-VEGF165複合物與塗有人類VEGFR2嵌合體之盤的結合。結合VEGF(非受體阻斷性)之VHH及抑制性(受體阻斷性)VHH之VHH序列ID及相應AA序列分別列於表2及表3中。
在Biacore(Biacore T100儀器，GE Healthcare)上分析抑制性VHH之解離速率。使用HBS-EP+緩衝液作為操作緩衝液且在25℃下進行實驗。經由胺偶合(使用EDC及NHS)將重組人類VEGF165不可逆地捕捉於CM5感測晶片上達+/-1500RU之目標程度。固定後，經由注射1 M乙醇胺(pH 8.5)10分鐘來使表面失活。活化參考表面且分別用EDC/NHS及乙醇胺失活。以每分鐘45 μl以於操作緩衝液中之10倍稀釋液形式注射VHH之周質萃取物並使其解離10或15分鐘。在不同樣品中，用再生緩衝液使表面再生。資料藉由減去參考通道之曲線及空白操作緩衝液注射作雙重參考。藉由在Biacore T100評估軟體v2.0.1中擬合兩相衰變模型來評估經加工之曲線。kd-快、kd-慢及%快之值列於表4中。
實例5 經純化之抗VEGF VHH的表徵
選擇三種抑制性抗VEGF VHH用於以經純化之蛋白質形式進一步表徵：VEGFBII23B04、VEGFBII24C4及VEGFBII23A6。使此等VHH在大腸桿菌TG1中表現為標記c-myc、His6之蛋白質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現且在37℃下持續4小時。旋轉細胞培養物後，藉由凍融集結粒來製備周質萃取物。使用此等萃取物作為起始物質，經由IMAC及尺寸排阻層析(SEC)純化VHH。最終VHH製劑顯示如經由SDS-PAGE所評估之95%純度。
5.1在人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc阻斷ELISA中評估阻斷人類VEGF165/VEGFR2之VHH
在人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc阻斷ELISA中評估VHH 之阻斷能力。簡言之，將1 μg/mL人類VEGFR2-Fc嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)塗佈於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在4 nM生物素標記之VEGF165存在下培育經純化之VHH於含有0.1%酪蛋白及0.05% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液(濃度範圍1 mM-64 pM)。使用結合辣根過氧化酶(HRP)之extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)及作為受質之TMB偵測bio-VEGF165與VEGFR2之殘餘結合。採用貝伐單抗(Avastin®)及蘭尼單抗(Ranibizumab)(Lucentis®)作為對照組。劑量抑制曲線展示於圖1中；相應IC50值及抑制%概述於表5中。
5.2在人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc阻斷ELISA中評估阻斷人類VEGF165/VEGFR2之VHH
亦在人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc阻斷ELISA中評估VHH。簡言之，將2 μg/mL VEGFR1-Fc嵌合體(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)塗佈於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中。在0.5 nM生物素標記之VEGF165存在下培育經純化之VHH於含有0.1%酪蛋白及 0.05% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液(濃度範圍1 mM-64 pM)。使用結合辣根過氧化酶(HRP)之extravidin(Sigma,St Louis,MO,USA)及作為受質之TMB偵測bio-VEGF165與VEGFR1之殘餘結合。採用貝伐單抗、蘭尼單抗及不相關VHH(2E6)作為對照組。劑量抑制曲線展示於圖2中；相應IC50值及抑制%概述於表6中。
5.3在人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc阻斷AlphaScreen中評估抗VEGF165VHH
亦在人類VEGF165/人類VEGFR2-Fc阻斷AlphaScreen中評估VHH之阻斷能力。簡言之，將經純化之VHH(濃度範圍：200 nM-0.7 pM)於含有0.03% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液添加至4 pM bio-VEGF165中且培育15分鐘。隨後，添加VEGFR2-Fc(0.4 nM)及塗有抗Fc VHH之接受體珠粒(20 μg/ml)且在黑暗中培育此混合物1小時。最後，添加抗生物素蛋白鏈菌素供體珠粒(20 μg/ml)且在黑暗中培育1小時後，在Envision微量盤讀取器上量測螢光。劑量-反應曲線展示於圖3中。VHH阻斷人類VEGF165-人類VEGFR2-Fc相互作用的IC50值概述於表7中。
5.4在人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc阻斷AlphaScreen中評估抗VEGF165 VHH
亦在人類VEGF165/人類VEGFR1-Fc阻斷AlphaScreen中評估VHH之阻斷能力。簡言之，將經純化之VHH(濃度範圍：500 nM-1.8 pM)於含有0.03% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液添加至0.4 nM bio-VEGF165中且培育15分鐘。隨後，添加VEGFR1-Fc(1 nM)及塗有抗Fc VHH之接受體珠粒(20 μg/ml)且在黑暗中培育此混合物1小時。最後，添加抗生物素蛋白鏈菌素供體珠粒(20 μg/ml)且在黑暗中培育1小時後，在Envision微量盤讀取器上量測螢光。劑量-反應曲線展示於圖4中。VHH阻斷人類VEGF165-人類VEGFR1-Fc相互作用的IC50值及抑制%概述於表8中。
5.5人類VEGF165-VHH相互作用之親和力的測定
藉由SPR在Biacore T100儀器上分析VHH VEGFBII23B04與hVEGF165之結合動力學。經由胺偶合(使用EDC及NHS)將重組人類VEGF165直接固定於CM5晶片上。以介於10 nM與360 nM之間的不同濃度分析VHH。注射樣品2分鐘且使其在45 μl/min之流速下解離20分鐘。在樣品注射之間，用100 mM HCl使晶片表面再生。使用HBS-EP+(Hepes緩衝液pH 7.4+EDTA)作為操作緩衝液。藉由Biacore T100評估軟體v2.0.1使用兩態反應模型擬合結合曲線。所計算之抗VEGF VHH的親和力列於表9中。
5.6與小鼠VEGF164之結合
使用結合ELISA測定與小鼠VEGF164之交叉反應性。簡言之，在4℃下將重組小鼠VEGF164(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)以1 μg/mL塗佈於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中隔夜。用酪蛋白溶液(1%於PBS中)阻斷各孔。以於含有0.1%酪蛋白及0.05% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液(濃度範圍：500 nM-32 pM)形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠-HRP結合物(DAKO)偵測結合，隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行酶促反應(圖5)。包括小鼠VEGF164反應性mAb作為陽性對照組。作為參考，亦量測與人類VEGF165之結合。EC50值概述於表10中。
5.7與VEGF121之結合
經由固相結合ELISA評估與重組人類VEGF121之結合。簡言之，在4℃下將重組人類VEGF121(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)以1 μg/mL塗佈於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中隔夜。用酪蛋白溶液(1%於PBS中)阻斷各孔。以於含有0.1%酪蛋白及0.05% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液(濃度範圍：500 nM-32 pM)形式施用VHH，且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠-HRP結合物(DAKO)偵測結合，隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行酶促反應(圖6)。採用VEGFR2之連續稀釋液作 為陽性對照組。EC50值概述於表11中。
5.8與VEGF家族成員VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF之結合
經由固相結合ELISA評估與VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF之結合。簡言之，在4℃下將VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(R&D Systems,Minneapolis,MS,USA)以1 μg/mL塗佈於96孔MaxiSorp盤(Nunc,Wiesbaden,Germany)中隔夜。用酪蛋白溶液(1%於PBS中)阻斷各孔。以連續稀釋液(濃度範圍：500 nM-32 pM)形式施用VHH且使用小鼠抗myc(Roche)及抗小鼠-AP結合物(Sigma,St Louis,MO,USA)偵測結合。採用適當受體之連續稀釋液作為陽性對照組，且用結合辣根過氧化酶(HRP)之Fc特異性山羊抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Laboratories Inc.,West Grove,PA,USA)偵測結合，隨後在受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Pierce,Rockford,IL,USA)存在下進行酶促反應。VHH及對照組之劑量-反應曲線展示於圖7中。結果顯示所選VHH與VEGFB、VEGFC、VEGFD或PlGF不存在可偵測的結合。
5.9抗原決定基分級(binning)
進行基於Biacore之抗原決定基分級實驗以研究何種 VEGF結合劑結合與VEGFBII23B04類似或重疊的抗原決定基。為此，將VEGFBII23B04固定於CM5感測晶片上。對於各樣品，使人類VEGF165通過晶片表面且由VEGFBII23B4可逆地捕捉。接著以240秒表面接觸時間及每分鐘10 μL之流速注射經純化之VHH(100 nM)或周質萃取物(1/10稀釋)。在不同樣品之間，用再生緩衝液(100 mM HCl)使表面再生。用Biacore T100評估軟體評估經加工之曲線。VHH可分成兩組：第一組另外結合VEGFBII23B04捕捉之VEGF165且第二組不能同時結合VEGFBII23B04捕捉之VEGF165。表12-A概述所測試VHH之結合抗原決定基。
使用相同分析設置評估VEGFR1、VEGFR2、蘭尼單抗及貝伐單抗是否能夠與VEGFBII23B04同時結合人類VEGF-165。表12-B呈現對VEGFBII23B04捕捉之VEGF165的另外結合反應。僅VEGFR2不能結合VEGFBII23B04捕捉之VEGF165，從而強調VEGFBII23B04對於VEGF-VEGFR2相互作用之阻斷能力。另外，此等資料顯示VEGFBII23B04抗原決定基不同於貝伐單抗及蘭尼單抗抗原決定基。
5.10在HUVEC增殖分析中表徵抗VEGF VHH
在增殖分析中評估所選VHH之效力。簡言之，使初級HUVEC細胞(Technoclone)缺乏補充劑隔夜，接著一式四份將每孔4000個細胞接種於96孔組織培養盤中。在VHH不存在或存在下用33 ng/mL VEGF刺激細胞。第4天藉由[3H]胸苷併入量量測增殖率。HUVEC增殖分析結果結果展示於表格中。
5.11在HUVEC Erk磷酸化分析中表徵抗VEGF VHH
在HUVEC Erk磷酸化分析中評估所選VHH之效力。簡言之，使初級HUVE細胞缺乏血清隔夜，接著在VHH不存在 或存在下用10 ng/mL VEGF刺激5分鐘。用含4%甲醛之PBS固定細胞且藉由ELISA使用phosphoERK特異性抗體(抗phosphoMAP激酶pERK1&2，M8159，Sigma)及多株兔抗小鼠-免疫球蛋白-HRP結合物(PO161，Dako)量測ERK磷酸化程度。如表14中所示，VEGFBII23B04及貝伐單抗使VEGF誘導之Erk磷酸化受到至少90%的抑制，其IC50<1 nM。
實例6 多價阻斷性抗VEGFVHH之產生
使VHH VEGFBII23B04與VEGFBII23B04遺傳融合，產生均二聚VHH(AA序列參見表15)，或與不同的結合VEGF之VHH遺傳融合，產生雜二聚VHH。為產生雜二聚VHH，將一組10種獨特的結合VEGF之VHH以兩種不同位向經由含9或40個Gly-Ser之可撓性連接子連接至VEGFBII23B04(AA序列參見表15)。使均二聚VEGFBII23B04(VEGFBII010)及40種雜二聚二價VHH在大腸桿菌TG1中表現為標記c-myc、His6之蛋白質。藉由添加1 mM IPTG來誘導表現且在37℃下持續4小時。旋轉細胞培養物後，藉由凍融集結粒來製備周質萃取物。使用此等萃取物作為起始物質且經由IMAC純化VHH並去鹽，產生如經由SDS-PAGE所評估之90%純度。
分別如實例5.3及5.4中所述，在VEGFR2及VEGFR1阻斷AlphaScreen分析中測試一組40種二價VHH。基於效力及最大抑制程度，選擇5種最佳二價VHH(VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBI023、VEGFBI024及VEGFBII025)用於進一步表徵。5種所選二價VHH在競爭性VEGFR2及VEGFR1 AlphaScreen中之篩選結果的概述展示於表16中。
實例7 格式化抗VEGF VHH之表徵
分別如實例5.1、5.2、5.3及5.4中所述，在VEGFR2及VEGFR1阻斷ELISA(分別為圖8及9、表17及表18)及AlphaScreen分析(圖10及11、表19及20)中並列比較VHH VEGFBII010、VEGFBII021、VEGFBII022、VEGFBII023、VEGFBII024及VEGFBII025。
另外，亦測試格式化VHH阻斷mVEGF164/mVEGFR2-huFc相互作用之能力。簡言之，將經純化之VHH(濃度範圍：4 μM-14.5 pM)於含有0.03% Tween 20(Sigma)之PBS緩衝液中的連續稀釋液添加至0.1 nM生物素標記之mVEGF164中且培育15分鐘。隨後，添加小鼠VEGFR2-huFc(0.1 nM)及塗有抗huFc VHH之接受體珠粒(20 μg/ml)且培育此混合物1小時。最後，添加抗生物素蛋白鏈菌素供體珠粒(20 μg/ml)且在培育1小時後在Envision微量盤讀取器上量測螢光。劑量-反應曲線展示於圖12中。VHH阻斷小鼠VEGF164/VEGFR2-hFC相互作用之的IC50值概述於表21中。
亦在ELISA中測試格式化VHH結合mVEGF164及人類VEGF165(實例5.6；圖13；表22)、VEGF121(實例5.7；圖15；表23)及VEGF家族成員VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF(實例5.8；圖14)之能力。如實例5.5中所述分析人類VEGF165之結合動力學。KD值列於表24中。
亦在VEGF介導之HUVEC增殖及Erk磷酸化分析中測試VHH VEGFBII010、VEGFBII022、VEGFBII024及VEGFBII025。
在增殖分析中評估所選格式化VHH之效力。簡言之，使 初級HUVEC細胞(Technoclone)缺乏補充劑隔夜，接著一式四份將每孔4000個細胞接種於96孔組織培養盤中。在VHH不存在或存在下用33 ng/mL VEGF刺激細胞。第4天藉由[3H]胸苷併入量量測增殖率。表25中所示之結果說明格式化VHH及貝伐單抗使VEGF誘導之HUVEC增殖受到大於90%的抑制，其IC50<1 nM。
在HUVEC Erk磷酸化分析中評估所選格式化VHH之效力。簡言之，使初級HUVE細胞缺乏血清隔夜，接著在VHH不存在或存在下用10 ng/mL VEGF刺激5分鐘。用含4%甲醛之PBS固定細胞且藉由ELISA使用phosphoERK特異性抗體(抗phosphoMAP激酶pERK1&2，M8159，Sigma)及多株兔抗小鼠-免疫球蛋白-HRP結合物(PO161，Dako)量測ERK磷酸化程度。如表26中所示，格式化VHH及貝伐單抗使VEGF誘導之Erk磷酸化受到大於90%的抑制，其IC50<1 nM。
實例8 序列最佳化 8.1 VEGFBII23B04之序列最佳化
將VEGFBII23B04之胺基酸序列與人類生殖系序列VH3-23/JH5比對，參見圖16(SEQ ID NO：179)。
比對顯示VEGFBII23B04相對於參考生殖系序列含有19個構架突變。選擇位置14、16、23、24、41、71、82、83及108之非人類殘基以用其人類生殖系對應物進行取代。產生一組8種VEGFBII23B04變異體，其在此等位置帶有人類殘基之不同組合(AA序列列於表27中)。構築另一種變異體，其中藉由引入S60A突變來移除位置D59S60之潛在異構化位點(CDR2區，參見圖16，以粗斜體殘基指示)。
在VEGF165/VEGFR2 AlphaScreen中以經純化之蛋白質形式表徵此等變異體(實例5.3、圖17)。在熱漂移分析中測定各純系之熔融溫度(Tm)，其係基於在併入Sypro Orange(Invitrogen)後螢光信號增加(Ericsson等人，Anal.Biochem.357(2006)，第289-298頁)。所有變異體均呈現與VEGFBII23B04相比類似的IC50及與親本VEGFBII23B04相比類似或較高的Tm值。表28概述所測試的9種純系在pH 7下之IC50值及Tm值。
在第二循環中，組合來自人類化嘗試之耐受性突變(VEGFBII111G06)及避免所選位點之潛在轉譯後修飾的突變(D16G、S60A取代及E1D突變)，產生源自VEGFBII23B04之序列最佳化純系：VEGFBII0037。預測一種額外序列最佳化變異體(VEGFBII038)，其含有與VEGFBII0037相同之取代，除I82M突變以外，因為此突變可能與效力之較小下降相關。來自兩種序列最佳化純系之序列列於表29中。在 VEGF165/VEGFR2阻斷AlphaScreen中表徵VEGFBII0037及VEGFBII0038(實例5.3，圖18)，如上文所述在熱漂移分析中測定熔融溫度且在Biacore中測定結合VEGF165之親和力(實例5.5)。2種序列最佳化VHH之特徵概述呈現於表30中。
8.2 VEGFBII5B05之序列最佳化
將VEGFBII5B05之胺基酸序列與人類生殖系序列VH3-23/JH5比對，參見圖19(SEQ ID：NO：179)。比對顯示VEGFBII5B05相對於參考生殖系序列含有15個構架突變。選擇位置23、60、83、105、108之非人類殘基以用其人類生殖系對應物進行取代，而選擇位置44之組胺酸以用麩醯 胺酸進行取代。構築一種帶有6個所述突變之人類化變異體(AA序列列於表31中)。
構築另一種變異體，其中藉由引入M30I突變來移除位置M30之潛在氧化位點(CDR1區，參見圖19，以粗斜體殘基指示)。使用ProteOn測試兩種變異體結合hVEGF165之能力。簡言之，用人類VEGF165塗佈GLC ProteOn感測晶片。以1/10稀釋變異體之周質萃取物且注射於塗有人類VEGF165之晶片上。計算解離速率且與親本VEGFBII5B05之解離速率比較。2種變異體之解離速率在與親本VEGFBII5B05之解離速率相同的範圍內，從而指示所有突變均為可耐受的(表32)。
在第二循環中，組合來自人類化嘗試之突變及M30I取 代，產生VEGFBII5B05之序列最佳化純系，稱為VEGFBII032。序列列於表33中。藉由Biacore測定VEGFBII032之親和力(參見實例5.5)且如上文所述在熱漂移分析中測定熔融溫度。序列最佳化VHH VEGFBII032之特徵概述呈現於表34中。
在增殖分析中評估序列最佳化純系VEGFBII037及VEGFBII038之效力。簡言之，使初級HUVEC細胞(Technoclone)缺乏補充劑隔夜，接著一式四份將每孔4000個細胞接種於96孔組織培養盤中。在VHH不存在或存在下用33 ng/mL VEGF刺激細胞。第4天藉由[3H]胸苷併入量量測增殖率。表35中所示結果說明親本VHH VEGFBII23B04 之活性(效力及抑制程度)在序列最佳化純系VEGFBII038中得到保留。
實例9 靶向Ang2之二價VHH的構築、產生及表徵
分別將VHH 1D01(SEQ ID No：214)、11B07、00908及00027(SEQ ID No：216)與1D01(SEQ ID No：214)、11B07、00908及00027(SEQ ID No：216)遺傳融合，產生均二聚VHH。經由含9個GlySer或40個GlySer之可撓性連接子連接二價VHH。將格式化VHH之編碼DNA序列選殖於表現載體pAX172中。使VHH在甲醇酵母中表現為c端標記myc-His6之蛋白質。簡言之，由在30℃(250 rpm)下培育過週末之單群落條紋開始BGCM培養。將培養基轉變為BMCM後，在30℃(250 rpm)下培育培養物直至夜晚，隨後用100%甲醇誘導。次日，再誘導培養物3次(早晨、下午、夜晚)。次日，在4℃(1,500×g)下離心培養物20分鐘。經由固定金屬親和層析(IMAC)純化上清液中存在之標記His6之VHH，隨後去鹽(DS)，最後凝膠過濾(GF)以移除任何內毒素/雜質。所有二價VHH之格式及序列的概述均描述於圖 20及表36-A(連接子序列加下劃線)，SEQ ID NO 180-185中。表現程度在表36-B中指示。
為與單價構建嵌段相比研究抗Ang2阻斷性質，在人類Ang2/hTie2(圖21-1)、小鼠Ang2/mTie2(圖21-2)及食蟹獼猴Ang2/cTie2(圖21-3)及人類Ang1/hTie2(圖22)競爭ELISA中分析二價VHH。IC50值之概述展示於表37中。
實例10 使用抗血清白蛋白作為半衰期延長方式來構築、產生及表徵靶向VEGF及Ang2的三價雙特異性VHH
使用抗VEGF VHH VEGFBII00038(US 2011/0172398 A1)及抗Ang2 VHH 00027(SEQ ID No：216)作為構建嵌段以產生雙特異性VHH VEGFANGBII00001-00004。使用與結合血清白蛋白之VHH的遺傳融合作為半衰期延長方法。經由含三個Ala或9個Gly-Ser之可撓性連接子連接構建嵌段。產生VHH且如實例9中所述純化。所有四種雙特異性VHH之格式及序列的概述均描述於圖23及表37-A(連接子序列加下劃線)，SEQ ID NO 186-189中。表現程度在表38-B中指示。
為與單價構建嵌段VEGFBII00038相比研究抗VEGF阻斷性質，所有四種雙特異性VHH均在VEGF/VEGFR2-Fc(圖22)競爭AlphaScreen中分析。與專利US 2011/0172398 A1中所述之實例12.3相比，略微調整該分析。人類VEGF165與人類VEGFR2-Fc皆以0.05 nM添加。此競爭分析亦在VHH與25 μM人類血清白蛋白一起培育後進行。IC50值及抑制%之概述展示於表39中。
為與單價構建嵌段00027(SEQ ID No：216)相比研究抗Ang2阻斷性質，所有四種雙特異性VHH均在人類Ang2/hTie2-Fc(圖25)競爭ELISA中分析。此分析亦在VHH與0.5 μM人類血清白蛋白一起培育後進行。IC50值之概述展示於表40中。
實例11 使用抗血清白蛋白結合作為半衰期延長方式來構築、產生及表徵靶向VEGF及Ang2的三價及四價雙特異性VHH
構築十種靶向VEGF及Ang2之雙特異性VHH(VEGFANGBII00005-00015)。在此等構築體中，包括單價及二價1D01(SEQ ID NO：214)、單價及二價7G08(SEQ ID NO：215)及二價00027(SEQ ID NO：216)抗Ang2構建嵌 段。使用與結合血清白蛋白之VHH的遺傳融合作為半衰期延長方法。經由含9個Gly-Ser之可撓性連接子連接構建嵌段。產生VHH且如實例8中所述純化。所有十種雙特異性VHH之格式及序列的概述均描述於圖26及表41-A(連接子序列加下劃線)，SEQ ID NO 190-199中。表現程度在表41-B中指示。
為與單價構建嵌段VEGFBII00038相比研究抗VEGF阻斷性質，所有十種雙特異性VHH均在VEGF/VEGFR2-Fc(實例10；圖27-1)及VEGF/VEGFR1(圖27-2)競爭AlphaScreen中分析。與專利US 2011/0172398 A1中所述之實例12.4相比，略微調整該VEGFR1分析。人類VEGF165與人類VEGFR1-Fc皆以0.05 nM添加。此等競爭分析亦在VHH與25 μM人類血清白蛋白一起培育後進行。IC50值之概述展示於表42中。
為與各別單價構建嵌段7G08(SEQ ID No：215)、1D01(SEQ ID No：214)及00027(SEQ ID No：216)相比研究抗Ang2阻斷性質，所有十種雙特異性VHH均在人類Ang2/hTie2-Fc(參見實例5.1；圖28-1)、小鼠Ang2/mTie2-Fc(參見實例5.2；圖28-2)及食蟹獼猴Ang2/cTie2-Fc(參見實例5.2；圖28-3)競爭ELISA中分析。人類分析亦在VHH與0.5 μM人類血清白蛋白一起培育後進行。另外，進行hAng2介導之HUVEC存活分析(參見實例5.5；圖29)。IC50值及抑制%之概述展示於表43中。
已測定對人類血清白蛋白之親和力且展示於表44中。簡言之，經由胺偶合將人類血清白蛋白(Sigma,St Louis,MO,USA)固定於CM5晶片上。使用多循環動力學方法：注射遞增濃度之VHH(2-8-31-125-500 nM)且使其以100 μL/min之流速締合2分鐘並解離10分鐘。在VHH注射之間，用10 mM甘胺酸鹽酸鹽(pH 1.5)之10秒脈衝及60秒穩定時期使表面再生。藉由擬合1：1相互作用模型(朗繆耳結合(Langmuir binding))或異質配體模型來評估締合/解離資料。由所得締合速率常數ka及解離速率常數kd計算親和力常數KD(表44)。
實例12 使用抗血清白蛋白結合作為半衰期延長方式來構築、產生及表徵靶向VEGF及Ang2的序列最佳化且親和力成熟之雙特異性VHH
構築14種靶向VEGF及Ang2之雙特異性VHH(VEGFANGBII00015-00028)。在此等構築體中，包括二價00921(序列最佳化1D01變異體)(SEQ ID No：220)、單價VHH 00908-00932-00933-00934-00935-00936-00937-00938(序列最佳化/親和力成熟之28D10變異體)(SEQ ID No：222)、二價00956(SEQ ID NO：223)(序列最佳化28D10變異體)及單價00928(SEQ ID NO：221)(序列最佳化37F02變異體)抗Ang2構建嵌段。使用與結合血清白蛋白之VHH的遺傳融合作為半衰期延長方法。經由含9個Gly-Ser之可撓性連接子連接構建嵌段。所有14種雙特異性VHH之格式及序列的概述均描述於圖30及表45-A(連接子序列加下劃線)，SEQ ID NO 200-213中。
表現程度在表45-B中指示。
為與單價構建嵌段VEGFBII00038相比研究抗VEGF阻斷性質，雙特異性VHH在VEGF/VEGFR2-Fc(實例10；圖31-1)及VEGF/VEGFR1(實例11；圖31-2)競爭AlphaScreen中分析。此等競爭分析亦在VHH與25 μM人類血清白蛋白一起培育後進行。IC50值之概述展示於表46-A中。
藉由SPR在Biacore T100儀器上分析雙特異性VHH對人類VEGF165之結合動力學(參見專利US 2011/0172398 A1中所述之實例12.5)。採用單價奈米抗體VEGFBII00038作為參考(表46-B)。
在結合ELISA中測定VHH結合人類同功異型物VEGF121 之能力。依序使用生物素標記之抗VHH 1A4及extravidin-HRP偵測VHH連續稀釋液與1 μg/mL直接塗佈之人類VEGF121(R&D)(人類VEGF165作為參考)的結合。1A4為抗VHH VHH(由Ablynx NV內部產生)。基準阿瓦斯丁充當陽性對照組且使用結合HRP之抗人類Fc抗體偵測。不相關VHH充當陰性對照組。對VEGF165及VEGF121之代表性結合反應曲線展示於圖46中，相應EC50值概述於表46-C中。
在結合ELISA中評估與大鼠及小鼠VEGF164之結合。依序使用生物素標記之抗VHH 1A4及extravidin-HRP偵測VHH與1 μg/mL直接塗佈之鼠類或大鼠VEGF164(R&D)的結合。作為陽性對照組，滴定小鼠/大鼠交叉反應性單株抗體B20-4.1(Genentech)且用結合HRP之抗人類Fc抗體偵測。不相關VHH充當陰性對照組。結果展示於圖33中。所有3種雙特異性VHH均不與小鼠及大鼠VEGF交叉反應。
經由結合ELISA評估與人類VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及PlGF之結合。依序使用生物素標記之抗VHH 1A4及 extravidin-HRP偵測VHH與1 μg/mL直接塗佈之VEGF-B(R&D)、VEGF-C(R&D)、VEGF-D(R&D)及PlGF(R&D)的結合。作為陽性對照組，採用適當受體(對於hVEGF-B及hPlGF為hVEGFR1-Fc、對於hVEGF-C為hVEGFR2-Fc、對於hVEGF-D為抗hVEGF-D mAb(R&D))之連續稀釋液。不相關VHH充當陰性對照組。結果展示於圖34中。所有3種雙特異性VHH均不結合VEGF家族成員。
為與各別單價構建嵌段00921(SEQ ID NO：220)及00938(SEQ ID NO：222)相比研究抗Ang2阻斷性質，所有3種雙特異性VHH均在人類Ang2/hTie2-Fc(參見實例5.1；圖35-1)、小鼠Ang2/mTie2-Fc(參見實例5.2；圖35-2)及食蟹獼猴Ang2/cTie2-Fc(參見實例5.2；圖35-3)競爭ELISA中分析。人類分析亦在VHH與0.5 μM人類血清白蛋白一起培育後進行。另外，在hAng1/hTie2競爭ELISA(參見實例5.3；圖36)及Ang2介導之HUVEC存活分析(參見實例5.5；圖37)中測試雙特異性VHH。IC50值及抑制%之概述展示於表47-A中。
已測定VEGFANGBII00022-25-28對人類、小鼠、食蟹獼猴及大鼠Ang2之親和力(參見實例5.4)且展示於表47-B中。
已測定VEGFANGBII00022-25-28對人類、小鼠及食蟹獼猴血清白蛋白之親和力(實例11)且展示於表48中。由所得締合速率常數ka及解離速率常數kd計算親和力常數KD(表48)。
圖1：經純化之單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)
圖2：經純化之單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)
圖3：經純化之單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖4：經純化之單價VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖5：單價VHH與重組人類及小鼠VEGF之結合(ELISA)
圖6：單價VHH與人類VEGF121之結合
圖7：經純化之VHH不結合VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF
圖8：格式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(ELISA)
圖9：格式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(ELISA)
圖10：格式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖11：格式化VHH阻斷hVEGF165/hVEGFR1-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖12：格式化VHH阻斷mVEGF164/mVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖13：格式化VHH結合小鼠及人類VEGF
圖14(14-1至14-8)：格式化VHH不結合VEGFB、VEGFC、VEGFD及PlGF
圖15：格式化VHH結合VEGF121
圖16：VHH VEGFBII23B04與人類VH3/JH生殖系共同序列之序列比對
圖17：VEGFBII23B04之VHH變異體阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖18：序列最佳化之VEGFBII23B04純系阻斷hVEGF165/hVEGFR2-Fc相互作用(AlphaScreen)
圖19：VHH VEGFBII5B05與人類VH3/JH生殖系共同序列之序列比對
圖20：二價Ang2 VHH的描述
圖21(21-1A至21-3D)：經純化之二價Ang2 VHH阻斷hAng2-hTie2(25-1)、mAng2-mTie2(25-2)及cAng2/cTie2(25-3)相互作用(ELISA)
圖22：經純化之二價Ang2 VHH阻斷hAng1-hTie2相互作用(ELISA)
圖23：三價VEGF×Ang2雙特異性VHH的描述
圖24(24A至24D)：經純化之三價VEGF×Ang2奈米抗體阻斷hVEGF-hVEGFR2相互作用(AlphaScreen)
圖25(25A至25D)：經純化之三價VEGF×Ang2 VHH阻斷hAng2-hTie2相互作用(ELISA)
圖26：三價及四價VEGF×Ang2雙特異性VHH的描述
圖27(27-1A至27-2H)：經純化之三價及四價VEGF×Ang2 VHH阻斷hVEGF-hVEGFR2(31-1)及hVEGF-hVEGFR1(31-2)相互作用(AlphaScreen)
圖28(28-1A至28-3G)：經純化之三價及四價VEGF×Ang2 VHH阻斷hAng2-hTie2(32-1)、mAng2-mTie2(32-2)及cAng2-cTie2(32-3)相互作用(ELISA)
圖29(29A至29F)：經純化之三價及四價VEGF×Ang2 VHH阻斷hAng2介導之HUVEC存活
圖30：序列最佳化及親和力VEGF×Ang2雙特異性VHH的描述
圖31(31-1A至31-2C)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH阻斷hVEGF-hVEGFR2(35-1)及hVEGF-hVEGFR1(35-2)相互作用(AlphaScreen)
圖32(32A及32B)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH結合人類VEGF165(36-1)及hVEGF121(36-2)(ELISA)
圖33(33A及33B)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH結合(A)小鼠及(B)大鼠VEGF164(ELISA)
圖34(34A至34D)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH結合(A)人類VEGF-B、(B)人類VEGF-C、(C)人類VEGF-D及(D)人類PlGF(ELISA)
圖35(35-1A至35-3C)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH阻斷hAng2-hTie2(39-1)、mAng2-mTie2(39-2)及cAng2-cTie2(39-3)相互作用(ELISA)
圖36(36A至36C)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH阻斷hAng1-hTie2相互作用(ELISA)
圖37(37A至37C)：經純化之VEGFANGBII00022-25-28 VEGF×Ang2 VHH阻斷hAng2介導之HUVEC存活
<110> 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司
<120> 結合VEGF及ANG2之雙特異性結合分子
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<223> 合成連接子
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<223> 突變型美洲駝序列
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<210> 211
<211> 515
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<223> 突變型美洲駝序列
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<210> 212
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<223> 突變型美洲駝序列
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<212> PRT
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<400> 214
<210> 215
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<211> 124
<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<210> 221
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 突變型美洲駝序列
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<223> 突變型美洲駝序列
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<400> 275

Claims (44)

  1. 一種雙特異性結合分子，其包含至少一個VEGF結合組分、至少一個Ang2結合組分及至少一個血清白蛋白結合組分，其中該Ang2結合組分結合Ang2之效力為結合Ang1或Ang4之效力的至少5,000倍。
  2. 如請求項1之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分至少包含具有四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區的可變域，其中該CDR3具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列Ser Arg Ala Tyr Xaa Ser Xaa Arg Leu Arg Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Tyr，其中位置5之Xaa為Gly或Ala；位置7之Xaa為Ser或Gly；位置12之Xaa為Gly、Ala或Pro；位置13之Xaa為Asp或Gly；位置16之Xaa為Asp或Glu；且其中該VEGF結合組分能夠以60%之抑制率阻斷人類重組VEGF165與人類重組VEGFR-2之相互作用。
  3. 如請求項2之雙特異性結合分子，其中該CDR3具有選自以下之序列：SEQ ID NO：2 SRAYGSSRLRLGDTYDY；SEQ ID NO：3 SRAYGSSRLRLADTYDY；SEQ ID NO：4 SRAYGSSRLRLADTYEY；SEQ ID NO：5 SRAYGSGRLRLADTYDY；SEQ ID NO：6 SRAYASSRLRLADTYDY； SEQ ID NO：7 SRAYGSSRLRLPDTYDY；SEQ ID NO：8 SRAYGSSRLRLPGTYDY。
  4. 如請求項3之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分包含一或多個免疫球蛋白單可變域，其各含有a. CDR3，其具有選自SEQ ID NO：2至8所示之第一組序列的胺基酸序列；b. CDR1及CDR2，其具有如表3中所指示含於選自SEQ ID NO：9至46所示之第二組序列的序列中之胺基酸序列，其中該第二序列含有根據a)之該所選序列中的各別CDR3。
  5. 如請求項4之雙特異性結合分子，其中該一或多個免疫球蛋白單可變域為VHH。
  6. 如請求項5之雙特異性結合分子，其中該一或多個VHH具有選自SEQ ID NO：9-46所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
  7. 如請求項6之雙特異性結合分子，其包含一或多個具有選自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：25之胺基酸序列的VHH。
  8. 一種雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分係藉由如請求項7中所定義之VHH的親和力成熟及/或序列最佳化獲得。
  9. 如請求項8之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分係藉由具有SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列之VHH的序列最佳化獲得。
  10. 如請求項9之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分具有選自SEQ ID NO：47-57所示之序列的胺基酸序列。
  11. 如請求項5之雙特異性結合分子，其中該VEGF結合組分包含兩個或兩個以上VHH，其為a.相同VHH，其能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用或b.不同VHH，其結合VEGF之不重疊抗原決定基，其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷重組人類VEGF與重組人類VEGFR-2之間的相互作用且其中至少一個VHH能夠以60%之抑制率阻斷該相互作用。
  12. 如請求項11之雙特異性結合分子，其中該等相同VHH a)係選自具有SEQ ID NO：9-46所示之胺基酸序列的VHH或藉由該VHH之親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之VHH。
  13. 如請求項12之雙特異性結合分子，其中該VHH係選自具有SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：47-57所示之胺基酸的VHH。
  14. 如請求項13之雙特異性結合分子，其包含兩個各具有SEQ ID NO：57所示之胺基酸序列的VHH。
  15. 如請求項14之雙特異性結合分子，其中a.抑制率60%之該一或多個VHH係選自i.具有選自SEQ ID NO：9-46所示之胺基酸序列的胺基酸序列之VHH或ii.藉由該等VHH之親和力成熟及/或序列最佳化所獲 得之VHH，且其中b.抑制率60%之該一或多個VHH係選自i.SEQ ID NO：58-124或ii.藉由該VHH之親和力成熟及/或序列最佳化所獲得之VHH。
  16. 如請求項15之雙特異性結合分子，其中兩個VHH含於具有SEQ ID NO：128-168所示之胺基酸序列的多肽中，由如表13中所示之連接子序列分隔。
  17. 如請求項16之雙特異性結合分子，其中該VHH a)i.具有SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列且該VHH b)i.具有SEQ ID NO：64所示之胺基酸序列。
  18. 如請求項17之雙特異性結合分子，其中根據a)ii)之該等VHH係選自具有SEQ ID NO：47-57所示之胺基酸序列的VHH且其中根據b)ii)之該等VHH係選自具有SEQ ID NO：125-127所示之胺基酸序列的VHH。
  19. 如請求項18之雙特異性結合分子，其包含兩個VHH，其中一者具有SEQ ID NO：57所示之胺基酸且其中一者具有SEQ ID NO：127所示之胺基酸。
  20. 如請求項1至19中任一項之雙特異性結合分子，其包含Ang2結合組分，該Ang2結合組分至少包含具有四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區的可變域，其中該CDR3具有選自SEQ ID NO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
  21. 如請求項20之雙特異性結合分子，其中該Ang2結合組分為經分離之免疫球蛋白單可變域或含有該等免疫球蛋白單可變域中之一或多者的多肽，其中該免疫球蛋白單可變域由四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區組成，且其中該CDR3具有選自SEQ ID NO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
  22. 如請求項21之雙特異性結合分子，其中該一或多個免疫球蛋白單可變域含有a. CDR3，其具有選自SEQ ID NO：226、229、232、235、238、241、244、247、250或253(表49)所示之第一組胺基酸序列的胺基酸序列；b. CDR1，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所指示作為部分序列含於選自SEQ ID NO：224、227、230、233、236、239、242、245、248或251(表49)所示之第二組胺基酸序列的序列中之胺基酸序列；c. CDR2，其具有如表36-A、38-A、41-A或45-A所指示作為部分序列含於選自SEQ ID NO：225、228、231、234、237、240、243、246、249或252(表49)所示之第二組胺基酸序列的序列中之胺基酸序列。
  23. 如請求項20之雙特異性結合分子，其中該一或多個免疫球蛋白單可變域為VHH。
  24. 如請求項23之雙特異性結合分子，其中該一或多個VHH具有選自SEQ ID NO：214、215、216、217、218、219、 220、221、222或223所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
  25. 一種免疫球蛋白單可變域，其係藉由如請求項22中所定義之免疫球蛋白單可變域的親和力成熟獲得。
  26. 一種VHH，其係藉由如請求項24中所定義之VHH的親和力成熟獲得。
  27. 一種結合Ang2之VHH，其具有選自SEQ ID NO：214、215、216、217、218、219、220、221、222或223所示之酸序列的胺基酸序列。
  28. 一種免疫球蛋白單可變域，其係藉由如請求項27中所定義之VHH的人類化獲得。
  29. 一種免疫球蛋白單可變域，其係藉由如請求項22中所定義之免疫球蛋白單可變域的人類化獲得。
  30. 如請求項1至19中任一項之結合分子，其中該血清白蛋白結合組分為經分離之免疫球蛋白單可變域或含有該等免疫球蛋白單可變域中之一或多者的多肽，其中該免疫球蛋白單可變域由四個構架區及三個分別為CDR1、CDR2及CDR3之互補決定區組成，且其中該CDR3具有選自SEQ ID NO：257、260、263、266、269、272或275所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
  31. 如請求項30之結合分子，其中該一或多個免疫球蛋白單可變域含有a. CDR3，其具有選自SEQ ID NO：257、260、263、266、269、272或275所示之第一組胺基酸序列的胺基酸序列； b. CDR1，其具有選自SEQ ID NO：255、258、261、264、267、270或273所示之第二組胺基酸序列的胺基酸序列；c. CDR2，其具有選自SEQ ID NO：256、259、262、265、268、271或274所示之第二組胺基酸序列的胺基酸序列。
  32. 如請求項30之雙特異性結合分子，其中該一或多個免疫球蛋白單可變域為VHH。
  33. 如請求項32之雙特異性結合分子，其中該一或多個VHH具有SEQ ID NO：98或254所示之胺基酸序列。
  34. 如請求項1至19中任一項之雙特異性結合分子，其具有選自SEQ ID NO：180-213所示之胺基酸序列的胺基酸序列。
  35. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至24及30至34中任一項之雙特異性結合分子，如請求項25、28及29中任一項之免疫球蛋白單可變域，或如請求項26或27之VHH。
  36. 一種載體，其含有如請求項35之核酸。
  37. 一種宿主細胞，其含有如請求項35之核酸分子或如請求項36之載體。
  38. 一種醫藥組合物，其含有至少一種如請求項1至24及30至34中任一項之雙特異性結合分子，如請求項25、28及29中任一項之免疫球蛋白單可變域，或如請求項26或27之VHH作為活性成分。
  39. 如請求項38之醫藥組合物，其係用於治療與VEGF及/或 Ang2介導之對血管生成的作用相關之疾病。
  40. 如請求項39之醫藥組合物，其係用於治療癌症及癌性疾病。
  41. 如請求項39之醫藥組合物，其係用於治療眼病。
  42. 一種如請求項1至24及30至34中任一項之雙特異性結合分子，如請求項25、28及29中任一項之免疫球蛋白單可變域，或如請求項26或27之VHH的用途，其係用於製造供治療與VEGF及/或Ang2介導之對血管生成的作用相關之疾病的藥劑。
  43. 一種如請求項1至24及30至34中任一項之雙特異性結合分子，如請求項25、28及29中任一項之免疫球蛋白單可變域，或如請求項26或27之VHH的用途，其係用於製造供治療癌症及癌性疾病之藥劑。
  44. 一種如請求項1至24及30至34中任一項之雙特異性結合分子，如請求項25、28及29中任一項之免疫球蛋白單可變域，或如請求項26或27之VHH的用途，其係用於製造供治療眼病之藥劑。
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