JP2002508658A - 野生型ｈｕＢＵＢ１遺伝子の減少の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト腫瘍におけるhuBUB1遺伝子の変異および／または減少を評価するための方法が提供される。野生型huBUB1遺伝子の減少は新生物の発生に関与する。治療レジメはhuBUB1の変異状態に基づいて計画され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 野生型huBUB1遺伝子の減少の検出 本出願は以下の係属中の仮出願番号第60／049,068号(1997年6月11日出願)；同 第60／068,102号(1997年12月12日出願)；および同第60／070,182号(1997年12月3 0日出願)の優先権を主張する。これらの出願の各々は本明細書中に参考として援 用される。発明の技術分野 本発明はガンの診断の領域に関する。より詳細には、本発明は腫瘍組織におけ る野生型huBUB1遺伝子の減少および/または変化の検出に関する。発明の背景 細胞周期調節およびアポトーシスに関与する遺伝子およびタンパク質は、ガン の発生において重要であることが見いだされている。当該分野において、細胞周 期およびアポトーシスを制御する細胞の成分を同定する必要性が存在し続けてい る。発明の要旨 本発明の目的は新形成を診断、予知、および処置するためのツールおよび方法 を提供することである。本発明のこの目的および他の目的は以下に記載する1つ 以上の実施態様によって提供される。 本発明の1つの実施態様は、単離および精製されたhuBUB1タンパク質を提供し 、これは配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも85％同一であるアミノ 酸配列を含む。 本発明の他の実施態様は、単離および精製されたhuBUB1ポリペプチドを提供し 、これは配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくとも85％同一であるアミノ 酸配列から選択された少なくとも6個の連続するアミノ酸を含む。 本発明のさらに他の実施態様は、ペプチド結合で互いに融合した第1のタンパ ク質セグメントと第2のタンパク質セグメントとを含む融合タンパク質を提供す る。第1のタンパク質セグメントは、配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なく とも85％同一であるアミノ酸配列を有するhuBUB1タンパク質の少なくとも6個の 連続するアミノ酸を含む。 本発明のさらに他の実施態様は、huBUB1タンパク質に特異的に結合する抗体の 調製物を提供する。 本発明のなお他の実施態様は、単離および精製されたサブゲノムポリヌクレオ チドを提供し、これは配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも85％ 同一のヌクレオチド配列から選択される少なくとも10個の連続するヌクレオチド を含む。 本発明のさらなる実施態様は、単離および精製されたサブゲノムポリヌクレオ チドを含むDNA発現構築物を提供する。この単離および精製されたサブゲノムポ リヌクレオチドは、配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも85％同 一であるヌクレオチド配列から選択される少なくとも10個の連続するヌクレオチ ドを含む。 本発明の他の実施態様は宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、単離および精 製されたサブゲノムポリヌクレオチドを含む。この単離および精製されたサブゲ ノムポリヌクレオチドは、配列番号1で示されるヌクレオチド配列と少なくとも8 5％同一であるヌクレオチド配列から選択される少なくとも10個の連続するヌク レオチドを含む。 本発明のさらに他の実施態様は、ヒトの新生物組織の診断方法を提供する。新 生物であると疑われる組織をヒトから単離する。その組織由来の野生型huBUB1遺 伝子の減少または野生型huBUB1遺伝子の発現産物を検出する。野生型huBUB1遺伝 子またはその発現産物の減少は組織の新形成を示す。 本発明のさらに他の実施態様は、野生型huBUB1遺伝子の機能を、huBUB1遺伝子 における変異によってこの遺伝子の機能を減少した細胞に供給する方法を提供す る。野生型huBUB1遺伝子の全てまたは一部が、この遺伝子の機能を減少した細胞 中に導入される。この野生型huBUB1遺伝子の一部は、細胞の非新生物性増殖に必 要とされる。野生型huBUB1遺伝子の全てまたは一部が細胞中で発現する。 本発明のさらに他の実施態様は、一対の一本鎖DNAプライマーを提供する。こ の一対の一本鎖DNAプライマーは、huBUB1遺伝子コード配列の全てまたは一部の 合成を可能にする。 本発明の他の実施態様は、配列番号1に示すような野生型huBUB1遺伝子に相補 的な核酸プローブを提供する。 本発明のさらに他の実施態様は、変異体huBUB1遺伝子に相補的な核酸プローブ を提供する。 本発明のさらに他の実施態様は、ヒトにおける新生物組織の存在を検出する方 法を提供する。身体サンプルをヒトから単離する。変異体huBUB1遺伝子または発 現産物を身体サンプルにおいて検出する。変異体huBUB1遺伝子または発現産物の 検出はヒトにおける新生物組織の存在を示す。 本発明の他の実施態様は、ヒトにおけるガンに対する遺伝的素因を検出する方 法を提供する。血液および胎児組織からなる群から選択されるヒトサンプルを単 離する。このサンプルからDNAを抽出する。野生型huBUB1遺伝子のDNAからの減少 を検出する。野生型huBUB1遺伝子の減少の検出は、そのヒトにおけるガンに対す る遺伝的素因を示す。 本発明のさらなる実施態様は、huBUB3−huBUB1結合を妨害する試験化合物を同 定するための方法を提供する。この化合物は候補治療剤である。第1のタンパク 質、第2のタンパク質、および試験化合物を接触させる。第1のタンパク質はhuBU B1に結合するhuBUB3の少なくとも一部を含み、そして第2のタンパク質はhuBUB3 に結合するhuBUB1の少なくとも一部を含む。あるいは第1のタンパク質はhuBUB3 に結合するhuBUB1の少なくとも一部を含み、そして第2のタンパク質はhuBUB1に 結合するhuBUB3の少なくとも一部を含む。第2のタンパク質に結合し、第2のタン パク質から置換され、または第2のタンパク質との結合を妨げられる第1のタンパ ク質の量、あるいは第1のタンパク質に結合し、第1のタンパク質から置換され、 または第1のタンパク質との結合を妨げられる第2のタンパク質の量が決定される 。第2のタンパク質に結合する第1のタンパク質の量、または第1のタンパク質に 結合する第2のタンパク質の量を減少させる化合物、あるいは第2のタンパク質に 結合する第1のタンパク質、または第1のタンパク質に結合する第2のタンパク質 を 置換する化合物、あるいは第1のタンパク質と第2のタンパク質との結合を妨げる 化合物は、候補治療剤として同定される。 本発明の他の実施態様は、huBUB3−huBUB1結合を妨害する化合物を同定する方 法を提供する。細胞を、huBUB1−huBUB3結合を阻害する能力について試験される 化合物と接触させる。この細胞は、配列特異的DNA結合ドメインを含む第1の融合 タンパク質、転写活性化ドメインを含む第2の融合タンパク質、および配列特異 的DNA結合ドメインによって認識されるDNAエレメントから下流にレポーター遺伝 子を含むDNA構築物を含む。第1の融合タンパク質は、huBUB1タンパク質に結合す るhuBUB3タンパク質の少なくとも一部をさらに含み、そして第2の融合タンパク 質は、huBUB3タンパク質に結合するhuBUB1タンパク質の少なくとも一部をさらに 含む。あるいは、第1の融合タンパク質は、huBUB3タンパク質に結合するhuBUB1 タンパク質の少なくとも一部をさらに含み、そして第2の融合タンパク質はhuBUB 1タンパク質に結合するhuBUB3タンパク質の少なくとも一部をさらに含む。この 化合物の存在下でのレポーター遺伝子の発現の量を決定する。レポーター遺伝子 の発現量を減少させる化合物を候補治療剤として同定する。 本発明のさらに他の実施態様は、huBUB1のキナーゼ活性を減少させる試験化合 物を同定する方法を提供する。huBUB1タンパク質を試験化合物と接触させる。hu BUB1タンパク質のキナーゼ活性を決定する。huBUB1タンパク質のキナーゼ活性を 減少させる化合物を候補治療剤として同定する。 本発明のさらに他の実施態様は抗腫瘍剤に対する腫瘍の感受性を高める方法を 提供する。腫瘍を、huBUB1キナーゼ活性を阻害する化合物、またはhuBUB1−huBU B3結合を阻害する化合物と接触させる。腫瘍の抗腫瘍剤に対する感受性が高まる 。 本発明の他の実施態様は、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを細胞中で発現 する方法を提供する。huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを細胞に送達する。hu BUB1サブゲノムポリヌクレオチドを発現させる。 従って、本発明は、当該分野にヒトhuBUB1遺伝子およびタンパク質の配列を提 供する。この情報により、高度に特異的なアッセイを行って特定の腫瘍組織の新 生物状態を評価することが可能となる。図面の簡単な説明 図1。図1は選択されたキナーゼを示し、これはhuBUB1を含み、ClustalWを用い て整列する。 図2。図2はhuBUB1およびhuBUB3遺伝子の染色体位置を示す。詳細な説明 ヒトhuBUB1遺伝子が細胞周期制御およびアポトーシスに関与することが本発明 の発見である。huBUB1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号1に 示す。huBUB1タンパク質はhuBUB3タンパク質に結合する。huBUB3遺伝子およびタ ンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を配列番号3および4に各々示す 。huBUB1およびhuBUB1−huBUB3複合体はキナーゼ活性を有し、そしてhuBUB1は自 己リン酸化し得る。 huBUB1はガン細胞中で変異する。従って、野生型huBUB1遺伝子または機能の減 少は新形成の診断に使用され得る。さらに、治療レジメはhuBUB1の変異状態に基 づいて計画され得る。野生型huBUB1は微小管毒物、例えば、ビンクリスチン、ビ ンブラスチン、タキソール、およびタキソテールに対する耐性を与える。従って 、huBUB1における変異の知見は、これらの薬剤が有効に用いられ得ることを示す 。対照的に野生型huBUB1の知見は他の薬剤の使用を示唆する。 huBUB1タンパク質は配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。ヒト組織に生じ るこの配列の天然に存在する任意の生物学的に活性な改変体は本発明の範囲内に ある。全長huBUB1の天然に存在する生物学的に活性な改変体はhuBUB3に結合し、 そして自己リン酸化の能力を含むキナーゼ活性を有する。huBUB1のhuBUB3結合ド メインは配列番号2のアミノ酸1−400内に位置し、より詳細には配列番号2のアミ ノ酸200−400内に位置する。huBUB1ポリペプチドは長さが全長huBUB1とは異なり 、6、8、10、12、15、18、20、25、30、35、40、45、50、75、80、90、または10 0個以上の、huBUB1タンパク質の連続するアミノ酸を含む。 huBUB1タンパク質およびhuBUB1ポリペプチドの改変体もまた生じ得る。huBUB1 改変体は天然に存在するか、または天然に存在しないものであり得る。天然に存 在するhuBUB1改変体はヒトまたは他の種において見いだされ、配列番号2で示さ れるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。天然に存在しないhuBU B1改変体であって、天然に存在するhuBUB1改変体と実質的に同じ生物学的活性を 保持する改変体もまたここで包含される。好ましくは、天然に存在するかまたは 天然に存在しないhuBUB1改変体は配列番号2で示されるアミノ酸配列と少なくと も85％、90％、または95％同一のアミノ酸配列を有し、そして同様の生物学的特 性、例えばキナーゼ活性を有し、これは自己リン酸化する能力、およびhuBUB3に 結合する能力を包含する。より好ましくは、この分子は少なくとも98％または99 ％同一である。野生型huBUB1タンパク質またはポリペプチドとhuBUB1改変体との 間の配列同一性パーセントは、野生型と改変体との間でマッチするアミノ酸の数 をカウントし、そしてマッチする総数を野生型huBUB1配列のアミノ酸残基の総数 で除することによって計算される。 好ましくは、huBUB1改変体中のアミノ酸の変化は保存的なアミノ酸変化である 。すなわち、同様に荷電または非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸 変化は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。 天然に存在するアミノ酸は通常、以下の4つのファミリーに分けられる：酸性(ア スパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非 極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ ン、メチオニン、トリプトファン)、および非荷電極性(グリシン、アスパラギン 、グルタミン、システイン（cystine）、セリン、トレオニン、チロシン)のアミ ノ酸。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンはときには一緒に芳 香族アミノ酸として分類される。 ロイシンをイソロイシンまたはバリンで孤立置換すること、アスパラギン酸を グルタミン酸で孤立置換すること、トレオニンをセリンで孤立置換すること、ま たはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で同様に孤立置換することは、得られ るhuBUB1改変体の生物学的特性に大きな影響を与えないと予期することは合理的 である。huBUB1改変体の特性および機能は、huBUB1タンパク質または配列番号2 のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同様のタイプのものであるが、改変体の特 性および機能は程度が異なり得る。アミノ酸の変化により機能的なhuBUB1改変体 を生じるかどうかは容易に決定され得る。例えば、huBUB1改変体のhuBUB3への結 合は特異的抗体（これは本明細書に開示される）を用いて検出され得る。huBUB1 改変体自体またはhuBUB3との複合体でのキナーゼ活性もまた、以下に説明するよ うに測定され得る。 huBUB1改変体は、グリコシル化形態、他の分子との凝集結合体、および関係な い化学部分との共有結合性結合体を包含する。huBUB1改変体はまた対立遺伝子改 変体、種改変体、および変異タンパク質(mutein)を包含する。huBUB1とhuBUB3と の結合、またはhuBUB1のキナーゼ活性に影響しない領域の切断物または欠失物も またhuBUB1改変体である。共有結合性改変体は、当該分野で公知のように、官能 基と、アミノ酸鎖あるいはN末端またはC末端残基で見いだされる基とを連結する ことによって調製され得る。 huBUB1は、標準的な生化学的方法を用いて、huBUB1産生ヒト細胞、例えば脾臓 、胸腺、前立腺、精巣、小腸、結腸、末梢血リンパ球、心臓、脳、胎盤、肺、肝 臓、骨格筋、腎臓、または膵臓から抽出され得る。単離および精製されたhuBUB1 タンパク質またはポリペプチドは、細胞中でhuBUB1タンパク質またはポリペプチ ドに通常会合する他の化合物、例えば特定のタンパク質、炭水化物、脂質、また は細胞下オルガネラから分離される。単離および精製されたhuBUB1タンパク質ま たはポリペプチドの調製物は少なくとも80％純粋である。好ましくはこの調製物 は90％、95％、または99％純粋である。 huBUB1タンパク質およびポリペプチドはまた、組換えDNA法によって、あるい は合成化学法によって産生され得る。組換えhuBUB1タンパク質またはポリペプチ ドの産生のために、配列番号1で示されるhuBUB1ヌクレオチド配列から選択され るコード配列、またはhuBUB1タンパク質をコードするこの配列の改変体は、公知 の原核生物または真核生物発現系(下記参照)で発現され得る。細菌、酵母、昆虫 、または哺乳動物の発現系を当該分野で公知のように用い得る。 あるいは、合成化学法、例えば固相ペプチド合成を用いてhuBUB1タンパク質ま たはポリペプチドを合成し得る。ペプチド、アナログまたは誘導体の産生のため の一般的な手段はCHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES，AND PROTEINS--A SURVEY OF RECENT DEVELOPMENTS，Weinstein，B.編、Marcell Dek ker，Inc.発行、New York(1983)に概説されている。さらに、D-アミノ酸による 通常のL-立体異性体の置換を行って、分子の半減期を増大させ得る。huBUB1改変 体は同様に産生され得る。 少なくとも6、8、10、12、15、18、20、25、50、60、75、80、90、または100 個以上の連続するhuBUB1アミノ酸を含む天然に存在しない融合タンパク質もまた 構築され得る。huBUB1融合タンパク質はhuBUB1アミノ酸配列に対する抗体の生成 に有用であり、かつ種々のアッセイ系での使用に有用である。例えば、huBUB1融 合タンパク質を用いて、huBUB1タンパク質と相互作用し、そのキナーゼ活性に影 響を与えるタンパク質、またはhuBUB1とhuBUB3との結合を妨害するタンパク質を 同定し得る。タンパク質アフィニティークロマトグラフィーのような物理的方法 、あるいは酵母ツーハイブリッド系またはファージディスプレイ系のような、ラ イブラリーに基づくタンパク質−タンパク質相互作用のアッセイもまた、この目 的に用いられ得る。このような方法は当該分野で周知であり、薬物スクリーニン グとしてもまた用いられ得る。 huBUB1融合タンパク質は2つのタンパク質セグメントが互いにペプチド結合に よって融合したものを含む。第1のタンパク質セグメントは、少なくとも6、8、1 0、12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、75、80、90、または100個以上の 、huBUB1タンパク質の連続したアミノ酸を含む。例えば、huBUB1融合タンパク質 はhuBUB3結合部位および／またはhuBUB1のキナーゼドメインを含み得る。これら のドメインは、huBUB1のアミノ酸配列を酵母のホモログであるScBUB1のアミノ酸 配列と整列させることによって認識され得る。アミノ酸は配列番号2で示される アミノ酸配列から選択され得るか、または上記の配列のようなこの配列の生物学 的に活性な改変体から選択され得る。第1のタンパク質セグメントはまた全長のh uBUB1を含み得る。 第2のタンパク質セグメントは全長タンパク質あるいはタンパク質フラグメン トまたはポリペプチドであり得る。融合タンパク質は、当該分野で公知のように 検出可能なマーカー、例えば放射性、蛍光、化学発光、またはビオチン化マーカ ーで標識され得る。第2のタンパク質セグメントは、検出可能な産物、例えばβ- ガラクトシダーゼを生成する酵素であり得る。第1のタンパク質セグメントは、 好都合なようにＮ末端またはＣ末端であり得る。 融合タンパク質の作製のための技術は、組換えによる技術、または2つのタン パク質セグメントを共有結合により連結する技術のいずれもがまた周知である。 組換えDNA法を用いて、例えば、後述のように、配列番号1から選択されるコード 配列を適切なリーディングフレームで第2のタンパク質セグメントをコードする ヌクレオチドと共に含むDNA構築物を作製し、そしてこのDNA構築物を宿主細胞中 で発現させることにより、huBUB1融合タンパク質を調製し得る。 単離および精製されたhuBUB1タンパク質、ポリペプチド、改変体、または融合 タンパク質を免疫原として用いて、huBUB1タンパク質に特異的に結合する抗体の 調製物を得ることができる。この抗体を用いて、とりわけ、ヒト組織中の野生型 huBUB1タンパク質またはhuBUB1−huBUB3複合体およびそれらの断片を検出し得る 。また、この抗体を用いて、huBUB1タンパク質の過少発現または過剰発現、ある いはサイズまたは電気泳動の移動度が変化したhuBUB1タンパク質の発現をもたら す、huBUB1遺伝子における変異の存在を検出し得る。huBUB3タンパク質に特異的 に結合する抗体は、huBUB1抗体に関して後で記載するのと同様に用いられ、かつ 調製され得る。 ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製物が標準的方法を用いて作製 され得る。単鎖抗体もまた調製され得る。huBUB1タンパク質、ポリペプチド、改 変体、または融合タンパク質に特異的に結合する単鎖抗体が、例えば、単鎖免疫 グロブリンディスプレイライブラリーから、当該分野で公知のように単離され得 る。ライブラリーはhuBUB1タンパク質アミノ酸配列に対して「パンニング」され 、そしてhuBUB1タンパク質の異なるエピトープに対して高親和性で結合する多く の単鎖抗体が単離され得る。Hayashiら、1995、Gene 160:129-30。単鎖抗体はま た、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のようなDNA増幅法を用いて、ハイブリドーマcD NAをテンプレートとして用いて構築され得る。Thirionら，1996，Eur．J．Cance r Prev．5:507-11。 単鎖抗体は単一特異的(monospecific)または二重特異的(bispecfic)であり得 、そして二価または四価であり得る。四価の二重特異的単鎖抗体の構築はColoma およびMorrison，1997，Nat．Biotechnol．15:159-63に教示されている。二価の 二重特異的単鎖抗体の構築はMallenderおよびVoss，1994，J．Biol．Chem．269: 19 9-206に教示されている。 単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、後述のように、手動または自動の ヌクレオチド合成を用いて構築され、DNA発現構築物中に標準的な組換えDNA法を 用いてクローン化され、そしてこのコード配列を発現する細胞中に導入され得る 。あるいは、単鎖抗体は、例えば繊維状ファージ技術を用いて直接産生され得る 。Verhaarら，1995，Int．J．Cancer 61:497-501;Nichollsら，1993，J．Immuno l，Meth．165:81-91。 huBUB1特異的抗体は、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有する全長huBUB1 タンパク質中に存在するエピトープ、huBUB1ポリペプチド、または単独もしくは 融合タンパク質の一部としてのhuBUB1改変体に、特異的に結合する。好ましくは 、huBUB1エピトープは他のヒトタンパク質中には存在しない。代表的には、少な くとも6、8、10、または12個の連続するアミノ酸がエピトープの形成に必要とさ れる。しかし、非連続的アミノ酸を含むエピトープはより多く(例えば、少なく とも15、25、または50個)のアミノ酸を必要とし得る。 huBUB1タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または改変体に特異的に 結合する抗体は、ウェスタンブロットまたは他の免疫化学的アッセイで用いられ る場合、他のタンパク質が与える検出シグナルよりも少なくとも5倍、10倍、ま たは20倍高い検出シグナルを与える。好ましくは、huBUB1エピトープに特異的に 結合する抗体は免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、そして huBUB1タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、または改変体を溶液から免 疫沈降させ得る。 抗体は当該分野で周知の方法で精製され得る。好ましくは、抗体は、huBUB1タ ンパク質、ポリペプチド、改変体または融合タンパク質が結合したカラムに抗体 を通すことにより、アフィニティー精製される。結合した抗体は次にカラムから 、例えば高塩濃度のバッファーを用いて溶離され得る。 サブゲノムポリヌクレオチドは全染色体より少ない染色体を含む。好ましくは ポリヌクレオチドはイントロンを含まない。精製および単離されたhuBUB1サブゲ ノムポリヌクレオチドは、配列番号1で示されるヌクレオチド配列またはその相 補体から選択される少なくとも6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50 、 75、100、125、150、175、または200以上の連続するヌクレオチドを含み得る。 配列番号1はヒトhuBUB1遺伝子のコード配列である。1つの実施態様では、huBUB1 サブゲノムポリヌクレオチドは、huBUB1およびScBUB1のアミノ酸配列またはヌク レオチド配列を整列することによって決定されるように、huBUB1のキナーゼドメ インまたはhuBUB3結合部位をコードするヌクレオチドを含む。 配列番号1で示されるヌクレオチド配列の相補体は、配列番号1で示される連続 的ヌクレオチド配列とワトソン−クリック塩基対を形成する連続的なヌクレオチ ド配列である。配列番号1で示されるヌクレオチド配列の相補体(アンチセンス鎖 )もまたサブゲノムポリヌクレオチドであり、これを用いてhuBUB1アンチセンス オリゴヌクレオチドを提供し得る。huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドはまた、 huBUB1特異的単鎖抗体およびリボザイム、またはhuBUB1アミノ酸配列を含む融合 タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。 huBUB1タンパク質または改変体のアミノ酸配列をコードする縮重ヌクレオチド 配列、ならびに少なくとも85％、90％、95％、98％、または99％が配列番号1で 示されるヌクレオチド配列と同一の相同的ヌクレオチド配列もまた、huBUB1サブ ゲノムポリヌクレオチドである。野生型huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドと相 同的huBUB1ヌクレオチド配列との間の配列同一性パーセントは、野生型とホモロ グとの間でマッチするヌクレオチドの数をカウントし、そしてマッチする総数を 野生型huBUB1配列のヌクレオチドの総数で除することによって計算される。代表 的には、相同的huBUB1配列は、当該分野で公知のように、ストリンジェントな条 件下でハイブリダイズすることにより確認され得る。 huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドは、標準的な核酸精製技術を用いて他のヌ クレオチド配列を含まないように単離および精製され得る。例えば、制限酵素お よびプローブを用いて、huBUB1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む ポリヌクレオチドフラグメントを単離し得る。単離および精製されたサブゲノム ポリヌクレオチドは調製物中に存在し、この調製物は他の分子を含まないか、あ るいは少なくとも90％は他の分子を含まない。 huBUB1タンパク質をコードする相補的DNA分子は、逆転写酵素を用いて、huBUB 1 mRNAをテンプレートとして用いて作製され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) または他の増幅技術を用いて、当該分野で公知のように、ヒトのゲノムDNAまた はcDNAのいずれかをテンプレートとして用いて、huBUB1サブゲノムポリヌクレオ チドを得ることができる。あるいは、合成化学技術を用いて、huBUB1タンパク質 の領域、単鎖抗体、またはリボザイムのコード配列を含むか、あるいはアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを含む、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを合成し得 る。遺伝コードの縮重により、配列番号2のアミノ酸配列を含むhuBUB1タンパク 質をコードする代替ヌクレオチド配列が合成され得る。 精製および単離されたhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドをポリヌクレオチド のさらなるコピーを得るためのプライマーとして用い得るか、あるいは野生型お よび変異体のhuBUB1コード配列を同定するプローブとして用い得る。huBUB1サブ ゲノムポリヌクレオチドを用いて、huBUB1 mRNA、タンパク質、ポリペプチド、 または融合タンパク質を発現し得、そしてhuBUB1アンチセンスオリゴヌクレオチ ドおよびリボザイムを生成し得る。 huBUB1コード配列を含むhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを発現構築物中で 用い得る。好ましくは、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを発現プラスミド( 例えば、Ecdyson系、pIND、In Vitro Gene)中に挿入する。huBUB1サブゲノムポ リヌクレオチドは、ベクターおよび細胞株中で当該分野で周知の技術を用いて増 殖され得る。huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドは直鎖状または環状の分子であ り得る。これらは自己複製分子上に存在し得るか、あるいは複製配列を有さない 分子上に存在し得る。これらはそれ自体または他の調節配列によって、当該分野 で公知のように、調節され得る。 huBUB1発現構築物を含む宿主細胞が、次にhuBUB1タンパク質の全てまたは一部 の発現に用いられ得る。huBUB1発現構築物を含む宿主細胞は原核生物または真核 生物であり得る。種々の宿主細胞が、細菌、酵母、昆虫、およびヒト発現系での 使用に利用可能であり、そしてhuBUB1発現構築物の発現または増殖のために用い られ得る(下記参照)。発現構築物は宿主細胞中に当該分野で公知の任意の技術を 用いて導入され得る。これらの技術は、トランスフェリン−ポリカチオンで仲介 されるDNA移入、裸のまたは被包された核酸によるトランスフェクション、リポ ソームで仲介される細胞融合、DNA被覆されたラテックスビーズの細胞内輸送、 プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、およびリン酸カ ルシウム仲介トランスフェクションを包含する。 huBUB1発現構築物は、選択された宿主細胞において機能性であるプロモーター を含む。当業者は適切なプロモーターを、当該分野で公知であり使用されている 多数の細胞型特異的プロモーターから容易に選択し得る。発現構築物はまた、宿 主細胞で機能性である転写ターミネーターを含み得る。発現構築物は、全てまた は一部のhuBUB1タンパク質、改変体、融合タンパク質、抗体、またはリボザイム をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。ポリヌクレオチドセグメント はプロモーターの下流に位置する。ポリヌクレオチドセグメントの転写はプロモ ーターのところから開始される。発現構築物は直鎖状または環状であり得、そし て所望であれば自己複製のための配列を含み得る。 huBUB1発現構築物の発現のための細菌系は、Changら，Nature(1978)275:615， Goeddelら，Nature(1979)281:544，Goeddelら，Nucleic Acids Res.(1980)8:405 7，EP36,776，U.S.4,551,433，deBoerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1983)80 .21-25,およびSiebenlistら，Cell(1980)20:269に記載されるものを包含する。 酵母中の発現系は、Hinnenら，Proc.Natl．Acad．Sci．USA(1978)75:1929;Ito ら，J.Bacteriol.(1983)153：163;Kurtzら，Mol．Cell．Biol．(1986)6:142;Kun zeら，J.Basic Microbiol.(1985)25:141:Gleesonら，J.Gen．Microblol(1986)13 2:3459，Roggenkampら，Mol．Gen．Genet．(1986)202:302;Dasら，J.Bacterial ．(1984)158:1165;De Louvencourtら，J.Bacteriol．(1983)154:737，Van den B ergら，Bio/Technology（1990）8:135;Kunzeら，J.Basic Microbiol．(1985)25: 141;Creggら，Mol．Cell．Biol．(1985)5:3376，U.S．4,837,148，US 4,929,555 ;BeachおよびNurse，Nature(1981)300:706:Davidowら，Curr．Genet．(1985)10: 380，Gaillardinら，Curr．Genet．(1985)10:49，Ballanceら，Biochem．Biophy s．Res．Commun．(1983)112:284-289;Tilburnら，Gene（1983）26:205-221，Yel tonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1984)81:1470-1474，KellyおよびHynes、E MBO J．(1985)4:475479;EP 244,234，およびWO 91/00357に記載されるものを包 含する。 昆虫中でのhuBUB1発現構築物の発現は、U.S．4,745,051，Frlesenら(1986) 「バキュロウイルス遺伝子発現の調節」、THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIR USES(W．Doerfler編)，EP 127,839，EP155,476，およびVlakら，J．Gen．Virol ．（1988）69:765-776，Millerら，Ann．Rev．Microblol．(1988)42:177，Carbo nellら，Gene(1988)73:409，Maedaら，Nature（1985）315:592-594，Lebacq-Ver heydenら，Mol．Cell．Biol．(1988)8:3129;Smithら，Proc．Natl．Acad．Sci． USA（1985）82:8404，Miyajimaら，Gene（1987）58:273；およびMartinら，DNA （1988）7:99に記載のように行われ得る。多数のバキュロウイルス株および改変 体、ならびに対応の宿主由来の許容性昆虫宿主細胞が、Luckowら，Bio/Technolo gy（1988）6:47-55，Millerら，GENETIC ENGINEERING(Setlow，J.K.ら偏)，第8 巻(Plenum Publishing，1986)，第277-279頁，およびMaedaら，Nature，（1985 ）315:592-594に記載される。 huBUB1発現構築物の哺乳動物発現は、Dijkemaら，EMBO J．(1985)4:761，Gorm anら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA(1982b)79:6777，Boshartら，Cell（1985）4 1:521およびU.S．4,399,216に記載のようにして達成され得る。huBUB1発現構築 物の哺乳動物発現の他の特徴は、HamおよびWallace，Meth．Enz．(1979)58:44， BarnesおよびSato，Anal．Biochem．(1980)102:255，U.S．4,767,704，US 4,657 ,866，US 4,927,762，US 4,560,655，WO 90/103430，WO 87/00195，およびU.S． RE 30,985に記載のようにして促進され得る 本発明のサブゲノムポリヌクレオチドはまた、遺伝子送達ビヒクルにおいて、 huBUB1mRNAまたはオリゴヌクレオチド(天然huBUB1 mRNAの配列またはその相補体 のいずれかを有する)、全長huBUB1タンパク質、huBUB1融合タンパク質、huBUB1 ポリペプチド、またはhuBUB1特異的リボザイムまたは単鎖抗体を細胞(好ましく は真核生物細胞)中に送達する目的で用いられ得る。本発明によれば、遺伝子送 達ビヒクルは、例えば、裸のプラスミドDNA、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチ ドを含むウイルス発現ベクター、またはhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドをリ ポソームまたは縮合剤と組み合わせたものであり得る。 本発明の1つの実施態様では、遺伝子送達ビヒクルはプロモーターおよびhuBUB 1サブゲノムポリヌクレオチドを含む。好適なプロモーターは組織特異的プロモ ーター、および細胞増殖によって活性化されるプロモーター、例えば、チミジン キナーゼおよびチミジル酸シンターゼプロモーターである。他の好適なプロモー ターは、ウイルスによる感染で活性化されるプロモーター、例えば、α−および β−インターフェロンプロモーター、およびホルモンで活性化されるプロモータ ー、例えばエストロゲンを包含する。用いられ得る他のプロモーターは、Molone yウイルスLLR、CMVプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを包含 する。 huBUB1遺伝子送達ビヒクルはウイルス配列、例えばウイルス複製起点またはパ ッケージングシグナルを含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス (astrovirus)、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポーバウイルス、パ ラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レ トロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択さ れ得る。好適な実施態様では、huBUB1遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイ ルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびその種々の使用は、多数の参 考文献に記載されており、例えば、Mannら、Cell 33:153，1983，CaneおよびMul ligan，Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA 81:6349，1984，Millerら，Human Gene T herapy 1:5-14，1990，米国特許第4,405,712号、同4,861,719号、および同4,980 ,289号、ならびにPCT出願番号WO 89/02,468号、WO 89/05,349号、およびWO 90/0 2,806号を包含する。多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが本発明で使用 され得る。これは例えば、EP 0,415,731;WO 90/07936;WO 94/03622;WO 93/25698 ;WO 93/25234;米国特許第5,219,740号;WO 9311230;WO 9310218;VileおよびHart ，Cancer Res．53:3860-3864，1933;VileおよびHart，Cancer Res．53:962-967 ，1993;Ramら，Cancer Res．53:83-88，1993;Takamiyaら，J．Neurosci．Res．3 3:493-503，1992;Babaら，J．Neurosurg．79:729-735，1993(米国特許第4,777,1 27号、GB 2,200,651，EP 0,345,242およびWO 91／02805)に記載のものを包含す る。 特に好適なレトロウイルスは、レトロウイルスベクターとして用いられるトリ 白血症ウイルス(ATCC番号VR-535およびVR-247)、ウシ白血病ウイルス(VR-1315) 、マウス白血病ウイルス(MLV)、ミンク細胞病巣誘導(focus-inducig)ウイルス(K ochら，J.Vir．49:828，1984;およびOliffら，J.Vlr．48:542，1983)、マウス肉 腫ウイルス(ATCC番号VR-844、45010および45016)、細網内皮症ウイルス(ATCC番 号VR-994、VR-770および45011)、ラウス肉腫ウイルス、Mason-Pfizerサルウイル ス、ヒヒ内因性ウイルス、内因性ネコレトロウイルス(例えば、RD114)、および マウスまたはラットgL30配列を含むレトロウイルス由来である。組換えレトロウ イルスがそこから生成され得る特に好適なMLVの株は、4070Aおよび1504A(Hartle yおよびRowe，J．Vir．19:19，1976)、Ableson(ATCC番号VR-999)、Friend(ATCC 番号VR-245)、Graffi(Ruら，J．Vir．67:4722，1993;およびYantchev Neoplasma 26:397，1979)、Gross(ATCC番号VR-590)、Kirsten(Albinoら，J．Exp．Med．16 4:1710，1986)、ハーベイ肉腫ウイルス(Manlyら，J．Vir．62:3540，1988;およ びAlbinoら，J．Exp．Med．164:1710，1986)およびRauscher(ATCC番号VR-998)、 およびモロニーMLV(ATCC番号VR-190)を包含する。特に好適な非マウスレトロウ イルスは、ラウス肉腫ウイルスである。好適なラウス肉肺ウイルスはBratislava (Manlyら，J．Vir．62:3540，1988;およびAlbinoら，J．Exp．Med．164:1710，1 986)、Bryan高力価(例えば、ATCC番号VR-334，VR-657，VR-726，VR-659，および VR-728)，Bryan標準(ATCC番号VR-140)、Carr-Zilber(Adgighitovら，Neoplasma 27:159，1980)，Engelbreth-Holm(Laurentら.，Biochem Biophys Acta 908:241 ，1987)，Harris，Prague（例えば、ATCC番号R-772，および45033）およびSchmi dt-Ruppin(例えば、ATCC番号VR-724，VR-725，VR-354)ウイルスを包含する。 上記のレトロウイルスのいずれもが、本明細書で提示した開示および当該分野 で公知の標準的な組換え技術(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Labor atory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，およびKu nkle，PNAS:488，1985)が有れば、レトロウイルスhuBUB1遺伝子送達ビヒクルの 組立または構築のために容易に利用され得る。レトロウイルスhuBUB1発現ベクタ ーの一部は異なるレトロウイルス由来であり得る。例えば、レトロベクターLTR はマウス肉腫ウイルス由来であり得、tRNA結合部位はラウス肉肺ウイルス由来で あり得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルス由来であり得、そして 第2鎖合成起点はトリ白血症ウイルス由来であり得る。これらの組換えレトロウ イルスベクターは、それらを適切なパッケージング細胞系に導入することによ る形質導入コンピテントなレトロウイルスベクター粒子の生成に用いられ得る( 出願番号07/800,921、1991年11月29日出願参照)。組換えレトロウイルスは、組 換えレトロウイルスゲノムを宿主細胞DNAの特異的領域に組み込む部位特異的組 み込みに向けて産生され得る。このような部位特異的組み込みは、レトロウイル ス粒子に取り込まれたキメラインテグラーゼによって仲介される(出願番号08/44 5,466、1995年５月22日出願参照)。組換えウイルス遺伝子送達ビヒクルは複製欠 陥組換えウイルスであることが好ましい。 上記レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルと共に用いるのに適したパッケージン グ細胞系は容易に調製され得(出願番号08/240,030号、1994年5月9日；WO 92/052 66もまた参照)、そしてこれを用いてプロデューサー細胞系(ベクター細胞系また は「VCL」とも称される)が、組換えウイルス粒子の産生のために作製され得る。 特に好適な本発明の実施態様では、パッケージング細胞系はヒト(例えば、HT108 0細胞)またはミンク親細胞系から作製され、これにより、ヒト血清中での不活性 化を生き延びることができる組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが産生さ れ得る。組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築は、WO 91/02805に詳 細に記載される。これらの組換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、これら を適切なパッケージング細胞系に導入することによって、形質導入コンピテント なレトロウイルス粒子の生成に用いられ得る(出願番号07/800,921参照)。同様に 、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルもまた本明細書で提示した開示が有れば容 易に調製および使用され得る(Berkner，Biotechniques 6:616-627，1988，およ びRosenfeldら，Science 252:431-434，1991，WO 93/07283，WO 93/06223，およ びWO93/07282もまた参照のこと)。 huBUB1遺伝子送達ビヒクルはまた組換えアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルで あり得る。このようなビヒクルは本明細書で提供した開示が有れば容易に調製お よび使用され得る(Berkner，Biotechniques 6:616，1988，およびRosenfeldら， Science 252:431，1991，WO 93/07283，WO 93/06223，およびWO93/07282参照の こと)。アデノ随伴ウイルスhuBUB1遺伝子送達ビヒクルもまた、huBUB1アミノ酸 またはヌクレオチドの送達のために構築および使用され得る。アデノ随伴ウイル ス遺伝子送達ビヒクルのインビトロでの使用は、Chatterjeeら、Science 258:1 485-1488(1992)，Walshら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．89:7257-7261(1992)，Wal shら，J．Clin．Invest．94:1440-1448(1994)，Flotteら，J．Biol．Chem．268: 3781-3790(1993)，Ponnazhaganら，J．Exp．Med．179:733-738(1994)，Millerら ，Proc．Nat'l Acad．Sci．91:10183-10187(1994)，Einerhandら，Gene Ther．2 :336-343(1995)，Luoら，Exp．Hematol．23:1261-1267(1995)，およびZhouら，G ene Therapy 3:223-229(1996)に記載される。これらのビヒクルのインビボでの 使用は、Flotteら．Proc．Nat'l Acad．Sci．90:10613-10617(1993)，およびKap littら，Nature Genet．8:148-153(1994)に記載される。 本発明の他の実施態様では、huBUB1遺伝子送達ビヒクルは、トガウイルス由来 である。好適なトガウイルスには、アルファウイルス、特に米国特許出願第08／ 405,627号(1995年3月15日出願)、WO 95／07994に記載のものが包含される。アル ファウイルスは、シンドビスウイルスおよびELVSウイルスを含めて、huBUB1ポリ ヌクレオチドの遺伝子送達ビヒクルであり得る。アルファウイルスは、WO 94/21 792、WO 92/10578およびWO 95/07994に記載される。いくつかの異なるアルファ ウイルス遺伝子送達ビヒクル系は、本発明に従って、huBUB1サブゲノムポリヌク レオチドを細胞に送達するために構築および使用され得る。このような系の代表 的な例は、米国特許第5,091,309号および同第5,217,879号に記載されるものを包 含する。本発明での使用のために特に好適なアルファウイルス遺伝子送達ビヒク ルは、WO 95/07994、および米国出願第08/405,627号に記載されるものを包含す る。 好ましくは、組換えウイルスビヒクルは、シンドビスウイルスに基づく組換え アルファウイルスのウイルスビヒクルである。シンドビス構築物、ならびに多く の同様の構築物は、米国出願第08／198,450号の記載と本質的に容易に調製され 得る。シンドビスウイルス遺伝子送達ビヒクルは、代表的には、シンドビスウイ ルス転写を開始し得る5’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌク レオチド配列、サブゲノムフラグメント転写を妨げるように不活性化されるウイ ルス接合領域、およびシンドビスRNAポリメラーゼ認識配列を含む。任意には、 ウイルス接合領域は、サブゲノムポリヌクレオチド転写が減少、増加、または維 持されるように改変され得る。当業者に理解されるように、他のアルファウイル ス由来の対応する領域が、上記のものの代わりに用いられ得る。 アルファウイルス由来の遺伝子送達ビヒクルのウイルス接合領域は、サブゲノ ムポリヌクレオチドの転写を妨げるために不活性化されている第1のウイルス接 合領域と、サブゲノムポリヌクレオチド転写が減少するように改変されている第 2のウイルス接合領域とを含む。アルファウイルス由来のビヒクルはまた、cDNA 由来のウイルスRNAの合成を開始し得る5’プロモーターと、転写終結を制御する 3’配列を含み得る。 本発明で利用し得る他の組換えトガウイルス遺伝子送達ビヒクルは、セムリキ 森林ウイルス(ATCC VR-67;ATCC VR-1247)、ミッデルブルグウイルス(ATCC VR-37 0)、ロスリバーウイルス(ATCC VR-373;ATCC VR-1246)、ベネズエラウマ脳炎ウイ ルス(ATCC VR923;ATCC VR-1250;ATCC VR-1249;ATCC VR-532)由来のビヒクル、お よび米国特許第5,091,309号および同第5,217,879号に記載のビヒクル、およびWO 92/10578に記載のビヒクルを包含する。上記のシンドビスビヒクル、ならびに 多数の同様の構築物は、米国出願第08/198,450号の記載と本質的に同様に容易に 調製され得る。 本発明での使用に適した他のウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、ポリオ ウイルス(Evansら，Nature 339:385，1989，およびSabinら，J．Biol．Standard ization 1:115，1973)(ATCC VR-58);ライノウイルス(Arnoldら，J．Cell．Bioch em．L401，1990)(ATCC VR-1110);ポックスウイルス、例えば、カナリアポックス ウイルスまたはワクシニアウイルス(Fisher-Hochら、PANAS 86:317，1989;Flexn erら，Ann．N.Y．Acad．Sci．569:86，1989;Flexnerら，Vaccine 8:17．1990;U. S．4,603,112およびU.S．4,769,330;WO 89/01973)(ATCC VR-111;ATCC VR-2010); SV40(Mulliganら，Nature 277:108，1979)(ATCC VR-305)，(Madzakら，J．Gen． Vir．73:1533，1992);インフルエンザウイルス(Luytjesら，Cell 59:1107，1989 ;McMichealら，The New England Journal of Medicine 309:13，1983;およびYap ら，Nature 273:238，1978)(ATCC VR-797);パルボウイルス、例えばアデノ随伴 ウイルス(Samulsklら，J．Vir．63:3822，1989，およびMendelsonら，Virology 166:154，1988)(ATCC VR-645)；単純ヘルペスウイルス(Kitら，Adv．Exp．Med． Biol．215:219，1989)(ATCC VR-977;ATCC VR-260);Nat ure 277:108，1979);ヒト免疫不全ウイルス(EPO 386,882，Buchschacherら，J． Vir．66:2731，1992);麻疹ウイルス(EPO 440,219)(ATCC VR-24);A(ATCC VR-67;A TCC VR-1247)，アウラ(Aura)(ATCC VR-368)，ベバル(Bebaru)ウイルス(ATCC VR- 600;ATCC VR-1240)，Cabassou(ATCC VR-922)，Chikungunyaウイルス(ATCC VR-64 ;ATCC VR-1241)，Fort Morgan(ATCC VR-924)，Gethaウイルス(ATCC VR-369;ATCC VR-1243)，Kyzylagach(ATCC VR-927)，Mayaro(ATCC VR-66)，Mucamboウイルス( ATCC VR-580;ATCC VR-1244)，Ndumu(ATCC VR-371)，Pixunaウイルス(ATCC VR-37 2;ATCC Vr-1245)，Tonate(ATCC VR-925)，Triniti(ATCC VR-469)，Una(ATCC VR- 374)，Whataroa(ATCC VR-926)，Y-62-33(ATCC VR-375)，O'Nyongウイルス、東部 (Eastern)脳炎ウイルス(ATCC VR-65;ATCC VR-1242)，西部(Western)脳炎ウイル ス(ATCC VR-70;ATCC VR-1251;ATCC VR-622;ATCC VR-1252)，およびコロナウイル ス(Hamreら，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．121:190，1966)(ATCC VR-740)由来の ものを包含する。 本発明のサブゲノムhuBUB1ポリヌクレオチドはまた、凝集剤と組み合わされて 遺伝子送達ビヒクルを形成し得る。好適な実施態様では、凝集剤はポリカチオン 、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペル ミン、スペルミジン、およびプトレシンである。このような結合を作製するため の多くの適切な方法が当該分野で公知である(例えば、出願番号08/366,787、199 4年12月30日出願を参照のこと)。 別の実施態様では、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドはリポソームと会合し て、遺伝子送達ビヒクルを形成する。リポソームは小さな脂質小胞であり、水性 コンパートメントが脂質二重層で包囲されて構成され、典型的には直径数百オン グストロームの球状か、またはわずかに細長い構造である。適切な条件下では、 リポソームは細胞の原形質膜、または細胞中のエンドサイトーシス小胞の膜に融 合し得、これはリポソームをインターナライズし、それにより内容物が細胞質中 に放出される。しかし細胞表面に対する相互作用の前には、リポソーム膜は比較 的不透過性のバリアとして作用し、このバリアはその内容物を例えば分解酵素か ら隔離および保護する。さらに、リポソームは合成構造なので、所望の特徴を取 り入れた特別に工作されたリポソームが生成され得る。Stryer，Biochemistry， 236-240頁，1975(W.H．Freeman，San Francisco，CA);Szokaら，Biochim．Bioph ys，Acta 600:1，1980;Bayerら，Biochim．biophys．Acta．550:464，1979;Rivn ayら，Meth．Enzymol．149:119，1987;Wangら，PNAS 84:7851，1987，Plantら， Anal．Biochem．176:420，1989，および米国特許第4,762,915号を参照のこと。 リポソームは、本発明で開示するようなhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを含 む、DNA、RNA、プラスミド、および発現構築物を包含する種々の核酸分子をカプ セル化し得る。 本発明で使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性(正荷電)、アニオン 性(負荷電)、および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、プラス ミドDNA(Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7416，1987)、mRNA( Maloneら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:6077-6081，1989)、および精製され た転写因子(Debsら，J．Biol.Chem．265:10189-10192，1990)の機能性形態での 細胞内送達を仲介することが示されている。カチオン性リポソームは容易に入手 可能である。例えば、N[1-2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリエチル アンモニウム(DOTMA)リポソームは、商品名LipofectinでGIBCO BRL，Grand Isla nd，NYから入手可能である。Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5148- 5152．87，1994もまた参照のこと。他の市販のリポソームとしては、Transfecta ce(DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE(Boerhinger)が挙げられる。他のカチオン性リ ポソームは容易に入手可能な物質から当該分野で周知の技術を用いて調製され得 る。例えば、Szokaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:4194-4198，1978;およ びDOTAP(1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポ ソームの記載に関してはWO 90/l1092参照のこと。 同様に、アニオン性および中性のリポソームが、例えばAvanti Polar Lipids( Birmingham，AL)から容易に入手可能であり、あるいは容易に入手可能な物質か ら容易に調製され得る。このような物質としては、とりわけホスファチジルコリ ン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファ チジルコリン(DOPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジオレ オイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が挙げられる。これらの物質はま たDOTMAおよびDOTAP出発物質と適切な比率で混合され得る。これらの物質を用い るリポソームの作成方法は、当該分野で周知である。 リポソームは、多重層小胞(MLV)、小さな単層小胞(SUV)、または大きな単層小 胞(LUV)を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体が当該分野で公知の方法を 用いて調製され得る。例えば、Straubingerら、METHODS OF IMMUNOLOGY(1983)， 第101巻、第512-527頁;Szokaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:3410-3414，1 990;Papahadjopoulosら，Biochim．Biophys．Acta 394:483，1975;Wilsonら，Ce ll 17:77，1979;DeamerおよびBangham，Biochim．Biophys．Acta 443:629，1976 ;Ostroら，Biochem．Biophys．Res．Commun．76:836，1977;Fraleyら，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 76:3348，1979;EnochおよびStrittmatter，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 76:145，1979;Fraleyら，J．Biol．Chem．255:10431，1980;Szoka およびPapahadjopoulos，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:145，1979;ならびにS chaefer-Ridderら，Science 215:166，1982参照のこと。 加えて、リポタンパク質をhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドと共に細胞への 送達のために含め得る。このようなリポタンパク質の例としては、カイロミクロ ン、HDL、IDL、LDL、およびVLDLが挙げられる。これらのタンパク質の変異体、 フラグメント、または融合物もまた用いられ得る。天然に存在するリポタンパク 質の改変、例えば、アセチル化LDLもまた用いられ得る。これらのリポタンパク 質は、ポリヌクレオチドのリポタンパク質レセプターを発現する細胞への送達を 標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質がポリヌクレオチドと共に含まれる ならば、他の標的化リガンドは組成物中に含まれない。 他の実施態様では、裸のhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチド分子を、WO 90/11 092および米国特許第5,580,859号に記載のように、遺伝子送達ビヒクルとして用 いる。このような遺伝子送達ビヒクルはhuBUB1DNAまたはRNAのいずれかであり得 、そして、特定の実施態様では、死菌アデノウイルスに連結される。Curielら， Hum．Gene．Ther．3:147-154，1992。他の適切なビヒクルとしては、DNA−リガ ンド(Wuら，J．Biol．Chem．264:16985-16987，1989)、脂質−DNAコンビネーシ ョン(Felgnerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413 7417，1989)、リポソー ム(Wangら，Proc．Natl．Acad．Sci．84:7851-7855，1987)および微粒子銃(micr oprojectiles)(Williamsら，Proc．Natl．Acad．Sci．88:2726-2730，19 91)が挙げられる。 裸のhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドの細胞内への取り込みの効率は、ポリ ヌクレオチドを生分解性ラテックスビーズにコートすることによって増大させ得 る。このアプローチは、ラテックスビーズが、培養において細胞と共にインキュ ベートされた場合、細胞の核周囲領域に効率よく輸送および濃縮されるという知 見を利用する。このビーズは次に、筋肉内に注入されると細胞中に輸送される。 huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドコートラテックスビーズは、エンドサイトー シスがラテックスビーズにより開始された後に効率よく細胞中に輸送され、その ため遺伝子の移入および発現効率を増大させる。この方法は、ビーズを処理して その疎水性を増大させ、それによりエンドソームの破壊およびhuBUB1サブゲノム ポリヌクレオチドの細胞質中への放出を促進することによって、さらに改善し得 る。 huBUB1またはhuBUB3活性は、細胞中で、細胞をhuBUB1またはhuBUB3それぞれの 発現産物に結合する試薬と接触させることによって減少され得る。本発明の1つ の実施態様では、試薬はリボザイム、すなわち触媒活性を有するRNA分子である 。例えば、Cech，Science 236:1532-1539;1987:Cech，Ann．Rev．Biochem．59:5 43-568;1990，Cech，Curr．Opin．Struct．Biol．2:605-609;1992，Coutureおよ びStinchcomb，Trends Genet．12:510-515，1996。リボザイムを用いて、RNA配 列を切断して、当該分野で公知のように、遺伝子機能を阻害し得る(例えば、Has eloffら、米国特許第5,641,673号)。 huBUB1またはhuBUB3遺伝子のコード配列を用いて、huBUB1またはhuBUB3遺伝子 から転写されるmRNAに特異的に結合するリボザイムを生成し得る。他のRNA分子 をトランスで高度に配列特異的な様式で切断し得るリボザイムを設計および構築 する方法が、当該分野で開発および記載されている(Haseloff，J.ら，Nature 33 4:585-591，1988参照のこと)。例えば、リボザイムの切断活性を、不連続の「ハ イブリダイゼーション」領域をリボザイム中に設計することにより、特定のRNA に標的化し得る。ハイブリダイゼーション領域は、標的RNAに相補的な配列を含 み、そのためその標的に特異的にハイブリダイズする(例えば、Gerlachら、EP 3 21,201参照のこと)。配列番号1および3に示されるヌクレオチド配列は、適切 なハイブリダイゼーション領域配列の供給源を提供する。より長い相補的配列を 用いて、ハイブリダイゼーション配列の標的に対する親和性を増大させ得る。リ ポザイムのハイブリダイゼーションおよび切断領域は、不可欠的に関連する。従 って、標的RNAを相補的領域を通じてハイブリダイズすると、リボザイムの触媒 的領域は標的を切断し得る。 リボザイムは、当該分野で公知であり、かつ上記のように、細胞中にDNA構築 物の一部として導入され得る。機械的方法、例えば、マイクロインジェクション 、リポソーム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン 酸カルシウム沈降を用いて、上記のように、リボザイム含有DNA構築物をhuBUB1 またはhuBUB3の発現を減少させることが望まれる細胞中に導入し得る。あるいは 、細胞がDNA構築物を安定に保持することが所望の場合には、これは、当該分野 で公知のように、プラスミド上に供給され、そして別の要素として維持され、あ るいは細胞のゲノム中に組み込まれ得る。DNA構築物は、転写調節エレメント、 例えばプロモーターエレメント、エンハンサーまたはUASエレメント、および転 写ターミネーターシグナルを細胞中のリボザイムの転写を調節するために含む。 Haseloffらの米国特許第5,641,673号に教示のように、リボザイムは、リボザ イム発現が標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答して生じるように、操作され 得る。リボザイムはまた、mRNAの破壊がリボザイムおよび標的遺伝子の両方が細 胞中で誘導された場合にのみ生じるようにさらなるレベルの調節を提供するよう に操作され得る。 本発明の他の実施態様において、huBUB1またはhuBUB3遺伝子発現のレベルは、 アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を用いて低減される。アンチセンス配列は 、配列番号1または3に示されるヌクレオチド配列から選択されるhuBUB1またはhu BUB3をコードする配列の少なくとも一部に対して相補的である。好ましくは、ア ンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、少なくとも11ヌクレオチド長であるが、 少なくとも12、15、20、25、30、35、40、45、または50以上のヌクレオチド長で あり得る。より長い配列もまた用いられ得る。アンチセンスオリゴヌクレオチド 分子はDNA構築物中に提供され得、そして、上記のように細胞中に導入されて、h uBUB1またはhuBUB3の細胞中でのレベルを低下させる。 アンチセンスオリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオ チド、または両方の組み合わせであり得る。オリゴヌクレオチドは、手動で、あ るいは自動合成機によって、1つのヌクレオチドの5’末端を他のヌクレオチドの 3’末端と、非ホスホジエステルのヌクレオチド間結合、例えば、アルキルホス ホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオ エート、アルキルホスホネート、ホルホルアミデート、ホスフェートエステル、 カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、 およびホスフェートトリエステルで共有結合することにより合成され得る。Brow n，Meth．Mol．Biol．20:1-8，1994;Sonveaux，Meth．Mol．Biol．26:1-72，199 4;Uhlmannら、Chem．Rev．90:543-583，1990参照。 正確な相補性は、アンチセンス分子と、huBUB1またはhuBUB3遺伝子の相補的な コード配列との間の二重鎖形成の成功には必ずしも必要ではないが、ミスマッチ が1つしかないアンチセンス分子が好ましい。当業者は、アンチセンス-センス対 の計算された融点を容易に用いて、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特 定のコード配列との間で許容され得るミスマッチングの度合いを決定し得る。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、huBUB1またはhuBUB3コード配列にハイブ リダイズするその能力に影響を与えること無く改変され得る。これらの改変はア ンチセンス分子の内部、あるいは一端または両端に存在し得る。例えば、ヌクレ オシド内ホスフェート結合は、アミノ基および末端リボースとの間の種々の数の 炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を付加することによって改変 され得る。改変された塩基および／または糖、例えば、リボースの代わりのアル ビノース、または3’ヒドロキシル基または5’ホスフェート基が置換sれた3’， 5’-置換オリゴヌクレオチドもまた、改変されたアンチセンスオリゴヌクレオチ ドにおいて使用され得る。これらの改変されたオリゴヌクレオチドは当該分野で 周知の方法で調製され得る。例えば、Agrawalら，Trends Biotechnol．10:152-1 58，1992;Uhlmannら，Chem．Rev．90:543-584，1990;Uhlmannら，Tetrahedron． Lett．215:3539-3542，1987参照のこと。 huBUB1に特異的に結合する本発明の抗体、特に一本鎖抗体はまたhuBUB1のレベ ルを変更するために用いられ得る。同様にhuBUB3に対して調製される抗体はhuBU B3のレベルを変更するために用いられ得る。これらの抗体はhuBUB1およびhuBUB3 が結合することを妨げる。本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドは 上記のように細胞中に導入され得る。 好ましくは、huBUB1またはhuBUB3発現のレベルを減少させるために用いられる 機構は、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、または抗体のいず れであれ、遺伝子発現のレベルを少なくとも50％、60％、70％、または80％低減 させる。より好ましくは、遺伝子発現のレベルを少なくとも90％、95％、99％、 または100％低減させる。遺伝子発現のレベルの低減のために選択される機構の 有効性は、当該分野で周知の方法、例えばヌクレオチドプローブのhuBUB1または huBUB4 mRNAへのハイブリダイゼーション、定量的RT-PCR、あるいは本発明の特 異的抗体を用いたhuBUB1またはhuBUB4タンパク質の検出を用いて評価され得る。 huBUB1またはhuBUB3抗体、リボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを含む組成物は任意に、薬学的に受容可能な担体を含み得る。薬学的に受容可 能な担体は当該分野で周知である。このような担体としては、これらに限定され ないが、大きな、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖類 、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、お よび不活性ウイルス粒子が挙げられる。薬学的に受容可能な塩もまたhuBUB1また はhuBUB3組成物で用いられ得る。例えば、無機塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩 、リン酸塩、または硫酸塩、ならびに、有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオ ン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩である。huBUB1またはhuBUB3組成物はま た液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノール、ならびに 湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤のような物質を含み得る。リポソーム、例えば 、米国特許第5,422,120号、WO 95/13796、WO 91/14445、またはEP 524,968 B1に 記載のようなリポソームもまたhuBUB1組成物の担体として用いられ得る。 典型的には、huBUB1またはhuBUB3組成物は注射用として、液体溶液または懸濁 液のいずれかとして調製される。しかし、液体ビヒクルの中での溶液または懸濁 液に適した固体形態もまた調製され得る。huBUB1またはhuBUB3組成物は腸溶性コ ーティング錠剤またはゲルカプセルに、当該分野で公知の方法、例えば米国特許 第4,853,230号、EP 225,189、AU 9,224,296、およびAU 9,230,801に従って処方 され得る。 huBUB1における変異は新形成の診断となる。本発明の診断法によれば、野生型 huBUB1遺伝子の減少が検出される。減少は欠失および／または点変異事象に帰因 し得る。単一のhuBUB1対立遺伝子のみが変異した場合、初期新生物状態が示され 得る。しかし、両方の対立遺伝子が変異した場合は、後期の新生物状態が示され 得る。点変異事象は調節領域、例えばhuBUB1遺伝子のプロモーターで生じ得、hu BUB1 mRNAの発現の欠失または減少へと至る。これはhuBUB1発現の定量のための アッセイを用いて決定され得る。 組織におけるhuBUB1野生型遺伝子の欠失の検出のためには、周囲の正常組織を 含まない組織を単離することが有用である。組織調製物を腫瘍(またはガン)細胞 に関して濃縮する手段が当該分野で公知である。例えば、組織をパラフィンまた はクリオスタット切片から単離し得る。ガン細胞はまた正常細胞からフローサイ トメトリーによって分離され得る。正常細胞から腫瘍を分離するためのこれらの 技術ならびに他の技術が当該分野で周知である。腫瘍組織に正常細胞がたくさん 混入していると、変異の検出がより困難になる。 点変異の検出は、腫瘍組織中に存在するhuBUB1対立遺伝子(単数または複数)の 分子クローニング、およびこの対立遺伝子を当該分野で周知の技術を用いて配列 決定することによって達成され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応または他 の増幅技術を用いて、huBUB1遺伝子配列を腫瘍組織由来のゲノムDNA調製物から 直接増幅し得る。増幅された配列のDNA配列を次に決定する。ポリメラーゼ連鎖 反応自体は当該分野で周知である。例えば、Saikiら，Science，239，487，1988 ;米国特許第4,683,195号参照。huBUB1遺伝子を増幅するために用いられ得る特異 的プライマーは後に詳述する。 huBUB1遺伝子の特異的欠失もまた検出され得る。例えば、huBUB1遺伝子または 周囲のマーカー遺伝子についての制限フラグメント長多型(RFLP)プローブを用い て、huBUB1対立遺伝子の減少を評価し得る。当該分野で公知の欠失を検出する他 の技術が用いられ得る。 野生型huBUB1遺伝子の減少はまた、huBUB1遺伝子の野生型発現産物の減少に基 づいて検出され得る。このような発現産物は、mRNAならびにhuBUB1発現産物自体 の両方を包含する。点変異は、mRNAを直接配列決定するか、mRNAから作製される cDNAを分子クローニングすることによって検出され得る。クローン化cDNAの配列 は、当該分野で周知のDNA配列決定技術を用いて決定され得る。cDNAはまたポリ メラーゼ連鎖反応PCR)によって配列決定され得る。これは後で詳述する。 あるいは、ミスマッチの検出を用いてhuBUB1遺伝子またはそのmRNA産物中の点 変異が検出され得る。これらの技術は配列決定よりも感度が低いが、より単純で あり、多数の腫瘍に対して行われる。ミスマッチ切断技術の例はRNase保護法で あり、これは詳細がWinterら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82，7575(1985) およびMeyerら，Science 230,1242(1985)に記載される。本発明の実施において 、この方法は標識されたリボプローブの使用を伴い、このリボプローブはヒト野 生型huBUB1遺伝子に対して相補的である。リボプローブ、および腫瘍組織から単 離されたmRNAまたはDNAのいずれかをアニール(ハイブリダイス)して、それと同 時に、あるいはその後に酵素RNase Aで切断される。この酵素は二重鎖RNA構造中 のミスマッチを検出し得る。ミスマッチがRNaseAでによって検出されたなら、こ れはミスマッチの部位を切断する。従って、アニールされたRNA調製物が電気泳 動ゲルマトリックス上で分離される場合、ミスマッチがRNase Aで検出および切 断されたならば、全長二重鎖RNAよりもリボプローブおよびhuBUB1 mRNAまたはDN Aについて小さいRNA産物が観察される。リボプローブはhuBUB1 mRNAまたは遺伝 子の全長である必要はないが、いずれかのセグメントであり得る。リポプローブ がhuBUB1 mRNAまたは遺伝子のセグメントのみを含むのであれば、これらのプロ ーブの多くを用いてmRNA配列全体をミスマッチについてスクリーニングすること が望ましい。 同様のやり方で、DNAプローブを用いて、酵素的または化学的切断を通じて、 ミスマッチを検出し得る。例えば、Cottonら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85. 4397(1988)およびShenkら，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72.，989(1975 )参照。あるいは、ミスマッチはミスマッチ二重鎖のマッチ二重鎖に対する電気 泳動の移動度のシフトによって検出し得る。例えば、Cariello，Human Genetics 42，726(1988)参照のこと。リボプローブまたはDNAプローブのいずれかで、変 異を含むかも知れない細胞mRNAまたはDNAは、PCRまたは他の増幅技術を用いるハ イブリダイゼーションの前に、当該分野で公知のように、増幅され得る。 増幅された腫瘍組織由来のhuBUB1遺伝子のDNA配列はまた、対立遺伝子特異的 プローブを用いてスクリーニングされ得る。これらのプローブは核酸オリゴマー であり、その各々が既知の変異を含むhuBUB1遺伝子配列の領域を含む。例えば、 1つのオリゴマーは、huBUB1遺伝子配列の一部に対応して少なくとも約15、18、2 0、30、または50ヌクレオチド長であり得る。このような一連の対立遺伝子特異 的プローブを用いて、増幅産物がスクリーニングされて、huBUB1遺伝子中の予め 同定された変異の存在が同定され得る。対立遺伝子特異的プローブの増幅された huBUB1配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロンフィルター上で行 われ得る。特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、腫瘍組織中に対 立遺伝子特異的プローブにおけるのと同様の変異が存在することを示す。 野生型huBUB1遺伝子の減少はまた野生型huBUB1タンパク質機能の減少のスクリ ーニングによっても検出され得る。huBUB1タンパク質が疑う余地なく有する全て の機能が解明されているわけではないが、少なくとも2つの特異的機能が公知で ある。タンパク質huBUB1はhuBUB3に結合する。huBUB1タンパク質がhuBUB3に結合 する能力の減少は、タンパク質中の変異的変化を示し、これはhuBUB1遺伝子自体 の変異的変化を反映する。同様に、huBUB1のキナーゼ活性の減少が変異の検出手 段としてモニターされ得る。あるいは、huBUB1機能に関与するエピトープがモノ クローナル抗体または一本鎖抗体で表される、モノクローナル抗体または一本鎖 抗体のパネルを用い得る。パネル中のモノクローナル抗体に対するhuBUB1の結合 の減少または動揺はhuBUB1タンパク質の変異的変化、従ってhuBUB1遺伝子自体の 変異的変化を示す。変化したhuBUB1タンパク質を検出するための任意の手段を用 いて、野生型huBUB1遺伝子の減少が検出され得る。 変異huBUB1遺伝子または遺伝子産物はまた、体試料、例えば血清または糞便、 あるいは他の体液、例えば尿および痰の中で検出され得る。組織中の変異huBUB1 遺伝子または遺伝子産物の検出について上で述べたのと同様の技術を他の体試料 に適用し得る。このような体試料をスクリーニングすることにより、単純な初期 診断が多くのタイプのガンに関して達成され得る。さらに、化学治療の進行が、 このような体試料を変異huBUB1遺伝子または遺伝子産物に関して試験することに よってより容易にモニターされ得る。 新生物組織の診断のための本発明の方法は広範囲な腫瘍にわたって適用可能で ある。これらの腫瘍としては、肺、胸部、脳、結腸直腸、膀胱、間葉、前立腺、 肝臓ならびに胃の腫瘍が挙げられる。さらに、この方法は白血病および骨肉腫に おいて用いられ得る。従って、huBUB1遺伝子は広範囲の腫瘍の発生において役割 を保有するように思われる。本発明の診断方法はhuBUB1が腫瘍形成において役割 を果たす任意の腫瘍に適用可能である。本発明の診断方法は、適切な処置のコー スを決定し得るので臨床家に有用である。例えば、野生型huBUB1対立遺伝子の減 少を示す腫瘍は有糸分裂毒タイプの化学治療をしさする。腫瘍中の野生型huBUB1 は他のタイプの抗ガン治療を用いるべきであることを示唆する。 本発明はまた診断キットを提供する。本発明のキットはhuBUB1遺伝子のヌクレ オチド配列をポリメラーゼ連鎖反応または他の増幅技術を用いて決定するために 有用である。キットは、1つまたは1セットの一本鎖DNAプライマー対を含み、こ れはhuBUB1遺伝子自体のDNA合成の増幅をプライムするために、huBUB1遺伝子内 またはその周囲の配列にアニールし得る。完全なセットはhuBUB1遺伝子コード配 列のヌクレオチドの全ての合成を可能にするが、選択された部分についての単離 されたプライマーもまた用いられ得る。プライマーのセットはイントロンおよび エクソン配列の両方の合成を可能としてもよく、しなくてもよい。しかし、これ は全てのエクソン配列の合成を可能とすべきである。 増幅された配列の引き続いてのクローニングを促進するために、プライマーは 5’末端に付加した制限酵素部位を有し得る。従って、プライマーの全てのヌク レオチドがhuBUB1配列またはhuBUB1に隣接する配列に由来するが、制限酵素部位 を形成するのに必要とされる数個のヌクレオチドは例外である。このような酵素 および部位は当該分野で周知である。プライマー自体は当該分野で周知の技術を 用いて合成され得る。一般に、プライマーは市販の合成機を用いて作製され得る 。好適な実施態様では、プライマー対は以下を含む：TWS86(5’ATCATTCATGGAGAC ATTAAGCC-3’)(配列番号5)およびTWS87(5’-TTTCATGTAAGAGCCAAAGAGCAT-3’)(配 列番号6)。 本発明によるヌクレオチドプローブは少なくとも約10、12、14、16、18、20、 25、または30個の連続するhuBUB1のヌクレオチドを含む。これらはまた標識され た部分を含み得、これによりプローブは検出され得る。これは放射標識、蛍光標 識、および酵素標識を含むがこれらに限定されない。本発明で提供されるヌクレ オチドプローブはRNase保護方法において、既に上で述べた点変異の検出のため に有用である。プローブはまた、他の技術を用いてhuBUB1遺伝子またはmRNAとの ミスマッチを検出するために用いられ得る。ミスマッチは、他の酵素(例えば、S 1ヌクレアーゼ)、化学物質(例えば、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウ ムおよびピペリジン)、またはミスマッチのハイブリッドを全体としてマッチの ハイブリッドと比べた電気泳動の移動度の変化を用いて検出され得る。これらの 技術は当該分野で公知である。Cotton(前出)；Shenk(前出)；Myers(前出)；Wint er(前出)；およびNovackら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83，586(1986)参 照。リボプローブを用いてmRNAとのミスマッチを検出するならば、これはヒト野 生型huBUB1遺伝子のmRNAに対して相補的である。従ってリボプローブは、huBUB1 タンパク質をコードしないという点でアンチセンスプローブである。なぜなら、 これはセンス鎖と反対の極性だからである。リボプローブは通常放射活性標識さ れる。このような標識化は当該分野で公知の任意の手段で行われ得る。リボプロ ーブを用いてDNAとのミスマッチを検出するならば、これは極性、センスまたは アンチセンスのいずれかであり得る。同様に、DNAプローブもまたミスマッチの 検出に用いられ得る。プローブはまたhuBUB1の変異対立遺伝子に対して相補的で あり得る。これらのプローブは他の患者における同様の変異をミスマッチよりも むしろハイブリダイゼーションに基づいて検出するために有用である。これらの プローブは上で述べられ、対立遺伝子特異的プローブとよぶ。 ガンまたは新形成に対する遺伝的素因はヒトの正常組織を試験することによっ て確認され得る。例えば、遺伝的に生殖系列のhuBUB1変異を受け継いだ人はガン を発症しやすい。この素因はその人の身体の任意の組織由来のDNAを試験するこ とによって決定され得る。最も単純には、血液を採血し、そして血液の細胞から DNAを抽出する。点変異、欠失、または挿入による野生型huBUB1対立遺伝子の減 少は、上記の任意の手段によって検出され得る。DNAはまた胎児組織からこの目 的で抽出および試験され得る。 本発明によれば、野生型huBUB1機能を、変異huBUB1対立遺伝子を保有する細胞 に供給する方法が提供される。遺伝子が染色体外に残留するように、ベクター中 の野生型huBUB1遺伝子または遺伝子の一部をベクター中の細胞に導入し得る。こ のような状況では、遺伝子は染色体外の位置から細胞によって発現される。遺伝 子の一部を、変異huBUB1対立遺伝子を保有する細胞中に導入し、かつその中で発 現させる場合、遺伝子部分は細胞の非新生物増殖に必要とされるhuBUB1タンパク 質の一部をコードするべきである。非新生物増殖に必要なhuBUB1タンパク質の一 部は、例えば、huBUB1タンパク質の一部を含むDNA発現構築物（例えば、huBUB3 結合ドメインまたはキナーゼドメイン）を新生物細胞系中にインビトロでトラン スフェクトし、そして細胞形態における変化、または細胞分裂速度の低下を観察 することにより、当該分野で公知のように、容易に決定され得る。 より好適なのは、野生型huBUB1遺伝子またはその一部が細胞中に存在する内因 性変異huBUB1遺伝子と組換えられるように変異細胞中に導入される状態である。 このような組換えは二重の組換え事象を必要とし、その結果huBUB1遺伝子の変異 が補正される。組換えおよび染色体外での維持のために遺伝子を導入するベクタ ーは当該分野で公知であり、そして任意の適切なベクターが用いられ得る。 huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドまたはポリペプチドあるいはhuBUB1活性を 有する他の分子を含む組成物を、変異huBUB1対立遺伝子を保有する細胞に供給し 得る。活性分子は、注射、経口投与、粒子銃、またはカテーテルによる投与を包 含する局所(local)投与または全身投与、ならびに局所(topical)投与によって細 胞中に導入される。あるいは、このような活性分子のいくつかは、能動的に、あ るいは拡散により、細胞に取り込まれ得る。 種々の方法を用いてhuBUB1治療組成物を直接身体の特定の部位に投与し得る。 腫瘍の処置のためには、例えば、適切なhuBUB1組成物が数回、腫瘍の本体内の異 なる数ケ所に注入される。あるいは、腫瘍に供給される動脈を同定し得、そして 組成物を腫瘍に供給するためにhuBUB1組成物をこのような動脈に注入し得る。 壊死中心を有する腫瘍を吸引し得、そしてhuBUB1組成物は空になった脛腫の中 心に直接注入され得る。huBUB1組成物はまた、例えば組成物の局所投与により、 腫瘍の表面に直接投与され得る。X線画像化を用いてこれらの送達方法のうちの 特定のものを補助し得る。huBUB1タンパク質またはポリペプチドまたはhuBUB1サ ブゲノムポリヌクレオチドを含む治療剤の組み合わせを、同時あるいは系列的に 、他の治療剤と共に投与し得る。 huBUB1組成物は、レセプターで仲介される標的化された送達を用いて特定の組 織に送達され得る。レセプター仲介DNA送達技術は、例えば、Findeisら，Trends in Biotechnol．11，202-05，(1993);Chlouら，GENE THERAPEUTICS:METHODS AN D APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER(J．A．Wolff編)(1994);Wu &Wu，J．B iol．Chem.263，621-24，1988;Wuら、J．Biol．Chem．269，542-46，1994;Zenke ら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87，3655-59，1990;Wuら，J．Biol．Chem ．266，338-42，1991に教示される。 特定のhuBUB1組成物の用量およびその組成物の投与手段の両方が、huBUB1組成 物の具体的な質、状態、年齢、および患者の体重、処置される個別の疾患の進行 、および他の関連の因子に基づいて決定され得る。組成物がhuBUB1タンパク質、 ポリペプチド、または抗体を含むならば、組成物の有効用量は患者の体重1kg当 たり約5μgから約50μgの範囲、1kg当たり約50μgから約5mg、患者の体重1kg当 たり約100μgから約500μg、そして1kg当たり約200μgから約250μgである。 huBUB1サブゲノムポリヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび リボザイム−または抗体コード配列を包含する)を含む組成物は、局所投与でDNA 約100ngから約200mgの範囲で投与され得る。適切な濃度範囲は約500ngから約50 ・g、約1μgから約2mg、約5μgから約500μg、そして約20μgから約100μgのDNA である。作用方法ならびに形質転換および発現の効力のような因子が考慮され、 これはhuBUB1組成物の最終的な効力に必要とされる用量に影響を与える。広範囲 の組織にわたってより高い発現が所望されるならば、より多量のhuBUB1組成物ま たは同量を連続的に投与すること、あるいは数回の投与を異なる例えば腫瘍部位 の隣接または近接組織部分に行うことが、正の治療結果を与えるために必要とさ れ得る。全ての場合において、臨床試行のルーチンの実験により至適な治療効果 の具体的な範囲が決定される。 内因性huBUB1遺伝子の細胞における発現は、内因性huBUB1遺伝子にインフレー ムで、huBUB1標的化配列、調節配列、エキソン、および不対のスプライスドナー 部位を含むDNA構築物を、相同的組換えによって、新規なhuBUB1転写単位を含む 相同的組換え細胞が形成されるように導入することによって変更され得る。この 新規な転写単位を用いて、huBUB1遺伝子を所望に応じて働かせたり、働かせない ようにしたりし得る。内因性遺伝子発現に影響を与えるこの方法は米国特許第5, 641,670号に教示され、これは本明細書中に参考として援用される。 標的化配列は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列から選択される少なく とも10、12、15、20、または50個の連続するヌクレオチドのセグメントである。 転写単位は内因性huBUB1遺伝子のコード配列の上流に位置する。外因性調節配列 がhuBUB1遺伝子のコード配列の転写を指示する。 本発明はまた、huBUB1キナーゼ活性を低下または阻害する能力、あるいはhuBU B1−huBUB3結合を妨害する能力について試験化合物をスクリーニングする方法を 提供する。試験化合物は当該分野で既知の薬理学的薬剤であり得、あるいは以前 まで薬理学的活性を有することが未知であった化合物であり得る。化合物は天然 に存在するものであり得、あるいは研究室で設計されたものであり得る。これら は微生物、動物、または植物から単離され得、そして組換え的に産生されるか、 または当該分野で公知の化学的方法によって合成され得る。 huBUB1タンパク質は自己リン酸化反応におけるhuBUB1キナーゼ活性の標的であ る。huBUB1依存性リン酸化はhuBUB1タンパク質に限定されず、外因性基質に対し て成功裡に向けられ得る。従って、huBUB1キナーゼ活性を、huBUB1の生化学的イ ンヒビターの同定を指向するスクリーニングアッセイの開発で使用し得る。huBU B1キナーゼインヒビターを用いて、ガンおよび他の過剰増殖障害、例えば乾癬に 対する新規な治療アプローチを開発し得る。スクリーニングアッセイは他のキナ ーゼ基質、例えば短縮型huBUB1ポリペプチド、融合タンパク質、合成ペプチド、 またはhuBUB1に関連しない基質を使用し得る。これらの代替のhuBUB1キナーゼ基 質は特定の属性(費用、使用の容易さ、相対効力)を有し得、そのためキナーゼ活 性のモニターの手段として、huBUB1自己リン酸化の使用よりもこれらの基質を使 用することを望ましくし得る。あるいは、所与のタンパク質のhuBUB1キナーゼ基 質としての活性の知見は、huBUB1に関連する診断および／または治療的適用のた めの新規標的の発見における適用を有する。例えば、キナーゼのクローン化基質 を発現する細菌および／またはファージのクローンを同定する特定の既知のキナ ーゼの生化学的活性を使用する、処理能力の高いフィルターベースのライブラリ スクリーニングアプローチを用いて、huBUB1キナーゼの生物学的に関連する基質 を同定し得る。これらのクローン化基質は、スクリーニングアッセイおよび／ま たは薬学的標的のさらなる開発において特徴付けおよび利用され得る。 例えば、huBUB1またはhuBUB1−huBUB3複合体のキナーゼ活性を低下させる化合 物を、huBUB1またはhuBUB1−huBUB3複合体を試験化合物に接触させ、そしてhuBU B1またはhuBUB1−huBUB3複合体のキナーゼ活性を決定することによって、同定し 得る。当該分野で公知の任意のインビトロキナーゼアッセイ、例えばWO 96/3664 2で教示のようなアッセイをこの目的に用い得る(実施例7も参照のこと)。huBUB1 自体または配列番号2で示されるhuBUB1配列に基づく合成ペプチド基質、または キナーゼ基質（例えば、PHAS-1）のような基質のリン酸化が測定され得る。必要 に応じて、基質は検出可能な標識、例えばビオチンを、精製または分離工程での 使用のために含み得る。huBUB1またはhuBUB1−huBUB3複合体のキナーゼ活性を低 下させる試験化合物を候補治療剤として同定する。 試験化合物はまた、細胞中のhuBUB1および／またはhuBUB3機能を阻害を指向す る薬剤を開発するために、huBUB1−huBUB3結合を妨害する能力についてスクリー ニングされ得る。このようなインヒビターは例えば、ポリペプチド、小ペプチド 、ペプトイド、または他のペプチドアナログまたは他の化学インヒビターであり 得る。これらのインヒビターのいくつか、例えば関連のペプチドまたは融合タン パク質は、本明細書に開示されるhuBUB1およびhuBUB3の配列の知見に基づいて合 理的に開発され得る。あるいは、化合物のランダムアレイはhuBUB1−huBUB3結合 アッセイにおける競合能力についてスクリーニングされ得る。 試験化合物を、huBUB3タンパク質および配列番号2に示されるhuBUB1アミノ酸 配列から選択される連続配列の混合物と接触させ得る。これらの分子は組換え的 に産生され得、あるいは標準的な化学的方法を用いて合成され得る。タンパク質 は、試験化合物の接触工程の前に予め結合され得る。あるいは、試験化合物を、 第2のタンパク質を加えるまえにタンパク質の1つと接触させ得る。 タンパク質は溶液中にあり得、または1つのタンパク質は固体支持体と結合し 得る。このタンパク質は、標識されていなくてもよく、または、例えば、放射活 性、蛍光、もしくは他の検出可能なマーカーで標識されていてもよい。これらは 、検出可能な酵素活性を有するかまたは有さない他のタンパク質と融合したhuBU B1またはhuBUB3を含む融合タンパク質であり得る。 1つの実施態様では、試験化合物の存在下で結合または未結合の2つのタンパク 質のうちの少なくとも1つの量が次に測定される。多くの方法が、タンパク質ま たは二量体の量を測定するために用いられ得る。例えば、結合または未結合のタ ンパク質の相対濃度は、分子の見かけの分子量を、サイズ排除クロマトグラフィ ーまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動で、非還元条件下で試験することによ って検出され得る。タンパク質の結合または解離を測定する他の方法は、当業者 に容易に想起され、そして用いられ得る。第2のタンパク質に結合する第1のタン パク質の量を低減させる試験化合物、または第2のタンパク質に結合する第1のタ ンパク質を置換する試験化合物、または第1のタンパク質が第2のタンパク質に結 合するのを妨げる試験化合物が治療剤の候補として同定される。 本発明に従って、酵母ツーハイブリッド技術を用いて、huBUB1−huBUB3結合を 妨害する試験化合物をスクリーニングする方法もまた提供される。酵母ツーハイ ブリッド技術は一般的にFields，S．およびSong，O.，Nature 340，245-46，198 9に教示される。 好ましい実施態様では、細胞を試験化合物に接触させる。細胞は2つの融合タ ンパク質を含み、これは組換えDNA構築物の手段によって細胞に供給され得る。 第1の融合タンパク質はDNA結合ドメインを含む。第2融合タンパク質は転写活性 ドメインを含む。第1の融合タンパク質はまた、(i)huBUB3に結合するhuBUB1の少 なくとも一部、または(ii)huBUB1に結合するhuBUB3の少なくとも一部のいずれか を含む。第1の融合タンパク質がhuBUB3に結合するhuBUB1の少なくとも一部を含 む場合、第2の融合タンパク質はhuBUB1に結合するhuBUB3の少なくとも一部を含 む。第1の融合タンパク質がhuBUB1に結合するhuBUB3の少なくとも一部を含む場 合、第2の融合タンパク質はhuBUB3に結合するhuBUB1の少なくとも一部を含む。 細胞はまた、第1の融合タンパク質のDNA結合ドメインが結合するDNAエレメント の下流のDNA配列を含むレポーター遺伝子を含む。 huBUB3およびhuBUB1領域が互いに結合する場合、DNA結合ドメインおよび転写 活性化ドメインは、十分近くに近接して、細胞中に検出可能なレポーター遺伝子 の転写を開始し得る転写アクチベーターを再構成する。試験化合物の存在下での レポーター遺伝子の発現を次に測定する。レポーター遺伝子の発現を増大させる 試験化合物は、huBUB1−huBUB3結合を増加させるための潜在的な薬物である。レ ポーター遺伝子の発現を減少させる試験化合物は、huBUB1−huBUB3結合を減少さ せる潜在的な薬物である。 多くのDNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインがこの系で用いられ得、こ れはGAL4、LexA、およびヒトエストロゲンレセプターのDNA結合ドメインがGAL4 または単純ヘルペスウイルスタンパク質VP16の酸性転写活性化ドメインと対にな ったものを含む(例えば、G.J．Hannonら，Genes Dev．7，2378，1993;A.S.Zervo sら，Cell 72，223．1993;A.B．Votjetら、Cell 74，205，1993;J.W．Harperら ，Cell 75，805，1993;B．Le Douarinら，Nucl．Acids Res．23，876，1995を参 照のこと)。当該分野で公知の多くのプラスミドが、DNAを操作するための標準的 な研究室の技術を用いて、融合タンパク質のコード配列を含むように構築され得 る(例えば、以下の実施例1を参照のこと)。 適切な検出可能なレポーター遺伝子は、E.coli lacZ遺伝子(この発現は比色的 に測定され得る(例えば、FieldsおよびSong、前出を参照のこと))、および酵母 の選択可能な遺伝子、例えば、HIS3(Harperら、前出；Votjetら、前出；Hannon ら、前出)またはURA3(Le Douarinら、前出)を含む。細胞を形質転換する方法も また当該分野で周知である。例えば、A.Hinnenら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S .A．75，1929-1933，1978を参照のこと。試験化合物は細胞培養培地の一部を含 み得、または別々に添加され得る。 本発明はまた、代謝インヒビターに対する腫瘍の感受性を増大させる方法を提 供する。微小管の機能を必要とするプロセスである正常細胞の分裂は、高度に制 御された細胞下成分(特に染色体および紡錘体)の分離を含む。正常細胞において 、微小管毒の存在は、これらの成分の分離の前に細胞分裂を停止する。このよう にして、細胞は、この分離の正常の忠実度に影響し得る条件下でこれらの成分の 分離を試みることを抑制する。 huBUB1(および／またはこの経路で機能することが知られる他の遺伝子、例え ばhuBUB3)を欠く変異細胞では、適切な微小管機能を感知するシグナル伝達経路 が存在しない。従って、これらの薬物で処置される変異細胞は、細胞サイクルの 進行の調節ができない。この場合、細胞分裂は細胞下成分の適切な分離なしに起 こり、そして子孫細胞は遺伝物質のランダムな画分(無から全部までの範囲)を受 け継ぎ得、そして1つか、無しか、または両方の紡錘体を受け継ぎ得る。子孫細 胞が、染色体の相補物を完全より少なく保持し、かつ紡錘体無しまたは2つの紡 錘体を保持する場合、得られる細胞は、必須の遺伝子の減少を通じて、紡錘体の 欠損を通じて、またはその後の多極的有糸分裂のカタストロフィー的効果を通じ て、死滅する運命にある。この現象は「有糸分裂的カタストロフィー(mitotic c atastrophe)」と呼ばれる。 有糸分裂的カタストロフィーを利用して、ガン細胞に対する抗腫瘍剤の細胞障 害性効果を公知の微小管毒まで増大させ得る。詳細には、huBUB1および機能的に 関連の遺伝子(例えばhuBUB3)における変異は、微小管毒に対する細胞の相対感度 を決定し得る。ヒトにおいて、huBUB1および／または他の遺伝子の変異状態は、 ガンの化学療法における微小管毒による処置の相対的な細胞障害性効果を決定し 得る。このような効果は、微小管毒で仲介されるガンの化学療法における部分的 な応答と完全な寛解との間の差異を説明し得る。現時点では、ガン化学療法にお ける微小管毒による腫瘍の細胞障害の正確な機構は比較的よくは理解されていな い。huBUB1および／または他の遺伝子の不活性化を用いて多くの腫瘍の微小管毒 、例えばビンブラスチン、タキソール、ビンクリスチン、およびタキソテールに 対する相対的感受性を増大させ得る。huBUB1変異細胞を含む腫瘍のこれらの薬剤 による処置は、細胞下成分の有糸分裂的分離の全体としての失敗を誘導し、これ により深刻な細胞障害性を生じる。対照的に、非変異細胞の処置は一過性の細胞 サイクルの遅延を誘導し得、処置の終止の後、この遅延から細胞は即時に回復し 得る。従って、huBUB1の変異状態を決定して、どのような化学療法レジメを用い るべきかを示し得る。例えば、野生型huBUB1は微小管毒に対する耐性を与えるの で、腫瘍におけるhuBUB1の中の変異の知見はこのような薬剤を有効に利用してそ の腫瘍を処置し得ることを示す。対照的に、野生型huBUB1の知見は他の薬剤の使 用を 示唆する。 本発明はまた、新形成またはその症状の処置のための新規の化学療法レジメを 提供し、ここでhuBUB1遺伝子の野生型コピーを有する腫瘍細胞を誘導して、微小 管インヒビターの存在下で致死的な有糸分裂的カタストロフィー効果を受けさせ 得る。これはhuBUB1および／またはhuBUB3機能の１つ以上の生化学的インヒビタ ー、ならびに１つ以上の微小管毒を投与することによって達成され得る。huBUB1 および／またはhuBUB3のインヒビターは、huBUB1変異細胞で遺伝子的に見いださ れるのと類似のhuBUB1機能の一時的な減少を生じさせ、それにより微小管毒に直 面したときに細胞サイクルの適切な調節の失敗が生じる。有糸分裂の分離の失敗 の結果生じる細胞毒性はhuBUB1変異細胞で見られるものと対応し、huBUB1／huBU B3インヒビターを除去すると、細胞は遺伝子的に安定な状態に戻るというさらな る利点を有する。このようにして、この経路の一時的な阻害を用いて、微小管毒 の化学療法的な効力に対するhuBUB1機能の減少の通常の必要条件を利用し得る。 huBUB1またはhuBUB3インヒビターは、例えば、キナーゼスクリーニングアッセ イにより、またはhuBUB1−huBUB3結合による妨害により、本明細書に記載される ように、同定され得る。インヒビターは、所望されるように、微小管毒と共に、 別々に、または連続的に添加され得る。本明細書に記載されるhuBUB1／huBUB3生 化学的インヒビターを含む化合物のクラスは通常のガン化学療法のアジュバント として用いられることが期待される。従って、処置された細胞は、癌細胞で共通 に観察される構成的な遺伝子の不安定性を発現するとは予測されない。一時的に huBUB1／huBUB3インヒビターで処置された細胞は、処置を停止した後、遺伝子的 に安定な状態に戻ることが予測される。 本発明の他の局面によれば、潜在的薬物が、huBUB1タンパク質の発現または機 能を抑制する能力による抗ガン剤としての用途に関してスクリーニングされ得る 。従って、潜在的薬物を細胞と接触させ、そしてhuBUB1 mRNAまたはタンパク質 の発現をモニターし得る。これは当該分野で周知の技術、例えばノーザンブロッ ト、免疫沈降、免疫ブロットなどによって達成され得る。ヒトhuBUB1核酸プロー ブまたはヒトhuBUB1タンパク質に対して特異的な抗体を利用する任意の技術が用 いられ得る。他の技術、例えば定量的RT PCRもまた使用され得る。加えて、イン ビト ロ技術が、候補薬物がhuBUB1キナーゼ活性またはhuBUB3への結合を阻害する能力 を試験するために利用され得る。このようなアッセイは、一旦huBUB1遺伝子およ びタンパク質の全配列を提供したなら、十分に当該分野の範囲内である。さらに 、酵母ツーハイブリッド系を用い得、ここでパートナーのうちの一方はhuBUB1の 全てまたは一部を含み、そしてパートナーの一方はhuBUB3の全てまたは一部を含 む。これらのパートナーの両方を含む細胞を試験化合物と接触させ得、そしてレ ポーター遺伝子のトランス活性化の欠失または減少をモニターし得る。 huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドはまた、試験化合物を、huBUB1サブゲノム ポリヌクレオチドの細胞への移動を増強するのに有用なもの、またはその後の細 胞内のhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドの生物学的効果を増強するのに有用な ものに関してスクリーニングする目的で被験体に送達され得る。このような生物 学的効果は、相補的huBUB1 mRNAに対するハイブリダイゼーションおよびその翻 訳の阻害、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドが発現してhuBUB1 mRNAおよび／ またはhuBUB1タンパク質を形成すること、およびhuBUB1サブゲノムポリヌクレオ チドの複製および組み込みを包含する。被験体は細胞培養物または動物、好まし くは哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。 スクリーニングされ得る試験化合物は、天然産物または合成のいずれかの、被 験体に投与し得る、任意の物質を包含する。化合物のライブラリーまたは混合物 が試験され得る。この化合物または物質は薬学的効果が既に既知または未知のも のであり得る。この化合物または物質は、huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドの 前、後、または同時に送達され得る。これらは別々に投与され得、またはhuBUB1 サブゲノムポリヌクレオチドとの混合物で投与され得る。 送達されたhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドの組み込みは当該分野で公知の 任意の手段でモニターされ得る。例えば、送達されたhuBUB1サブゲノムポリヌク レオチドのサザンブロッティングが行われ得る。送達されたポリヌクレオチドの フラグメントのサイズの変化は、組み込みを示す。送達されたポリヌクレオチド の複製は、とりわけhuBUB1プローブへのハイブリダイゼーションと組み合わせた 標識ヌクレオチドの取り込みの検出によってモニターされ得る。huBUB1サブゲノ ムポリヌクレオチドの発現は、送達されたポリヌクレオチドにハイブリダイズす るhuBUB1 mRNAの産生の検出によって、またはhuBUB1タンパク質を検出すること によってモニターされ得る。huBUB1タンパク質は免疫学的に検出され得る。従っ て、本発明によるhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドの送達は、huBUB1サブゲノ ムポリヌクレオチドの細胞への移動を、送達、組み込み、ハイブリダイゼーショ ン、発現、複製またはインビトロでの細胞中もしくは動物、好ましくは哺乳動物 、より好ましくはヒトへの組み込みを増強することによって、増強する能力につ いて、試験化合物をスクリーニングするための優れた系を提供する。 以下の実施例は例示のみの目的で提供され、上記で広範囲な用語で記載された 本発明の範囲を限定することを意図しない。実施例1 この実施例は、huBUB1をコードするヒトcDNA配列の単離を示す。 huBUB1のヒトcDNA配列を決定した(配列番号1参照)。この配列に対応する完全 なmRNAをノーザンブロッティングによって試験し、そして約3.5kbの長さである ことが見いだされた。このmRNAは約1000アミノ酸のタンパク質をコードするに充 分な長さである。単離されたcDNAの予想される翻訳産物はタンパク質キナーゼド メインを含む。このヒト遺伝子配列はユニークであり、現在までのところ、公開 されたデータベースにおいてヒト配列の相同性サーチを用いてもマッチは同定さ れていない。実施例2 この実施例は、huBUB1がhuBUB3との複合体として存在することを示す。 市販のベクタ−pCR3.1(Invitrogen)に基づく4つのプラスミドを構築した。こ れらのプラスミドは、野生型huBUB1(p385-1)、キナーゼモチーフ中にジヌクレオ チド置換を有し、その結果アミノ酸821のリジンからアラニンに置換するhuBUB1( p403-1；図1参照)、野生型huBUB3(p291-20、およびエピトープをタグ化したFLAG -huBUB3改変体タンパク質(p221-2)にれは、FLAGエピトープの3つのコピー、次い でhuBUB3のORFの5’末端に対して適切なリーディングフレームで融合したグリシ ンリンカー領域をコードする)をコードする。 グリシンリッチのATP結合ループおよび活性部位リジンを含む領域を図1に示す 。 保存されたアミノ酸残基(*)および類似する残基(.)が示される。huBUB1遺伝子の この領域には5つの活性部位リジン残基の候補がある。マウスおよびS．cerevisi ae遺伝子との比較、ならびにこれらのhuBUB1リジン残基の局所アミノ酸の状況に 基づいて、huBUB1キナーゼモチーフ中のリジン821(...VLKQV...)(配列番号7)を 、重複PCR戦略を用いて部位持異的変異誘発の標的とした。リジン821をコードす るAAAコドンを重複PCRによって、リジンの代わりにアラニンを特定するAGCコド ンで置換した。次いで、変異体DNAフラグメントを用いて、p385-1中の対応のフ ラグメントを置換した。得られたプラスミドをp403-1と呼ぶ。 次いで、これらのプラスミド上でコードされる遺伝子のタンパク質産物を、市 販のカップリングされた転写／翻訳キット(T7 TnTキット、Promega)を用いて、^{3 5} S標識メチオニン(Amersham)の存在下、または放射活性標識なしの反応中でイン ビトロで産生した。15μlの反応混合物は、150ngのhuBUB1野生型または変異体プ ラスミドおよび60ngのhuBUB3またはFLAG-huBUB3プラスミドを含んでいた。他の 成分を製造者が推奨するように添加した。カップリングされた転写／翻訳反応を 2時間、30℃で、TNES緩衝液(50mM Tris 7.5、100mM NaCl、2mM EDTA、1％NP-40) を添加してインビトロでのタンパク質合成反応を停止させる前に進行させた。全 ての緩衝液には1mMのDTTを補充した。 翻訳混合物のアリコートを、アガロースビーズ(Kodak)と結合体化した抗FLAG モノクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。翻訳混合物を遠心分離によって明 澄化し、そして可溶性画分を、100μlの最終容量中で、予め結合緩衝液(TNES)で 洗浄した9μlの免疫ビーズと共に1時間室温でインキュベートした。ビーズを短 時間の遠心分離によって採集し、そして系列的に洗浄して非結合物質を除去した 。ビーズを結合緩衝液(TNES)中で2回洗浄し、2MのNaClを補充したNP-40を欠くTN ES(TNE)中で2回洗浄し、そしてEDTAを欠きかつ10mMのMgCl₂を補充したTNE緩衝液 で2回洗浄した。 ビーズを短時間の遠心分離で採集した。次にビーズを10μlのSDS-PAGE試料緩 衝液中に再懸濁し、そして短時間、95℃まで加熱して、会合したタンパク質を遊 離させた。溶出物を10〜20％のSDS-PAGEゲル(Novex)にロードした。1時間200Vで の電気泳動の後、ゲルをクーマシー脱染溶液で固定し、そしてWhatmanの3mmクロ マトグラフィー紙上でオートラジオグラフ分析の前に乾燥した。 ³⁵S-標識された反応混合物をゲル上でインキュベートして、種々のプラスミド 産物の合成の相対効率を示した。同様のレベルの標識タンパク質がこれらの実験 で用いた種々のプラスミドによって産生されていた。抗FLAG抗体ビーズを用いた 免疫沈降(IP)の後、FLAG−huBUB3およびhuBUB1物質の両方がビーズによって保持 された。FLAG-huBUB3を欠くIPペレットでは比較的少量のhuBUB1が一貫して観察 された。 これらの結果はFLAG-huBUB3とhuBUB1との間の会合を示す。弱く会合したタン パク質は2MのNaCl洗浄によって除去されるので、huBUB1およびFLAG-BUB3の両方 の抗FLAGアガロースビーズによる保持は、これらの成分間の高親和性の相互作用 を示すようである。FLAG-BUB3の非存在下での低レベルのhuBUB1の沈降は、低レ ベルのタンパク質の凝集がアッセイの後期に生じることを示すようである。なぜ なら、同様のレベルが抗FLAGイムノビーズを欠く偽の免疫沈降反応で検出され得 るからである。³⁵S-標識huBUB1リジン-821からアラニンへの変異体タンパク質も またFLAG-huBUB3で効率的に共免疫沈降し、このアミノ酸がhuBUB1とFLAG-BUB3と の相互作用には不必要であることを示す。実施例3 この実施例はhuBUB1の自己リン酸化、およびリジン821がhuBUB1キナーゼ活性 に必要であることを示す。 未標識のインビトロでの転写／翻訳反応を並行して調製し、免疫沈降させ、そ してさらに³³P-ATPキナーゼ基質と共にインキュベートした。未標識の転写／翻 訳反応由来の洗浄したビーズを採集し、そして25μlの最終容量中で、最終洗浄 緩衝液(EDTAを欠き、10mM MgCl₂を補充したTNE緩衝液)に10nMの³³P-標識ATP(1反 応当たり1μCi)を補充したものの中でさらにインキュベートした。室温で0.5時 間後、過剰のTNE緩衝液を加えて反応を停止した。 野生型huBUB1がFLAG-huBUB3と同時翻訳された場合、SDS-PAGEゲルにおける相 対移動度が、huBUB1の相対移動度と同一の³³P-標識バンドが検出され、これは野 生型huBUB1がキナーゼ基質であることを示唆した。FLAG-huBUB3を省略すると有 意な³³P-標識物質の検出に失敗する結果となった。huBUB1はFLAG-BUB3の非存在 下 であまり免疫沈降しないので、これは標識バンドがhuBUB1翻訳産物を表すことを 示す。同様に、huBUB1リジン-821からアラニンの変異体を含む反応におけるhuBU B1バンドの非存在は、この反応におけるリン酸化の失敗を示す。 この結果は、観察されたリン酸化活性がhuBUB1キナーゼモチーフ中にリジン-8 21を必要とすることを示す。この結果は、観察されたhuBUB1リン酸化活性がFLAG -huBUB3／huBUB1複合体と共免疫沈降するキナーゼの混入に起因するという可能 性を排除する。実施例4 この実施例は、huBUB1自己免疫化活性の必要条件を示す。 種々の実験を用いて、この自己リン酸化活性の必要条件(種々のNaCl、MgCl₂、 ATP、KCl、pHおよび時間を包含する)を規定した。huBUB1キナーゼは種々の条件 下で自己リン酸化し得る。別の免疫沈降プロトコルを用いて実験を行った。この プロトコルではHA-エピトープタグをhuBUB1のN末端に導入した。そして複合体が 抗HAモノクローナル抗体およびプロテインGアガロースビーズ(BMB)を用いて沈降 された。HA-huBUB1タンパク質もまた自己リン酸化し得る。huBUB3の同時翻訳は この自己リン酸化活性を刺激し得る。この結果は、huBUB3の会合によるキナーゼ の生化学的活性化、あるいはhuBUB3同時翻訳によるhuBUB1折り畳みの効率の改善 を表し得る。同様の結果が、エピトープタグ化戦略とは独立して得られたので、 本発明者らは、huBUB1のhuBUB3に対する親和性および観察されたhuBUB1の自己リ ン酸化活性は無関係のアーチファクトによるものではないと結論した。実施例5 この実施例は、潜在的なhuBUB1自己リン酸化部位の同定を示す。 未標識のインビトロで合成されたhuBUB1／FLAG-BUB3物質の少量をスケールア ップ反応で産生し、そして免疫沈降で精製した。huBUB1はATPの存在下で自己リ ン酸化した。DTTを含むSDS-PAGE試料緩衝液中で加熱することによりタンパク質 をビーズから溶離し、そして10〜20％のSDS-PAGEゲル(Novex)上で分離した。ゲ ルをクーマシーブルーで染色した。 淡いhuBUB1およびFLAG-huBUB3のバンドが相対移動度により同定され、そしてh uBUB1に対応するバンドをゲルから切り出した。このゲルスライスのタンパク質 をトリプシンを用いて分解し、そして得られたペプチドフラグメントをエレクト ロスプレー質量分析によって分析した。 断片化パターンがロイシンおよび／またはイソロイシンの存在に一致する種が 検出され得、これらのうちのいくつかは、huBUB1 DNA配列データから予期される ように、huBUB1トリプシンフラグメントの予想される質量に一致し得る。これら のペプチドの中で、断片化パターンがホスフェートの存在を示唆するサブセット が同定され得、これはhuBUB1ペプチドRVITISK(配列番号2のアミノ酸210-216)の 予想される質量に対応するペプチドを包含する。このペプチドを仮にhuBUB1自己 リン酸化の部位として同定する。huBUB1タンパク質配列は公知の混合機能キナー ゼに類似し、これはセリン、スレオニンまたはチロシンをリン酸化し得る。従っ て、実際のリン酸化残基(reside)は、huBUB1配列におけるスレオニン213または セリン215の改変を表し得、あるいはこれらの両方の残基の改変を表し得る。実施例6 この実施例はhuBUB1キナーゼ活性のインヒビターについてのスクリーニング方 法を示す。 公知の化合物のセットをインビトロhuBUB1キナーゼアッセイを用いてスクリー ニングした。試験化合物はオロムチン(olomucine)、ミレセチン(myrecetin)、ヒ ペリシン(hypericin)、ヨードツベルシジン(iodotubercidin)、エラグ酸、エモ ジン(emodin)、およびスタウロスポリンを含んだ。これらの化合物の公知のキナ ーゼに対する相対的特異性は文献に報告されている。これらの化合物のうちのい くつかは比較的特異的なキナーゼインヒビターとして分類されており(例えば、 オロムチン、ミレセチン、エラグ酸)、一方、他のインヒビターは広範囲のキナ ーゼを阻害することが知られる(例えば、ヒペリシン、ヨードツベルシジン、ス タウロスポリン)。 未標識のFLAG-BUB3／BUB1のインビトロでの翻訳産物を抗FLAGで免疫精製した 。³³P-ATPキナーゼ反応を、インヒビターの存在または非存在下で20μlの反応容 量で行った。標識された反応産物をSDS-PAGEゲル上で分離し、そして相対的なhu BUB1自己リン酸化をホスホルイメージャー(phosphorimager)の助けを借りて決定 した。初期スクリーニングは10および20μMの各化合物を用いて行った。このス ク リーニングで正の結果を示す化合物を次に5、10、および20μMで再び試験した( 表1)。 huBUB1キナーゼは明らかに、ヒペリシン、ヨードツベルシジン、およびスタウ ロスポリンで阻害された。これらの化合物は広範囲のキナーゼインヒビターとし て知られる化合物のクラスに入り、そして同様の濃度で多くのキナーゼを阻害す ることが知られる。これらの結果は、スクリーニングアッセイをhuBUB1キナーゼ の生化学的インヒビターの同定に対して用いることが成功であることを示す。実施例7 この実施例はhuBUB1キナーゼの基質を示す。 免疫精製されたFLAG-BUB3／BUB1 ³³P-ATPキナーゼの反応を、記載のように構 築し、20μlのキナーゼ反応当たり1μgの潜在的キナーゼ基質を加えた。huBUB1 を先に記載したhuBUB1-K821A変異体で置換した並行反応もまた行った。次に反応 産物をSDS-PAGEゲル上で分離し、そしてオートラジオグラフィーによて可視化し た。 試験されるタンパク質標的はPHAS-I(Strategene)、カゼイン、ミエリン塩基性 タンパク質(MBP)、ヒストンHI、およびGST-p53タンパク質を含む。これらのうち 、PHAS-Iのみがキナーゼ基質としての明白なhuBUB1依存的活性を示した。huBUB1 -K821A変異体タンパク質を含む反応は標識産物を産生せず、これはPHAS-Iのリン 酸化がhuBUB1活性を必要とすることを示す。 これらの結果は、huBUB1キナーゼ活性の決定における外因性基質の有用性を示 す。この結果は、小規模なスクリーニングをhuBUB1タンパク質基質の同定に対し て用い得ることを示し、huBUB1に関連する新規診断および治療用途のための新規 な標的の発見のための潜在的な用途を示す。 PHAS-I基質はhuBUB1自己リン酸化反応を妨害しないようであった。これはhuBU B1自己リン酸化反応がPHAS-Iリン酸化よりも効率がよいことを示し得る。これは huBUB1自己リン酸化が同じモノマーのキナーゼドメインによる個別のモノマーの リン酸化を通じて、相対的に効率的な一分子反応で生じる場合に起こり得る。あ るいはhuBUB1自己リン酸化は別々のhuBUB1モノマー間で起こり得、この場合、自 由に会合する外因性基質はhuBUB1リン酸化に関してより効率的に完了することが 期待され得る。実施例8 この実施例は、huBUB1および／またはhuBUB3に会合または結合するタンパク質 およびポリペプチドを同定するための小規模スクリーニングを示す。このスクリ ーニングは、huBUB1−huBUB3結合の低分子インヒビターの同定に容易に適合され 得、これはhuBUB1および／またはhuBUB3機能に対して指向される新規な薬剤を提 供し得る。このアッセイを用いて、本発明者らは、huBUB1のN-末端のサブドメイ ンをhuBUB3の会合に十分であるとして定義する。このドメインは、huBUB1−huBU B3相互作用アッセイにおける潜在的な阻害特性を有するペプチド配列の有用な供 給源として役立つ。 多くのhuBUB1コードプラスミドが産生された。プラスミドp385-1は全長huBUB1 をベクターpCR3.1(Invitorogen)中でコードし、これをさらなる構築物の骨格と して使用した。全ての構築物は、ベクターpCR3.1のクローン化部位のすぐ上流に 位置するバクテリオファージT7プロモーターを用いて、カップリングした(coupl ed)反応において転写および翻訳されるのに適した配向にあった。全長HAエピト ープがタグ化したhuBUB1プラスミドを構築し(p396-1)、これはトリプルHAタグ、 次いでhuBUB1 ATG開始部位に融合した6×グリシンリンカーをコードする。この プラスミドのC末端短縮型改変体もまた産生され、これはHA-BUB1 1-199(p365-2) (C末端から内部のhuBUB1 EcoRV部位までの欠失を表す)；HA-BUB1 1-400(p377-2) (N末端MIuNI huBUB1フラグメントを表す)；およびHA-BUB1 200-400(p365-1)(こ れはHAタグを内部EcoRV/MuNI BUB1フラグメントに融合する)をコードする構築物 を含む。これらの短縮型改変体はそのC末端にさらなるベクターコードペプチド 配列を含む。本明細書で記載される研究に用いられるさらなる構築物は、pCR3.1 に基づくヒトMAD2およびhu-rael発現プラスミド(それぞれ、p344-6およびp375-1 と称する)を包含し、これらは、その各々のGenbank登録(ヒトMAD2についてはHSR NAMADおよびHSU64510；hu-raelについては、HSU84720)に記載のように、これら の遺伝子に対するオープンリーディングフレーム(ORF)由来のPCR産物をクローニ ングすることによって産生される。 次いで、³⁵S−メチオニン標識タンパク質およびポリペプチドを、これらのプ ラスミドから、カップリングされたインビトロでの転写／翻訳反応(IVT)によっ て、上記のように産生した。IVT反応物を、抗FLAGアガロースビーズ(Kodak IBI) またはプロテインGビーズ(BMB)と合わせた抗HAモノクローナル抗体をいずれかを 用いて、免疫沈降(IP)した。ビーズを先に記載のように徹底的に洗浄して、非特 異的会合タンパク質の除去を確実にした。これは2M NaCl緩衝液中での比較的ス トリンジェントな洗浄を包含する。結合タンパク質を、試料をSDS試料緩衝液中 で加熱することによって遊離させ、そして10〜20％SDS-PAGEゲルで分析した。初 期³⁵S-標識翻訳反応物のアリコートも同様に分析した。 FLAG-BUB3と会合することが観察されるポリペプチドは、全長huBUB1、ならび にhuBUB1短縮型改変体のHA-BU1 200-400およびHA-BUB1 1-400を含んだ。FLAG-BU B3で保持されないタンパク質は、ヒトMAD2、タグ化されていないhuBUB3、および HA-BUB1 1-199を包含した。 実験の第2のセットを用いて、種々のポリペプチドのHA-BUB1 1-400に対する親 和性を示した。huBUB3およびFLAG-BUB3の両方がHA-BUB1 1-400に結合した。全長 huBUB1もヒトrael遺伝子の産物も、huBUB1のこのドメインとは会合しないことが 観察された。 huBUB1の短縮型改変体とFLAG-BUB3との、これらの比較的ストリンジェントな 条件下での会合は、HA-BUB1 200-400短縮型改変体に包含されるhuBUB1のN末端サ ブドメインがhuBUB3の認識に十分であることを示唆する。同様の結果が、HA-BUB 1 1-400短縮型改変体を独立して用いて、huBUB3およびFLAG-BUBを免疫沈降した 場合に得られ、これらのタンパク質間相互作用がIP方法とは独立して、観察され 得ることを示す。 2MのNaClでのIPの洗浄を省略すると、HA-BUB1 1-199のFLAG-BUB3によるいくら かの保持が検出され得た。FLAG-BUB3とHA-BUB1 1-199対HA-BUB1 200-400との比 較的弱い会合の観察ははいくらか驚きであった。S.cerevisiaeとhuBUB1配列との 整列は、huBUB1の最初の200アミノ酸中のドメインがこれらのタンパク質の間で 最も高度に保存されたアミノ酸配列のセグメントを保持することを示唆し、本発 明者らが最初に推定した保存ドメインが高親和性のhuBUB3相互作用を仲介するに 十分であることを定義する。比較的弱く保存された第2のhuBUB1ホモログが記載 されており(huBUB1R1;Cahillら，Nature 392:300-303)、そしてさらなるアミノ 酸配列の第2ドメインのhuBUB1とhuBUB1R1との間の相同性がN-末端の近くで同定 され、HA-BUB1 200-400構築物中で保持される配列に対応する。本発明者らは、h uBUB1のこの領域中のドメインは高親和性のhuBUB1−huBUB3会合に十分であるが 、さらなるタンパク質間接触がHA-BUB1 1-199構築物中に存在するドメインによ っておそらくなされるようであると結論づけた。 huBUB3は明らかにhuBUB1と会合するが、huBUB3はhuBUB1-FLAG-BUB3抗FLAG IP 複合体から排除された。この結果は、huBUB1複合体が単一のhuBUB3モノマーを保 持し、そしてhuBUB3が自由に自己会合しないことを示唆する。huBUB3が存在した 場合、FLAG-BUB3複合体中のhuBUB1の収率は低下した。この結果は、再現性良く 得られ、そしてhuBUB1との会合についての翻訳混合物中でのFLAG-BUB3とhuBUB3 との間の競合を示す。 HA-BUBl 1-400はBUB3の存在下で全長huBUB1と会合しない。全長HA-BUB1を用い る他の実験は、タグ化されていないhuBUB1が同様にHA-BUB1／BUB3抗HA IP複合体 から排除されたことを示した。次いで、これらの結果は、huBUB3複合体が単一の huBUB1モノマーを保持し、そして、huBUB1が自由に自己会合しないことを示唆す る。従って、本発明者らは、これらの実験で研究されたhuBUB1-huBUB3複合体が 各タンパク質の単一モノマーから構成されると結論づける。 hu-rae1翻訳産物とhuBUB1のhuBUB3結合ドメインとの会合もまた研究された。 相同性のサーチは、huBUB3およびhu-raelタンパク質の両方を、両タンパク質がS .cerevisiae BUB3に対して有意な相同性を示すという事実に基づいて、huBUB1の 候補リガンドとして同定した。本発明者らは、hu-raelタンパク質とhuBUB1との 間の有意な会合を検出可能とする条件は同定しなかった。hu-rae-1およびhuBUB3 の両方がほとんど排他的にWD40(trp-asp)繰り返しモチーフからなる。Hu-rae-1 はまた、S.pombe rael遺伝子およびS．cerevisiae YET7遺伝子に構造的に関連す る。これらはシグナル伝達動原体機能において役割を果たすことは報告されてい ない。 本発明者らはまた、ヒトMAD2遺伝子産物とhuBUB1およびhuBUB3との会合を研究 した。マウスBUB1およびヒトMAD2は各々ヒト動原体と会合することが示されてい る。huBUB1およびhuBUB3は過剰発現細胞中の分裂核に局在する。S.cerevisiae M AD2との強力な相同性は、同じ調節経路におけるヒトMAD2ホモログの機能を示唆 する。本発明者らは、ヒトMAD2とhuBUB1またはhuBUB3タンパク質との明確な複合 体が観察され得る条件は同定していない。この時点で、本発明者らは、いくつか の他の条件下でMAD2がhuBUB1および／またはhuBUB3と、直接、または他の未知タ ンパク質との三元複合体の形態のいずれかで、会合することを問題外となし得な かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ０７Ｋ 16/18 // Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 16/18 5/00 Ａ Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０７０，１８２ (32)優先日 平成９年12月30日(1997．12．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも85％同一であるアミノ酸配 列を含む、単離および精製されたhuBUB1タンパク質。 ２．配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも85％同一であるアミノ酸配 列から選択される少なくとも６個の連続するアミノ酸を含む、単離および精製さ れたhuBUB1ポリペプチド。 ３．ペプチド結合で互いに融合した第１のタンパク質セグメントおよび第２のタ ンパク質セグメントを含む融合タンパク質であって、ここで該第１のタンパク質 セグメントが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも85％同一である アミノ酸配列を有するhuBUB1タンパク質の少なくとも６個の連続するアミノ酸を 含む、融合タンパク質。 ４．huBUB1タンパク質に特異的に結合する抗体の調製物。 ５．配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも85％同一であるヌクレ オチド配列から選択される少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む、単離 および精製されたサブゲノムポリヌクレオチド。 ６．配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも85％同一であるヌクレ オチド配列から選択される少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む、単離 および精製されたサブゲノムポリヌクレオチドを含む、DNA発現構築物。 ７．配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも85％同一であるヌクレ オチド配列から選択される少なくとも10個の連続するヌクレオチドを含む、単離 および精製されたサブゲノムポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。 ８．ヒトの新生物組織の診断方法であって： ヒトから新生物であると疑われる組織を単離する工程； 野生型huBUB1遺伝子または野生型huBUB1遺伝子の発現産物の該組織からの減少 を検出する工程であって、ここで該野生型huBUB1遺伝子またはその発現産物の該 減少が該組織の新形成を示す、工程、 を包含する、方法。 ９．野生型huBUB1遺伝子の機能を、huBUB1遺伝子における変異によって該遺伝子 の機能を減少した細胞に供給する方法であって： 野生型huBUB1遺伝子の全部または一部を該遺伝子の機能を減少した細胞中に導 入する工程であって、ここで該野生型huBUB1遺伝子の一部は、該細胞の非新生物 性増殖に必要であり、これによって該野生型huBUB1遺伝子の全てまたは一部が該 細胞中で発現される、工程、 を包含する、方法。 １０．一対の一本鎖DNAプライマーであって、ここで該一対の一本鎖DNAプライマ ーがhuBUB1遺伝子コード配列の全てまたは一部を合成し得る、一対の一本鎖DNA プライマー。 １１．配列番号１で示される野生型huBUB1遺伝子に相補的な核酸プローブ。 １２．変異体huBUB1遺伝子に相補的な核酸プローブ。 １３．ヒトにおける新生物組織の存在を検出する方法であって： 身体サンプルをヒトから単離する工程；および 該身体サンプルにおいて変異体huBUB1遺伝子または発現産物を検出する工程で あって、ここで、変異体huBUB1遺伝子または発現産物の検出が該ヒトにおける新 生物組織の存在を示す、工程、 を包含する、方法。 １４．ヒトにおけるガンに対する遺伝的素因を検出する方法であって： 血液および胎児組織からなる群から選択されるヒトサンプルを単離する工程； DNAを該サンプルから抽出する工程；および 野生型huBUB1遺伝子の減少を該DNAから検出する工程であって、ここで該野生 型huBUB1遺伝子の減少の検出がヒトにおけるガンに対する遺伝的素因を示す、工 程、 を包含する、方法 １５．huBUB1−huBUB3結合を妨害する試験化合物を同定するための方法であって 、該化合物は候補治療剤であり： 第１のタンパク質、第２のタンパク質、および試験化合物を接触させる工程で あって、ここで該第１のタンパク質がhuBUB1に結合するhuBUB3の少なくとも一部 を含み、そして該第２のタンパク質がhuBUB3に結合するhuBUB1の少なくとも一部 を含み、または該第１のタンパク質がhuBUB3に結合するhuBUB1の少なくとも一部 を含み、そして該第２のタンパク質がhuBUB1に結合するhuBUB3の少なくとも一部 を含む、工程；ならびに 該第２のタンパク質に結合するか、該第２のタンパク質から置換されるか、も しくは該第２のタンパク質との結合を妨げられる該第１のタンパク質の量を決定 する工程、または該第１のタンパク質に結合するか、該第１のタンパク質から置 換されるか、もしくは該第１のタンパク質との結合を妨げられる該第２のタンパ ク質の量を決定する工程であって、ここで該第２のタンパク質に結合する該第１ のタンパク質の量もしくは該第１のタンパク質に結合する該第２のタンパク質の 量を低減させる化合物、または該第２のタンパク質に結合する該第１のタンパク 質もしくは該第１のタンパク質に結合する該第２のタンパク質を置換する化合物 、または該第１のタンパク質と該第２のタンパク質との結合を妨げる化合物が、 候補治療剤として同定される、工程、 を包含する、方法。 １６．huBUB3−huBUB1結合を妨げる化合物を同定する方法であって： 細胞を、huBUB1−huBUB3結合を阻害する能力について試験される化合物に接触 させる工程であって、ここで該細胞が(a)配列特異的DNA結合ドメインを含む第１ の融合タンパク質、(b)転写活性ドメインを含む第２の融合タンパク質、および( c)配列特異的DNA結合ドメインによって認識されるDNAエレメントの下流にレポー ター遺伝子を含むDNA構築物、を含み、ここで該第１の融合タンパク質は、huBUB 1タンパク質に結合するhuBUB3タンパク質の少なくとも一部をさらに含み、そし て該第２の融合タンパク質は、huBUB3タンパク質に結合するhuBUB1タンパク質の 少なくとも一部をさらに含むか、あるいは、ここで該第１の融合タンパク質は、 huBUB3タンパク質に結合するhuBUB1タンパク質の少なくとも一部をさらに含み、 そして該第２の融合タンパク質は、huBUB1タンパク質に結合するhuBUB３タンパ ク質の少なくとも一部をさらに含む、工程；ならびに 該化合物の存在下での該レポーター遺伝子の発現の量を決定する工程であって 、ここで該レポーター遺伝子の発現の量を減少させる化合物が候補治療剤として 同定される、工程、 を包含する、方法。 １７．huBUB1のキナーゼ活性を低減させる試験化合物を同定する方法であって： huBUB1タンパク質を試験化合物と接触させる工程；および 該huBUB1タンパク質のキナーゼ活性を決定する工程であって、ここで該huBUB1 タンパク質のキナーゼ活性を低減させる化合物が候補治療剤として同定される、 工程、 を包含する、方法。 １８．細胞中のhuBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを発現する方法であって： 該huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドを該細胞に送達する工程であって、それ により、該huBUB1サブゲノムポリヌクレオチドが発現される、工程、 を包含する、方法。