TW201111503A - Method for producing lactobacillus capable of expressing human lactoferrin and purpose thereof - Google Patents

Description

201111503 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 〃本發明係有關於一種新型乳酸菌之技術，特別係指以基因工程構 築一種能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌，該能表現人類乳鐵蛋白之乳酸 菌能附著於生物體消化道内而產製人類乳鐵蛋白，並且發揮抗菌之功 效。 【先前技術】 按’抗生素至今㈣以作為細誠染之治療方法，然而近年來發 現由於抗生素被廣泛施打或是添加於食品及觸之巾，導致多種致病 性菌株具有對抗不同抗生素之能力。有鑑於此，目前於世界各國已經 陸續禁止或嚴格規範抗生素朗於—般性食品與飼料添加劑，是以， 發展及尋找抗生素之替代物，便成為科學界中之一重要課題。 乳鐵蛋白(lactofemn ; LF)分子量約為78~8〇kD，具有結合金 子的能力，為鐵結合蛋白(transferrin)家族成員之一(Anders〇n拼此 1989)，除了可以攜帶二價或三價的鐵離子以外，還可以與銅、辞和錳 離子結合。乳鐵蛋白可於哺乳動物之乳汁、黏膜分泌物等外分泌物中 以及顆粒性嗜中性白血球中發現(Yamauchj故a/，娜；l〇耐制 and lyer，Ί995) ’尤其以乳汁中之含量為最多。 許多研究文獻巾皆指出乳鐵蛋自具有抗菌、抗病毒與免疫調節等 多重功能，例如： 1.可增加腸營養物(包括鐵與礦㈣)的吸收和刺激免疫細胞生長 (Nuijens eia/_, 1996)。 k強巨&細胞’夕核白血球的殺菌作用^^丨丨㈣咖〇)。 3. 淋巴球的成長及分化。 4. 刺激多核血球釋出干擾素。 5. 抗發炎反應（Goldman eia/·，Ί986)。 6. 有靜菌的作用：抑制病源菌（如大腸桿菌)與病毒的生長繁殖 201111503 (Lu ef a，”1987 ; Fujihara ef a，·，1的5 ; Chen ei a，.，20〇5)。 7_具有transcription factor之功能，能活化NF-?B等蛋白，並涉 . 及多條細胞訊息傳遞路徑（Oh, ei a/.，2004)。 換&之，乳鐵蛋白為係為非特異性免疫反應及免疫調節蛋白重要 力貞之―，使得乳鐵蛋自之生產可望顧於人類健食品或動物飼料 之添加物，以增強抗菌能力。 雖然人類乳鐵蛋白具有上述優點，但是由於人類乳鐵蛋白係於人 乳中之含量最尚，而人乳之取得有限，亦有利用基因工程使非人類之 ' 哺乳動物大量產製重組人類乳鐵蛋白(Patrick ei a/_, 2002)，不過仍須 _· 、經由回收純化之步驟才能取得人類乳鐵蛋白，故於產製人類乳鐵蛋白 之過程中增加成本β 乳酸菌(Lactic acid bacteria; LAB)種類眾多，泛指能將食物發酵 成為乳^之細菌者，例如.Ladobaci•丨丨us hctoeooeue ieptoeaxiijs 等。乳I菌與人類生活息息相_，用以發酵、保存食品上或是增添食 〇〇風味因此般被涊疋為安全的機能性食品。近年來研究發現長期 食用含乳_之食品’對促進身體機能健全有益，故將乳_視為益 生菌（probiotic)的-種。其中，所謂益生菌係指可於生物體腸道内繁殖 而不具致雜，並可增進腸道菌叢品質者，換言之，益生菌除了能於 消化道中存帥外，更重要的是要_於生倾腸道作長（Ta_k， G. W. 1999)。 此外—’最近之研究更指出酪蛋白乳酸桿菌(Laci〇々ad//i的具 有更大範圍之生物功能，包含有抗腫瘤（如版m〇r)、抗致病性 (:ntipath〇genic)以及免疫刺激活性(immUn〇stimulatory activities)。目 二2赂蛋白魏桿菌為_之發酵乳製品，更有研究指出將老鼠傲 酵乳製品，發現可抑制_及病毒感染，並錄人體研究中也 曰服齡蛋白乳酸桿菌可有效預防膀胱癌(bladder cancer)之再發 生。 上所述’基於倾菌上述之特性，加以生物技術之快速發展" 4 201111503 目前藉由魏i表現外來基因的相騎究甚多，也實驗⑽目當多種 重組菌株。一般而言，使用乳酸菌來表現具有生物活性的蛋白 ^ 個優點： 有幾 1. 能在工業發酵過裎中適時大量表現蛋白。 2. 提供研究特定蛋白質不同表現量對細胞代謝之影響 3.乳酸菌為格蘭氏陽性菌(Grarn-p〇sitive bacteria)，故在表現 外來蛋白時，可保持蛋白質之完整性，不似格蘭氏陰性菌 (Gram-negative bacteria)表現外來蛋白時會在細胞中遭受蛋白酶之破 壞。

然而，如欲將這些基因重組菌株應用於食品或是醫藥上之前提， 除了必須要確認其安全性，亦即研究產物要經過審慎嚴袼地安全性評 估，確保其不論對動物體或是人體不會有危害之虞；尚還需要選取^ 質體，其與外來基因接合後，能在重組菌株内穩定表現，才能達 大之功效。 【發明内容】 因此，本發明之主要目的即在於提供一種能表現人類乳鐵蛋白之 乳酸菌’以BCRC910434之寄存編號被寄存在中華民國食品工業研究 所，寄存日為民國98年7月3日。 本發明之另一目的係在於一種能生產人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製 造方法，其包含下列步驟： a. 建構一重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體（rhLF/pLac plasmid)，包含有一人類乳鐵蛋白基因片段、一段乳酸調控序列(匕邱) 及至少兩抗藥性之篩選標記；其中，該表現質體之構築係由一乳酸菌 專一載體(pLac vector)與該人類乳鐵蛋白之基因片段分別以限制酶截 切後進行接合(ligate)反應而成。 b. 將步驟a之該重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體以電轉形之 方法送入一乳酸菌中。 c_獲得可表現重組人類乳鐵蛋白之乳酸菌，具有該重組人類乳 201111503 鐵蛋白基因之表現質體。 更進一步而言，步驟a更包含下列步驟： (i)自人類cDNA基因庫中篩選出一完整人類乳鐵蛋白基 因(human lactoferrin cDNA)。 (Π)以聚合酶連鎖反應擴增步驟(i)之該完整人類乳鐵蛋白 基因，得到含有一人類乳鐵蛋白基因片段之產物，長度為2 2kl^

(出）人類乳鐵蛋白基因之次選殖(subC|orie) ··將步驟(jj)所得 到之該產物送入pGEM-T載體上而得到一重組質體rhLF/pGEM-T，並 將該重組質體rhLF/pGEM-T轉形於大腸桿菌中(£⑺句中。 (iv) 以限制酶截切且純化步驟㈣之該重組質體 rhLF/pGEM-T，回收該人類乳鐵蛋白基因片段。 (v) 以限制酶截切且純化一乳酸菌之pi_ac載體。 (vi) 將步驟(iv)之該人類乳鐵蛋白基因片段與步驟(v)之乳酸 菌之pLac載體(pLac vector)進行接合(iigate)反應。 (VH)得到一重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體(出田 plasmid)。 /本發明之次-目的在於提供—種能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌， 其係具有於-生物體消化道_著且產製人難鐵蛋自之能力，進而 於該消化勒發揮較佳之抗力，並可賴乳_顧於醫 產業中。 本發明之再-目的在於提供_種絲現人輒鐵蛋自之乳酸菌， 其係用以倘食品添加物，亦可作為動物補之添加物。 本發明之又-目的在於提供__魏表現人祕鐵蛋自之乳酸菌， j可有效地產製人_鐵蛋白，是以，藉由生_繪純化人類乳鐵 Ϊ白’該純化後之人類乳鐵蛋白係可顧作為食品添加物、動物飼料 添加物或是醫藥組成物中之有效成份。 【實施方式】 201111503 為了達成上述目的’以下兹舉若干較佳實施例並配合圖式做更進 一步之說明如后。 本心明係提供-種能表現人類乳鐵蛋自之乳酸菌，依法於寄存日 民國9。8年7月3曰，以BCRC91輸號之寄存編號寄存在中華民國新 竹食品工業研究所，並經由實齡析確定該能表現人類乳鐵蛋白之乳 酸菌可於生物_化道_著而發揮抗®功效，亦可將魏表現人類 乳鐵蛋白之乳酸菌作為一食品添加物。 本發鴨以基因工減祕製備含有重組人·紐自基因之乳 # _ ’首先，製備含有-重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體(rhLF/pUc ' plasmi_職_定表觀纽人織鐵蛋自，再將該表現 質體以電穿孔(e|ectroporati〇n)轉形之方法送入一乳酸菌中，即可得到 -乳酸_雜。如第-圖A及第-圖B卿，該纽人類乳鐵蛋白 基因之表現質體(rhLF/pLac plasmid)係至少包含有一人類乳鐵蛋白基 因片段、一段乳酸調控序列（Lac)以及至少兩個抗藥性篩選標記 (selection marker)，用以對抗生素 Ampicn丨丨n 及 Eryth〇mycin 產生:藥 性。 ’、 本發明所提供之重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體係由一乳酸菌 • pLac載體(PLac vector)與人類乳鐵蛋白之基因片段，分別以限制酶截切 後進行接合(ligate)反應而成。 本發明係提供一能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製造方法，其 中’所選用之勝任乳酸菌係為Lacio&ad/⑹owd)，係講於新竹 食品工業發展研究所威種保存及研究中心(Culture Colleetion and Research Center ; CCRC)，寄存編號為 CCRC 10690。 本發明之實例一為構築重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體。 首先’自人類 cDNA 基因庫中(human 5，-stretch cDNA library)選 殖出一完整人類乳鐵蛋白基因(human lactoferrin cDNA)，以聚合酶連 鎖反應(PCR ; polymerase chain reaction)擴增之該完整人類乳鐵蛋白^ 201111503 基因，得到含有編碼為人類乳鐵蛋白基因片段之一產物，長度為 2.2kb ;其中，聚合酶連鎖反應引子之設計係利用人類乳鐵蛋白基因非 密碼引子序列(mutagenic primer)’内含有川核酸限制酶切為之上游 引子(hLH-βρ川(+))及下游引子(hLH-Sfif/l丨㈠）： hLH-8g/ll(+) ： 5,-CAGA]OTAAGGAGGTGAGCAG-3, hLH-8g/ll(-) ： S'-AG^TCTGGGAATCAAGACGG-S' 進行人類乳鐵蛋白基因之次選殖(subclone)，其係將上述含有人類 乳鐵蛋白基因片段之產物利用連接酶(T4 DNA ligase)構築於pGEM-T Easy載體(vector)上’而得到一重組人類乳鐵蛋白基因之pgem-t質 體(rhLF/pGEM-T)，並依據Chang and Miler(1988)之方法將該重組人 類乳鐵蛋白基因之pGEM-T質體轉形至大腸桿菌中(E.co//DH5a)中。 再利用ββ[/ΙΙ核酸限制酶截切，域認為正確的重組人類乳鐵蛋白基 因之pGEM-T質體DNA’可得到3.0kb之pGEM-T載體與2.2kb人類 乳鐵蛋白基因片段；再利用低熔點洋菜膠(LMP agarose gel ;丨ow melting temperature agarose gel)將人類乳鐵蛋白基因片段回收，並溶 於去離子水中。 本發明所選定之乳酸菌載體PLac-LF係為一可於乳酸菌中穩定表 現之載體，經川核酸限制酶截切後進行純化，並與上述回收之人類 乳鐵蛋白基因片段經適當比例添加後，利用連接酶(丁4 DNA llgase)及 10X緩衝液於16°C下進行接合反應，得到一重組人類乳鐵蛋白基因之 表現質體(巾1_%1_30卩丨3811^€|)，如第一圖八所示。 本發明之實例二係製備並選殖乳酸菌轉形株。 將該勝任乳酸菌Lease/·自-7(TC冰箱取出，置於冰桶中10-15分 鐘，待菌體完全解凍後，將實例一中所構築好的該表現質體 DNA(rhLF/PUc p丨asmid DNA)750_Ube與準備好之勝任乳酸壯 case/40 A丨混合均勻再移入電穿孔專用之2_比色管(c_te)。該 混合液於 25GGV ’電容25#F，電阻2(Χ)Ω之條件下進行電擊， 並於電擊後立刻加入預冷的1mlS〇c溶液中。 r 201111503 再將該比色管中之混合液移到1.5ml的試管中培養於37°C培養箱 中振盪Γ2個小時。而後以離心方式去除上清液後，將菌液塗佈於含 有抗生素Erythomycin之MRS固態培養基上，培養於37°c培養箱内1 小時，得到乳酸菌轉形株(hLF/L. case/)。 將乳酸菌轉形株於溫度為37°C、含有抗生素Erythomycin之MRS 液體培養基中培養1小時，選殖出乳酸菌轉形株之菌落。而後，抽取 乳酸菌轉形株之質體DNA，進行聚合酶連鎖反應及洋菜膠電泳分析， 用以檢測質體DNA是否含有人類乳鐵蛋白基因片段，其中，以原生乳 酸菌’作為反向對照組(negativecontrol)，以重組人類乳鐵蛋白基因之 表現質體，作為正向對照組(positivecontrol)，結果如第一圖β及第二 圖所示，顯示乳酸菌轉形株(hLF/L. case/)内確實具有編碼為重組人類 乳鐵蛋白之基因序列，並且該重組質體能於乳酸菌轉形株内表現重組 人類乳鐵蛋白。 本發明之實例三係分析重組人類乳鐵蛋白於乳酸菌轉形株内之表 現量。 將乳酸菌轉形株於一適當環境下分別培養0、12、24、36、48、 60及72小時後，再將經不同培養時間之各該乳酸菌轉形株分別加入 破菌緩衝液（breaking buffer)及尺寸為〇.5mm之酸洗玻璃珠 (acid-washed glass beads)中’放置於震盪器上震盪3〇秒，再置於冰 上30秒，重複8次後’離心後萃取得到所有細胞内蛋白質。將所萃取 之細胞内蛋白質先進行聚丙烯胺膠體電泳(sodiufT1 dc)deey| su|fate polyacrylamide gel electron ; SDS-户AGE) ’ 再將經過電泳分離之蛋 白質以西方轉潰法（Western blotting)轉潰於pvdf膜上，利用膜上 之專-性抗體_重組人齡鐵蛋白，再以f光化學顯雖nhanced chemiluminescence detection system)進行顯影。其中，本實例中係 以原生乳酸菌的細胞萃取物作為對照組(NC)，並以不同質量之純化人 類乳鐵蛋自’其籽4為78kD，錢子二氣毅還觸（卿耐〇1拙 reductase ; DHFR)抗體，其分子量為25kD ’分別作為確認實驗正確: 9 201111503 性之用。 分析結果如第三圖A所示，顯示經培養48小時之乳酸菌轉形株中 之重組人類乳鐵蛋白表現量最高，此外，並以酵素結合免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosobent assay; ELISA)作定量分析，可知重組 人類乳鐵蛋白於各該乳酸菌轉形株内皆有表現(參閱第三圖A最下方所 示）。 由上述分析結果可知重組人類乳鐵蛋白於培養48小時表現量最 大’故將乳酸菌轉形株(hLF/Z*· case/)於不含有Erythomycin之MRS培 養基’培養48小時’而後進行真空冷凍乾燥，製備出菌粉。該菌粉加 入2D水(ddH2〇 ; distilled deionized water)成為菌液，用以提供之後 試驗之用。 本發明之實例四係以圓盤濾紙擴散試驗(disc diffusion assay)測定 重組人類乳鐵蛋白於活體外之抗菌能力。 首先’將濃度為2x106CFU/ml之致病性菌株E co// ACTT25922 的菌液3ml接種於含有2% BPW(bacto peptone water)瓊脂培養基 上，再分別加入濃度3mg/spot之重組人類乳鐵蛋白，另加上濃度為 10/z g/spot抗生素amp|丨cjl丨丨n(Ap+)以及濃度為2mg/sp〇t之牛乳鐵蛋白 (bLF)作為正向對照組，結果如第四圖^所示。並以分光光度計分析， 結果如第四目B所示’顯示重組人纖鐵蛋自確實可以有效抑制致病 性菌株生長。其巾，籲為完全未加任何致病性g株之培養基，▽為加 入重組人類乳鐵蛋白之實驗組，▼為加入牛乳鐵蛋白之對照組，〇為 接種致病性菌株之培養基。 本發明之κ例五係以掃摇式電子顯微鏡觀察重組人類乳鐵蛋白之 抗菌效果。 將致病性菌株£ co// ACTT25922接種於含有2% Βρνν(_〇 peptone water) ’ 生長至對數期(|〇ga「jthmjc phase)，再以找 稀 釋菌液，使其濃度為2x1G6CR_。將經純化之重組人類乳鐵蛋白溶 於水中’絲同#之騎與經純化之她人缝鐵蛋自相混合，得到 201111503 體積為10ml、濃度為3mg/ml之溶液。將該溶液置於37°C水中震盪2 小時，再以1700xg離心10分鐘。分別將致病性菌株£ c〇//以及該容 液以相同條件培養2小時，再以掃描式電子顯微鏡觀察，結果如第五 圖A及B所示，比對後可知該重組人類乳鐵蛋白會造成細菌細胞群體 有破裂之情形產生，亦即重組人類乳鐵蛋白具有抗菌效果。 本發明之實例六係對經不同處理之小鼠進行攻毒試驗。 束數隻四週齡之丨CR小鼠’分為下列四組： 第一組為顧食乳酸菌轉形株(hLF/L case/)之處理組：以含人類乳 鐵蛋白之乳酸菌三到六次，每次間隔24小時，單次給予〇.4m|濃度為 6x106CFU/m丨之菌液，相當於2.4x106CFU/小鼠。等到最後一次餵食 結束後48小時’再分別以致病性菌株[c〇//ACTT25922進行攻毒試 驗，給予0.4ml濃度為2.2x109CFU/ml，相當於8.8x1〇8CFU/小鼠。 第二組為原生乳酸菌(WT/L case/)之對照組：以原生乳酸菌餵食 二到六次，每次間隔24小時，單次給予a4m|濃度為6x1〇6CFU/m| 之菌液’相當於2·4χ106CFU/小鼠。等到最後一次餵食結束後48小時， 再分別以致病性菌株£. co// ACTT25922進行攻毒試驗，給予〇4m丨 濃度為 2.2x109CFU/ml，相當於 8.8x108CFU/小鼠。 第三組為進行致病性菌株攻毒耐受性試驗c〇// 〇n丨y)之對照 組.以致病性菌株£ co//A(JTT25922進行攻毒試驗，給予〇 4m丨濃度 為 2.2x109CFU/ml，相當於 8.8x108CFU/小鼠。 又 第四組為無處理之空白控制組（Negative control)。 將第一至三組小鼠經攻毒試驗48小時後，犧牲解剖，第四組小& 直接犧牲解剖。 & 由於主要>肖化道細菌係叢聚於十二指腸璧，且有膽汁等分泌物加 入，菌數不會迅速增加，菌相也較於其餘部位來得單純，攻毒試驗對 其影響程度亦較顯著。是以，截切犧牲小鼠之小腸前三分之一處之組 織進行以下乳酸菌轉形株於活體内抗菌功能的分析。 本發明之實例七係觀察統計經攻毒試驗小鼠外觀之受損程戶。 11 201111503 下表一係用以定義小鼠經致病性菌株£ co// Α(^ΓΤ25922攻毒試 驗後之受損等級表。

呼吸、體色、活動力、哺乳正常 正常 大量牛奶在胃 1 蒼白，接受灌食 活動力較差 呼吸加快 有牛奶存在胃中 輕微生病 2 倉白或是灰色，不正常呼吸 活動力減緩，哺乳減少 胃有牛奶，皮膚輕微塌陷 普通程度生病 3 紫柑，難以灌食·’呼吸困難 明顯嗜睡，沒有翻動反應 胃内沒有牛奶 皮膚塌陷，脫水 邁向死亡 4 沒有生命跡象，屍僵 死亡 以上表一作為標準，將經攻毒試驗之小鼠予以分類計算，經統計 後結果如第六圖所示，顯示僅慑食大腸桿菌攻毒組中約有6掷之小鼠 與僅原生乳酸菌之對照組中約有31%之小鼠有體重減輕，虛弱甚至死 亡等不正常之健康情形，而餵食乳酸菌轉形株之處理組中僅有非常少 數的小鼠有發生病徵。由此可知’乳酸菌轉形株的破可對生物體發揮 抗菌之保護能力。 本發明之實例八係分析重組人類乳鐵蛋白於活體内之表現。 取實例六中之第一到四組小鼠之小腸前三分之一、約2公分的会且 織。先以生理食鹽水將擷取小腸中的内含物沖出。再萃取小腸細胞内 12 201111503 之蛋白質’以西方轉潰法進行分析’其實驗流程大致等同於如實例三， 故於此不加以贅述。分析結果如第三圖B所示，顯示乳酸菌轉形株於 十二指腸内有良好生存能力，並且能夠於生物體内表現重組人類乳鐵 蛋白。 本發明之實例九係分析乳酸菌轉形株於活體之抗菌功能（一）。 EMB(Eosin-methylene blue agar)培養基會抑制格蘭氏陽性菌，讓 格蘭氏陰性菌易增生，屬鑑別性培養基之一。EMB含有乳酸 (lactose)、曙紅（eosin)、及甲基藍（ethy|ene blue)，可用於鑑定腸道

菌。E co//於缺乏葡萄糖之環境中，會藉由基因調控活化乳糖操作組， 使用乳糖產生能量。過程因發酵產生有機酸，使染劑還原沉澱於菌體 表面，形成藍綠色金屬光澤之菌落，其他腸道菌無此特徵，因此本實 力係藉由EMB培養基鑑定£. co//。 取實例六中各組小鼠小腸前三分之一、約2公分的組織。以1m| 針筒吸取1 ml生理食鹽水’注入已擷取之小腸將内含物沖出。取〇 2加 腸道沖洗液塗佈於EMB鑑別性培養基，於37qc下，培養16小時後 計算菌落數，結果如下表二所示。其巾，p值是各_對於分組3所 計算出之值。 表二 分 傲食乳酸菌之次數 傲食致病性致病性菌株£.c〇// P值 ^；_-____ 菌株E.CO//· 於十二指腸之動量 1 6 X (0.2 ml PBS) _106^ 8.8 2 6 X (hLF/L. casei) 8.4 + 5 5 3 6 X (0.2 ml PBS) + 3,018.8 士 _- 627.2 4 3 X (Wt//.. casei) + 1,143.4 土 405.6 P=0.14 4* 5 3 X (hlF/L. casei) 587.1 ± 221.9 P<〇.〇5 13 201111503 162.5 ± 103.8 P<0.01 6 6 X (Wt/L case/) 7 6X(hLF/L case/)_+_ 26.3 ± 20.1_ P<〇〇〇^ 由表二可知，餵食乳酸菌轉形株之分組7明顯降低致病性菌株之 數量’且儀食乳酸菌轉形株之分組7與未攻毒之分組1並無顯著不同。 再者，餵食原生乳酸菌之分組6雖然也有降低致病性菌株之數量，但 是相對於餵食乳酸菌轉形株之分組7,分組6中的致病性菌株數量仍高 出分組7約1〇倍。換言之，上述結果證實乳酸菌轉形株具有相者 之抗菌能力。 田义

+赞明之弟十貫例係分析乳酸函轉形株於活體之抗 取實例六中被犧牲小鼠之小腸前三分之一、約2公分的組織，並 與三聚甲醛(paraforma丨dehyde)混合，再以 ac.T. (0ptima| c_g

TemPerature)包埋後置於_8〇〇c冷;東櫃。等到〇 c 丁硬凝後進行冷凉 切片，取厚度為5㈣之組織切片，取厚度為之組織切片了滴 於組織上至完全覆蓋，放入水中退染，再滴E〇Sin於組織 上至凡全覆盘’放入水中退染，待玻片乾燥後進行封片。 理之tit片Γ微鏡觀察，結果如第七圖八至D所示，除了無處 處理:=f有完整腸道結構(第七圖A所示)，其餘三組相較於無 Ϊ各^ 皆出現不同程度之病理特徵。更進—步而言，僅 絨歧大朗絨毛麵錄底喊麟之特徵， 溅乇权具他組更為疏細，絨毛間隙 嚴重受指而承韶〜# “更為月顯，腸道中央也因絨毛前端 、更頌件工洞化(第七圖Β所示），而餵舍斥生 :道狀損害一 最完整。 圖D所不），小鼠腸道結構 由上可知，由比對觀察各組小 含重組人觀鐵蛋白之乳酸 、、、。構之完整度’可間接證明 ’可於小腸内發揮保護能力。 201111503 本發明第Η•—實例係分析乳酸菌轉形株於活體之抗菌功能(三）。 取實例六中被犧牲小鼠之前三分之一小腸、約2公分的組織，包 埋與切片之步驟大致同實例十。而後，將切片後組織脫水固定，以1〇/〇 雙氧水滴於組織上十至十五分鐘，以去除内源性過氧化氫酶 (peroxidase)。以稀釋 1〇〇〇 倍之一級抗體（旧比丨_t anti-hLF polyclonal first antibody)滴於組織切片上培養之，再以稀釋2000倍之 biotin-labeled 二級抗體（bi〇tin-labeled anti-rabbit IgG secondary antibody)滴於組織上培養之。以vectastain ABC kit滴於玻片上進行染 色。以Hematoxylin進行負染，放入水中退染，待玻片乾燥後進行封 片。 將上述玻片以顯微鏡觀察’結果如第八圖A及B所示。由於一級 抗體（rabbit anti-hLF polyclonal first antibody)會與存在於腸道之乳酸 菌轉形株進行原位雜交(/π s/ftv hybridization)，是以，經過餵食乳酸菌 轉形株的小鼠腸道’可被一級抗體所辨識，進而呈現hLF_p〇sitive之 深褐色斑點(第八圖A箭頭處），而如第八圖B所示，經過原生乳酸菌 餵食之小鼠，即無深褐色斑點；亦即乳酸菌轉形株係可附著於生物體 之消化道内。 本發明第十二實例係分析乳酸菌轉形株於活體之抗菌功能(四）。 由於小腸絨毛鬲度被認為是一種可用以判斷小腸受損程度之標 準’因此，本實例係以統計學方法分析實例十中各組小鼠之十二指腸 織毛1¾度。 分析結果如第九圖所示，未攻毒之空白控制組之小鼠十二 毛長度約為851.0±86.48, ’與健食大腸㈣攻麵之十二指腸域 毛長度(532·8±147·45/ζ m)差距甚大。而被餵食乳酸菌獅株之小鼠十 二指腸絨毛高度(893.9±99.79㈣除了明顯高於齡大腸桿菌攻毒 組’也高於伽食社乳酸菌(766.1±1〇3_50㈣之小鼠，並與未攻毒 之空白控做的小鼠絨毛高度幾乎沒有勤卜由此可推斷乳酸菌轉形 株對於消化道具有良好之保護功效。 15 201111503 藉由上述各該實例之結果，本發明所提供之可生產人類乳鐵蛋白 之乳酸菌係具有以下優點： 1·該猶菌轉形株所生產之重組人類乳鐵蛋白係具有良好之抗 能力。 2·該礼酸菌轉形株係可於一生物體内穩定表現重組人類乳鐵蛋 白。 3·該乳酸菌轉形株可附著於一生物體之消化道，並可有效地保護 消化道而避免被致病性菌株之破壞。 4·該猶ϋ轉形株係可歧地細於作為食品添加物或是動物飼 料添加物。 5. 由於該乳酸菌轉形株於生物體内具有良好的抗菌能力 ，故該乳 酸菌轉形株係可應用於醫藥蛋白產業。 6. 藉由生物技術，自該乳酸菌轉形株中所萃取並經純化而得之人 類乳鐵蛋白係可應用於作為食品添加物、動物飼料添加物或是醫藥組 合物中之有效成份。 上述說明係針對本發明以實例為具體說明，非用以限制本發明之 專利範圍，凡脫離本發明技術特徵所為之等效實施或是變更，均應包 含於本案之專利範圍中。 【圖式簡單說明】 第一圖Α係重組人類乳鐵蛋白表現載體之構築。 第一圖B係重組人類乳鐵蛋白之胺基酸鏈。 第一圖係為分析乳酸菌轉形株中之重組人類乳鐵蛋白表現載體之 電泳圖。 第二圖A係以西方轉潰法分析經不同培養時間之乳酸菌轉形株的 重組人類乳鐵蛋白之表現量。 第二圖B係以西方轉潰法分析分別乳酸菌轉形株及其重組人類乳 鐵蛋白於活體内之表現情形。 第四圖A係以圓盤濾紙擴散試驗(d丨sc diffusj〇rl assay)分析重組人 16 201111503 類乳鐵蛋自贿财之抗®能力。 圖 係以分光光度計將第四圖八所得結果量化分析之折線 圖細掃描式電子賴鏡贿致病，關株之生長情形。 B係以掃描式電子顯微鏡觀帛，致病 性鹵株之生長情形。 第八圖係為不同處理組之小鼠經攻毒試驗後’統計於各個外觀受 抽程度下數量輯之絲圖。 ，七圖A係為無處理之小鼠之小腸组織切片圖。

第七圖B係為單触食致病性紐之小鼠之小腸組織切片圖。 第七圖C係為飯食原生乳酸菌之小鼠經攻毒試驗後之小腸組織切 片圖。 第七圖D係為餵食乳酸菌轉形株之小鼠經攻毒試驗後之小腸組織 切片圖。 第八圖A係以免疫組織化學（immunohistochemical;丨HC)分析 表現經饒食乳酸菌轉形株之小鼠之小腸組織切片圖。 第八圖B係以免疫組織化學（Immunohistochemica丨；IHC)分析 表現饒食原生乳酸菌之小鼠之小腸組織切片圖。。 第九圖係為不同處理組之小鼠經攻毒試驗後，統計各組小鼠小腸 絨毛長度之直條圖。 【主要元件符號說明】 盔 17

Claims (1)

1. 201111503 七、申請專利範圍： 1. 一種能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製造方法，包含了列步驟： a·建構一重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體，能於乳酸菌内穩定表 - 現；其中，該重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體係包含有一編碼為人 ' 類乳鐵蛋白（hLF ; human lactoferrin)之基因片段； - b•將步雜3之該重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體以電轉形方法送入 —乳酸菌中； : c.獲得一乳酸菌轉形株’具有該重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體， % 用以生產人類乳鐵蛋白。 2·依據申請專利範圍第1項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製造方 法，其中，步驟a係更包含下列步驟： (i) 自人類cDNA基因庫中篩選出一為完整人類乳鐵蛋白基因 (human lactoferrin cDNA); (i丨）以聚合酶連鎖反應擴增步驟(丨)之該完整人類乳鐵蛋白基 因，得到一含有人類乳鐵蛋白基因片段之產物； (⑴）人類乳鐵蛋白基因之次選殖(subclone):將步驟(ij)所得到 魯 之該產物送入pGEM-T載體上而得到一重組質體 rhLF/pGEM-T，並將該重組質體rhLF/pGEM-T轉形於大腸桿 菌中(£. co//)中； (iv) 以限制酶截切且純化步驟（iii)之該重組質體 rhLF/pGEM-T，以回收該人類乳鐵蛋白基因片段； (v) 以限制酶截切一乳酸菌專一載體(pLac-LF); (vi) 將步驟(iv)之該人類乳鐵蛋白基因片段與步驟(v)之乳酸菌 專一載體進行接合(丨igate)反應； (vii) 得到一重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體(rhi_F/pLac plasmid)。 3·依據申請專利範圍第彳項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製造方 18 201111503 法，其中，步驟a中之該重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體係更包含 有一乳酸調控序列以及至少兩個抗藥性篩選標記。 - 4·依據申請專利範圍第2項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製造方 法，其中，所使用之限制酶係為川核酸限制酶。 - 5_依據申請專利範圍第1項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌的製造方 法，其中，步驟b中電轉形方法係為電穿孔(electr〇p〇rat丨〇η)之方法。 6. —種依據申請專利範圍第1項所述方法製得之能表現人類乳鐵蛋白之 乳酸菌轉形株的用途，其係用以於一生物體消化道内產製一人類乳鐵 • 蛋白。 - 7_ 一種依射請專利範圍第1摘述方法製得之能表現人類乳鐵蛋白之 乳酸菌轉形株的用途，其係具有附著於一生物體消化道内生存之能 力。 8. -種依據申請專利範圍第]項所述方法製得之能表現人類乳鐵蛋白之 乳酸菌轉形株的用途，其係用以於-生物體消化内發揮良好之抗菌能 力。 9. -種依據申請專利範圍帛1項所述方法製得之能表現人類乳鐵蛋白之 乳酸菌轉形株的用途’其係用以作為食品添加物。 # 1〇. 一種依據申請專利範圍第1項所述方法製得之能表現人類乳鐵蛋白 之乳酸菌轉形株的用途，其係用以作為動物飼料添加物。 11_ -種依射請專利翻第彳項職方法t得之滅贿雜所生產 之人類乳鐵蛋白的用途，其經純化後係用以作為食品添加物。 12. -種絲申請專利翻第彳項騎方法料之乳__株所生產 之人類乳鐵蛋白的用途，其經純化後係用以作為動物飼料添加物。 13. -種域申請專利顧第彳項所述方賴得之乳__株所生產 之人類乳鐵蛋白的用途’其經純化後係用以作為醫藥組合财之有效 成份。 19 201111503 14_ 一種重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體的構築，係由一乳酸菌專一 載體與一編碼為人類乳鐵蛋白之基因片段分別以限制酶截切後進行 接合(ligate)反應而成。 15. 依據申請專利範圍第14項所述重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體 的構築，其中，所使用之限制酶係為Bg/ll核酸限制酶。 16. 依據申請專利範圍第14項所述重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體 的構築，其中，所使用之該乳酸菌專一載體係為一 pLac載體。 17. 依據申請專利範圍第14項所述重組人類乳鐵蛋白基因之表現質體 的構築，其中，該乳酸菌載體係更包含有一乳酸調控序列以及至少兩 個抗藥性筛選標記。 18. —種依據申請專利範圍第14項所述重組人類乳鐵蛋白基因之表現 質體，係具有於一乳酸菌中穩定表現重組人類乳鐵蛋白之能力。 19. 一種能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌轉形株，其係以bcrc91〇434 號之寄存編號被寄存在中華民國新竹食品工業研究所，寄存曰為民國 98年7月3日。 20. —種依據申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌 轉形株的用途，其係用以於一生物體消化道内產製一人類乳鐵蛋白。 21. —種依據申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌 轉形株的用途，其係具有附著於一生物體消化道内生存之能力。 22. —種依據申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌 轉形株的用途，其係用以於一生物體消化内發揮良好之抗菌能力。 23. —種依據申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌 轉形株的用途’其係用以作為食品添加物。 24· -種依據申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌 轉形株的用途’其係用以作為動物飼料添加物。 25· -種自申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌轉 20 2〇Π 11503 形株經純化而得之人類乳鐵蛋白，其係具有作為食品添加物之用途。 26.種自申請專利範圍第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌轉 形株經純彳卜轉之人滅鐵蛋自，錢具有作為動物飼料添加物之 . 途。 27_ -種自申請專利細第19項所述能表現人類乳鐵蛋白之乳酸菌轉 . 形株經純化而得之之人類乳鐵蛋白，其係用以作為醫藥組合物中之有 效成份。

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