TW201024317A

TW201024317A - Process for the production of bivalirudin

Info

Publication number: TW201024317A
Application number: TW098143850A
Authority: TW
Inventors: Luciano Forni; Geoffroy Sommen
Original assignee: Lonza Braine Sa
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2010-07-01
Also published as: EA201101015A1; ES2439502T3; JP5996618B2; TWI453216B; ZA201104195B; CN103864894A; TWI599580B; DK2382232T3; US8921517B2; JP5730781B2; EP2382232A1; TWI538919B; CN102264757A; CA2916716C; SG171859A1; TW201630927A; CA2744627A1; EP2382232B1; CN103864894B; KR20110112385A

Description

201024317 ; 六、發明說明：本發明係關於一種為下式之二十聚體肽的比伐盧定之新穎彙集合成 H-D-Phe1 -Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1 °-As p-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH ( I) 。本發明另外係關於若干種作為比伐盧定合成中之中間物的經保護之肽。藉由凝血酶進行蛋白水解加工在控制血液凝結中起關鍵作用。水蛭素（hirudin )為一種潛在的臨床凝血酶肽抑制劑，其由65個胺基酸組成。但較短之肽區段亦已證實有效治療血检形成（一種危及生命之病狀）。 US 5,196,404揭示此等較短肽之一比伐盧定，其為有效凝血酶抑制劑。比伐盧定亦稱為水經肽（hirulog ) -8、 BG-8967、依盧丹（Efludan)、Angiomax®或 Hirulog®且具 ® 有式I中所給出之胺基酸序列。 WO 98/5 0563描述一種藉由重組技術來製備多種肽（包括比伐盧定）之方法。該方法包含使肽表現為融合蛋白質之一部分，隨後由醯基受體自該融合蛋白質釋放該肽。

Okayama 等人 Chem. Pharm. Bull. 1996，44, 1344-1350 及 Steinmetzer 等人 1999，2(55, 598-605設計在王樹脂（Wang resin )上固相合成不同水蛭肽。王樹脂需要用濃三氟乙酸使肽自樹脂裂解。在製備比 3 201024317 伐盧定之類似固相合成方法中，WO 91/02750揭示一種依序方法：將單一經Boc保護之胺基酸連接於B〇cL白胺酸二乙烯基苯樹脂，隨後使用HF/對曱酚/硫酸乙基甲酯同時脫除保護基及脫離’且隨後;東乾及純化。在兩種情況下，使肽自樹脂裂解需要侵蝕性酸性條件，可能伴隨整體脫除保護基且可能導致與胺基酸殘基進行不欲副反應，因此不利地影響產物純度。此外，副反應通常藉由錯誤併入、單一胺基酸之雙重命中（double-hit)及/或外消旋化而出現在固相合成中且產生具有極類似於目標肽之結構的副產物。因此難以純化且導致產量損失。當尚連接於固體載體時，尤其較長肽易採用不規則構形，使得更難以將其他胺基酸連接於生長中之鏈。因此，此問題隨肽長度增加而增加。 WO 2007/033383揭示一種製造比伐盧定之方法，其係基於固相合成或固相合成與溶液合成之組合（.混合方法）。在一具體實例中，在高度酸不穩定樹脂上製備比伐盧定肽序列。在另一具體實例中，藉由使側鏈經保護之#端肽片段與側鏈經保護之C端肽片段偶合且隨後使用強酸性條件脫除保護基來製備比伐盧定《在此情況下，該等#端片段以及該C端片段之前驅體（亦即減去Leu之狀序列）皆藉由固相合成來製備。此策略之缺點之一為實質上形成 D-Tyr19-比伐盧定。此雜質難以移除，因此需要額外努力、成本及產量損失來獲得純化產物。另外，WO 2007/033383 之實施例中所獲得之經純化比伐盧定的量僅在數公克範圍内’說明此方法不適於大規模製造高純度比伐盧定。 201024317 本發明之-目標在於提供一種更有效之比成’其克服線性固相合成之已知缺點且適：造。此目標已藉由如申請專利範圍第i項之方法、如" 專利範圍第項之肽片段及如申請專利範圍第29項之此等肽片段之用途來達成。較佳具體實例構成附屬項利範圍第2-18及20-28項之標的。本發明係關於一種按照彙集方法之方法，亦即分別人成個別片段且接著在溶液相中偶合來構建所需肽。彙集：成之挑戰在於❹】適合的片段及其偶合順細克服棄集^ 成之已知缺點。此等缺點為偶合及分離期間之溶解性問題、相較於固相合成反應速率較低、及偶合期間c端片段外消旋化危險高❹。比伐盧定由2G個胺基酸殘基組成，以至於存在大量的可能片段及偶合順序。另外，比伐盧定含有 7 個胺基酸殘基，亦即-Arg3·、_Asn9_、.Asp"·、_Glul3_、 -Glu14-、_GluW及-Glul，所有均具有需要適當保護及脫除保護之反應性侧鏈官能基。單_片段之N端及〇端亦需要適當保護及脫除保護，因此增加找到達成本發明目標之途徑的挑戰性。申請者意外地發現式I之比伐盧定宜藉由如下所定義之[(1 + 2) + (3 + {4 + 5})]策略來構建。數字ι、2及5表示式V、VI及X之3個肽片段，數字3表示式ΧΙΠ之天冬胺酸衍生物，且數字4表示式XI之笨丙胺酸衍生物。本發明 5 201024317 係關於—種在溶液相中製造式i之比伐盧定的方法，其包含以下步驟：

(a )使下式之視情況側鏈經保護之肽 P1 -D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) ( V)，其中P1為保護基，與下式之視情況側鏈經保護之肽反應 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly,0-OP2 (SEQ ID NO 5 ) (VI)，其中P2為保護基，產生下式之視情況侧鏈經保護之肽 PI -D-PheLPro-Arg-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-Asn-GlyW-OP】 (SEQ ID NO 2) (VII)，其中PI及P2如上所定義， (b)移除步驟（a)中所產生之肽的p2，產生下式之視情況側鏈經保護之肽 P1 - D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-〇H ( SEQ ID NO 2 ) ( II )，其中PI如上所定義， (C )使下式之側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) ( X)，其中P3為保護基，與下式之苯丙胺酸反應 201024317 P4-Phe12-OH (XI)，其中P4為保護基，產生下式之側鍵經保護之肽 P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9 ) ( XII)，其中P3及P4如上所定義， (d)移除步驟（c)中所產生之肽的P4，產生式XII之ΛΓ端保護基經脫除及側鍵經保護之相應肽， ® ( e )使步驟（d )中所產生之式XII之肽與下式之側鏈經保護之天冬胺酸反應 P5-Aspn-OH ( XIII) ’ 其中P5為保護基，產生下式之側鏈經保護之肽 P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3 ) ( XIV)，其中P3及P5如上所定義， ❹ (Ο移除步驟（e)中所產生之肽的P5，產生下式之視情況側鍵經保護之肽 H-Asp-Phc-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3 ) ( III)，其中P3如上所定義， (g )使步驟（b )中所產生的式π之視情況側鏈經保護之肽與步驟（f)中所產生的式ΙΠ之侧鏈經保護之肽反應，產生下式之側鏈經保護之肽 7 201024317

Pl-D-Phe'-Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-

Leu20-〇P3 ( SEQ ID NO 1 ) (IV)，其中PI及P3如上所定義， (h)移除步驟（g)中所產生之肽的p卜p3及側鏈保護基，產生式I之比伐盧定。本發明之方法經由彙集片段合成，非常有效地合成比伐盧定，可容易適合於工業規模製造。 C端保護基P2 (對於肽VI)及P3 (對於肽χ)可為與其他保護基正交之任何保護基。適合實例為可藉由皂化移除之c端保護基，如甲基（Me)或乙基（Et)，或可藉由催化性氫化移除之C端保護基。在本發明方法之一具體實例中，在步驟（a)中，保護基P1為對催化性氫化穩定之保護基且保護基P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基；在步驟（〇中，保護基P3為可藉由催化性氫化移除之保護基且保護基P4為與式X之肽之侧鏈保護基及p3正交的保護基；且在步驟（e)中，保護基p5為與式χπ及 XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，從而得到包含以下步驟之溶液相方法： (a )使下式之視情況侧鏈經保護之肽 P1 -D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4 ) 其中P1為對催化性氫化穩定之保護基， (V)， 201024317 與下式之視情況側鏈經保護之肽反應 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) ( VI)，其中P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，產生下式之視情況側鏈經保護之肽 P1 -D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)， © 其中PI及P2如上所定義， (b)移除步驟（a)中所產生之肽的P2，產生下式之視情況側鏈經保護之肽 P1 - D-Phe1 -Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH ( SEQ ID NO 2 ) (II)，其中PI如上所定義， (c )使下式之側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ® ( SEQ ID NO 8) ( X)，其中P3為可藉由催化性氫化移除之保護基，與下式之苯丙胺酸反應 P4-Phe12-OH (XI)，其中P4為與式X之肽之侧鏈保護基及P3正交的保護基，產生下式之側鏈經保護之肽 P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 9 201024317 (XII) ’ (SEQ ID NO 9) 其中P3及P4如上所定義， (d) 移除步驟（c)中所產生之肽的P4，產生式χπ之#端保護基經脫除及側鏈經保護之相應肽， (e) 使步驟（d)中所產生之式XII之肽與下式之侧鏈經保護之天冬胺酸反應 P5-Asp11-OH (XIII)，其中P5為與式XII及χπΐ之狀/胺基酸之側鍵保護基及P3正交的保護基，產生下式之側鏈經保護之肽 P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20- (XIV)， OP3 ( SEQ ID NO 3 ) 其中P3及P5如上所定義， (Ο移除步驟（e)中所產生之肽的P5，產生下式之視情況側鏈經保護之肽 H-Asp-Phe-Glu-Glu-IleI5-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20- OP3 ( SEQ ID NO 3) ( III)，其中P3如上所定義， (g )使步驟（b )中所產生的式π之視情況側鏈經保護之肽與步驟（f)中所產生的式III之側鏈經保護之肽反應，產生下式之側鏈經保護之肽

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-〇P3 ( SEQ ID NO 1 ) (IV), 201024317 其中P1及P3如上所定義， (h)移除步驟（g)中所產生之肽之P1、P3及側鏈保護基，產生下式之比伐盧定 H-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-

Leu20-OH ( SEQ ID NO 1 ) (I)〇此處及下文中’作為特性化兩個不同保護基之行為屬性的術語「正交（orthogonal )」應理解為意謂一保護基可藉 ® 由某種方法裂解而不會影響另一保護基。舉例而言，「與侧鏈保護基正交之保護基」意謂可藉由某種方法裂解而不會影響侧鏈保護基之保護基。此策略之優點在於其可以商業規模應用，因此能夠製造具有極佳純度且每批數公斤量之比伐盧定而不形成難處理之雜質，如D-Phe12-比伐盧定、DTyr'比伐盧定或Asp9_ 比伐盧定。舉例而言，當使經保護之Asp_phel2片段與式χ 之經保護之肽片段偶合時，形成5% D_phel2_比伐盧定此 ❿形成可意外地由本發明方法抑制。如本發明方法中所應用之催化性氫化的優點在於其為非常乾淨之反應方法，不同於其他脫除保護基方法，其不會誘發碳陽離子形成，使得由該等碳陽離子與目標肽之間的反應所產生之不欲副產物不會形成。比較之下，W〇2〇〇7/〇33383中所揭示之途徑中，藉由使用第三丁基（tBu;呈第三丁基越或第三丁醋形式）來保護’第三丁基為僅可藉由酸解（例如用鹽酸或三氟乙酸）來裂解之保護基。此酸解會誘發諸如第三丁基化路胺 11 201024317 酸之副產物形成，該等副產物由於具有相似物理化學性質而難以在最終產物中除去。酸解之另一缺點在於處置大量強酸（諸如三氟乙酸）對製造與環境皆產生安全問題，尤其是商業規模。進一步比較之’若使用可藉由皂化移除之c端保護基 (諸如Et)作為式VI及VII之肽之P2，則在鹼性條件下將. 其移除可誘發天冬醯胺殘基（_Asn9·)及精胺酸殘基（_Arg3_ ). 實質上降解。即使既不用酸，亦不用鹼，而用酶促反應之較溫和方法（如用酶枯草桿菌蛋白（subtiHsin)皂化）來實❽ 現皂化，亦觀察到天冬醯胺殘基之降解引起實質上形成 Asp9-比伐盧定。在本發明之單一反應步驟之前、期間及之後，所有肽片段以及所有偶合產物均可按原樣或以適合之鹽形式存在，視分子之物理化學性質及/或反應條件而定。適合之鹽為例如與三乙胺（TEA )、二環己基胺（DCHA )、鹽酸（HC1) 及三氟乙酸（TFA )形成之鹽。在步驟（h)中，P卜P3及側鏈保護基可隨後或同時移 ◎ 除。較佳地，在步驟（h)中，首先同時移除P3及側鏈保護基，且隨後移除P1。典型地，步驟（a)至（g)中每一者後所獲得之肽片段在進行下一步驟之前分離。申請者意外地發現，在步驟（h) 中，在移除P1之前可無需分離在同時移除p3及側鏈保護基後所獲得之肽，同時獲得類似產量且對純度無負作用。 12 201024317 此令人驚訝，因為通常分離步驟對於移除在隨後脫除保護基步驟中反應且由此降低目標肽之純度的副產物而言必不可少。此發現對整個製程之成本及時間具有積極作用且典型地使脫除pi之肽的產量較高，因為分離通常使產物有所損失。因此’在本發明方法之一更佳具體實例中，在步驟 (h)中，在移除pi之前不分離在同時移除p3及側鏈保護基後所獲得之肽。對催化性氫化穩定之任何通常已知之保護基可用作 ® P1。適合實例為第三丁氧羰基（B〇c)、2_(聯苯_4_基）丙_2_ 基氧羰基（Bpoc)、2-(3,5-二甲氧基苯基）丙_2_基氧羰基 (Ddz )、第-9-基曱氧幾基（Fmoc )、金剛烷基]氧羰基 (Adc )、第三戊氧羰基（A〇c )、二苯基膦基（Dpp )、2_(甲基％醯基）乙氧羰基（Msc )及欧醯基（Pht )。p 1較佳為b〇c、 Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc，P1 更佳為 b〇c。可使用分別與式II之片段（對於p4 )、式χιΙΙ之胺基 ❹酸及式XIV之片段（對於Ρ5 )的側鏈保護基及Ρ3正交之任何通常已知及適合之保護基作為保護基Ρ4及ρ5α較佳地，Ρ4及Ρ5對催化性氫化穩定且與侧鏈保護基及ρ3正交。舉例而s ’適合保護基為b〇c、BpOC、Ddz、Fmoc、Adc、 Aoc、DPP、Msc 及 Pht。P4 及/或 P5 較佳為 Boc、Bpoc ' Ddz、Fm〇c 或 MSC ; P4 及/或 P5 更佳為 Boc e 在本發明方法之一較佳具體實例中，P丨、P4及P5中至〉、者為 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc ; PI、P4 及 P5 中至少一者較佳為Boc。 13 201024317 可使用可藉由催化性氫化移除之任何通常已知之保護基作為保護基P3。適合實例為苯曱基（Bzi)、苯甲氧基甲基（Bom )、苯甲醯甲基（Pac ) ' 4_硝基苯甲基（〇Nbz )、 4-"比啶基甲基（Pic )及4-磺酸基苯甲基。P3較佳為Bzl、 Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom。P3更佳為Bzl。保護基Bom對酸敏感且保護基Boc、Bp〇c及Ddz 可由酸裂解’亦即Bom不與Boc、Bpoc或Dzd正交。此處及下文中，此行為排除同時使用Bom與保護基Boc、Bp〇c 或Dzd中之一者。可使用可藉由催化性氫化移除且在側鏈經保護之情況下同時與側鏈保護基正交之任何通常已知的保護基作為保護基P2。適合實例為Bz卜Bom、Pac、ONbz、Pic及4-續酸基本曱基。P2較佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4_ 磺酸基苯甲基；P2更佳為Bzl。在一較佳具體實例中，P2及P3中至少一者為Bzl、 Bom、Pac、ONbz、Pic或4_磺酸基苯甲基，其限制條件為若P4或P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom。P2與 P3中至少一者較佳為Bzl。在一更佳具體實例中，P卜P4及P5中至少一者為B〇c、 Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc ;且 P2 及 P3 中至少一者為 Bzl、 Bom、Pac、〇NbZ、Pic或4-磺酸基苯甲基，其限制條件為若P4或P5為B〇C、Bp〇C或Ddz’則P3不為Bom。較佳地， PI、P4及P5中至少一者為Boc且P2及p3中至少—者為 201024317

Bz卜較佳地，在本發明之方法中，式III、IV、X及XII-XIV 之側鏈經保護之肽/胺基酸經至少一個選自由Bzl、Bom、

Pac ONbz Pie及4·續酸基笨甲基所組成之群組的側鍵保護基保護；其限制條件為若“或？5為M B声或Ddz，則側鏈保護基均不為Bom。詳口之，在本發明之方法中，式Ιιι ιν χ及χιιχιν 之側鏈經保護之肽/脸篡舱姑s _ 胺丞酸經至少一個作為側鏈保護基之

Bzl保護。典型地’式V之狀的側鏈在精胺酸殘基處經適合側鏈保護基（諸如石肖基）保護，以避免不欲副反應。典型地，式VI之肽的側鏈在天冬醯胺殘基處經適合侧鏈保護基保護，尤其對於㈣經，以避免*欲副反應。適合實例為一苯甲基（Trt ) ’尤其在#端經FmQe保護之情況下。意外地，巾請者發現對於式VAVH可無需側鍵保護’此便於其組裝與其偶合產物（亦即式νπ之肤）之c 端脫除保護基。此發現允許不考慮c端與側鏈保護之間的正交性，因此使途徑更為簡單。另—優點在於相應未經保

護之起始物質比經保講之你I访β β A 1卞曼乙物質購買便宜，此對於大規模製造尤為重要。較佳地，在本發明之方法中，在步驟（a)中，式V及 W之視情況側鏈經保護之肽中至少―者的側鏈未經保護。在兩種肽之側鏈皆未經保護之情況下，步驟（a)及（b)中所得之式VII及II之肽的側鏈亦未經保護。 15 201024317 最佳地’在本發明之方法中，在步驟（a )中，式V與VI之肽的側鏈皆未經保護；在步驟（c)中’式X之肽經至少一個選自由bzi、Bom、

Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基笨甲基所組成之群組的側鏈保護基、較佳Bzl保護’其限制條件為若p4或p5為b〇c、Bpoc 或Ddz，則側鏈保護基均不為B〇m ;及在步驟（e)中’式X之天冬胺酸衍生物經選自由Bzl、Bom、

Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯曱基所組成之群組的側鏈保護基、較佳Bzl保護，其限制條件為若p4或p5為b〇c、Bpoc Ο 或Ddz，則側鍵保護基均不為Bom。甚至更佳地’在本發明之方法中，在步驟（a)中，式 V與VI之肽的側鏈均未經保護；且在步驟（c )與（e )中，至少一個側鏈保護基為Bzl。在本發明方法之一最佳具體實例中，在步驟（c )中，式X之肽的側鏈經保護4個麩胺酸及1個酪胺酸之侧鏈的5 個側鏈保護基保護，由此得到下式之肽 H-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)- ❹ Tyr(P10)-Leu20-OP3 ( SEQ ID 8 ) ( Xb )，其中P3為可藉由催化性氫化移除之保護基，P3較佳為 Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯甲基；P3更佳為Bzl ;且 P6至P10各自獨立地選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic 及4-磺酸基苯甲基所組成之群組；P6至Pl〇各自較佳為 Bzl ;且 16 201024317 在步驟（e )中’式χπΐ之側鏈經保護之天冬胺酸為 P5-Asp(〇Pll)1,.〇H » 其中P5為與式ΧΠ及ΧΠΙ之肽/胺基酸的側鏈保護基及p3 正交之保護基；P5較佳對催化性氫化為穩定的且與侧鏈保護基及P3正交；P5更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ; P5 最佳為 Boc ;且 Pll 係選自由 Bzl、Bom、Pac、ONbz、

Pic及4-磺酸基苯甲基所組成之群組；pn較佳為Bzl。此處及下文中，對於C端與側鏈，縮寫「OP[數字]」 ® 表示酯（與側鏈及C端兩者之羧酸反應後），而縮寫r p[數字]」表示醚。舉例而言’「OBzl」表示苯甲酯（與侧鍵或c 端之羧基反應後）’而縮寫「Bzl」表示苯甲醚（與例如酪胺酸之酚系羥基反應後）。較佳地，在本發明之方法中，P卜P4及P5為Boc ; P2、 P3、P6、P7、P8、P9、P10 及 Pll 為 Bzl ; 更佳地，PI、P4 及 P5 為 Boc，P2、P3、P6、P7、P8、P9、 P10及P11為Bzl且式V及VI之肽的側鏈未經保護，從而 ® 得到包含以下步驟之溶液相方法： (a)使

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH ( SEQ ID NO 4 ) 與

H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl ( SEQ ID NO 5) 反應，產生

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-G 17 201024317 ly10-OBzl ( SEQ ID NO 2 ) (b)移除步驟（a)中所產生之肽的Bzi，產生

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH ( SEQ ID NO 2) (c )使 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu( OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID 8 ) 與

Boc-Phe12-OH 反應，產生

Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9)， (d) 移除步驟（c)中所產生之肽的Boc，產生N端保護基脫除之相應肽， (e) 使步驟（d)中所產生之肽與

Boc-Asp(OBzl)n-OH 反應，產生

Boc-Asp(OBzl)n-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3 ) (f) 移除步驟（e)中所產生之肽的Boc，產生

H-Asp(OBzl)n-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro -Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ 201024317 ID NO 3 ) (g) 使步驟（b)中所產生之肽與步驟（f)中所產生之肽反應，產生

Boc-D-Phe -Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1 )，及 (h) 移除步驟（g)中所產生之肽的Boc、保護C端之Bzl 及所有保護側鏈之Bzl，產生式I之比伐盧定。此較佳具體實例非常簡單且無需複雜的保護基策略。較佳地，在步驟（h)中’首先同時移除保護c端之 Bzl及所有保護侧鏈之Bzl，得到#端經Boc保護之比伐盧定

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-

Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-〇H (SEQ ID NO 1 ) ，且隨後移除Boc。較佳地，同時移除保護C端之Bzl及所有保護側鏈之 Bzl後所獲得之iV端經Boc保護的比伐盧定在移除b〇c之前不分離。 C端保護基P2、P3以及侧鏈保護基P6至Pi 1在其可藉由催化性氫化移除之情況下可藉由熟習此項技術者已知之任何催化性氫化方法來移除。氫化可藉由元素氫或藉由使用適合之氫供體來完成，該氫供體如甲酸、曱酸銨、1 19 201024317 環已二烯、1,4-環已二烯或硼烷加合物（諸如 ieri-BuNH2.BH3 )。適合氫化催化劑為例如基於貴金屬之氫化催化劑’尤其為稱為鉑類金屬之金屬’亦即铑、釕、鈀、蛾、銥及鉑。氫化催化劑宜在載體（諸如木炭）上。視所需活性而定，氫化催化劑可「中毒」以降低其活性，詳言之經硫化。

視情況，可將適合助催化劑添加至載體氫化中。該等助催化劑可為釩或鉬化合物，如氧化釩（V) ( V205 )、偏釩酸銨（NH4V03)或鉬酸鈉（Na2Mo04)。在一較佳具體實例中，催化劑再循環，此對生產成本與環境皆具有正面作用。對於催化劑再循環，可應用任何適於催化劑再循環之處理。

較佳地，移除步驟（b)及（h)中之至少一者在溶劑中以氫氣及鈀/木炭進行。可使用可溶解反應物之任何惰性液體溶劑作為溶劑。適用溶劑包括函化芳族烴，諸如氣苯及二氟甲苯；齒化烴，諸如二氣甲烷及二氣乙烯；醇，諸如曱醇、乙醇、2-丙醇、丁醇及苯曱醇；鹵化醇，諸如2,2,2_ 二氟乙醇；羧酸，諸如乙酸；羧酸酯及内酯，諸如乙酸乙醋、乙酸甲醋及戊内醋；及含有雜原子之有機溶劑，諸如 ^甲基吼洛咬酮（NMP)或；^•二曱基甲酿胺（DMF)。溶劑可單獨使用，以溶劍混合物形式或以與水之混合物形式使用。視肽片段之溶解性而定，甚至可使用純水因此，在步驟（b)中，可在作為溶劑之純水中移除丙酮與水之混較佳溶劑係選自由DMF、丙蜩、乙酸、 20 201024317 合物及乙酸與水之混合物所組成之群組。在一較佳具體實例中，移除步驟（b)在選自由DMF、丙酮、水及丙酮與水之混合物所組成之群組的溶劑中進打，尤其在DMF中進行β 移除步驟（b)更佳在卿中進行。意外地發現移除步驟（b)中所用之溶劑對最後比伐盧定之雜質概況有影響觀察1到DMF優於例如丙網與水之混合物，從而雙重併

Pro-Arg-Pr〇-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- ( SEQ ID NO 2 )後所形成之雜質可得以抑制。在另-較佳具體實例中，移除步驟（h)在乙酸或乙酸之混0物中進行；尤其在乙酸與水之混合物中進行。移除步驟（b) & (h)之氫化過程可於大氣麼力或超大氣壓力下進行。典型壓力為1巴（bar)至1()()巴。宜使用1巴至70巴、尤其2巴至1〇巴。 ❹ 、一移除步驟（b)及（h)之氫化反應可於低溫或高溫下進仃。例示性溫度範圍為-抓至7(rc。較佳為代與㈣之間的溫度，且最佳為lot至4(TC之範圍。 ’ 相中^發明方法之偶合步驟（小（小（6)&4)在溶液行且可使用肽合成技術中已知之反應條件別側鏈夫她奴祕 > 卞延打。各禾絰保濩或經保護之肽片段/胺基酸衍生物使用春v 并一*努偶合劑完成，例如鱗或纟床偶合劑，如六氟磷酸苯 ==唑·Κ基氧基-參（二曱基胺基）鱗（BOP)、六氟磷酸苯并并一丨_基氧基-參（N_D比咯啶基）鱗（pyB〇p)、六氟磷酸〇_(笨一唑基）-1，1，3,3-四甲基姝（HBTU)、六氟磷酸〇_(6_ 21 201024317 氣苯并三唑-1-基）-l，l，3,3-四甲基I尿（HCTU)、四氟硼酸〇-(6·氣苯并三唑-1-基3 曱基！尿（TCTU)、六氟磷酸〇·(7-氮雜苯并三唑-1-基）-l，l，3,3-四甲基ί尿（HATU)、四氟硼酸0-(7-氮雜苯并三唑-1-基）-^3,3-四甲基！尿 (TATU)、四氟硼酸〇·(苯并三唑-卜基）-mi四甲基雀尿 (TBTU)及四氟硼酸〇_[氰基（乙氧羰基）亞曱胺基卜丨丄^ 四甲基！尿（TOTU );或碳化二亞胺偶合劑，如二異丙基碳化二亞胺（DIC)、二環己基碳化二亞胺（DCC)及水溶性峡化一亞胺（WSCDI ) ’如1·乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳 ❹ 化二亞胺（EDC )，視情況呈鹽形式，如呈鹽酸鹽形式。其他偶合技術使用預先形成之活性酯，諸如羥基丁二醯亞胺（HOSu)及對硝基苯酚（HONp)酯；預先形成之對稱酸酐、非對稱酸酐，諸如ΑΓ-羧酸酐（NCA);及醯鹵，諸如酿氟或醢氣。較佳偶合劑為碳化二亞胺偶合劑，最佳為DiC 或EDC，適合為EDC鹽，諸如EDC.HC1。偶合步驟（a)、（c)、（e)及（g)之反應混合物宜含有鹼，較佳為三級胺驗’其脫除羧基組份之質子且中和胺基 ❹ 組份之相對離子，且因此促進當場反應。適合鹼為例如三烷基胺，如况#-二異丙基乙胺（DIPEA)或三乙胺（TEA); N，N- 一烧基本胺’如W-二乙基苯胺；2，4,6 -三院基η比咬，如2,4,6-三曱基吡啶；及沁烷基嗎啉，如f甲基嗎琳。詳言之，反應混合物宜含有TEA或DIPEA作為鹼。偶合步驟（a)、（c)、（e)及（g)之反應混合物可另外含有輔助親核試劑作為添加劑’因為該等親核試劑對抑制 22 201024317 不欲副反應具有積極作用。可應用任何已知之辅助親核試劑。適合輔助親核試劑之實例為丨_羥基苯并三唑（H〇Bt )、 iV-羥基丁二醯亞胺（HOSu )、iV-羥基_3,4-二氫-4-側氧基 -1，2,3-苯并三卩井（HOOBt)及丨_羥基_7_氮雜苯并三唑 (HOAt)。偶合步驟之反應混合物較佳另外含有H〇Bt。在一較佳具體實例中，偶合步驟（a)、（c)、（e)及（g) 之偶合混合物係選自由DIC/HOBt/TEA、EDC/HOBt/DIPEA 及EDC/HOBt/TEA所組成之群組。 ® 可使用可溶解反應物之任何惰性液體溶劑作為偶合步驟（a )、（ c )、（ e )及（g )之溶劑。適用偶合溶劑為水溶性溶劑，如二甲亞砜（DMS〇)、二噁烷、四氫呋喃（thf)、 1-甲基-2-吡咯啶酮（>^11>)、愚沁二甲基甲醯胺（]^17)、二甲基乙醯胺（DMA)或其任何混合物；非水溶性溶劑，如二氣甲烷（DCM)、乙酸乙酯或其任何混合物；及水溶性溶劑與非水溶性溶劑之間的任何適合混合物，包括與 _ 水之混合物。較佳溶劑為DMF或DMF與水之混合物。步驟（d)、（f)及（h)之#端保護基脫除可使用肽合成技術中已知之反應條件進行且視保護基pl、P4及p5之性質而定。在保護基為B〇c之情況下適合由酸、較佳由三氟乙酸來脫除保護基，該酸可以純形式或以與惰性溶劑 (如甲苯、THF或甲苯與THF之混合物）之混合物形式應用。在保護基為Fmoc之情況下，可藉由與鹼、宜與二級胺 (諸如哌啶或二乙胺）反應來脫除#端保護基。典型地，脫除#端保護基在溶劑中進行，該溶劑可為不干擾反應物之 23 201024317 任何溶劑，如氣化烴，諸如二氯甲烷；烷基化醯胺及内醯. 胺，諸如二甲基甲酿胺< b甲基I…酮；芳族烴，諸如甲苯；謎’諸如THF或其任何混合物。脫除MB〇c基團較佳在甲苯巾或在苯盼、f苯及之混合物中進行。步驟（h)後所獲得之粗比伐盧定可藉由習知方法，如製備型HPLC或逆流分布法來純化。可重複純化步驟。上述情況亦適用於步驟（3)至（§)後所獲得之肽片段。最終式I之比伐盧定可根據肽化學中已知之分離方法，諸如沈殿或來乾來分離。 q 式V及VI之視情況側鏈經保護之肽及式χ之侧鏈經保護之肽可使用習知肽合成方法來製備，例如溶液相合成（同義》司.均相肽合成，縮寫為HPPS)、固相肽合成（spps) 或SPPS與HPPS之組合，稱為混合合成（同義詞：混合相肽合成，縮寫為MPPS)。在本發明方法之一具體實例中，選自由式V之視情況側鍵經保護之肽、式VI之視情況側鏈經保護之肽及式χ之側鏈經保護之肽組成的群之肽中之至少一者在在先的程序 ο 中藉由溶液相合成來製備。較佳地，此等肽以相應二肽，亦即序列模式-D-Phe^Pro-、-Arg3-Pr〇_、_Gly5_Gly_、 -Gly7-Gly-、-Asn9-Gly-、-G1u13-G1u-、-Ile15_Pro_、_Glui7_Glu- 或-Tyri9-LeU-開始組裝。#端、C端及側鏈保護基以及反應條件可為如熟習此項技術者已知之任何保護基及條件，較佳與上文所述相同或相似。詳言之，在溶液相中製造下式之視情況側鏈經保護之 24 201024317 肽

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH ( SEQ ID NO 4 ) (V)，較佳為側鏈未經保護之肽Va，其中 P1為保護基’ P1較佳為對催化性氫化穩定之保護基，更佳為 Boc、Bp〇c、Ddz、Fmoc 或 Msc，P1 最佳為 b〇c ; 的方法包含以下步驟：

、a )移除下式之視情況側鏈經保護之二肽 (XVI)， P12-Arg-Pro4-OP13 較佳為侧鏈未經保護之二肽XVIa，的 P12，其中 P12為保護基，P12較佳為與側鏈保護基及P13正交之保護基，P12更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基及P13正交之保護基，P12更佳為Boc、Bp〇c、Ddz、〇 Fmoc 或 MSC，Ρ12 最佳為 Boc ;且

Pl3為保護基，諸如Bzl、曱基（Me)或乙基（Ε〇;

Pl3較佳為可藉由催化性氫化移除且與側鏈保護基正交之保護基，P13更佳為Bzh Bom、Pac、ONbz、Pic 或4-續酸基苯曱基，pi3最佳為Bzl ; 其限制條件為右P12為b〇c、Bpoc或Ddz，則pi3不為 Bom ; ^ U \ 使步驟（a)中所產生之#端保護基脫除且視情況側鍵絰保護之二肽、較佳相應側鏈未經保護之二肽與下式 25 201024317 之視情況側鏈經保護之二肽反應

Pl-D-Phe1-Pro-0 W (XVII)，較佳與側鏈未經保護之二肽XVIIa反應，其中 P1如上所定義，且w為氫或預先活化基團，諸如五氟苯基（Pfp )，產生下式之視情況侧鏈經保護之肽

Pl-D-Phe'-Pro-Arg-Pro-OPH ( SEQ ID NO 4) ❿ (XV)，較佳為側鏈未經保護之肽XVa，其中 P1及P13如上所定義，及 (c )移除步驟（b )中所產生之式χν之視情況側鏈經保護

之狀、較佳側鏈未經保護之肽XVa的P丨3，產生式V 之視情況側鏈經保護之肽；較佳為侧鏈未經保護之肽 Va ° ❹ 亦詳言之，在溶液相中製造下式之視情況侧鏈經保護之肽 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-GlyI0-〇P2 ( SEQ ID NO 5 ) (VI)，較佳為側鏈未經保護之肽VIa，其中 P2為保護基，P2較佳為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，P2更佳為Bzi、B〇m、 26 201024317 〜、〇NbZ、Pic或4_績酸基苯甲基，P2最佳為Bzl 的方法包含以下步驟： a )移除下式之視情況侧鏈經保護之二肽

P14-Asn-Gly10-〇P2 (XVI 較佳為側鏈未經保護之二肽XVIIIa的P 14，其中 P14為保護基，pi4較佳為與侧鏈保護基及p2正交之保護基，P14更佳為對催化性氫化穩定且與侧鏈保護基及P2正交之保護基，pi4更佳為B〇c、Bp〇c、Ddz、Fm〇c 或Msc ’ P14最佳為Boc ;且 P2如上所定義；其限制條件為若P14為B〇c、Bpoc或Ddz，則p2不為 Bom ; (b)使步驟（a)中所產生之#端保護基脫除且視情況側鏈

經保護之二肽、較佳侧鏈未經保護之相應二肽與下式之四甘胺酸反應

P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-〇H (SEQIDNO10) (IXX), 其中 P15為保護基，PI 5較佳為與式χχ之肽之侧鏈保護基正交的保護基，Ρ15更佳為對催化性氫化穩定且與式 XX之肽之侧鏈保護基正交的保護基，ρ15更佳為B〇c、 Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc，P15 最佳為 Boc ; 產生下式之視情況側鏈經保護之肽 27 201024317

Pl5-Gly5.Gly-Gly-Gly-Asn-Gly,0-〇P2 (SEQ ID NO 5) (XX), 較佳為側鏈未經保護之肽XXa，其中 P2及P15如上所定義，其限制條件為若P15為Boc、Bpoc或Ddz，則P2不為 Bom ;及 (c )移除步驟（b )中所產生的式χχ之視情況侧鏈經保護之肽、較佳側鏈未經保護之肽xxa的！>15，產生式¥1 〇之視情況側鏈經保護之肽，較佳為側鏈未經保護之肽 Via。另外詳言之’在溶液相中製造下式之視情況側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 8) (χ), 較佳下式之肽的方法 H-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Ty ® r(P10)-Leu20-〇P3 ( SEQ ID 8) ( Xb )，其中 p3為保護基，P3較佳為可藉由催化性氫化移除之保護基， P3更佳為Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-續酸基苯曱基， P3最佳為Bzl，且 p6至Pl〇各自獨立地選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic 及4-磺酸基苯甲基所組成之群組，P6至Pl〇各自較佳為 28 201024317

Bz卜其包含以下步驟： (a )移除下式之側鏈經保護之肽 P16-Glu-Glu-Ty-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 6 ) ( VIII)，較佳下式之肽的P16 P16-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-〇P3 (SEQ ID NO 6 ) ( Vlllb )， © 其中 P3及P8至Pl〇如上所定義，且 P16為保護基，P16較佳為與側鍵保護基及P3正交之保護基，P16更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基及P3正交之保護基，pi6更佳為Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或Msc，P16最佳為Boc ; 其限制條件為若P16為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為 Bom ； ❹ (b)使步驟（a)中所產生的式νπι之#端保護基脫除且側鏈經保護之肽、較佳相應肽Vlllb與下式之側鏈經保護之肽反應

P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-OH (SEQ ID NO 7) (ΙΧ)，較佳與以下反應 P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-OH (SEQ ID NO 7) (ixb), 29 201024317 其中 P6及P7如上所定義，且 P17為保護基，P17較佳為與側鏈保護基正交之保護基’ P17更佳為對催化性氫化穩定且與側鏈保護基正交之保護基 ’P17 更佳為 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc， P17最佳為Boc，產生下式之側鏈經保護之肽 P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3

(SEQ ID NO 8 ) ( χχι) , Q 較佳為下式之肽 P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu (OP9)-Tyr(Pl〇)-Leu20-OP3 (SEQID8) (XXIb) 其中 p3、P6至Pl〇及P17如上所定義，其限制條件為若PI7為B〇c、Bpoc或Ddz，則P3或p6 至P10中之任一者不為B〇m，及 ❹ (c)移除步驟（b)中所產生的式χχι之側鏈經保護之肽、較佳相應肽XXIb之P17，產生式X之侧鏈經保護之肽’較佳為肽Xb。在本發明方法之另一具體實例中，選自由式V之視情况側鍵經保護之肽、4 VI之視情況側鍵經保護之肽及式X 之侧鍵經保護之肽組成的群之肽中《至少一者在在先的裎序中藉由固相合成來製備。從而可使用任何通常已知之 30 201024317 SPPS方法，包括SPPS構建嵌段及SPps條件。可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載體，或直接連接於連接子之固體載體’中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇（可溶性PEG聚合物）為可溶性樹脂之固體載體的一實例，因此在組裝單一構建嵌段後形成 ©可溶性肽-樹脂。較佳樹脂為具有三苯甲基或溴二苯甲基之基於聚苯乙烯之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氣化2氣三苯甲基樹脂（CTC樹脂）、氣化三苯甲基樹脂、氣化4_甲基二苯甲基樹脂及氣化4-甲氧基三苯甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成該等肽片段。本發明之另一目標為提供適用作本發明方法中之中間物的肽。詳言之，此等肽之一為選自由以下者所組成之群組的肽：

下式之視情況側鏈經保護之肽

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) ( v)，其中pi為保護基，PI較佳為對催化性氫化穩定之保護基 ’ P1 更佳為 B〇c、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc，pi 最佳為Boc ;且該肽的側鏈視情況在精胺酸殘基處經適合側鏈保護基 (諸如硝基）保護； (u)下式之視情況側鏈經保護之肽 31 201024317 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-〇P2 (SEQ ID NOS) (vi), 其中P2為保護基，P2較佳為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，p2更佳為 Bz卜Bom、pac、〇Nbz、Pic或4_磺酸基苯甲基，p2 最佳為Bzl ;且該肽的側鏈視情況在天冬酿胺殘基處經適合侧鏈保護基（諸如三苯甲基（Trt))保護；

(iii) 下式之視情況側鏈經保護之肽

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly10-〇P2 (SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1、P2及視情況存在之侧鏈保護基以及p 1、P2 及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義； (iv) 下式之側鏈經保護之肽

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly丨0-〇H (SEQ ID NO 2) (Ila)，其中PI及側鏈保護基以及PI及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了 Boc-D-PheLpro-ArgiPbO-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly1()-〇H ’其中Pbf為五甲基二氫苯并呋喃磺醯基且Trt為三苯曱基。此肽作為CTC樹脂上固相合成之產物揭示於WO 2007/0333 83中。相比之下，本發明式Ila之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成； 32 201024317 (V) 下式之側鏈未經保護之肽 P1 - D-Phe1 - Pro-Arg-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly'OH (SEQ ID NO 2) (lib)，其中PI以及PI之較佳含義如上所定義； (vi)下式之側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8 ) ( X )，其中P3為保護基，P3較佳為可藉由催化性氫化移除之保護基 ’ P3 更佳為 Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic 或 4-橫酸基苯曱基’ P3最佳為Bzi ;且側鍵保護基為至少一個適合侧鏈保護基，較佳選自由 Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-磺酸基苯曱基所組成之群組，更佳為Bzl ; (vii)下式之側鏈經保護之肽 P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3

(SEQ ID NO 9) ( XII)，其中P3及侧鏈保護基以及p3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且 P4為保護基’ P4較佳為與式χ之肽之側鏈保護基及 P3正交的保護基，P4更佳為B〇c、Bpoc、Ddz、Fmoc 或Msc ’ P4最佳為Boc，其限制條件為若p4為B〇c、 Bpoc 或 Ddz ’ 則 p3 不為 B〇m ; 或 P4為氫； 33 201024317 (viii ),下式之側鏈經保護之肽 P5-Asp-Phe-Glu-Glu-IleB-Pro-Glu-Glu-Tyr-Lei^O-OPS (SEQ ID NO 3 ) ( XIV)，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且 P5為保護基，P5較佳為與式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，P5更佳為Boc、 Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P5最佳為Boc，其限制條件為若P5為Boc、Bpoc或Ddz，貝U P3不為Bom，除了 Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu 5 其中 tBu為第三丁基。此肽作為前驅肽（亦即減去Leu之肽序列）及H-Leu-OtBu之間反應的產物揭示於 WO 2007/033383中。如WO 2007/033383中所揭示之前驅肽已在前述步驟中藉由CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu反應後，在繼續下一步之前不分離所揭示之肽。相比之下，本發明式XIV之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成，且在其形成後分離之； (ix)下式之側鏈經保護之肽 H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3 ) ( III )，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含 34 201024317 義如上所定義，除了 H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu2()-OtBu。此肽揭示於WO 2007/033383中。其為上述#端保護基脫除之肽。因此，如上文所解釋，其形成方式不同於本發明式III之側鏈經保護之肽；及 (X) 下式之側鏈經保護之肽

P1 -D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 1 ) (IV)，其中PI、P3及侧鏈保護基以及PI、P3及視情況存在之側鍵保護基之較佳含義如上所定義，除了 Boc-D-PheLPro-ArgpbO-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Il e15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu。此肽作為 Boc-D-Phe1 -Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(T rt)-Gly10-OH 與

H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu (兩者皆如上文所解釋）偶合後之產物揭示於 WO 2007/033 3 83中。因此，形成此偶合產物之方式不同於形成本發明式IV之側鏈經保護之肽的方式。 35 201024317 在一較佳具體實例中，式v之肽的側鏈未經保護且具有下式

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH ( SEQ ID NO 4 )，其包含比伐盧定之胺基酸位置1 -4的序列》在另一較佳具體實例中，式VI之肽的側鏈未經保護且具有下式 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl ( SEQ ID NO 5) > 其包含比伐盧定之胺基酸位置5_10的序列。在另一較佳具艎實例中，式VII之肽的側鏈未經保護且 © 具有下式

Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- 〇Bzl ( SEQ ID NO 2)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1 _ 1 0的序列。在另一較佳具體實例中，式lib之側鏈未經保護之肽為

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-〇H ( SEQ ID NO 2)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1·1〇的序列。 © 在另一較佳具體實例中’式X之側鏈經保護之肽為 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl )-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 8)，其包含比伐盧定之胺基酸位置13-20的序列。在另一較佳具體實例中，式XII之側鏈經保護之肽為

Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9)，或 36 201024317 H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu( OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9)，兩者皆包含比伐盧定之胺基酸位置12-20的序列。在另一較佳具體實例中，式XIV之側鏈經保護之肽為 Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Gl u(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3)，其包含比伐盧定之胺基酸位置11-20的序列。 ® 在另一較佳具體實例中，式ΠΙ之侧鏈經保護之肽為 H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3)，其包含比伐盧定之胺基酸位置11-20的序列。

在另一較佳具體實例中，式IV之側鏈經保護之肽為 Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile,5-Pro-Glu ® (OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 1)，其包含比伐盧定之胺基酸位置1-20的序列。在另一態樣中，本發明係關於一種選自由以下者所組成之群組之肽的用途：

(i )下式之視情況侧鏈經保護之肽 Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V)， 37 201024317 其中p 1為保護基，P1較佳為對催化性氫化穩定之保護基，P1 更佳為 Boc、Bpoc ' Ddz、Fmoc 或 Msc，P1 最佳為Boc ;且該肽的側鏈視情況在精胺酸殘基處經適合側鏈保護基 (諸如硝基）保護；較佳地，肽V的側鏈未經保護且具有下式

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH ( SEQ ID NO 4 )； (ii )下式之視情況側鏈經保護之肽

H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-〇P2 (SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為保護基，p2較佳為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基，p2更佳為

Bz卜B〇m、Pac、〇Nbz、pic或4_項酸基苯甲基，p2 最佳為Bzl ;且該肽的侧鏈視情況在天冬醯胺殘基處經適合側鏈保護基（諸如三苯甲基（Trt))保護；

較佳地，該肽VI的側鏈未經保護且具有下式

H-Gly5-Gly-Gly-Gly.Asn-Gly10-〇B2l ( SEQ ID NO 5)； (iii )下式之視情況侧鏈經保護之肽

Pl-D-Phe'-Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly10-OP2 ( SEQ ID NO 2 ) (VII)，其中PI、P2及視情況存在之侧鏈保護基以及pi、及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義； 38 201024317 較佳地，該肽VII之側鏈未經保護且具有下式

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly10-OBzl ( SEQ ID NO 2 )； (iv )下式之侧鏈經保護之肽

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH ( SEQ ID NO 2 ) ( Ila)，其中PI及侧鏈保護基以及PI及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義， © 除了 Boc-D-PheLPro-ArgiPbQ-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-

Asn(Trt)-Gly1()-OH，其中Pbf為五甲基二氫苯并呋喃磺醯基且Trt為三苯甲基。此肽作為CTC樹脂上固相合成之產物揭示於WO 2007/033383中。相比之下，本發明式Ila之側鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成； (v )下式之側鍵未經保護之肽 P1 - ϋ-ΡΙιε'-ΡΓΟ-Αα-ΡΓΟ-ΟΙ^^-ΟΙγ-ΟΙγ-ΟΙγ-Αβη- Ο — Gly10-OH ( SEQ ID NO 2 ) ( lib )，其中PI以及PI之較佳含義如上所定義；較佳地，式lib之侧鏈未經保護之肽為

Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH ( SEQ ID NO 2); (vi )下式之側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) ( X)， 39 201024317 其中P3為保護基，P3較佳為可藉由催化性氫化移除之保護基 ’ P3 更佳為 Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic 或 4- 確酸基苯曱基，P3最佳為Bzl ;且側鏈保護基較佳選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic 及4-磺酸基苯甲基所組成之群組，更佳為Bzl ; 較佳地，式X之側鏈經保護之肽為 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu( OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-〇Bzl ( SEQ ID NO 8 )； (vii )下式之侧鏈經保護之肽 P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9 ) (XII)，其中P3及側鏈保護基以及P3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且 P4為保護基’ P4較佳為與式X之肽之側鏈保護基及 P3正交的保遵基，P4更佳為b〇c、Bpoc、Ddz、Fmoc 或Msc，P4最佳為Boc，其限制條件為若P4為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為 Bom ；或 P4為氫；較佳地，式XII之側鏈經保護之肽為

Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9)，或 201024317 H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9 )； (viii )下式之側鏈經保護之肽 P5 -Asp-Phe-Glu-Glu-IleM-Pro-Glu-Glu-Tyr-Lei^O-OPS (SEQ ID NO 3) ( XIV)，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義；且 © P5為保護基，P5較佳為與式XII及XIII之肽/胺基酸之侧鏈保護基及P3正交的保護基，P5更佳為Boc、 Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，P5最佳為Boc，其限制條件為若P5為Boc、Bpoc或Ddz，則P3不為Bom，除了 Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu，其中 tBu為第三丁基。此肽作為前驅肽（亦即減去Leu之肽序列）及H-Leu-OtBu之間反應的產物揭示於WO ® 2007/033383中。如WO 2007/033383中所揭示之前驅肽已在前述步驟中藉由CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu反應後，在繼續下一步之前不分離所揭示之肽。相比之下，本發明式XIV之侧鏈經保護之肽藉由不同方式，亦即藉由溶液相合成來形成，且在形成後分離之；較佳地，式XIV之側鏈經保護之肽為

Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15- 41 201024317

Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3 )； (ix )下式之側鏈經保護之肽 H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3 ) ( III )，其中P3及側鏈保護基以及P3及側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了 H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu2°-OtBu。此肽揭示於WO 2007/033383中。其為上述iV端保護基脫除之肽。因此，如上文所解釋，其形成方式不同於本發明式III之側鏈經保護之肽；較佳地，式III之侧鏈經保護之肽為 H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3 )；及 (x )下式之側鏈經保護之肽 P1 -D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile^-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu^-OPB (SEQ ID NO 1 ) (IV)，其中PI、P3及側鏈保護基以及PI、P3及視情況存在之側鏈保護基之較佳含義如上所定義，除了 Boc-D-Phe^Pro-ArgCPbi^-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly- 201024317

Asn(Trt)-Gly10-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Il e15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu。此肽作為

Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(T rt)-Gly10-OH 與 H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu (兩者皆如上文所解釋）偶合後之產物揭示於 w〇 © 2007/033383中。因此’形成此偶合產物之方式不同於形成本發明式IV之側鏈經保護之肽的方式；較佳地，式IV之側鏈經保護之肽為

Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1 )；作為合成下式之比伐盧定中的中間物〇 H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-As p-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH ( SEQ ID NO 1 ) ( I)。本發明亦係關於一種製造式I之比伐盧定的方法，其包含以下步驟： (a )使下式之肽

Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (lie)， 43 201024317 其中pi為保護基，與下式之肽反應 H-Asp(OPll)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3) ( IIIc)，其中P3及P6至Pll各為Bzl，得到下式之肽 P1 -D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(OPll)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15- ©

Pro-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IVc)，其中PI、P3及P6至Pll如上所定義； (b) 移除步驟（a)中所產生之肽的側鍵及c端保護基p3 及P6至Pll ;及 (c) 移除步驟（b)中所產生之肽的#端保護基p卜得到式 I之比伐盧定。本發明之方法經由彙集片段合成，非常有效地合成比〇伐盧定，可容易適合於工業規模製造。此外，比伐盧定之此製備途徑非常簡單且無需使用複雜的保護基策略。另外’選擇多種構建喪段（片段）以避免組裝期間外消旋化或使其最少。在本發明之反應之前、期間及之後，所有片段以及所有偶σ產物均可按原樣存在或可以適合之鹽形式存在，視为子之物理化學性質及/或反應條件而定。適合相對離子為 44 201024317 例如三乙胺（TEA )、二環己基胺（DCHA )、鹽酸（HCl ) 及三氟乙酸（TFA )之鹽形式。可使用對催化性氳化穩定之任何保護基作為保護基 P1’諸如第三丁氧羰基（Boc)、苐-9-基甲氧羰基（Fmoc)、 h(3,5-二甲氧基苯基）丙_2_基氧羰基（Ddz)、金剛烷基-1-氧幾基（Adc )、第三戊氧羰基（Aoc )、二苯基膦基（Dpp )、 2·(甲基磺醯基）乙氧羰基（Msc )及酞醯基（pht )。保護基 P1 較佳為 Boc、Fmoc 或 Ddz。保護基P3及P6至P11較佳為苯甲基（Βζ1)β此處及下文中，縮寫「OBzl」表示苯甲酯（與側鏈及匚端兩者之羧酸反應後），而縮寫「Bzl」表示苯甲醚（與例如酪胺酸之盼系經基反應後）。步驟（a)至（c)可使用肽合成技術中已知之標準反應條件進行。 + =合及脫除保護基㈣（a)、（b)A⑷較佳在溶液

對於偶合步驟（a y , 狂使用…'邛匈浴劑。第一脫除保護基步驟（b)較佳在r 較佳在乙酸及/或水中進行，而第二脫除 w步驟U)較佳在甲苯中進行。在—較佳具體實例中’偶合步驟（a)在H0BtEDCHC1 及TEA之組合下完成。在一較佳具體實例中氣及鈀/木炭進行。在—較佳具體實例中

第一脫除保護基步驟（b)以氫第一脫除保護基步驟（c)在TFA 45 201024317 下進行。步驟（Ο後所獲得之粗產物可藉由習知方法例如用製備型HPLC、逆流分布法或等效方法來純化。若需要純

2，則上述情況亦適用於步驟（a) *⑴後所獲得物。 J ❹ 經保護之肽片段山及叫可使用習知肽合成方法來製備，例如溶液相合成（HPPS )或固相合成（SPPS )。在SPPS 之情況下，可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載體，或直接連 ^於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性綮人聚合物聚乙二醇為可溶性樹脂艘的一實例。較佳樹脂為具有三苯甲基或演二苯之：於聚苯乙浠之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氣化 ❹ 脂(CTC樹脂)、氣化三苯甲基樹脂、氣化樹甲二二甲基樹脂及氣化4·甲氧基三苯甲基樹脂ecTC 樹月曰較佳適用於合成含有自由㈣官能基之片段。較佳具體實例中’經保護之肽片段山及叫使用 /谷液相合成來製備。本發明之另-目標為提供適用作本物的經保護之肽。詳古之，U 之中間之肽，其中P1為伴；一為式IVC之經保護干P1為保護基，P1較佳為B〇c ; 至ΡΠ為Bzl。且P3及P6 尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肤為式⑴之 46 201024317 #端經保護之肽，其中P1為保護基，P1較佳為B〇c。在另一態樣中，本發明亦關於一種製造下式之#端經保護之肽的方法

Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly^-O H (SEQIDN0 2) (IIc), 其中P1為Boc，該方法包含： (a) 移除下式之肽之（：端保護基

Pl-D-Phe'-Pro-Arg-Pro-OPn (SEQIDN0 4) ( Vc), 其t P1為Boc’且P13為保護基，諸如Bz卜甲基（Me) 及乙基（Et) ; P13較佳為Bzl ; 得到式Vc之#端經保護且c端未經保護之肽，其中 P13 為 Η ; (b) 移除下式之肽之汊端保護基 (Vic)， P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1 °-〇Bzl (SEQ ID NO 5) 其中P15為Boc，得到式Vic之C端經保護且#端未經保護之肽，其中 P15 為 Η ; (c)使步驟（a)中所產生之式Vc之肽，其中^^為^ 與步驟（b)中所產生之式Vic之肽反應，其中P15為 Η，得到下式之肽 47 201024317

Pl-D-Phe'-Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-

Gly10-〇Bzl ( SEQ ID NO 2) (VIIC)，其中PI為Boc ;及 (d)移除步驟（c)中所產生之肽之C端保護基，得到式nc 之#端經保護之肽。步驟（a)至（d)可使用肽合成技術中已知之標準反應條件進行。偶合及脫除保護基步驟（心、（13)、（（〇及（（1)較佳在溶液中進行。對於偶合步驟（c)，較佳使用DMF作為溶劑。第一脫除保護基步驟（〇較佳在丙_中進行，而第二脫除保護基步驟⑴較佳在曱苯及/或THF中進行。第三脫除保護基步驟（d)較佳在選自由DMF、丙酮、水及丙酮與水之混合物所組成之群組的溶劑中進行。片在—較佳具體實例中，第一脫除保護基步驟（a)以氫礼及把/木炭進行。〇在—較佳具體實例中，第二脫除保護基步驟（1>)在tfa 下進行。在-較佳具體實例中，偶合步驟（c)纟H〇Bt、dic 及TEA之組合下完成。在一較佳具體實财，第三脫除保護基步驟⑷以氫氣及鈀/木炭進行。步驟⑷後所獲得之粗產物可藉由習知方法，例如用 ! HpLC、逆流分布法或等效方法來純化。若需要純 48 201024317 化，則上述情況亦適用於步驟（a)、（b)及（e)後所獲得之中間物。經保護之肽片段Vc及Vic可使用習知肽合成方法來製

備’例如溶液相合成（HPPS )或固相合成（spps )。在SPPS 之情況下，可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保護之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體载體，或直接連接於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇為可溶性樹脂之固體載體的一實例，由此產生可溶性肽-樹脂結合物◊較佳樹脂為具有三苯甲基或演二苯甲基之基於聚苯乙稀之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氣化2•氯三苯P基樹脂（cTc 樹脂）、氣化三苯甲基樹脂、氣化4•甲基三苯甲基樹脂及氯化4-甲氧基三苯甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成含有自由羧基官能基之片段。鲁在一較佳具體實例中，經保護之肽片段Vc及Vk使用溶液相合成來製備。 ,本發明之另-目標為提供一種經保護之狀，其適用作製造式He之#端經保護之肽的本發明方法中之中間物。詳言之，此等肽之一為式Vc之C端及#端經保護之肽，其中 ⑴為保護基，較佳為Bz卜此等肽中之另—者為具有自由 C端的式Vc之ΛΓ端經保護之肽。

尤其適用作本發明方法中之中間物的另一之c端經保護之肽，其中pi5為b〇c;或m為J 49 201024317 尤其適用作本發明方法中之中間物的另一狀為式viic 之C端及#端經保護之肽，其中pi為保護基，ρι較佳為 B〇c。尤其適用作比伐盧定之製造方法中之中間物的另一狀為式IIIc之經保護之肽，其中p3及P6至pu為Bzi。在另一態樣中，本發明亦係關於一種製造下式之經保護之肽的方法 H-Asp(〇Pll)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pr〇_Glu (OP8)-Glu(OP9)-Tyr(Pl 〇)-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3 ) 其中P3及P6至Pll為Bzl，該方法包含：

(IIIc)，

移除下式之肽之#端保護基 P16-Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-〇P3 (VIIIc)， (SEQ ID NO 6) 其中P3及P8至Pl〇為Bzi且P16為B〇c，

得到式VIIIc之c端經保護且#端未經保護之肽，其中P16為Η ; (b)使步驟（a)中所產生之式VIIIc之肽（其中pl6為η 且Ρ3及Ρ8至Ρ1〇為By)與下式之肽反應

P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-OH (IXc)， (SEQ ID NO 7) 其中P17為Boc ;且P6及P7為Bzl，得到下式之肽 50 201024317 P17-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-Glu (OP9)-Tyr(Pl〇)-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) ( Xc)，其中P17為Boc ;且P3及P6至P10為Bzl ; (c) 移除步驟（b)中所產生的式xc之肽之#端保護基，其中P3及P6至P10為Bzl ;且P17為Boc，得到式Xc之C端經保護且#端未經保護之肽，其中 P3及P6至Pl〇為Bzl且P17為Η ; (d) 使步驟（㈧中所產生之式Xc之肽（其中ρΐ7為η; 且Ρ3及Ρ6至Ρΐ〇為Βζ1)與下式之經保護之胺基酸反應 (XI)

Boc-Phe12-〇H 得到下式之肽 P4-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-Glu(OP8)-

Glu(〇P9)-Tyr(Pl〇)-Leu20-〇P3 (SEQ ID NO 9) ( XIIc)，其中P3及P6至Pl〇為Bzl;且以為Boc; (e) 移除步驟（d)中所產生的式XIIc之肽之#端保護基， =中P3及P6至P10為Bzl且？4為B〇c，得到式XIIc之C端經保護且w端未經保護之肽，其中 P3及P6至P10為Bzl ;且P4為η ; (f) 使步驟（e)中所產生之式xnc之肽其中ρ4為Η，且Ρ3及Ρ6至Ρ1〇為βζι，與下式之經保護之胺基酸反應 51 201024317

Boc-Asp(OPl l)n-OH (XIIIc)，其中Pll為Bzl，得到下式之肽

Boc-Asp(OPll)-Phe-Glu(OP6)-Glu(OP7)-Ile15-Pro-

Glu(OP8)-Glu(OP9)-Tyr(P10)-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) ( XIVC), 其中P3及P6至Pll為Bzl ;及 ❹ (g)移除步驟（f)中所產生之肽之W端保護基，得到式nic 之C端經保護之肽。步驟（a)至（g)可使用肽合成技術中已知之標準反應條件進行。偶合及脫除保護基步驟（a)至（g)較佳在溶液中進行。對於偶合步驟⑴、⑷*(〇,較佳使用DMF作為溶劑。脫除保護基步驟（a)、（c)、（e)及（g)較佳在作為溶劑之甲苯與THF之混合物中進行。在一較佳具體實例中，偶合步驟⑴、⑷及（〇在 ❹ ^卜職侧及分別對於步驟（b )為驗Μ、對於步驟（d)及（f)為mpEA之袓人、 λ , χ ，σ下疋成。在另一較佳具體 m TFA a ^ (g)之保護基脫除藉由使用TFA及苯酚來進行。 τ将田便步驟（g)後所獲得之粗產物可製備型HPLC、逆流分布法由U方法’例如用化，則上述情況亦適用於步驟 ^來純化°若需要純物。）至（f)後所獲得之中間 52 201024317 經保護之肽片段VIIIc、IXc、XI及XIIIc可使用習知肽合成方法來製備’例如溶液相合成（HPPS )或固相合成 (SPPS)。在SPPS之情況下’可應用熟習此項技術者已知且允許製備經保§蔓之肽的所有樹脂。此處，樹脂應以廣泛方式解釋。因此，術語「樹脂」應理解為意謂例如單獨固體載趙，或直接連接於連接子之固體載體，中間視情況存在柄狀物。樹脂可為不可溶或可溶的。可溶性聚合物聚乙二醇為可溶性樹脂之固體載體的一實例。較佳樹脂為具有三 ® 苯甲基或溴二苯甲基之基於聚苯乙烯之樹脂。三苯甲基樹脂之實例為氣化2-氣三苯甲基樹脂（CTC樹脂）、氣化三苯甲基樹脂、氣化4-甲基三苯甲基樹脂及氣化4_甲氧基三苯

甲基樹脂。CTC樹脂較佳適用於合成含有自由羧基官能基之片段》 A 在一較佳具體實例中，經保護之肽片段VIIIC、IXc、 XI及XIIIc使用溶液相合成來製備。 Φ 本發明之另一目標為提供一種經保護之肽，其適用作製造式IIIc之c端經保護之肽的本發明方法中之中間物。詳言之，此等肽之一為式XIVc之經保護之肽，其中p3及 P6 至 P11 為 Bzl。尤其適用作本發明方法中之中間物的另一肽為式Μ。之側鏈經保護之肽，其中P3及P6至ρι〇為Bzi ;且Μ為 B〇c保護基，或Ρ4為η。尤其適用作本發明方法中之中間物的另-狀為式以之侧鏈經保護之肽，其中Ρ3及Ρ6至ρι〇為Βζΐ ;且pu為 53 201024317

Boc保護基，或P17為η。尤其適用作本發明方、土 + 月方去中之中間物的另-肽為式IXc

之經保護之肽，其中P6 & ρ Λ IXC _ 及P7為Bzl，·且P17較佳為Boc。尤其適用作本發明方法中之中間物的另一狀為式villc 之側鏈經保護之肽，其中六T 及P8至ρι〇為Bzl ;且pi6

Boc保護基，或P16為η。〃在另態樣中*本發明亦as -tjt, t / 赞月亦係關於一種任何上述肽作為比伐盧定合成中之中間物的用途。實施例以下非限制性實施例將詳細說明本發明之代表性具體實例。一縮寫：

Boc 第三丁氧羰基 Bzl 苯曱基 DCC 1，3 - —環己基碳化二亞胺 DCHA 二環己基胺 DCU 二環己基脲 DIC 二異丙基碳化二亞胺 DIPEA ΛΓ，ΛΓ-二異丙基乙胺 DMF 二甲基甲醯胺 EDCHC1 1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽 equiv. 當量 54 201024317 HOBt 1-羥基苯并三唑 MTBE 甲基第三丁基醚 NMM iv-曱基嗎啉 HOPfp 五氟苯酚 OPfp 五氟苯酯 HOSu 羥基丁二醯亞胺 Su iV- 丁二醯亞胺基 TEA 三乙胺 TFA 三氟乙酸 THF 四氫呋喃

實施例 1 :製備 H-Asn-Gly10-OBzl.TFA 於 20°C 下添加 Boc-Asn-Gly-OBzl ( 90.20 kg ; Hexagon Labs Inc·，USA)至 TFA ( 90 L)、甲苯（388 L)及 THF ( 45 L )之混合物中。於<2°C下緩慢添加TFA ( 198 L )至混合物中。於20°C下使反應完成。由HPLC監測裂解完成。接著緩慢添加THF，且於真空中蒸發反應混合物。與甲苯與THF之混合物一起進行三次共沸蒸餾。獲得呈油狀殘餘物形式之Η-Α8η-01γ1()-0Βζ1·ΤΡΑ，用乙酸乙酯稀釋。此溶液直接用於下一化學步驟中（參見實施例3 )。產率： 100%。純度（根據 HPLC) : 99.3%。

實施例 2:製備 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH.TEA( SEQ ID NO 10) 55 201024317 於 20°C下緩慢添加 TEA ( 73.1 L )至 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OEt ( SEQ ID NO 10) [98.11 kg；

Bonora 等人，CAimz.ca /ία/ζ·α”α 1980，/70， 503-510 ’ 類似地由 Boc-Gly-Gly-OH ( Senn Chemicals， Switzerland )及 H-Gly-Gly-OEt.HCl ( Senn Chemicals， Switzerland)製備]於丙酮（78.44 L)與經處理之水（491 L) 之混合物中的懸浮液中。於20°C下使反應完成。由HPLC 監測皂化完成。於真空中蒸發溶液，且用經處理之水調整殘餘物體積 ©

至 456 L。此 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH TEA ( SEQ ID NO 10)溶液直接用於下一化學步驟中（參見實施例3)。產率： 100%。純度（根據 HPLC) : 99.6%。實施例 3:製備 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1G-OBzl(SEQ ID NO 5 ) 於 0°C 下用 TEA 將 H-Asn-Gly10-〇Bzl-TFA ( 573 L ,參見實施例1 )之乙酸乙酯溶液的pH值調至6-6.5。如自實施 ◎ 例 2 獲得之 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH ( SEQ ID NO 10)溶液冷卻至0°C且添加，隨後添加HOBt( 28.52 kg)及EDC.HC1 (69.81 kg)。於 0°C 下用 TEA ( 121 L)將 pH 值調至 6-6.5。使反應混合物升溫以達到室溫。在完成偶合後（約10 h後；如HPLC所指示），添加 NaCl至反應混合物中。冷卻懸浮液及過濾，得到固艎殘餘物，用NaC 1水溶液洗務若干次且接著冷卻。於真空中乾燥 56 201024317 所得固體，得到130.151<^(100%)8〇<;-01丫5-〇17-017-01丫-Asn-Gly1()-OBzl ( SEQ ID NO 5 )，純度為 97.9% (根據 HPLC)。實施例 4:製備 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1()- OBzl.TFA (SEQ ID NO 5 ) 於<2°C之溫度下緩慢添加6〇^01丫5-01丫-01丫-01丫-八811-

Gly10-OBzl ( SEQ ID NO 5) ( 131.20 kg，參見實施例 3)至 © TFA( 131 L)、曱苯（525 L)及 THF( 105 L)之混合物中。於22°C之溫度下緩慢添加TFA ( 289 L )至反應混合物中。於20°C下使反應在約1.5小時内完成（由HPLC監測）。於真空中濃縮反應混合物，且殘餘物傾倒於二異丙醚中。過濾所得懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌若干次且接著於真空中乾燥 q|^，jl3〇.99kgH-Gly5_Gly-Gly-Gly-Α8η-01γ1()-0ΒΖ1·ΤΡΑ ( SEQ ID NO 5)，純度為 97.5% (根據 HPLC)。 e 實施例 5 :製備 H-Arg-Pro-OBzlJHCl 於22°C下緩慢添加於乙酸（ 380 L)中之鹽酸（1M) 至 Boc-Arg-Pro-OBzl.HCl ( 95.00 kg ; Hexagon Labs Inc.， USA)於乙酸（190 L)及THF (19L)中之懸浮液中。由 HPLC監測裂解完成（約1小時後）。於真空中蒸發反應混合物。首先與乙酸一起共沸蒸镏’且接著與DMF —起共沸蒸餾。得到呈油狀殘餘物形式 57 201024317 之 H-Arg-Pro-OBzl-2 HCl，用 DMF 稀釋，獲得約 380 L 之體積。所得溶液直接用於下一化學步驟中（參見實施例7 )。產率：100%。純度（根據HPLC) : 96%。實施例 6 :製備 Boc-D-Phe-Pro-OPfp 於24°C下添加HOPfp ( 17.78 kg)於乙酸乙酯（10 L) 中之溶液至 Boc-D-Phe-Pro-OH ( 33.33 kg ; Bachem AG， Switzerland)於乙酸乙酯（183 L)中之懸浮液中。於-6°C 下緩慢添加DCC ( 21.44 kg)於乙酸乙酯（83·3 L)中之溶液至反應混合物中。接著混合物升溫至室溫。由HPLC監測偶合完成（約2小時）。藉由過濾移除DCU鹽且用乙酸乙酯洗滌。於真空中蒸發濾液，直至達到約80 L之殘餘體積《與甲苯一起共沸蒸餾若干次。油狀殘餘物於石油醚中沈澱。過濾固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥，獲得 26_3 kg ( 54% ) Boc-D-Phe-Pro-OPfp，純度為 99.3% (根據 HPLC )。實施例 7:製備 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OBzl HCUSEQID NO 4) 於 20°C 下用 DMF ( 360 L)稀釋 H-Arg3-Pro-OBzl.2HCl 之溶放（1〇3.00 kg ; 561 L溶液；參見實施例5)。在低於 55°C下於真空中蒸發DMF ( 82 L)。接著於 20°C 下添加 Boc-D-Phe-Pro-OPfp ( 121.54 kg ; 參見實施例6 )至H-Arg'Pro-OBzMHCl溶液中。於0°C下 201024317 用TEA ( 58 L )將所得混合物之pH值調至6.5。於〇°c下使反應完成’歷時約2〇小時，如HPLC監測所指示。遽除所得懸浮液之固體部分且用DMF洗滌。於真空中濃縮濾液，直至殘餘體積為約385 L。添加去離子水、NaC1 及乙酸乙醋之混合物。分離各相且依次用NaI1c〇3水溶液、 NazCO3水溶液、hci之鹽水溶液及最後用鹽水洗滌有機相。於真空中濃縮有機相，得到油狀殘餘物，藉由與甲苯一起共沸蒸餾來脫水且於2(TC下在二異丙醚中沈澱。過濾 ® 所得懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌若干次且於真空中乾燥’得到 106 kg Boc-D-PheLpro-Arg-Pro-OBzl.HCl (SEQ ID NO 4 )，純度為 96% (根據 HPLC )。

實施例 8:製備 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OHC SEQ ID NO 4) 於 20°C下用 TFA/THF 之混合物（50/50，V/V，0.03 L) 將 Boc-D-PheLpro-Arg-Pro-OBzl-HCl ( SEQ ID NO 4 ) (33.58 kg ’參見實施例7)於丙_ (67 l)中之溶液的pH

G 值調至4。添加所得混合物至鈀/木炭（3.36kg)於丙酮（17 L)中之懸浮液中。在2(TC下於約3巴氫氣壓力下氫化至少 2小時。由HPLC監測氫化完成。經纖維素濾筒過濾反應混合物。用丙酮洗滌濾餅若干次。於真空中濃縮合併之濾液。藉由使用丙酮與甲苯之混合物進行共沸蒸餾，使所得油狀殘餘物脫水。用乙酸乙酯稀釋油狀殘餘物且傾倒於二異丙鍵中。過濾所得懸浮液’ 且用二異丙醚洗滌沈澱物若干次並於真空中乾燥，得到31.4 59 201024317 kg Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4)，純度為 99.4% (根據 HPLC)。實施例 9 :製備 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl ( SEQ ID NO 2 ) 於 <2°C下使用 TEA( 9 L) WH-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Ο1γ10-ΟΒζ1·ΤΡΑ ( SEQ ID NO 5 ) ( 25.20 kg，參見實施例 4) 於DMF ( 504 L)及去離子水（25 L)中之溶液的pH值調至 6.5-7。於 <2°C 下緩慢添加 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) ( 25.46 kg，參見實施例 8)及 HOBt ( 1.02 kg)。於4 2°C下緩慢添加DIC ( 9.5 L)至反應混合物中。於42°C下使用TEA (0.3 L)將所得混合物之pH值調至 7-7.5。於10°C下使反應完成，歷時10天，如HPLC及TLC 所監測。於真空中濃縮反應混合物，得到油狀殘餘物，使其於乙酸乙酯與二異丙醚之混合物中沈澱。移除上清液若干次且用相同體積之二異丙醚置換。過濾混合物，得到固體，用二異丙醚洗滌三次且於真空中乾燥，得到30.50 kg( 76%)

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly^-OBzl (SEQ ID NO 2)，純度為 83.4% (根據 HPLC)。實施例 10 :

Gly-Asn-Gly10-OH ( SEQ ID NO 2 ) 添加 Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn- 201024317

Gly'OBzl ( SEQ ID NO 2 ) ( 23.43 kg 淨肽重量，參見實施例9)於丙酮（43 L)與去離子水（9 L)之混合物中的溶液至鈀/木炭（.0.75 kg)於丙酮（3 L)中之懸浮液中。在 20C下於約3巴氮氣壓力下氣化小時。由HPLC監測氯化完成。添加去離子水（3 6 L )至反應混合物中且經纖維素據筒過濾所得混合物。用去離子水與丙酮之2J混合物洗務遽餅若干次。於真空中濃縮合併之濾液。藉由使用DMF與甲苯 ® 之混合物進行共沸蒸餾，使所得殘餘物脫水，得到21 5 kg

Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly^-OH (SEQ ID NO 2 )，純度為 80% (根據 HPLC )。實施例 11 :製備 Boc-Tyr(BZl)-Leu2<)-OBZl 將 H-Leu-OBzl·對甲苯磺酸鹽（22.2 kg ; Bachem AG， Switzerland)懸浮於乙酸乙酯（i〇8 L)中，接著於室溫下添加TEA(約7.1 L)。添加呈固體狀之Boc_Tyr(Bzl)_〇H( 2〇 kg，Senn Chemicals，Switzerland)及 HOBt ( 7.3 kg)。於 -6°C下添加DCC ( 12.2 kg)於DMF ( 40 L)中之溶液至混合物中。由TLC及HPLC監測反應完成。藉由過濾來移除所形成之DCU。依次用KHS04水溶液與鹽水之混合物、KHSO4水溶液、NaHC03水溶液及鹽水洗條渡液。於真空中蒸發有機相。將殘餘物溶解於乙酸乙酯令’且接著於石油醚中沈澱。過濾固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥。於真空中濃縮母液溶液及於石油醚中沈澱 61 201024317 後，獲得第二批物質。過濾固體，用石油醚洗滌且於真空中乾燥。接著混合兩批物質，得到 25_9 kg ( 84% ) Boc-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl，純度為 97% (根據 HPLC)。

實施例 12 :製備 H_Tyr(Bzl)-Leu2()-OBzl.TFA 於 20°C 下缓慢添加 TFA ( 83 L ) 至

Boc-Tyr(Bzl)-Leu2°-OBzl ( 25.9 kg，參見實施例 11 )、苯紛 (1.3 kg)、甲苯（104 L)及THF ( 21 L)之混合物中。於 20°C下使反應完成。由HPLC監測裂解完成。於真空中蒸發反應混合物。與甲苯與THF之混合物一起共沸蒸餾。接著添加乙酸乙酯及石油醚至殘餘物中。過濾固體，依次用乙酸乙酯與石油醚之混合物及石油醚洗滌，且最後於真空中乾燥，得到 23.7 kg ( 89% ) Η-ΤγΓ(Βζ1)-Ι^ιι2()-ΟΒζ1·ΤΡΑ，純度為 98% (根據 HPLC)。實施例 13 :製備6〇〇01\1(0821)-0111(0621)-丁>^(621)-

Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 6 ) 添加 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OSu ( 42.90 kg，Senn Chemicals，Switzerland)至 H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl.TFA( 23_7 kg，參見實施例12)於DMF (80 L)中之溶液中。於〇。〇下用DIPEA將反應混合物之pH值緩慢調至7-7.5。於20°C 下使反應混合物完成反應。由HPLC監測偶合完成。於真空中蒸發反應混合物，且油狀殘餘物傾倒於經處理之水中。過濾固體，用經處理之水洗滌，於乙腈與經處 201024317 理之水的混合物中再形成漿料且最後於真空中乾燥，得到 40.3 kg Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 6 )，純度為 92% (根據 HPLC )。實施例 14 :製備 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-

Leu20-OBzl TFA ( SEQ ID NO 6 ) 於 15°C下緩慢添加6〇〇0111(0821)-0111(0621)-丁>^(^21)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 6) ( 117.45 kg，參見實施例 13) © 至 TFA ( 117 L)、苯酌 ( 5·87 kg)、甲苯（470 L)及 THF (94 L)之混合物中。於d7°C下再緩慢添加TFA ( 282 L) 至混合物中。於15 °C下使反應完成。由HPLC監測裂解完成（3小時）。在低於35°C下於真空中蒸發反應混合物。藉由與曱苯 /THF之混合物一起共沸蒸餾，且接著與曱苯一起共沸蒸餾’來移除殘餘TFA。添加MTBE ( 825 L )至油狀殘餘物中。接著添加石油醚至所得懸浮液中。冷卻後，過濾固體 ❹ 且用石油喊洗務若干次。再懸浮於石油謎中且過渡後，用石油醚洗滌固體。重複一次此程序。接著於真空中乾燥固體，得到114.86 1^(96%)11-0111(0821)-0111(0821)-丁71^21)-

LeuM-OBzl.TFAC SEQ ID NO 6)，純度為 96%(根據 HPLC)。實施例 15 :製備6〇〇-0111(0821)-0111(0821)-11615-?]·。- OH DCHA ( SEQ ID NO 7) 緩慢添加 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OSu ( 62 kg，Senn 63 201024317 *

Chemicals，Switzerland)至 H-Ile-Pro-OH-TFA ( 36 kg，

Bachem AG，Switzerland)於 DMF ( 433 L)中之溶液中。於0°C下用DIPEA將pH值調至7-7.5。由HPLC監測反應完成。於真空中蒸發反應混合物且用乙酸乙酯稀釋油狀殘餘物。用KHS〇4水溶液及鹽水洗滌混合物。於真空中蒸發有機層’且藉由與曱苯一起共沸蒸餾，使油狀殘餘物脫水。用甲苯稀釋油狀殘餘物，且用DCHA將pH值調至7-7.5。接著添加石油醚至混合物中。過濾由此獲得之固體，用石 ® 油醚洗滌且於真空中乾燥，得到102 kg Boc-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Ile15-Pro-OH DCHA( SEQ ID NO 7)，純度為 89%(根據 HPLC)。實施例 16 :製備8〇〇0111(0821)-0111(0621)-11615-?1'〇-

Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 8 ) 於 <4°C 下緩慢添加 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15- © Pro-〇H‘DCHA ( SEQ ID NO 7 ) ( 98.88 kg，參見實施例 15) 及 HOBt ( 13.82 kg)至11-0111((^21)-0111(0321)-丁71"(821)· LeuM-OBzl.TFA ( SEQ ID NO 6) ( 110.39 kg，淨肽重量，參見實施例14)於DMF ( 451 L)中之溶液中。於_6°C下分小份添加EDC-HC1 ( 22.99 kg)至混合物中。於-6°C下用TEA (12 L)將反應混合物之pH值調至6.5-7。於10°C下使偶合完成，歷時16小時，如HPLC所監測。 64 201024317 今藉由過濾來移除鹽。於真空中蒸發濾液。使油狀殘餘物（470 L )於NaHC〇3溶液中沈澱。過濾固體且用經處理之水洗滌若干次。再懸浮於經處理之水中後，添加乙腈。接著冷卻懸浮液。過濾固體，用水洗滌且於真空中乾燥，得到 160.34 kg(88%)Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 8 )，純度為90% (根據HPLC )。 ❹ 實施例 Π :製備 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-〇Bzl-TFA (SEQ ID NO 8) 於 <5°C 下添加 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pr〇-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 8 ) (72.24 kg，參見實施例 16)至 TFA ( 72 L)、甲苯（289 L) 及THF( 6L)之混合物中。於<2°C下再緩慢添加TFA( 159 L)至混合物中。於20°C下使反應完成，歷時2.5小時（由 ® HPLC監測）。於真空中蒸發反應混合物。藉由與甲苯與THF 之混合物一起共沸蒸餾若干次來移除殘餘TFA。用甲苯稀釋油狀殘餘物且傾倒於二異丙醚中。過濾固體且用二異丙醚洗滌若干次。再懸浮於乙腈與二異丙醚之混合物中後，接著過濾固艎，用二異丙醚洗滌若干次且最後於真空中乾燥，得到 61.7 kg( 87%)H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl TFA ( SEQ ID NO 8)，純度為88.9% (根據HPLC)。 65 201024317 實施例 18 :製備 Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-

Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-O Bzl ( SEQ ID NO 9) 於 ^24°C 下緩慢添加 Boc-Phe-OH ( 10.03 kg ; Senn Chemicals AG，Switzerland )及 HOBt ( 4.95 kg )至 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu2°-〇Bzl.TFA ( SEQ ID NO 8) ( 61.63 kg，參見實施例17)於DMF ( 264 L)中之溶液中。於-5°C下緩慢添加 ❹ EDC.HC1 ( 8.5 3 kg)。於-5^下用 DIPEA ( 47.5 L)將反應混合物之pH值逐漸調至6.5-7。於10°C下使偶合完成，歷時23小時（由HPLC監測）。於真空中蒸發反應混合物。將油狀殘餘物懸浮於 NaHCC)3溶液中。過溏、固體，用經處理之水洗務若干次且於真空中乾燥，得到 67_64 kg ( 95% ) Boc-Phe_Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9)，純度為 87.9% (根據 HPLC)。〇實施例 19 :製備 H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-

Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzlT FA ( SEQ ID NO 9) 於 15°C 下分小份添加 Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9 ) ( 67.66 kg，參見實施例 18)至 TFA ( 68 L)、苯 66 201024317 秦酚（3.3 8 kg)、甲苯（271 L)及THF ( 54 L)之混合物中。於15°C下再緩慢添加TFA ( 149 L)至混合物中。由HPLC 監測裂解完成（4.3小時）。於真空中蒸發反應混合物。藉由與甲苯與THF之混合物一起共沸蒸餾若干次來移除殘餘TFA。用甲苯稀釋油狀殘餘物且傾倒於二異丙醚中。過濾固體，用二異丙醚洗滌若干次且於真空中乾燥，得到67.25 kg ( 99%) H-Phe-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-〇 Leu20-OBzl.TFA ( SEQ ID NO 9 )，純度為 86_6% (根據 HPLC)。實施例 20 :製備 Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3) 於 <(TC下分小份添加 Boc-Asp(OBzl)u-OH ( 20.22 kg) (Senn Chemicals AG，Switzerland)及 HOBt ( 8.42 kg)至 H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-(3lu(〇Bzi) -Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl.TFA ( SEQ ID NO 9 ) ( 60.46 kg 淨肽重量，參見實施例19)於DMF( 370 L)中之溶液中e m_5〇c 下緩慢添加EDC，HC1 ( 13.38 kg)至反應混合物令。於_5〇c 下用DIPEA( 27 L)將所得混合物之pH值逐漸調至6.5-7。接者於10C下使偶合反應完成，歷時35小時（由hplC監測）。接者於真空中濃縮反應混合物。緩慢添加所得油爿大殘 67 201024317 餘物至NaHC〇3水溶液中。過濾所得懸浮液且再懸浮於去離子水中。過遽且用去離子水洗滌若干次並用乙腈與去離子水之混合物洗滌一次後，於真空中乾燥所得固體，得到64 kg (96%) Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-〇Bzl ( SEQ ID NO 3)，純度為81.4% (根據HPLC)。實施例 21 :製備 H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-T Ο yr(Bzl)-Leu20-OBzl-TFA ( SEQ ID NO 3 ) 於低於 15°C 之溫度下分小份添加

Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OB zl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3 ) (64.00 kg，參見實施例20)至TFA ( 64 L)、苯酚（3.2 kg)、甲苯 (265 L )及THF ( 5 1 L )之混合物中。於d 5 °C下再緩慢添加TFA( 141 L)至反應混合物中。於15°C下裂解，歷時4.8 小時（由HPLC監測）。 © 於真空中濃縮反應混合物。於20°C下添加所得油狀殘餘物至二異丙醚中以沈澱。過濾所得懸浮液，再懸浮於二異丙醚中且再次過濾。用二異丙醚洗滌固體且於真空中乾燥，得到 61.4 kg (淨肽重量）（95%) H-Asp(〇Bzl)_phe-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Ι^ιι2°-ΟΒζ1·ΤΡΑ ( SEQ ID NO 3 )，純度為 77.6% (根據 HPLC)。 68 201024317 實施例 22 :製備3〇〇-0-?1^1-?1'〇-人巧-?1>〇-0175-017-01丫-Gly-Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(B zl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 1 ) 於 <4°C 下分小份添加 H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-O Bzl，TFA ( SEQ ID NO 3 ) ( 104.40 kg，參見實施例 21 )及 ❹ HOBt (8.42 kg)至8〇〇-0-?1161-?1"〇-人巧-?1>〇-01)^5-01^>-01^_-Gly-Asn-Gly10-OH ( SEQ ID NO 2) ( 65.47 kg，參見實施例 10)於DMF( 345 L)中之溶液中。於-5°C下緩慢添加EDC.HC1 (12.46 kg)。於_5°C下用TEA ( 16·5 L)將反應混合物之pH 值逐漸調至6.5-7。於-5°C下使偶合完成，歷時22小時（由 HPLC監測）。用去離子水緩慢稀釋反應混合物《過濾所得懸浮液，用去離子水洗滌且於真空中乾燥，得到 72 kg ( 50% ) ❹ Boc-D-1Phe-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp( OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(0 821)-丁乂1'(321)-1^112()-0621(8£(5 1〇]^0 1)，純度為81.4%(根據 HPLC)。實施例 23 :製備 H-D-PheLPro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-

Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-G lu-Glu-Tyr-Leu20-OH-2TFA (比伐盧定） 69 201024317 (SEQ ID NO 1 ) 添加 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-GlyS-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp(〇Bzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(O Bzl)-Glu(〇Bzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-〇Bzl(SEQ ID NO 1) ( 15.00 kg，參見實施例22 )於乙酸（53 L )中之懸浮液至鈀/木炭 (1.13 kg)、去離子水（6L)及乙酸（5L)之混合物中。在 S7°C下於約3巴氫氣壓力下氮化（由HPLC監測）。完成（5小時）後，冷卻反應混合物且用去離子水及乙酸稀釋。經纖維素濾筒過濾所得混合物，用乙酸與經處理之水的混合物洗提若干次。於真空中濃縮濾液。藉由卡耳_ 費雪滴定法（Karl Fischer titration )測試所得殘餘物之水含量（水含量<5.0% )。接著添加曱苯至油狀殘餘物中，隨後添加TFA。由HPLC 監測裂解完成（1小時後）。於真空中濃縮反應混合物。添加所得油狀殘餘物至二異丙醚中以沈澱。過濾所得懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌若干次且於真空中乾燥，得到8.41 kg (淨肽重量） (78% )粗 H-D-PheLPro-Arg-Pro-Gly^-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H-2TF A (比伐盧定）（SEQ ID NO 1 )，粗比伐盧定之純度為65% (根據HPLC )。經HPLC偵測，無D-Phe12-比伐盧定雜質形成，亦即位置12未出現外消旋化。藉由C18逆相固定相上之製備型jjPLC來純化粗肽。在第一步驟中藉由用乙酸銨/水/乙腈進行梯度洗提來純化 201024317 粗比伐盧定，且在第二步驟中藉由用三氟乙酸/水/乙猜進行梯度洗提來純化。濃縮含有純產物之洗提液部分且;東乾，得到5_89 kg ( 70%，以粗肽中之比伐盧定含量計）呈白色粉末狀之 H-D-PheLPro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-H-2TF A(比伐盧定）（SEQ ID NO 1 )，純度為99%(根據HPLC)。經债測’無D-Phe12-比伐盧定及D-Tyr19-比伐盧定形成’且所摘測到之其他各雜質不超過0.2% (根據HPLC )。 ❹ 【圖式簡單說明】無【主要元件符號說明】無 71 201024317 序列表 <110>隆沙布萊恩公司 <120>比伐盧定(Bivalirudin)的製造方法 <130> LP2156PC00 <160> 10 <170〉Patentln3.3版 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體

<220> <221>雜項特徵 <222> (1)..(1) <223> Phe之D鏡相異構物(D-Phe) <400> 1

Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu lie Pro 15 10 15

Glu Glu Tyr Leu 20 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體 <220> <221>雜項特徵 <222> (1)..(1) <223> Phe之D鏡相異構物(D-Phe) <400> 2

Phe Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213>人工 201024317 <220> <223>合成的構築體 <400> 3

Asp Phe Glu Glu lie Pro Glu GIu Tyr Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213>人工 <220〉 <223>合成的構築體 <220> <221>雜項特徵 <222> (1)..(1) <223> Phe之D鏡相異構物〇>Phe) <400> 4

Phe Pro Arg Pro 1 <210〉 5 <211> 6 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體 <400> 5

Gly Gly Gly Gly Asn Gly 1 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體 <400> 6 Glu Glu Tyr Leu <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213>人工 201024317 <220> <223>合成的構築體 <40〇> 7

Glu Glu lie Pro <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體 <400> 8

Glu Glu lie Pro Glu Glu Tyr Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體 <400> 9

Phe Glu Glu lie Pro Glu Glu Tyr Leu 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213>人工 <220> <223>合成的構築體 <400> 10

Gly Gly Gly Gly

Claims

201024317 七、申請專利範圍： 1. 一種在溶液相中製造下式之比伐盧定（bi valirudin ) 的方法 H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1 ) ( I) ，其包含以下步驟： (a )使下式之視情況側鏈經保護之肽 P1 -D-Phe1 -Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V)，其中PI為對催化性氫化穩定之保護基，與下式之視情況側鏈經保護之肽反應 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly 10-OP2 (SEQ ID NO 5) ( VI)，其中P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之侧鏈保護基正交之保護基，產生下式之視情況側鏈經保護之肽 PI-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 ( SEQ ID NO 2 ) (VII)，其中PI及P2如上所定義， (b)移除步驟（a)中所產生之該肽的P2，產生下式之視情況側鍵經保護之肽 P1-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-〇H (SEQ ID NO 2) (II)， 1 201024317 其中pi如上所定義， (c )使下式之側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8) (χ)，其中P3為可藉由催化性氫化移除之保護基，與下式之苯丙胺酸反應 P4-Phe12-OH (XI)，其中P4為與該式X之肽之侧鏈保護基及p3正交的保護基，產生下式之側鏈經保護之肽 P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) ( χπ), 其中P3及P4如上所定義， (d) 移除步驟（c)中所產生之該肽的p4，產生式XHi# 端保護基脫除、側鍵經保護之相應肽， (e) 使步驟（d)中所產生之該式XII之肽與下式之側鏈經保護之天冬胺酸反應 P5-Aspn-OH ( XIII)，其中P5為與該式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基，產生下式之側鏈經保護之肽 P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20 OP3 ( SEQ ID NO 3) 其中P3及P5如上所定義， (XIV)， 201024317 (f)移除步驟（e)中所產生之該肽的P5,產生下式之視情況側鏈經保護之肽 H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20- 〇P3 ( SEQ ID NO 3 ) ( III)，其中P3如上所定義，

(g )使步驟（b )中所產生的該式π之視情況侧鏈經保護之肽與步驟（f)中所產生的該式III之側鏈經保護之肽反應，產生下式之侧鏈經保護之肽 Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly-Asn- Gly10-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr- Leu20-〇P3 ( SEQ ID NO 1 ) (IV)，其中PI及P3如上所定義， (h)移除步驟（g)中所產生之該肽之pl、p3及侧鏈保護基’產生式I之比伐盧定。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中PI、P4及P5 中至y者為第二丁氧羰基（Boc)、2-(聯苯-4-基）丙-2-基氧羰基（BP〇c)、2_(3,5_二曱氧基苯基）丙_2基氧羰基 < DdZ )、第-9_基甲氧羰基（Fmoc )或2-(甲基磺酿基）乙氧羰基（Msc )。其中PI、P4及P5 3. 如申請專利範圍第2項之方法中至少一者為Boc。 4. 如申請專利範圍第彳固弟1至3項中任一項之方法，其中 P2與P3中至少—去氣贫田曾,u 、者為苯甲基（Bzl)、苯甲氧基甲基（Bom)、表甲醯曱基（pac )、4_鎖美贫田| , a 均基本甲基（〇Nbz )、4-吡啶基甲基 3 201024317 (Pic)、< 4·績酸基苯甲基，其限制條件為s P4或P5為 Boc、Bpoc 或 Ddz，則 P3 不為 B〇m。 5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中p^p3中至少一者為Bzl。 6. 如申請專利ϋ圍第4 5項中任—項之方法其中該等式m、IV、X、及ΧΙΙ·χιν之側鏈經保護之肽/胺基酸經至少-個選“以下者所組成之群組之側鏈保護基保護：苯曱基（Bzl)、苯曱氧基甲基（B〇m)、苯甲酿甲基（〜）、 4-确基苯甲基（ONbz)、4·«^基甲基（Pie)、及4_橫酸基苯甲基；其限制條件為若P4或P5為B〇c、Bp〇c或⑽，則該等側鏈保護基均不為B〇m。 7. 如申靖專利|&圍第6項之方法，其中該等式in、〗v ' X、及χπ-χιν之側鏈經保護之肽/胺基酸經至少一個保護。 8. 如申請專利範圍第丨至7項中任一項之方法，其中在步驟（a )中該等式v及VI之視情況侧鏈經保護之肽中至少一者之側鏈未經保護。 9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中在步驟（c)中該式X之肽具有下式 H-Glu(OP6)-Glu(OP 7)-11615-Pro-Glu(OP 8)-Glu(OP9)- Tyr(P10)-Leu20-〇P3 ( SEQ ID 8) ( Xb )，其中 P3為可藉由催化性氫化移除之保護基；且 P6至P10各自獨立地選自由Bzi、B〇m、Pac、ONbz、Pic、 201024317 及4-磺酸基苯甲基所組成之群組；且在步驟（e)中該式XIII之侧鍵經保護之天冬胺酸為 P5-Asp(OPll)n-OH，其中 P5為與該式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及p3正交的保護基；且 PI 1係選自由Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic及4-績酸基苯甲基所組成之群組。

10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中p3為By、 Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯曱基；p6至ρι〇各自獨立地為Bz卜Bom、pac、〇Nbz、Pic或4·磺酸基苯甲基； P5 為 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc ;且 pu 為 Bzl、B〇m、 Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基苯曱基。 11. 如中請專利範圍第10項之方法，其中p3為Ed， P6 至 P10 各自為 Bzl ’ P5 為 Boc，且 pil 為 Bzl。 12. 如申請專利範圍第9至U項中任一項之方法，其中 PI、P4 及 P5 為 Boc ;且 P2、p3、％、ρ7、ρ8、μ、p⑺ 及 Pll 為 Bzl。 13.如申請專利範圍第1至12 在步驟⑴中，首先同時移除==:法，其中久°褒（等）側鏈保螬其，且隨後移除P1。哎诉遷基， 14. 如申請專利範圍第13 及該（等）側鏈保護基後所獲得 15. 如申請專利範圍第1至項之方法，其中同時移除P3 之肽在移除P1之前不分離。 14項中任-項之方法，其中 5 201024317 該等移除步驟（b)及（h) 鈀/木炭進行。中至少一者在溶劑中以氫氣及 16·如申請專利範圍第15項之方法，其中該溶劑係選自由心二甲基甲酿胺、丙嗣、丙酮與水之混合物、乙酸、及乙酸與水之混合物所組成之群組。 17.如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中選自由該式v之視情況侧鏈經保護之肽、該式νι之視情況側鏈經保護之肽及該式χ之側鏈經保護之肽組成的群之該等肽中之至夕者藉由溶液相合成在在先的程序中製備。 18·如申請專利範圍第1至16項中任一項之方法，其中選自由該式v之視情況側鏈經保護之肽、該式VI之視情況側鏈經保護之肽及該式X之側鏈經保護之肽組成的群之該等肽中至少一者藉由固相合成在在先的程序中製備。 19.一種肽’其係選自由以下者所組成之群組： (i ) 下式之視情況側鏈經保護之肽 Pl-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (v)，其中P1為對催化性氫化穩定之保護基； (ii )下式之視情況侧鏈經保護之肽 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為可藉由催化性氫化移除且與視情況存在之側鏈保護基正交的保護基； (ui )下式之視情況側鏈經保護之肽 201024317 Pl-D-Phe1 -Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 ( SEQ ID NO 2 ) (VII)，其中PI及P2如上所定義； (iv ) 下式之側鏈經保護之肽 Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (Ila)，其中 PI 如上所定義，除了 Boc-D-Phe^Pro-ArgCPbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH ； ® ( v) 下式之側鏈未經保護之肽 P1 -D-Phe1 - Pro-Arg-Pro-Gly^-Gly-Gly-Gly-Asn-GlyW-OH (SEQ ID NO 2) (lib)，其中PI如上所定義； (vi ) 下式之側鏈經保護之肽 H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8 ) ( X)，其中P3為可藉由催化性氫化移除之保護基； (vii)下式之側鏈經保護之肽 P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 9) ( XII) » 其中P3如上所定義；且P4為與該式X之肽之側鏈保護基及P3正交的保護基；或P4為氫； (viii )下式之侧鏈經保護之肽 P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3 ) (XIV)， 7 201024317 其中P5為與該式XII及XIII之肽/胺基酸之側鏈保護基及P3正交的保護基；且P3如上所定義；除了 Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu ； (ix) 下式之側鏈經保護之肽 H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 3 ) ( III)，其中P3如上所定義；除了 H-Asp(OtBu)-Phe-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu2()-OtBu ;及 (x ) 下式之側鏈經保護之肽 Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1 Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 ( SEQ ID NO 1 ) (IV)，其中PI及P3如上所定義；除了 Boc-D-Phe^Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu2(>-OtBu。 20. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式v之視情況側鍵經保護之肽為 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-OH ( SEQ ID NO 4) 〇 21. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式VI之視情況侧鍵經保護之狀為 H-Gly -Gly-Gly-Gly-Asn-GlyiO-OBzl (SEQ ID NO 5 )。 201024317 l 22. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式VII之視情況侧鏈經保護之肽為 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-GlyS-Gly- Gly-Gly-Asn-Gly10-〇Bzl ( SEQ ID NO 2)。 23. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式IIb之視情況側鏈未經保護之肽為Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly5- Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1 ❶-OH ( SEQ ID NO 20)。 24. 如申請專利範圍第！9項之肽，其中該式χ之侧鏈經保護之肽為 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)- ® Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 8 )。 25. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式χπ之側鏈經保護之肽為Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9 ) 或 H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu (OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 9)。 26·如申請專利範圍第19項之肽，其中該式XIV之側鏈經保護之肽為 Boc-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)- ❹ Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3 )。 27. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式III之侧鏈經保護之肽為 H-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile,5-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl ( SEQ ID NO 3 )。 28. 如申請專利範圍第19項之肽，其中該式IV之側鏈經保護之肽為 Boc-D-Phe^Pro-Arg-Pro-Gly^Gly-Gly-Gly- 9 201024317 Asn-Gly10-Asp(OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ile15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl( SEQ ID NO 1 )。 29.—種任一如申請專利範圍第19至28項中任一項之肽的用途，其用作比伐盧定合成中之中間物。八、_式：無 10