TW201241177A - Method for measuring resistance or sensitivity to Docetaxel - Google Patents

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Dorre Grueneberg
Xi Huang
Sridaran Natesan
Paul August
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Aventis Pharma Inc
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Description

201241177 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 發明領域 這也明s涉及某旦些新賴、有效且在此之前是未知的方法， 二/ k侧量特㈣傳標記物較對照物的增加或減 >、’可預測或監測患者對於紫杉醇類細oid)化合物分子的反 f。本翻還提供了某些套組，這些套組通·量特定遺傳 標記物的賊或蛋白水平並與賴物或參雜記物比較，可 預測或監測患者對於紫杉醇類化合物分子的反應。 【先前技術】 〜 本發明之背景 多西紫杉醇(Docetaxel)是一種抗有絲分裂藥物，廣泛地 用於乳癌、肺癌和卵巢癌的治療，其次，還用於頭部、頸部、 月和如列腺的癌症治療(Hong，（9«〇?/〇幻；16 : 9，2002)。 多西紫杉醇通過與β-微管蛋白結合以及阻·止心和β-微管蛋 白雜二聚物的分解來抑制微管動力學過程，從而終止腫瘤的 生長(Ringel and Horwitz，/他"Qmcer /㈣ 83 : 288，1991)。 多西紫杉醇和一種相關紫杉烧(taxane)即太平洋紫杉醇 (paclitaxel)的抗腫瘤活性’起因於靶向有絲分裂紡錘體的微 管，阻止染色體的排列和分隔，阻止細胞週期性進化並激活 凋亡途徑(Wang ei fl/.，Cawcer 88 : 2619, 2000)。通過涉及 p53/p21wafl/Cipl、raeras和有絲分裂原激活的蛋白激酶 (MAPKs)的細胞信號事件’太平洋紫杉醇的促凋亡活性與 Bcl-2的磷酸化和失活被聯繫起來(Wang eia/.，Cawcer 88 : 201241177 2619，2000)。雖然多西紫杉醇是一種比太平洋紫杉醇更有 效的抗癌劑’但涉及其細胞毒性的途徑卻尚未很好地確定 (Katsumata，万r/Cimcer 89 ·· S9, 2003)。在某些細胞係中觀察 到了多西紫杉醇通過一種涉及Bcl-2填酸化和胱冬裂酶 -3(caspase-3)活化的機制所誘發的凋亡（Kolfsch〇ten打α/， Biochem Pharmacol 63 : 733, 2002)。在各種培養的細胞係内 調節紫杉烷誘發的細胞殺傷作用的其它蛋白包括HeLa細胞 内的 Aurora-A(Anand ei α/.，Cimcer Ce// 3 : 51，2003)、乳腺 癌細胞内的 HER-2(Tanabe β α/·, /«i J 0«〇>/ 22 : 875, 2003)、 膠質母細胞瘤細胞内的p21wafl/Cipl(Li β «/历0/ CTiem 277 : 11352，2002)以及卵巢癌細胞内的 JNK/MKKl (Lee ei α/·，CTzem 273 : 28253，1998)。 在本領域内存在著一種需要，即需要鑑別某些可誘發對 於多西紫杉醇的抗藥性的藥用蛋白，這種抗藥性使這些蛋白 在藥物開發過程中可用於鑑別那些可消除其活體内功能並 能提高細胞對於抗腫瘤藥物化療敏感性的藥劑（小分子、 siRNA等）。在本領域内還需要一種測定方法，用於在化療 前可靠地預測哪些患者在接受基於多西紫杉醇抗腫瘤藥物 的化療之後會有起色，而哪些患者則不會。申請人在本文中 描述了一種新穎的測定方法’該測定方法能預測對於多西紫 杉醇的抗藥性和/或敏感性，並為能消除癌症抗藥性的新療 法的發展提供了某些篩檢方法。 ’' 【發明内容】 本發明之概述 4 201241177 依照本發明提供了某些新穎和有效的方法’通過比較串 者和對照物體内特定遺傳標記物的活化和/或表達的水平了 監測和/或預測患者對紫杉醇類化合物分子的反應。 在一具體實施例中，本發明提供了一種預測或監測癌症 患者對紫杉醇類化合物分子的反應的方法，其包括以下步 驟： a) 從上述患者的癌症部位採取試驗樣本； b) 採取對照樣本； c) 測量一種或一種以上遺傳標記物的水平；以及 d) 在試驗樣本和對照樣本之間比較所測的上述一種 或一種以上遺傳標記物的水平； 其中’與對照樣本比較，在試驗樣本内所測的上述一種 或-種以上遺傳標記物水平的下降表賴紫轉類化合物 分子抗藥性的増強。 在本發明之這-方面所提供的特定遺傳標記物包括： BubRl .智人，類似於蛋白激酶(BUBR1)mRNA，完全 cds(互補DNA)(基因庫檢索號：af_〇79);
Mad2 .智人MAD2蛋白mRNA(基因庫檢索號·· AJ000186)；
MpSl ·智人TTK蛋白激酶(TTK)，mRNA(基因庫檢索 號：NM—003318);
Racl/CDC42 的 GEFT:智人 交換因子 ’轉錄變異體2 ’ _(基因錢索號： NM_133483)； 201241177
Bubl :智人BUB1(苯并咪嗤1同系物解除抑制芽殖)(酵 母)(BUB1)，mRNA(基因庫檢索號：NM_004336); hSepharase .智人額外纺鐘極樣1(釀酒酵母)(esj>l1)， mRNA(基因庫檢索號：NM_012291);
CamKIId :智人鈣/約調素依賴性蛋白激酶(CaM激酶贝 S(CAMK2D)，轉錄變異體3，mRNA(基因庫檢索號： NM_001221)； ' CDK6 :智人週期蛋白依賴性蛋白激酶6(CDK6)， mRNA(基因庫檢索號：NM_001259); GRB2 :智人生長因子受體結合蛋白2(GRB2),轉錄變 異體1，mRNA(基因庫檢索號：nm_002086); 在另-具體實施例巾，本發明涉及—種_或監測癌症 患者對紫杉_化合物分子的反應的方法，其包括以下步 a) 從上述患者的癌症部位採取試驗樣本； b) 採取對照樣本； c) 測量-種或-種以上遺傳標記物的水平；以及 d) 在試驗樣本和對照樣本之間比較所測的上述一種 或一種以上遺傳標記物的水平； 其中’與對照樣本比較’在試驗樣本晴測的上述一種 票記物水平的下降表明對紫杉醇類化合物 分子敏感性的增強。 在本發明的這一具體方面， 可選自以下一組遺傳標記物： 一種或一種以上遺傳標記物 6 201241177 P21(Wafl):智人週期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑 1Α(ρ21，Cipl)(CDKNlA)，轉錄變異體卜mRNA(基因庫檢 索號：NM_000389);
Pim-1 :智人pim-1致癌基因(PIM1)，mRNA(基因庫檢 索號：NM_002648); GBP-1 :智人鳥苷酸結合蛋白1，干擾素可誘導， 67kDa(GBPl)，mRNA(基因庫檢索號：NM_002053); RXRA :智人類視黃醇X受體，α (RXRA)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_002957); SPF45:智人RNA結合基序蛋白n(RBM17)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_032905);
Heel :智人著絲粒相關2(KNTC2)，mRNA(基因庫檢索 號：NM_006101);
Rafl :智人时致癌基因的mRNA(基因庫檢索號： X03484)；
Aurora A :智人 aurora•相關激酶 ，完全 cds(基因庫檢索號：AF008551); TACC3 :智人轉化、含酸性捲曲螺旋的蛋白 3(TACC3) ’ mRNA(基因庫檢索號：NM—006342);
RelB :智人v_rel網狀内皮組織增生病毒致癌基因同系 物B ’ B-細胞3(鳥類）的κ輕多肽基因增強子的核因子 (RELB) ’ mRNA(基因庫檢索號：ΝΜ_〇〇65〇9); PRKCD :智人蛋白激酶c，δ(ρκκα))，轉錄變異體卜 mRNA(基因庫檢索號：ΝΜ_〇〇6254); 201241177 BRAF35 :智人高遷移率族20B(HMG20B)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_006339); HSPA1L :智人熱休克 70kDa 蛋白 1A(HSPA1A)， mRNA(基因庫檢索號：NM_005345); STK11 :智人絲胺酸/蘇胺酸激酶ι1(黑斑息肉綜合 征)(STK11)，mRNA(基因庫檢索號：NM_000455); MKK3 :智人MAP激酶激酶3(MKK3)mRNA，完全 cds(基因庫檢索號：L36719)。 在一更進一步的具體實施例中，本發明涉及一種預測或 監測癌症患者對紫杉醇類化合物分子的反應的方法，其包括 以下步驟： a) 從上述患者的癌症部位採取試驗樣本； b) 須j量選自以下一組遺傳標記物的一種或一種以上遺 傳標記物的水平：
BubRl :智人，類似於蛋白激gi(BUBR1)mRNA，完全 cds(互補DNA)(基因庫檢索號：AF〇46〇79);
Mad2 :智人MAD2蛋白mRNA(基因庫檢索號： AJ000186)；
Mpsl :智人TTK蛋白激酶(TTK)，mRNA(基因庫檢索 號：NM_003318); ”
Racl/CDC42 的 GEFT :智人 RAC/CDC42 交換因子 (GEFT) ’轉錄變異體2，mRNA(基因庫檢索號： NM—133483); '
Bubl :智人BUB1(笨并咪唑i同系物解除抑制芽殖)(酵 8 201241177 母)(BUB1) ’ mRNA(基因庫檢索號：nm_〇〇4336); hSepharase :智人額外紡錘極樣ι(釀酒酵母)(espli)， mRNA(基因庫檢索號：NM_012291);
CamKIId :智人鈣/i弓調素依賴性蛋白激酶(CaM激酶)π 5(CAMK2D) ’轉錄變異體3，mRNA(基因庫檢索號： NM—001221); CDK6 :智人週期蛋白依賴性蛋白激酶6(cdK6)， mRNA(基因庫檢索號：NM_001259); GRB2 :智人生長因子受體結合蛋白2(GRB2)，轉錄變 異體1，mRNA(基因庫檢索號·· NM_002086); c) 測量選自以下一組遺傳標記物的一種或一種以上參照 遺傳標記物的水平： GAPDH :智人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_〇〇2〇46> ; RPS9 :智人 cdna 克隆 IMAGE:6647283，部份 cds(基 因庫檢索號：BC071941); d) 比較試驗樣本中所測的上述一種或一種以上遺傳標 記物的水平和上述一種或一種以上參照遺傳標記物的水平； 其中’與上述一種或一種以上參照遺傳標記物的水平比 較’在上述一種或—種以上遺傳標記物水平的下降表明對紫 杉醇類化合物分子抗藥性的增強。 本發明的另一個進一步的具體實施例涉及一種預測或 監測癌症患者對紫杉醇類化合物分子的反應的方法，其包括 以下步驟： 201241177 a) 從上述患者的癌症部位採取試驗樣本； b) 測量選自以下一組遺傳標記物的一種或一種以上遺 傳標記物的水平： P21(Wafl):智人週期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑 1Α(ρ2卜Cipl)(CDKNlA)，轉錄變異體卜mRNA(基因庫檢 索號：NM_000389);
Pim-1 :智人pim-1致癌基因(PIM1) ’ mRNA(基因庫檢 索號：NM_002648); GBP-1 .智人鳥皆酸結合蛋白1，干擾素可誘導， 67kDa(GBPl)，mRNA(基因庫檢索號：NM_002053); RXRA :智人類視黃醇X受體，q^rxra)，(基因 庫檢索號：NM_002957); SPF45 :智人RNA結合基序蛋白17(RBM17)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_032905);
Heel :智人著絲粒相關2(KNTC2)，mRNA(基因庫檢索 號：NM_006101);
Rafl :智人raf致癌基因的mRNA(基因庫檢索號： X03484)；
AuroraA :智人 aurora-相關激酶 ，完全 cds(基因庫檢索號：AF008551); TACC3 :智人轉化、含酸性捲曲螺旋的蛋白 3(TACC3) ’ mRNA(基因庫檢索號：nm 006342);
RelB :智人v-rel網狀内皮組織增生病毒致癌基因同系 物B，B-細胞3(鳥類）的κ輕多肽基因增強子的核因子 201241177 (RELB) ’ mRNA(基因庫檢索號：NM_〇〇6509); PRKCD :智人蛋白激酶c，s(PRKCD)，轉錄變異體1， mRNA(基因庫檢索號：NM_006254); BRAF35 :智人高遷移率族2〇B(HMG20B)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_〇〇6339); HSPA1L :智人熱休克 7〇kDa 蛋白 1A(HSPA1A)， mRNA(基因庫檢索號：nm_005345); STK11 :智人絲胺酸/蘇胺酸激酶u(黑斑息肉綜合 征)(STK11)，mRNA(基因庫檢索號：NM_〇〇〇455); MKK3 :智人MAP激酶激酶3(MKK3)mRNA，完全 cds(基因庫檢索號：L36719)。 c) 測量選自以下一組遺傳標記物的一種或一種以上參照 遺傳標記物的水平： GAI>DH :智人3-磷酸甘油搭脫氣酶<GApDj，mRNA@ 因庫檢索號：NM_002046); RPS9 ·智人 cDNA 克隆 image:6647283，部份 cds(基 因庫檢索號：BC071941); d) 比較試驗樣本中所測的上述一種或一種以上遺傳標 記物的水平和上述-種或-種以上參照遺傳標記物的水平； 其中’與上述-種或-種以上參照遺傳標記物的水平比 較上述種或-種以上送傳標記物水平的下降表明對紫杉 醇類化合物分子易感性的增強。 本發明涉及預測或監測癌症患者對紫杉醇類化合物分 子的反應的各種方法。因此’本㈣的—個進—步具體實施 201241177 例包括紫杉醇類化合物分子太平洋紫杉醇、多西紫杉醇 XRP9881 和 XRP6258 〇 通過採用下文中詳述的各種技術來測量RNA、DNA < 蛋白的水平，可評估本發明所述的各種遺傳標記物。本發明 的另一些具體實施例則涉及預測或監測患者對紫杉醇類化 合物分子的反應的各種套組。 通過以下結合附圖所作的詳細說明，對本發明的上述方 面和其它方面、特點和優點將能更好地理解。 本發明之詳細說明 本發明以申請者對基因標記物的鑒定為充分依據，該基 因才示s己物可預測受试者對紫杉醇(tax〇id)類藥物是否具有抗 性或敏感性。採用以細胞為基礎的干擾(RNAi)篩檢， 申s青者觀察到對多西紫杉醇(d〇cetaxel)的抗藥性或敏感性與 特定基因標記物相關。 〜 本專利說明及專利權要求中使用了許多術語及短語。這 些術語及短語之定義如下： 在本文中，「預後」這個術語，是指關於因癌症而引起 的死亡或疾病進程的預測或可能性，其中包括抗藥性以及復 發、轉移擴展和贅生性疾病。 在本文中’「預測」這個術語，是指病患對一種藥物或 組藥物反應良好或不良的可能性以及這些反應的程度，例 如，病患於手術摘除原發性腫瘤後及/或化療一段時間後是 否能存活而無赫復發。本翻所預見的顏方法可在臨床 12 201241177 是紫杉醇類患合適的治療方法，尤其 種預測方法對預測病巧_=1療決心本發明的各 療。*種物或«物組合的化療及/或放射治 a H文$ ’軸」軸術語是指所有紐及紐的贅 l 1和增殖，並指所有的前癌性細胞和癌性細胞與组 、纖0 /、、 在本文「癌」和「癌性」S指哺乳動物的某種生理 病狀，其典雜徵為無節制細胞生長。癌症賴子包括但不 限於以下各種癌症.乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、肝 細胞癌、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、 尿道癌、癌、黑素瘤、腦癌（包括成膠質細胞瘤和成神經管 細胞瘤）、膽道癌、絨膜癌、食道癌、胃癌、血液腫瘤（包括 急性淋巴細胞性和髓性白血病）、多發性骨髓瘤、愛滋病相 關白血病和成人τ-細胞白血病/淋巴瘤、上皮内瘤樣病變（包 括鮑溫病和帕哲氏病）、淋巴瘤（包括何傑金氏病和淋巴細胞 性淋巴瘤）、成神經細胞瘤、口腔癌（包括鱗狀細胞癌）、肉瘤 (包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨 肉瘤）、皮膚癌(包括黑素瘤、卡波西肉瘤、基底細胞性癌和 鱗狀細胞癌）、睾丸癌[包括胚組織瘤如精原細胞瘤、非精原 細胞瘤(畸胎瘤、絨膜癌）、間質瘤以及生殖細胞腫瘤]、曱狀 腺癌（包括曱狀腺腺癌和髓樣癌）、腎癌（包括腺癌和維爾姆斯 13 201241177 瘤）。 在本文中’「病患」這個術語主要是指人，但也可包括 非人類靈長類動物、牛、馬、猪、綿羊、山羊、狗、描和喃 齒類動物β試者最好是人，其疑似患有癌症，或已確診患 有癌症，或屬於患癌高危人群，例如有家族癌症史。在本發 明-個首_實施射，癌為乳腺癌。#定疑似患有癌症的 受試，的方法包括手檢、活組織切片檢查、受試者家族病 史、受試者財或若干雜技術，包魏房χ賴相、磁共 振成像、料減譜或正t子魏_掃描。癌症的診斷^ 法和癌症診斷的臨床特性為醫療領域專業人士所熟知。 一在本文中，「樣本」這個m吾是指採用相關醫療領域内 -般專業人士熟知的方法所取得的組織。活組織切片檢查等 各種方法包括贿剖刀分敝織塊、·解剖、靖射為基 礎的顯微解剖或本領_熟知的其他細胞分離方法。由於病 變組織活檢材料t細胞細的可魏和轉方法靈敏 度的可變性，分析所需樣本的細胞數量可從丨、1〇、5〇、1〇〇、 200、300、500、1000、5_、1〇，㈣至 5〇，_ 或更多不等。 合適的樣本大小取決於細驗成和活錄況，確定細胞租成 和活檢狀況時的標準製備步驟及其後在本發明中所採用的 核酸分離方法為本領域内—般專業人士所熟知。例如，取自 活檢的樣本可能足以評價KNA表達轉鎌增。反之，若 小型活檢區域巾細胞數量未達合適的數量，顺要採用抓八 轉換方法和/讀增方法’或_其他提高鎌分子解析度 的方法。上述允許採财隨檢材料的方法為本領域内一般 201241177 在本文中，「測試」這個術語，在與樣本連㈣情況 是指採自纽錢區域·本，或採自顯示 變特徵的身體區域的樣本。 支次在 在本文中，「對照」這_語，在與樣本連用的情況下， 是指用於比較目的的樣本。最理想的情況是，所謂這些樣本 具有「對照」侧，是減樣本未顯示或據絲患有任何影 響基因表達的疾病或魅，在以這些樣本作為參照標準的疾 病方面尤其如此。也可以這樣認為：疾病和病症的不同階段 可以加以比較’在此情況下，「對照」樣本相當於該疾病或 病症的較早·。例如’對雜本可以是採自身體上非癌變 但可比較部位的樣本。此外，對照樣本可採自同一個受試者 的可比較部位，或與該第—個受試者實質上相似的第二個受 試者(物種、年齡、體重、性別等相同或相似)的非癌變部位。 最後，對照樣本柯採㈣紫杉醇類分子治療產生良好反應 的第二個受試者的癌變部位。 「核酸分子」是指核苷(腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿 ，啶核苷或胞嘧啶核苷，簡稱「RNA分子」）或脫氧核苷(腺 嘌呤脫氧核苷、烏嘌呤脫氧核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷或胞嘧 啶脫氧核苷’簡稱「DNA分子」）的磷酸酯聚合體形式或其 鱗酸酯類似物(比如硫代填酸酯和硫酯），可為單鏈形式或雙 鏈螺旋形式。也可能是雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和 15 201241177 RNA-RNA螺旋。核酸分子(特別是DNA或RNA分子)這個 術語僅指該分子的一級和二級結構，並不限於任何特定的二 級結構。因此該術語包括雙鏈DNA分子，其形式可為直鏈 或環形DNA分子(如限制片段）、質粒和染色體。在討論特 定雙鏈DNA分子的結構時，可根據僅給出順5，端至3，端的 方向沿著非轉錄DNA鏈(即含有與mR^A同源序列的鏈)的 序列的慣例來描述序列。「重組DNA分子」是指已經過分子 生物加工的DNA分子。 在本文中，為特定蛋白質編碼的、單個核酸分子的「部 份」這個術語，是指由足賊量魏或多肽編碼的相鄰核苦 酸所組成的單個核酸分子的部份或片段。自然:，單個核酸分 子的-個「部份」不止—個㈣酸，而由這個部份編碼的肽 或多肽含有許多胺基酸殘基，如下文肽和多肽的定義所述。 在本文中’「肽」這個術語’是指由肽鍵共價連接的兩 個或兩個以上胺基酸。在—特定實施例中—個肽包含至少 1〇個f基酸，較佳的是至少如個、更佳的是3〇個、更為 佳的是40個、最佳的是50個或更多。
該蛋白與身難本巾賴標記物的水平相 士亡Ϊ文中’夕肽」這個術語，是指由多個相鄰胺基酸 ，，聚合物’特別是多肽的分子量可高於H)〇kD。 文中，遺傳標記物」這個術語，县指一生理組合 ' DNA或蛋白質水平來預 :性或敏感性。此外，遺傳 也可用作蛋白質的「替代」標記 201241177 該相關性可以是正_係，即蛋白_性水平的下降對應於 遺傳標記物水平的下降。或者，該侧性也可以是反比關 係’即蛋㈣滩水平的下_狀遺龍記物水平的上 升這種生理，、且σ物包括(但當然不限於)細胞(例如其前體幹 細胞)蛋白質、錄、DNA、職、碳水化合物或脂肪酸， 在此僅舉數例。在本發_—個特定實_巾，根據已測定 的基因標記物水平，可制受財對紫满㈣物是否有抗 性或敏感性。此類遺傳標記物的例子包括但不限於下列各 項：
BubRl :智人，類似於蛋白激酶(BUBR1)mRNA，完全 cds(互補DNA)(基因庫檢索號：AF〇46〇79);
Mad2 :智人MAD2蛋白mRNA(基因庫檢索號： AJ000186)；
Mpsl :智人TTK蛋白激酶(TTK)，mRNA(基因庫檢索 號：NM_003318);
Racl/CDC42 的 GEFT:智人 RAC/CDC42 交換因子 (GEFT)，轉錄變異體2，mRNA(基因庫檢索號： NM_133483)；
Bubl .智人BUB1(苯并咪嗤1同系物解除抑制芽殖)(酵 母)(BUB1)，mRNA(基因庫檢索號：NM_0〇4336); hSepharase :智人額外紡錘極樣丨(釀酒酵母)(ESpu)， mRNA(基因庫檢索號：NM_012291);
CamKIId .智人妈/辦調素依賴性蛋白激酶(CaM激酶）II 5(CAMK2D) ’轉錄變異體3，mRNA(基因庫檢索號： «；： 17 201241177 NM_001221)； CDK6.智人周期蛋白依賴性蛋白激酶6(cdk6)，mRNA (基因庫檢索號：NM_001259); GRB2 :智人生長因子受體結合蛋白2(GRB2)，轉錄變 異體1 ’ mRNA(基因庫檢索號：nm_002086丨； P21(Wafl).智人周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑 1Α(ρ2卜Cipl)(CDKNlA)，轉錄變異體卜mRNA(基因庫檢 索號：NM_000389);
Pim-1 :智人pim-1致癌基因(piMl)，mRNA(基因庫檢 索號：NM_002648); GBP-1 :智人鳥苷酸結合蛋白1，干擾素可誘導， 67kDa(GBPl) ’ mRNA(基因庫檢索號：NM_002053); RXRA :智人類視黃醇X受體，o^rxra)，mRNA(基因 庫檢索號：NM_002957); SPF45:智人RNA結合基序蛋白l7(RBM17)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_032905”
Heel :智人著絲粒相關2(KNTC2)，mRNA(基因庫檢索 號：NM_006101);
Rafl :智人raf致癌基因的mRNA(基因庫檢索號： X03484)；
Aurora A :智人 aurora-相關激酶 l(ARKl)mRNA，完全 cds(基因庫檢索號：AF008551); TACC3 :智人轉化、含酸性捲曲螺旋的蛋白 3(TACC3)，mRNA(基因庫檢索號：NM—006342); 201241177
RelB :智人v-rei網狀内皮組織增生病毒致癌基因同系 物B，B-細胞3(鳥類）的κ輕多肽基因增強子的核因子 (RELB) ’ mRNA(基因庫檢索號：NM_006509); PRKCD :智人蛋白激酶c，S(PRKCD)，轉錄變異體卜 mRNA(基因庫檢索號：NM_006254); BRAF35 :智人高遷移率族20B(HMG20B)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_〇〇6339); HSPA1L :智人熱休克 7〇kDa 蛋白 1A(HSPA1A)， mRNA(基因庫檢索號：NM_005345); STK11 :智人絲胺酸/蘇胺酸激酶n(黑斑息肉綜合 征)(STK11) ’ mRNA(基因庫檢索號：NM_000455); MKK3 :智人map激酶激酶3(MKK3) mRNA，完全 cds(基因庫檢索號：L36719)。 在本文中，「參照遺傳標記物」這個術語，是指所測定 的RNA、DNA或蛋白質水平在服用紫杉醇類藥’物之前、期 間或之後保持不變的生理組合物。「參照遺傳標記物」被稱 為看家基因。這些基因的選擇以其在諸如癌症之類的被檢驗 系統中相對不變的表達水平為基礎。看家基因用於使表達的 結果正常化。此類遺傳標記物的例子包括但當然不限於以下 兩項· GAPDH :智人3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)，mRNA(基 因庫檢索號：NM_002046);
RpS9:智人cDNA克隆 IMAGE:6647283,部份 cds(基 因庫檢索號：BC071941)。 19 201241177 在本文中，「紫杉醇類分子」這個術語，是指屬於紫杉 烷(taxane)族的一類化療化合物。紫杉醇類的具體成員包 括但不限於太平洋紫杉醇(紫杉醇）、多西紫杉醇(剋癌易) 及其類似物（即XRP9881和XRP6258 ;參見Ojima和 Gemey，4:737，2004)。由於此 類分子為β-微管蛋白結合物，可穩定類似於多西紫杉醇 的聚合形式的微管’因此可以預期，此處所描述的生物 標記物的臨床表達將反映對這些藥物的類似反應狀況。 在本文中，「分子」、「化合物」或「藥劑」等術語，是 才曰現在已知或以後發現的任何組合物。本專利中應用的化合 物或藥劑的例子包括有機化合物(例如人造的、天然的和光 活性化合物）、肽(例如人造的、天然的和光活性化合物，即 D型或L型胺基酸）、碳水化合物、核酸分子等。 在本文中，「雜交嚴格度」或「嚴格條件下的雜交」，是 指本領域内一般專業人士能夠輕易判定的條件，通常是一種 取決於探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的經驗性計算。通常， 較長的探針需要較高的溫度，以便進行適當的退火，而較短 的探針需要較低的溫度。雜交通常取決於當互補鏈處於低於 其熔化溫度的環境時變性DNA的重退火能力。探針與可雜 ^序列之間所要達到的同系性越高，所能採用的相對溫度越 南。於是，較高的相對溫度往往使反應條件更嚴格，而在較 低的溫度下’則嚴格度較低。關於雜交反應嚴格度的進一步 、田節和解釋，可參閱 Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，wney interscience Publishers，（1995)。 201241177 在本文中，嚴格條件」或「尚度嚴格條件」是指下列 參數.（1)洗務時採用低離子強度和高溫，例如5〇。c下的 0.015 Μ氣化鋼/0.0015 Μ摔樣酸納/0.1%十二烧基硫酸 納；（2)雜交時採用曱酸胺等變性劑，例如42。c下5〇%(ν/ν) 曱醯胺加0.1%牛血清白蛋白/〇.l〇/〇Fic〇U液/01〇/〇聚乙稀 吡咯烷酮/pH 6.5的50 mM磷酸鈉緩衝液以及75〇 ^氯 化鈉、75 mM檸檬酸鈉；或(3)在一溶液中的過夜雜交，該 溶液在42。C下含50%甲醯胺，5x SSC(0.75 Μ氣化鈉，0.075 Μ檸檬酸納）、50 mM磷酸鈉(ρΗ 6.8)、〇 1%焦磷酸鈉、5χ Denhardt’s溶液、經聲波處理的鮭魚精子 DNA(50 .mu.g/ml)、0.i%十二烷酸磺酸鈉和1〇%硫酸葡聚 糖’然後在0.2x SSC(氣化納/擰檬酸鈉）中於42。〇洗滌1〇分 鐘，再以含有EDTA的〇·1χ SSC於55。C進行高嚴格度洗 滌。適度嚴格條件可按Sambrook等在【分子克隆：實驗室 手冊】（Molecular Cloning: A Laboratory Manual，New York:
Cold Spring Harbor Press，1989)中的描述加以鑒定，該適度嚴 格條件包括採用嚴格度低於以上描述的洗滌溶液和雜交條 件(如溫度、離子強度和十二烷酸續酸鈉百分率）。適度嚴格 條件的一個例子為37°C下在一溶液中進行過夜雜交，該溶 液含20%甲酿胺、5x SSC(15〇慮氯化納、15 _檸檬酸 三鈉）、50 mM 磷酸鈉(pH 7.6)、5x Denhardfs 溶液、10%硫 酸葡聚糖、和20mg/ml變性的片段化鮭魚精子DNA，然後 於37-50〇C在lx SSC中洗滌濾膜。專業人士將會根據探針 長度等因素調節溫度、離子強度等。雜交核酸時的適當嚴格 21 201241177 度取決於核酸分子長度和互補程度，以及其他本領域内眾所 周知的變數。兩個核苷酸序列之間的相似性或同系性越大， 則含有這些序列的雜種核酸的Tm越大。核酸雜交的相對穩 定性（對應於較高的Tm)以下列順序遞減：、 DNA:RNA、DNA:DNA。較理想的情況是，可雜交核酸的最 低長度至少約為12個核苷酸，較佳的是至少約為16個、更 佳的是至少約為24個、最佳的是至少約為36個。 在本文中，「標記」或「可檢測標記」是指一種可檢測 標記化合物或組合物，它直接或間接與一種抗體、寡肽或其 他有機分子配對，而生成「標記的」抗體、寡肽或其他有機 刀子。5亥己本身可被檢測到(如放射性同位素標記或螢光 標記），或者，如果該標記為酶標記，則可催化可檢測的底 物化合物或組合物的化學變異。 在本文中，「直接標記」是指在其自然狀態下輕易可見 的物體，可為肉眼所見，或在藉助濾光器和/或輔加刺激(如 以紫外光激發螢光)的情況下可見。其例子包括但不限於加 色標記、金屬溶膠顆粒、染粒溶膠顆粒、染色乳膠或染料外 包脂質體(見第4,313,734號美國專利、第4,373,932號美國 專利、WO 88/08534、EP-A0 280 559、0 281 327、第 4,703,017 號美國專利所描述）。其他的直接標記包括放射性核苷酸、 不透射線物、螢光成份或發光成份。 在本文中，「間接標記」是指可依照本發明加以使用的 酶。與免疫測定相關的各種類型的酶為本領域内所熟知，例 如，鹼性磷酸酶和辣根過氧化物酶、溶菌酶、6_填酸葡萄糖 22 201241177 脫虱S#、乳酸脫氫酶和尿素酶’ EvaEngvall在【酶免疫測定 -ELISA 與 EMIT(Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT)】 一文（Methods in Enzymology，70:419-439(1980))和第 4,857,453號美國專利中詳細地討論了這些酶以及其他一些 酶。 在本文中，「套組」這個術語是指由一個或多個容器以 及與谷器相關的標鐵或說明書組成的·一種產品。在一首選的 實施例中’此類容器可包含可檢測標記抗體、可檢測標記抗 體片段、或可檢測標記寡核苷酸《在另一實施例中，此類容 器提供各種手段，以便從身體樣本獲得總RNA，反轉錄總 RNA以獲得CDNA ’以及使用一套引子使cDNA經歷聚合 §#鏈反應’這套引子中的一個或兩個均具有可檢測標記。套 組可包括其他容器’這些容器包含諸如稀釋液和緩沖劑、對 照抗體、寡肽、或小型有機分子。該標籤或說明書可提供組 份描述，以及關於貯藏和預期體外用途或診斷用途的說明。 再則’按照本發明，可運用本領域的常規分子生物學、 微生物學和重組DNA技術。這些技術在文獻中得到充分解 釋。參見：Sambrook ’ Fritsch&Maniatis的【分子克隆：實 驗室手冊】（Mo丨ecidar Cloning: A Labomtory Manual)，第二 版(1989) ’ Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(本文簡稱「Sambrook et al.，1989」）；【DNA 先fk ’· f 殘方法】（DNA Cloning: A Practiced Approach， Volumes I和II(D.N. Glover編，1985));【寡核苷酸合成】 Ά办《认e也)(M.J. Gait編，1984);【核酸雜交】 23 201241177 (M/c/ez’c ddc? ZfyhnVfc如’⑽)[B.D. Hames 和 S.J. Higgins 編 (1985)];【轉錄和翻譯】（Thm^cn沖·〇« 7>γ^/ί^·οη)[Β·0.
Hames和SJ· Higgins編(1984)];【動物細胞培養】（XmVnfl/ Ce// CWiwre)[R.I_ Freshney 編(1986)];【固定化細胞和酶】 {Immobilized Cells And Enzymes)[lKL Press j (1986)]； B. Perbal【分子克隆實用指南】¢4 /Vac^oj/ Gw/i/e 7b Molecular Cloning)(l9S4) ； F.M. Ausubel 等編【最新分子生 物學實驗方法彙_ 編 1 (Current Protocols: in Molecular Biology) > John Wiley & Sons » Inc.(1994) ° 通常，RNAi技術使用合成的或載體生成的雙鏈rna以 誘導含有同系序列的mRNA的降解(McManus和Sharp，Μζί ge«祝3:737，2002)。RNAi篩選已被用來闡明許多生物 體中的基因功能’例如線蟲(Caenorhabditis elegans)(Simmer
以 fl/.，/7必所1:E12, 2003)，果繩(Lum ei α/.，Sc/ewce 299:2039，2003)和哺乳動物細胞(Aza-Blanc β a/.,施/ CeM 12:627, 2003) 〇 在本發明中，針對大多數爲激酶族成員的1〇1種與癌相 關的基因，將HCT116結腸癌細胞用於篩選siRNAs，並以 面解析度的劑n文應曲錢量化多西紫杉醇的殺傷作用。採 用此方法，申請者已經顯示9個基因（包括BubIU、Bubl， Mad2、Mpsl和GEFTRac/CDC)的低水平表達可抑制多西紫 杉醇的殺傷作用，而降低15個其他基因（包括咖、邱、 TACC3和A_a_A)喊射加強乡西紫轉所料的細胞 死亡。 24 201241177 因此，廣而言之，本發明擴展至某些診斷方法和套組， 可將這些診斷方法和套組用於鑒定正在服用多西紫杉醇或 考慮服用該藥物的個體對該藥物是否會有抗性或敏感性。 申請者已經觀察到對多西紫杉醇的抗藥性，抗藥性與喪 失一組廣泛的檢查點控制基因相關，這些基因包括、 BuM、Mad2、Mspl 和 GEFTRac/CD。 對多西紫杉醇的敏感性增加與若干基因之一的喪失有 關，這些基因包括GBP-卜STK1卜RXRA、Heel、SPF45、 Hafl、RELB、MKK3、PRKCD、HSPA1A、BRAF35、 Aurora-A、Pim-1、TACC3 和 p21wafl/Cipl，抑制這些基因 的抑制劑可在多西紫杉醇療法中用作有價值的輔助藥。 有絲分裂的檢查點基因可透過抑制Cdc20-APC(細胞分 裂後期促進複合體)作為延遲細胞分裂後期的可靠機制，直 至姐妹染色單體的著絲粒適當地附著於有絲分裂紡錘體 上，並在赤道板上排列(Zhou β α/.，Ce//細115:3547， 2002) ’從而使細胞可靠地退出有絲分裂，並以精確的DNA 互補進入另外的細胞周期。如有微管抑制劑存在，退出有絲 分裂的細胞不再能妥善地分隔其染色體，通常立即凋亡或在 若干細胞周期後凋亡(Taylor和McKeon，Cd/ 89:727， 1997)。微管抑制劑與有絲分裂檢查點基因(如BubR1)喪失這 兩種因素的結合可使細胞避免有絲分裂阻滯，而不經歷細胞 祠亡，從而導致染色體不穩定性(ON)和非整倍性(Shin扣fl/， Ciwzcer Ce// 4:483, 2003)。近來’在將微管抑制劑太平洋紫杉 醇用於處理其BubRl和Mad2下調的MCF-7細胞時，產生 25 201241177 了抗藥性資料(Sudo 以此 64:2502, 2004)。
Pim-1基因編碼一種屬於相關激酶小家族的絲胺酸/蘇 胺酸激酶。Pim-1的功能一直與增殖、分化、細胞凋亡，腫 瘤發生、組織缺氧，血管生成和有絲分裂聯繫在一起(Wang占 此所历如咖也如1593:45, 2002)。顯微成像資料以及 AKT次磷酸化資料和升高的胱冬裂酶_3(Caspase-3)活性測 量值顯示’透過滅活為細胞生存起介導作用的AKT信號， Pim-1的向下調節增強了多西紫杉醇誘導的細胞凋亡。pim_】 和p21在使HCT116細胞對多西紫杉醇敏化中具備極為相似 的特點；與顯示p21為Pim-1的磷酸化底物這一報告一致 (Wang et a丨.，Biochim Biophys Acta 1593.A5, 2QQ2)。在不存在 多西紫杉醇的情況下，Pim-1的向下調節誘導了一定程度的 細胞凋亡，但當該藥物存在時效力則更高；然而在多西紫杉 醇不存在時向下調節轉化酸性捲曲螺旋蛋白質TACC3並不 誘導細胞死亡，表明僅RNAi技術本身對細胞增殖沒有影 響。上述結果表明不同蛋白質的損耗可引起細胞對多西紫杉 醇敏化的不同機制。 ' 因此，在本發明的一個方面，可根據表j和表π中所述 的-個或鋒基因的活化以及這絲_蛋自質水平來選 擇治療策略，並監測所選治療策略的有效性。 、 在-特定的實施财，我們提供了—種方法，監測化療 過程中表I和表II中所示的一個或多個基因的活化水平，以 評價和預測化療對病患的有雜。對採自_(如乳腺瘤、 結腸瘤、非小細胞肺瘤和胃瘤）的活檢材料、或採自未確診 26 201241177 癌症病患或正接受治療的病患的腫瘤活檢材料的短期培養 物進行處理，以便分離出DNA(Hafnerea/.，々c^
Med 127:1221, 2003 ； Rodriguez et al., Clin Cell Res 10:5785, 2004)、信使 RNA(Chang 以 a/·，Lancet. 362:340, 2003)和/或蛋 白質(Espina ei fl/.，《//mmimc?/施290:121，2004)，以評價 表I和表II中所描述的基因或其亞群的活化水平或蛋白質水 平。基因轉錄和蛋白質表達圖譜可用於診斷和預測可能的治 療策略的療效，並可作為監測病患治療反應的有用工具。 按照本發明，可用本領域常用的任何現有方法從腫瘤樣 本中分離RNA(Ullmann β «/历⑽〇/公阳從9:95, 2〇〇4 ;
Badiee et a!” BMC Biotechno!3a3, 2QQ3)。從受試者身上獲取 一個或多個細胞，並從細胞中分離出尺^八。例如，可從受 試者身上獲得外周血白細胞(PBL)，亦可能獲得一細胞樣本 後，針對需要的細胞類型使該樣本強化。可採用各種技術將 細胞從細胞混合體中分離出來，例如，採用與所·胞類型 ，特疋抗原決定基結合的抗體來分離細胞。如果所需的細胞 疋在固體喊巾，則可使㈣微蝴或卿觀顯微切割 (LCM)之類的方法分割特定細胞(B〇nner扣虬， 278.1481, 1997，Fended，Jw/外认 154:61，1999)。可用 各種方法從域或細雜树提取，例如魏酸胍溶 解繼以氣化铯離心(Chirgwin et al，施“_ 18:5294, 1979)。可從單個細胞獲取⑽八，如從單個細胞製備
cDNA 文庫的方法所述(Dulac，Cmr Top Dev BiGl. 36:245, 1998)。 Rna樣本可針對特定種類進—步加以強化。例如，在一實 27 201241177 施例中，可從RNA樣本中分離出p〇ly(A)+RNA。特別是， P〇ly-T寡核苷酸可作為mRNA的親合配體被固定於固體載 體上。用於該目的的套組已有市售，如MessageMaker套組 (Life Technologies，Grand Island，N.Y·)。該強化過程可透過 引子特異性cDNA合成、或以cDNA合成為基礎進行多輪線 性擴增以及模板指導的體外轉錄等方法實現(Wang ei α/.， Pwc 他"Sa· USA 86:9717, 1989 ; Dulac et al.，同上）。 有多種擴增方法適用於本發明之方法，包括聚合酶鏈反 應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)(Wu和Wallace，⑽如 4:560 ’ 1989)、自主序列複製(SSR)(Guatelli 扣 α/.，iV% 87:1874, 1990)、基於核酸的序列擴增(NASBA) 和轉錄擴增(Kwoh ei a/., Proc #故/ doze? Sd C/似 86:1173, 1989) °PCR技術專用方法為本領域内所熟知[例如參見 【PCR技術.DNA擴增的原理和應用】（PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification)(H. A. Erlich 編 ’ Freeman Press，N.Y·，N.Y·，1992);【PCR 規程： 方法和應用指南】(A Guide to Methods and Applications)(Innis， e广 a/·編，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)]。 可採用本領域技術人士瞭解的方法標記RNA以進行檢 測。例如，採用由Affymetrix公司等生產的蛋白質微陣列。 採用任何常用方法進行雜交以標記和檢測RNA，例如直接 RNA染料標記’如用Cyanine-3(青藍3)或Cyanine-5(青藍 5)(Perkin Elmer MPS544001KT)。其他方法包括透過核苷酸 的反轉錄而實現的直接cDNA標記，而該核苷酸則用青藍3 28 201241177 或青藍 5(Badiee A 2003)、螢光素、Alexa 染料(Molecular Probes)或其他螢光團加以標記。再則，還可利用間接的 cDNA標記，如FairPlayTM/胺基烯丙基標記(stratagene目錄 说.252002)、3DNA樹枝狀南分子標記(Genispherelnc)或酶 信號擴增標記(MICROMAXTSA，Perkin Elmer)。另外，可 藉RNA探針量化RNA ’這些探針可藉酶、螢光、放射性或 發光等方法檢測。 在本發明的一個方面’ RNA取自腫瘤樣本，並運用 Taqman技術檢測遺傳標記物。生成引子以檢測表I和表π 中標明的特定RNA或其亞群’並用反轉錄酶來擴增引子。 籍由反轉錄擴增的特定片段的檢測可透過以下方式完成：凝 膠電泳、聚合物電泳、直接DNA定序、光檢測、螢光信號 的喪失、酶反應或經由對互補RNA的雜交進行檢測。 在本發明的另一方面，利用實時PCR來檢測寡核苷酸。 將取自腫瘤樣本的mRNA反向翻譯為cdna。生成引子以 藉聚合酶鍵反應技術來擴增表I和表II中標明的特定处认 或其亞群。可透過凝膠電泳和溴化乙咬或CYBR綠染色，或 透過測量聚合酶所釋放的螢光團標記序列特定探針發出的 螢光強度來完成mRNA水平的檢測。 在本發明的又-個方面，採用了北方印跡法(N〇rthem blotting)。RNA取自腫瘤樣本，後以凝膠電泳加以分離，並 轉移至-膜上。透過制P32等放射朗位素標記探針的雜 父’或透過基於扭的顯色法或發光法，來確定豐产。 在本發明的另一方面，基因劑量可作為轉錄水平代
S 29 201241177 指標。表I和表II中的轉錄物或其亞群的基因劑量可以定量 地確定’從而評價腫瘤對多西紫杉醇療法是否有反應 (Rodriguez 扣 a/” C7z>2 Res 10:5785, 2004)。由於此評 價在新辅助治療(手術前的治療)之前進行，所以，如果病患 屬於有反應之列，則可用多西紫杉醇治療，如果屬於無反應 之列，則可施用另一種化療藥劑。 從病患腫瘤活檢材料中提取DNA，並以本領域專業人 士所用方法對其純化以去除雜質。用來確定腫瘤DNA中的 基因劑量的方法包括但不限於定量PCR、基因組DNA晶 片、原位雜交或南方印跡法(southem)(Hafner扣乂， Pathol Lab Med 127:1221, 2003 ； Rodriguez aL, Clin Cancer Aes 10:5785, 2004)。因此，這些方法可用於確定表工 和表II中一個基因或多個基因的副本數，並將其與對照樣本 或參照標記物相比較。 在本發明的又一個方面，蛋白質水平可用作轉錄水平的 替代測量標準。蛋自質水平6顯示與轉錄水平的抑制或提高 相關，而’本發明包括絲測量蛋白f水平的技術，該^ 2水平與由表1和表11中轉錄物編碼的多肽產品相關。蛋 質作為對多西紫㈣的酬反應的標記物加以檢測和使 。蛋白質檢測方法為本領域所熟知。 用抗體檢聰蛋自表_方法。 紋叙疋運 在-特定實施财’免疫測定_來檢測表〖和表 或多個基因的蛋白質產品。另外’對抗表I和表H 】任何-種蛋自質的抗體可麟若干其讀測方法。這些 201241177 檢測方法包括但不限於下列各項：西方印跡法(Westem blot) USA測定和夾心ELISA。另外’亦考慮採用其他不 使用抗體_定法，包㈣些使用DNA寡核賊類或多肽 類化合物的方法，從而識別由表Ϊ和表II所列轉錄物(如適 合體)編碼的蛋自質。亦可採用生物樣本的質譜分析方法， 透過確定蛋自水解分裂後肽>1段的精確分子量，來確定多肽 的組份。 本發明進一步包含合適的標記，其中包括酶、螢光團， 如異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白㈣、德克薩斯紅(Texas red ’ TR)、羅丹明、自由或螯合的鑭系鹽、發色團、放射性 同位素、螯合劑、染料、膠體金、乳膠顆粒、配體(如生物 素)和化學發光劑。 在本發明的一個方面，所用放射性標記可為同位素，如 3H、14C、32P、35S、36 C1、51 Cr、57C〇、58C〇、59Fe、 90Y、1251、1311、和186Re等。可透過目前已知和已有的 计算規程進行放射活性水平的量化。反之，亦可採用不透射 線的物質。在以輕為標記的實施例中，可採用目前利用的比 色法、分光光度法、螢光分光光度法、電流測量法或本領域 熟知的氣體定量分析法等任何一種技術。 本發明的又一個方面是採用肽結合劑，例如抗體或抗體 片段。抗體包括按照常規方法製備的多克隆抗體和單克隆抗 體。僅抗體分子的一小部份，即抗體補位元，參與該抗體與 其抗原決定基的結合(一般内容參見，Clark，W. R.(l986)【現 代免疫學的試驗基礎】（The Experimental Foundations of 201241177
Modem Immunology) ’ Wiley & Sons，Inc.，New York ; Roitt， 1.(1991)【基礎免疫學】第 7 版(Essential Immunology，7th Ed.)，Blackwell Scientific Publications，Oxford)。例如 ’ pFc’ 和Fc區域為補體級聯的效應因子，但不參與抗原結合。其 pFc’區域已被酶裂，或生成時缺失pFc，區域的一個抗體，被 稱為F(ab’)2片段，它保留完整抗體的兩個抗原結合位點。 因此，本發明的一個實施例採用一個可檢測標記抗體片段， 如F(ab’)2。同樣，其Fc區域已被酶裂，或其生成時缺失Fc 區域的一個抗體，被稱為Fab片段，它保留完整抗體分子的 抗原結合位點之一。Fab片段由一個共價結合的抗體輕鏈和 被稱為Fd的抗體重鏈的一部份組成。Fd片段為抗體特異性 的主要決定子(一單個Fd片段可與多達1〇個不同的輕鏈相 聯而不改變抗體特異性），單獨存在的Fd片段保留抗原決定 基的結合能力。 正如本領域所熟知的，在抗體的抗原結合部份内，有互 補決定區(CDR)，而互補決定區直接與抗原的決定基和框架 區域(FRs)發生交互作用，框架區域維持抗體決定基的三級 結構(一般内容參見Clark，1986 ; Roitt，1991)。在IgG免疫 球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈，有4個框架區域(FR1至 FR4)，它們分別被3個互補決定區(CDR1至CDR3)分隔 開。這些CDR，特別是CD3區域，尤其是重鏈CDR3，在 很大程度上是造成抗體特異性的原因。哺乳動物抗體的非 CDR區域可為同種或異種抗體的相似區域所替代，同時保 留原抗體的抗原決定基特異性，這已為本領域所公認。這在 32 201241177 「人類化」抗體的研發和利用中得到極為清楚的證明，在該 「人類化」抗體中非人類CDR與人類的FR和/或Fc/pFc， 區域共價結合’以生成功能抗體（參見第4,816,567、 5,225，;539、5,585,089、5,693,762 和 5,859,205 號美國專利）。 完全人類單克隆抗體亦可透過對轉基因小鼠進行免疫 處理來製備’這些轉基因小鼠在很大部份基因位置上具有人 類免疫球蛋白重鏈和輕鏈。對這些小鼠（如 Xen〇M〇USe(Abgenix)，HuMAb 免疫處理後’可按照鮮的雜瘤技術製備單級抗體。這 些單克隆抗體將具備人類免疫球蛋自絲酸序列，因而，應 用於人類時不會引起人類抗小鼠抗體(HAMA)反應。〜 因此對本領域-般專業人士顯而易見的是，本發明亦 包括F(ab’)2、Fab、Fv和Fd片段；嵌合抗體；嵌合F(ab，)2 片段抗體；嵌合Fab 4段抗體以及嵌合Fd #段抗體。在欲 合抗體中，Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2忉或輕鏈 CDR3區域[被㈤系人類或非人類序列所替代；在嵌合 F(ab’)2片段抗體中，FR和/或CDR1和/或cdr2枋或輕鏈 CDR3區域已被同系人類或非人類序列所替代；在嵌合触 片段抗體令，FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈cdr3 區域已被同系人類或非人類序列所替代；在嵌合Fd片段抗 體中’ FR和/或CDR1和/或CDR2區域已被同系人類或非人 *員序列所替代。本判亦包括所謂單鏈抗體。 *透過參考下列非限制性實例可更好地理解本發明，這些 貝例係作為本發明之示範提供。列出以下實例是為了更充分 33 201241177 地說明本發明之首選的實施例，而決不應以任何方式將其解 釋為限定本發明之廣泛範圍。 實例 實例1 : siRNA篩選 為了鐘別能增加細胞對多西紫杉醇的抗藥性或敏感性 的基因’針對101種基因在HCT116細胞内進行了 siRNA 篩選，同時使用一系列多西紫杉醇濃度以產生劑量效應曲 線。人的結腸癌細胞係HCT116獲自ATCC，並在37°C與 95% C〇2和5% 〇2的條件下在補加100單位/ml青黴素、 100 gg/ml鏈黴素、4 mM L-榖醯胺和10%胎牛血清的 McCoy 5A中培養。上述均為與癌相關的基因，其中 包括在對多西紫杉醇具有抗藥性的乳房腫瘤中過度表達的 那些基因，正如基因表達圖譜實驗所顯示(Chang以 Za«cei362:362,2003)。其他的準則是，該目標可隨著藥物 發的過程加以修正。總的方案概括如下。第一天，將Hcni6 細胞按每孔5,000個細胞接種在96孔培養板上，第二天按 每基因用3-4 siRNA轉染。所用siRNA的代表性樣本如表！ 和表II所不。用脂質體試劑Lipofectamine 2〇〇〇啊响邮 在96孔培養板上將轉染至配丁 μ細 胞内。第三天，將siRNA除去並加入濃度範圍為〇到4〇 _ 的多西紫满。第六天，使用wsw測定法定量測定細胞 存活率。這是-種監啦活細胞内絲體脫_活性的測定 法，該活性導致了四唑鹽爾心的裂解而形成曱臢 34 201241177 (formazan)。在測定當天，將培養基從％孔培養板上除去。 將JST-1試劑(Roche)在McCoy 5A培養基中稀釋10倍並 於每孔内加入100ul。然後將培養板於37〇c培養4〇 _ 8〇分 鐘，再在 SpeCtr〇Max(M〇lecular Devices)上於 45〇nm 讀數。 通過计异貝驗值與對照siRNA數值的比率，將WST-1值按 等級分組，結果共15個基因被鑒定為可增加敏感性，9個 基因可增加抗藥性’如下文的表m所示。增加敏感性和抗 藥性的基因可進一步劃分為以下兩種類型：1}在多西紫杉醇 濃度較低時(1-6 nM)觀察到siRNA改變IC50的效應，或2) 在較咼遭度時(>6nM)觀察到顯著的效應和較小的ic5〇轡 化。 與 Mad2、BubRl 和 Mpsl 的 siRNA 相比，以 Grb2、 CDK6、Sepharase，以及鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶π S(CamKIID)為目標的siRNA在較低的多西紫杉醇濃度範圍 (1_6ηΜ)内顯示了更顯著的效應和典型的IC5〇變化。蟪之， 這一分組顯示了比有絲分裂檢查點基因較弱的抗藥性，而且 CamKIID siRNA形成了最高程度的保護，比對照細胞高出 兩倍。這些數據顯示’四個有絲分裂檢查點基因以及其他幾 個基因的喪失可在不同程度上增加對多西紫杉醇的抗藥 性。圖1的數據顯示了幾條典型的劑量效應曲線，對應於用 siRNA轉染隨後又接觸各種濃度多西紫杉醇的細胞。對抗四 種有絲分裂檢查點基因，包括BubRl、Bubl、Mad2和 Mpsl(Bubl的數據未顯示)以及Rac/Cdc42的鳥嘌呤核苷酸 交換因子(GEFT)的siRNA，顯示了對多西紫杉醇的顯著抗藥 35 201241177
西紫轉濃度制(>6 nM)此效應更為顯 者。對於Mad2顯示了抗的最高水平，心胞存活率比 ，照S1RNA轉染的細胞增加五倍。在薛檢中大多數姻A 沒有得分’作為-個代表性實例，我們在此處顯示了人的成 視網臈細胞瘤1(RB1)。 綜上所述，這些結果顯示’ siRNA篩選可幫助人們瞭解 基因表達的向下調節是如何敏化細胞或在用多西紫杉醇處 理時如何保護細胞，以及根據不同的濃度而產生不同的作用 機制以減緩多西紫杉醇引起的細胞死亡。 表I :，加對多西紫杉醇的敏感性的siRjvjA序列： 基因名 稱 siRNA序列 序列識 別號 siRNA序列 序列識 別號 P21(W GCGAUGGAACU 1 AGACCAUGUGG 3 afl) UCGACUUU ACCUGUCA UGGAACUUCGA 2 CUUUGUCA Pim-1 CCUUCGAAGAA 4 UAUUCCUUUCG 6 AUCCAGAA* AGCAUGAC UGGUGUGUGGA 5 GAUAUUCC * GBP-1 CGAAAGGCAUG 7 GAACAGGAGCA 9 UACCAUAA ACUACUAA GAUACAGGCUG 8 36 201241177 AAGAGAUU RXRA GCAAGGACCUG 10 GACCCUGUCACC 12 ACCUACAC AACAUUU GCAAGGACCGG 11 AACGAGAA SPF45 CAAAUCCGCUG 13 GACCCUAUGUU 15 ACUGAAAU UCCUAAUG GAACAAGACAG 14 ACCGAGAU Heel GUGUAUUCGAC 16 GUACUCAGUUG 18 AACUCUGU CAGACAUU GAUUGCAAGAU 17 GUAUCACAAAU 19 UGGAACAA UGGCUAGA Rafl GCACGGAGAUG 20 GACAUGAAAUC 22 UUGCAGUA CAACAAUA GCAAAGAACAU 21 GGAAUGAGCUU 23 CAUCCAUA GCAUGACU Aurora GAGAACUGCUA 24 GAAGGUCGGAU 26 A CUUAUAUA GCAUGAUG GAAUAUGCACC 25 GUAAAGGAAAG 27 ACUUGGAA UUUGGUAA TACC3 GCACCUCGCUUC 28 GAACGAAGAGU 30 CCACAAG CACUGAAG GAGCGGACCUG 29 37 201241177 UAAAACUA RelB GCAGAAAGAGG 31 GCCCGUCUAUG 33 ACAUAUCA ACAAGAAA GCAGCGAGCCA 32 UUGCCUUU PRKC GGACGUGGAUU 34 GAAAGAACGCU 36 D GCAAACAA UCAACAUC GCAUGAAUGUG 35 CACCAUAA BRAF3 GGGCGUACCAG 37 GUCUGAAGCCU 39 5 CAGUCUGA AUAAGAUG GCUCUGGGCUC 38 AUGAACAC HSPA1 GAGAUCGACUC 40 GAUCAACGACG 42 L CCUGUUUG GAGACAAG UGGAGGAGUUC 41 AAGAGAAA STK11 GAAGAAGGAAA 43 GAAACAUCCUC 45 UUCAACUA CGGCUGAA GAGAAGCGUUU 44 CCCAGUGU MKK3 GGUGGAGGCUG 46 GGAGGGCCAUG 48 AUGACUUG UGAAGAUG GGAGAUUGCUG 47 GAUGUGAAGCC 49 38 201241177 UGUCUAUC Γ ------ CUCCAAUG *各序列顯示了良好的抑制作用
表II :降低對多西紫杉醇的敏感性的siRNA序列： 基因 siRNA序列 序列識 siRNA序列 序列識 名稱 別號 別號 BubRl GCAAUGAGCCU 50 GGAAGAAGAUC 52 UUGGAUAU* UAGAUGUA GGAACAACCUC 51 AUUCUAAA Mad2 GAAAUCGUGGC 53 GCCGAGUUCUU 55 CGAGUUCU CUCAUUCG GUGGCAUAUAU 54 GGAACAACUGA 56 CCAUCUGA AAGAUUGG Mpsl GUCGUUACAGU 57 GAUGAACUAAG 59 CAAGCAAU* CUUGAAUA GCACGUGACUA 58 GAGCAGUACCA 60 CUUUCAAA CUAGAAAU GEFT GAACACAGCCU 61 GGAUGAAGAUG 63 GGAUAUGU AGCUGUAA GCACCGAGACU 62 GCAUGUGGCUC 64 AUUUCUUG AGAUCUUG Bubl GUACAACAGUG 65 GCUUGUGAUAA 67 ACCUCCA AGAGUCAA 39 201241177 GAUGCUGGAUG 66 GAUCCACCAGA 68 UGUGAAUA UGCUAUUG hSepar GCUGUCAGAUA 69 GUGGACAGUUG 71 ase GUUGAUUU UAAAUCUA GCCUACAGCUUC 70 GAAGAUCGUUU 72 UAUAGUC CCUAUACA CamKI GCACGAAAGCA 73 GCUAGAAUCUG 75 ID AGAGAUUA CCGUCUUU GAAGAAAGCAG 74 GAUCAAGGCUG 76 AUGGAGUA GAGCUUAU CDK6 GAACAUGUCGA 77 GAGUAGUGCAU 79 UCAAGACU CGCGAUCU GUUUGUAACAG 78 GUAACAGAUAU 80 AUAUCGAU CGAUGAAC GRB2 GAACGAAGAAU 81 GGUACAAGGCA 83 GUGAUCAG GAGCUUAA GUGGAUUAUCA 82 GUGCCACAGCA 84 CAGAUCUA GCCGACAU 對照序列： GUCGACCAUUA 85 GGAUUCGUAAC 86 UGUACCGGAU GUGAUUAGCG 不影響對多西紫杉醇反應的siRNA序列： 40 201241177 RB1 GAAACAGAAGA ACCUGAUU 87 GUACAUCUCAG AAUCUUGA 89 GAAAGGACAUG UGAACUUA 88 *各序列顯示了良好的抑制作用 表in:影響對多西紫杉醇反應的基因 增加對多西紫杉醇敏感性的siRNA : 基因名稱 序列識 別號 檢索號 IC50 比率 p(IC50 比率） 最小 比率 P(最小 比率） P21(Wafl) 90 NM_000389 0.70 0.0004 0.25 0.0000 Pim-1 91 NM—002648 0.80 0.0011 0.30 0.0000 GBP-1 92 NM一002053 0.59 0.0000 0.25 0.0000 RXRA 93 NM_002957 0.64 0.0011 0.36 0.3098 SPF45 94 NM—032905 0.72 0.0000 0.47 0.0000 Heel 95 NM 一006101 0.64 0.0000 0.31 0.0121 Rafl 96 X03484 0.90 0.0059 0.30 0.0000 Aurora A 97 AF008551 0.73 0.0000 1.37 0.0018 TACC3 98 NM_006342 0.29 0.0000 0.85 0.0077 RelB 99 NM_006509 0.56 0.0000 0.77 0.0052 PRKCD 100 NM—006254 0.46 0.0683 0.59 1.0000 BRAF35 101 NM 一006339 0.44 0.0000 1.29 0.1361 41 201241177 HSPA1L 102 NM 005345 0.60 0.0404 1.08 1.0000 STK11 103 NM 000455 0.94 0.4544 0.27 0.0000 MKK3 104 L36719 0.51 0.0000 0.82 0.0553 增加對多西紫杉醇抗藥性的siRNA ：： 基因名稱 序列識 別號 檢索號 IC50 比率 p(IC50 比率） 最小 比率 P(最小 比率） BubRl 105 AF046079 1.88 0.2207 3.01 0.5663Λ Mad2 106 AJ000186 3.22 0.0076 5.06 1·0000Λ Mpsl 107 NM_003318 3.55 0.0008 2.92 1.0000Λ Racl/CDC42 的 GEFT 108 NM_133483 3.50 1.0000 2.42 1.0000Λ Bubl 109 NM—004336 1.38 0.0007 2.45 0.0000 hSeparase 110 NM_012291 1.99 0.0000 0.88 1.0000 CamKIID 111 NM_001221 2.03 0.0016 1.29 1.0000 CDK6 112 NM_001259 1.99 0.0000 1.14 1.0000 GRB2 113 NM 一002086 1.97 0.0000 1.16 1.0000 不影響對多西紫杉醇的反應的siRNA : 基因名稱 序列識 別號 檢索號 IC50 比率 p(IC50 比率） 最小 比率 P(最小 比率） RBI 114 NM_000321 0.87 0.0061 1.03 0.4863 42 201241177 GAPDH 115 NM_002046 nd nd nd nH RPS9 116 BC071941 nd nd 11 LI ------- nd nd 注： 最小比率：多西紫杉醇劑量最高處siRNA與對照 P值越小’樣本和對照物之間的差異就越顯著。 標有符號Λ的卩值很高，因為劑量效應曲線的曲矣 即使該差異很顯著且可再現。 Nd=尚未確定 ----- 物的比率。 良擬合程度差， 實例2 :交叉檢驗可增強對多西紫杉醇抗藥性的一類^抓八 siRNA篩檢法一個潛在的缺點在於這樣一種觀察，即 siRNA可復原為具有部份同一性的轉錄物或引發微 RNA(miRNA)翻譯阻滯，使得目標特異性作用和非特異性(鳴離 位點的）作用難以區分(Jackson et al，Nat Biotechnol 21:635, 2003)。為了以一種獨立的方法用第二種序列來證實抗藥性用 一種反轉錄病毒載體感染HCT116細胞，產生了 BubR1和 Mpsl穩定的抑制細胞係，該載體載有為一種短髮失(sh)RNA 編碼的DNA低聚核苷酸。該s_A含有一個不同於siRNA 的序列，對準開放讀框的一個獨特的區域。反轉錄病毒包裝的 細胞係GP2-293獲自Clontech。將細胞保存在補加了 1〇〇單位 /ml青黴素、i〇〇pg/mi鏈黴素、4mMLL-穀醯胺和1〇%胎牛 血清的DMEM内。經瞬時轉染GP2-293細胞而產生病毒。在 轉染前24小時在一 1〇 cm培養皿上總共接種了 3.6 X 106個 43 201241177 細胞。在用含有10%FBS但不含抗生素的DMEM轉染前4小 時’更換培養基。用6 pg載體DNA、6 pg包膜質粒 VSV-G(Clontech)以及 72 μΐ 脂質體試劑 Lipofectamine-2000 轉 染細胞。在14-16小時後更換培養基；24小時之後收穫病毒上 清液，通過一 0.45 μΜ過濾器過濾，並用於在8 pg/ml溴化己 二曱胺存在的條件下感染HCT116細胞，感染複數(M.O.I)為 5。在感染後48小時在0.5 pg/ml嘌呤黴素中選擇細胞達7天 或直至背景細胞死亡。以BubRl和Mpsl抑制細胞係產生的 劑量效應曲線再次顯示抗藥性增加，在較高的多西紫杉醇濃度 下更為顯著(圖2)，與經siRNA瞬間轉染所獲的結果相似。為 了檢驗shRNA是否降低了 mRNA水平，我們採用了實時pcr 來檢測内源性轉錄物，並證實與載體對照物的穩定的細胞係(圖 3)相比，BubRl和Mpsl穩定的抑制細胞係内rna水平降低。 將細胞溶解並用RNAqueous -96(Ambion)提取RNA。用 Primer Express™ 軟體（英國 PE Applied Biosystems)設計
Taqman™探針及正向引子和反相引子。除了所測試的特定基 因’對於探針和引子序列的BLAST檢索未顯示與其它序列顯 著的同一性。為了進行實時PCR’為每孔製備了 20 μΐ TaqMan™ 主混合物：4.825 μΐ 無 RNA 酶的水、12.5 μΐ 2x Universal PCR 主混合物和0.625 μΐ 40x MultiscribeTM和RNA酶抑制劑混合 物(Applied Biosystems)、0.9 μΐ 正向和反向引子(loo μΜ)、〇 25 μΐ探針(100 μΜ)。每孔加入了 5 μΐ樣本RNA(約1 ng/ml)。在 TaqMan™ ABI Prism 77〇〇 Sequence Detector™(英國 Perkin-Elmer)上分析培養板。循環參數為於48 °C循環30分 201241177 鐘’於95 °C循環10分鐘，再於95 °c循環I5秒計4〇個週 期’以及於60 °c循環丨分鐘^從標準曲線外推測試基因禮A 值並表示為剩餘百分數。 實例3 ·透過避免有絲分裂阻滯’ Mad2、BubRl和Mpsl的向 下调節可保護細胞避免多西紫杉醇誘發的死亡，並產 生非整倍性 正如WST-1測定所確定的’在多西紫杉醇存在的情況下， 有絲分裂檢查點基因的喪失與意味著抗藥性的細胞存活率上 升相關（圖1)〇為了進-步測試WST4測量有效性，進行了細 胞學實驗峨察細胞形鮮和存活率(圖4)。使料焦點顯微 鏡追蹤細胞並使用鈣黃綠素_AM( 一種因細胞内酯酶而發出綠 色螢光的活體染料)作為新陳代謝活性細胞指示劑。圖4顯示 加入多西紫杉醇後16小時，Mad2、BubRl及Mpsl siRNA轉 染的細胞過早地退出了有絲分裂而進入一種明顯的分裂間期 狀態，並呈現一種平坦的細胞形態，而大多數對照siRNA轉染 的細胞則處於有絲分裂阻滯狀態，並呈現一種圓形的細胞形 ·%。以刖對於其它微管抑制劑已經描述過平坦的細胞表型，並 述及細胞從有絲分裂阻滯狀態退出、實際上並沒有完成有絲分 裂而進入一種明顯的分裂間期狀態的能力(Kung a/., Proc Natl Acad Sci 87:9553, 1990; Lanni and Jacks, Mol Cell Biol 18:1055, 1998)。在處理後 72 小時，關於 Mad2、BubRl 或 Mpsl siRNA向下調節細胞最引人注目的觀察結果是增加了許多細胞 以及非常大的細胞粒度，而對照siRNA轉染的細胞與之相比， 45 201241177 由於多西紫杉醇處理的結果它們已被實質上消滅。在多西紫杉 醇不存在的情況下，在兩個不同的時刻，有絲分裂檢查點向下 調節的細胞看起來與對照物細胞相似，處理後72小時細胞數 量的增加提示’在siRNA存在的情況下細胞在活躍地增長。 繼微管抑制劑如秋水仙鹼（c〇lcemid)、洛可達唑 (nocodazole)和太平洋紫杉醇處理之後，有絲分裂檢查點受損的 細胞能夠繞過有絲分裂阻滯並過早地退出有絲分裂(Tayl〇r and McKeon, Cell 89:727, 1997; Shin et al.y Cancer Cell 4:483, 2003; Masuda et al, Am J Pathol 163:1109, 2003; Sudo et aL, Cancer 及es 64:2502, 2004)。為了確定經多西紫杉醇處理的hcti 16細 胞經二種特定的檢查點基因Mad2、BubRl或Mpsl抑制之後 疋否過早地退出有絲分裂，我們測量了被轉染細胞的有絲分裂 指數。將siRNA轉染的Mad2、BubRl或Mpsl細胞未經處 理(〇)或在經多西紫杉醇處理後8、16、24、36、48和72小時 收穫，然後加以固定並與多克隆抗體一起培養，該多克隆抗體 檢測組蛋白H3的磷酸化作為有絲分裂的跡象(有絲分裂指數套 組，Cellomics)。圖5以曲線顯示了所有時刻的情況。有絲分裂 指數在處理後16小時和24小時之間達到高峰，表明在所有情 況下均發生了有絲分裂阻滞。對於用對照siRNA轉染的細胞， 有絲分裂指數達到了最高值，但用Mad2和BubRl siRNA轉染 的細胞則顯示了有絲分裂指數的顯著下降。Mpsl siRNA的效 應不象Mad2和BubRl那樣顯著。這些結果清楚地顯示，有 絲分裂檢查點受損的細胞能繞過多西紫杉醇誘發的有絲分裂 阻滯狀態，而且BubRl siRNA是繼Mad2和Mpsl之後最有效 46 201241177 的 為了排除有絲分裂指數的變化與抑制效率的重大差異是 =的可能㈣們採用實時PCR來測量有絲分裂檢查點轉二 7、’。圖6所示的實驗顯示，1nRNA的水平降低到了與Mad2、' BubRl和Mpsl siRNA轉染的細胞相當的水平提示有 指數的差異更能反映基因的功能。 〃 ^ ，顯微鏡觀察獲得的數據看來，上述顆粒非常大的細胞也 h有異常的DNA含量。為了進—步調查這 ，的細胞是否能夠克服多西紫杉醇誘發的細 咿’重新進入S p白b段而產生非整倍細胞，我們進行了以^八 ==量D!!A含量°分別在多西紫杉醇存在或不存在的“ ''固定Mps卜BubRh Mad2和對照卿八轉染的細 胞’並用视丙錢色，再進行FACS分析。在加人多
Sf_固不同時刻收集數據(數據未顯示），圖7顯示了處理 後72小時的分佈圖。多西紫杉醇加入後72小時，践叫、 Β，1、Mad2和siRNA的轉染導致了細胞的積聚，其臟含 望分別為8N、16N以及32N(BubR1的情•在 s_A的情況下’當多西紫杉醇存辦，檢測出了(dna含量 為)8N的細胞群，但對於有絲分裂檢查點向下調節的細胞，此 N =群的數量要大得多。在加入多西紫杉醇後一健早的 時刻(數據未顯示）’大多數對照細胞被阻滞在4N，而用Mps卜 BUbR1和Mad2 SiRNA轉染的細胞職4N前進到8N。這些社 ’有絲分裂檢查點翻的抑做得細胞能更迅速地積‘ 至異常的DNA水平，而且與野生仙胞味，越過了更高的 201241177 倍生閾值我們的結果顯示了·犯、此咖和Mp以在用 以前未表徵的微管抑制劑多西紫杉醇調節有絲分裂指數和細 胞週期性進化過程中的作用。 實例4 · BubRl向下調節細胞内多西紫杉醇抗藥性細胞群的形 成 假定與抗微管舰合的BubR1表達不狀非整倍性相 關，而且BubRl的恢復與激活檢查點和非整倍細胞的洞亡相 關’那麼BubRl _亡_對於純聽真性的調節似乎是 很重要的(Shin e WaCW/ 4:483, 2GG3)。為了確^有絲分 裂檢查點基㈣永久性向下雕是魏使_以更大的增殖 能力增長，測試了 BubRl和Mpsl穩定的抑制細胞係(圖4)在 多西紫杉醇持續存在的條件下增殖和建立細胞群的能力。由於 Mad2的損傷對於細胞是致命的，故Mad2穩定的抑制細胞係 無法產生(Michel ei ίϊ/·，iVoc Λ^αί/ Jcai/ 免/101:4459, 2004)。用 5 nM多西紫杉醇處理BubR卜Mpsl和對照stlRNA穩定的抑制 細胞係達10天之後，用結晶紫染色。圖8顯示，與對照細胞 係相比，BubRl抑制細胞係產生了多得多的大細胞群。在5 nM 多西紫杉醇存在時，Mpsl抑制細胞係不能產生細胞群。當將 這些培養板培養17天后，在對照培養板上可觀察到細胞群， 但其數篁與BubRl抑制細胞係相比仍然較少。這此结果將 BubRl(但不是Mpsl)的低水平與化療藥物多西紫杉醇存在時細 胞的快速生長相關聯。 48 201241177
貫例5對於此增加對多西紫杉醇敏感性的的交叉檢驗 除了鐘別能保護細胞免遭多西紫杉醇誘發的殺傷的 siRNA之外’此筛檢過程也鑑別了能使細胞對殺傷作用更敏感 的 SlRNA。在表 111 中，Pim-卜 P21wafl/Cipl、GBP-卜 RXRA、 Hecl、SPF45、Rafl代表了一組在較高多西紫杉醇濃度下(>6 _ 顯不了顯著的殺傷作用而汇兄只有很小變化的siRNA。致癌絲 胺酸/蘇胺酸激酶Pim-i和細胞週期抑制劑p2lWafi/ciPi的siRNA 劑罝效應曲線是非常相似的(圖9)，這可能反映了信號通路内 的疊加或協力作用；而且先前的報導顯示，p21wafl/CiPl是pim l 的底物(Wang 以 fl/.，所印/⑽如1593:45, 2〇〇2)。更令 人感興趣的是Pim-1在前列腺上皮細胞内過度表達的數據，這 種過度表達導致了有絲分裂檢查點的干擾和基因的不穩定性 (Roh β α/.，Qwcer 及從 63:8079, 2003)。這些結果與 Mad2、
BubRl和Mpsl的表達不足的數據是一致的，顯示了一種具有 相反表達水平的可比表型(參見圖1)。可增加對多西紫杉醇敏 感性的另一種siRNA是Heel。 在表 III 中，TACC3、RELB、Aurora-A、PRKCD(PKC)、 HSPA1A以及BRAF35代表了 一組在較低多西紫杉醇濃度(丨_ 6 nM)下增加敏感性且IC50發生典型變化的sjR^A〇Aurora-A是 在有絲分裂發生時起作用並涉及中心體成熟和紡錘體集合的 絲私酸/棘胺酉夂激 S#(參閱 Meraldi ei β/.，Cwrr Dev 14:29，2004)。很令人感興趣的是某些公開的數據顯示， Aurora-A在HeLa細胞内的過度表達保護了細胞免遭太平洋紫 杉醇的殺傷’這與我們的Aurora_A表達不足增強了多西紫杉醇 49 201241177 殺傷作用的結果是_致的(Anand c们外 2003)。誠然，這是Aur〇ra_A的I(：5〇小幅度的下降，代表了存 活率下降25% ;但是，通 s_反騎縣的傳輸造成 HCT116細胞内Aur〇ra_A穩定的抑制(將圖9與圖⑺和圖Μ 比較）’該結果得以完全重現。 實例6:Piml在多西紫杉醇不存在時可抑制hctu6細胞的增 殖 曰 匕/為了進一步評估該篩檢過程的優點，重要的是要將在多西 紫杉醇不存在時影響細胞存活率的siRNA和那些與多西紫杉 醇共同起作用而增強殺傷能力的siRNA加以區別。為了區別各 種可能性，我們研究了 siRNA轉染對增殖的影響，使用錐蟲 藍排除分析法和細胞計數來確定轉染後24、48、72小時6孔 培養板上存活細胞的數量。我們的結果顯示，Pimq siRNA可 抑制HCT116細胞内的增殖，而TACC3siRNA對增殖則沒有 影響(圖12 ;圖13顯示了量化的抑制），儘管兩種siRNA均能 提高多西紫杉醇誘發的細胞死亡(圖9)。 實例7 :使用Live/Dead分析對抗藥性基因和敏感性基因進行 驗證 為了直觀地比較能對多西紫杉醇產生敏感性和抗藥性的 siRNA ’使用了顯微成像來確定活細胞與死細胞的比率，用詞 頁綠素-A將活細胞染成綠色，用碘化丙啶(PI)將死細胞核染成 紅色。在加入多西紫杉醇之後(72小時)，siRNA轉染的BubRl 50 201241177 細胞含有的存活細胞最多，而siRNA轉染的pim l和tacc3 含有的死細胞衫’制細酬介於兩者之剛雜未顯示 雖然在72小時之前BubRl siRNA單獨顯示了細胞死亡的增 加，但最終該細胞變得對多西紫杉醇具有抗藥性。在24小時 之則Pim-1 siRNA單獨造成了細胞死亡，而ΤΑ(χ3 siRNA則 未造成死亡。這些結果顯示，·R1的向下調節與上升的細胞 存活率和抗§_關’而Pim_l和TACC3的向下調節則與上 升的細胞死亡率和藥物敏感性相關。Pim_ 1和Tacc3的顯千* 多西紫杉醇存在時其殺傷作用增強，但這—分析不能 作用和協力殺傷作用之間的差異。 實例8 ·多西紫杉醇誘發的胱冬裂酶_3活性因BubR1的向下調 節降低但因Pim-1的向下調節而增強 多西紫杉醇能誘發凋亡而造成細胞的死亡(Dm扣fl/， •/施 / M^/ll:799, 2003)。為 了確定 和 BubR1 siRNA 在 多西紫杉醇存在和不存在的情況下是否能調節一條標準的凋 亡途徑’我們(使用一種bi〇plex分析)研究了 HCT116細胞内 的激活胱冬裂酶-3水平(圖14)。在用40 nM多西紫杉醇處理48 小時後，在對照細胞内誘發了胱冬裂酶_3活性，這種誘發因 Pim-1的向下調節而進一步增強，但因BubR1的向下調節而降 低(中圖和下圖）。在多西紫杉醇不存在的情況下，pim—丨的向下 調節導致了處理後24小時胱冬裂酶_3活性略有增加，但在處 理後48小時和72小時則回到了對照水平(上圖），這表明其它 的凋亡機制已被激活以維持籍由WST-1和LIVE/DEAD分析法 201241177 於處理後72 *時所觀察到的增·傷作用。在多西紫杉醇不 存在的情況下，BubRl的向下調節導致了胱冬裂酶·3活性很輕 微的增加LX下祕絲是-朗：在live/dead分析 中’ BubRl的抑制在處理後72小時最初造成了細胞的死亡。 這些結果進-步提示，Pim]和BubR1通過胱冬裂酶_3活性的 調節是多西紫杉醇殺傷作用的效應子。 實例9 :涉及多西紫杉醇誘發的Pim 1相關敏感性和BubR1相 關抗藥性的信號通路
Pim-1引起的活性有力地提示，Pim-1在阻止導致細胞死 亡的信號事件而促進有利於細胞存活的信號事件過程中起著 關鍵的作用。為了定義與Pim_l的抑制相關的細胞死亡增加的 分子基礎’我們研究了涉及細胞存活的關鍵細胞通路的活化狀 態，AKT。將HCT116按每孔4 X 105細胞接種在6孔培養板 上’並於次日使用脂質體試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen) 以16 nM siRNA轉染。24小時之後，以5 nM和40 nM多西 紫杉醇處理細胞或不加處理。在加入多西紫杉醇後24、48和 72小時，以冰冷的裂解緩衝液(5〇 mM HEPES緩衝液
(PH7.4)、1% NP40、2.5 mM EDTA、100 mM 氟化鈉、10 mM 鈉ΡΡι、蛋白酶抑制劑混合片劑(Roche)、2 mM原釩酸鈉)來溶 解細胞’並以12,000g離心1〇分鐘。然後採用DC蛋白分析 法(BioRad)定量分析溶胞產物的總蛋白水平。使用活性胱冬裂 酶-3 beadmates 套組(Upstate)和 Luminex 100TM 系統，按照製造 商推薦的規程確定活性胱冬裂酶-3水平。使用總AKT抗體 52 201241177 bead套組和磷特異性AKT s473抗體bead套組(Bi〇s〇urce)以及
Lummex 1〇〇ΤΜ系統，按照製造商推薦的規程確定總akt和磷 酸化ΑΚΤ的水平。 圖15所示的實驗結果顯示，與對照樣本相比，的 向下調節減少了 AKT的基線磷酸化，而且隨著多西紫杉醇濃 度的增加這種影響顯著地加強。通過比較，BubR1的向下調節 增加了 AKT的基線磷酸化而且這種影響在多西紫杉醇濃度較 低而不是較高時得到加強，表明在較高劑量時也許有其他的信 號通路被激活。 申請人進行了西方印跡分析，使用抗Pimd和BubR1的 抗體於第48小時測量蛋白水平。將等量蛋白載入NupAGE Novex Bis-Tris凝膠(lnvitr〇gen)。按照製造商的推薦，使用了 抗 Pim-1 (Santa Cruz biotechnology)、BubRl(BD bioscience)和 α- 微管蛋白(Sigma)的抗體。將第二抗體與HRp(Bi〇Rad)結合並以 ECL西方印跡檢測系統(Amhersham Biosciences)檢測，然後再 與 ECL Hyperfilm(Amhersham Biosciences)接觸。圖 16 所示的 貫驗結果顯示’與對照樣本相比，Pim_l和BubRi蛋白水平降 低，顯示了降低的蛋白水平對應於某種功能的變化(圖15)。這 些數據提示，Pim-1蛋白水平的向下調節能夠阻止AKT的磷 酸化和活化，以迫使細胞趨向凋亡。Pimd似乎能通過激活有 利於生存的通路而導致細胞的生存。 本發明的範圍不限於此處所述的特定具體實施例。確實， 除了此處所述的那些實施例，本發明之各種各樣的修改，通過 前面的說明和附圖，對於本領域的專業人士將變得顯而易見。 53 201241177 這類修改均屬於所附的專利權要求範圍。 本文引述的所有參考文獻均以其整體引用在此。
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<210> <211> <212> <213> 3 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 3 agaccaugug gaccuguca 201241177 <210> <211> <212> <213> 4 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 4 ccuucgaaga aauccagaa <210> <211> <212> <213> 5 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 5 uggugugugg agauauucc <210> <211> <212> <213> 6 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 6 uauuccuuuc gagcaugac <210> <211> <212> <213> 7 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 7 cgaaaggcau guaccauaa <210> <211> <212> <213> 8 19 RNA 人工 201241177 <220> <223> siRNA <400> 8 gauacaggcu gaagagauu <210> <211> <212> <213> 9 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 9 gaacaggagc aacuacuaa <210> <211> <212> <213> 10 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 10 gcaaggaccu gaccuacac <210> <211> <212> <213> 11 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 11 gcaaggaccg gaacgagaa <210> <211> <212> <213> 12 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 12 201241177 gacccuguca ccaacauuu <210> <211> <212> <213> 13 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 13 caaauccgcu gacugaaau
<210> <211> <212> <213> 14 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 14 gaacaagaca gaccgagau
<210> <211> <212> <213> 15 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 15 gacccuaugu uuccuaaug <210> <211> <212> <213> 16 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 16 guguauucga caacucugu <210> 17 <211> 19 201241177
<212> <213> RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 17 gauugcaaga uuggaacaa
<210> <211> <212> <213> 18 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 18 guacucaguu gcagacauu
<210> <211> <212> <213> 19 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 19 guaucacaaa uuggcuaga
<210> <211> <212> <213> 20 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 20 gcacggagau guugcagua
<210> <211> <212> <213> 21 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA 201241177 <400> 21 gcaaagaaca ucauccaua
<210> <211> <212> <213> 22 19 RNA 人工. <220> <223> siRNA <400> 22 gacaugaaau ccaacaaua
<210> <211> <212> <213> 23 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 23 ggaaugagcu ugcaugacu
<210> <211> <212> <213> 24 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 24 gagaacugcu acuuauaua
<210> <211> <212> <213> 25 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 25 gaauaugcac cacuuggaa 201241177
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<210> <211> <212> <213> 28 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 28 gcaccucgcu ucccacaag
<210> <211> <212> <213> 29 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 29 gagcggaccu guaaaacua <210> <211> <212> <213> 30 19 RNA 人工 201241177 <220> <223>
siRNA <400> 30 gaacgaagag ucaci agaag 19 <210> <211> <212> <213> 31 19 RNA 人工 <220> <223>
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<210> <211> <212> <213> 36 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 36 gaaagaacgc uucaacauc
<210> <211> <212> <213> 37 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 37 gggcguacca gcagucuga
<210> <211> <212> <213> 38 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA <400> 38 gcucugggcu caugaacac <210> <211> <212> <213> 39 19 RNA 人工 201241177 <220> <223> siRNA <400> 39 gucugaagcc uauaagaug <210> <211> <212> <213> 40 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 40 gagaucgacu cccuguuug <210> <211> <212> <213> 41 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 41 uggaggaguu caagagaaa <210> <211> <212> <213> 42 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 42 gaucaacgac ggagacaag <210> <211> <212> <213> 43 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 43 201241177 gaagaaggaa auucaacua <210> 44 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 44 gagaagcguu ucccagugu <210> 45 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 45 gaaacauccu ccggcugaa <210> 46 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 46 gguggaggcu gaugacuug <210> 47 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 47 ggagauugcu gugucuauc <210> 48 <211> 19 201241177 <212> <213> RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 48 ggagggccau gugaagaug
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<210> <211> <212> <213> 55 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 55 gccgaguucu ucucauucg
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<210> <211> <212> <213> 62 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 62 gcaccgagac uauuucuug
<210> <211> <212> <213> 63 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 63 ggaugaagau gagcuguaa <210> <211> <212> <213> 64 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 64 gcauguggcu cagaucuug <210> <211> <212> <213> <220> <223> 65 18 RNA 人工 siRNA <400> 65 guacaacagu gaccucca 201241177 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < iah 6 9^^ 6 1 w Λ <220> <223> siRNA <400> 66 gaugcuggau gugugaaua iah 9 9凡」 6 1 ^ Λ, > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 67 gcuugugaua aagagucaa <210> 68 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 68 gauccaccag augcuauug <220> <223> siRNA <400> 69 gcugucagau aguugauuu
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<213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 70 gccuacagcu ucuauaguc <210> <211> <212> <213> 71 19 RWA 人工 <220> <223> siRNA <400> 71 guggacaguu guaaaucua
<210> <211> <212> <213> 72 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 72 gaagaucguu uccuauaca
<210> <211> <212> <213> 73 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 73 gcacgaaagc aagagauua
<210> <211> <212> <213> 74 19 RNA 人工 <220> <223> SiRNA 201241177 <400> 74 gaagaaacca gauggagua <210> 75 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 75 gcuagaaucu gccgucuuu ,ah Em > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < <220> <223> siRNA <400> 76 gaucaaggcu ggagcuuau <210> 77 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 77 gaacaugucg aucaagacu <210> 78 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 78 guuuguaaca gauaucgau <210> 79 201241177
<211> <212> <213> 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 79 gaguagugca ucgcgaucu
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<210> <211> <212> <213> 82 19 RNA 人工 <220> <223> siRNA <400> 82 guggauuauc acagaucua <210> <211> <212> <213> 83 19 RNA 人工 <220> 201241177 <223> siRNA <400> 83 gguacaaggc agagcuuaa 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < c Ax 95 1NJ a 8 2 R Λ, <210> 84 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 84 <220> <223> siRNA <400> 85 gucgaccauu auguaccgga u 61s 8 2 R > > > > 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < <220> <223> siRNA <400> 86 ggauucguaa cgugauuagc g <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 87 gaaacagaag aaccugauu 201241177 <210> 88 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 88 . gaaaggacau gugaacuua 19 <210> 89 <211> 19 <212> RNA <213> 人工 <220> <223> siRNA <400> 89 guacaucuca gaaucuuga 19 <210> 90 <211> 2140
<212> DNA <213> 人類 <400> 90 agctgaggtg tgagcagctg ccgaagtcag ttccttgtgg agccggagct gggcgcggat 60 tcgccgaggc accgaggcac tcagaggagg cgccatgtca gaaccggctg gggatgtccg 120 tcagaaccca tgcggcagca aggcctgccg ccgcctcttc ggcccagtgg acagcgagca 180 gctgagccgc gactgtgatg cgctaatggc gggctgcatc caggaggccc gtgagcgatg 240 gaacttcgac tttgtcaccg agacaccact ggagggtgac ttcgcctggg agcgtgtgcg 300 gggccttggc ctgcccaagc tctaccttcc cacggggccc cggcgaggcc gggatgagtt 360 gggaggaggc aggcggcctg gcacctcacc tgctctgctg caggggacag cagaggaaga 420 ccatgtggac ctgtcactgt cttgtaccct tgtgcctcgc tcaggggagc aggctgaagg 480 gtccccaggt ggacctggag actctcaggg tcgaaaacgg cggcagacca gcatgacaga 540 tttctaccac tccaaacgcc ggctgatctt ctccaagagg aagccctaat ccgcccacag 600 gaagcctgca gtcctggaag cgcgagggcc tcaaaggccc gctctacatc ttctgcctta 660 gtctcagttt gtgtgtctta attattattt gtgttttaat ttaaacacct cctcatgtac 720 ataccctggc cgccccctgc cccccagcct ctggcattag aattatttaa acaaaaacta 780 21 840 201241177 ggcggttgaa tgagaggttc ctaagagtgc tgggcatttt 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DNA 人類 <400> 114 gctcagttgc cgggcggggg agggcgcgtc cggtttttct caggggacgt tgaaattatt tttgtaacgg gagtcgggag aggacggggc gtgccccgac gtgcgcgcgc gtcgtcctcc ccggcgctcc tccacagctc gctggctccc gccgcggaaa ggcgtcatgc cgcccaaaac cccccgaaaa acggccgcca ccgccgccgc tgccgccgcg gaacccccgg caccgccgcc gccgccccct cctgaggagg acccagagca ggacagcggc ccggaggacc tgcctctcgt caggcttgag tttgaagaaa cagaagaacc tgattttact gcattatgtc agaaattaaa gataccagat catgtcagag agagagcttg gttaacttgg gagaaagttt catctgtgga tggagtattg ggaggttata ttcaaaagaa aaaggaactg tggggaatct gtatctttat tgcagcagtt gacctagatg agatgtcgtt cacttttact gagctacaga aaaacataga aatcagtgtc cataaattct ttaacttact aaaagaaatt gataccagta ccaaagttga taatgctatg tcaagactgt tgaagaagta tgatgtattg tttgcactct tcagcaaatt ggaaaggaca tgtgaactta tatatttgac acaacccagc agttcgatat ctactgaaat aaattctgca ttggtgctaa aagtttcttg gatcacattt ttattagcta aaggggaagt attacaaatg gaagatgatc tggtgatttc atttcagtta atgctatgtg tccttgacta ttttattaaa ctctcacctc ccatgttgct caaagaacca tataaaacag 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tctgattttg tgcaaaagct tcaaattaaa 4200 acagctgcat tagaaaaaga ggcgcttctc ccctccccta cacctaaagg tgtatttaaa 4260 74 201241177 ctatcttgtg tgattaactt atttagagat gctgtaactt aaaatagggg atatttaagg 4320 tagcttcagc tagcttttag gaaaatcact ttgtctaact cagaattatt tttaaaaaga 4380 aatctggtct tgttagaaaa caaaatttta ttttgtgctc atttaagttt caaacttact 4440 attttgacag ttattttgat aacaatgaca ctagaaaact tgactccatt tcatcattgt 4500 ttctgcatga atatcataca aatcagttag tttttaggtc aagggcttac tatttctggg 4560 tcttttgcta ctaagttcac attagaatta gtgccagaat tttaggaact tcagagatcg 4620 tgtattgaga tttcttaaat aatgcttcag atattattgc tttattgctt ttttgtattg 4680 gttaaaactg tacatttaaa attgctatgt tactattttc tacaattaat agtttgtcta 4740 ttttaaaata aattagttgt taagagtctt aa 4772 <210> 115 <211> 1260 <212> DNA <213>人類 <400> 115 aaattgagcc cgcagcctcc cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca 60 tcttcttttg cgtcgccagc cgagccacat cgctcagaca ccatggggaa ggtgaaggtc 120 ggagtcaacg gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt 180 aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg 240 ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag 300 cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttccaggagc gagatccctc caaaatcaag 360 tggggcgatg ctggcgctga gtacgtcgtg gagtccactg gcgtcttcac caccatggag 420 aaggctgggg ctcatttgca ggggggagcc aaaagggtca tcatctctgc cccctctgct 480 gatgccccca tgttcgtcat gggtgtgaac catgagaagt atgacaacag cctcaagatc 540 atcagcaatg cctcctgcac caccaactgc ttagcacccc tggccaaggt catccatgac 600 aactttggta tcgtggaagg actcatgacc acagtccatg ccatcactgc cacccagaag 660 actgtggatg gcccctccgg gaaactgtgg cgtgatggcc gcggggctct ccagaacatc 720 atccctgcct ctactggcgc tgccaaggct gtgggcaagg tcatccctga gctgaacggg 780 aagctcactg gcatggcctt ccgtgtcccc actgccaacg tgtcagtggt ggacctgacc 840 75 201241177 tgccgtctag aaaaacctgc caaatatgat gacatcaaga aggtggtgaa gcaggcgtcg 900 gagggccccc tcaagggcat cctgggctac actgagcacc aggtggtctc ctctgacttc 960 aacagcgaca cccactcctc cacctttgac gctggggctg gcattgccct caacgaccac 1020 tttgtcaagc tcatttcctg gtatgacaac gaatttggct acagcaacag ggtggtggac 1080 ctcatggccc acatggcctc caaggagtaa gacccctgga ccaccagccc cagcaagagc 1140 acaagaggaa gagagagacc ctcactgctg gggagtccct gccacactca gtcccccacc 1200 acactgaatc tcccctcctc acagttgcca tgtagacccc ttgaagaggg gaggggccta 1260 <210> 116 <211> 974 <212> DNA <213> 人類 <400> 116 gtttgcttag gtgaggcgca gacggggaag cggagccaac atgccagtgg cccggagctg 60 ggtttgtcgc aaaacttatg tgaccccgcg gagacccttc gagaaatctc gtctcgacca 120 agagctgaag ctgatcggcg agtatgggct ccggaacaaa cgtgaggtct ggagggtcaa 180 atttaccctg gccaagatcc gcaaggccgc ccgggaactg ctgacgcttg atgagaagga 240 cccacggcgt ctgttcgaag gcaacgccct gctgcggcgg ctggtccgca ttggggtgct 300 ggatgagggc aagatgaagc tggattacat cctgggcctg aagatagagg atttcttaga 360 gagacgcctg cagacccagg tcttcaagct gggcttggcc aagtccatcc accacgctcg 420 cgtgctgatc cgccagcgcc atatcaggta ccacctcgga tgggcacctg aatcttcctc 480 cacctgcccc tctgatggtt gccctcacta agcctgctgt ccctatctcc tatgcagccc 540 tcggaggtga tgggtgtgaa ctcacccaga gggtacagat tcacccttgc acacagctca 600 ccagggagct ggggcagcct cttgccccaa tagcccagcg caagggtcac tgcggctcta 660 gccgtacacc ttgtgaaggc ctctgccagg catgtgggca gctggacagg gtccgcaagc 720 aggtggtgaa catcccgtcc ttcattgtcc gcctggattc ccagaagcac atcgacttct 780 ctctgcgctc tccctacggg ggtggccgcc cgggccgcgt gaagaggaag aatgccaaga 840 agggccaggg tggggctggg gctggagacg acgaggagga ggattaagtc cacctgtccc 900 tcctgggctg ctggattgtc tcgttttcct gccaaataaa caggatcagc gctttaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaa 974 76

Claims (1)

  1. 201241177 七 '尹請專利範園·· •種綱生物樣本t軸細麵料彡賴化合物分子的 反應的方法，其包括以下步驟： a) 從該患者的癌症部位獲得試驗樣本； b) 獲得對照樣本； c) 测量TTK蛋白激酶(Mpsl)之水平；以及 Φ比較在試驗樣本和對照樣本中所測量的Mpsl之水平； 其中，與對照樣本比較，在試驗樣本内所測的Mpsl水平 的下降表示對紫杉醇類化合物分子抗性的增強。 2. 如申請專利範圍第1項之方法’其中該紫杉醇類化合物 分子係選自由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇XRP9881和 XRP6258組成之群組。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該Mpsl的水平是由 mRNA、DNA或蛋白測量。 4. 如申請專利範圍第3項之方法’其中該mRNA是採用選 自由下列組成之群組的技術所測量：原位雜交、反轉錄酶 聚合酶鏈反應、核酸雜交、電泳、北方墨點法和質譜。 5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該DNA是採用選自 由下列組成之群組的技術所測量：定量聚合酶鏈反應、基 因組DNA-晶片、原位雜交、電泳、南方墨點法和質譜。 6. 如申請專利範圍第3項之方法’其中該蛋白是採用選自 由下列組成之群組的技術所測量：免疫測定法、西方墨點 法、ELISA，以及質譜。 1 201241177 .種預測或監測腫瘤細胞對紫杉醇類化合物分子的反應 之套組，其中該套組包含可檢測標記抗體、可檢測標記抗 體片段或可檢測標記寡㈣酸，該寡核苷酸包含能在嚴格 條件下與包含SEQ Π) NO_: 1〇7的Mpsl核苷酸序列雜交 的核酸。 8’種預測或監測癌症患者對紫杉醇類化合物分子的反應 之套組’其中該套組包含： a) 從身體樣本分離總RNA之RNA回收溶液； b) 反轉錄總RNA以獲得cDNA之酵素；以及 c) 使該cDNA經由聚合酶鏈反應擴增之一組引子， 其中一個或兩個引子具有可檢測標記，且兩個引子均衍生 自包含SEQ Π) NO.: 1〇7的Mpsl核苷酸序列。 9. 如申睛專利範圍第7或8項之套組，其中該可檢測標記 係選自由下列組成之群組：一種酶、一種放射性同位素、 或一種發螢光的化合物…種化學發細分子、不透射線 的物質、脂質體，以及半抗原分子。 10. 種預測生物樣本中腫瘤細胞對紫杉醇類化合物分子的 反應的方法，其包括以下步驟： a) 測量來自s玄患者的癌症部位之試驗樣本中ττκ蛋白 激酶(Mpsl)之水平； b) 測量s亥試驗樣本中一種或一種以上參照標記物的水 平，其中該參照標記物係選自由下列組成之群組：甘油 媒-3-磷酸脫氫酶(GApDH)及处切；及 c) 比較在試驗樣本中所測的Mps〗和該一種或一種以上參 2 201241177 照標記物的水平； 其中’與該一種或一種以上參照標記物的水平比較，Mpsl 水平的下降表示對紫杉醇類化合物分子抗性的增強。 Π.如申請專利範圍第1〇項之方法，其中該紫杉醇類化合物 分子係選自由太平洋紫杉醇、多西紫杉醇XRP9881和 XRP6258組成之群組。 12·如申請專利範圍第10項之方法，其中該STK11的水平 是由mRNA、DNA或蛋白測量。 13·如申請專利範圍第12項之方法，其中該mRNA是採用 選自由下列組成之群組的技術所測量：原位雜交、反轉錄 酶聚合酶鏈反應、核酸雜交、電泳、北方墨點法和質譜。 14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該DNA是採用選 自由下列組成之群組的技術所測量：定量聚合酶鏈反應、 基因組DNA-晶片、原位雜交、電泳、南方墨點法和質譜。 15. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該蛋白是採用選自 由下列組成之群組的技術所測量：免疫測定法、西方墨點 法、ELISA，以及質譜。 16. —種預測或監測腫瘤細胞對紫杉醇類化合物分子的反應 的套組，其中該套組包含可檢測標記抗體、可檢測標記抗 體片段或可檢測標記寡核苷酸’該寡核苷酸包含能在嚴格 條件下與包含SEQ ID NO.: 107的Mpsl核苷酸序列雜交 的核酸。 3 201241177 17. 如申請專利範圍第16項之套組，其進一步包含可檢測標 記抗體、可檢測標記抗體片段或可檢測標記寡核苷酸，該 养核苷酸包含能在嚴格條件下與參照標記物雜交的核酸。 18. —種預測或監測生物樣本ψ腫瘤細胞對紫杉醇類化合物 分子的反應的套組，其中該套組包含： a) 從身體樣本分離總RNA之RNA回收溶液； b) 反轉錄總RNA以獲得cDNA之酵素； c) 使與Mpsl (SEQ ID NO.: 107)相關的cDNA經由聚合酶 鏈反應擴增之第一組引子，以及 d) 使與參照標記物相關的cDNA經由聚合酶鏈反應擴增 ，，.之第二組引子， 其中，一個或一個以上之引子具有可檢測標記。 19. 如申請專利範圍第16或18項之套組，其中該可檢測標 記係包含一種酶、一種放射性同位素、或二釋發曼忠的化 合物、一種化學發光劑分子·'、不透射線的物質、脂質體-， 以及半抗原分子。 20. 如申請專利範圍第17或18項之套組，其中該參照標記 物係選自由 GAPDH (SEQ ID NO.: 115)及 RPS9 (SEQ ID NO.: 116)組成之群組。
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