TW201114909A - Primers and kit of thrips identification and identification method for the same - Google Patents

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201114909 六、發明說明· 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種快速鑑定三種薊馬害蟲之引子 對、鑑定套組及其方法’且特別是有關於一種以聚合酶連 鎖反應快速鑑定薊馬害蟲之方法。 【先前技術】 薊馬是植物花朵、葉片或球根花卉的種球上常見的害 • 蟲，薊馬幼蟲及成蟲取食植物組織，造成花部及果實損害； 雌蟲產卵於植物組織内，常造成植物無法正常生長，作物 之品質及產量均受影響。為害花舟的薊馬大多產卵在植物 較幼嫩的部位’如新芽、幼葉、花瓣等組織内或表面上， 成蟲與幼蟲之外形與習性相似，其銼吸式口器可銼吸植物 組織’於花瓣上會造成花瓣脫色、圓形斑狀傷痕；於葉部 上會使葉片失去鮮綠而呈黃白色、形態皺縮畸形等。此外， 飼馬亦為蕃茄斑點萎凋病毒(T〇mat〇 spotted wiltvirus)等病 • 毒的主要傳播媒介。 莉馬幼蟲體形極小（約2 mm )’以傳統形態鑑定方式 鑑定15馬幼蟲極為困難，若欲飼養至成蟲則需五至七曰以 上。例如’西方花薊馬原產於美洲’危害的寄主植物種類 多且適應性強’隨著經貿往來頻繁以擴散到世界許多國 家’目前在許多國家都已存在並且常造成作物嚴重的危 害。西方花劍馬是台灣檢疫法規中的檢疫害蟲，於輸入切 花、蔬菜及鮮果中均曾檢出。目前已發展以分子生物學方 201114909 法LAMP技術檢測西方花薊馬，其反應的靈敏性可達ι〇〇 毫微微克，並可大帳縮短鑑定時間。然而，目前創馬的分 生鑑定研究多集中在西方花薊馬，其他薊馬種類的分生餘 定技術則仍待開發。 由於薊馬對於經濟作物之危害甚深，目前對於薊馬的 研究工作也持續在進行。然而薊馬種類眾多，且個體皆細 小且外觀相似，肉眼不易分辨，更增加了研究工作的困難 度0 •有鑑於此，需要發展更多且更快速且正確的鑑定方 法，來達到鑑定主要的薊馬害蟲之目的。 【發明内容】 因此，本發明之一態樣是在提供鑑定三種薊馬害蟲之 引子對，係選自具有如序列辨識號SEQIDNO:M4所示之 序列及上述序列之衍生序列。 依據本發明一實施例，一第一引子對組合包含三種引 • 子對組合，係選自SEQ ID ΝΟ:1-4所示序列之寡核苷酸引 子’可用以鑑別西方花薊馬。其中，引子對（A)由引子 FocclU5 ( SEQ ID NO: 1 )與引子 Focc2D5 ( SEQ ID NO:2 ) 組成；引子對（B)由引子F〇cclU5 (SEQIDNO:l)與引 子Focc3D ( SEQ ID NO:3)所組成；引子對（C)由引子 Focc3U ( SEQ ID NO:4 )與引子 Focc3D ( SEQ ID NO:3 ) 所組成。 依據本發明另一實施例，一第二引子對組合包含三種 201114909 引子對組合，係選自SEQ IDNO:5-10所示序列之寡核苷酸 引子，可用以鑑別台灣花薊馬。其中，引子對（D )由引 子 Fint2U ( SEQ ID NO:5 )與引子 Fint2D ( SEQ ID NO:6 ) 所組成；引子對（E)由引子Fint3U (SEQIDNO:7)與引 子Fint3D( SEQ ID NO:8 )所組成；引子對（F )由引子Fint4U (SEQIDNO:9)與引子 Fint4D(SEQIDNO:10)所組成。 依據本發明再一實施例，一第三引子對組合包含三種 引子對組合，係選自SEQIDNO:ll-14所示序列之寡核苷 φ 酸引子，可用以鑑別蔥薊馬。其中，引子對（G)由引子 Ttab971U ( SEQ ID NO: 11 )與引子 TtablD ( SEQ ID NO: 12 ) 所組成；引子對（H)由引子Ttab972U ( SEQ ID NO:13) 與引子TtablD (SEQ ID NO:12)所組成；引子對（I)由 引子 Ttab972U ( SEQ ID NO: 13 )與引子 Ttab974D ( SEQ ID NO:14)所組成。 本發明之另一態樣在於提供一種鑑定三種薊馬害蟲之 套組，包含第一引子對組合、第二引子對組合、第三引子 φ 對組合。第一引子對組合係選自SEQ ID ΝΟ:1與SEQ ID NO:2、及/或 SEQ ID ΝΟ:1 與 SEQ ID NO:3、及/或 SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:3 ;第二引子對組合係選自SEQ ID NO:5 與 SEQ ID NO:6、及/或 SEQ ID NO:7 與 SEQ ID NO:8、及/或 SEQ ID NO:9 與 SEQ ID NO:10 ;第三引子對 組合係選自SEQIDNO:ll與SEQIDNO:12、及/或SEQID NO:12 與 SEQ ID NO:13、及/或 SEQ ID NO:13 與 SEQ ID NO:14。 本發明之另一態樣在於提供一種鑑定三種薊馬害蟲之 201114909 方法，其包含下列步驟：（a)提供待測蟲體之基因體去氧 核醣核酸做為模版’ DNA模版的濃度以單隻莉馬萃取〇να 的1/50比例，約5ng ; (b)使用至少三對引子對或其衍生 序列進行聚合酶連鎖反應，所述之至少三對引子對係分別 選自第一引子對組合中之至少其中之一引子對、第二引子 對組合中之至少其中之一引子對及第三引子對組合中之至 少其中之一引子對；及（c)分析聚合酶連鎖反應增幅之片 段長度’藉由增幅出之目標核酸片段分子量大小，可快速 φ 鑑定三種薊馬科害蟲。 【實施方式】 本發明之實施方式係運用分子生物學技術，利用不同 蟲種於基因體分子層次上的差異，設計具有專一性之寡核 苷酸引子對’用以快速、準確鑑定不同薊馬害蟲。 本發明實施例使用莉馬染色體ITS2 ( intergenic spacer 2 ) DNA序列為模版，以引子Pi_2 (SEQIDNO : 15)及 鲁引子28SJ2 ( SEQ ID NO . 16)構成之引子對進行聚合酶連 鎖反應增幅’增幅出之片段以洋菜瓊脂電泳分離，並以回 收試劑純化模版DNA備用。模版DNA經由核酸自動定序 儀（Automatic sequencer)確定序列。 利用上述引子P1-2與引子28SJ2，增幅出西方花薊馬 (Frankliniella occidentalis)会灣庀蕺馬（Frankliniella )以及蔥萄馬（)三種不同薊馬之染色 體ITS2 DNA片段，並以核酸自動定序儀定序後之取得序 列，利用BioEdit程式軟體將各個分類單元的DNA序列放在 201114909 一起比對分析，並搜尋多個物種序列差異，設計西方花薊 馬、台灣花薊馬、蔥薊馬之專一性引子。第1圖為三種薊馬 之ITS2DNA序列比對圖；西方花薊馬、台灣花薊馬、蔥薊 馬之縮寫分別為Focc、Fint、Ttab。 利用不同薊馬之染色體ITS2 DNA片段序列差異，設 計可鑑定不同薊馬害蟲的專一性引子對，係選自具有如序 列辨識號SEQ ID NO: 1-14所示之序列及上述序列之衍生序 列。 • 依據本發明一實施例，一第一引子對組合包含三種引 子對組合，係選自SEQ ID ΝΟ:1-4所示序列之寡核苷酸引 子’可用以鑑別西方花薊馬。其中，引子對（A )之引子

FocclU5 (SEQIDNO:l)與引子 f0CC2D5 (SEQIDNO:2) 可於含西方花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出236bp的 片段（SEQIDNO:17);引子對（B)之引子 FocclU5 (SEQ IDNO:l)與引子Focc3D (SEQIDNO:3)可於含西方花莉 馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出243 bp的片段（SEQ ID 鲁 NO:18);引子對（C)之引子 Focc3U (SEQ ID NO:4)與 引子Focc3D (SEQ ID N〇:3)可於含西方花薊馬之去氧核 糖核酸樣本中增幅出l5〇bp的片段（SEqidn〇:19)。 依據本發明另一實施例，一第二引子對組合包含三種 引子對組合，係選自SEQ IDNO:5-10所示序列之寡核苷酸 引子，可用以鑑別台灣花薊馬。其中，引子對（D )之引 子 Fint2U ( SEQ ID NO:5 )與引子 Fint2D ( SEQ ID NO:6)

可於含台灣花®馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出M2bp的 片段（SEQIDNO:20);引子對⑻之引子Fint3u (SEQ 201114909 IDNO:7)與引子Fint3D (SEQIDNO:8)可於含台灣花莉 馬之去氧核糖核酸樣本中増幅出303 bp的片段（SEQ id NO:21 );引子對（F)之引子 Fint4U ( SEQ IDNO:9)與弓！ 子Fint4D (SEQIDNOilO)可於含台灣花薊馬之去氧核糖 核酸樣本中增幅出243 bp的片段（SEQ ID NO:22 )。 依據本發明再一實施例，一第三引子對組合包含三種 引子對組合’係選自SEQ ID ΝΟ:11-14所示序列之寡核苦 酸引子’可用以鑑別蔥薊馬。其中，引子對（G)之引子 φ Ttab971U ( SEQ ID NO: 11 )與引子 TtablD ( SEQ ID NO:12 ) 可於含蔥薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出420 bp的片段 (SEQ ID NO:23 );引子對（η )之引子 Ttab972U ( SEQ ID NO:13)與引子TtablD ( SEQ ID NO:12)可於含蔥薊馬之 去氧核糖核酸樣本中增幅出397 bp的片段（SEQ ID NO:24);引子對（I)之引子 Ttab972U (SEQ ID NO:13) 與引子Ttab974D(SEQIDNO:14)可於含蔥薊馬之去氧核 糖核酸樣本中增幅出346 bp的片段（SEQ ID NO:25)。 φ 因聚合酶連鎖反應本身之特性，引子與欲增幅之模版 間之序列即便存在變異性，仍可藉調節聚合酶連鎖反應中 黏合步驟之反應溫度而合成特定之DNA片段。故於本發明 所屬技術領域中具一般知識之人士根據本發明之揭示，即 可根據欲增幅之DNA片段設計不同之引子。因此，任何針 對本發明實施例所述之個別引子所為之鹼基置換、加入或 縮減所形成的引子，如其仍可與本發明實施例所述之相對 應引子組成引子對而增幅出包含SEQ ID NO : 17_25的特 定片段’皆不脫離本發明所欲保護之範圍。 201114909 ，因此’上述個別引子對中可包含於至少其令 3’端或5’端修飾核㈣序列’仍和原序列具有70%以上 相似性之寡核苦酸庠列· 。上 何生相）仍可與所屬引子財另1子（序列可 同:特㈣增幅包含本發明實施例所述之 ^ m相’且增幅後的特定片段序列與本發明竇 具有8。%以上相似性者’皆不脫離本發明 依縣發明之—實施方式，提供—種 =且’包含至少_5|子對，係選自於引子對⑷、= 對（Β)及引子對（C)。 之奎明之一實施方式’提供一種鑑定台灣花薊馬 =套組’包含至少1子對’係選自於引子對（d = 對（E)、引子對（F)。 丨子 依照本發明之-實施方式，提供一種鐘定惠莉馬之套 、、且’包含至少-引子對，係選自於引子對 及引子對⑴。 上述之鑑定西方花15馬、台灣花®馬及蔥I?馬之㈣ 更包含萃取待測蟲體染色體DNA所需之試劑；及/或進行 聚合酶連鎖反應所㈣的試劑；狀切行電泳分析所需要 之試劑，其中電泳分析包含但不限於填脂醣凝膠電 細管凝膠電泳。 本發明實施例之鑑別莉馬害蟲之方法，包含下列步驟： U)提供待測蟲體之基因體去氧核㈣酸做為模版， 待測蟲體體染色體DNA之萃取可藉由熟習項技術者所熟知 201114909 之方法而達成〇薊馬標本 莉馬則為國外之刮馬c要為台灣地區’而西方花 二不本。軚本浸泡在75%酒精内，置於 考触、^ 。®馬樣本去氧核核酸的萃取方法，參 fjirr)之方法略加修改而成或用市售之歷 dna之r所件的DNA溶液保存於-20 °C中備用，將溶出 期及地3馬外祕製作成玻#標本，在玻片上標示採集日 期及地點，做為存證標本。 取人#、使用引子對（A) _⑴進行聚合酶連鎖反應。 乂 α連鎖反應可藉由熟習項技術者所熟知之方法而達 成聚合酶連鎖反應通常包含三個步驟：（丨）使一模版 (template)進行變性’以形成兩單股；⑵使兩引子分別 與步驟（1)之兩股進行黏合；（3)卩DNA聚合酶延伸等 引子以取得兩雙股之DNA。重複循環上述之諸等步驟，而 一特定之DNA片段即可獲得擴增。一般而言，為使反應充 刀進行，通常於循環反應之前先進行一第一階段變性步驟。 依照本發明之一實施例，聚合酶連鎖反應條件為

95 C升溫2分鐘，之後以95°C 40秒、60°C 20秒、72°C 20 秒，進行35個循環，接著以72°C 10分鐘完成反應，反 應後之產物於4°C保存備用，聚合酶連鎖反應產物可用 以進行後續凝膠電泳分析。 (c)分析聚合酶連鎖反應增幅之片段長度，藉由增幅 出之目標核酸片段分子篁大小，可快速鑑定薊馬科害蟲。 依照本發明之另一實施例，在進行（b)步驟前，以引 子 Pl-2(SEQIDNO: 15)及引子 28SJ2(seqidn〇: 16) 構成之引子對進行聚合酶連鎖反應增幅薊馬染色體ITS2 201114909 DNA片段，增幅出之片段進一步回收純化，做為模版DNA。 本發明所例示之實例中，測試與西方花薊馬親緣關係相近 之薊馬共17種，包含台灣花薊馬小黃 範馬（Scirtothrips dorsalis)、玉米窥馬（Frankliniella williamsi)、 赤Ψ 範馬（Selenothrips rubrocinctus)、南廣範馬（Thrips palmi)、 版夠窥馬（Rhipiphorothrips cruentatus)、網故範馬屬（Helionothrips 印·）、棉紋薊馬cAae吨、板背薊馬屬沩φ 印·）、1毛薊馬屦（Stenchaetothripssp.)、籍、腹齒薊馬（Fulmekiola φ sermta)、菊花^丨馬（Microcephalothrips abdominalis)、反勤馬 (Thrips hawaiiensis)、褐尾包箾馬（Bolacothrips graminis)、黑魚 貝薊馬（如加扣me/am_corm；〇、蘭花馬（Z)⑽卿咖扣 ⑶冲邮·）、豆花薊馬（μ幻加ms )及尤加律莉馬 (Tflem·况/znjw ewc/^πϊ )。經聚合酶連鎖反應增幅後以瓊脂醣 凝膠電泳分析DNA片段大小，所有測試的非西方花薊馬及 空白組呈陰性反應。 本發明所例示之實例中，測試與台灣花薊馬親緣關係 •相近之薊馬共12種，包含玉米薊馬、赤帶薊馬、腹鉤薊馬、 直毛薊馬屬、蔗腹齒薊馬、菊花薊馬、褐尾包蓟馬、黑角貝薊馬、 蘭花S馬、尤加律,15馬、管尾亞目（Tubulifera)及薊馬屬（Thrips

Sp _)。經聚合酶連鎖反應增幅後以瓊脂醣凝膠電泳分析D N A 片段大小，所有測試的非台灣花薊馬及空白組呈陰性反應。 树明所例示之實例中’測試與m親緣關係相^ 之薊馬共17種，包含西方花薊馬、台灣花薊馬、小黃薊馬、玉 •關馬、赤帶,¾馬、南黃®馬、腹鉤15馬、觀齒莉馬’、菊花莉 馬、花薊馬、褐尾包薊馬、黑角貝薊馬、蘭花薊馬、尤加律薊馬·'·、 201114909 m 馬{Thrips alliorum)、稻蘇馬 iStenchaetothrips biformis) 及豆花薊馬。經聚合酶連鎖反應增幅後以瓊脂醣凝膠電泳分 析DNA片段大小，所有測試的非蔥薊馬及空白組呈陰性反 應。 由此可知本發明實施例之專一性引子對的靈敏度高且 具鑑別之特異性，可快速鑑別西方花薊馬、台灣花薊馬及 蔥薊馬，優於傳統形態鑑定之不確定性。 本發明之實施方式亦提供一種鑑定三種薊馬類害蟲之 φ 套組，其包含第一引子對組合、第二引子對組合及第三引 子對組合。其中，第一引子對組合包含至少一引子對，係 選自 SEQ ID NO: 1 與 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 1 與 SEQ ID NO:3、SEQIDNO:4與SEQIDNO:3及與上述個別引子之 衍生序列所組成之引子對。第二引子對組合包含至少一引 子對，係選自 SEQ ID NO:5 與 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 與 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 與 SEQ ID NO:10 及與上述 個別引子之衍生序列所組成之引子對。第三引子對組合包 Φ 含至少一引子對，係選自SEQIDN0:11與SEQIDNO:12、 SEQIDNO]2與SEQIDNO:l3、SEQIDNO:13與SEQID NO:14及與上述個別引子之衍生序列所組成之引子對。 依照本發明之實施例，上迷套組更包含萃取待測蟲體 染色體DNA所需之試劑；及/或進行聚合酶連鎖反應所需 要的試劑，及/或進行分析所需要之簡。電泳分析包 括但不限於填脂_凝膠電泳或毛細管凝膠電泳。 使用鑑定三種15馬類害&之套組的方法，包含使用至 少三對引子對或其衍生序列進行聚合酶連鎖反應，藉由增 12 201114909 =之目標核酸諸分子量大小，可快速鑑定三種莉馬類 j。所述之至少三利子對，好對係分制自第一引 合中之至少其中之1子對、第二引子對組合中之 夕，、中之一引子對及第三引子對組合中之至少其中之一 引子對。 列實例予以詳細朗本發明，然並不意味本發 明僅侷限於下列實例所揭示之内容。 _ 實例一 請參照第2A-2C圖，為利用第—引子對組合之專一性 ==種類15馬染色體1取之特異性片段的瓊脂 醣凝膠電泳圖譜。

仇备ίΓ ’ *2A圖係利用引子對⑷增幅不同種類，莉馬 木體TS2之特異性片段之電泳圖譜。Μ為100 bp DNA 為空白控制組’泳道1_22代表不同種類的薊 一）。第2A圖之結果顯示以西方花薊馬專一性引 鲁I對（A)對各姻馬樣本進行PCR增幅，所測試的物種 =道7、8 ' 9 ' 10及22之西方花莉馬樣本在約23 ^現義之目標條帶外，其餘各個額種的㈣樣本及 二白控制組均未增幅到產物。 IT S 2 ί 圖f利用引子對⑻增幅不同種類15馬染色體 桃r H 之電泳圖譜。M^1〇〇bpDNA階梯標 幟’一C為二白控制組’泳道…代表不同種類的莉馬樣本 2B圖之結果顯示以西方花薊馬專一性 (B)對各_馬樣本進行pcR ，所測試的物種除泳 13 201114909 及23之西方花gj馬樣本在約如如）處出現明顯之目 心條帶外’其餘各個不同種㈣馬樣本及空白控制組均未 增幅到產物。 第2C圖係彻引子對（c)增幅不同種賴馬染色體 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。m為綱# 階梯標 幡’一C為空白控制、組，泳道1-22代表不同種類的莉馬樣本 (表一）。第2C圖之結果顯示以西方花薊馬專一性引子對 (C)對各種gj馬樣本進行pCR增幅，所測試的物種除泳 道7、8、9、1〇及22之西方花g馬樣本在約150 bp處出 現明顯之目標條帶外’其餘各個不同種的薊馬樣本及空白 控制組均未增幅到產物。 根據上述實例，可知引子對（A)、引子對（B)及引 子對（c)均可分別於含西方花薊馬DNA之樣本中增幅產 生穩定明顯之專-性片段，且不會在非西方花莉馬的樣本 中增幅出目標性片段，顯示引子對（A)、（B)及（c)具 極佳之專一性，可應用於準確偵測西方花薊馬。 請參照第3A_3C圖，為利用第二引子對組合之專一性 引子增幅不同種類薊馬染色體ITS2之特異性片段的瓊脂 醣凝膠電泳圖譜。 其中’第3 A圖係利用引子對（D )增幅不同種類薊馬 ^色體ITS2之特異性片段之電泳圖譜。μ為1 〇〇 bp DNA 階梯標幟，泳道1-12代表不同種類的薊馬樣本(表三）。第 3A圖之結果顯示以台灣花薊馬專一性引子對（D)對各種 201114909 薊馬進行PCR增幅，所測試的物種除泳道12之台灣花薊 馬樣本在142bp處出現明顯之目標條帶外，其餘各個不同 種的薊馬樣本均未增幅到產物。 第3B圖斜⑻丨子對⑻增料同種賴馬染色體 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。M為1〇〇冲dna階梯標 幟，泳道l-i2代表不同種類的莉馬樣本(表三）。第3b圖 之結果顯示以台灣花15馬專一性引子對⑻對各種朝馬進 二PCR料，所職的_除料12之西方彳^馬樣本 ^約303 bp處出現明顯之目標條帶外，其餘各個不同種的 魚！J馬樣本均未增幅到產物。 ΓΓΜ第3C圖係彻引子對（F)增幅不同種類'莉馬染色體 S2之1 異性片段之電泳圖譜。M為i〇〇 bp眶階梯標 η:白控制組，泳㉟M1代表不同種_馬樣本 (表二)°第3C圖之結果顯示以台灣花 2=;樣本進行 2 =化.¾馬樣本在約243 bp處出現明顯之目標條帶外， "餘各個不同種㈣馬及空白控制組均未增幅到產物。 子射？述實例’可知引子對（D)、引子對⑻及引 魏 =可分別於含台灣花15馬DNA之樣本中增幅產 ==之專一性片段，且不會在非 =T片段，顯示引子對⑼、⑻*(F)t 極佳之專—性’可應祕準確_台灣花15馬。 實例三 請參照第4A-4C圖 為利用第三引子對組合之專一性 15 201114909 引子增幅不同種類薊馬染色體ITS2之特異性片段的毛細 管凝膠電泳圖譜。 1 其中，第4A圖係利用引子對（G)增幅不同種類薊馬 染色體ITS2之特異性片段之電泳圖譜。厘為DNA分子量 標幟，泳道1-24代表不同種類的薊馬樣本（表四）。第4a ，之結果顯示以蔥U馬專-性引子對（G)對各種莉馬進 行PCR增幅，所測試的物種除泳道12之葱莉馬樣本在約 420 bp處出現明顯之目標條帶外，其餘各個 樣本均未增幅到產物。 的,小％ 係利用引子對（H)增幅不同種類15馬染色體 之特異性片段之電泳圖譜。M為_a分子量標織， ^道1-24代表不同種類的莉馬樣本(表四）。帛4b圖之社 1 顯示以_馬專-性引子對W對各_進行pc: =’所測試的物種除泳道12之惠莉馬樣本在約397卟 未增同種的15馬樣本均 聰m生增幅不同種類莉馬染色體 1 道！·24代表不同種類關馬樣本，泳道k24 同 性==+(ί四)。第化圖之結果顯示以編專-性引子對⑴對各種13馬樣 η号 物種除泳道12之茴匈黾揭 ㈢幅，所測試的 標條帶外，苴餘各ϋ本在約346 _處出現明顯之目 到產物。 同種的15馬及空白控制組均未增幅 根據上述實例，可知料對⑻、引子對⑻及引 201114909 子對⑴均可分餅dna之樣材增幅產生穩 定明顯之專一性片段，且不會在非葱莉馬的樣本中增幅^ 目標性片段’顯示引子對（G)、⑻&⑴具極佳之專 一性，可應用於準確偵測蔥薊馬。 〜雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限 ,本發明’任何熟習此技藝者，在*脫離本發明之精神和 範圍内”可作各種之更動與潤飾’因此本發明之保護範 圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 【圖式簡單說明】 為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例 能更明顯易懂’所附圖式之說明如下： 第1圖為二種薊馬之ITS2 DNA序列比對圖。 第2A圖係利用引子對（A)增幅不同種類薊馬染色體 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 第2B圖係利用引子對（B)增幅不同種類薊馬染色體 _ JTS2之特異性片段之電泳圖譜。 第2C圖係利用引子對（c)增幅不同種類薊馬染色體 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 第3A圖係利用引子對（D)增幅不同種類薊馬染色體 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 第3B圖係利用引子對（E)增幅不同種類薊馬染色體 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 第3C圖係利用引子對（F)增幅不同種類薊馬染色體 201114909 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 第4A圖係利用引子對（〇)增幅不同種類薊馬染 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 “色題 第4B圖係利用引子對（η)增幅不同種類薊馬染 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 體 第4C圖係利用引子對⑴㉟幅不同種類莉馬染 ITS2之特異性片段之電泳圖譜。 主要元件符號說明 無

18 201114909 序列表 <110>國立中興大學 <120>鑑定薊馬害蟲之專一性引子對、鑑定套組及其方法 <160〉10 <210>SEQIDNO: 1 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primerbind < 230 >鑑別西方花薊馬專一性引子

<400〉1 gg t cgc 11 c a ccgct.tcccc cgtaaa 2 6 <210>SEQIDNO:2 <211>26 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primerbind <230>鑑別西方花薊馬專一性引子 <400>2 caaagtgcga gaaaataatg caaact 2 6

<210>SEQIDNO:3 <211>28 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primer_bind <230>鑑別西方花薊馬專一性引子 <400>3 cgaaacgcaa agtgcgagaa aataatgc 28 201114909 <210>SEQIDNO:4 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primer_bind <230>鑑別西方花薊馬專一性 <400>4 agcctccaga cgttctgcca 引子 aaag

<210>SEQIDNO:5 <211>27 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primerbind <230>鑑別台灣花薊馬專一性引子 <400 >5 atcctgtatg gagaaagcac t ctgccg

<210>SEQIDNO:6 <211>27 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primer_bind <230>鑑別台灣花薊馬專一性引子 <400>6 cgagtacgag gacaagaaac gtcacac <210>SEQIDNO:7 <211>21 <212>DNA <213〉人工序列 201114909 < 220 > primerbind <230>鑑別台灣花薊馬專一性引子 <400>7 cagactgttc cgagagaaat c 21 <210>SEQIDNO:8 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primer—bind <230〉鑑別台灣花薊馬專一性引子

<400>8 2 0 ttttgttgca cacttttccg <210>SEQIDNO:9 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primerbind <230>鑑別台灣花15馬專一性引子

<400>9 ccaaactcaa agaccagact gttccgagag 3 0 <210>SEQIDNO: 10 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primerbind <230>鑑別台灣花薊馬專一性引子 <400>10 cgtcgagtac gaggac aaga aacgtcac 28 3 201114909 <210>SEQIDNO: 11 <211>25 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primerbind < 230 >鑑別蔥薊馬專一性引子 <400〉11 agaaacgatt accagactgc ccaag

<210>SEQIDNO: 12 <211>25 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primerbind <230>鑑別蔥薊馬專一性引子 <400>12 agtgatgcag cacaacacat t ccac

<210>SEQIDNO: 13 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primer_bind <230>鑑別蔥薊馬專一性引子 <400 >13 agcgacagca cacacctcgt gtgtgttg <210>SEQE)NO: 14 <211>26 201114909 <212>DNA <213 >人工序列 < 220 > primer_bind <230>鑑別蔥薊馬專一性引子 <400 >14 cagtgatgca gcacaacaca ttccac 2 6 <210>SEQIDNO: 15 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primer—bind 、以及蔥薊馬之染色體ITS2 DNA片段專一性引子 19 <230>西方花薊馬、台灣花薊馬 <400〉15 gtggatccct gggcttgtg <210>SEQIDNO: 16 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 < 220 > primerbind φ <230>西方花薊馬、台灣花薊馬、以及蔥薊馬之染色體ITS2DNA片段專一性引子 <400>16 gttagtttct tttcctc 17 <210>SEQIDNO: 17 <211>236

<212>DNA <213 >Frankliniella occidentalis < 220 > Misc_feature <223 >西方花薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400>17 50 tggtcgcttc accgcttccc ccgtaaagag aaagcactct gcctagcggt 100 201114909 acgtcttata aaggatagcc agagagcgcc ctcgtgcgct agacagcctc cagacgttct gccaaaagcg gcgggtgtgt gacgtttctt gttctcggac tcgacgtcgc gccgcccgtc ttgaagactt ggaggtatgc cttacaaaga gcaaccgcgc agtttgcatt attttctcgc actttg

<210>SEQIDNO: 18 <211 >243 <212>DNA <213 > Frankliniella occidentalis < 220 > Misc_feature <223 >西方花薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400>18

150 200 236 50 100 150 200 243 tggtcgcttc accgcttccc ccgtaaagag aaagcactct gcctagcggt acgtcttata aaggatagcc agagagcgcc ctcgtgcgct agacagcctc cagacgttct gccaaaagcg gcgggtgtgt gacgtttctt gttctcggac tcgacgtcgc gccgcccgtc ttgaagactt ggaggtatgc cttacaaaga gcaaccgcgc agtttgcatt attttctcgc actttgcgtt teg <210>SEQIDNO: 19 <211>150

<212>DNA < 213 > Frankliniella occidentalis < 220 > Miscfeature <223>西方花薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400〉19 cagcctccag acgttctgcc aaaagcggcg ggtgtgtgac gtttcttgtt 50 ctcggactcg acgtcgcgcc gcccgtcttg aagacttgga ggtatgeett 100 acaaagagca accgcgcagt ttgeattatt ttctcgcact ttgcgtttcg 150 <210>SEQIDNO: 20 <211>142

<212>DNA < 213 > Frankliniella intonsa < 220 > Misc feature <223>台灣花薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 6 50 201114909 <400 >20 atcctgtatg gagaaagcac tctgccggta caaagcggta cgtcttataa aggataacca gagagcgccc ccgcgcgcta acagccctca gacgttctgc caaaagttgg cgggtgtgtg acgtttcttg tcctcgtact eg <210>SEQIDNO:21 <211>303

<212>DNA < 213 > Frankliniella intonsa < 220 > Misc一 feature <223>台灣花薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400>21

100 142 50 100 150 200 250 300 303 cagactgttc cgagagaaat ctctggagcg aggttggagt ctccgcgcgc gagcgtggta ctcttaaaat cctcagggag tcacatcctg tatggagaaa gcactctgcc ggtacaaagc ggtaegtett ataaaggata accagagage gcccccgcgc gctaacagcc ctcagacgtt ctgccaaaag ttggcgggtg tgtgacgttt cttgtcctcg tactcgacgt cgcagcgccc gtettgaaga cttgagggta tgccttataa agagcaaccg ttccggaaaa gtgtgcaaca aaa <210>SEQE)NO: 22 <211>243

<212>DNA < 213 > Frankliniella intonsa < 220 > Misc—feature <223>台灣花薊馬之染色鱧ITS2 DNA特徵區域 <400>22 ccaaactcaa agaccagact gttccgagag aaatctctgg agcgaggttg 50 gagtctccgc gegegagegt ggtactctta aaatcctcag ggagtcacat 100 cctgtatgga gaaagcactc tgccggtaca aagcggtacg tettataaag 150 gataaccaga gagcgccccc gcgcgctaac agccctcaga cgttctgcca 200 aaagttggc gggtgtgtgac gtttcttgtc ctcgtactcg aeg 243

<210>SEQBDNO: 23 <211 >420 <212>DNA 7 50 201114909 < 213 > Thrips tabaci < 220 > Miscfeature <223 >蔥薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400 >23 agaaacgatt accagactgc ccaagcgaca gcacacacct cgtgtgtgtt ggagcagggc gagcttgggg ttctgctccc tttgcggagt agttccctta aatgccttga ggcagaggct tctctcagtc ttactgatta taaggaaatc agttcgtcgc aagatgaacc ctgatggact tggtcggttc gacacgaaaa agcacgcaaa cttgagagta cgtctctttg cctcacgcat tctacaatca aacgttcagt tgaaaacaag tagttgggcg tgaagacccc agcgaacggg tgcagtacag gactcgaagc tcgtgcattt agcgtgcgcc tgagtggaat gtgttgtgct gcatcactga ataaaaacga ttcgaatgca ttttgtaatc cgacctcagt tcaggagaga 100 150 200 250 300 350 400 420

<210>SEQIDNO:24 <211>397

< 212 > DNA < 213 > Thrips tabaci < 220 > Misc_feature <223>蔥薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400 >24

50 100 150 200 250 300 350 397 agcgacagca cacacctcgt gtgtgttgga gcagggcgag cttggggttc tgctcccttt gcggagtagt tcccttaaat gccttgaggc agaggcttct ctcagtctta ctgattataa ggaaatcagt tcgtcgcaag atgaaccctg atggacttgg tcggttcgac acgaaaaagc acgcaaactt gagagtacgt ctctttgcct cacgcattct acaatcaaac gttcagttga aaacaagtag ttgggcgtga agaccccagc gaacgggtgc agtacaggac tcgaagctcg tgcatttagc gtgcgcctga gtggaatgtg ttgtgctgca tcactgaata aaaacgattc gaatgcattt tgtaatccga cctcagttca ggagaga <210>SEQIDNO:25 <211>346

< 212 > DNA < 213 > Thrips tabaci < 220 > Miscfeature <223>蔥薊馬之染色體ITS2 DNA特徵區域 <400 >25 8 201114909 agcgacagca cacacctcgt gtgtgttgga gcagggcgag cttggggttc 50 tgctcccttt gcggagtagt tcccttaaat gccttgaggc agaggcttct 100 ctcagtctta ctgattataa ggaaatcagt tcgtcgcaag atgaaccctg 150 atggacttgg tcggttcgac acgaaaaagc acgcaaactt gagagtacgt 200 ctctttgcct cacgcattct acaatcaaac gttcagttga aaacaagtag 250 ttgggcgtga agaccccagc gaacgggtgc agtacaggac tcgaagctcg 300 tgcatttagc gtgcgcctga gtggaatgtg ttgtgctgca tcactg 346

Claims (1)

1. 201114909 七、申請專利範圍： i 一種鑑疋莉馬害蟲之引子對，係選自於： 引子對（A)，由具有SEQIDNO:l所示之序列的引子 與具有SEQIDNO:2所示之序列的引子組成，可用以鑑別 西方花薊馬； # 引子對（B)，由具有SEQIDNO:l所示之序列的引子 與具有SEQ ID NO:3所示之序列的引子組成，可用以鑑別 西方花薊馬； μ 引子對（C)，由具有SEQIDNO:4所示之序列的引子 與具有SEQIDNO:3所示之序列的引子組成，可用以鑑別 西方花薊馬； μ 引子對（D) ’由具有SEQIDNO:5所示之序列的引子 與具有SEQ ID NO:6所示之序列的引子組成，可用以鏗別 台灣花薊馬； m 引子對（E) ’由具有SEQIDN0:7所示之序列的引子 與具有SEQIDNO:8所示之序列的引子組成，可用以鑑別 台灣花薊馬； 引子對（F) ’由具有SEqIDN0:9所示之序列的引子 與具有SEQIDNO:1〇所示之序列的引子組成，可用以麥 台灣花薊馬； m 引子對（G)，由具有SEQ ID N0:11所示之序列的引 子與具有SEQIDNO:12所示之序列的引子組成，可用以鑑 別蔥薊馬； μ 引子對（Η)，由具有SEQ π)州):13所示之序列的引 子與具有SEQIDNO:12所示之序列的引子組成，可用以鑑 201114909 別蔥薊馬；以及 引子對（I)，由具有SEQ；[DNO:13所示之序列的引子 與具有SEQIDNO:14所示之序列的引子組成， 蔥薊馬。 2.如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（A)可於含西方花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅 出216 bp的片段。 3.如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（A)可包含於至少其中—引子之3，端或5，端修飾核 苷酸序列，仍和原序列具有7〇%以上相似性，且此具衍 生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出與 SEQ ID NO : 17所示序列具有8〇%以上相似性之去氧核糖 核酸片段。 4·如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（B)可於含西方花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出 223 bp的片段。 5.如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（B)可包含於至少其中一引子之3,端或5，端修飾核 苷酸序列，仍和原序列具有7〇%以上相似性，且此具衍 生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出與 SEQ ID NO : 18所示序列具有8〇%以上相似性之去氧核糖 201114909 核酸片段。 6. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（C)可於含西方花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出 149 bp的片段。 7. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（C)可包含於至少其中一引子之3’端或5'端修飾核 苷酸序列，仍和原序列具有70%以上相似性，且此具衍 生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出與 SEQ ID NO : 19所示序列具有80%以上相似性之去氧核糖 核酸片段。 8. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（D)可於含台灣花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅 出142 bp的片段。 9. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中引 子對（D)可包含於至少其中一引子之3’端或5’端修飾核 苷酸序列，仍和原序列具有70%以上相似性，且此具衍 生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出與 SEQ ID NO : 20所示序列具有80%以上相似性之去氧核糖 核酸片段。 10.如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 201114909 引子對（E)可於含台灣花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅 出303 bp的片段。 11. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對（E)可包含於至少其中一引子之3'端或5’端修飾 核苷酸序列，仍和原序列具有70%以上相似性，且此具 衍生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出 與SEQ ID NO : 21所示序列具有80%以上相似性之去氧核 糖核酸片段。 12. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對（F)可於含台灣花薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅 出243 bp的片段。 13. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對（F)可包含於至少其中一引子之3’端或5’端修飾 核苦酸序列，仍和原序列具有70%以上相似性，且此具 衍生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出 與SEQ ID NO: 22所示序列具有80%以上相似性之去氧核 糖核酸片段。 14. 如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對（G)可於含蔥薊馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出 420 bp的片段。 201114909 15.如請求項1所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對（F)可包含於至少其中一引子之3,端< 5,端修飾 核普酸序列’仍和原序列具有7〇%以上相似性，且此且 衍生序列的引子仍可與所屬引子對中另—引子共同增幅出 與SEQ ID NO : 23所示序列具#跳以上相似性之去氧核 糖核酸片段。 16.如請求項丨所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對⑻可於含蔥15馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出 397 bp。 17.如請求項1所述之鑑定勒馬害蟲之引子對，其中 引子對（Η) T包含於至少其中一引子之3,端或5，端修飾 核㈣序列’仍和原序列具有观以上相似性，且此具 衍生序列的引子仍可與所屬引子射另—引子共同增幅出 與SEQ ID NO: 24所示序列具有8〇%以上相似性之去氧核 糖核酸片段。 18.如請求項丨所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，其中 引子對⑴可於含'f 15馬之去氧核糖核酸樣本中增幅出346 bp的片段。 19.如請求項丨所述之鑑定薊馬害蟲之引子對，苴中 引子對⑻T包含於至少其中一引子之3，端或5,端修飾 核苦酸序列’仍和原序列具有7G%以上相似性，且此具 201114909 衍生序列的引子仍可與所屬引子對中另一引子共同增幅出 與SEQ ID NO: 25所示序列具有80%以上相似性之去敦核 糖核酸片段。 Λ . 20. —種鑑定西方花薊馬之套組，包含至少—引子 對’係選自於引子對（Α)、引子對（Β)及引子對（c)。 21 · —種鑑定台灣花莉馬之套組，包含至少一引子 ^ 對’係選自於引子對（D)、引子對（Ε)及引子對（F)。 22. —種鑑定蔥薊馬之套組，包含至少一引子對，係 選自於引子對（G)、引子對（Η)及引子對（I)。 23. —種鑑定三種薊馬類害蟲之套組，包含： 第一引子對組合，包含至少一引子對，係選自SEQ ID NO: 1 與 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 1 與 SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4與SEQIDNO:3所組成之引子對； ® 第二引子對組合，包含至少一引子對，係選自SEQ ID NO:5 與 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7 與 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:10所組成之引子對；以及 第三引子對組合，包含至少一引子對，係選自SEQ ID ΝΟ:11 與 SEQIDNO:12、SEQIDNO:12 與 SEQIDNO:13、 ’ SEQ ID NO:13與SEQ ID NO:14所組成之引子對。 24.如請求項i5_18所述之套組，更包含萃取待測蟲體 201114909 染色體DNA所需之試劑。 25. 如請求項15-18所述之套組，更包含進行聚合酶連 鎖反應所需要的試劑。 26. 如請求項15-18所述之套組，更包含進行電泳分析 所需要之試劑。 B 27. —種鑑定三種薊馬害蟲之方法，包含： (a) 提供待測蟲體之基因體去氧核醣核酸做為一模 版； (b) 使用至少三對引子對與該模版進行聚合酶連鎖反 應，所述之至少三對引子對引子對係分別選自： 第一引子對組合中之至少其中之一引子對，係選自 SEQ ID ΝΟ:1 與 SEQ ID NO:2、SEQ ID ΝΟ:1 與 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:3及與上述個別引子之 φ 衍生序列所組成之引子對； 第二引子對組合中之至少其中之一引子對，係選自 SEQ ID ΝΟ:5 與 SEQ ID NO:6、SEQ ID ΝΟ:7 與 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9與SEQ ID NO:10及與上述個別引子 之衍生序列所组成之引子對；以及 第三引子對組合中之至少其中之一引子對，係選自 SEQ ID ΝΟ:11 與 SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:12 與 SEQ ID NO:13、SEQIDNO:13 與 SEQIDNO:14 所組成之引子對； 以及 7 201114909 (C)分析聚合酶連鎖反應增幅之片段長度，藉由增幅 出之目標核酸片段分子量大小，快速鑑定西方花薊馬、台 灣花薊馬及蔥薊馬三種薊馬害蟲。 28. 如請求項27所述之鑑定三種薊馬害蟲之方法，其 中該模版為待測蟲體之染色體ITS2 DNA片段。 29. 如請求項27所述之鑑定三種薊馬害蟲之方法，其 中該模版為待測蟲體之基因體DNA。