KR20140016345A - Dll4와 Ang2에 결합하는 이중특이성 결합분자 - Google Patents

Dll4와 Ang2에 결합하는 이중특이성 결합분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Dll4와 Ang2를, 바람직하게 VHH와 도메인 항체 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인 형태로 결합하는 이중특이성 결합분자, 이를 함유하는 약학 조성물 및, 신생혈관형성에 대한 Dll4- 및/또는 Ang2-매개 효과와 연관된 질환의 치료에서 이들의 용도에 관한 것이다. 또한, 이중특이성 결합분자를 코딩하는 핵산, 숙주세포 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Dll4와 Ang2에 결합하는 이중특이성 결합분자{BISPECIFIC BINDING MOLECULES BINDING TO DLL4 AND ANG2}
본 발명은 사람의 치료요법 분야에 관한 것으로, 구체적으로 암 치료요법과 이러한 치료요법에 유용한 약물 및 조성물에 관한 것이다.
종양의 임계크기가 약 1 mm3에 이르면 종양은 산소와 영양분을 갖는 혈액공급을 유지하는 신생혈관형성(angiogenesis)에 의존하게 되어 추가 성장할 수 있다. 항-신생혈관형성 요법은 여러 종류의 종양에서 중요한 치료방법이 되고 있다. 이러한 요법들은 VEGF 경로(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400)를 VEGF(Avastin) 또는 그의 리셉터(Sutent 및 Sorafinib)를 중화하여 블로킹하는데 집중되어 있다. 최근의 마우스 연구에서는 Tie2 리셉터의 리간드인 Angiopoietin2 (Ang2)가 VEGF 같은 다른 혈관신생인자의 기능을 수행하여 혈관 리모델링을 조절하는 것으로 나타났다. Ang2는 내피세포에 의해 주로 발현되고, 저산소증과 다른 혈관신생인자들에 의해 강력하게 유도되며 종양 혈관 형성성을 조절하여 혈관이 VEGF 및 FGF2에 반응할 수 있도록 하는 것으로 입증되었다 (Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). 이러한 역할에 부합하여, Ang2의 결실 또는 저해가 신생혈관형성을 감소시켰다(Falcon et al., Am J Pathol. 2009 Nov; 175(5):2159-70). 대장암, NSCLC 및 흑색종 환자에게서 높은 Ang2 혈청 농도가 보고되었다(Goede et al., Br J Cancer. 2010 Oct 26; 103(9): 1407-14),(Park et al., Chest. 2007 Jul;132(1): 200-6), (Helfrich et al., Clin Cancer Res. 2009 Feb 15; 15(4):1384-92). CRC 암에서 Ang2 혈청 농도는 항-VEGF 요법에 대한 치료반응과 연관되어 있다.
Ang-Tie 시스템은 2개의 리셉터(Tie1 및 Tie2)와 3개 리간드(Ang1, Ang2 및 Ang4)로 구성되어 있다(Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77.). Tie2, Ang1 및 Ang2는 이러한 종류들 중 가장 잘 연구된 것들이며, Tie1은 희귀 리셉터(orphan receptor)이고, 혈관 리모델링에서 Ang4의 역할은 여전히 규명되어야 한다. Ang2 및 Ang1은 Tie2 결합과 활성화에 대한 대항 작용을 매개한다. Ang2 매개 Tie2 활성화는 내피세포 활성화, 주위세포 분해, 혈관 누출 및 혈관 발아(vessel sprouting)의 유도를 유발한다. Ang2에 비하여 Ang1 시그널링은 주위세포의 보충에 의해 혈관 통합을 유지하여 내피세포 정적(quiescence)을 유지한다.
Angiopoietin 2(Ang2)는 Tie2 리셉터 티로신 키나제에 대한 66 kDa의 분비 리간드이다(Augustin et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Mar; 10(3): 165-77). Ang2는 N-터미널의 꼬여진 코일 도메인과 C-터미널 피브리노겐 유사 도메인으로 구성되며, 후자는 Tie2 상호작용에 필요하다. Ang2는 내피세포에 의해 주로 발현되고, 저산소증과 VEGF를 포함한 다른 혈관신생인자들에 의해 강력하게 유도된다. Tie2는 내피세포, 조혈성줄기세포 및 종양세포에서 발견된다. Ang2-Tie2는 종양 혈관 형성성을 조절하여 혈관이 VEGF 및 FGF2에 반응할 수 있도록 하는 것으로 입증되었다.
시험관 내에서 Ang2는 완만한 미토겐, 화학유인물질 및 사람 제정맥 내피세포(HUVEC) 내 튜브 형성 인듀서로 작용하는 것으로 나타났다. Ang2는 섬유아세포에서 이소성으로 발현된 Tie2의 티로신 인산화를 유발하고, HUVEC 내에서 ERK-MAPK, AKT 및 FAK의 인산화 같은 하위 시그널링 이벤트를 촉진한다. Ang1 유도성 내피세포 반응에서 Ang2의 길항적 역할이 설명되어 왔다.
Ang2 결핍은 마우스에서 중증의 림프 패턴화 결합을 유발하는 것으로 입증되었다. Ang2의 상실이 배아 혈관 발달에 불필요할 수 있지만 Ang2 결핍 마우스는 망막과 신장에서 지속적인 혈관 결함을 가진다. 신생혈관형성 부위(예를 들어, 난소)에서의 Ang2 발현의 다이나믹 패턴과 함께, 이러한 발견은 Ang2가 VEGF 같은 다른 혈관신생인자의 작용을 수행하여 혈관 리모델링을 조절하는 것을 시사한다.
Ang2-Tie2 시스템은 혈관신생 스위치와 종양 신생혈관형성의 후기 단계에서 결정적인 역할을 한다. Ang2 발현은 종양 연관 내피에서 강력하게 상향 조절된다. Ang2 결핍 마우스에, 특히 종양 성장의 초기 단계 동안 이식되었을 때 종양 성장의 감소가 관찰되었다. Ang2 mAbs에 의한 Ang2의 치료적 블로킹은 다양한 종양 이종이식 모델에서 광범위한 효능을 나타내었다.
US 2008/0014196에 요약된 바와 같이, 신생혈관형성은 고형 종양과 전이를 포함하여 수많은 장애의 발병에 연관되어 있다.
종양 성장의 경우에 신생혈관형성은 과형성에서 신생물형성으로의 전이 및, 종양의 성장과 전이에 양분을 공급하는데 중요한 것으로 보인다. Folkman 등의 문헌[Nature 339-58 (1989)]에 따르면, 이렇게 하여 종양 세포가 정상 세포와 비교하여 성장 이점을 얻을 수 있다. 따라서, 항-신생혈관형성 요법은 다양한 종류의 종양에 있어서 중요한 치료방법이 되었다. 이러한 요법들은 VEGF 경로를 블로킹(blocking)하는데 집중하고 있다(Ferrara et al., Nat Rev Drug Discov. 2004 May;3(5):391-400).
Notch 시그널링 경로는 세포-세포 커뮤니케이션에 중요하고, 배아 발생 동안과 성체에서 수많은 세포 분화 과정을 조절하는 유전자 조절 메카니즘에 관여한다. Notch 시그널링은 많은 암들, 예를 들어 T-세포 급성 림프구성 백혈병과 고체 종양에서 이상조절된다(Sharma et al. 2007, Cell Cycle 6 (8): 927-30; Shih et al., Cancer Res. 2007 Mar 1;67(5): 1879-82).
Dll4 (또는 Delta like 4 또는 delta-like ligand 4)는 Notch 리간드의 델타 그룹 중 하나이다. Dll4의 세포외 도메인은 N-터미널 도메인, Delta/Serrate/Lag-2(DSL) 도메인, 및 8개 상피성장인자 (EGF)-유사 반복물의 탠덤(tandem)으로 구성된다. 일반적으로 EGF 도메인은 아미노산 잔기 218-251 (EGF-1; 도메인 1), 252-282 (EGF-2; 도메인 2), 284-322 (EGF-3; 도메인 3), 324-360 (EGF-4; 도메인 4), 및 362-400 (EGF-5; 도메인 5)을 포함하는 것으로 인식되며, hDll4의 아미노산 잔기 약 173-217의 DSL 도메인과 아미노산 잔기 약 27-172의 N-터미널 도메인을 가진다(WO 2008/076379).
Dll4는 혈관 내피에 의해, 특히 동맥 내피에서 고도의 선택 발현을 나타내는 것으로 보고되었다(Shutter et al . (2000) Genes Develop.　14: 1313-1318). 최근의 마우스 연구에서 Dll4는 VEGF에 의해 유도되며 혈관 발아와 분지를 제어하는 네거티브 피드백 조절제인 것으로 나타났다. 이러한 역할과 일치하여, Dll4의 결실 또는 저해는 과도한 신생혈관형성을 일으킨다(Scehnet et al ., Blood. 2007 Jun 1; 109(11):4753-60). 이러한 억제되지 않은 신생혈관형성은 역설적으로 항VEGF 치료요법에 대해 저항성인 종양에서조차도 비생산성 맥관구조의 형성으로 인하여 종양 성장을 감소시킨다(Thurston et al ., Nat Rev Cancer. 2007 May;7(5):327-31; WO 2007/070671; Noguera-Troise et al ., Nature. 2006 Dec 21; 444(7122)). 또한, VEGF와 Dll4를 함께 저해하는 것은 복수의 종양 종류의 이종이식 모델에서 항VEGF만을 비교하여 우수한 항종양활성을 제공하는 것으로 나타났다(Noguera-Troise et al., Nature. 2006 Dec　21; 444(7122):1032-7; Ridgway et al ., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7).
이러한 결과로 인하여, Dll4는 암 치료요법의 유망한 타겟으로 여겨지고 있으며, Dll4를 표적으로 하는 (사전)임상개발 중인 다양한 생물학적 화합물들은 다음에 기술된 바와 같다: REGN-421 (= SAR153192; Regeneron, Sanofi-Aventis; WO2008076379) 및 OPM-21M18 (OncoMed) (Hoey et al ., Cell Stem Cell. 2009 Aug　7; 5(2):168-77), 둘다 전체 사람 Dll4 항체; YW152F (Genentech), 인간화된 Dll4 항체(Ridgway et al ., Nature. 2006 Dec 21;444(7122):1083-7); Dll4-Fc (Regeneron, Sanofi-Aventis), Dll4의 세포외 영역과 사람 IgG1의 Fc 영역으로 구성된 재조합 융합 단백질 (Noguera-Troise et al ., Nature. 2006 Dec 21;444(7122)).
그러나, 최신기술의 모노클로날 항체(MAbs)와 융합 단백질은 이들의 치료학적 적용 측면에서 몇 가지 단점이 있다: 이들은 분해를 방지하기 위해 거의 동결온도에 저장해야만 한다. 또한, 이들은 소화관에서 빨리 분해되기 때문에 경구투여에 적합하지 않다. 암 치료요법에서 MAbs의 또다른 중요한 제한점은 불량한 이송으로, 이로 인하여 농도가 낮고 종양에서 모든 세포를 표적으로 하지 못한다.
본 발명의 목적은 사람의 치료요법을 위한 신규한 항-혈관신생 결합분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 이러한 결합분자 및 이를 포함하는 조성물의 용도 및/또는 투여를 포함하는, 상기 질환, 장애 또는 상태의 예방, 치료, 완화 및/또는 진단을 위한 방법을 제공하는 것이다. 특히 본 발명의 목적은 현재 사용되거나/되고 종래기술에서 알려진 약제, 조성물 및/또는 방법과 비교하여 이점을 제공하는 약리학적으로 활성인 결합분자, 조성물 및/또는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이점은, 특히 상기한 바와 같은 일반적인 항체 또는 이들의 단편과 비교하였을 때, 예를 들어 제조목적에서 개선된 치료학적 및/또는 약리학적 특성 및/또는 다른 유리한 특성을 포함한다.
제1 측면에 따라, 이중특이성 결합분자, 바람직하게 이중특이성 면역글로불린, 바람직하게 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 및 도메인 항체를 제공하며, 이것은 단일 분자 내에 적어도 하나의 DLL4-결합성분과 적어도 하나의 Ang2-결합성분을 포함한다. 이중특이성 결합분자들은 바람직하게 추가의 결합성분, 바람직하게 혈청 알부민에 결합하는 결합성분을 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 필수적으로 (i) 적어도 하나의 Dll4 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 Dll4 결합성분과 (ii) 적어도 하나의 Ang2 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 Ang2 결합성분을 포함하고, 여기에서 성분들은 이들이 동시에 Dll4와 Ang2에 결합하거나 이들이 한번에 Dll4 또는 Ang2에 결합하는 방법으로 서로 연결된다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 두 성분은 서로에 대해 독립적으로 VHH 또는 도메인 항체, 및/또는 여기에서 정의된 VL 도메인 같은 다른 유형의 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하지만, 단 이러한 면역글로불린 단일 가변 도메인 각각은 항원, 즉 Dll4 또는 Ang2 각각과 결합하게 된다.
바람직한 구체예에 따라, 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 같은 종류의 것이며, 특히 모든 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 VHH 또는 도메인 항체들이다.
특히 바람직한 구체예에 따라, 모든 면역글로불린 단일 가변 도메인들은 VHH, 바람직하게 인간화된(또는 여기에서 정의된 바와 같은 "서열 최적화된") VHH이다. 따라서, 본 발명은 (임의로 인간화되거나 서열 최적화된)항-Dll4 VHH 및 (임의로 인간화되거나 서열 최적화된)항-Ang2 VHH를 포함하는 이중특이성 결합분자에 관한 것이다.
그러나, 당업자들에게 있어서 본 내용이 다른 항-Dll4 또는 항-Ang2 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 도메인 항체를 포함하는 이중특이성 결합분자에 유사하게 적용될 수 있다는 것은 명확하다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 결합분자를 코딩하는 핵산 및 이를 함유하는 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 이중특이성 결합분자 및 임의로 조성물의 추가 성분 하나 이상을 함유하거나 포함하는 생성물 또는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 이중특이성 결합분자, 핵산, 숙주세포, 생성물 및 조성물을 제조 또는 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 여기에 기술된 이중특이성 결합분자, 핵산, 숙주세포, 생성물 및 조성물의 적용과 용도뿐만 아니라 Dll4 저해로 조절될 수 있는 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 이중특이성 결합분자의 Ang2 결합성분은 Ang1 또는 Ang4보다 적어도 5,000 배 초과, 바람직하게 10,000 배 초과의 역가로 Ang2에 결합하는 것을 발견하였다. 이는 Ang1 매개 시그널링의 활성화 블로킹을 상당히 방지하여 의도된 항-혈관신생 효과에 대응할 것이다.
본 발명에 따른 이중특이성 결합분자의 DLL4 결합성분은 Dll1, Jagged1보다, 및 바람직하게 또한 Jagged2에 대해서 적어도 1,000 배 초과의 친화도로 DLL4-A에 결합하는 것을 발견하였다. 이러한 선택성으로 인하여 원치않는 부작용을 방지할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 결합된 VHH 도메인(linked VHH domain)으로서 제공된다. 이 분자들은 일반적인 항체보다 훨씬 더 작고, 따라서 일반적 항체들보다 종양 내에 더 깊이 침투하는 능력이 있다. 이러한 이점은 글리코실화 부위에서 자유로워진 후에 여기에 기술된 특이 서열에 의해 더 두드러진다.
게다가, 이중특이성 성질(1 분자 내 Dll4- 및 Ang2-결합성분)로 인하여 양 작용그룹의 종양 투과성이 필수적으로 동등하게 되고, 이로써 Dll4 및 Ang2의 조합된 길항작용의 유리한 효과가 확실하게 종양 투과의 전체 깊이 내에 제공될 것이다. 이것은 이들 표적물에 대한 개별 길항제의 조합보다 유리한 것으로, 왜냐하면 개별 길항제의 투과 깊이는 항상 어느 정도까지 변화하기 때문이다. 본 발명의 바람직한 이중특이성 결합분자의 다른 이점은 여기에 기술된 혈청 알부민 결합분자 같은 혈청 알부민 결합성분으로 인한 이들의 증가된 혈청 반감기이다.
본 발명에 대한 이러한 측면과 다른 측면, 구체예, 이점 및 적용은 이하의 상세한 설명에 의해 더욱 명확해질 수 있다.
정의
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어들은 당업자들에게 명백한 당업계에서의 일반적인 의미를 가진다. 예를 들어, 다음과 같은 표준 핸드북뿐만 아니라 여기에서 인용된 일반적인 배경기술을 참조할 수 있다: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), 및 Roitt et al ., "Immunology" (2nd　Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989). 또한, 달리 표시되지 않는 한, 상세하게 특별히 기술되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 당업자들에게 자명하게 그 자체로 알려진 방법으로 수행될 수 있고 수행되었다. 또한, 예를 들어 표준 핸드북, 위에서 언급된 일반적 배경기술 및 거기에 인용된 추가 참고문헌을 참조할 수 있다.
"이중특이성 결합분자"란 용어는 적어도 하나의 Ang2-결합분자(또는 "Ang2-결합성분")와 적어도 하나의 Dll4-결합분자(또는 "Dll4-결합성분")을 포함하는 분자를 지칭한다. 이중특이성 결합분자는 하나 초과의 Ang2-결합분자 및/또는 하나 초과의 Dll4-결합분자를 함유할 수 있는데, 즉 이중특이성 결합분자가 Ang2 또는 Dll4에 결합하는 분자 부분, 즉 그의 "Ang2-결합성분"(또는 항-Ang2 성분) 또는 "Dll4-결합성분"(또는 항-Dll4 성분) 각각에 (이하에 정의된 바와 같은)바이파라토프(biparatopic) Ang2-결합분자 및/또는 바이파라토프 Dll4-결합분자를 함유하는 경우에서이다. 그러나, 본 발명에서 "이중특이성"이란 용어가 이중특이성 결합분자에서 Dll4과 Ang2 이외의 분자에 대해 결합 특이성을 갖는 다른 결합성분을 배제하는 것으로 해석되지는 않아야 한다. 이러한 추가 결합성분의 비제한적 예는 혈청 알부민과 결합하는 결합성분이다.
달리 표시되지 않는 한, "면역글로불린"과 "면역글로불린 서열"이란 용어는-여기에서 중쇄(heavy chain) 항체 또는 일반적인 4-사슬 항체를 지칭하는데 사용되던지 간에-, 일반적인 용어로 사용되어 전체 크기 항체, 그의 개별적 사슬, 이들의 모든 부분, (비제한적으로 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인 각각과 같은 항원-결합 도메인 또는 단편을 포함하는)도메인 또는 단편을 포함한다. 또한, 여기에서 사용된 (예를 들어, "면역글로불린 서열", "항체 서열", "(단일) 가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열" 같은 용어에서)"서열"이란 용어는, 내용이 보다 제한된 설명을 필요로 하지 않는 한, 일반적으로 관련 아미노산 서열뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
여기에서 사용된 (폴리펩티드 또는 단백질의) "도메인"이란 용어는 나머지 단백질에 대하여 독립적으로 그의 삼차 구조를 유지하는 능력을 가지는 폴딩된 단백질 구조를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별 작용특성을 담당하고, 많은 경우에 나머지 단백질 및/또는 도메인의 작용 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전이될 수 있다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 도메인"은 항체 사슬(예컨대, 일반적인 4-사슬 항체의 사슬 또는 중쇄 항체의 사슬)의 구형 영역, 또는 본질적으로 이러한 구형 영역으로 구성되는 폴리펩티드를 지칭한다. 면역글로불린 도메인은 이것이 항체 분자의 면역글로불린 폴딩 특성을 유지하는 것을 특징으로 하며, 보존된 디설파이드 결합에 의해 임의로 안정화된 2개 베타 시트 내에 배열된 약 7개 역평행(antiparallel) 베타 가닥의 2층 샌드위치로 구성된다. 면역글로불린 도메인은 (a) 가변 도메인(들), 즉, 하나 이상의 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 가변 도메인"은 당업계와 이하에서 "프레임워크(framework) 영역 1" 또는 "FR1"; "프레임워크 영역 2" 또는 "FR2"; "프레임워크 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "프레임워크 영역 4" 또는 "FR4"로 각각 지칭되는 4개 "프레임워크 영역"으로 본질적으로 구성되는 면역글로불린 도메인을 의미하며; 프레임워크 영역은 3개의 "상보성(Complementarity) 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 간섭되며, CDR은 당업계와 이하에서 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"로 각각 지칭된다. 그러므로, 면역글로불린 가변 도메인의 일반적 구조 또는 서열은 다음과 같이 표시될 수 있다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. 이것이 항원 결합 부위를 수반하여 항원에 항체에 대한 특이성을 제공하는 면역글로불린 가변 도메인이다. 본 발명에 있어서는 VHH와 도메인 항체 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인이 바람직하다.
여기에서 사용된 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 추가적인 가변 면역글로불린 도메인과 쌍을 이루지 않고 항원의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 가변 도메인을 의미한다. 본 발명의 의미에서 면역글로불린 단일 가변 도메인의 일 예는 면역글로불린 단일 가변 도메인 VH 및 VL(VH 도메인과 VL 도메인) 같은 "도메인 항체"이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 다른 예는 이하에 정의된, 카멜리드(camelid)에서 유래한 "VHH 도메인"(또는 간단하게 "VHH")이다.
상기한 정의의 관점에서, 일반적인 4 사슬 항체(예를 들어, 당업계에 공지된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 분자), 또는 Fab 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드 결합된 Fv 또는 scFv 단편 같은 Fv 단편, 또는 일반적 4 사슬 항체에서 유도된 다이아바디(diabody)(모두 종래기술에서 공지됨)의 항원 결합 도메인은 통상적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 여겨지지 않는데, 왜냐하면 이러한 경우들에 있어서 항원의 각 에피토프에 대한 결합이 일반적으로 하나(단일)의 면역글로불린 도메인에 의해서 발생하는 것이 아니라, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 같은 한 쌍의 (결합하고 있는)면역글로불린 도메인, 즉 각 항원의 에피토프에 공동으로 결합하고 있는 면역글로불린 도메인의 VH-VL 쌍에 의해 발생할 수 있기 때문이다.
VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, 및 VHH 항체로도 알려진 "VHH 도메인"은 원래 "중쇄 항체"(즉, "경쇄가 없는 항체"; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993))의 항원 결합 면역글로불린 (가변) 도메인으로 기술되었다. "VHH 도메인"이란 용어는 일반적인 4 사슬 항체에 존재하는 중쇄 가변 도메인(여기에서는 "VH 도메인" 또는 "VH 도메인"으로 지칭)과 일반적인 4 사슬 항체에 존재하는 경쇄 가변 도메인(여기에서는 "VL 도메인" 또는 "VL 도메인"으로 지칭)으로부터 이들 가변 도메인을 구별하기 위해 선택된다. VHH 도메인은 특정하게 에피토프에 추가의 항원 결합 도메인 없이 결합할 수 있다(에피토프가 VH 도메인과 함께 VL 도메인에 의해 인식되는 일반적인 4-사슬 항체 내의 VH 또는 VL 도메인과 대조). VHH 도메인은 작고, 강력하며 단일 면역글로불린 도메인에 의해 형성된 효율적인 항원 인식 단위이다.
본 발명의 내용 중에서, VHH 도메인, VHH, VHH 도메인, VHH 항체 단편, VHH 항체, "Nanobody®" 및 "Nanobody® 도메인"("Nanobody"는 Ablynx N.V.(Ghent, Belgium)의 상표명이다)은 상호교환적으로 사용되고, (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 구조를 가지며; 제2 면역글로불린 가변 도메인을 필요로 하지 않고 에피토프에 특이적으로 결합하는)대표적인 면역글로불린 단일 가변 도메인이며, 이들은 예를 들어 WO 2009/109635의 도 1에 정의된, 소위 "홀마크(hallmark) 잔기"에 의해 VH 도메인과는 구별된다.
면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH의 아미노산 잔기는 Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38(1999)의 도 2에서 보이는 바와 같이 카멜리드의 VHH 도메인에 적용된, Kabat 등("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)이 제공한 VH 도메인에 대한 일반적 넘버링에 따라 번호가 매겨진다. 이 넘버링에 따르면,
- FR1은 1-30 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR1은 31-35 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR2는 36-49 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR2는 50-65 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR3는 66-94 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- CDR3는 95-102 위치의 아미노산 잔기를 포함하고,
- FR4는 103-113 위치의 아미노산 잔기를 포함한다.
그러나, -VH 도메인과 VHH 도메인에 대해 당분야에서 공지된 바와 같이- 각각의 CDR 내 아미노산 잔기의 총 수는 가변적일 수 있고 Kabat 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다는 것에 유의해야 한다(즉, Kabat 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열 내에 있지 않을 수 있거나, 실제 서열은 Kabat 넘버링에 의해 부여된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이것은 일반적으로 Kabat 넘버링이 실제 서열 내 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응하거나 상응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
유사한 방식으로 VHH 도메인에도 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기 넘버링을 위한 선택적 방법이 당분야에 공지되어 있다. 그러나, 본 명세서, 특허청구범위 및 도면에서, Kabat에 따르고 상기된 바와 같은 VHH 도메인에 적용된 넘버링은 별도의 지시가 없는 한, 다음과 같다.
VHH 도메인 내의 아미노산 잔기의 총 수는 일반적으로 110 내지 120, 주로 112 내지 115의 범위가 된 것이다. 그러나, 더 짧은 서열 및 더 긴 서열 또한 여기에 기술된 목적에 적합할 수 있다는 것에 유의해야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 및 도메인 항체는 이들을 치료요법에서 작용성 항원-결합분자로 사용하는데 매우 유리하게 만드는 다수의 독특한 구조적 특징과 작용 특성을 갖는다. 특히, 이에 제한되지 않고, (경쇄 가변 도메인과 쌍을 이루지 않으면서 항원에 작용적으로 결합하도록 자연적으로 "디자인된")VHH 도메인은 단일의 상대적으로 작은 작용성 항원 결합 구조 단위로서 기능할 수 있다.
그 독특한 특성으로 인하여 여기에 정의된 바와 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 또는 VH(또는 VL)는 -단독으로 또는 거대 폴리펩티드, 예를 들어 바이파라토프 분자의 일부로서- 많은 중요한 이점을 제공한다:
- 높은 친화도와 고선택성으로 항원을 결합하는데 단일 도메인만이 필요하기 때문에 2개의 별개 도메인을 제공할 필요가 없고 이러한 2개 도메인은 정확한 공간 형태와 구조로 존재하지 않을 수 있으며(즉, scFv와 같이, 특별히 설계된 링커를 사용);
- 면역글로불린 단일 가변 도메인이 단일 핵산 분자로부터 발현될 수 있고 (글리코실레이션 같은)번역후 변성이 필요하지 않고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다가 및 다종(multispecific) 포맷으로 용이하게 조작될 수 있고(여기에서 상세히 언급됨);
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 그의 타겟에 대하여 높은 특이성과 친화도, 낮은 고유 독성을 가지며 주입 또는 주사 이외의 대안적 경로로 투여될 수 있고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 열, pH, 프로테아제 및 다른 분해제 또는 조건에 매우 안정하여 냉각장치를 사용하지 않고 제조, 보관 또는 수송이 가능하고;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 소규모 및 상업적 규모로 제조하기 용이하고 비교적 저렴하다. 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 (예를 들어, 이하에 상세히 기술한 바와 같은)미생물 발효를 사용하여 생산할 수 있고, 예를 들어 일반적인 항체를 사용하는 것처럼, 포유동물 발현 시스템을 사용할 필요가 없으며;
- 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 단편과 비교하여 상대적으로 작고(대략 15 kDa, 또는 일반적인 IgG 보다 10배 더 작음), 따라서 조직(제한적인 것은 아니나, 예를 들어 고체 종양 및 다른 치밀 조직 포함)으로의 침투성이 높으며, 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 단편보다 더 많은 투여량으로 투여할 수 있고;
- VHH는 (4 사슬 항체로부터의 VH 도메인과 비교하여 특히 이들의 연장된 CDR3 루프로 인한)특이적인 이른바 "공동(cavity) 결합 특성"을 가지며, 따라서 일반적인 4 사슬 항체와 그의 항원 결합 단편이 접근할 수 없는 타겟과 에피토프에 접근할 수 있으며;
- (Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)에 기술된 마우스에서 유도된 항원 결합 도메인처럼)VHH는 매우 가용성이고 안정하며 응집경향이 없는 특별한 이점을 가진다.
본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들을 얻는 특정한 생물학적 공급원 또는 특이적 제조방법에 제한되지 않는다. 예를 들어, VHH는 다음 단계들을 포함하여 얻을 수 있다:
(1) 자연적으로 발생하는 중쇄 항체의 VHH 도메인을 단리하거나; 중쇄 항체 또는 VHH를 포함하는 라이브러리를 스크리닝하여 이들로부터 VHH를 단리하고;
(2) 자연적으로 발생한 서열을 가지는 VHH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(3) 임의로 친화도 성숙한 후, 자연적으로 발생한 서열을 가지는 VHH를 (여기에 기술된 바와 같이)"인간화"하거나 인간화된 VHH를 코딩하는 핵산을 발현하고;
(4) 동물 종, 특히 포유동물 종, 예를 들어 사람에서 유래한 자연적으로 발생한 항체의 면역글로불린 단일 가변 헤비 도메인을 (하기한 바와 같이)"카멜라이징(camelizing)"하거나 이러한 카멜라이즈된 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(5) VH를 "카멜라이징"하거나, 이러한 카멜라이징된 VH를 코딩하는 핵산 분자를 발현하고;
(6) 합성적 또는 반합성적으로 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하는 방법을 사용하고;
(7) VHH 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 핵산 합성 기술을 사용하여 제조한 다음, 이렇게 얻어진 핵산을 발현하고;
(8) 중쇄 항체 또는 VHH에 대하여 친화도 성숙, 돌연변이(예를 들어, 랜덤 돌연변이 또는 부위 특이적 돌연변이) 및/또는 VHH의 친화도 및/또는 특이성을 증가시키기 위한 다른 방법을 수행하거나/하고;
(9) 이전 단계들을 조합 또는 선택하는 단계.
상기한 단계들을 수행하는데 적합한 방법과 기술은 당분야에 공지되어 있으며 당업자들에게는 명백한 것이다. 예를 들어, 특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH 도메인을 얻는 방법은 WO2006/040153 및 WO2006/122786에 기술되어 있다.
특정 구체예에 따라, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 본 발명의 폴리펩티드 내에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 자연적으로 발생한 VHH 도메인의 아미노산 서열에 본질적으로 상응하지만, 상기한 자연 발생 VHH 서열의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 사람에서 유래한 일반적인 4-사슬 항체의 가변 헤비 도메인 내의 상응하는 위치(들)에서 발생한 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 "인간화" 또는 "서열-최적화"(임의로 친화도-성숙 이후)된 아미노산 서열을 갖는 VHH 도메인이다. 이는 당업자들에 의해 일반적으로 사용될 수 있는 당분야에서 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 특정한 구체예에서, 인간 생식세포 Vh3 서열 DP-29, DP-47, DP-51 또는 그의 일부에서 유래된 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있거나, 그에 대해 고도로 상동성이고, 임의로 JH5 같은 JH 서열과 조합될 수 있다. 따라서, 인간화 프로토콜은 임의의 VHH 잔기를 DP 47, DP 29 및 DP 51 같은 생식세포 VH 유전자의 상응하는 프레임워크 1, 2 및 3(FR1, FR2 및 FR3) 잔기로 단독 또는 조합하여 대체하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 적합한 프레임워크 영역(FR)은, 예를 들어 WO 2006/004678에 개시된 것들로부터 선택될 수 있고, 구체적으로 소위 "KERE" 및 "GLEW" 클래스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 대략 44 내지 47 위치에 아미노산 서열 G-L-E-W를 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인과 그의 개별적 인간화 대응물이다. 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.
예를 들어, 103 P,R,S-그룹 및/또는 (이하에 정의된)GLEW-그룹에 속하는 VHH에 대한 인간화 치환은 108Q 내지 108L이다. 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화 방법은 당분야에 알려져 있다.
치료상 적용을 고려하여 개선된 특성, 예를 들어 강화된 친화도 또는 감소된 면역원성을 갖는 결합한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 당분야에 공지된 기술, 예컨대 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발), CDR 그래프팅, 인간화, 다른 면역글로불린 서열로부터 유도된 단편의 조합, 오버랩핑 프라이머를 사용하는 PCR 조립 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하는 유사 기술; 또는 여기에 기술된 "서열 최적화"라고도 지칭된, 상기한 것들의 임의의 적합한 조합에 의해 개별적인 결합분자로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, 표준 핸드북뿐만 아니라 상세한 설명과 실시예를 참조할 수 있다.
적절한 경우, 친화도가 증가된 결합분자는 또다른 결합분자의 친화도-성숙에 의해 얻어질 수 있으며, 후자는 친화도-성숙 분자와 관련하여 "모체" 결합분자이다.
특이적 항원 또는 에피토프에 결합하는 VHH를 얻는 방법은, 예를 들어 WO2006/040153 및 WO2006/122786에 이미 기술되어 있다. 또한, 거기에 상세히 기술된 바와 같이, 카멜리드로부터 유도된 VHH 도메인은 원래 VHH 서열의 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기를 인간의 일반적인 4-사슬 항체 VH 도메인 내의 상응하는 위치에 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체함으로써 "인간화 (humanized)"(여기에서 "서열-최적화"로도 지칭되며, "서열-최적화"는 인간화 이외에도 잠재적인 번역 후 변성 부위의 제거와 같은 개선된 특질을 갖는 VHH를 제공하는 하나 이상의 돌연변이에 의한 서열의 추가 변성을 포함할 수 있다)될 수 있다. 인간화된 VHH 도메인은 하나 이상의 전체 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있고, 보다 더 특정한 구체예에서 임의로 JH5 같은 JH 서열과 조합된, DP-29, DP-47, DP-51, 또는 그의 일부로부터 유래된 인간 프레임워크 영역 서열을 함유할 수 있다.
"Dab" 및 "dAbs" (용어 "Domain Antibodies"와 "dAbs"는 GlaxoSmithKline 그룹사의 상표로서 사용된다)로도 알려진 도메인 항체는, 예를 들어 Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domain antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); 및 WO2003/002609에 기술되어 있다.
도메인 항체는 본질적으로 비-카멜리드 포유동물 항체, 특히 인간 4-사슬 항체의 VH 또는 VL 도메인에 해당한다. 단일 항원 결합 도메인으로서 즉, VL 또는 VH 도메인 각각과 쌍을 이루지 않고 에피토프와 결합하기 위해서는, 예를 들어 인간의 단일 VH 또는 VL 도메인 서열 라이브러리(library)를 사용함으로써 이러한 항원 결합 특성에 대한 특이적인 선택을 필요로 한다.
도메인 항체는 VHH처럼 약 13 내지 약 16 kDa의 분자량을 가지며, 전체 인간 서열로부터 유래한 경우에는, 예를 들어 인간의 치료 용도를 위한 인간화를 필요로 하지 않는다. 또한, 그것은 VHH 도메인의 경우와 같이 원핵생물의(prokaryotic) 발현 시스템에서도 잘 발현되고, 전체 제조 비용에 있어서 상당한 감소를 제공한다.
또한, 하나 이상의 상기한 CDR을 다른 "스캐폴드(scaffold)", 예를 들어 비제한적으로 인간의 스캐폴드 또는 비-면역글로불린 스캐폴드에 "이식(graft)"할 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 이러한 CDR 이식을 위한 적합한 스캐폴드 및 기술은 당분야에 잘 알려져 있다.
상호교환적으로 사용될 수 있는, "에피토프" 및 "항원 결정요인"이란 용어는 종래 항체 또는 본 발명의 폴리펩티드와 같은 항원-결합분자, 보다 구체적으로 상기 분자의 항원-결합부위에 의해 인식되는 폴리펩티드 같은 거대분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 면역글로불린에 대한 최소 결합부위를 정의하는 것이므로, 면역글로불린 특이성의 타겟을 나타낸다.
임의 에피토프, 항원 또는 단백질 (또는 적어도 하나의 그의 일부, 단편 또는 에피토프)에 "결합하거나" 또는 "특이적으로 결합할 수 있는", "친화도를 갖거나/갖고 특이성을 갖는" 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 일반적으로 항원-결합분자 또는 그의 단편)는 상기 에피토프, 항원 또는 단백질에 "대해" 또는 "그에 대향하는" 것이라고 일컬어지거나, 그러한 에피토프, 항원 또는 단백질에 대한 "결합"분자이다. 본 명세서에서, 또한 Dll4-결합성분은 "Dll4-중화"로서 불릴 수 있다.
일반적으로, "특이성"이란 용어는 특정한 항원-결합분자 또는 항원-결합 단백질(예컨대, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인) 분자가 결합할 수 있는 상이한 종류의 항원 또는 에피토프의 수를 지칭한다. 항원-결합분자의 특이성은 그의 친화도 및/또는 결합활성을 기초로 결정될 수 있다. 항원과 항원-결합 단백질의 분리에 대한 평형상수(KD)로 표시되는 친화도는 에피토프와 항원-결합 단백질상 항원-결합 부위 사이 결합력의 척도이다: KD값이 적을수록, 에피토프와 항원-결합분자 사이의 결합력은 더 강하다(선택적으로, 친화도는 또한 1/KD인 친화도 상수(KA)로서 표현될 수 있다). (예를 들어, 본 명세서의 상세한 설명에 기초하여)당업자에게 명확한 바와 같이, 친화도는 관심있는 특이적 항원에 따라 그 자체가 알려진 방식으로 측정될 수 있다. 결합활성은 항원-결합분자(예를 들어, 면역글로불린, 항체, 면역글로불린 단일 가변 도메인) 또는 이를 함유하는 폴리펩티드와 적절한 항원 사이의 결합력에 대한 척도이다. 결합활성은 에피토프와 항원-결합분자상 그의 항원 결합 부위 사이 친화도 및 항원-결합분자상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수, 모두와 관련되어 있다.
에피토프를 인식하는 항원-결합분자의 일부를 파라토프(paratope)라 한다.
별도의 지시가 없는 한, 용어 "Dll4-결합분자" 또는 "Ang2-결합분자"는 여기서 정의된 바와 같은, 항-Dll4 또는 항-Ang2 항체, 항-Dll4 항체 또는 항-Ang2 항체 단편, "항-Dll4 항체-유사 분자" 또는 "항-Ang2 항체-유사 분자" 및 임의의 이들과의 컨쥬게이트를 포함한다. 항체는 단일클론 항체 및 키메릭(chimerized) 단일클론 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "항체"란 용어는 숙주세포에서 재조합 발현에 의해 생산된 단일클론 항체와 같은 완전한 면역글로불린을 포함할 뿐만 아니라, 항체 단편, 또는 예를 들어 WO 2002/056910에 기술된 바와 같은 소위 "SMIP" ("Small Modular Immunopharmaceuticals")라 불리는 단일-사슬 항체 및 선형 항체를 포함하는 "항체-유사 분자"를 포함한다; 항체-유사 분자는 여기서 정의된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다. 항체-유사 분자의 다른 예는 면역글로불린 슈퍼 패밀리 항체(IgSF) 또는 CDR-이식 분자이다.
"Ang2-결합분자" 또는 "Dll4-결합분자"는 각각 1가 표적-결합분자 (즉, 각 표적의 하나의 에피토프와 결합하는 분자)뿐만 아니라 2가 또는 다가 결합분자 (즉, 하나 초과의 에피토프에 결합하는 결합분자, 예를 들어 이하에 정의된 바와 같은 "바이파라토픽(biparatopic)" 분자) 모두를 지칭한다. 하나 초과의 Ang2(또는 Dll4)-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 Ang2(또는 Dll4)-결합분자도 "포맷된(formatted)" 결합분자라 불리고, 이들은 표적-결합성분 내에서 면역글로불린 단일 가변 도메인 이외에 링커(linker) 및/또는 이펙터(effector) 작용을 갖는 잔기(moieties), 예를 들어 알부민-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인과 같은 반감기 연장(half-life-extending) 잔기, 및/또는 혈청 알부민 같은 융합 파트너 및/또는 PEG 같은 부착 폴리머를 포함할 수 있다.
여기서 사용된 "바이파라토픽 Ang2(또는 Dll4)-결합분자" 또는 "바이파라토픽 면역글로불린 단일 가변 도메인"이란 용어는 여기에서 정의된 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 결합분자를 의미하고, 여기에서 2개의 분자는 각 항원의 2개의 비중첩 에피토프에 결합한다. 본 바이파라토픽 결합분자는 에피토프에 대하여 다른 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 구성된다. 에피토프를 인식하는 항원-결합분자(예컨대, 항체 또는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 일부를 파라토프라 한다.
또한, 포맷된 결합분자는 비록 덜 바람직하기는 하나, 2개의 동일한 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는, 같거나 중첩하는 에피토프 또는 이들의 각 항원을 인식하는 2개의 상이한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 이 경우, VEGF와 관련하여 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VEGF 다이머를 형성하는 2개 모노머 각각의 같거나 중첩하는 에피토프에 결합할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 결합분자는 10E-5 내지 10E-14 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게 10E-7 내지 10E-14 몰/리터 (M) 이하, 더욱 바람직하게 10E-8 내지 10E-14 몰/리터, 및 더욱 더 바람직하게는 10E-11 내지 10E-13의 해리상수(KD) (Biacore 또는 Kinexa 어세이로 측정), 및/또는 적어도 10E7 ME-1, 바람직하게 적어도 10E8 ME-1, 더욱 바람직하게 적어도 10E9 ME-1, 예컨대 적어도 10E11 ME-1의 결합상수(KA)로 결합한다. 10E-4 M을 초과하는 임의의 KD값은 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 목적하는 항원, 즉 VEGF 또는 Dll4에, 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 10 nM 미만, 예컨대 500 pM 미만의 KD로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 대한 항원-결합 단백질의 특이적 결합은, 예를 들어 여기에 기술된 어세이, Scatchard 분석 및/또는 경쟁적 결합 어세이, 예컨대 방사면역어세이(RIA), 효소 면역어세이(EIA) 및 샌드위치 경쟁 어세이, 및 당분야에 그 자체가 알려진 이들의 다양한 이형을 포함하는, 공지된 임의의 적합한 방식으로 측정될 수 있다.
아미노산 잔기는 당분야에서 일반적으로 알려지고 동의된, 표준 3-문자 또는 1-문자 아미노산 코드에 따라 표시되었다. 두 개 아미노산 서열을 비교할 때, "아미노산 차이"란 용어는, 두 번째 서열에 비해, 참조 서열의 위치에서 지정된 번호의 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환을 의미한다. 치환의 경우, 이러한 치환은 바람직하게 아미노산의 보존적 치환이며, 이는 아미노산 잔기가 유사한 화학 구조를 갖고, 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 기타 생물학적 특성에 영향을 거의 미치지 않거나 근본적인 영향이 없는 또다른 아미노산 잔기로 대체되는 것을 의미한다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 WO 98/49185에서는, 아미노산의 보존적 치환이 바람직하게 하기 그룹 (ⅰ) - (ⅴ)의 하나의 아미노산이 동일 그룹 내의 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 치환이다: (ⅰ) 작은 지방족, 비극성, 또는 약간의 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (ⅱ) 극성, 음전하의 잔기 및 그들의 (하전되지 않은(uncharged)) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (ⅲ) 극성, 양전하의 잔기: His, Arg 및 Lys; (ⅳ) 거대 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (ⅴ) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존적 아미노산 치환은 다음과 같다: Ala을 Gly 또는 Ser으로; Arg을 Lys으로; Asn을 Gln 또는 His로; Asp를 Glu로; Cys를 Ser으로; Gln을 Asn으로; Glu을 Asp로; Gly을 Ala 또는 Pro으로; His을 Asn 또는 Gln으로; Ile을 Leu 또는 Val으로; Leu을 Ile 또는 Val으로; Lys을 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met을 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe을 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser을 Thr으로; Thr을 Ser으로; Trp을 Tyr으로; Tyr을 Trp 또는 Phe으로; Val을 Ile 또는 Leu으로 치환.
폴리펩티드 또는 핵산 분자는 - 예를 들어, 그것이 얻어진 본래의 생물학적 공급원 및/또는 반응 배지 또는 배양 배지와 비교할 때 - 상기 공급원 또는 배지에서 그와 결합된, 기타 단백질/폴리펩티드, 기타 핵산, 기타 생물학적 성분 또는 거대 분자와 같은, 적어도 하나의 기타 성분 또는 적어도 하나의 오염 물질, 불순물 또는 소량(minor) 성분으로부터 분리된 경우 "본질적으로 분리(형태)(로)"되었다고 본다. 특히, 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 적어도 2-배, 특히 적어도 10-배, 더욱 특히 적어도 100-배, 및 1000-배 이상까지 정제된 경우 "본질적으로 분리"된 것으로 간주한다. "본질적으로 분리된 형태로" 존재하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 바람직하게 적합한 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 같은 적합한 크로마토그래피 기술을 사용하여 판정할 때, 본질적으로 상동성(homogeneous)이다.
두 개의 Dll4-결합분자 서열 또는 두 개의 Ang2-결합분자 서열 간의 "서열 동일성(sequence identity)"은 그 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 의미한다. 이는 WO 2008/020079의 49쪽 및 50쪽의 f) 단락에서 설명된 바와 같이 계산 또는 판정될 수 있다. "서열 유사성(sequence similarity)"은 동일하거나, 아니면 보존적으로 치환된 아미노산의 백분율을 의미한다.
VHH 도메인에도 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기 넘버링의 대안적 방법이 당분야에 알려져 있다. 그러나, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 상세한 설명, 청구항 및 도면에서는 상기 설명된 바와 같이 VHH 도메인에 적용된, Kabat에 따른 넘버링을 따랐다.
"친화도-성숙된" Dll4-결합분자 또는 Ang2-결합분자, 특히 VHH 또는 도메인 항체는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변경을 포함하는데, 이는 각 모체 Dll4-결합분자 또는 Ang2-결합분자에 비해, Dll4 또는 Ang2에 대한 친화도를 개선한다. 본 발명의 친화도-성숙된 Dll4-결합분자 또는 Ang2-결합분자는 당분야에서 공지된 방법, 예를 들어 Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, 또는 Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA　91: 3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J.　Mol. Biol. 226(3): 889 896; KS　Johnson 및 RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
본 발명에서, "서열번호: x의 아미노산 서열"은, 달리 언급되지 않는 한, 각 서열번호: x에 나타낸 서열과 100 % 동일한 아미노산 서열;
a) 각 서열번호: x에 나타낸 서열과 적어도 80 퍼센트의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열;
b) 각 서열번호: x에 나타낸 서열과 3, 2, 또는 1 개의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
용어 "암" 및 "암성(cancerous)"은 제어되지 않은 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특성화되는 포유동물에서의 생리학적인 상태를 지칭하거나 기술한다. 본 발명의 이중특이성 결합분자로 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는, 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 아세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 및 백혈병(leukemia)를 포함한다. US 2008/0014196에서 Dll4 길항제로 치료될 수 있다고 제안된, 이러한 암의 보다 구체적인 예는, 편평세포암종(squamous cell cancer), 소세포폐암(small-cell lung cancer), 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer), 폐 선암(adenocarcinoma of the lung), 폐 편평암종(squamous carcinoma of the lung), 복막 암(cancer of the peritoneum), 간세포 암(hepatocellular cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 아교모세포종(glioblastoma), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간세포암(hepatoma), 유방암(breast cancer), 결장암(colon cancer), 대장암(colorectal cancer), 자궁내막암종(endometrial carcinoma) 또는 자궁암종(uterine carcinoma), 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 전립선암(prostate cancer), 외음암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암종(hepatic carcinoma), 위암(gastric cancer), 흑색종(melanoma), 및 다양한 유형의 두경부 암(head and neck cancer)을 포함한다. 신생혈관형성의 조절장애는 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 많은 장애를 일으킬 수 있다. 이들 장애는 비종양성(non-neoplastic) 및 종양성(neoplastic) 상태 모두를 포함한다. 종양은 상기한 것들을 비제한적으로 포함한다.
US 2008/0014196에서 Dll4 길항제로 치료될 수 있다고 제안된, 비종양성 장애의 비제한적인 예는, 원하지 않거나 비정상적인 비대증(hypertrophy), 관절염(arthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 건선(psoriasis), 건선판(psoriatic plaque), 사코이드증(sarcoidosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 죽상경화판(atherosclerotic plaque), 당뇨병(diabetic) 및 미숙아망막병증(retinopathy of prematurity)을 포함하는 기타 증식성 망막병증 (proliferative retinopathy), 수정체뒤섬유증식(retrolental fibroplasia), 신생혈관녹내장(neovascular glaucoma), 연령관련황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨황반부종(diabetic macular edema), 각막혈관신생(corneal neovascularization), 각막이식혈관신생(corneal graft neovascularization), 각막이식거부(corneal graft rejection), 망막/맥락막혈관신생(retinal/choroidal neovascularization), 전방각혈관신생(피부홍조)(neovascularization of the angle(rubeosis)), 혈관신생성 안질환(ocular neovascular disease), 혈관 재협착(vascular retenosis), 뇌동정맥기형(arteriovenous malformations: AVM), 뇌수막종(meningioma), 혈관종(hemangioma), 혈관섬유종(angiofibroma), 갑상선 과형성증 (thyroid hyperplasias, 그레이브스 병(Grave's disease) 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐염증, 급성 폐손상/ARDS, 패혈증, 원발(성) 폐고혈압증(primary pulmonary hypertension), 악성 폐낭삼출증(malignant pulmonary effusion), (예를 들어, 급성 뇌졸중/폐쇄성 뇌손상(closed head injury)/외상과 연관된)뇌부종(cerebral edema), 활액염(synovial inflammation), RA에서의 판누스 형성(pannus formation), 골화근염(myositis ossificans), 비대 골형성 (hypertropic bone formation), 골관절염(osteoarthritis(OA)), 난치성 복수(refractory ascites), 다낭성 난소병(polycystic ovarian disease), 자궁내막증(endometriosis), 체액 질환의 3차 스페이싱(3rd spacing of fluid diseases; 췌장염, 구획증후군(compartment syndrome), 화상, 장질환), 자궁종양(uterine fibroid), 조숙산통(premature labor), IBD와 같은 만성 감염(크론병 및 궤양성대장염), 신장 동종이식거부반응(renal allograft rejection), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 신증후군(nephrotic syndrome), (암이 아닌)원하지 않거나 비정상적인 조직 중량 증가, 혈우병성 관절(hemophilic joint), 비후흉터(hypertrophic scar), 모발성장 저해, 오시어-웨버 증후군(Osier-Weber syndrome), 화농육아종(pyogenic granuloma), 수정체후부섬유증식증(retrolental fibroplasias), 공피증(scleroderma), 트라코마(trachoma), 혈관유착(vascular adhesion), 윤활막염(synovitis), 피부염(dermatitis), 전자간증(preeclampsia), 복수(ascites), (심장막염과 연관된 것 같은)심낭삼출(pericardial effusion), 및 흉막삼출(pleural effusion)을 포함한다.
발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 Dll4 결합성분 및 적어도 하나의 Ang2 결합성분을 포함하는 이중특이성 결합분자에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 다른 결합성분, 바람직하게 혈청 알부민 결합성분(혈청 알부민 결합분자)을 추가로 포함하는 적어도 하나의 Dll4 결합성분 및 적어도 하나의 Ang2 결합성분을 포함하는 이중특이성 결합분자에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합분자의 혈청 알부민 결합성분은 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 상기한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 폴리펩티드이고, 여기에서 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개 프레임워크 영역과 3개 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 포함하고, 상기 CDR3는 서열번호: 522, 525, 528, 531, 534, 537, 또는 540에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
더욱 바람직하게, 혈청 알부민 결합성분의 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다음을 함유한다:
a. 서열번호: 522, 525, 528, 531, 534, 537, 또는 540에 나타낸 제1 그룹의 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
b. 서열번호: 520, 523, 526; 529, 532, 535, 또는 538에 나타낸 제2 그룹의 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
c. 서열번호: 521, 524, 527, 530, 533, 536, 또는 539에 나타낸 제2 그룹의 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2.
더욱 바람직한 구체예에서, 혈청 알부민 결합성분의 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH, 바람직하게 서열번호: 98 또는 519에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것이다.
바람직한 구체예에 따르면, Dll4 결합성분과 Ang2 결합성분은 적어도 하나의 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인과 적어도 하나의 Ang2 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 각각을 포함한다.
바람직한 측면에서, Dll4 결합성분과 Ang2 결합성분은 각각 적어도 하나의 Ang2 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인과 적어도 하나의 Dll4 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 각각을 포함하고, 여기에서 각각의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개 프레임 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 갖는다.
따라서, 본 발명의 이중특이성 결합분자에 함유된 항-Dll4 및/또는 항-Ang2 성분은 2(또는 그 이상)개의 항-Dll4(또는 항-Ang2, 각각) 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4(또는 Ang2) 표적 내에서 상이한 에피토프에 대향(directed)된다. 따라서, 이중특이성 결합분자 내의 2개 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 항원 특이성을 갖고, 따라서 상이한 CDR 서열을 갖는다.
이러한 2가(bivalent) 결합분자는, 두 개의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 두 개의 서로 다른 파라토프를 포함할 것이므로, 각각 "바이파라토프성 단일 도메인 항체 구조물(construct)"(면역글로불린 단일 가변 도메인이 단일 도메인 항체로 구성 또는 필수적으로 구성되는 경우), 또는 "바이파라토프성 VHH 구조물"(면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH로 구성 또는 필수적으로 구성되는 경우)로도 지칭된다.
본 발명의 이중특이성 결합분자에 있어서, 결합분자 하나 또는 양자는 2가일 수 있다; 예를 들어, Ang2-결합성분이 바이파라토프성이고 Dll4-결합성분이 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, Ang2-결합성분이 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인이고 Dll4-결합성분이 바이파라토프성일 수 있다.
본 발명의 이중특이성 결합분자에 있어서, 이것은 바람직하게 2가의 Ang2 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 바이파라토프성 VHH를 함유하는 Ang2 결합성분이다.
Dll4-결합성분은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 갖는 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하고, 여기에서 CDR3는 다음 서열번호에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다:
a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
c) 서열번호: 375 내지 395.
서열번호: 1 내지 166 및 458의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열 a)는 부분 서열로서 표 5와 서열번호: 167 내지 332 및 459에 기재된 제2 그룹 서열에서 선택된 상응하는 아미노산 서열 내에 함유된다.
서열번호: 333 내지 353의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열 b)는 부분 서열로서 표 16-A와 서열번호: 354 내지 374에 기재된 제2 그룹 서열에서 선택된 상응하는 서열 내에 함유된다.
서열번호: 375 내지 395의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열 c)는 부분 서열로서 표 16-B와 서열번호: 396 내지 416에 기재된 제2 그룹 서열에서 선택된 상응하는 서열 내에 함유된다.
제2 측면에서, Dll4-결합성분은 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각으로 구성되고, CDR3는 다음 서열번호에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다:
a) 서열번호: 1 내지 166 및 458,
b) 서열번호: 333 내지 353, 또는
c) 서열번호: 375 내지 395.
다른 측면에서, Dll4-결합성분의 면역글로불린 단일 가변 도메인은,
a) 서열번호: 1 내지 166 및 458에 기재된 제1 그룹 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
b) 표 5에 표시된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 167 내지 332 및 459에 기재된 제2 그룹 아미노산 서열에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2;를 함유하고, 여기에서 서열번호 1 - 166에 있어서 제1 그룹의 서열번호: x는 y = x + 166이라는 점에서 제2 그룹의 서열번호: y에 상응한다.
다른 측면에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은,
a) 서열번호: 333 내지 353에 기재된 제1 그룹 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
b) 표 16-A에 표시된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 354 내지 374에 기재된 제2 그룹 서열에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2;를 함유하고, 여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 y = x + 21이라는 점에서 제2 그룹의 서열번호: y에 상응한다.
다른 측면에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은,
a) 서열번호: 375 내지 395에 기재된 제1 그룹 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
b) 표 16-B에 표시된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 396 내지 416에 기재된 제2 그룹 서열에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2;를 가지고, 여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 y = x + 21이라는 점에서 제2 그룹의 서열번호: y에 상응한다.
바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이다.
다른 측면에서, VHH는 표 5와 서열번호: 167 내지 332 및 459에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
Ang2-결합성분은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 갖는 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하고, 여기에서 CDR3는 서열번호: 491, 494, 497, 500, 503, 506, 509, 512, 515, 또는 518에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
제2 측면에서, Ang2-결합성분은 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각을 포함하며, CDR3는 서열번호: 491, 494, 497, 500, 503, 506, 509, 512, 515, 또는 518에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
다른 측면에서, Ang2-결합성분의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다음을 함유한다:
a. 서열번호: 491, 494, 497, 500, 503, 506, 509, 512, 515, 또는 518 (또한 표 36 참조)에 기재된 제1 그룹 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
b. 표 22-A 또는 28에 표시된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 489, 492, 495, 498, 501, 504, 507, 510, 513, 또는 516 (또한 표 36 참조)에 기재된 제2 그룹 아미노산 서열에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
c. 표 22-A 또는 28에 표시된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 490, 493, 496, 499, 502, 505, 508, 511, 514, 또는 517 (또한 표 36 참조)에 기재된 제2 그룹 아미노산 서열에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR2.
바람직하게, Ang2-결합성분의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이고, 바람직하게 서열번호: 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 또는 488에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
다른 바람직한 구체예에서, Ang2-결합성분의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 여기에서 기술된 바와 같이 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙 또는 인간화에 의해 얻어진다.
마찬가지로, 본 발명은 또한 여기에 기술된 Ang2-결합성분의 VHH를 친화도 성숙 또는 인간화하여 얻어진 VHH에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 서열번호: 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 또는 488에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 Ang2-결합 VHH에 관한 것이다.
치료 용도에 있어서, 향상된 친화도 또는 감소된 면역원성(immunogenicity) 같은 개선된 특성을 갖는 Dll4- 및/또는 Ang2-결합성분은 본 발명의 개별 Dll4- 또는 Ang2-결합성분으로부터, (예를 들어, 합성, 랜덤 또는 자연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발하는)친화도 성숙, CDR 그래프팅(grafing), 인간화, 서로 다른 면역글로불린 서열에서 유도된 단편의 조합, 중첩 프라이머를 사용한 PCR 어셈블리(assembly), 및 당업자에게 공지된 면역글로불린 서열을 조작하는 유사 기술들; 또는 이들의 적절한 조합 같은 기술들에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상세한 설명과 실시예뿐만 아니라 표준 핸드북을 참조할 수 있다.
바람직하게, 증가된 친화도를 갖는 본 발명의 Dll4-결합성분은 또 다른 Dll4-결합성분의 친화도 성숙에 의해 얻어지는데, 친화도 성숙 분자에 대하여, 후자는 "모체" Dll4-결합성분을 나타낸다. 이것은 Ang2-결합성분에 대해서도 마찬가지이다.
그러므로, 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 Dll4- 또는 Ang2-결합분자는 위에서 정의된 모체 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙으로 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
친화도 성숙을 위해 적합한 모체 Dll4-결합성분은, 예를 들어 서열번호: 167 내지 332 및 459에 기재된 아미노산 서열을 갖는 상기한 VHH이다.
친화도 성숙을 위해 적합한 모체 Ang2-결합성분은, 예를 들어 서열번호: 479, 480, 481, 482, 483, 또는 484에 기재된 아미노산 서열을 갖는 상기한 VHH이다.
따라서, 본 발명은 또한 위에서 정의된 VHH의 친화도 성숙 및/또는 서열 최적화에 의해 얻어진 Ang2-결합분자, 예를 들어 서열번호: 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 서열 최적화로 얻어진 VHH에 관한 것이다. 후자의 VHH를 생성하기 위해 사용된 "소스(source)" 아미노산 서열은 서열번호: 479, 480, 또는 481에 기재되어 있다. 또한, 이러한 아미노산 서열은 본 발명의 결합분자에 적용될 수 있는 적합한 Ang2-결합성분이다.
여기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 결합분자는 바람직하게 적어도 하나의 혈청 알부민 결합성분을 포함한다. 그러므로, 특히 바람직한 결합분자는 적어도 하나의 Dll4-결합성분, 적어도 하나의 Ang2-결합성분 및 적어도 하나의 혈청 알부민 결합성분을 갖는다. 이러한 3가지 결합성분들의 순서는 도 16 또는 23에 나타낸 순서처럼 모든 가능한 순서일 수 있으며, 예를 들어 Dll4-, Ang2- 또는 혈청 알부민 결합성분이 N-터미널 또는 C-터미널일 수 있다. 특히 도 16의 기호설명표에 언급된 "00042", "00045" 또는 "00050"은 Ang2-결합성분을 나타내는 한편, "00018"은 Dll4-결합성분을 나타내고 "ALB11"은 혈청 알부민 결합성분을 나타낸다. 이들 중 어떤 것도 특정 서열로 이해되지 않아야 하며, 본 발명의 결합분자의 가능한 구성에 대한 내용에서 사용되는 경우 일반적으로 Ang2-, Dll4- 및 혈청 알부민 결합성분을 나타낸다.
그러나, 혈청 알부민 결합성분은 Dll4- 및 Ang2-결합성분(또는 그 반대) 사이에 있는 것이 바람직하고, 적어도 하나의 Ang2-결합성분이 N-터미널이고 이어서 적어도 하나의 혈청 알부민 결합성분, 그 다음에 C-터미널에 적어도 하나의 Dll4-결합성분이 이어지는 것이 특히 바람직하다. 이러한 구성이 특히 유용한 것으로 나타났다.
그러므로, 본 발명은 바람직한 측면에서 서열번호: 460-478에 기재된 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 적어도 하나의 Dll4-결합성분, 적어도 하나의 Ang2-결합성분 및 적어도 하나의 혈청 알부민 결합성분을 포함하는 결합분자에 관한 것이다.
여기서 사용된 "적어도 하나의" 결합성분(Ang2, Dll4 또는 혈청 알부민)은 본 발명의 결합분자가 여기에 기술된 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 바람직하게 표시된 1, 2, 3, 4, 또는 5 Ang2-, Dll4 및/또는 혈청 알부민 결합성분(즉, 독립체/유닛)을 함유할 수 있는 것을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 197에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 친화도 성숙으로 얻어진 Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 서열번호: 197에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH에서 유도된 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 354 내지 374에 기재된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 358에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 358에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 356에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 356에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열번호: 224에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 서열번호: 224에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH에서 유도된 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 396 내지 416에 기재된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인에서 선택된다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 402에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 402에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 416에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 416에 기재된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 407에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VHH이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서열번호: 413에 기재된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진다.
다른 구체예에 따라, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 위에서 정의된 VH 도메인이다.
또다른 구체예에 따라, 본 발명 또는 본 발명의 폴리펩티드에 존재하는 Dll4- 및/또는 Ang2-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 종류에서 대표적인 것은 "카멜화(camelized)", 즉 일반적인 4 사슬 항체에서 유래한 자연적으로 발생하는 가변 중쇄의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 자연적으로 발생한 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. 이것은 알려진 방법 자체로 수행할 수 있고, 당업자들에게 명백하며, 또한 국제 공개특허 WO 1994/04678을 참조할 수 있다. 이러한 카멜화는 VH-VL 경계와 소위 Camelidae Hallmark 잔기(예를 들어, 국제 공개특허 WO 1994/04678 참조)에 존재하는 아미노산 위치에서 우선적으로 발생할 수 있다. 이러한 "인간화"와 "카멜화" 방법 및 이들과 일치하는 바람직한 프레임워크 영역 서열은 국제 공개특허 WO 2006/040153의 46 및 98 페이지와 국제 공개특허 WO 2006/122786의 107 페이지에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 Dll4- 또는 Ang2-결합성분, 예를 들어 이들을 함유하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 폴리펩티드는, 이들이 Dll4 또는 Ang2 분자 각각에서 하나 이상의 에피토프와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 점에서 Dll4 또는 Ang2에 대해 특이성을 가진다.
Dll4- 및/또는 Ang2-결합성분과 그의 항원 Dll4 또는 Ang2 각각의 특이적 결합은 공지된 적합한 방법, 예를 들어 여기에 기술된 어세이, 스캐쳐드(Scatchard) 분석 및/또는, 방사면역검정법(RIA), 효소면역검정법(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경쟁 어세이 같은 경쟁적 결합 어세이와, 당업계에 알려진 이들의 상이한 변형으로 결정할 수 있다.
항원 Dll4와 관련하여, 본 발명의 Dll4 결합성분, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종에 제한되지 않는다. 따라서, 사람의 치료를 목적으로 하는 경우, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 바람직하게 사람 Dll4와 결합한다. 그러나, 다른 포유동물 종에서 유래한 Dll4와 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 있다. 하나의 종 형태의 Dll4와 결합한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 다른 종의 Dll4와 교차반응할 수 있다. 예를 들어, 사람 Dll4와 결합한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 영장류의 하나 이상의 다른 종의 Dll4 및/또는 질환에 대한 동물 모델, 예를 들어 원숭이(특히 사이노몰거스원숭이(Cynomolgus) 또는 벵골원숭이(Rhesus)), 마우스, 래트, 래빗, 돼지, 개 및, 특히 신생혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 및 장애의 동물 모델(예를 들어, 여기에서 언급된 종 및 동물 모델)에 사용된 하나 이상의 동물 종의 Dll4과 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 교차 반응성을 나타내는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 원숭이, 특히 사이노몰거스원숭이 또는 벵골원숭이, 또는 마우스와 래트 같은 숙지된 질환 모델에서 시험될 수 있도록 하였기 때문에 연구 및/또는 의약 개발에 유리하다. 이것은 Ang2에 대해서도 마찬가지이다.
또한, 본 발명의 Dll4-결합성분은 특이적 도메인 또는 이들이 대향하는 Dll4의 항원성 결정인자로 제한되거나 규정되지 않는다. 바람직하게, 치료학적 Dll4 길항제의 개발에서 동물 모델로 사용하고자 하는 사람 이외의 종에서 유래한 하나 이상의 Dll4 분자와의 교차 반응성에 비추어 Dll4-결합성분은 사람 Dll4와 고도의 동일성을 가지는 관심있는 Dll4의 영역 내의 에피토프를 인식한다. 예를 들어, 마우스 모델을 사용하는데 있어서, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 전체적으로 또는 부분적으로 EGF-2 도메인 내에 위치한 에피토프를 인식하여 사람과 마우스 간에 높은 동일성을 나타낸다. 이것은 Ang2에 대해서도 마찬가지이다.
그러므로, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서열번호: 417의 아미노산 잔기 252-282에 해당하는 EGF-2 도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 함유된 에피토프에 결합하는 그룹에서 선택된, Dll4-결합성분, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드가 여기에서 정의된 바와 같은 바이파라토프 분자이고 이것이 본 발명의 하나 초과의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하면, 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인 성분은 상기에서 정의된 EGF-2 도메인 내의 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4 및/또는 Ang2와 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 500 pM 미만 같은 10 nM 미만의 친화도(실시예 5.7에 기술된 바와 같이, 표면 플라스몬 공명 분석으로 측정)로 결합한다.
바람직하게, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 실시예 5.1에 기술된 경쟁 ELISA 어세이에서 측정된 바와 같이, 10-6 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위, 더욱 바람직하게 10-8 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위, 보다 더 바람직하게 10-9 내지 10-10 몰/리터 이하의 범위의 IC50값을 가진다.
본 발명의 비제한적인 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 Dll4-결합 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드는 Dll4와 10-5 내지 10-12 몰/리터 (M) 이하, 바람직하게 10-7 내지 10-12 몰/리터 (M) 이하, 더욱 바람직하게 10-8 내지 10-12 몰/리터 (M)의 해리상수(KD), 및/또는 적어도 107 M-1, 바람직하게 적어도 108 M-1, 더욱 바람직하게 적어도 109 M-1, 예컨대 적어도 1012 M-1의 결합상수(KA); 및 특히 500 nM 미만, 바람직하게 200 nM 미만, 더욱 바람직하게 500 pM 미만 같은 10 nM 미만의 KD로 결합한다. Dll4에 대한 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인의 KD와 KA값을 측정할 수 있다. 이것은 Ang2에 대해서도 마찬가지이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 중첩되지 않는(non-overlapping) 상이한 에피토프에서 항원 Dll4 또는 Ang2 각각에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 Dll4-결합성분에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 이러한 폴리펩티드는 (i) Dll4 또는 Ang2 각각의 제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인과 (ii) Dll4 또는 Ang2 각각의 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 본질적으로 구성되거나 포함하고, 여기에서 Dll4/Ang2의 제1 에피토프와 Dll4/Ang2의 제2 에피토프는 동일한 에피토프가 아니다. 다시 말해서, 본 발명의 이러한 폴리펩티드는 Dll4/Ang2에 존재하는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인으로 본질적으로 구성되거나 포함하며, 여기에서 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이들이 동시에 Dll4/Ang2를 결합할 수 있는 방법으로 서로에 결합된다. 이런 의미에서, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드가 Dll4/Ang2에 대한 적어도 2개의 결합부위를 포함한다는 점에서 "이가(bivalent)" 또는 "다가" 면역글로불린 구조물, 특히 "다가 면역글로불린 단일 가변 도메인 구조물"로 간주될 수 있다.
본 발명의 이러한 Dll4-결합성분은 (적어도) 2개의 항-Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하며, 여기에서 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4 분자 내의 상이한 에피토프에 대한 것이다. 따라서, 이들 2개 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상이한 항원 특이성을 가지게 됨에 따라 상이한 CDR 서열을 가진다. 이러한 이유로, 본 발명의 폴리펩티드는 여기에서 "바이파라토프 폴리펩티드" 또는 "바이파라토프 단일 도메인 항체 구조물"(만일 면역글로불린 단일 가변 도메인이 단일 도메인 항체로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다면) 또는 "바이파라토프 VHH 구조물"(만일 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다면)로 각각 명명되는데, 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 2개의 상이한 파라토프를 포함하기 때문이다. 이것은 필요한 부분만 약간 수정하여 Ang2에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명의 특이적 구체예에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드가 2개 이상의 항-Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인, 즉 3개, 4개 또는 그 이상의 항-Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 경우에, 적어도 2개의 항-Dll4 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Dll4 분자 내의 상이한 에피토프에 대한 것이며, 여기에서 임의의 추가 면역글로불린 단일 가변 도메인은 이러한 2개의 상이한 에피토프 및/또는 Dll4 분자 내에 존재하는 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 이것은 필요한 부분만 약간 수정하여 Ang2에 대해서도 마찬가지이다.
본 발명에 따라, 2 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로에 대하여 독립적으로 VH 또는 VHH이거나/이고, 여기에서 정의된 VL 도메인 같은 면역글로불린 단일 가변 도메인의 다른 종류일 수 있으나, 단 이러한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항원, 즉 Dll4 또는 Ang2 각각과 결합한다.
결합성분에 대한 상세한 설명은 우선적으로 Dll4-결합성분에 대해 제공된다. 그러나, Dll4-결합성분에 대해 여기에서 요약된 특징과 옵션들은 모두 필요한 부분만 약간 수정하여 Ang2-결합성분에 대해서도 동등하게 적용된다.
바람직한 구체예에 따라, 이중특이성 결합분자 내에 존재하는 결합분자들(Ang2-결합성분 내의 Ang2-결합분자 또는 Dll4-결합성분 내의 Dll4-결합분자 또는 2개의 인접한 Ang2- 및 Dll4-결합성분)은 서로 직접적으로(즉, 링커를 사용하지 않고) 또는 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 바람직하게 링커 펩티드이며, 2개의 상이한 결합분자가 하나의 동일한 타겟 분자 내에서 또는 2개의 상이한 분자들 내에서 타겟의 중첩되지 않는 에피토프 각각에 결합할 수 있도록 선택된다.
바이파라토프 결합분자의 경우에, Ang2- 또는 Dll4-결합성분 내에서 링커의 선택은 특히 에피토프에 따라, 구체적으로 면역글로불린 단일 가변 도메인들이 결합하는 타겟상의 에피토프간 거리에 따라 달라지며, 임의로 일부 제한된 정도의 일반적 실험 후에 여기에서의 설명에 기초하여 당업자들에게 명확해질 수 있다.
2개 결합분자(2 VHH 또는 도메인 항체들 또는 VHH 및 도메인 항체) 또는 2개 결합성분들은 추가의 VHH 또는 도메인 항체 각각에 의해 서로 연결될 수 있다(이러한 결합분자에서 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기한 추가 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접 또는 적합한 링커에 의해 연결될 수 있다). 이러한 추가의 VHH 또는 도메인 항체는, 예를 들어 증가된 반감기를 제공하는 VHH 또는 도메인 항체일 수 있다. 예를 들어, 후자의 VHH 또는 도메인 항체는 (사람) 혈청 알부민 또는 (사람) 트랜스페린(transferrin) 같은 (사람) 혈청 단백질에 결합할 수 있는 것일 수 있다.
선택적으로, 각각의 타겟에 결합하는 2개 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 연속적으로 (직접 또는 적합한 링커에 의해) 연결될 수 있고 (증가된 반감기를 제공할 수 있는)추가의 VHH 또는 도메인 항체는 직접 또는 링커에 의해 2개 이상의 상기한 면역글로불린 서열 중 하나에 연결될 수 있다.
적합한 링커는 본 발명의 특이적 폴리펩티드와 관련하여 여기에 기술되었고, - 비제한적으로 예를 들어 - 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 아미노산 서열은 바람직하게 9개 이상의 아미노산, 더욱 바람직하게 적어도 17개의 아미노산, 예컨대 약 20 - 40 아미노산의 길이를 가진다. 그러나, 상한은 결정적이지 않으며, 이러한 폴리펩티드의 바이오의약 생산 등과 관련한 간편성을 위해 선택된다.
링커 서열은 자연적으로 발생하는 서열 또는 비자연적으로 발생하는 서열일 수 있다. 치료학적 목적으로 사용될 경우, 링커는 본 발명의 이중특이성 결합분자가 투여되는 대상 내에서 비면역원성인 것이 바람직하다.
링커 서열의 유용한 일 그룹은 국제 공개특허 WO 1996/34103 및 WO 1994/04678에 기술된 중쇄 항체의 힌지(hinge) 영역에서 유도된 링커이다.
다른 예는 폴리-알라닌 링커 서열, 예를 들어 Ala-Ala-Ala이다.
링커 서열의 바람직한 추가예는 서로 다른 길이의 Gly/Ser 링커, 예를 들어 (glyxsery)z 링커, 예컨대 (gly4ser)3, (gly4ser)4, (gly4ser), (gly3ser), gly3, 및 (gly3ser2)3이다.
링커들의 일부 비제한적 예는 도 40과 48에 기재한, 예를 들어 하기 링커들이다:
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (35GS; 서열번호: 90);
GGGGSGGGS (9GS; 서열번호: 91);
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (40GS; 서열번호: 92).
이중특이성 결합분자가 폴리머, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 잔기를 결합하여 변성되면, 링커 서열은 바람직하게 아미노산 잔기, 예컨대 시스테인 또는 리신을 포함하여 링커 영역 내에서 페길화(PEGylation) 같은 변성이 가능하다.
페길화에 유용한 링커의 예는 다음과 같다:
GGGGCGGGS ("GS9,C5", 서열번호:93);
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS25,C5", 서열번호:94)
GGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGG ("GS27,C14", 서열번호:95),
GGGGSGGGGSGGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C15", 서열번호:96), 및
GGGGCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ("GS35,C5", 서열번호:97).
또한, 링커는, 예를 들어 WO 2004/081026에 나타낸 바와 같은 폴리(에틸레 글리콜)잔기일 수도 있다.
다른 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 (임의로 1 또는 2개 링커에 의해)다른 잔기, 예컨대 비제한적인 바람직한 구체예에서 상기한 바와 같은 추가의 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있는 다른 폴리펩티드에 의해 서로 연결된다. 이러한 잔기는 본질적으로 불활성이거나, 폴리펩티드의 목적하는 특성을 개선하는 등의 생물학적 효과를 가지거나, 폴리펩티드에 하나 이상의 바람직한 추가 특성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 제한적인 것은 아니나 잔기는 단백질 또는 폴리펩티드의 반감기를 개선하거나/하고 그의 면역원성을 감소시키거나 다른 바람직한 특성을 개선할 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 이중특이성 결합분자는, 특히 치료제로서 사용되거나 사용할 목적일 경우에 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 환자의 혈청 또는 다른 체액에서 연장하는 잔기를 포함한다. "반감기"란 용어는 (변성된) 폴리펩티드의 혈청 농도를 생체 내에서, 예를 들어 폴리펩티드의 분해 및/또는 소거 및/또는 자연적 메카니즘에 의한 부골화(sequestration)로 인해 50%까지 감소하는데 소요되는 시간으로 정의된다.
더욱 구체적으로, 이러한 반감기 연장 잔기는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 공유결합되거나 융합될 수 있고, Fc 부분, 알부민 잔기, 알부민 잔기의 단편, 알부민 결합잔기, 예를 들어 항알부민 면역글로불린 단일 가변 도메인, 트랜스페린 결합잔기, 예를 들어 항트랜스페린 면역글로불린 단일 가변 도메인, 폴리옥시알킬렌 분자, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 분자, 알부민 결합 펩티드 또는 하이드록시에틸 전분(HES) 유도체일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 혈액에서 발견된 항원에 결합하는 성분, 예를 들어 혈청 알부민, 혈청 면역글로불린, 티록신 결합 단백질, 피브리노겐 또는 트랜스페린을 포함하여 생성된 본 발명의 폴리펩티드에 생체 내에서 증가된 반감기를 제공한다. 특별하게 바람직한 구체예에 따라, 이러한 성분은 알부민 결합 면역글로불린이고, 특히 알부민 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예컨대 알부민 결합 VHH 도메인이 바람직하다.
인간에게 사용하기 위하여, 이러한 알부민 결합 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 인간 혈청 알부민에 결합하며, 바람직하게 인간화된 알부민 결합 VHH 도메인이다.
인간 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공개특허 WO 2006/122786에 상세히 기술되어 있다. 특히, 유용한 알부민 결합 VHH는 ALB 1과 그의 인간화된 대응물 ALB 8 (WO 2009/ 095489)이다. 그러나, 상기 공개특허에서 언급된 다른 알부민 결합 VHH 도메인 또한 사용할 수 있다.
특별하게 유용한 알부민 결합 VHH 도메인은 서열번호: 98 또는 519에 기재된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 함유하는 ALB8이다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 2개 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 바람직하게 VHH에서 국제 공개특허 WO 01/79271과 WO03/59934에 기술된 것과 같은 혈청 알부민 분자에 융합될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개특허 WO 2001/79271에 기술된 바와 같이, 융합 단백질은 일반적인 재조합기술에 의해 얻어질 수 있고: 혈청 알부민, 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 분자는 이중특이성 결합분자를 코딩하는 DNA에 결합되고, 얻어진 구조물은 선택된 숙주세포, 예를 들어 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 같은 효모 세포, 또는 박테리아 세포에서 발현하는데 적합한 플라스미드에 도입된 다음, 숙주세포를 융합된 뉴클레오티드 서열로 형질감염하여 적합한 조건 하에서 배양한다. 유용한 HSA의 서열은 서열번호: 99에 나타내었다.
다른 구체예에 따라, 본 발명의 폴리펩티드의 반감기를 연장하는 변성(또한 이러한 변성은 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킨다)은 적합한 약리학적으로 허용가능한 폴리머, 예컨대 직쇄 또는 측쇄 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 또는 그의 유도체(예를 들어, 메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 또는 mPEG)의 결합을 포함한다. 일반적으로, 당분야에서 항체와 항체 단편(예를 들어, 제한적인 것은 아니나 도메인 항체 및 scFv)에 사용된 페길화(PEGylation) 같은 적합한 형태의 페길화를 사용할 수 있으며; 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다: Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003); Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov. 2 (2003); 및 WO 2004/ 060965.
폴리펩티드의 페길화를 위한 다양한 시약들은, 예를 들어 Nektar Therapeutics(미국), 또는 NOF Corporation(일본)에서 상업적으로 입수할 수 있으며, 예컨대 Sunbright® EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, 및 ME Series, 예컨대 Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, 및 Sunbright® ME-400MA가 있다.
바람직하게, 부위 특이적 페길화가 특히 시스테인 잔기에 의해 사용된다(예를 들어, Yang et al., Protein Engineering 16, 761-770 (2003) 참조). 예를 들어, 이러한 목적을 위해 PEG를 본 발명의 폴리펩티드에서 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기에 결합시키고, 본 발명의 폴리펩티드는 PEG 결합을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 적합하게 도입하도록 변성되거나, PEG 결합을 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 본 발명의 폴리펩티드 N- 및/또는 C-터미널에 융합할 수 있으며, 이 모두는 당업자에게 공지된 단백질 조작 기술을 사용한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드에서 PEG는 5 kDa 초과, 예를 들어 10 kDa 초과 및, 200 kDa 미만, 예를 들어 100 kDa 미만; 예를 들어 20 kDa 내지 80 kDa 범위의 분자량으로 사용된다.
페길화와 관련하여, 일반적으로 본 발명은 또한, 바람직하게 페길화가 (1) 생체내에서 반감기를 증가시키고; (2) 면역원성을 감소시키고; (3) 페길화에 대해 공지된 하나 이상의 추가적인 유리한 특성을 제공하고; (4) 그의 타겟에 대한 폴리펩티드의 친화도에 본질적으로 영향을 주지 않으며(예를 들어, 당업계에서 기술된 적합한 어세이로 측정하였을 때, 친화도를 50% 초과, 더욱 바람직하게 10% 초과까지 감소시키지 않는다); 및/또는 (5) 본 발명의 이중특이성 결합분자의 다른 바람직한 특성에 영향을 주지 않는 방법으로, 하나 이상의 아미노산 위치에서 페길화된 이중특이성 결합분자를 포함하는 것을 주지하여야 한다. 적합한 PEG-그룹과 이들을 특이적으로 또는 비특이적으로 결합하는 방법은 당업자들에게 명확한 것이다. 폴리펩티드의 페길화를 위한 다양한 시약들은, 예를 들어 Nektar Therapeutics(미국), 또는 NOF Corporation(일본)에서 상업적으로 입수할 수 있으며, 예컨대 Sunbright® EA Series, SH Series, MA Series, CA Series, 및 ME Series, 예컨대 Sunbright® ME-100MA, Sunbright® ME-200MA, 및 Sunbright® ME-400MA가 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 페길화된 폴리펩티드는 40 kDa 또는 60 kDa의 분자량을 갖는 선형 PEG의 하나의 PEG 잔기를 포함하며, 여기에서 PEG 잔기는 링커 영역 내의 폴리펩티드에, 특히 서열번호: 93에 나타낸 GS9-링커 펩티드의 5 위치, 서열번호: 95에 나타낸 GS27-링커 펩티드의 14 위치, 또는 서열번호: 96에 나타낸 GS35-링커 펩티드의 15 위치, 또는 서열번호: 97에 나타낸 35GS-링커 펩티드의 5 위치에 결합된다.
본 발명의 이중특이성 결합분자는 다음 화학식에 나타낸, 상기한 PEG 시약 중 하나, 예를 들어 "Sunbright® ME-400MA"로 페길화될 수 있다:
Figure pct00001
링커 및/또는 반감기 연장 작용그룹을 함유하는 이중특이성 결합분자는 서열번호: 81과 도 48에 나타내었다.
다른 구체예에 따라, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 여기에서 정의된 도메인 항체이다.
본 발명의 이중특이성 결합분자에 존재하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 은 "카멜화(camelized)", 즉 일반적인 4 사슬 항체에서 유래한 자연적으로 발생하는 가변 중쇄의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 중쇄 항체의 VHH 도메인 내의 상응하는 위치에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 잔기로 대체하여 자연적으로 발생한 VH 도메인의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 가진다. 이것은 알려진 방법 자체로 수행할 수 있고, 당업자들에게 명백하며, 또한 국제 공개특허 WO 94/04678을 참조할 수 있다. 이러한 카멜화는 VH-VL 경계와 소위 Camelidae Hallmark 잔기(예를 들어, 국제 공개특허 WO 94/04678 참조)에 존재하는 아미노산 위치에서 우선적으로 발생할 수 있다. 이러한 "인간화"와 "카멜화" 방법 및 이들과 일치하는 바람직한 프레임워크 영역 서열은 국제 공개특허 WO 2006/040153의 46 및 98 페이지와 국제 공개특허 WO 2006/122786의 107 페이지에 상세히 설명되어 있다.
결합성분들은 바람직한 구체예에서 Ang2 분자 또는 Dll4 분자 내의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함한다는 점에서 이들은 Ang2 또는 Dll4 각각에 대해 특이성을 갖는다.
결합성분의 그의 항원 Ang2 또는 Dll4에 대한 특이적 결합은, 예를 들어 여기에 기술된 어세이, Scatchard 분석 및/또는 경쟁적 결합 어세이, 예컨대 방사면역어세이(RIA), 효소 면역어세이(EIA 및 ELISA) 및 샌드위치 경쟁 어세이, 및 당분야에 그 자체가 알려진 이들의 이형을 포함하는, 그 자체가 공지된 임의의 적합한 방식으로 측정될 수 있다.
항원 Ang2 또는 Dll4 각각과 관련하여, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 종과 관련하여 제한되지 않는다. 따라서, 사람의 치료를 목적으로 하는 경우, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게 사람 Ang2 또는 사람 Dll4 각각에 결합한다. 그러나, 다른 포유동물 종에서 유래한 Ang2 또는 Dll4 각각과 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이들을 함유하는 폴리펩티드도 본 발명의 범위 내에 있다. Ang2 또는 Dll4의 하나의 종 형태와 결합한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 하나 이상의 다른 종의 개별 항원과 교차반응할 수 있다. 예를 들어, 사람 항원과 결합한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 영장류의 하나 이상의 다른 종의 개별 항원 및/또는 질환에 대한 동물 모델, 예를 들어 원숭이(특히 사이노몰거스원숭이(Cynomolgus) 또는 벵골원숭이(Rhesus)), 마우스, 래트, 래빗, 돼지, 개 및, 특히 Ang2 저해로 조절될 수 있는 질환 및 장애의 동물 모델(예를 들어, 여기에서 언급된 종 및 동물 모델)에 사용된 하나 이상의 동물 종의 항원과 교차 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 교차 반응성을 나타내는 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 원숭이, 특히 사이노몰거스원숭이 또는 벵골원숭이, 또는 마우스와 래트 같은 숙지된 질환 모델에서 시험될 수 있도록 하였기 때문에 연구 및/또는 의약 개발에 유리하다.
또한, 결합성분은 특이적 도메인 또는 이들이 대향하는 항원의 항원성 결정인자로 제한되거나 규정되지 않는다. 바람직하게, 치료학적 Ang2/Dll4 길항제의 개발에서 동물 모델로 사용하고자 하는 사람 이외의 종에서 유래한 하나 이상의 항원 분자와의 교차 반응성에 비추어 결합성분은 사람 항원과 고도의 동일성을 가지는 개별 항원 영역 내의 에피토프를 인식한다. 예를 들어, 마우스 모델을 사용하는데 있어서, 본 발명의 이중특이성 결합분자 내에 함유된 항-Ang2 면역글로불린 단일 가변 도메인은 사람과 마우스 간에 높은 동일성을 나타내는 Ang2의 EGF-2 도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치한 에피토프를 인식한다.
그러므로, 바람직한 구체예에 따라, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 서열번호: 101의 아미노산 잔기 252-282에 해당하는 EGF-2 도메인 내에 전체적으로 또는 부분적으로 함유된 에피토프에 결합하는 그룹에서 선택된 면역글로불린 단일 가변 도메인인 Dll4-결합분자를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이성 결합분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한 이러한 핵산 분자는 "본 발명의 핵산"으로서 여기에서 언급될 것이고, 또한 여기에서 정의된 바와 같이 유전자 구조물의 형태일 것이다. 본 발명의 핵산은 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA (예를 들어 목적하는 숙주세포 또는 숙주 유기체 내의 발현에 특이적으로 적응된 코돈 사용법을 갖는 DNA)일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 핵산은 상기에 정의된 바와 같이 본질적으로 단리된 형태이다.
본 발명의 핵산은 또한, 예를 들어 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 YAC 같은 벡터의 형태일 수 있거나, 벡터 내에 존재할 수 있거나/있고 벡터 일부일 수 있다. 벡터는 특히 발현 벡터, 즉 시험관내 및/또는 생체내에서 (즉 적합한 숙주세포, 숙주 유기체 및/또는 발현 시스템 내에서) 이중특이성 결합분자의 발현에 제공할 수 있는 벡터일 수 있다. 이러한 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 적합한 조절 구성요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터 등과 작동적으로 연결될 수 있는 본 발명의 핵산을 적어도 하나 포함한다. 특정한 숙주에서 특이적 서열의 발현 관점에서 이러한 구성요소 및 그의 선택은 당업자에게 있어서 일반적 지식이다. 본 발명의 이중특이성 결합분자를 발현하는데 유용하거나 필수적인 조절요소 및 다른 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 터미네이터, 통합(integration) 인자, 선택 마커, 리더 서열, 리포터(reporter) 유전자 등의 특정한 예는 예를 들어 WO 2006/040153의 131 내지 133쪽에 개시되어 있다.
여기에 제공된 본 발명의 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열 정보에 기초하여 본 발명의 핵산은 그 자체가 공지된 방식(예를 들어, 자동 DNA 합성 및/또는 재조합 DNA 기술)으로 제조되거나 얻어질 수 있거나/있고 적합한 천연 공급원으로부터 단리할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 이중특이성 결합분자를 발현하거나 발현할 수 있거나/있고 본 발명의 핵산을 함유하는 숙주세포에 관한 것이다. 특히 바람직한 구체예에 따라, 상기 숙주세포는 박테리아 세포이고; 다른 유용한 세포는 효모 세포, 진균류 세포 또는 포유동물 세포이다.
적합한 박테리아 세포는 Escherichia coli , Proteus, 및 Pseudomonas의 균주와 같은 그람-음성 박테리아 균주 및 Bacillus , Streptomyces , Staphylococcus , 및 Lactococcus의 균주와 같은 그람-양성 박테리아 균주의 세포를 포함한다. 적합한 진균류 세포는 Trichoderma , Neurospora 및 Aspergillus종의 세포를 포함한다. 적합한 효모 세포는 Saccharomyces (예를 들어 Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (예를 들어 Schizosaccharomyces pombe), Pichia (예를 들어 Pichia pastoris 및 Pichia methanolica), 및 Hansenula . 종의 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는, 예를 들어 CHO 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포 등을 포함한다. 그러나, 양서류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 이종 단백질 발현의 기술분야에 사용되는 임의의 다른 세포도 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 이중특이성 결합분자를 제조하는 방법을 추가로 제공하고, 이러한 방법은 일반적으로 다음 단계들을 포함한다:
- 본 발명의 이중특이성 결합분자를 발현할 수 있는 조건 하에서 이중특이성 결합분자를 코딩할 수 있는 핵산을 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계;
- 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩티드를 배양물로부터 회수 또는 단리하는 단계; 및
- 본 발명의 이중특이성 결합분자를 임의로 추가 정제 및/또는 변성 및/또는 제형화하는 단계.
산업적 규모의 생산을 위해, 바람직한 숙주 유기체는 큰 규모의 발현, 생산 및 발효, 및 특히 큰 규모의 약제학적 발현, 생산 및 발효에 적합한 E.　 coli , Pichia pastoris , 및 S. cerevisiae 균주를 포함한다.
특이적 발현 시스템의 선택은 특정한 번역후 변성, 더욱 구체적으로 글리코실화에 대한 요건에 일부 의존한다. 글리코실화가 바람직하거나 필요한 본 발명의 이중특이성 결합분자의 생산은 발현된 단백질을 글리코실화하는 능력을 갖는 포유동물의 발현 숙주 사용을 필요로 할 수 있다. 이러한 측면에서, 얻어진 글리코실화 패턴(즉, 결합된 잔기의 종류, 수 및 위치)은 발현에 사용되는 세포 또는 세포 계통에 따라 달라진다는 것은 당업자에게 명확할 것이다.
본 발명의 이중특이성 결합분자는 위에서 제시된 바와 같은 세포에서 (예를 들어, 세포기질, 주변세포질 또는 봉입체 내에서)세포내적으로 생산된 다음, 숙주세포로부터 단리되고 임의로 추가 정제하거나; 이들을 (예를 들어, 숙주세포가 배양된 배지에서)세포 외적으로 생산한 다음, 배양 배지로부터 단리하고 임의로 추가 정제할 수 있다.
폴리펩티드의 재조합 생산에 사용되는 방법 및 시약, 예를 들어 적합한 특이적 발현벡터, 형질전환 또는 형질감염 방법, 선택 마커, 단백질 발현 유도 방법, 배양 조건 등은 당분야에 알려져 있다. 마찬가지로, 본 발명의 폴리펩티드 제조 방법에 유용한 단백질 분리 및 정제 기술도 당업자들에게 잘 알려져 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 서열번호: 1 내지 166 및 458, 서열번호: 333 내지 353, 또는 서열번호: 375 내지 395, 각각에 나타낸 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 항-Dll4-VHH 내에 함유된 CDR3의 아미노산 서열을 갖는 펩티드, 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
이러한 펩티드는 본 발명의 VHH로부터 유도된 CDR3에 상응한다. 이들, 특히 이들을 코딩하는 핵산 분자는 면역글로불린 사슬 내 CDR3를 대체하기 위한 CDR 그래프팅, 또는 비면역글로불린 스캐폴드, 예를 들어 프로테아제 저해제, DNA-결합 단백질, 시토크롬 b562, 나선-번들 단백질, 디설파이드-가교 펩티드, 리포칼린 또는 안티칼린(anticalin) 내로의 삽입에 따라 이러한 스캐폴드에 타겟-결합 특질을 부여하는데 유용하다. CDR-그래프팅 방법은 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 인간화 항체(일반적으로 인간 항체의 Fv 프레임워크상에 설치류 항체의 CDR을 이식하는 것을 포함)에 널리 사용된다.
본 발명의 CDR3를 함유하는 면역글로불린 또는 비면역글로불린 스캐폴드를 얻기 위해, 이러한 분자를 코딩하는 DNA를 분자 생물학의 표준 방법, 예를 들어 유전자 합성, 올리고뉴클레오티드 어닐링(annealing) 또는, 예를 들어 Daugherty et al., 1991, Nucleic acid Research, Vol. 19, 9, 2471-2476에 기술된 중첩 PCR 단편에 의해 얻어질 수 있다. VHH CDR3를 비면역글로불린 스캐폴드 내로 삽입하는 방법은 Nicaise et al., 2004, Protein Science, 13, 1882 - 1891에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 이중특이성 결합분자 및 임의로 그 자체가 알려진, 즉 조성물의 의도된 용도에 따른 조성물의 추가 성분 하나 이상을 함유하거나 포함하는 제품 또는 조성물에 관한 것이다.
약학적 용도를 위해, 본 발명의 이중특이성 결합분자 또는 이를 함유하는 폴리펩티드는 적어도 하나의 본 발명의 이중특이성 결합분자 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제 및/또는 보조제, 및 임의로 하나 이상의 약학적으로 활성인 추가 폴리펩티드 및/또는 화합물을 포함하는 약학적 제제 또는 조성물로서 조제될 수 있다. 비제한적 예에 의해, 이러한 제제는 경구 투여, 비경구 투여(예를 들어, 정맥주사, 근육내주사 또는 피하주사 또는 정맥 인퓨전), 국소 투여, 흡입에 의한 투여, 피부 패취, 임플란트, 좌약 등에 적합한 형태일 수 있다. -투여의 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있는-이러한 적합한 투여 형태뿐만 아니라 그의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체는 당업자에게 명확한 것이고 여기에서 추가로 기술된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 이중특이성 결합분자, 특히 하나의 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 적합한 담체, 희석제 또는 (즉, 약학적 용도에 적합한)첨가제, 및 임의로 하나 이상의 추가적 활성 물질을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 이중특이성 결합분자는 공지된 적합한 방법으로 제제화되어 투여될 수 있으며: 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인에 대하여는, 예를 들어 다음 문헌을 참조할 수 있다: WO 2004/041862, WO 2004/041863, WO 2004/041865, WO 2004/041867 및 WO 2008/020079, 및 표준 핸드북, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990), Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005); 또는 the Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel Ed.), Wiley, Weinheim, 2007 (예를 들어 252-255쪽 참조).
예를 들어, 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 일반적 항체 및 항체 단편(ScFv것 및 다이아바디 포함) 및 다른 약학적으로 활성인 단백질에 대하여 공지된 방법으로 제제화되어 투여할 수 있다. 이러한 제제와 이를 제조하는 방법은 당업자들에게 명확하고, 예를 들어 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 관내(intraluminal), 동맥내 또는 척추강내) 또는 국소(즉, 경피 또는 피내) 투여에 적합한 조제물을 포함한다.
비경구 투여용 조제물은, 예를 들어 주입 또는 주사에 적합한, 멸균 용액, 현탁액, 분산액 또는 에멀젼일 수 있다. 이러한 조제물을 위한 적합한 담체 또는 희석제는, 예를 들어 멸균수 및 약학적으로 허용가능한 수성 완충액 및 용액, 예를 들어 생리적 인산염 완충 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 Hank 용액; 워터 오일; 글리세롤; 에탄올; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 미네랄 오일, 동물성 오일 및 식물성 오일, 예를 들어 땅콩유, 콩기름, 및 적합한 이들의 혼합물이나, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체 같은 약학적으로 허용가능한 비히클과 조합하여 전신, 예를 들어 경구로 투여할 수 있다. 경구적 치료 투여를 위하여, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 하나 이상의 첨가제와 조합하여, 섭취가능한 정제(ingestible tablet), 구강정(buccal tablet), 트로키(troches), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물과 조제물은 적어도 0.1%의 본 발명의 Dll4 결합분자를 포함하여야 한다. 조성물과 조제물에서 이들의 비율은, 물론 변경할 수 있으며, 간편하게 약 2 내지 약 60 중량%의 주어진 단위 용량 형태일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물에서 본 발명의 이중특이성 결합분자의 양은 유효 투여 농도가 얻어질 수 있는 정도이다.
정제, 알약, 캡슐 등은 또한 결합제, 첨가제, 붕해제, 윤활제 및 감미제 또는 풍미제를 포함할 수 있으며, 이들에 대하여는 국제 공개특허 WO 08/020079의 143-144쪽에 언급되어 있다. 단위 복용 형태가 캡슐일 경우, 이것은 상기한 종류의 물질 이외에 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 또는 고체 단위 복용 형태의 물리적 형태를 달리 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 젤라틴, 왁스, 쉘락(shellac) 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 이중특이성 결합분자, 감미제로서 슈크로스 또는 프럭토스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향 같은 향미제를 함유할 수 있다. 임의의 단위 복용 형태를 제조하는데 사용되는 물질은 사용된 양에 있어서 당연히 약학적으로 허용가능하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 서방성 제제 및 장치와 결합될 수 있다.
경구 투여용 조제물과 제제는 또한 본 발명의 구조물이 위장의 환경을 견디고 장을 통과할 수 있는 장용 코팅정으로 제공될 수 있다. 보다 일반적으로, 경구 투여용 조제물과 제제는 위장관의 원하는 부위에 전달하기 위해 적합하게 제제화될 수 있다. 또한, 적합한 좌약제는 위장관으로의 전달을 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 이중특이성 결합분자는 또한 국제 공개특허 WO 2008/020079의 144-145쪽에 상세히 기술된 바와 같이 주입 또는 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 결합분자의 국소 투여에 있어서, 일반적으로 이것은 조성물 또는 제제로서 고체 또는 액체일 수 있는 피부과학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 WO 2008/020079의 145쪽에 상세히 기술된 바와 같이 투여하는 것이 바람직하다.
일반적으로, 로션 같은 액체 조성물 내에서 본 발명의 이중특이성 결합분자의 농도는 약 0.1-25 wt-%, 바람직하게 약 0.5-10 wt-%이다. 반고체, 또는 겔이나 분말 같은 고체 조성물 중 농도는 약 0.1-5 wt-%, 바람직하게 약 0.5-2.5 wt-%이다.
치료에 사용하는데 필요한 본 발명의 이중특이성 결합분자의 양은 선택된 특정한 이중특이성 결합분자뿐만 아니라 투여경로, 치료되는 상태의 성질 및 환자의 연령과 상태에 따라 달라지며, 궁극적으로 주치의 또는 임상의 재량에 따른다. 또한, 본 발명의 이중특이성 결합분자의 투여량은 표적 세포, 종양, 조직, 그래프트 또는 기관에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 단일 용량 또는, 예를 들어 1일 당 2, 3, 4 이상의 하위(sub) 용량으로서 적절한 간격으로 투여되는 분할 투여로 편리하게 제공될 수 있다. 하위 용량 자체는, 예를 들어 별개의 대략적으로 분산된 다수의 투여로 추가 분할될 수 있으며; 취입기로부터의 복수 흡입 또는 눈에 여러 방울을 적용하는 것을 예로 들 수 있다.
투약요법은 장기 치료, 1일 치료를 포함한다. "장기"란 용어는 적어도 2 주, 바람직하게 수 주, 수 개월 또는 수 년간의 기간을 의미한다. 당업자들이라면 여기에서 실시방법이 제공된 일반적인 실험만을 사용하여 투여량 범위의 필요한 변형을 결정할 수 있다. Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA 참조. 또한, 합병증이 있는 경우에 개별 의사는 투여량을 조절할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은, 예컨대 다음과 같은 치료 목적을 위한 본 발명의 이중특이성 결합분자, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 함유하는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다:
- 신생혈관형성에 대한 Dll4 매개 및/또는 Ang2-관련 효과와 연관되거나 Notch 시그널링 경로 및/또는 Tie2 시그널링 경로를 본 발명에 따른 이중특이성 결합분자로 조절하여 예방, 치료 또는 완화될 수 있는, 특히 사람의 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 및/또는 완화;
- 적어도 하나의 본 발명의 이중특이성 결합분자, 예를 들어 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 이를 함유하는 약학 조성물의 약학적으로 활성인 양을 상기한 요법이 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 상기한 요법이 필요한 환자의 치료방법;
- 신생혈관형성에 대한 Dll4 매개 및/또는 Ang2-매개 효과와 연관된 장애, 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 완화를 위한 의약의 제조;
- 상기한 목적으로 사용된 약학 조성물 또는 의약의 활성 성분.
특별한 측면에 따르면, 장애, 질환 또는 상태는 여기에서 정의된 바와 같은 암 또는 암성 질환이다.
다른 측면에 따르면, 질환은 신생혈관형성에 대한 Dll4 매개 및/또는 Ang2-매개 효과와 연관되거나, Notch 시그널링 경로 및/또는 Tie2 시그널링 경로를 이중특이성 결합분자로 조절하여 치료되거나 완화될 수 있는 눈 질환이다.
치료될 암성 질환에 따라, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 그 자체 또는, 특히 DNA 손상제 같은 화학요법제 또는 신생혈관형성, 시그널 형질도입 경로 또는 유사분열 검사점을 암 세포에서 저해하는 치료학적으로 활성인 화합물에서 선택된 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 사용할 수 있다.
추가 치료제를 임의로 동일한 약학 조제물의 성분으로서 동시에, 또는 이중특이성 결합분자의 투여 전,후에 투여할 수 있다.
임의의 구체예에서, 추가 치료제는 EGFR, VEGFR, HER2-neu, Her3, 오로라(Aurora)A, 오로라B, PLK 및 PI3 키나제, FGFR, PDGFR, Raf, Ras, KSP, PDK1, PTK2, IGFR 또는 IR의 저해제로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 저해제일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
추가 치료제의 또다른 예는 CDK, Akt, src/bcr abl, cKit, cMet/HGF, c-Myc, Flt3, HSP90의 저해제, 헤지호그(hedgehog) 길항제, JAK/STAT, Mek, mTor, NFkappaB, 프로테아좀(proteasome), Rho의 저해제, wnt 시그널링의 저해제 또는 유비퀴틴화 경로의 저해제 또는 Notch 시그널링 경로의 다른 저해제이다.
오로라 저해제의 예는 PHA-739358, AZD-1152, AT 9283, CYC-116, R-763, VX-680, VX-667, MLN-8045, PF-3814735이나, 이에 한정되지는 않는다.
PLK 저해제의 예는 GSK-461364이다.
raf 저해제의 예는 BAY-73-4506(또한 VEGFR의 저해제이기도 함), PLX 4032, RAF265(또한 VEGFR 저해제 추가), 소라페닙(sorafenib) (또한 VEGFR 저해제 추가), 및 XL 281이다.
KSP 저해제의 예는 이스피네십(ispinesib), ARRY-520, AZD-4877, CK-1122697, GSK 246053A, GSK-923295, MK-0731, 및 SB-743921이다.
src 및/또는 bcr-abl 저해제의 예는 다사티닙(dasatinib), AZD-0530, 보수티닙(bosutinib), XL 228 (IGF-1R의 저해제이기도 함), 닐로티닙 (PDGFR 및 cKit의 저해제이기도 함), 이마티닙 (또한 cKit 저해제), 및 NS-187이다.
PDK1 저해제의 예는 BX-517이다.
Rho 저해제의 예는 BA-210이다.
PI3 키나제 저해제의 예는 PX-866, BEZ-235 (mTor의 저해제이기도 함), XL 418 (Akt의 저해제이기도 함), XL-147, 및 XL 765 (mTor의 저해제이기도 함)이다.
cMet 또는 HGF의 저해제의 예는 XL-184 (또한 VEGFR, cKit, Flt3의 저해제이기도 함), PF-2341066, MK-2461, XL-880 (또한 VEGFR 저해제), MGCD-265 (또한 VEGFR, Ron, Tie2의 저해제), SU-11274, PHA-665752, AMG-102, 및 AV-299이다.
c-Myc 저해제의 예는 CX-3543이다.
Flt3 저해제의 예는 AC-220 (또한 cKit 및 PDGFR의 저해제), KW 2449, 레스타우르티닙(lestaurtinib) (또한 VEGFR, PDGFR, PKC의 저해제), TG-101348 (또한 JAK2 저해제), XL-999 (또한 cKit, FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제), 서니티닙(sunitinib) (또한 PDGFR, VEGFR 및 cKit의 저해제), 및 탄두티닙(tandutinib) (또한 PDGFR, 및 cKit의 저해제)이다.
HSP90 저해제의 예는 타네스피마이신(tanespimycin), 알베스피마이신 (alvespimycin), IPI-504 및 CNF 2024이다.
JAK/STAT 저해제의 예는 CYT-997 (또한 투불린과 상호작용), TG 101348 (또한 Flt3의 저해제), 및 XL-019이다.
Mek 저해제의 예는 ARRY-142886, PD-325901, AZD-8330 및 XL 518이다.
mTor 저해제의 예는 템시롤리무스(temsirolimus), AP-23573 (또한 VEGF 저해제로서 작용), 에베롤리무스(everolimus)(또한 VEGF 저해제), XL-765(PI3 키나제 저해제) 및 BEZ-235(PI3 키나제 저해제이기도 함)이다.
Akt 저해제의 예는 페리포신, GSK-690693, RX-0201 및 트리시리빈 (triciribine)이다.
cKit 저해제의 예는 AB-1010, OSI-930(VEGFR 저해제로서도 작용), AC-220(Flt3 및 PDGFR의 저해제이기도 함.), 탄두티닙(Flt3 및 PDGFR의 저해제이기도 함), 악시티닙(axitinib)(VEGFR 및 PDGFR의 저해제이기도 함), XL-999 (Flt3, PDGFR, VEGFR, FGFR의 저해제이기도 함), 수니티닙(Flt3, PDGFR, VEGFR의 저해제이기도 함), 및 XL-820(VEGFR- 및 PDGFR 저해제로서도 작용), 이마티닙(또한 bcr-abl의 저해제), 닐로티닙(nilotinib)(또한 bcr-abl 및 PDGFR의 저해제)이다.
헤지호그 길항제의 예는 IPI-609 및 CUR-61414이다.
CDK 저해제의 예는 셀리시클립(seliciclib), AT-7519, P-276, ZK-CDK (VEGFR2 및 PDGFR을 저해하기도 함), PD-332991, R-547, SNS-032, PHA-690509 및 AG 024322이다.
프로테아좀 저해제의 예는 보르테조밉(bortezomib), 카필조밉(carfilzomib), 및 NPI-0052 (또한 NFkappaB의 저해제이기도 함.)이다.
NFkappaB 경로 저해제의 예는 NPI-0052이다.
유비퀴틴화 경로 저해제의 예는 HBX-41108이다.
바람직한 구체예에서, 추가 치료제는 항-신생혈관형성제이다.
항-신생혈관형성제의 예는 FGFR, PDGFR 및 VEGFR의 저해제 또는 각각의 리간드(예를 들어, 페가프타닙(pegaptanib) 같은 VEGF 저해제 또는 항-VEGF 항체 베바시주맵), 및 탈리도마이드이며, 이러한 제제는 베바시주맵, 모테사닙(motesanib), CDP-791, SU-14813, 텔라티닙 (telatinib), KRN-951, ZK-CDK (CDK의 저해제이기도 함), ABT-869, BMS-690514, RAF-265, IMC-KDR, IMC-18F1, IMiDs (면역조절제), 탈리도마이드 유도체 CC-4047, 레날리도마이드, ENMD 0995, IMC-D11, Ki 23057, 브리바닙(brivanib), 세디라닙, XL-999 (cKit 및 Flt3의 저해제이기도 함), 1B3, CP 868596, IMC 3G3, R-1530 (Flt3의 저해제이기도 함), 수니티닙(cKit 및 Flt3의 저해제이기도 함), 악시티닙(cKit의 저해제이기도 함), 레스타우르니팁 (lestaurtinib) (Flt3 및 PKC의 저해제이기도 함), 바탈라닙, 탄두티닙 (Flt3 및 cKit의 저해제이기도 함), 파조파닙 (pazopanib), GW 786034, PF-337210, IMC-1121B, AVE-0005, AG-13736, E-7080, CHIR 258, 소라페닙 토실레이트 (Raf의 저해제이기도 함), RAF-265 (Raf의 저해제이기도 함), 반데타닙(vandetanib), CP-547632, OSI-930, AEE-788 (EGFR 및 Her2의 저해제이기도 함), BAY-57-9352 (Raf의 저해제이기도 함), BAY-73-4506 (Raf의 저해제이기도 함), XL 880 (cMet의 저해제이기도 함), XL647 (EGFR 및 EphB4의 저해제이기도 함), XL 820 (cKit의 저해제이기도 함), 및 닐로티닙 (cKit 및 brc-abl의 저해제이기도 함)에서 선택되나, 이에 한정되지는 않는다.
추가 치료제는 또한 소분자 EGFR 저해제 또는 항EGFR 항체일 수 있는 EGFR 저해제 중에서 선택될 수 있다. 항EGFR 항체의 예는, 비제한적으로 세툭시맵, 파니투무맵, 마투주맵이며; 소분자 EGFR 저해제의 예는 제피티닙이다. 다른 EGFR 조절제의 예는 EGF 융합 독소이다.
EGFR 및 Her2 저해제 중에는 라파티닙(lapatinib), 게피티닙, 에를로티닙, 세툭시맵, 트라스투주맵, 니모투주맵, 잘루투무맵, 반데타닙(또한 VEGFR의 저해제), 페르투주맵(pertuzumab), XL-647, HKI-272, BMS-599626 ARRY-334543, AV 412, mAB-806, BMS-690514, JNJ-26483327, AEE-788 (또한 VEGFR의 저해제), ARRY-333786, IMC-11F8, Zemab이 본 발명의 이중특이성 결합분자와의 조합에 유용하다.
본 발명의 이중특이성 결합분자로의 치료요법에서 유리하게 조합될 수 있는 다른 약제는 토시투무맵(tositumumab) 및 이브리투모맵 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan) (2개의 방사능표지된 항-CD20 항체), 알렘투주맵(항-CD52 항체), 데노수맵(파골세포 분화인자 리간드 저해제), 갈릭시맵 (CD80 길항제), 오파투무맵 (ofatumumab) (CD20 저해제), 자놀리무맵(CD4 길항제), SGN40 (CD40 리간드 리셉터 조절제), 리툭시맵 (CD20 저해제) 또는 마파투무맵(mapatumumab) (TRAIL-1 리셉터 작용제)이다.
본 발명의 이중특이성 결합분자와 조합하여 사용될 수 있는 다른 화학요법제는 호르몬, 호르몬 유사체 및 항호르몬제(예: 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 풀베스트란트, 메제스트롤 아세테이트, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드, 부세렐린 아세테이트, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 메드록시프로제스테론, 옥트레오타이드, 아르족시펜, 파시레오타이드, 바프레오타이드), 아로마타제 저해제(예: 아나스트로졸, 레트로졸, 리아로졸, 엑세메스탄, 아타메스탄, 포메스탄), LHRH 작용제 및 길항제(예: 고세렐린 아세테이트, 로이프롤라이드, 아바렐릭스, 세트로렐릭스, 데슬로렐린, 히스트렐린, 트리프토렐린), 항대사물질(예: 항엽산제, 예를 들어 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 피리미딘 유사체, 예를 들어 5 플루오로유라실, 카페시타빈, 데시타빈, 넬라라빈 및 젬시타빈, 퓨린 및 아데노신 유사체, 예를 들어 머캅토퓨린 티오구아닌, 클라드리빈 및 펜토스타틴, 사이타라빈, 플루다라빈); 항종양 항생제(예: 안트라사이클린, 예를 들어 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신 및 이다루비신, 미토마이신-C, 블레오마이신 닥티노마이신, 플리카마이신, 미토잔트론, 픽산트론, 스트렙토조신); 백금 유도체(예: 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 로바플라틴, 사트라플라틴); 알킬화제(예: 에스트라무스틴, 메클로레타민, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 다카바진, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 하이드록시우레아, 테모졸로마이드, 니트로소우레아, 예를 들어 카무스틴 및 로무스틴, 티오테파); 항유사분열제(예: 빈카 알칼로이드, 예를 들어 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈, 빈플루닌 및 빈크리스틴; 및 탁산, 예를 들어 파클리탁셀, 도세탁셀 및 이의 제형, 라로탁셀; 시모탁셀 및 에포틸론, 예를 들어 익사베필론, 파투필론, ZK-EPO); 토포이소머라제 저해제(예: 에피포도필로톡신, 예를 들어 에토포사이드 및 에토포포스, 테니포사이드, 암사크린, 토포테칸, 이리노테칸) 및 다수의 화학요법제, 예를 들어 아미포스틴, 아나그렐리드, 인터페론 알파, 프로카바진, 미토탄 및 포르피머, 벡사로텐, 셀레콕시브 중에서 선택되나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 이중특이성 결합분자의 특히 바람직한 조합 짝은 VEGF 길항제, 예를 들어 베바시주맵(Avastin®), 바가테프(Vargatef)®, 소라페닙 및 수니티닙이다.
본 발명의 이중특이성 결합분자 또는 이를 함유하는 폴리펩티드, 및 이들을 포함하는 조성물의 효능은 적합한 시험관내 어세이, 세포 기반 어세이, 생체내 어세이 및/또는 공지된 동물 모델 또는 이들의 조합을 사용하여 관심있는 특정 질환 또는 장애에 따라 시험할 수 있다. 적합한 어세이와 동물 모델은 당업자들에게 명확하며, 예를 들어 여기에 기술되고 이하의 실시예에서 사용된 어세이, 예를 들어 증식 어세이가 있다.
예를 들어, 친화도 성숙 VHH가 완전하게 hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 블로킹하는 것을 나타내는 도 10의 ELISA 데이터; hDLL4/hNotch1-Fc 경쟁 ELISA에서의 친화도 성숙 VHH에 대한 IC50 (nM)값; 및 재조합 사람 DLL4 및 마우스 DLL4에 대한 정제된 친화도 성숙 VHH의 친화도 KD (nM)에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 실험에서 얻어진 데이터로부터 본 발명의 Dll4 결합성분들이 종래기술의 Dll4 결합분자의 특성보다 우월한 특성을 가지는 것을 확인하였다. 이것은 본 발명의 Dll4 결합성분이 암과 같은 신생혈관형성에 대한 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 및 장애에서 치료효능을 가지는 유망한 후보물질임을 나타낸다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면,
a) 샘플을 앞서 정의된 바와 같은 본 발명의 Dll4- 및/또는 Ang2 결합성분과 접촉하고,
b) Dll4- 및/또는 Ang2-결합성분과 샘플의 결합을 검출하고,
c) (b) 단계에서 검출된 결합을 표준물과 비교하고, 샘플과 관련한 결합의 차이가 신생혈관형성에서 Dll4 매개 효과와 연관된 질환 또는 장애의 진단인 것인, 질환의 진단방법을 제공한다.
이러한 용도와 다른 용도에 있어서, 본 발명의 이중특이성 결합성분을, 예를 들어 비오틴-(스트렙트)아비딘 결합쌍 같은 특이적 결합쌍의 일부인 작용그룹을 삽입하는 등으로 추가 변성하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 작용그룹을 사용하여 본 발명의 이중특이성 결합분자를 다른 단백질, 폴리펩티드 또는 결합쌍의 다른 절반에 결합된 화학적 화합물에, 즉 결합쌍의 형성에 의해 연결할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이성 결합분자는 비오틴에 컨쥬게이트되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 다른 단백질, 폴리펩티드, 화합물 또는 담체에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 컨쥬게이트된 이중특이성 결합분자는 검출가능한 시그널 생성제가 아비딘 또는 스트렙타비딘에 컨쥬게이트된 진단 시스템 등에서 리포터로 사용될 수 있다.
도 1: 사람, 벵골원숭이 및 사이노몰거스원숭이 DLL4의 아미노산 서열 배열.
도 2: 사람과 마우스 DLL4 결실 돌연변이체 (윗첨자는 아미노산 도메인 범위).
도 3: hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 블로킹하는 정제된 VHH (ELISA).
도 4: hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 블로킹하는 정제된 VHH (AlphaScreen).
도 5: CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 블로킹하는 정제된 VHH (FMAT).
도 6: DLL4 매개 Notch1 분해를 블로킹하는 정제된 VHH (리포터).
도 7: 정제된 VHH와 재조합 사람 및 마우스 DLL4의 결합 (ELISA).
도 8: 정제된 VHH와 재조합 사람 DLL1 및 사람 Jagged-1의 결합 (ELISA).
도 9: 정제된 VHH와 사람/마우스/사이노몰거스원숭이 DLL4의 결합 (FACS).
도 10: hDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 블로킹하는 친화도 성숙 VHH (ELISA).
도 11: CHO-hDLL4/hNotch1-Fc 및 CHO-mDLL4/hNotch1-Fc 상호작용을 블로킹하는, 정제된 친화도 성숙 VHH (FMAT).
도 12: 정제된 VHH와 사람/마우스 DLL4의 결합 (ELISA).
도 13: 정제된 친화도 성숙 VHH와 재조합 사람 DLL1 및 사람 Jagged-1의 결합 (ELISA).
도 14: 정제된 VHH와 사람/마우스/사이노몰거스원숭이 DLL4의 결합 (FACS).
도 15: HUVEC 증식의 Dll4 매개 저해에 대한 VHH 효과의 평가.
도 16: 설명 사이클 1 DLL4xAng2 VHH
도 17: hDLL4-hNotch1 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 1 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 18: CHO-hDLL4/Notch1(44-1)과 CHO-mDLL4/Notch1(44-2) 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 1 DLL4xAng2 VHH (FMAT)
도 19: 사람, 마우스 및 사이노몰거스원숭이 DLL4 과발현 CHO 세포에 결합한 정제 사이클 1 DLL4xAng2 VHH (FACS)
도 20: 사람, 마우스 및 래트 DLL4에 결합한 정제 사이클 1 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 21: 사람 DLL1 및 Jagged-1에 결합한 정제 사이클 1 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 22: hAng2-hTie2 (48-1), mAng2-mTie2 (48-2) 및 cAng2/cTie2 (48-3) 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 1 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 23: 설명 사이클 2 DLL4xAng2 이중특이성 VHHs
도 24: hDLL4-hNotch1 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 25: CHO-hDLL4/Notch1(51-1)과 CHO-mDLL4/Notch1(51-2) 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH(FMAT)
도 26: hDLL4 매개 Notch1 활성화를 블로킹하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (리포터 유전자 어세이)
도 27: 사람, 마우스 및 사이노몰거스원숭이 DLL4 과발현 CHO 세포에 결합한 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (FACS)
도 28: 사람, 마우스 및 래트 DLL4에 결합하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 29: 사람 DLL1 및 Jagged-1에 결합하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 30: hAng2-hTie2 (56-1), mAng2-mTie2 (56-2) 및 cAng2/cTie2 (56-3) 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 31: hAng1-hTie2 상호작용을 블로킹하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH (ELISA)
도 32 : hAng2 매개 HUVEC 생존을 블로킹하는 정제 사이클 2 DLL4xAng2 VHH.
재료 및 방법
a) 사람, 마우스 및 사이노몰거스원숭이 Dll4를 과발현하는 CHO 및 HEK293 세포주의 생산
사람(서열번호: 417; NM_019074.2)과 마우스 Dll4 (NM_019454.3)를 코딩하는 cDNA를 Human Adult Normal Tissue Heart cDNA 라이브러리(BioChain, Hayward, CA, USA)와 Mouse Heart Tissue cDNA 라이브러리(C57/Bl6 균주로부터 단리) 각각으로부터 상응하는 서열 (표 1 참조; 서열번호:421 내지 426)의 5' 및 3' UTR 내에 고안된 올리고뉴클레티드를 사용하여 증폭하였다. 앰플리콘을 포유동물 발현벡터 pCDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클론하였다.
Figure pct00002

사이노몰거스원숭이 Dll4 cDNA를 Cynomolgus Normal Tissue Heart cDNA 라이브러리(BioChain, Hayward, CA, USA)로부터, 근접 관련종 벵골원숭이의 Dll4 코딩 서열(Macaca mulatta Dll4, 서열번호: 418; XM_001099250.1)(표 1 참조)의 5' 및 3' UTR에서 설계된 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 최종 앰플리콘을 포유동물 발현벡터 pCDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클론하였다. 사이노몰거스원숭이 Dll4의 아미노산 서열은 벵골원숭이에 100%, 사람에 대하여 99% 일치하는 것으로 나타났다(도 1 참조: 사람 서열과의 차이는 굵은 밑줄로 표시하였다).
사람 Dll4, 마우스 Dll4 또는 사이노몰거스원숭이 Dll4를 과발현하는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 구축하기 위하여 모체 CHO 세포를 pCDNA3.1(+)-neo-hDll4, pcDNA3.1(+)-neo-mDll4 또는 pcDNA3.1(+)-neo-cDll4 각각으로 전기천공하였다. 사람 Dll4 및 마우스 Dll4를 과발현하는 사람 배아 신장(HEK293) 세포를 pCDNA3.1(+)-neo-hDll4 또는 mDll4 플라스미드 각각의 Fugene (Roche)으로 HEK293 모세포주에서 지질 매개성 형질감염으로 생성하였다. 모든 조건에서, 형질감염체를 1 mg/mL 게네티신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가하여 선별하였다.
b) 모노클로날 항-Dll4 IgG 및 Fab 단편의 생산
미국 공개특허 제2008/0014196호(Genentech)에서는 수많은 이종그래프트 모델에서의 종양 성장에 대한 VEGF mAb 및 Dll4 mAb의 추가 효과를 입증하기 위해 Ridgway 등(2006)이 사용한 사람/마우스 교차반응성 Dll4 mAb를 기술하였다. 이러한 항-Dll4 mAb와 그의 상응하는 Fab를 정제하여 생화학적/세포적 어세이와 이종그래프트 모델에서, 그리고 파지 선택 동안의 특이적 용출에서 이 항체(단편)의 특성을 평가하였다. Dll4 mAb의 공개된 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 hIgG2aκ 프레임워크에 클론하고, HEK293 세포에서 일시적으로 발현하여 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 상징액으로부터 정제하였다. 정제된 Dll4 mAb는 ELISA와 FACS (CHO-mDll4 및 CHO-hDll4 세포 사용)에서 사람 Dll4와 마우스 Dll4에 대한 결합, Biacore에서의 양 성장인자 상동성 유전자(orthologue)에 대한 서브-나노몰(sub-nanomolar) 친화도를 나타내었다.
상응하는 Dll4 Fab 단편을 E. coli에서의 발현을 위한 역번역(back-translation)과 코돈 최적화에 기초한 유전자 어셈블리에 의해 Leto's Gene 최적화 소프트웨어(www.entechelon.com)를 사용하여 제조하였다. 가변 경쇄 (VL), 가변 중쇄 (VH), 정상(constant) 경쇄 (CL) 및 중쇄의 정상 도메인 1 (CH1)의 어셈블리에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하여 어셈블리 PCR를 수행하였다. VL+CL 및 VH+CH1을 코딩하는 cDNA 세그먼트를, LacZ 프로모터, 카나마이신에 대한 저항성 유전자, 복수 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열을 함유하는 pUC119 유도 벡터에 SfiI 및 AscI 제한부위와 KpnI 및 NotI 제한부위 각각을 사용하여 클론하였다. Fab 코딩 서열을 가지는 프레임에서, 발현벡터는 C-터미널 HA 및 His6-태그(tag)를 코딩한다. Fab 단편은 E. coli에서 His6-태그된 단백질로서 발현된 후, 배양배지에서 고정화된 금속 친화도 크로마토그래피(IMAC)와 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제된다. 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 관련 아미노산 서열이 기술되었으며(각각 미국 공개특허 제2008/0014196호의 서열번호: 1 및 서열번호: 2);온전한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 서열번호: 419와 420에 각각 나타내었다.
c) 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 Dll4 돌연변이체의 생산
항-Dll4 VHH에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 Dll4의 세포외 도메인(ECD) 내 영역을 동정하기 위해 Dll4 ECD의 프로그레시브 결실 돌연변이를 생성하였다. 폴리His-태그에 융합된 Dll4 ECD의 결실 단편의 내포된 시리즈를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 CMV 프로모터 상부를 포함하는 포유동물 발현벡터 pSecTag2/Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조하였다(도 2 참조: 아미노산 도메인 영역은 상첨자로 표시). 재조합 단백질을 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포에서 Freestyle 293 Expression System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 발현하고 조절된 배지를 모아서 IMAC로 정제하였다. EGF2 유사 도메인이 없는 Dll4 돌연변이체만이 상기한 인간화된 사람/마우스 교차반응성 항-Dll4 mAb(캡쳐링 항-인간 IgG 코팅된 Biacore 센서칩에 의해 고정화)에 대해 손상된 결합을 나타내었다. 이 IgG는 Dll4 도메인에서 특이적 결합 에피토프를 가지는 것으로 알려져 있다(Genentech의 미국 공개특허 제2008/0014196A1호).
d) Dll4 리포터 어세이 플라스미드의 생산
리포터 어세이는 Notch1의 γ-세크리타제 매개 분해와 Dll4로의 자극시 Notch1의 세포내 도메인 (NICD)의 핵 전좌(translocation)에 기초하여 기본적으로 기술된 바(Struhl and Adachi, Cell. 1998 May 15;93(4):649-60)와 같이 개발되었다. Gal4/VP16 코딩 서열을 NCID 코딩 서열에 도입하였다. Herpes 단순 바이러스성 전사 활성제 도메인 VP16에 융합된 효모 GAL4의 DNA 결합 단편으로 구성되는 강력한 하이브리드 전사 활성제 GAL4-VP16을 Notch1의 막관통영역에 대한 카복시 터미널에 도입하였다. γ-세크리타제에 의한 이 구조물의 분해로 Gal4/VP16 NICD 융합 단백질이 방출되고, 이 단백질은 이것이 결합하여 동시 형질감염된 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 전사적으로 활성화하는 핵에 전좌하게 되어, 강력한 GAL4-UAS 프로모터 서열을 포함한다(Struhl, G. and Adachi, A., Cell, vol. 93, 649-660, 1998). 사람 Notch1-Gal4/VP16 발현 카세트를 pcDNA3.1(+)-neo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클론하였다. pGL4.31[Luc2P/Gal4UAS/Hygro] 벡터(Promega, Madison, WI, USA)를 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 사용하였다.
실시예 1
라마에서 체액성 면역반응을 유도하는 상이한 종의 Dll4 로의 면역화
1.1 면역화
Ethical Committee of the faculty of Veterinary Medicine (University Ghent, Belgium)의 승인 후에 4마리의 라마(지정번호 208, 209, 230, 231)를 재조합 사람 Dll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)의 6회 근육내 주사(주 단위로 100 또는 50 μg/투여)로 면역시켰다. Dll4 항원을 Stimune (Cedi Diagnostics BV, Lelystad, The Netherlands)에 제제화하였다. 3마리의 다른 라마(지정번호 127b, 260, 261)를 위에 기술된 바와 같이 구축된, 변성 사람 Dll4 및 마우스 Dll4를 과발현하는 CHO 세포의 4회 피하 주사로 표준방법에 따라 면역시켰다. 세포를 D-PBS에 재현탁시키고 주사 전에 빙냉하였다. 또한, 3마리의 다른 라마(지정번호 282, 283, 284)를 표준방법에 따라 변성 재조합 사람 Dll4 및 마우스 Dll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, US)의 4회 근육내 주사(2주 단위로 100 또는 50 μg/투여)로 면역시켰다. 0일째, 사람 Dll4의 최초 주사는 Complete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA)에서 제제화되었고, 사람 및 마우스 Dll4로의 후속 주사는 Incomplete Freund's Adjuvant (Difco, Detroit, MI, USA)에서 제제화되었다.
1.2 라마에서의 유도된 면역반응의 평가
사람 Dll4에 대한 동물에서의 면역반응 유도를 ELISA로 평가하기 위해, 0일(면역전), 21일 및 43일(말초혈액 림프구[PBL] 수집 시간)째에 라마 208, 209, 230 및 231에서, 0일 및 51일째에 라마 127b, 260 및 261에서, 및 0일, 28일, 50일째에 라마 282, 283 및 284에서 혈청을 수집하였다. 요컨대, 2 μg/mL의 재조합 사람 Dll4 또는 마우스 Dll4(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 4 ℃에서 밤새 96 웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에 고정시켰다. 웰을 카제인 용액(1%)으로 블로킹하였다. 혈청 희석액을 첨가한 후, 특이적으로 결합된 면역글로불린을 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)로 컨쥬게이트된 염소 항-라마 면역글로불린(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)과 TMB 기질(3,3',5,5'-테트라멘틸벤지딘) (Pierce, Rockford, IL, USA) 존재 하의 후속 효소반응을 사용하여 검출하였으며, Dll4에 대한 유의한 항체 의존성 면역반응이 유도된 것으로 나타났다. 특이적으로 결합된 면역글로불린은 일반적인 라마 IgG1 항체 또는 중쇄만의 라마 IgG2 또는 IgG3 항체(표 2-A)를 특이적으로 인식하는 항체로 검출될 수 있기 때문에 항체 반응은 일반적 항체 및 B-세포 레퍼토리를 발현하는 중쇄만의 항체에 의해 시작된다. 마우스 Dll4가 주사된 모든 라마에서 항체 반응은 일반적인 마우스 Dll4에 대해 특이적으로 B-세포를 발현하는 중쇄만의 항체에 의해 시작된다. 또한, 세포 면역화된 동물의 혈청 역가는 사람 및 마우스 Dll4를 과발현하는 HEK293 세포에서의 FACS 분석으로 확인된다(표 2-B). 각 라마에 대한 Dll4 혈청 역가반응을 표 2에 나타내었다.
Figure pct00003

Figure pct00004

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Figure pct00006

실시예 2
중쇄만의 항- Dll4 항체 단편 레퍼토리의 클로닝 및 파지 제조
최종 면역원 주사 후에, 중쇄 항체를 생산하는 B-세포의 공급원인 면역조직을 면역된 라마에서 수집하였다. 전형적으로, 최종 항원 주사 후 4일과 8일째에 수집된 2개의 150 ml 혈액샘플, 및 최종 항원 주사 후 4일째에 수집된 하나의 림프절 생검을 각 동물에서 수집하였다. 혈액샘플에서 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 Ficoll-Hypaque를 사용하여 제조업자(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)의 지시에 따라 제조하였다. PBMC와 림프절 생검으로부터, 전체 RNA를 추출하고, RT-PCR의 출발물질로 사용하여 VHH를 코딩하는 DNA 세그먼트를 WO 05/044858에 기술된 바와 같이 증폭하였다. 각각의 면역된 라마에 대하여 수집된 이 동물의 모든 면역 조직으로부터 단리된 전체 RNA를 모아서 라이브러리를 구성하였다. 요컨대, PCR로 증폭된 VHH 레퍼토리를 특이적 제한부위에 의해 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하기 위해 설계된 벡터에 클론하였다. 이 벡터는 pUC119에서 유도되었으며 LacZ 프로모터, M13 파지 gIII 단백질 코딩 서열, 암피실린 또는 카베니실린에 대한 저항성 유전자, 다중 클로닝 부위 및 하이브리드 gIII-pelB 리더 서열(pAX050)을 함유한다. VHH 코딩 서열을 가지는 프레임에서 벡터는 C-터미널 c-myc 태그와 His6 태그를 코딩한다. 파지는 표준방법에 따라 제조되고 추후 사용을 위해 4 ℃에서 멸균여과한 후 보관하였다.
실시예 3
파지 디스플레이에 의한 Dll4 특이적 VHH 의 선별
모든 라마에서 얻어진, 파지 라이브러리로서 클론된 VHH 레퍼토리를 상이한 선택 전략에 사용하였으며, 다양한 선택 조건을 적용하였다. 변수들은 다음과 같다: i) Dll4 단백질 포맷(사람 Dll4(Met1-Pro524) 및 마우스 Dll4 (Met1-Pro525) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)의 C-터미널로 His-태그된 재조합 발현 세포외 도메인), 또는 Dll4를 과발현하는 CHO 또는 HEK293 세포에 존재하는 전장 사람 Dll4 및 마우스 Dll4, ii) 항원 제시방법(Dll4로 직접 코팅된 플레이트 또는 비오틴-태그에 의해 Dll4로 코팅된 Neutravidin 플레이트; 용액상; Neutravidin 코팅된 플레이트에서 캡쳐링하기 전의 용액내 인큐베이션), iii) 항원 농도, 및 iv) (트립신에 의해 비특이적이거나 동족 리셉터 Notch1/Fc 키메라 또는 항-Dll4 IgG/Fab에 의해 특이적인)상이한 용출 방법. 모든 선별은 Maxisorp 96 웰 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 수행하였다.
다음과 같이 선별하였다: 고체상 및 용액상 선택 포맷에 대한 Dll4 항원 조제물을 상기한 바와 같이 다양한 농도로 제공하였다. 파지 라이브러리와 2시간 인큐베이션하고 충분히 세척한 후, 결합된 파지를 트립신(1 mg/mL)으로 30분 동안 용출하였다. 트립신을 파지 용출에 사용하는 경우, 프로테아제 활성을 0.8 mM 프로테아제 저해제 ABSF를 사용하여 즉시 중화하였다. 대조용으로, 선별 w/o 항원을 동시에 수행하였다. 기본값(비항원 대조용)에 대하여 농축을 나타내는 파지 결과물을 사용하여 E. coli를 감염시켰다. 감염된 E. coli 세포를 다음 선별단계(파지 복구)에서 파지를 제조하기 위해 사용하거나, 개별 VHH 클론의 분석을 위한 아가 플레이트(LB+amp+글루코스2%)에 도말하였다. 특이적 바인더에 대한 선별 결과물을 스크린하기 위해 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 추출하여 1 mL 96-딥웰 플레이트에서 배양하였다. LacZ-조절된 VHH 발현을 글루코스 부재 하에서 IPTG (최종 0.1-1mM)를 첨가하여 유발하였다. 주변세포질 추출물(~80 μL 부피)을 표준방법에 따라 제조하였다.
실시예 4
Dll4 - Notch1 AlphaScreen 및 FMAT 경쟁 어세이에서 주변세포질 추출물의 스크리닝
주변세포질 추출물을 사람 Dll4/사람 Notch1 AlphaScreen 어세이에서 스크린하여 발현된 VHH의 블로킹(blocking) 능력을 평가하였다. 사람 Dll4를 비오틴(Sigma, St Louis, MO, USA)과 비오틴아미도헥사노익산 3-설포-N-하이드록시숙신이미드 에스테르 소듐염(Sigma, St Louis, MO, USA)을 사용하여 비오틴화하였다. Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 수용체 비즈(beads)에 결합된 항-Fc VHH를 사용하여 제조업체(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)의 지시에 따라 캡쳐하였다. VHH의 중화능력을 평가하기 위하여 주변세포질 추출물의 연속 희석물을 비오틴화된 사람 Dll4와 사전 인큐베이션하였다. 이 혼합물에 수용체 비즈와 스트렙타비딘 도너 비즈를 첨가하고 추가로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. Envision Multilabel Plate 판독기 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)에서 680 nm의 여기 파장과 520 nm의 방출 파장을 사용하여 플레이트들을 판독하여 형광을 측정하였다. 형광 시그널의 감소는 사람 Notch1/Fc 리셉터에 대한 비오틴화된 사람 Dll4의 결합이 주변세포질 추출물에서 발현된 VHH에 의해 블로킹된 것을 나타낸다.
선택적으로, CHO-hDll4와 CHO-mDll4 세포를 사람 Notch1/Fc FMAT (Fluoro-metric Microvolume Assay Technology) 경쟁 어세이에서 사용하였다. 재조합 사람 Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 무작위로 Alexa-647 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 표지하였다. 요약하면, 5 μL의 주변세포질 물질을 7,500 CHO-hDll4 또는 CHO-mDll4 과발현 세포 각각 및 100 pM 또는 175 pM의 표지된 사람 Notch1/Fc에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션한 후 판독하였다. 비경쟁 기준선을 결정하기 위해서, 사람 Notch1/Fc~Alexa647를 가지는 세포의 적어도 30 복제를 포함하여 기준선으로부터 저해율을 계산하였다. 모든 계산은 웰 시간당 형광의 평균과 웰 당 카운트 수를 포함하는 FL1_전체 시그널에 기초하였다.
이 스크리닝으로부터 저해 VHH를 선별하고 서열화하였다. 서열분석에서는 40개의 상이한 B-세포 계통에 속하는 167개의 고유 VHH가 나타났다. 각각의 B-세포 계통에서 발견된 변이체의 전체 수를 표 3에 기재하였다. 주변세포질의 스크리닝 데이터 개요를 표 4에 나타내었다. 얻어진 모든 고유 VHH의 아미노산 서열을 서열목록(서열번호:167 - 332 및 459)과 표 5(CDR 및 프레임워크 영역 표시)에 나타내었다.
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실시예 5
정제된 항- Dll4 VHH 의 특성화
실시예 4에 기술된 스크리닝에서 선별된 저해성 항-Dll4 VHH를 추가로 정제하여 특성화하였다. 선별된 VHH를 E. coli TG1에서 c-myc, His6-태그된 단백질로서 발현하였다. 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고 37 ℃에서 4시간 동안 계속하였다. 세포 배양물을 스피닝한 후, 주변세포질 추출물을 펠릿을 동결융해하여 제조하였다. 이 추출물을 출발물질로 사용하여 VHH를 IMAC와 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 정제하여 SDS-PAGE 순도 95%로 생성하였다.
5.1 ELISA에서 Dll4를 블로킹하는 VHH의 평가
VHH의 블로킹 능력을 사람 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 블로킹 ELISA로 평가하였다. 요약하면, 1μg/mL의 사람 Notch1/Fc 키메라(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany) 내에 코팅하였다. 15 nM 비오틴화 사람 Dll4의 고정 농도를 VHH의 연속 희석물과 1시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 혼합물을 코팅된 Notch1 리셉터에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴화 사람 Dll4의 남아있는 결합을 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 컨쥬게이트된 엑스트라비딘(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 검출하였다(도 3). 사람 Dll4를 상기한 바와 같이 비오틴화하였다. 사람 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 6에 기재하였다.
Figure pct00055

5.2. AlphaScreen에서 Dll4 블로킹 VHH의 평가
요약하면, 1 nM 비오틴화 사람 Dll4를 스트렙타비딘 코팅된 도너(donor) 비즈(20 μg/mL)에 캡쳐하고, 0.4 nM의 리셉터 사람 Notch1(Fc 융합 단백질)을 항-사람 Fc VHH 코팅된 수용체 비즈(20 μg/mL)에 캡쳐하였다. 적재된 양 비즈를 경쟁 VHH의 희석 범위와 함께 인큐베이션하였다(도 4). 사람 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 7에 기재하였다.
Figure pct00056

5.3 항-Dll4 VHH에 의한, CHO 세포 상에서 발현된 사람 또는 마우스 Dll4에 결합한 사람 Notch1/Fc 결합의 저해
VHH의 블로킹 능력을 실시예 4에 요약된 바와 같이 사람 및 마우스 Dll4 - 사람 Notch1/Fc 경쟁 FMAT 어세이에서 평가하였다(도 5). CHO 세포에서 발현된 사람 또는 마우스 Dll4에 대한 사람 Notch1/Fc의 상호작용을 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 8에 기재하였다.
Figure pct00057

5.4 리포터 어세이에서 Dll4 블로킹 VHH의 평가
선별된 VHH의 능력을 평가하기 위해, Notch1의 γ-세크리타제 매개 분해와 Dll4로의 자극시 Notch1의 세포내 도메인(NICD)의 분비에 기초한 리포터 어세이를 수행하였다. Notch1-GAL4/VP16 구조물을 HEK 세포에서 pGL4.31[Luc2P/Gal4 UAS/Hygro] 리포터 플라스미드로 동시형질감염하여 융합 단백질을 일시적으로 발현하였다. 일시적으로 형질감염된 세포를 24시간 동안 안정한 HEK293-hDll4 세포주와 동시배양하여 자극하였다. 형질감염 48시간 후에 판독하였다. 동시배양의 개시 1시간 전에 VHH를 HEK293-hDll4 세포와 사전 인큐베이션하고 동시배양하는 동안 포함시켰다(도 6). Notch1의 Dll4 매개 분해와 그의 NICD의 리셉터 세포 핵으로의 차후 전좌를 블로킹하는 VHH의 IC50값을 표 9에 기재하였다.
Figure pct00058

5.5 에피토프 비닝(binning)
예를 들어, 벤치마크 항체가 결합될 때, VHH가 Dll4에 동시에 결합할 수 있는지를 측정하기 위해 에피토프 비닝 실험을 수행하였다(Biacore T100 instrument에서 표면 플라스몬 공명(SPR) 사용). 항-Dll4 Fab 단편을 레퍼런스와 CM5 센서 칩의 활성 유동세포에 비가역적으로 고정시켰다. 각 샘플(사이클)에 대하여 사람 Dll4를 활성 유동세포와 레퍼런스 유동세포에 주입하고 항-Dll4 Fab로 가역적으로 캡쳐하였다. VHH의 추가 결합은 고정 표면상의 주입에 의해 평가되었다. 모든 VHH와 항-Dll4 Fab를 100nM로 주사하였으며, 표면접촉시간은 120초이고 유속은 10μL/분으로 하였다. 표면을 10 mM 글리신(pH 1.5)을 사용하여 재생하였다. 진행된 곡선을 Biacore T100 Evaluation 소프트웨어로 평가하였다. 표 10-A는 분석된 VHH와 대조군의 순차적 주사/재생 경로를 나타낸다. VHH DLLBII56A09 (서열번호: 300), DLLBII96C03 (서열번호: 326), DLLBII101G08 (서열번호: 197) 및 DLLBII115A05 (서열번호: 224)는 Dll4 Fab에 의해 캡쳐된 사람 Dll4에 추가적으로 결합하지 않는 것으로 나타났다. Dll4 Fab의 주사 또한 사람 Dll4를 추가적으로 결합하지 못하여 모든 에피토프가 포화되었음을 시사하였다. 그러므로, 이러한 VHH가 사람 Dll4를 결합하는데 있어서 Dll4 Fab와 중첩하는 에피토프를 인식하는 것으로 결론지을 수 있다. 사람만의 VHH DLLBII6B11 (서열번호: 174) 및 DLLBII104G01 (서열번호: 215)은 Dll4 Fab 캡쳐 사람 Dll4 상에서 추가 결합을 나타내어, 사람 Dll4에 특이적인 VHH가 사람/마우스 교차반응 VHH와는 다른 에피토프를 인식하는 것을 시사하였다.
Figure pct00059

5.6 Dll4 결실 돌연변이체를 사용한 에피토프 맵핑(mapping)
Dll4 돌연변이체에 대한 VHH의 결합을 Biacore에서 평가하였다. 요약하면, VHH DLLBII101G08(서열번호:197) 및 DLLBII115A5(서열번호: 224)를 CM4 Sensorchip 상에 코팅하고 200 nM의 각 결실 돌연변이체를 칩을 통하여 주사하였다. 결합을 정성적으로 평가하였다. DLLBII56A09(서열번호: 300), DLLBII101G08 (서열번호: 197) 및 DLLBII115A05(서열번호: 224)의 결합은 사람 및 마우스 Dll4 돌연변이체 hDll4.1 및 mDll4.8, 각각에 대하여 관찰되지 않았으며, EGF-유사 2 도메인이 결손되었다(Table 10-B). hDll4/Dll4 IgG 경쟁 ELISA를 사용한 간접 증거가 이미 이러한 관찰을 적중하였다. 요약하면, 1 μg/mL의 Dll4 IgG를 96 웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany)에 코팅하였다. 고정 농도의 6 nM 비오틴화 사람 Dll4를 VHH의 연속 희석물과 1시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 혼합물을 코팅된 IgG에서 추가로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오틴화 사람 Dll4의 남아있는 결합을 호오스래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 엑스트라비딘(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 검출하였다(데이터는 기재하지 않음). 사람 Dll4를 상기한 바와 같이 비오틴화하였다. 모노클로날 항-Dll4 IgG(Genentech, 미국 공개특허 제2008/00 14196A1호)가 Dll4의 EGF-유사 2 도메인 내의 에피토프와 결합하는 것은 특허 문헌으로부터 알려져 있다.
Figure pct00060

5.7 hDll4 - VHH 상호작용의 친화도 측정
Dll4 - VHH 상호작용의 친화도를 결정하기 위한 운동역학적 분석을 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 Biacore T100 장치에서 수행하였다. 재조합 사람 Dll4를 CM5 칩 상에 아민 커플링(EDC 및 NHS 사용)에 의해 고정화하거나 비오틴화된 사람 Dll4를 SA칩(스트렙타비딘 표면) 상에 캡쳐하였다. 정제된 VHH 또는 Fab 단편을 2분 동안 상이한 농도(10 내지 300 nM)로 주사하고 20분 동안 45 μl/분의 유속으로 해리시켰다. 샘플 주입 사이에 표면을 10 mM 글리신 pH 1.5 및 100 mM HCl로 재생하였다. HBS-N (Hepes 완충액 pH 7.4)을 런닝(running) 완충액으로 사용하였다. 가능하면, 데이터를 결합 곡선에 대하여 1:1 상호작용 모델(Langmuir 결합)을 근사하여 평가하였다. 친화도 상수 KD를 얻어진 결합 및 해리 속도상수 (ka)와 (kd)로부터 계산하였다. 항-Dll4 VHH의 친화도를 표 11에 기재하였다.
Figure pct00061

5.8 상동성유전자(orthologues)(mDll4, cDll4) 및 구성 멤버(hJagged-1, hDLL1)에 대한 결합
마우스 Dll4에 대한 교차 반응성을 측정하기 위하여 결합 ELISA를 수행하였다. 요약하면, 재조합 마우스 Dll4 (R&D Systems, Minneapolis, MS, USA)를 밤새 4 ℃에서 1 μg/mL로 96웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany) 내에 코팅하였다. 웰들을 카제인 용액(PBS 중의 1% 용액)으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석물로서 적용하고 결합을 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-AP 컨쥬게이트 (Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 검출하였다(도 7). 레퍼런스로 사람 Dll4와의 결합을 측정하였다. 표 12에 EC50값을 요약하였다.
Figure pct00062
VHH의 사이노몰거스원숭이 교차 반응성을 측정하기 위하여 FACS 결합 실험을 수행하였다. 사이노몰거스원숭이 Dll4를 발현하는 HEK293 세포(일시적 또는 안정한 형질감염)를 VHH의 적정 결합 실험에 사용하였다. 빙냉 하에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 모든 샘플을 세척하고 항-c-myc~Alexa647 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 적용하여 검출하였다. 사람과 마우스 Dll4를 과발현하는 HEK293 세포를 레퍼런스로 하였다. 평균 MCF값을 FACS 어레이에서 측정하고 EC50값의 계산에 사용하였다(도 9 참조).
상동성 리간드 사람 DLL1 및 사람 Jagged-1에 대한 결합의 부재를 고체상 결합 어세이(ELISA)에 의해 평가하였다. 요약하면, 사람 DLL1 (Alexis, San Diego, CA, USA) 및 사람 Jagged-1(Alexis, San Diego, CA, USA)을 밤새 4 ℃에서 1 μg/ mL로 96웰 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, Wiesbaden, Germany) 내에 코팅하였다. 웰들을 카제인 용액(PBS 중의 1% 용액)으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석물로서 적용하고 결합을 마우스 항-myc(Roche) 및 항-마우스-AP 컨쥬게이트(Sigma, St Louis, MO, USA)를 사용하여 검출하였다. 모든 항-Dll4 VHH는 이러한 상동성 리간드에 대하여 비교차반응성인 것으로 간주되었다(도 8).
5.9 Dll4 매개 HUVEC 증식의 블로킹에서 VHH의 평가
선별된 VHH의 능력을 문헌[Ridgway et al ., Nature. 2006 Dec 21;444 (7122):1083-7]에 기술된 증식 어세이의 변형된 형태로 평가하였다. 요약하면, 96 웰 조직 배양 플레이트를 코팅 완충액(PBS, 0.1% BSA) 중의 정제된 Dll4-His (RnD Systems; C-터미널 His-태그된 사람 Dll4, 아미노산 27-524, 0.75ml/well, 10 ng/ml)으로 코팅하였다. 웰을 PBS로 세척하고 4000 HUVE 세포/웰을 4회 접종하였다. 세포 증식을 [3H]-티미딘 결합에 의해 4일째에 측정하였다. 도 15에 나타낸 결과는 DLL4 VHHs DLLBII101G08, DLLBII104G01, DLLBII115A05, DLLBII56A09 및 DLL4 Fab가 투여량 의존적인 방식으로 HUVEC 증식에 대하여 DLL4에 따른 효과를 저해하는 것을 증명하고 있다. IC50값을 표 13에 요약하였다. 시험된 VHH는 10 μM에서 DLL4에 따른 효과를 완전히 저해하였다.
Figure pct00063

실시예 6
선별된 항- Dll4 VHH 의 친화도 성숙
VHH DLLBII101G08 및 DLLBII115A05에 대하여 2 사이클의 친화도 숙성을 수행하였다.
제1 사이클에서, 아미노산 치환을 프레임워크(FW)와 상보성 결정 영역(CDR)에 error-prone PCR방법을 사용하여 무작위로 도입하였다. 2 라운드 PCR에 기초한 방법(Genemorph II Random Mutagenesis kit, Stratagene, La Jolla, CA, USA)으로 1 ng의 DLLBII101G08 또는 DLLBII115A05 cDNA 템플레이트를 사용하여 돌연변이를 수행한 다음, 0.1 ng의 제1 라운드 생성물을 사용하여 제2 error-prone PCR을 수행하였다. 폴리쉬 단계 후에, PCR 생성물을 고유 제한부위를 통해서 VHH 라이브러리의 파지 디스플레이를 촉진하기 위해 설계된 벡터에 도입하였다. 용액중 선별의 다음 라운드를 비오틴화된 재조합 사람 DLL4 (biot-rhDLL4) 및 트립신 용출액의 농도를 감소하여 수행하였다. 또한 차가운 rhDLL4 (biot-rhDLL4보다 적어도 100x 과량)를 사용하는 제3 라운드의 친화도 유도 선별을 수행하였다. 교차반응성(의 보존)이 스크리닝 레벨에서 평가되었기 때문에 마우스의 DLL4에 대한 어떠한 선별도 포함되지 않았다. 각각의 돌연변이체는 LacZ 프로모터, 암피실린에 대한 저항성 유전자, 복수 클로닝 부위 및 ompA 리더 서열(pAX50)을 함유하는 pUC119로부터 유도된 발현벡터를 사용하는 재조합 단백질로서 생산되었다. E. coli TG1 세포를 발현벡터 라이브러리로 형질변환하여 아가 플레이트(LB + Amp + 2% 글루코스)에 도말하였다. 단일 콜로니를 아가 플레이트에서 채취하여 1 mL 96 딥(deep)웰 플레이트에서 배양하였다. IPTG (1mM)을 첨가하여 VHH 발현을 유도하였다. 주변세포질 추출물(~ 80 uL의 부피)을 표준방법에 따라 제조하고 ProteOn (BioRad, Hercules, CA, USA) 오프율 어세이에서 재조합 사람 및 마우스 Dll4에 대한 결합을 위해 스크린하였다. 요약하면, GLC ProteOn Sensor 칩을 (레퍼런스 채널인 L1/L3와)"리간드 채널" L2 및 L4상에서 재조합 사람 Dll4로 코팅하고, "리간드 채널" L3 및 L6를 마우스 Dll4로 코팅하였다. 친화도 성숙 클론의 주변세포질 추출물을 1/10으로 희석하고, "분석물질 채널" A1-A6에 의해 주사하였다. 평균 오프율을 플레이트에 존재하는 야생형 클론에 대해 계산하고, 오프율 향상을 계산하기 위한 레퍼런스로 사용하였다.
제2 사이클에서, 조합 라이브러리를 사이클 1에서 확인된 가능한 위치를 동시에 무작위화하여 생성하였다. 이를 위하여 전장의 DLLBII101G8 또는 DLLBII 115A05 cDNA를 중첩 PCR에 의해 무작위화 위치에 축퇴된 올리고뉴클레오티드(NNS)를 사용하여 합성하고 복구 PCR을 수행하였다. 조합 라이브러리를 생성하는데 사용된 프라이머 리스트를 표 14 및 서열번호 427 내지 457에서 확인할 수 있다. 무작위화된 VHH 유전자를 파지 디스플레이 벡터(pAX50)에 상기한 바(실시예 2)와 같이 특정한 제한부위를 사용하여 도입하였다. 각각의 VHH 클론의 주변세포질 추출물을 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다.
Figure pct00064

Figure pct00065

Figure pct00066
Figure pct00067
ProteOn 오프율 어세이에서 재조합 사람 Dll4와의 결합 스크리닝은 최대 38배(DLLBII101G08) 및 11배(DLLBII115A05) 개선된 오프율로 클론을 동정하였다(표 15).
Figure pct00068
Figure pct00069
최상위 DLLBII101G08 변이체와 DLLBII115A05 변이체를 C-터미널 c-myc 태그 및 (His)6 태그를 갖는 프레임에서 발현벡터 pAX100에 클론하였다. 재조합 마우스 Dll4에 대한 오프율도 개선되었다. VHH를 E. coli에서 His6 태그된 단백질로서 생산하여 IMAC 및 SEC에 의해 정제하였다. 서열을 표 16-A(DLLBII101G08)와 16-B (DLLBII11A05) 각각에 나타내었다.
Figure pct00070

Figure pct00071
Figure pct00072

Figure pct00073
Figure pct00074

Figure pct00075

Figure pct00076

Figure pct00077

Figure pct00078
Figure pct00079

실시예 7
정제된 친화도 성숙 항- Dll4 VHH 의 특성화
VHH DLLBII101G08과 DLLBII115A05의 친화도 성숙 변이체를 발현시켜서 상기한 바와 같이 정제하였다(실시예 6). VHH를 rhDLL1/rhJAG1 결합 ELISA 및 hDll4/ mDll4/ cynoDll4 FACS (실시예 5.8; 표 20; 도 12 및 13), rhDll4 - rhNotch1 경쟁 ELISA (실시예 5.1; 표 17; 도 10), 경쟁 rhNotch1 - CHO-hDll4 FMAT (실시예 5.3; 표 18; 도 11)에서 특성화하였다.
특성화 데이터를 표 21에 요약하였다. 전체적으로 친화도 성숙 VHH는 친화도와 효능에서 분명한 개선을 나타낸 반면, mDll4 및 cyno Dll4에 대한 이들의 결합은 유지되고 hDLL1 또는 hJAG1과의 결합은 관찰되지 않았다.
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083

Figure pct00084

Figure pct00085

Figure pct00086
Figure pct00087

실시예 8
항-혈청 알부민 결합을 반감기 연장으로서 사용한 DLL4 및 Ang2 를 표적으로 하는 이중특이성 VHH 의 구성, 생산 및 특성화
제1 사이클에서, 항-DLL4 VHH DLLBII00018 (US 2011/0172398 A1)과 사이클 1 서열 최적화 항-Ang2 VHH 00042(서열번호: 482), 00045(서열번호: 484) 및 00050 (서열번호:483)을 빌딩블록으로 사용하여 이중특이성 VHH DLLANGBII00001-00016을 생성하였다. 혈청 알부민 결합 VHH에 대한 유전자 융합을 반감기 연장 방법으로 사용하였다. 빌딩블록을 9 Gly-Ser 가요성 링커에 의해 연결하였다. VHH를 제조하여 실시예 5에 기술된 바와 같이 정제하였다. 모든 이중특이성 VHH의 포맷과 서열에 대한 개관을 도 16 및 표 22-A (링커 서열은 밑줄 표시), 서열번호 460-475에 기재하였다. 발현 농도는 표 22-B에 나타내었다.
Figure pct00088

Figure pct00089

Figure pct00090

항-DLL4 블로킹 특성을 일가의 빌딩블록 DLLBII00018과 비교에서 분석하기 위하여, 정제된 이중특이성 VHH 모두를 hDLL4/hNotch1 경쟁 ELISA(미국 공개특허 제2011/0172398 A1호에 기술된 실시예 5.1 참조)(도 17) 및 CHO-hDLL4 / CHO-mDLL4 경쟁 FMAT(미국 공개특허 제2011/0172398 A1호에 기술된 실시예 5.3 참조)(도 18)로 분석하였다. 여기서 ELISA 경쟁 어세이는 고정 농도의 8 nM 비오틴화 hDLL4로 수행되었다. ELISA 및 FMAT 경쟁 어세이는 모두 VHH와 12.5 μM 및 25 μM의 사람 혈청 알부민 각각과 사전 인큐베이션한 후에 수행되었다. IC50값과 저해율(%)을 요약하여 표 23에 나타내었다.
Figure pct00091
Figure pct00092
또한, 이중특이성 VHH의 마우스 및 사이노몰거스 DLL4에 대한 교차반응성을 측정하기 위하여, FACS 결합 실험을 수행하였다. 요컨대, 마우스 및 사이노몰거스 DLL4를 과발현하는 CHO 세포를 VHH의 적정 결합 실험에 사용하였다. 빙냉 하에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 모든 샘플을 세척하고 항-c-myc 다음에 표지된 염소-항 마우스 IgG-PE를 사용하는 2-단계 검출을 수행하였다. 사람 DLL4를 과발현하는 CHO 세포를 레퍼런스로 하였다. 평균 MCF값을 FACS 어레이로 측정하여 EC50값의 계산에 사용하였다(표 24: 도 19).
Figure pct00093
마우스 DLL4 및 래트 DLL4에 대한 교차반응성을 측정하기 위하여 결합 ELISA를 수행하였다. 요컨대, 재조합 마우스 DLL4(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) 와 래트 DLL4를 밤새 4 ℃, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석으로 적용하여 엑스트라비딘-HRP가 이어진 비오틴화 항-VHH 1A4 결합이 검출되었다. 1A4는 항-VHH VHH (Ablynx NV에 의해 인하우스 제조)이다. 레퍼런스로서 사람 DLL4에 대한 결합을 측정하였다. EC50값을 표 25와 도 20에 요약하였다.
Figure pct00094
상동성 사람 리간드 DLL1 및 Jagged-1에 대한 결합 부재를 고체상 결합 어세이(ELISA)에 의해 평가하였다. 요컨대, 1 μg/mL의 재조합 인간 DLL1(Alexis, San Diego, CA, USA) 또는 재조합 인간 Jagged-1(Alexis, San Diego, CA, USA)을 밤새 4 ℃, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석으로 적용하여 엑스트라비딘-HRP가 이어진 비오틴화 항-VHH 1A4 결합이 검출되었다. 이중특이성 VHH 모두는 이들 상동성 리간드에 대한 교차반응성이 없는 것으로 간주되었다. 결과를 도 21에 나타내었다.
항-Ang2 블로킹 특성을 일가의 항-Ang2 빌딩블록 00042, 00045 및 00050과의 비교에서 분석하기 위하여, 정제된 이중특이성 VHH 모두를 사람 Ang2/hTie2-Fc(도 22a 내지 22g), 마우스 Ang2/mTie2 (도 22h 내지 22k) 및 cyno Ang2/cTie2 (도 22l 내지 22o) 경쟁 ELISA로 분석하였다. 이 어세이 또한 VHH와 0.5 μM의 사람 혈청 알부민과의 인큐베이션 후에 수행되었다. IC50값과 저해율(%)을 요약하여 표 26에 기재하였다.
Figure pct00095

Figure pct00096

특정 DLL4-Ang2 이중특이성 VHH의 사람 혈청 알부민에 대한 친화도를 측정(실시예 5 참조)하여 표 27에 기재하였다. 친화도 상수 KD를 얻어진 결합 및 해리상수 ka 및 kd로부터 계산하였다.
Figure pct00097

제2 사이클에서, 항-DLL4 VHH DLLBII00018 (US 2011/0172398 A1)과 최종 서열 최적화 항-Ang2 VHH 00921(서열번호: 485), 00938(서열번호:486) 및 00956(서열번호:488)을 빌딩블록으로 사용하여 이중특이성 VHH DLLANGBII00017-00019를 생성하였다. 혈청 알부민 결합 VHH에 대한 유전자 융합을 반감기 연장 방법으로 사용하였다. 빌딩블록을 9 Gly-Ser 가요성 링커에 의해 연결하였다. 모든 이중특이성 VHH의 포맷과 서열에 대한 개관을 도 23과 표 28(링커 서열은 밑줄 표시), 서열번호 476-478에 기재하였다.
Figure pct00098
항-DLL4 블로킹 특성을 일가 빌딩블록 DLLBII00018과의 비교에서 분석하기 위하여, 정제된 이중특이성 VHH 모두를 hDLL4/hNotch1 경쟁 ELISA (미국 공개특허 제2011/0172398A1호에 기술된 바와 같은 실시예 5.1)(도 24), CHO-hDLL4 / CHO-mDLL4 경쟁 FMAT (미국 공개특허 제2011/0172398A1호에 기술된 바와 같은 실시예 5.3)(도 25) 및 hDLL4 매개 Notchl 활성화(리포터 유전자) 어세이(미국 공개특허 제2011/0172398A1호에 기술된 바와 같은 실시예 5.4)(도 26)로 분석하였다. 여기서 ELISA 경쟁 어세이는 고정 농도의 8 nM 비오틴화 hDLL4로 수행되었다. ELISA 경쟁 어세이, FMAT 경쟁 어세이 및 리포터 유전자 어세이는 또한 VHH와 12.5 μM, 25 μM 및 162 μM의 사람 혈청 알부민 각각과 사전 인큐베이션한 후에 수행되었다. IC50값과 저해율(%)을 요약하여 표 29에 기재하였다.
Figure pct00099

사람 DLL4, 마우스 DLL4 및 래트 DLL4에 대한 결합을 Biacore로 평가하였다. 요컨대, 이중특이성 VHH의 동역학적 분석을 Biacore T100 장치에서 SPR에 의해 수행하였다. 재조합 사람 DLL4(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA) 및 마우스 DLL4 (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)를 CM5 칩상에 아민 커플링으로 고정하였다. VHH를 이 표면들 상에 2.5 내지 1,800 nM의 상이한 농도로 주입하였다. 샘플을 2분 동안 주입하여 20분 동안 45 μl/분의 유속으로 분해하였다. 샘플 주입 사이에 표면은 100s 펄스의 10 mM 글리신 pH 1.5로 재생되었다. 결합/해리 데이터를 1:1 상호작용 모델(Langmuir 결합)을 조절하여 평가하였다. 친화도 상수 KD를 얻어진 결합 및 해리율 상수 ka 및 kd로부터 계산하였다(표 30).
Figure pct00100

또한, 이중특이성 VHH의 마우스 및 사이노몰거스 DLL4에 대한 교차반응성을 측정하기 위하여, FACS 결합 실험을 수행하였다. 요컨대, 마우스 및 사이노몰거스 DLL4를 과발현하는 CHO 세포를 VHH의 적정 결합 실험에 사용하였다. 빙냉 하에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 모든 샘플을 세척하고 비오틴화 항-VHH 1A4에 이어서 PE 표지된 스트렙타비딘을 사용하는 2-단계 검출을 수행하였다. 사람 DLL4를 과발현하는 CHO 세포를 레퍼런스로 하였다. 평균 MCF값을 FACS 어레이로 측정하여 EC50값의 계산에 사용하였다(표 31: 도 27).
Figure pct00101

마우스 DLL4와 래트 DLL4에 대한 교차반응성을 측정하기 위해, 결합 ELISA를 수행하였다. 요컨대, 재조합 마우스 DLL4(R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)와 래트 DLL4를 밤새 4 ℃, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석으로 적용하여 엑스트라비딘-HRP가 이어진 비오틴화 항-VHH 1A4 결합이 검출되었다. 레퍼런스로서 사람 DLL4와의 결합을 측정하였다. EC50값을 표 32와 도 28에 요약하였다.
Figure pct00102

상동성 사람 리간드 DLL1 및 Jagged-1에 대한 결합 부재를 고체상 결합 어세이(ELISA)에 의해 평가하였다. 요컨대, 1 μg/mL의 재조합 사람 DLL1(Alexis, San Diego, CA, USA) 또는 재조합 사람 Jagged-1(Alexis, San Diego, CA, USA)을 밤새 4 ℃, 96-웰 MaxiSorp 플레이트(Nunc, Wiesbaden, Germany)에서 코팅하였다. 웰을 1% 카제인 용액으로 블로킹하였다. VHH를 연속 희석으로 적용하여 엑스트라비딘-HRP가 이어진 비오틴화 항-VHH 1A4 결합이 검출되었다. 이중특이성 VHH 모두는 이들 상동성 리간드에 대한 교차반응성이 없는 것으로 간주되었다. 결과를 도 29에 나타내었다.
항-Ang2 블로킹 특성을 최종 서열 최적화 일가 항-Ang2 빌딩블록 00921, 00938 및 00956과의 비교에서 분석하기 위하여 정제된 이중특이성 VHH 모두를 사람 Ang2/hTie2(도 30a 내지 30c), 마우스 Ang2/mTie2(도 30d 내지 30f), cyno Ang2/cTie2 (도 30g 내지 30i), hAng1/hTie2(도 31) 경쟁 ELISA 및 hAng2 매개 HUVEC 생존 어세이(도 32)에서 분석하였다. IC50과 저해율(%)의 요약을 표 33에 나타내었다.
Figure pct00103

사람, 마우스, 사이노몰거스원숭이 및 래트 Ang2에 대한 DLLANGBII00017-18-19의 친화도(실시예 5 참조)를 측정하여 표 34에 기재하였다.
Figure pct00104
사람, 마우스 및 사이노몰거스원숭이 혈청 알부민에 대한 DLLANGBII00017-18-19의 친화도를 측정(실시예 5)하여 표 35에 기재하였다. 친화도 상수 KD는 얻어진 결합 및 해리율 상수 ka 및 kd로부터 계산되었다.
Figure pct00105

Figure pct00106
SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Bispecific binding molecules binding to Dll4 and Ang2 <130> 12-0331-pct <160> 540 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Phe Ala Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 2 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser His Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 3 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 4 Pro Trp Asp Ser Trp Tyr Cys Gly Ile Gly Asn Asp Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 5 Pro Phe Ile His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 6 <211> 22 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 6 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Tyr Tyr Ser Pro 1 5 10 15 Glu Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 7 Pro Phe Ala His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 8 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 9 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 10 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 11 Pro Phe Ser His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 12 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 13 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val Phe Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 14 His Pro Leu Gln Asn Cys Cys Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 15 Pro Phe Ala Tyr Tyr Ser Asn Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 16 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Asn Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 17 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 18 Pro Phe Ala His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 19 Pro Phe Thr His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 20 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 21 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 22 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 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Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 32 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 33 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 34 Gly Arg Gly Phe Tyr His Asp Tyr Ser Ser Tyr Glu Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 35 Gly Pro Asp Cys Ser Ser Tyr Asp Tyr 1 5 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 36 Ser Leu Arg Gly Trp Asp Thr Thr Arg Ile Asp Tyr Glu Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 37 Ala Arg Gly Asp Ile Asp Val Tyr Thr Leu Ser Asp Ser 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 38 Ala Arg Gly Asp Ile Asp Val Tyr Thr Leu Ser Asp Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 39 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 40 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 41 Arg Leu Phe Lys Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 42 Leu Ala Thr Thr Val Thr Pro Ser Trp Val Asn Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 43 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 44 Ser Leu Arg Gly Trp Asp Thr Thr Trp Ile Asp Tyr Glu Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 45 Asp Ser Arg Arg Gly Gly Val Gly Asn Phe Phe Arg Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 46 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Ile Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 47 Arg Arg Asn Phe Leu Ser Asn Tyr 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 48 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 49 Ala Trp Cys Asp Ser Ser Trp Tyr Arg Ser Phe Val Gly Tyr 1 5 10 <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 50 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Arg Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 51 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 52 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 53 Pro Val Lys Val Ala Gly Leu Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 54 Asp Val Gln His Ser Ala Trp Leu Lys Pro Leu Thr Tyr 1 5 10 <210> 55 <211> 3 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 55 Asp Ile Tyr 1 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 56 Pro Tyr Tyr Ser Asp Phe Glu Gly Thr Thr Thr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 57 Thr Thr Arg Gly Arg Tyr Ser Ala Leu Ser Ala Ser Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 58 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 58 Asp Arg Tyr Ile Arg Ala Arg Gln Gly Asp Tyr Trp Gly Ala Tyr Glu 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 59 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 60 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 61 Pro Phe Asn His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 62 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Ser Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 63 Pro Phe Ser Tyr Tyr Asn Asn Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 64 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 64 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 65 Pro Phe Ala His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 66 Pro Phe Ala Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 67 Pro His Ser Asp Tyr Asp Glu Glu Ala Pro Ser Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 68 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Val Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 69 Ser Leu Gly Ser Ser Trp Cys Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 70 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 71 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 72 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 73 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Ala Tyr Cys Gly Val Asn Arg Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 74 Ala His Asp Asn Tyr Trp Phe Thr Asp Asp Ser Leu Gly Arg Gly Leu 1 5 10 15 Lys Tyr <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 75 Lys Thr Phe Gly Ser Asn Trp Tyr Asp Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 76 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 77 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 77 Asp Pro Phe His Asn Cys Tyr Ser Gly Ser His Tyr Ser Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 78 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 78 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 79 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 79 Pro Phe Asn Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 80 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 81 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 81 Pro Phe Ala His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 82 Glu Met Asp Gly Ser Arg Tyr Val 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 83 Val His Pro Ser Thr Gly Phe Gly Ser 1 5 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 84 Pro His Ser Asp Tyr Asp Glu Glu Ala Pro Ser Asp Phe Gly Ser 1 5 10 15 <210> 85 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 85 Arg Leu Phe Ser Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Ser Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 86 Arg Leu Phe Arg Gly Gly Cys Ala Val Val Ala Gly Thr Ser Trp Ala 1 5 10 15 Asp Phe Gly Ser 20 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 87 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 88 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 88 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 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<212> PRT <213> Lama Glama <400> 97 Asp Pro Leu Val Cys Gly Tyr Asn Asp Pro Arg Leu Ala Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 98 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 99 Pro Phe Asn Tyr Tyr Ser Asn Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 100 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 100 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Ser His Tyr Tyr Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 101 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 101 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Ser Asp Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 102 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 102 Pro Phe Ile His Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Asn Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 103 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 104 Ala Pro Ile Phe Glu Cys Pro Ser Gly Glu Ile Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 105 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 105 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 106 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 106 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Ser Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 107 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 107 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 108 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 108 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 109 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 109 Pro Phe Ala Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 110 Pro Phe Asn His Tyr Ser Phe Leu Cys Gly Val Asn Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 111 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Glu Val Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 112 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 112 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 113 Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 114 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 114 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 115 Ala Gly Ala Ser Ser Trp Cys Phe Pro Pro Gly Tyr 1 5 10 <210> 116 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 116 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Ile Tyr Tyr Ala Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 117 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 118 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 118 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 119 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 120 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 120 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Ser Asp Val His Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 121 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 121 Pro Phe Ser Tyr Tyr Ser Gly Leu Cys Gly Val Asn Gly Val Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 122 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 122 Ser Leu Gly Ser Ser Trp Cys Ala Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 123 Asp Pro Val His Asn Cys Tyr Ser Gly Arg Tyr Tyr Ala Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ala Val Tyr Glu Tyr 20 <210> 124 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 124 Ser Gly Ser Tyr Tyr Tyr Pro Thr Asp Val His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 125 Pro Phe Ser His Tyr Asn Asp Leu Cys Gly Val Asn Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 126 <211> 21 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 126 Asp Pro Ile His Asn Cys Tyr Ser Gly Asn Gly Tyr Asp Ser Pro Glu 1 5 10 15 Ala Val Tyr Asp Tyr 20 <210> 127 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1 5 10 <210> 135 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 135 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 136 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 136 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 137 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Tyr Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 138 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 138 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Thr Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 139 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 139 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Tyr Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 140 <211> 17 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 140 Lys Pro Asn Leu Lys Tyr Gly Ser Asp Trp Pro Pro Arg Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 141 Arg Thr Ser Arg Ser Pro Arg Pro 1 5 <210> 142 <211> 15 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 142 Ser Asn Tyr Tyr Ser Val Tyr Asp Asp Arg Pro Val Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 143 Gly Ser Gly Ser Trp Gly Val 1 5 <210> 144 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 144 Asn Glu Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 145 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 145 Asn Glu Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 146 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 146 Gly Gly Arg Ser Phe Leu Pro Phe Val Pro Ala Tyr 1 5 10 <210> 147 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 147 Asn Glu Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 148 <211> 19 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 148 Asn Gly Gly Tyr Cys Ser Gly Tyr Gly Cys Tyr Glu Asp Ser Gly Gln 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 149 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 149 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 150 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 150 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 151 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 152 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 152 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Ile Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 153 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 153 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Ile Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 154 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 154 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 155 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 155 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 156 <211> 12 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 156 Pro Ala Pro Gly Ser Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 1 5 10 <210> 157 <211> 11 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 157 Pro Gly Ile Ala Ala Cys Arg Gly Ile His Tyr 1 5 10 <210> 158 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 158 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro His Glu Tyr Ala Tyr 1 5 10 <210> 159 <211> 14 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 159 Pro Arg Gly Trp Gly Pro Thr Gly Pro Leu Glu Tyr Gly Tyr 1 5 10 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Glama <400> 175 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val 35 40 45 Ser Cys Ile Asn Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Pro Phe Glu Tyr Tyr Ser Asp Leu Cys Gly Val Asn Gly Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 176 <211> 130 <212> PRT <213> Lama Glama <400> 176 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Arg Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 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Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 145 150 155 160 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg 165 170 175 Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Ala Ile Arg Ser Ser 180 185 190 Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 210 215 220 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Pro Ala Gly 225 230 235 240 Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 275 280 285 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr 290 295 300 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu 305 310 315 320 Arg Glu Tyr Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Tyr 325 330 335 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 340 345 350 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 355 360 365 Val Tyr Tyr Cys Ala Asn Arg Ala Pro Asp Thr Arg Leu Ala Pro Tyr 370 375 380 Glu Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 405 410 415 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 420 425 430 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala 435 440 445 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser 450 455 460 Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 465 470 475 480 Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 485 490 495 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg 500 505 510 Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 515 520 <210> 479 <211> 124 <212> PRT <213> Lama glama <400> 479 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ala Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Arg Cys Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 480 <211> 126 <212> PRT <213> Lama glama <400> 480 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Met Gly Leu Gly 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 481 <211> 129 <212> PRT <213> Lama glama <400> 481 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Arg Asp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Asp Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro 100 105 110 Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 482 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 482 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Ser Ile Arg Asp Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro 100 105 110 Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 483 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 483 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Arg Cys Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 484 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 484 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Met Gly Leu Gly 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 485 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 485 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Ser Gly Leu Gly 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 487 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 487 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Tyr Gly Glu Gln Trp Tyr Pro 100 105 110 Ile Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 488 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 488 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ser Ala Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro 100 105 110 Leu Tyr Glu Tyr Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 489 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 489 Asp Tyr Ala Leu Gly 1 5 <210> 490 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 490 Cys Ile Arg Cys Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 491 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 491 Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 <210> 492 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 492 Tyr Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 493 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 493 Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 494 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 494 Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Met Gly Leu Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 495 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 495 Asp Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 496 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 496 Cys Ile Arg Asp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 497 <211> 20 <212> PRT <213> Lama glama <400> 497 Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Glu Tyr Asp Ala 20 <210> 498 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 498 Asp Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 499 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 499 Ser Ile Arg Asp Asn Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 500 <211> 20 <212> PRT <213> Lama glama <400> 500 Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Glu Tyr Asp Ala 20 <210> 501 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 501 Asp Tyr Ala Leu Gly 1 5 <210> 502 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 502 Cys Ile Arg Cys Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 503 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 503 Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 <210> 504 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 504 Tyr Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 505 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 505 Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 506 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 506 Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Met Gly Leu Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 507 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 507 Asp Tyr Ala Leu Gly 1 5 <210> 508 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 508 Cys Ile Arg Cys Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 509 <211> 15 <212> PRT <213> Lama glama <400> 509 Ser Ile Val Pro Arg Ser Lys Leu Glu Pro Tyr Glu Tyr Asp Ala 1 5 10 15 <210> 510 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 510 Tyr Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 511 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 511 Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 512 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 512 Asp Ser Gly Gly Tyr Ile Asp Tyr Asp Cys Ser Gly Leu Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 513 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 513 Asp Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 514 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 514 Ala Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 515 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 515 Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Tyr Gly Glu Gln Trp Tyr Pro Ile Tyr 1 5 10 15 Glu Tyr Asp Ala 20 <210> 516 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 516 Asp Tyr Ala Ile Gly 1 5 <210> 517 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 517 Ala Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 518 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 518 Val Pro Ala Gly Arg Leu Arg Phe Gly Glu Gln Trp Tyr Pro Leu Tyr 1 5 10 15 Glu Tyr Asp Ala 20 <210> 519 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutated lama sequence <400> 519 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 520 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 520 Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 521 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 521 Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 522 <211> 6 <212> PRT <213> Lama glama <400> 522 Gly Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 523 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 523 Leu Asn Leu Met Gly 1 5 <210> 524 <211> 16 <212> PRT <213> Lama glama <400> 524 Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 525 <211> 8 <212> PRT <213> Lama glama <400> 525 Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5 <210> 526 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 526 Ile Asn Leu Leu Gly 1 5 <210> 527 <211> 16 <212> PRT <213> Lama glama <400> 527 Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 528 <211> 8 <212> PRT <213> Lama glama <400> 528 Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu 1 5 <210> 529 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 529 Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 530 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 530 Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 531 <211> 7 <212> PRT <213> Lama glama <400> 531 Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser 1 5 <210> 532 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 532 Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 533 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 533 Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 534 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 534 Gly Arg Gly Ser Pro 1 5 <210> 535 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 535 Ser Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 536 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 536 Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 537 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 537 Gly Arg Gly Ser Pro 1 5 <210> 538 <211> 5 <212> PRT <213> Lama glama <400> 538 Asn Tyr Trp Met Tyr 1 5 <210> 539 <211> 17 <212> PRT <213> Lama glama <400> 539 Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 540 <211> 13 <212> PRT <213> Lama glama <400> 540 Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr 1 5 10

Claims (42)

  1. 적어도 하나의 Ang2-결합성분과 적어도 하나의 Dll4-결합성분을 포함하는 이중특이성 결합분자.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 혈청 알부민 결합성분을 추가로 포함하는 이중특이성 결합분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및, 이하에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각을 갖는 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하는 Dll4 결합성분을 포함하는 이중특이성 결합분자:
    a. 서열번호: 1 내지 166 및 458,
    b. 서열번호: 333 내지 353, 또는
    c. 서열번호: 375 내지 395.
  4. 제3항에 있어서, Dll4-결합성분이 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인은 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및, 이하에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각으로 구성되는 이중특이성 결합분자:
    a. 서열번호: 1 내지 166 및 458,
    b. 서열번호: 333 내지 353, 또는
    c. 서열번호: 375 내지 395.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이
    a. 서열번호: 1 내지 166에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    b. 표 5에 기재된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 함유하고,
    c. 여기에서 서열번호 1 - 166에 대한 제1 그룹의 서열번호: x는 y = x + 166이라는 점에서 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하는, 이중특이성 결합분자.
  6. 제4항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이
    a. 서열번호: 333 내지 353에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    b. 표 16-A에 기재된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 함유하고,
    c. 여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 y = x + 21이라는 점에서 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하는, 이중특이성 결합분자.
  7. 제4항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이
    a. 서열번호: 375 내지 395에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    b. 표 16-B에 기재된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 396 내지 416에 나타낸 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 CDR2를 함유하고,
    c. 여기에서 제1 그룹의 서열번호: x는 y = x + 21이라는 점에서 제2 그룹의 서열번호: y와 상응하는, 이중특이성 결합분자.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH인 이중특이성 결합분자.
  9. 제8항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 167 내지 332 및 459에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 이중특이성 결합분자.
  10. 제8항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 354 내지 374에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 이중특이성 결합분자.
  11. 제8항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 396 내지 416에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 이중특이성 결합분자.
  12. 제5항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  13. 제9항에 정의된 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 VHH.
  14. 서열번호: 356 및 358에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 Dll4-결합 VHH.
  15. 제14항에서 정의된 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  16. 서열번호: 402, 407 및 416에 나타낸 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 Dll4-결합 VHH.
  17. 제16항에서 정의된 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  18. 제5항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  19. 제12항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  20. 제1항에 있어서, 서열번호: 417의 아미노산 잔기 252-282에 상응하는 EGF-2 도메인 내에 전체 또는 부분적으로 함유된 Dll4의 에피토프에 결합하는 이중특이성 결합분자.
  21. 제20항에 있어서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩티드인 이중특이성 결합분자.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및, 서열번호: 491, 494, 497, 500, 503, 506, 509, 512, 515, 또는 518에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각을 갖는 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하는 Ang2-결합성분을 포함하는 이중특이성 결합분자.
  23. 제22항에 있어서, Ang2-결합성분이 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인이 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및, 서열번호: 491, 494, 497, 500, 503, 506, 509, 512, 515, 또는 518에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각으로 구성되는 이중특이성 결합분자.
  24. 제23항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 다음을 함유하는 이중특이성 결합분자:
    a. 서열번호: 491, 494, 497, 500, 503, 506, 509, 512, 515, 또는 518 (표 36)에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    b. 표 22-A 또는 28에 기재된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 489, 492, 495, 498, 501, 504, 507, 510, 513, 또는 516 (표 36)에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    c. 표 22-A 또는 28에 기재된 바와 같이, 부분 서열로서 서열번호: 490, 493, 496, 499, 502, 505, 508, 511, 514, 또는 517 (표 36)에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 서열 내에 함유된 아미노산 서열을 갖는 CDR2.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH인 이중특이성 결합분자.
  26. 제25항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 또는 488에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 이중특이성 결합분자.
  27. 제24항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화도 성숙에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  28. 제26항에서 정의된 VHH의 친화도 성숙에 의해 얻어진 VHH.
  29. 서열번호: 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 또는 488에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 Ang2-결합 VHH.
  30. 제29항에서 정의된 VHH의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  31. 제24항에서 정의된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 인간화에 의해 얻어진 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  32. 제2항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈청 알부민 결합성분이 단리된 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 폴리펩티드이고, 여기에서 면역글로불린 단일 가변 도메인이 4개의 프레임워크 영역과 3개의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및, 서열번호: 522, 525, 528, 531, 534, 537, 또는 540에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열의 CDR3 각각으로 구성되는 결합분자.
  33. 제32항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 다음을 함유하는 결합분자:
    a. 서열번호: 522, 525, 528, 531, 534, 537, 또는 540에 나타낸 아미노산 서열의 제1 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    b. 서열번호: 520, 523, 526, 529, 532, 535, 또는 538에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1;
    c. 서열번호: 521, 524, 527, 530, 533, 536, 또는 539에 나타낸 아미노산 서열의 제2 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 VHH인 이중특이성 결합분자.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 VHH가 서열번호: 98 또는 519에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 이중특이성 결합분자.
  36. 제2항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열번호: 460 내지 478에 나타낸 아미노산 서열에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 이중특이성 결합분자.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항의 결합분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 이를 함유하는 벡터.
  38. 제37항의 핵산 분자를 함유하는 숙주세포.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항의 이중특이성 결합분자 적어도 하나를 활성성분으로서 함유하는 약학 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 신생혈관형성에 대한 Dll4-매개 및/또는 Ang2- 매개 효과와 연관된 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 암 및 암성 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 눈 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
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