TW201018482A

TW201018482A - Novel treatment

Info

Publication number: TW201018482A
Application number: TW098126600A
Authority: TW
Inventors: Stewart Leung; Lixin Li; Xue-Bin Liu; Hongtao Lu; Jingwu Z Zang; Ping Tsui
Original assignee: Glaxo Wellcome Mfg Pte Ltd
Priority date: 2008-08-08
Filing date: 2009-08-06
Publication date: 2010-05-16
Also published as: AR072985A1; US20100040616A1; CA2733432A1; DOP2011000041A; CN102177179A; IL211034A0; UY32038A; BRPI0916945A2; CO6341640A2; KR20110044777A; PE20110382A1; AU2009279471A1; MX2011001477A; WO2010017468A1; EP2318442A1; US20110287000A1; JP2011530533A; ZA201100974B; MA32621B1; CR20110118A

Description

201018482 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明&供治療多發性硬化许用甘Α ώ __ , 更化症及其他自身免疫疾病之新、法&用於δ亥等方法中之新穎經分離結合蛋白。本發明提供治療多發性硬化症之方法，其包含中和IL_7或IL_ 7R之生物活性。【先如技術】多發性硬化症_係影響中插神經系統之慢性炎症性脫趙鞠病。在MS中，據信在少突角質細胞之破壞中涉及浸潤炎症性免疫細胞，該等少突角質細胞負責產生及維持稱作髓鞘之脂肪層。；MS導致髓磷脂變薄或完全消失。若骑磷脂消失，則神經元不能再有效引導其電信號，從而導致多種神經機能障礙。患有MS之個體產生自鱧反應性丁細胞，其參與形成沿神經纖維髓鞘分佈之炎症性損傷。患有活動性MS之患者的腦脊髓液含有活化τ細胞，其浸潤腦組 φ 織並引發特徵性炎症損傷，從而破壞髓磷脂。儘管多發性硬化症之症狀及病程可因人而異，但其存在三種疾病形式·復發-緩解型MS、次發進行型MS、及原發進行型Ms。在MS之早期階段中，在急性增強之疾病活動的較短間 -期發生炎症侵襲。在該等發作之後出現恢復及緩解期。在緩解期期間，神經系統損傷中之局部腫脹消退，免疫細胞活性降低或變得無活性，且產生髓磷脂之細胞使軸突之髓賴再生。神經信號轉導改良’且由炎症導致之失能減輕或完全消失。此疾病階段稱作復發-緩解型MS(RRMS)。然而 141892.doc 201018482 並非所有損傷皆完全癒合❹某些損傷以「慢性」損傷形式保留，其通常具有缺少免疫細胞之脫髓鞘核心區。隨著時間流逝，位於該等損傷中心之細胞大多死亡，但炎症經常在其邊緣繼續存在。腦對某些神經元之損失可具有良好適應，並且永久性失能可能並不會持續多年。然而，超過 50%患有MS之患者最終進入稱作次發進行型MS(spMS)2 進行性惡化階段。在此階段中，疾病不再對疾病調修藥物產生良好反應’且患者之失能穩定惡化。MS早期自然病程中對神經元之破壞說明，SPMS之進行性失能可能係因神經元損失積累最終超過腦補償能力所致。原發進行型 MS係一類不存在復發之多發性硬化症，但身體及認知機能會在數年期間逐漸損失。治療患有復發-緩解型多發性硬化症之患者之目標係降低復發之頻率及嚴重性（及由此預防加劇）以及預防或延遲疾病進行性階段之發作。為達成此目標，在過去尤其已使用免疫調節或免疫抑制藥物，但由於其效能有限且毒性顯著故未被廣泛接受。舉例而言，人們已使用干擾素β-la、干擾素β-lb及乙酸格拉默（glatiramer acetate)成功實施了大型隨機控制試驗。經改變自身免疫T細胞反應及免疫系統調控網絡之機能障礙二者皆在人類自身免疫病理（例如MS及類風濕性關節炎）中具有重要作用（Kuehroo等人，（2002) Annu. Rev. Immunol. 20:101-123 ; Sospedra及 Martin (2005)，Annu. Rev. Immunol. 23: 683-747 ; Toh及 Miossec (2007)，Curr. 141892.doc 201018482

Opin. Rheumatol. 19:284-288)。儘管MS之病因及發病機制仍然未知，但一般認為涉及自身免疫病理’其中認為諸如TH1及TH17細胞等具有致病潛力之自體反應性T細胞具有重要作用。有證據表明，該等效應T細胞係在病程期間於體内活化且可歸因於中柩神經系統（CNS)炎症。亦有證據表明’在疾病活動期間該等τ 細胞介導EAE及MS相傷中對趙構脂表現細胞之破壞。另一方面，在MS患者中缺少通常抑制致病τΗ1及ΤΗ17細胞之調卽T細胞（Treg) ’從而使付免疫系統進一步傾向於促炎狀離。最近三個獨立群體報導在總計1 7,947個患有或未患MS2 供者中實施全基因組單核苦酸多態性（SNP)掃描之結果。在掃描334,923個SNP後’其發現人類IL-7受體〇^(iL-7Ra) 中之非同義編碼SNP與MS易感性具有高顯著性關聯（總 Ρ=2·9χ10-7)。SNP對應於CD127(亦稱作IL-7Ra)外顯子6中 T至C之變變化。此變化增加在RNA剪接期間跳過外顯子6 之機會，從而產生CD127之可溶性形式。此外，CD127及 IL-7 RNA在MS患者腦脊髓液（CSF)中之表現顯著高於其他精神病症患者之CSF。已知主要在胸腺環境中IL-7及IL-7受體（IL-7R)對T細胞及B細胞發育及内穩態具有重要作用。實際上，胸腺間質細胞、胎兒胸腺、及骨趙係IL-7之產生位點。il-7受體由兩個亞單元組成，即CD127及IL-2、IL-4、IL-9、IL-15及 IL-21受體之共有鏈（γ鏈或YC)。 141892.doc 201018482 CD127亦稱為 IL-7 受體 a(IL-7Ra)及 p90 IL-7R。人類 €〇127(5评丨33卩1^登錄號？16871)總共具有459個胺基酸（20 個信號序列）。其包含219個胺基酸之細胞外區域、25個胺基酸之跨膜區域及195個胺基酸之細胞内區域。本文所用 CD127内殘基之編號（例如關於抗體表位之描述）係基於全長蛋白質，包括信號序列殘基。CD127可以四種亞型存在，亞型H20(Swissprot登錄號P16871-1)具有以下胺基酸序列（包括信號序列）： MTILGTTFGM VFSLLQVVSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSF SCYSQLEVNG SQHSLTCAFE DPDVNTTNLE FEICGALVEV KCLNFRKLQE IYFIETKKFL LIGKSNICVK VGEKSLTCKK IDLTTIVKPE APFDLSVIYR EGANDFWTF NTSHLQKKYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTH VNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP ILLTISILSF FSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP ESFLDCQIHR VDDIQARDEV EGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVWTPES FGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDC RESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ (SEQ ID NO: 1) CD 127亦存於胸腺間質衍生的淋巴細胞生成素（TSLP)之受體中。TSLP受體係CD 127與細胞因子受體樣因子2 (CRLF2)之異二聚體。 IL-7與IL-7R之結合活化多個信號轉導途徑，包括導致磷酸化之JAK激酶1及3之活化及Stat5之活化。此途徑對胸腺產生之T細胞前體的存活至關重要，此乃因在誘導抗細胞凋亡蛋白Bcl-2時及阻止促細胞凋亡蛋白Bax進入線粒體時需要Stat5活化。另一 IL-7R介導途徑係活化PI3激酶，從而導致促細胞凋亡蛋白Bad之磷酸化及其胞質保留。 -6- 141892.doc 201018482 CD 1 27在外周休眠T細胞及記憶性T細胞中表現。人們對 IL-7調節Τ細胞存活及内穩態之機制及IL-7在外周之來源仍未完全瞭解。此外，人們對其在致病Τ細胞於自身免疫疾病中之分化及功能中之潛在作用的研究較少且大部分仍係未知。幾乎沒有報導表明IL-7可有助於自身免疫疾病之發病。 CD 127已闡述於WO 901 5870中，且多發性硬化症治療中 IL-7及CD127之拮抗劑已闡述於WO 2006052660及US 20060198822中。TSLP之抬抗劑已闡述於（例如）仍 7304144及 WO 2007096149 中。【發明内容】本發明發明者已顯示’ IL-7/CD127拮抗可有效改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)。治療導致所治療小鼠脾及脊髓二者中之TH17細胞顯著減少及較低程度之Th1細胞減少，此伴隨有Foxp3+Treg之含量增加。恢復自體反應性炎症性Τη 17及Τη 1細胞及Treg與CD 127拮抗劑之功能比之平衡可提供作為多發性硬化症及其他自身免疫疾病療法之巨大潛力。 TH17及TH1細胞之選擇性易感性可歸因於cd 127在活化致病τ細胞中之高表現度及其分化及存活對比_7之需要。對CD127之封阻導致經改變信號轉導事件，其特徵在於磷酸化JAK_1及STAT-5及BCL-2之下調及ΒΑχ活性增強，從而賦予CD127+ TH17及TH1細胞對細胞凋亡之易感性。相反，F〇xP3+ W可誘導Treg)對CDm拮抗具有抗性，此乃 141892.doc 201018482 因其不表現€〇127，或表現較低量的0〇127。在1乙-7/11^711 交互作用下游之信號轉導事件（包括細胞凋亡途徑）在 Foxp3+ Treg中不受中和性抗CD127抗體影響。此外，在人類TH17及TH1分化及存活中觀察到CD127拮抗之類似效應’其對Treg無影響。該等發現提供新證據來支持IL-7在致病T細胞分化及維持中之作用且在MS及其他人類自身免疫疾病中具有重要治療意義。此外’本發明發明者驚人地發現，在針對人類CD127之細胞外結構域產生之抗IL-7R抗體中僅小部分能與在CHO 細胞及PBMC之細胞表面上過度表現之CD127結合，且彼等抗體中僅一個亞組能抑制IL-7與CD 127細胞外結構域之交互作用。此外’人們發現與細胞表面上所表現CD127結合之大多數抗體不能抑制IL-7誘導之STAT-5磷酸化或Th17 擴增’或抑制性極差。儘管某些抗體能與IL_7不完全競爭結合CD127，但其不能顯著抑制IL-7誘導之STAT-5磷酸化或抑制IL-7誘導之lFN-γ及IL-17產生。在本發明第一態樣中’提供治療人類個體中自身免疫疾病或炎症性病症之方法，其包含向該個體投與IL_7受體介導的Th17擴增之拮抗劑。可觀察到IL-7受體介導之TH17擴增伴隨有該等細胞所產生IL_ 17之增加。因此，il-7受體介導的Th17擴增之拮抗劑通常抑制TH17細胞受IL-7誘導而產生IL-7 °亦可觀察到IL_7受體介導之Th17擴增伴隨有Th17 細胞所產生IFN-γ之增加，且因此本發明拮抗劑亦可抑制 TH17細胞產生lFN-γ。在分子層面上，IL_7受體介導的 141892.doc 201018482 ΤΗ17擴增之拮抗劑可抑制IL_7受體介導STAT_5磷酸化。因此’在另一態樣中’本發明提供治療人類個體中自身免疫疾病之方法’其包含向該個體投與IL_7受體介導 STAT-5磷酸化之拮抗劑。因此，在另一態樣中’本發明提供治療人類個體中自身免疫或炎症性疾病之方法，其包含向該個體投與有效量之 IL-7或IL-7R之拮抗劑以降低τΗ 17細胞相對於τΗ 1細胞之比。在一實施例中’拮抗劑係特異性結合IL_7或CD 127之結合蛋白’其可抑制IL-7與IL-7R受體複合物之結合。本發明發明者已確定，該等結合CD127之蛋白在功能性中和IL-7途徑或IL-7R介導的信號轉導中並非同等有效。相反， CD 127多狀中某些區域似乎在信號轉導途徑中具有重要作用，就此而言’能結合CD127中一或多個該等區域之抗體可尤其有效地中和IL-7途徑或IL-7R介導之信號轉導。該等區域由SEQ ID ΝΟ··1中之以下胺基酸殘基來限定：41至 63、65 至 80、84 至 105、148 至 169、及 202 至 219。本發明提供能結合複數個該等區域内至少一個胺基酸之抗原結合蛋白。在一實施例中’結合蛋白結合SEq ID NO: 1中65至 80、84至105、148至169、及202至219之各肽内之至少一個胺基酸。在一實施例中，結合蛋白結合由SEq ID NO: 1 中胺基酸148至169限定之區域中之至少一個胺基酸且結合由胺基酸212至219限定之區域中之至少一個胺基酸。結合蛋白另外可結合由胺基酸65至80及/或84至105限定之區域 141892.doc 201018482 中之至少一個胺基酸。在一實施例中，結合蛋白競爭性抑制R34.34(Dendritics 公司，第DDX0700號）與人類CD127之結合，或競爭性抑制具有6A3之重鏈及輕鏈可變區（分別為SEQ ID NO:193及 SEQ ID NO:194)之抗體與人類CD127之結合。可在（例如）競爭性ELISA分析中確定競爭性抑制。在一實施例中，結合蛋白以10 nM或更低、5 nM或更低、或1 nM或更低之親和性（KD)結合CD 127，如藉由表面電漿共振所量測。結合蛋白可為抗體或其片段。本發明抗體包括6A3、 6C5及 9B7 ° 在本發明另一態樣中，提供鑒定適用於治療自身免疫疾病或炎症性疾病之抗體或抗體片段之方法，該方法包含以下步驟：篩選複數個獨立抗體或抗體片段群以確定每個抗體群達成以下目的之能力： i. 抑制IL-7與IL-7R之結合， ii. 中和IL-7誘導之STAT-5磷酸化，及/或 iii. 抑制TH17細胞產生IL-17 ; 及選擇彼等能抑制IL-7與IL-7R之結合、能抑制IL-7誘導之STAT-5磷酸化、及/或能抑制TH17細胞在體内產生IL-17 之抗體或抗體片段群。在另一態樣中，本發明提供治療患者中多發性硬化症之方法，其包含向該患者投與IL-7或CD127之拮抗劑，其中該患者患有復發-緩解型多發性硬化症。 141892.doc -10· 201018482 在另一態樣中，本發明提供人類、人類化或嵌合抗體或其片段，其中該抗體或片段結合人類CD 127之表位，該表位在始於殘基編號80且終於殘基編號190之區域中含有至少一個胺基酸殘基。抗體或抗體片段可結合至少一個由以下胺基酸殘基組成之肽中之至少一個胺基酸：SEQ ID ΝΟ:1之41至63、65至 80、84至105、148至169、及202至219 ° 在另一實施例中，抗體或片段可結合人類CD 127之表位，該表位具有存於至少一個以下CD 127區域中之胺基酸殘基：35-49、84-105及 139-180。在另一實施例中，抗體或抗體片段結合以下線性肽中之至少一個肽：35-49、84-105及 171-180。在本發明較佳實施例中，拮抗劑係抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係抗CD 127抗體，或其抗原結合片段，其結合CD127且包含SEQ ID NO:197之重鏈互補決定區3 (CDRH3)或其類似物。抗原結合蛋白可另外包含8£()1〇]^0:195之€〇11111及 SEQ ID 1^0:196之001012中之至少一者或任一者之類似物，且可另外包含選自以下之一或多個或所有CDR : SEQ ID NO:195之 CDRH1、SEQ ID NO:196之 CDRH2、SEQ ID NO:198 之 CDRL1、SEQ ID NO: 199 之 CDRL2 或 SEQ ID N0:200之CDRL3，或其類似物。在一實施例中，結合蛋白為經分離人類、人類化或嵌合抗體。 141892.doc -Π - 201018482 在另一實施例中，本發明提供抗體或抗體片段，其與本發明結合蛋白競爭結合人類CD127，其中該抗體並非 R34.34(Dendritics公司，第 DDX0700號）。本發明亦提供經分離結合蛋白，其中該經分離結合蛋白結合人類CD127之表位，該表位含有始於殘基編號80且終於殘基編號190之區域内之至少一個胺基酸殘基。在另一實施例中，經分離結合蛋白結合位於由人類CD127之殘基編號80及190所述之區域内的表位。在本發明另一態樣中，提供結合人類CD127表位之經分離結合蛋白，該表位具有存於至少一個以下CD127區域中之胺基酸殘基：35-49、84-105、139-180 ;或提供結合至少一個以下線性肽之經分離結合蛋白：人類CD127之35-49、84-105、171-180，且在本發明之一個實施例中此結合可藉由ELISA來量測。在本發明另一態樣中，通過結合人類CD127表位（SEQ ID NO: 1)之經分離結合蛋白，該表位具有存於以下SEQ ID NO: 1區域内之胺基酸殘基，或該表位存於以下SEQ ID ΝΟ:1區域内：80-94、95-109、170-184。本發明之另一部分係如藉由肽ELIS A所量測結合以下肽中任一者之抗體： SEQ ID NO : 20-75(含）。在本發明結合蛋白及抗體所結合之CD 127表位之定義中，所用編號系統係指CD 127之全長序列，其包括信號序列。在一實施例中，人類CD 127之表位存於所引用SEQ ID ΝΟ:1殘基内。 141892.doc -12- 201018482 在一實施例中，本發明結合蛋白以如藉由表面電漿共振 (BIAcore)所量測小於1 nM之親和性（KD)、較佳如藉由表面電漿共振所量測小於5 00 nM之親和性（KD)、且更佳如藉由表面電漿共振所量測介於1 〇與1 〇〇 nM之間之親和性（KD) 結合人類CD127。在本發明另一態樣中，提供抗體或其片段’如藉由表面電漿共振所測定’其結合包含CD127殘基35-49、84-105、 171-180之C末端生物素化CD127肽，該肽結合至抗生蛋白鏈菌素感受器晶片上。在另一實施例中’抗體或其片段之結合另外需要至少一個側翼殘基或結構上與該至少一個位於CD 127之35-49、 84-105或171-180區域中之殘基相鄰之殘基。熟習此項技術者可使用（例如）ELISA分析中之丙胺酸替代掃描來容易地確疋6玄等抗體或其片段。就此而言，可藉由用丙胺酸獨立地取代該CD 127殘基並比較該抗體與丙胺酸取代CD127肽之結合親和性及該抗體與野生型CD127之結合親和性來確定’該抗體之結合是否需要位於CD 127之35-49、84-105或 171-180區域中之殘基或侧翼殘基或結構上相鄰之殘基。是否需要位於CD 127之35-49、84-105或171-180區域中之殘基係藉由抗體與丙胺酸取代CD127之結合親核性相對於與野生型CD127之結合親和性之降低來定義，其中如藉由 Biacore或ELISA親和性量測所測定，該降低超過i、2、 3、4或5倍。此外’在本文中結構上相鄰之殘基係在三度空間中與所 141892.doc 201018482 述殘基緊密相鄰且與抗體結合之殘基。熟習此項技術者應瞭解，抗原表位可為線性或非線性肽序列。在後者之非線性情況下，儘管殘基來自肽鏈之不同區域，但其在抗原之三度結構中可緊密相鄰。該等結構上相鄰之殘基可經由電腦建模程式或經由用業内已知方法（例如X射線晶體學）獲得之三度結構來確定。在本發明一實施例中提供治療性抗體，其係抗體或其抗原結合片段及/或其衍生物，其結合CD127且其包含以下 CDR ： CDRH1 ： RYNVH (SEQ ID NO:4)； CDRH2 ： MIWDGGSTDYNSALKS (SEQ ID NO:5)； CDRH3 ： NRYESG (SEQ ID NO:6)； CDRL1 ： KSSQSLLNSGNRKNYLT (SEQ ID NO：7); CDRL2 : WASTRES (SEQ ID N〇:8);及 CDRL3 : QNDYTYPFTFGS (SEQ ID NO:9)。在另一實施例中，本發明提供治療性抗體，其係抗體或其抗原結合片段及/或其衍生物，其結合CD 127且包含以τ CDR ： CRDH1 ： AYWMS (SEQ ID NO:78) CDRH2 : EINPDSSTINCTPSLKD (SEQ ID N〇:79) CDRH3 ： RLRPFWYFDVW (SEQ ID NO:80) CDRL1 : RSSQSIVQSNGNTYLE (SEQ ID N0:81) CDRL2 ： KVSNRFS (SEQ ID NO:82) CDRL3 : FQGSHVPRT (SEQ ID NO:83)。 141892.doc 14 201018482 在另一實施例中，本發明提供治療性抗體，其係抗體或其抗原結合片段及/或其衍生物，其結合CD127且包含以下 CDR ： CRDH1 ： TDYAWN (SEQ ID NO:195) CDRH2 ： YIFYSGSTTYTPSLKS (SEQ ID NO:196) CDRH3 ： GGYDVNYF (SEQ ID NO:197) CDRL1 ： LASQTIGAWLA (SEQ ID NO:198) CDRL2 : AATRLAD (SEQ ID NO:199)

CDRL3 : QQFFSTPWT (SEQ ID N0:200)。在此說明書通篇中，術語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」遵循Kabat編號系統，如Kabat等人；iSegwewcej of proteins of Immunological Interest NIH, 1987中所述。因此下文定義本發明CDR : CDR 殘基 CDRH1 31-35、35(A)、35(B) CDRH2 50-65 CDRH3 95-97 CDRL1 24-34 CDRL2 50-56 CDRL3 80-97 在本發明另一實施例中，提供包含以下重鏈可變區之單株抗體：

QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYNVHWVRQP 141892.doc 15 201018482 PGKGLEWLGMIWDGGSTDYNSALKSRLSITKDNSKSQVFL KMNSLQTDDTAMYYCARNRYESGMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:2) 在本發明另一實施例中，提供包含以下輕鏈可變區之單株抗體： DIVMTQTPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNRKNYLT WYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLII SSVQAEDLAVYYCQNDYTYPFTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO:3) 在本發明另一實施例中，提供包含以下重鏈可變區之單株抗體： EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFAFSAYWMSWVRQ APGKGLEWIGEINPDSSTINCTPSLKDKFIISRDNAKNTLSL QMNKVRSEDTALYYCARRLRPFWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO:76) 在本發明另一實施例中，提供包含以下輕鏈可變區之單株抗體： DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVQSNGNTYLEW YLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 77) 在本發明另一實施例中，提供包含以下重鏈可變區之單株抗體：

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITTDYAWNWIRQ 141892.doc -16- 201018482 FPGNKLEWMGYIFYSGSTTYTPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYYCARGGYDVNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:193) 在本發明另一實施例中，提供包含以下輕鏈可變區之單株抗體‘· DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYQQKP GKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAE DFVSYYCQQFFSTPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:194) 本發明亦提供抗體可變結構域序列，其相對以下SEQ ID NO序列之全長具有至少90%—致性、或至少95%—致性、或至少98%—致性、或至少99%—致性：2及3、76及77或 193及194 。在一實施例中，本發明經分離結合蛋白係在ELISA分析或FACS競爭性分析中與抗體R34.34(Dendritics公司，第 DDX0700號）或與具有SEQ ID NO:193中所述重鏈可變區及 SEQ ID NO:194中所述輕鏈可變區之抗體競爭結合CD127 之抗體。本發明亦提供治療多發性硬化症之單株抗體，其在與以下單株抗體中之一或多種相同之表位處結合人類CD127 : 包含SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3之可變區之單株抗體、包含SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77之可變區之單株抗體、及包含SEQ ID NO:193及SEQ ID NO:194之可變區之單株抗體。本發明亦提供治療多發性硬化症之單株抗體，其與以下 141892.doc -17- 201018482 單株抗體中之一或多種競爭結合人類CD127:包含SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3之可變區之單株抗體、包含SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77之可變區之單株抗體、及包含SEQ IDNO:193及SEQIDNO:194之可變區之單株抗體。在本發明另一實施例中提供經分離結合蛋白，其中該經分離結合蛋白能與抗體競爭結合人類CD127，該抗體包含以下重鏈可變區： QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYNVHWVR QPPGKGLEWLGMIWDGGSTDYNSALKSRLSITKDNSKS ❿ QVFLKMNSLQTDDTAMYYCARNRYESGMDYWGQGTT VTVSS (SEQ ID NO:2)；及以下輕鍵可變區： DIVMTQTPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNRKNY LTWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTD FTLIISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPFTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO:3)。在本發明另一實施例中提供經分離結合蛋白，其中該經分離結合蛋白能與抗體競爭結合人類CD127，該抗體包含以下重鏈可變區： EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFAFSAYWMSWV RQAPGKGLEWIGEINPDSSTINCTPSLKDKFIISRDNAKN TLSLQMNKVRSEDTALYYCARRLRPFWYFDVWGAGTT VTVSS (SEQ ID NO:76) 及以下輕鏈可變區： 141892.doc -18 - 201018482 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVQSNGNTYLE WYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 77)。在本發明另一實施例中提供經分離結合蛋白，其中該經分離結合蛋白能與抗體競爭結合人類CD 127，該抗體包含以下重鏈可變區： DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITTDYAWNWIRQ FPGNKLEWMGYIFYSGSTTYTPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYYCARGGYDVNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:193) 及以下輕鏈可變區： DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYQQKP GKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAE DFVSYYCQQFFSTPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:194)。熟習此項技術者應瞭解，為使抗體或片段（抗體或片段 A)與抗體 R34.34、6A3、6C5 或 9B7、或包含 SEQ ID NO:2 及 SEQ ID NO:3 之可變區或 SEQ ID NO:76 及 SEQ ID NO:77 之可變區或SEQ ID NO:193及SEQ ID NO: 194之可變區之抗體（抗體B)競爭（人類CD127之）特異性結合位點，抗體A 必須以在該分析中足以產生效應之量存在。舉例而言，抗體A及抗體B可以等莫耳量存在。若抗體A為競爭性抗體，則在ELISA分析中抗體A之存在可將抗體B與人類CD127之結合減弱10%、20%、3 0%、40%或50%以上。競爭性抗體 141892.doc -19- 201018482 (抗體A)可減弱抗體B與板結合人類CD127之結合，而非抗 CD127特異性對照則不需如此。在該等ELISA分析中，可使人類CD127結合至免疫分析板。能與抗體R34.34或本發明抗體競爭結合CD 127之經分離結合蛋白、具有SEQ ID NO:2之VH及SEQ ID NO:3之VL之經分離結合蛋白、具有SEQ ID NO:76之VH及SEQ ID NO:77之VL之經分離結合蛋白、或具有SEQ ID NO:193之 VH及SEQ ID ΝΟ:194之VL之經分離結合蛋白可用於治療MS 及其他自身免疫疾病。本發明結合蛋白可包含R34.34、9B7、6A3或6C5之 CDR，或其可包含其類似物。在本發明之背景下，包含 R34.34、9B7、6A3 或 6C5 CDR 類似物（R34.34 類似物、6A3 類似物、9B7類似物或6C5類似物）之抗體可分別具有與含有親代抗體（例如6A3或9B7)CDR之彼等相同或相似之功能特性，此乃因9B7類似抗體或6A3類似抗體以相同或相似結合親和性結合相同靶蛋白或表位。類似物可在其每個或所有CDR内包含一或多個胺基酸取代，且在一實施例中，親代抗體CDR之至少80%胺基酸殘基未改變，在另一實施例中CDR之至少90%未改變，且在另一實施例中CDR之至少95%胺基酸殘基未改變。在另一實施例中，親代抗體之 CDR H3全部未改變，同時其他CDR可與對應親代抗體 CDR相同或為其類似物。本發明亦提供人類化抗體，其中將R34.34、9B7、6A3 或6C5 CDR(或其類似物）移植至重鏈或輕鏈可變結構域網 141892.doc •20- 201018482 絡中。在本發明另一態樣中提供編碼本發明結合蛋白之多核苷酸序列。具體而言，提供編碼抗體或其片段之多核苷酸序列，該抗體或其片段包含存於9B7 (SEQ ID NO:4-9)中之 CDR之一或全部。其中亦提供編碼抗體或其片段之多核苷酸序列，該抗體或其片段包含存於6C5 (SEQ ID NO·· 78-83)中之CDR之一或全部。其中亦提供編碼抗體或其片段之多核苷酸序列，該抗體或其片段包含存於6A5 (SEQ ID ® NO: 195-200)中之CDR之一或全部。在本發明相關態樣中提供經本發明多核苷酸轉染之宿主細胞。本發明結合蛋白可用於治療多發性硬化症之方法中，該方法包含向有需要之患者投與安全有效劑量之本發明結合蛋白。在本發明之此態樣中，結合蛋白可為包含存於9B7 (SEQ ID NO:4-9)中之CDR之一或全部之抗體或其片段、或包含所有存於6C5 (SEQ ID NO:78-83)中之CDR之抗體或其片段、或包含所有存於6A3 (SEQ ID NO:195-200)*iCDR 之抗體或其片段。在本發明之此態樣中亦提供一種方法，其中需要治療之患者係將要到達或處於復發期之復發/緩解型MS (RRMS)患者。【實施方式】本發明係基於以下發現：IL-7/IL-7R信號轉導在小鼠及人類系統二者中定型TH1 7細胞之存活及擴增中具有關鍵作用，同時其在TH17分化中之作用與IL-6相比並非關鍵作 141892.doc -21 - 201018482 用。令人驚訝地，在EAE(多發性硬化症動物模型）中江_7r 拮抗對免疫系統之體内效應具有高度選擇性，其影響主要為圯L'表型之ΤΗ17細胞及τΗ 1細胞（程度較低），而不影響 Treg細胞。此選擇性似乎在ΕΑΕ中藉由IL_7R拮抗使致病 TH17細胞與Treg細胞之比重新平衡時具有重要作用且因此具有…療效能。在Th17細胞存活及擴增中上述江_7/匕_7尺信號轉導之新穎作用機制為IL_7R拮抗在EAE中之治療效能及在人類自身免疫疾病（例如MS)中之治療意義提供有力解釋。IL-7中和或IL_7R拮抗可能具有獨特治療優勢。一方面，治療提供區分致病TH1及TH17細胞與Treg及無關免疫細胞之選擇性。另一方面，^一尺拮抗之其他治療優勢涉及其對已分化TH17存活及擴增之選擇性效應，該效應與對 TH17分化之效應相反。可以想像，在治療背景中相對於 τηΠ分化靶向定型Th17之體内維持更為有效。對IL-7受體介導信號轉導之抑制由此為自身免疫或炎症性疾病之治療提供有希望之治療干預。本文所用術語IL-7R介導之信號轉導意指在IL-7受體複合物與其配體IL-7結合時所引發之生物效應。IL-7R介導之信號轉導由此包括（但不必須限於）IL-7誘導之STAT-5碟酸化、IL-7誘導之TH17細胞擴增及IL-7誘導之TH17細胞存活中之一或多者或全部。本文所用IL-7途徑结抗劑係可功能性阻斷IL-7之生物效應之任何實髏，此可藉由分析來量測。在分子層面上，可藉由對諸如IL-7誘導P-STAT5或Bcl-2等之分析來觀察並量 14-1892.doc -22- 201018482 測阻斷效應。本文中闡述實例性P-STAT5分析。在細胞層面上，可藉由對諸如Thl7分泌IL-17或IFNy等之分析來觀察並量測阻斷效應。本文亦闡述實例性分析。本發明經分離結合蛋白可呈抗體形式，例如完整抗體、人類、人類化或嵌合抗體、或該等抗體之片段或結構域。本發明該等抗體可包含存於9B7 (SEQ ID NO: 4-9)、6C5 (SEQ ID NO:78-83)或 6A3 (SEQ ID N0:195-200)中之一或多個或所有CDR以供治療多發性硬化症。本發明結合蛋白可結合CD127，例如可特異性結合 CD 127之單株抗體。結合蛋白亦可為用於治療多發性硬化症之減弱TSLP與TSLP受體結合且亦減弱IL-7與IL-7受體結合之實體，例如可結合IL-7及TSLP配體之雙特異性蛋白、或可產生此效應之IL-7R及TSLPR之元件、或各配體與受體之組合。就此而言，TSLP拮抗劑闡述於（例如）US7304144及W02007096149中，且如上述文獻所述， TSLP受體包含CD127。因此本發明拮抗劑可用作TSLP拮抗劑。本文所用術語「經分離」意指自結合蛋白可能存在之自然環境中將其移出，例如可將其與自然界中通常與其共存之物質純化分離。若該等結合蛋白佔樣品蛋白質質量之至少50%或至少80%，則結合蛋白基本上純淨。可用於本發明中之IL-7/IL-7R途徑拮抗劑能部分或完全抑制由IL-7誘導之STAT-5磷酸化。例如，可在分析中測定 STAT-5磷酸化，例如本文所述之分析（實例2.3) 〇在此一 141892.doc •23- 201018482 分析中，在存在及不存在測試試劑時用IL_7刺激PBMC。隨後藉由（例如）將pSTAT-5染色（例如用經標記抗pSTAT_5 抗體）後實施螢光活化細胞分選來定量評價細胞之pSTAT-5 含量。磷酸化STAT-5之含量亦可藉由ELISA來測定。彼等可降低磷酸化STAT-5含量之試劑可為自身免疫疾病之潛在候選治療藥物。在一實施例中，與未經處理細胞相比，拮抗劑能將磷酸化STAT-5含量降低80。/。。拮抗劑可能能將磷酸化STAT_5 含量降低85%、90%、95%或ι〇〇%。在此分析中，拮抗劑❿ 之ICm可為2 pg/ml或更低。在一實施例中，拮抗劑之1(：5〇小於或等於1 pg/ml、小於或等於〇 5 μ§/ιη1、小於或等於 0.25 pg/ml、或小於或等於ο ι μ§/ϊη1。本發明拮抗劑可尤其有效地抑制Th〖7細胞之擴增。TH17 細胞之擴增可在TH1 7擴增分析中加以測定，其包含在存在及不存在測試試劑時刺激τ細胞群擴增，之後刺激細胞產生IL-17並在存在及不存在測試試劑時評價細胞所產生IL_ 17之含量。 Θ 在一實施例中，相對於陰性對照，拮抗劑能在此一分析中將IL-17分泌抑制2〇%或更多。更通常而言，相對於對 . 照，拮抗劑能將IL-17分泌抑制50。/。、75%、85°/。或90°/。或更多。在某些實施例中，拮抗劑在分析中表現小於或等於 5〇 μ§/Γη1之1C50。在其他實施例中，IC5〇可小於或等於20 μ2/ιη1、10 Pg/ml 或 5 pg/ml。在此分析之實施例中’藉由在IL-1、IL-6及IL-23存在下 I41892.doc • 24· 201018482 用T細胞受體活化刺激來使人類CD4+ T細胞分化為ΤΗ17。在分化5天後，對CCR6+細胞實施分選以產生濃集Th17 群。然後用人類IL-7將此群刺激4〇 h並測定上清液中之IL-I7及IFN-γ增加。在40 h培養期間藉由功能性IL-7/IL-7R途徑拮抗劑（例如抗CD 127抗體）阻斷IL-7與CD 127之間之交互作用應可阻止TH17細胞之擴增，從而降低IL_ 17之產生。在此實施例中，可使用市售套組（例如CD4+ T細胞分離套組II，130-091-155號，Miltenyi Biotec)自人類外周血單核細胞分離CD4+ T細胞。然後通常以υχίΟΕό/ιηΙ之濃度使⑶4"1· Τ細胞再懸浮於具有10% FCS之RPMI培養基中。通常將細胞與對照或抗^一心抗體一起預培養3〇 min。然後在37°C下將細胞與1〇 ng/mi IL_7 一起培養或單獨培養72 h。在培養結束時，用％ ng/mi pMA及1 pg/ml離子徽素將細胞刺激5 h。然後收集細胞培養上清液且藉由eusa (eBiosciences)來測定 il-17 濃度。完整抗體本發明結合蛋白可為「完整抗體」。完整抗體通常為包含至少兩個重鏈及兩個輕鏈之異源多聚糖蛋白。除IgM 外’完整抗體為約15〇 KDa之異源四聚糖蛋白，其由兩個相同輕（L)鏈及兩個相同重（H)鏈組成。通常各輕鏈藉由一共價二硫鍵與重鏈相連，而在不同免疫球蛋白同型物重鏈之間二硫鍵之數目各不相同。各重鏈及輕鏈亦具有鏈内二硫鍵。各重鏈在一末端具有可變結構域（Vh)，後接多個恆定區。各輕鏈在另一末端具有可變結構域（Vl)及恆定區； 141892.doc -25- 201018482 輕鏈恆定區與重鏈第一恆定區對齊，且輕鏈可變結構域與重鏈可變結構域對齊。來自大多數脊椎動物物種之抗體輕鏈皆可根據恆定區胺基酸序列歸為稱作K (Kappa)及λ (Lambda)之兩種類型中之一類。端視其重鏈恆定區之胺基酸序列，可將人類抗鱧歸為五種不同種類：IgA、IgD、 IgE、IgG及IgM。IgG及IgA可進一步細分為不同亞類：

IgGl、IgG2、IgG3 及 IgG4 ;及 IgAl 及 IgA2。不同物種存在變體，其中小鼠及大鼠至少具有IgG2a、igG2b。抗體可變結構域賦予具有某些表現特定差異性之區域（稱作互補決疋區（CDR))之抗體以結合特異性。可變區之更保守部分稱為框架區（FR)。完整重鏈及輕鏈之可變結構域各自包含四個藉由二個CDR相連之FR。各鏈中之CDR藉由FR緊密地結合在一起並與其他鏈之CDR一起促成抗體中抗原結合位點之形成。恆定區並非直接作用於抗體與抗原之結合中，而是表現出各種效應子功能，例如參與抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC) '經由與FCy受體結合參與吞噬作用’經由新生Fc受體（FcRn)參與半衰期/清除率，及經由補體級聯之C1 q組份參與補體依賴性細胞毒性。已報導人類IgG2恆定區實質上缺少藉由傳統途徑活化補體或介導抗體依賴性細胞毒性之能力。已報導IgG4恆定區缺少藉由傳統途徑活化補體之能力且介導抗體依賴性細胞毒性之能力較弱。實質上缺少該等效應子功能之抗體可稱為「非溶解性j抗體。人類抗體 141892.doc -26 - 201018482 本發明結合蛋白可為「人類抗體」。人類抗體可藉由熟習此項技術者已知之多種方法來產生。人類抗體可藉由雜交瘤方法使用人類骨髓瘤或小鼠-人類雜骨髓瘤細胞系來製備，參見 Kozbor J. Immunol 133，3001, (1984)及

Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 5 1-63 頁（Marcel Dekker公司，1987)。替代方法包括使用噬菌體文庫或轉基因小鼠，該二者皆採用人類 V區庫（參見 Winter G，（1994)，Annu. Rev. Immunol 12, 433-455, Green LL (1999), J. Immunol, methods 231, 11-23)。現可使用若干種轉基因小鼠品系，其中其小鼠免疫球蛋白基因座已經人類免疫球蛋白基因區段替代（參見 Tomizuka K，(2000) PNAS 97，722-727 ； Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15，146-156)。在抗原激發後，該等小鼠能產生多種人類抗體，可自其中選擇目標抗體。可使用噬菌體文庫技術來產生人類抗體（及其片段），參見 McCafferty ; Nature，348，552-553 (1990)及 Griffiths AD 等人（1994) EMBO 13:3245-3260。嵌合及人類化抗體本發明結合蛋白可為「嵌合」或「人類化」抗體。完整非人類抗體在人類疾病或病症治療中之應用伴隨有現已確認之潛在免疫原性問題，在重複投與抗體後尤其如此：亦即患者之免疫系統會將非人類完整抗體識別為非己並產生 141892.doc -27- 201018482

中和反應。除研發完整人類抗體（參見上文）外，在過去數年中已研發出各種技術來克服該等問題，且該等技街一般涉及降低非人類胺基酸序列在完整治療性抗體中之組成同時保留自經免疫動物（例如小鼠、大鼠或兔）獲取非人類抗體之便利性。概言之’已使用兩種方法來達成此目的。第一種方法為嵌合抗體’其一般包含與人類恆定區融合之非人類（例如齧齒類動物，例如小鼠）可變結構域。由於抗體之抗原結合位點位於可變區内，因此嵌合抗體保留其抗原結合親和性但需要人類恆定區之效應子功能且因此能實施效應子功能。嵌合抗體通常係使用重組DNA方法來產生。使用習用程序對編碼抗體之DNA(例如cDNA)實施分離及測序（例如藉由使用能與編碼本發明抗體Η及l鏈可變區之基因特異性結合之寡核苷酸探針來實施，例如上述Seq ID NO:2及3之DNA)。可藉由用人類l及Η鏈之編碼序列取代對應非人類（例如鼠類）11及L恆定區來修飾DNA，例如參見 MoiTison ; PNAS 81，685ι (1984)。因此在本發明另一實施例中提供嵌合抗體，其包含具有以下序列之vH結構域： SEQ ID NO:2，及具有以下序列之Vl結構域：Seq ID NO:3且該等結構域與人類恆定區融合（其可為IgG同型，例如 IgGl)。第二種方法涉及生成人類化抗體，其中藉由使可變區人類化來降低抗體中之非人類組份含量。已有兩種人類化技術得到公認。第一種係藉由CDR移植來實施人類化。cDR 構建接近抗體N末端之環，其中其形成安置在框架區所提 141892.doc -28- 201018482 供支架中之表面。抗體之抗原結合特異性主要取決於表面形貌及其CDR表面之化學特性。該等特徵繼而取決於各 CDR之構象，取決於CDR之相對佈局，且取決於包含cDR 之殘基側鏈之性質及佈局。可藉由僅將非人類（例如鼠類）抗體（「供者」抗體）之CDR移植至適宜人類框架（「受者框架」）及恆定區中來達成免疫原性之顯著下降（參見；〇11^等人（1986) Nature 321，522-525 及 Verhoeyen Μ 等人（1988) ❿ Science 239, 1534-1536)。然而，CDR本身之移植可能並不能完全保留抗原結合特性，且經常發現若欲恢復顯著抗原結合親和性則需要在人類化分子中保留供者抗體之某些框架殘基（有時稱之為「回復突變」）（參見Queen c等人 (1989) PNAS 86, 10,029-10,033 ; Co, Μ等人（1991) Nature 351，5〇1_5〇2)。在此情況下，可自數據庫選擇顯示與非人類供者抗體具有最大序列同源性（通常6〇%或更高）之人類v 區以提供人類框架（FR)。可自人類共有序列或各人類抗體 • 選擇人類FR。其中將來自供者抗體之必需關鍵殘基取代至人類受者框架中以保留CDR構象。可使用抗體之電腦建模來幫助確認該等結構上重要之殘基，參見w〇 99/48523。或者，可藉由「鑲飾」法來達成人類化。對獨特人類及鼠類免疫球蛋白重鏈及輕鏈可變區實施之統計學分析揭示，暴露殘基之精確模式在人類與鼠類抗體中各不相同，且大部分單獨表面位置對少數不同殘基具有很強偏愛（參見 Padlan E.A.等人（1991) Mol. imniunol. 28，489-498及 Pedersen J.T·等人（1994) J. Mol· Biol. 235 ; 959-973)。因 14I892.doc -29- 201018482 此，藉由替換非人類Fv構架區中不同於彼等人類抗體中常見者之暴露殘基可能會降低非人類Fv之免疫原性。由於蛋白抗原性可能與表面可達性有關，故替換表面殘基可能足以使人類免疫系統「看不見」小鼠可變區（亦參見Mark G.E.專又（\994) ’ Handbook of Experimental Pharmacology ’ 第 113 卷：The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag，第105-134頁）。此人類化程序稱作「鑲飾」，此乃因僅改變抗體表面，而支撐殘基保持原狀。其他替代方法包括闡述於WO 04/006955中者及 HumaneeringTM (Kalobios)程序，其利用細菌表現系統並產生序列上類似於人類種系之抗體（Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California)。熟習此項技術者應瞭解，術語「衍生」不僅意欲將來源之含義定義為材料之物理來源，且亦欲定義為結構上與該材料相同但並非源自所述來源的材料來源。因此「在供者抗體發現中之殘基」不一定係自供者抗體純化獲得。因此，本發明之一態樣為人類化抗體，其包含存於小鼠抗體9B7 (SEQ ID NO: 4-9)中之CDR之一或多者或全部。多特異性或雙特異性抗體本發明結合蛋白可為「多特異性」或「雙特異性」抗體。多特異性或雙特異性抗體係可阻止或降低IL-7及TSLP 二者與其受體結合之抗體衍生物，該抗體與至少兩個選自 IL-7、TSLP、CD127、IL7Ry鏈或CRLF2之蛋白具有結合 141892.doc -30- 201018482 特異性，其亦係本發明之一部分。本發明結合蛋白亦可具有針對在ΤΗ17細胞之細胞表面上表現之IL-23之結合特異性，例如結合蛋白可具有針對IL-23R(或IL-23)及CD127二者、或IL-2R(或IL-23)及IL-7二者之特異性。製備該等抗體之方法為業内已知。傳統上，雙特異性抗體之重組製造係基於兩種免疫球蛋白Η鏈-L鏈對之共表現，其中該兩個Η鏈具有不同結合特異性，參見Millstein 等人，Nature 305 537-539 (1983) ; WO 93/08829 及

Traunecker等人EMBO，10，1991，3655-3659。由於Η及L鏈之隨機分配，可能產生十種具有不同抗體結構之混合物，其中僅有一種具有期望結合特異性。替代方法涉及將具有期望結合特異性之可變結構域與包含鉸鏈區、CH2及CH3 區中至少一部分之重鏈怪定區融合。較佳地，在至少一個融合體中具有含有輕鏈結合所需位點之CH1區。將編碼該等融合體及（若需要）L鏈之DNA插入不同表現載體中且隨後將其共轉染至適宜宿主生物體中。然而有可能將兩個或所有三個鏈之編碼序列插入一個表現載體中。在一較佳方法中，雙特異性抗體包括在一臂中具有第一結合特異性之 Η鏈及在另一臂中提供第二結合特異性之Η-L鏈對，參見 WO 94/04690。亦參見 Suresh等人，Methods in Enzymology 121， 210, 1986 。一種可能的方法係產生諸如上述等雙特異性抗體或雙特異性片段，其中第一特異性針對IL-7之表位且第二特異性針對TSLP。另一種可能的方法係產生諸如上述等雙特異 141892.doc -31 - 201018482 一特異性針對IL-7之表位性抗體或雙特異性片段，其中第且第二特異性針對IL_6。抗體片段本發月、°°蛋白可為「抗體片段」。在本發明某些實施例中提供4療性抗體，其為抗原結合片段。該等片段可為完整及/或人類化及/或嵌合抗體之功能性抗原結合片段，例如上述抗體之㈣、Fd、触，、F(ab,)2、Fv、Mv片段。 s等片4又亦了為人類、縣.轮或鯊魚或其他物種之單一可變結構域抗體或包含其之較大構造物。缺少恆定區之片段缺 '藉由傳統途徑活化補趙或介導抗體依賴性細胞毒性之能力。傳統上，該等片段係藉由完整抗體之蛋白水解消化來產生’例如藉由木瓜酶消化來產生（例如參見W〇 94/29348) ’但其亦可自重組轉化之宿主細胞直接產生。對於 ScFv 之產生’參見Bird等人；（1988) Science，242，423_ 420。此外，抗體片段可使用下述各種工程技術來產生。

Fv片段之兩個鏈似乎具有低於Fab片段之互作用能。為穩定vH與vL結構域之間之聯繫，人們一直用肽（Bird等人，（1988) Science 242, 423-426 ; Huston等人，PNAS，85, 5879-5883) 二硫鍵（Glockshuber 等人，（1990) Biochemistry, 29，1362-1367)及「隆凸位於孔洞中（knob in hole)」之突變（Zhu等人（1997), Protein Sei., 6, 781-788)將其連接。ScFv片段可藉由熟習此項技術者熟知之方法來製造，參見Whitlow 等人（1991) Methods companion Methods

Enzymol，2，97-105及 Huston 等人（1993) Int. Rev. Immunol 141892.doc -32- 201018482 10，195-217。ScFv可在諸如大腸桿菌（五c〇/z·)等細菌細胞中產生，但更通常而言可在真核細胞中產生。ScFv之一缺點在於產物之單效價，其妨礙多價結合所產生之高親和力，及其較短半衰期。人們為克服該等問題所作之嘗試包括藉由化學偶合自含有額外C末端半胱胺酸之scfv產生二價（ScFv’）2(Adams 等人（1993)，Can. Res 53, 4026-4034及 McCartney 等人（1995)，Protein Eng. 8，301_314);或藉由含有不成對C末端半胱胺酸殘基之ScFv之自發位點特異性二聚化來產生二價（ScFv，）2(參見Kipriyanov等人（1995)， Cell· Biophys 26，187-204)。或者，可藉由將肽連接體縮短至3至12個殘基來使ScFv形成多聚體以形成「二價抗體」，參見Holliger等人，PNAS (1993)，90，6444-6448。減小連接體另外亦可產生ScFV三聚體（「三價抗體」，參見 Kortt 等人（1997)，Protein Eng，10，423-433)及四聚體 (「四價抗鱧」’參見 Le Gall 等人（1999)，FEBS Lett, 453, 164-168)。亦可藉由與蛋白質二聚基元進行遺傳融合來達成二價ScFV分子之構造以形成「微抗體」（參見Pack等人 (1992)，Biochemistry 31，1579-1584)及「微體」（參見 Hu 等人（1996) ’ Cancer Res. 56, 3055-3061)。ScFv-Sc-Fv 串聯 ((ScFV)2)亦可藉由用第三肽連接體連接兩個以卜單元來產生’參見Kurucz 等人（1995)，J. Immol. 154，4576-4582。雙特異性二價抗體可經由兩個單鏈融合產物之非共價連接來產生’該等融合產物係由一種抗體之VH結構域及藉由短連接體與之相連之另一抗體VL結構域組成，參見 141892.doc -33- 201018482

Kipriyanov等人（1998)，Int. J. Can 77，763-772。可藉由引入上述二硫鍵或「隆凸位於孔洞中」之突變或藉由形成單鏈二價抗體（ScDb)來增強該等雙特異性二價抗體之穩定性，在該等單鏈二價抗體中兩個雜合ScFv片段經由肽連接體相連，參見 Kontermann 等人（1999)，J. Immunol. Methods 226 179-188。可藉由（例如）以下方式來獲得四價雙特異性分子：經由鉸鏈區使ScFv片段與IgG分子之CH3 結構域融合或與Fab片段融合，參見Coloma等人（1997)， Nature Biotechno 1. 15, 159-163。或者，可藉由融合雙特異性單鏈二價抗體來產生四價雙特異性分子（參見Alt等人， (1999) FEBS Lett 454，90-94)。亦可藉由以下方式來形成較小四價雙特異性分子：藉助含有螺旋-環-螺旋基元之連接體使ScFv-ScFv串聯二聚化（DiBi微抗體，參見Muller等人（1998)，FEBS Lett 432, 45-49)或使以防止分子内配對之取向包含四個抗體可變結構域（VH及VL)之單鏈分子二聚化 (串聯二價抗體，參見Kipriyanov等人，（1999)厂厘〇1· Biol. 293, 41-56)。雙特異性F(ab’）2片段可藉由Fab'片段之化學偶合或藉由經由白胺酸拉鏈之異二聚化來產生（參見 Shalaby 等人，（1992)，J. Exp. Med. 175, 217-225 及

Kostelny 等人（1992)，J. Immunol. 148, 1547-1553)。亦可獲得經分離VH及VL結構域，參見US 6,248,516、US 6,291,158、US 6,172,197。其他修飾本發明結合蛋白可包含其他修飾以增強或改變其效應子 141892.doc -34- 201018482 功能。據信抗體Fc區與各種Fc受體（FcyR)之間之交互作用可介導抗體之效應子功能，包括抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)、補體之固定、抗體之吞噬作用及半衰期/清除。可根據期望效應子特性來對本發明抗體Fc區實施各種修飾。具體而言，實質上缺少a)藉由傳統途徑活化補體；及b)介導抗體依賴性細胞毒性之功能之人類恆定區包括 IgG4恆定區、IgG2恆定區及IgGl恆定區，其含有特異性突變，例如揭示於EP 0307434 (WO 8807089)、EP 0629 240 (WO 9317105)及WO 2004/014953中之以下位置之突變： 234、235 ' 236 ' 237 ' 297、318、320及 / 或 322。已分別闡述在重鏈恆定區之CH2結構域内的殘基235或237處之突變（Kabat編號；EU索引系統）可降低與FcyRI、FcyRII及 FcyRIII之結合且由此降低抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)(Duncan等人，Nature 1988, 332 ； 563-564 ； Lund 等人，J. Immunol. 1991, 147 ; 2657-2662 ; Chappel等人， PNAS 1991， 88 ； 9036-9040 ； Burton 及 Woof，Adv.

Immunol. 1992, 51 ; 1-84 ； Morgan 等人，Immunology 1995, 86 ; 319-324 ; Hezareh 等人，J. Virol. 2001，75 (24) ; 12161-12168)。此外，某些報導亦已闡述，在補體依賴性細胞毒性（CDC)之恢復或介導中涉及某些該等殘基 (Morgan 等人，1995 ; Xu等人，Cell. Immunol. 2000 ; 200:16-26 ; Hezareh等人，J. Virol. 2001, 75 (24) ; 12161-12168)。因此可使殘基235及237二者突變為丙胺酸殘基 (Brett 等人 Immunology 1997, 91 ; 346-353 ； Bartholomew 141892.doc -35- 201018482 等人，Immunology 1995, 85 ; 41-48 ;及 WO 9958679)以降低兩種補體介導效應及FcYR介導效應。包含該等恆定區之抗體可稱為「非溶解性」抗體。可將救援受體結合表位納入抗體中以提高血清半衰期，參見 US 5,739,277。人類Fey受體包括 FcyR (I)、FcyRIIa、FcyRIIb、FcyRIIIa 及新生 FeRn。Shields 等人（2001)，J. Biol. Chem 276, 6591-6604證實，在所有FcyR之結合中皆涉及一類常見 IgGl殘基，而FcyRII及FcyRIII採用除此常見類別外之獨特位點。一組IgGl殘基在變為丙胺酸時可降低與所有FcyR之結合：Pro-238、Asp-265、Asp-270、Asn-297及 Pro-239。所有殘基皆位於IgG CH2結構域中且聚集在連接CHI與 CH2之鉸鏈附近。FcyRI之結合僅採用常見類別之IgGl殘基，而FcyRII及FcyRIII與除該常見類別外之獨特殘基交互作用。某些殘基之改變僅降低與FcyRII(例如Arg-292)或 FcyRIII(例如Glu-293)之結合。某些變體顯示與FcyRII或 FcyRIII之經改良結合，但不影響與其他受體之結合（例如 Ser-267Ala改良與FcyRII之結合，但其與FcyRIII之結合不受影響）。其他變體表現與FcyRII或FcyRIII之經改良結合且降低與其他受體之結合（例如Ser-298Ala改良與FcyRIII之結合並降低與FcyRII之結合）。對於FcyRIIIa而言，最佳結合IgGl變體在Ser-298、Glu-333及Lys-334具有組合丙胺酸取代。據信在使IgG分子免於降解並由此增加血清半衰期並增強跨組織胞吞轉運作用中涉及新生FcRn受體（參見 141892.doc -36- 201018482

Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57及 Ghetie等人 (2000) 5 Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766) ° 已確定可與人類FcRn直接交互作用之人類IgGl殘基包括Ile253、 Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及 His435。可向本發明治療性抗體中納入任一上述怪定區修飾。在一特定實施例中，治療性抗體實質上缺少以下功能： a)藉由傳統途徑活化補體；及b)介導抗體依賴性細胞毒性。在另一特定實施例中，本發明所提供本發明治療性抗體具有上文所詳述殘基變化中之任何一者（或多者）以改變半衰期/清除及/或效應子功能，例如ADCC及/或補體依賴性細胞毒性及/或補體溶解。在本發明另一態樣中，治療性抗體具有同型人類IgGl之恆定區，其在位置235(例如L235A)及237(例如G237A)(根據Kabat中所述之EU方案進行編號）具有丙胺酸（或其他中斷）取代。本發明之其他衍生物包括本發明抗體之糖基化變體。已知抗體在其恆定區中保守位置之糖基化對抗體功能、具體而言效應子功能（例如上文上述之彼等）具有顯著作用，例如參見 Boyd 等人（1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318。本文涵蓋加成、取代、缺失或修飾一或多個碳水化合物部分之本發明治療性抗體之糖基化變體。製備方法本發明結合蛋白可藉由熟習此項技術者已知之方法來製備。可在轉基因有機體中製造本發明抗體，例如山羊（參 141892.doc -37- 201018482 見 Pollock 等人（1999)，J· Immunol. Methods 231:147-157)、雞（參見 Morrow KJJ (2000)，Genet· Eng. News 20:1-55)、小鼠（參見p〇ll〇ck等人，出處同上）或植物（參見Doran PM (2000) > Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204 ； Ma JK-C (1998)，Nat. Med. 4 ; 601-606 ; Baez J 等人， BioPharm (2000) 13: 50-54，Stoger E等人；（2000) Plant

Mol. Biol· 42:583·590)。亦可藉由化學合成來製造抗體。然而，本發明抗體通常係使用熟習此項技術者熟知之重組細胞培養技術來製造。分離編碼抗體之多核苷酸並將其插入諸如質粒等可複製載體中以供在宿主細胞中之進一步增殖或表現。一種可用表現系統係麩胺酸合成酶系統（例如由L〇nza Biologies出售者），在宿主細胞係CH〇或NS〇時尤

其如此（參見下文）〇編碼抗體之多核苷酸易於使用習用程序（例如寡核苷酸探針）來分離及測序。可用載體包括質粒、病毒、噬菌體、轉座子、微型染色體，其中質粒為— 典型實施例。一般而言，該等載體另外包括以可操作方式連接至輕鏈及/或重鏈多核苦酸上以促進表現之信號= 列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列^可將、編碼輕鏈及重鍵之多核苦酸插入各載體中並將各載體同時或依序引人（例如藉由轉化、轉染、電穿孔或轉導)相同宿主細胞中，或若需要可在該弓丨入前將重鏈及輕鏈二者插入同一載體中。信號序列形式產本發明抗體可以具有異源信號序列之融合蛋白 141892.doc -38- 201018482 生’其在成熟蛋白N末端處具有特異性裂解位點。信號序列應可藉由宿主細胞來識別及處理。對於原核宿主細胞，信號序列可為鹼性磷酸酶、青黴素酶、或熱穩定腸毒素Η 前導序列。對於酵母分泌，信號序列可為酵母轉化酶前導序列、α因子前導序列或酸性磷酸酶前導序列，例如參見 WO 90/13646。在哺乳動物細胞系統中，可使用病毒分泌前導序列（例如單純皰疹gD信號序列）及天然免疫球蛋白信號序列（例如人類I g重鏈）。信號序列通常在閱讀框中連接編碼本發明抗體之多核芽酸。選擇標記典型選擇基因可編碼具有以下作用之蛋白：（3)賦予針對抗生素或其他毒素（例如氨苄西林、新黴素、胺甲嗓吟或四環素）之抗性，或（b)補充營養缺陷或提供在複合培養基中無法獲得之營養，或（c)二者之組合^選擇方案可涉及阻止不含載體之宿主細胞之生長。因具有（例如）共遞送選擇標記所賦予之藥物抗性，故已經編碼本發明治療性抗趙之基因成功轉化之細胞可存活。一實例為DHFR選擇系統，其中在DHFR陰性宿主品系中生成轉化體（例如參見page及

Sydenham 1991，Biotechnology 9: 64-68)。在此系統中，共遞送DHFR基因與本發明抗體多核苷酸序列，且隨後藉由核音撤除來選擇DHFR陽性細胞。若需要，亦採用DHFR 抑制劑胺曱喋呤來選擇具有DHFR基因擴增之轉化體。藉由將DHFR基因以可操作方式連接至本發明抗體編碼序列或其功能性衍生物’ DHFR基因擴増導致目標期望抗體序 141892.doc -39- 201018482 列同時擴增。CHO細胞係尤其可用於此DHFR/胺曱喋呤選擇之細胞系，且使用DHFR系統來擴增並選擇宿主細胞之方法已為業内廣泛接受，參見Kaufman R.J.等人，J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621，綜述可參見 Werner RG、Noe W、Kopp Κ、Schluter Μ，「Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals 」，

Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998年 8月。另一實例係楚胺酸合成酶表現系統（Bebbington等人， Biotechnology 1992，第10卷第169頁）。用於酵母之適宜選擇基因係trpl基因；參見Stinchcomb等人，Nature 282， 38 ， 1979 。啟動子將表現本發明抗體之適宜啟動子以可操作方式連接至編碼該抗體之DNA/多核苷酸上。用於原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-内醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸及諸如Tac等雜合體啟動子。適於在酵母細胞中表現之啟動子包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇化酶、甘油醛3磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸酯變位酶及葡糖激酶。可誘導酵母啟動子包括醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白及負責氮代謝或利用麥芽糖/半乳糖之酶。在哺乳動物細胞系統中表現之啟動子包括RN A聚合酶11 啟動子，包括病毒啟動子，例如多瘤病毒、雞癌病毒及腺 141892.doc -40- 201018482 病母（例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、巨細胞病毒（具體而言即刻早期基因啟動子）、反轉錄病毒、肝炎B病毒、肌動蛋白、勞氏肉瘤病毒（r〇us sarc〇nia virus) (RSV)啟動子及早期或晚期猿猴病毒4〇 ;及非病毒性啟動子’例如EF-la(Mizushima 及 Nagata，Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322)。可根據與用於表現之宿主細胞之適宜相容性來選擇啟動子。增強子元件 φ 例如對於高等真核生物中之表現而言，若適宜可引入額外增強子元件來替代彼等位於上述啟動子中者，或同時包括二者。適宜哺乳動物增強子序列包括來自珠蛋白、彈性蛋白酶白蛋白、胎蛋白、金屬硫蛋白及胰島素之增強子元件或者，可使用來自真核細胞病毒之增強子元件，例如SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子、杆狀病毒增強子或鼠類IgG2a基因座（參見w〇 • G4/GG9823)。同時該等增強子通常在載體上位於啟動子上游位點處，其亦可位於其他位置，例如多聚腺普酸化信號之未轉譯區或下游。可根據與用於表現之宿主細胞之適宜相容性來選擇增強子之定位。多聚腺苷酸化/終止在真核系統中，將多聚腺苦酸化信號以可操作方式連接至編碼本發明抗體之多核苦酸上。該等信號通常位於處開放閱項忙3纟哺乳動物系統中，信號之非限制性實例包括彼等衍生自生長激素、延長因子七及病毒(例如SV4〇) 141892.doc •41 · 201018482 基因或反轉錄病毒長末端重複序列者。在酵母系統中，聚腺苦酸化/終止信號之非限制性實例包括彼等衍生自碟酸甘油酸酯激酶（PGK)及醇脫氫酶！（ADH)基因者。在原核系統中，通常不需要多聚腺苦酸化信號，且通常代之以使用較短且更明確界定之終止子序列。可根據與用於表現之宿主細胞之適宜相容性來選擇多聚腺苷酸化/終止序列。提高產率之其他方法/元件除上文外，可用於提高產率之其他部件包括染色質重建兀件、内含子及宿主細胞特異性密碼子改變。可改變本發明抗體之密碼子使用以調整宿主細胞之密碼子偏好來（例如）增加轉錄物及/或產物之產率（例如H〇ekema A等人，

MolCellBiol 1987 7(8):2914_24)。可根據與用於表現之宿主細胞之適宜相容性來選擇密碼子。宿主細胞用於選殖或表現編碼本發明抗體之載體之適宜宿主細胞係原核、酵母或高等真核細胞。適宜原核細胞包括真細菌’例如腸桿菌科（enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌屬 (仏，例如大腸桿菌（例如ATCC 31，446 ; 31,537，27,325);腸桿菌屬（五;;歐文氏菌屬 (£>>νζ·«ζ_α)，克雷白氏桿菌屬（火;變形桿菌屬 (Proie⑽），沙門氏菌屬，例如鼠傷寒沙門菌 (心/mond/a ;沙雷菌屬（Serratia)，例如黏質沙雷菌marceaawi)及志贺菌屬（s/ngeHa)以及芽抱桿菌（Bacilli) ’例如枯草芽孢桿菌（J5心以山、）及地衣芽 141892.doc • 42- 201018482 孢桿菌〇β· (參見DD 266 710);假單胞菌屬

(Pseudomonas)，例如銅綠假單胞菌（户· aerwgkoia)及鍵徽菌屬（《Sirepiomyces)。亦涵蓋酵母宿主細胞，釀酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 、裂瘦酵母菌 {schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)(例如 ATCC 16,045 ； 12,424 ； 24178 ； 56,500)、子囊菌酵母屬（yarrowia) (EP 402，226)、甲醇酵母菌（Pic/πβ PfliiorhXEP 183，070，亦參見 Peng等人，J. Biotechnol. 108 (2004)185-192)、念珠菌屬（Ca«山、裏氏木黴菌（7Wc办θί/ermcz reeiz’a) (ΕΡ 244，234)、青黴菌 {Penicillin) ' 彎頸黴屬（Γσ/χρο<:/ί3ί/ζ·Μ»ί)及曲黴菌屬 (七/?〜#//似）宿主，例如構巢曲黴菌（A «zWawj)及黑曲徽菌（丄 m’ger)。儘管本發明明確涵蓋原核及酵母宿主細胞，但本發明之宿主細胞通常為脊椎動物細胞。適宜脊椎動物宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如COS-l(ATCC編號CRL 1650)、 COS-7(ATCC CRL 1651)、人類胚腎細胞系 293、PerC6 (Crucell)、倉鼠嬰腎細胞（BHK) (ATCC CRL. 1632)、 BHK570 (ATCC NO: CRL 10314)、293(ATCC 編號 CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-K1，ATCC編號：CCL 61 ; DHFR-CHO細胞系，例如DG44(Urlaub 等人，SomatCell Mol Genet (1986)，第 12卷第 555-566頁），尤其彼等適合於懸浮培養基之CHO細胞系）、小鼠支持細胞、猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞（ATCC CRL-1587)、 141892.doc -43- 201018482 HELA細胞、犬腎細胞（ATCC CCL 34)、人類肺細胞（ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞（例如NS〇(參見 US 5,807,715))、Sp2/0、Y0。因此，在本發明一實施例中提供經穩定轉化之宿主細胞，其包含編碼本文所述治療性抗體之重鏈及/或輕鏈之載體。通常，該等宿主細胞包含編碼該輕鏈之第一載體及編碼該重鍵之第二載體。亦可對該等宿主細胞實施進一步設計或調整以改變本發明抗體之品質、功能及/或產率。非限制性實例包括特異性修飾（例如糖基化）酶及蛋白質摺疊陪伴分子之表現。細胞培養方法經編碼本發明治療性抗體之載體轉化之宿主細胞可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來培養。可在旋轉式燒瓶、振盪式燒瓶、轉瓶、波式反應器（例如來自 waVebi〇tech.com之System 10〇〇)或中空纖維系統中培養宿主細胞，但大規模生產較佳使用攪拌罐式反應器或袋式反應器（例如 Wave Biotech，Somerset，New Jersey USA) ’ 對於懸浮培養而言尤其如此。通常攪拌罐適合用（例如）分佈器、擋流板或低剪切力葉輪來通氣。對於泡罩塔及氣升式反應器，可採用直接用空氣或氧氣泡通氣。倘若在無血清培養基中培養宿主細胞，則該培養基可補充有細胞保護劑 (例如普盧蘭尼克（plur〇nic) F_68)以幫助預防通氣過程造成之細胞損傷。根據宿主細胞特徵，可使用微載體作為錨定依賴性細胞系之生長基質，或可使細胞適應懸浮培養（典 141892.doc 201018482 型方式）。宿主細胞（尤其脊椎動物宿主細胞）之培養可採用多種作業模式，例如批次、饋料-批次、反覆批次加工（參見 Drapeau 等人（1994) cytotechnology 15: 103-109)、擴展批次加工或灌注式培養。儘管可在含血清培養基（如含肽牛血清（FCS)之培養基）中培養重組轉化之哺乳動物宿主細胞，但較佳在無血清培養基（例如Keen等人（1995) Cytotechnology 17:153_163中所揭示者）或市售培養基（例如

ProCHO-CDM 或 UhraCHO™ (Cambrex NJ，USA))中培養該等宿主細胞，該等培養基中若需要可補充有能量來源（例如葡萄糖）及合成生長因子（例如重組胰島素）。宿主細胞之無血清培養可能需要使彼等細胞適應在無血清條件下生長。一種適應方法系在含血清培養基中培養該等宿主細胞’並反覆將80°/。培養基更換為無也清培養基以使宿主細胞逐漸適應無企清條件（例如參見Scharfenberg K等人 (1995) * Animal Cell technology： Developments towards the 21st century(Beuvery E.C.等人編輯），第 619-623 頁， Kluwer Academic publishers) 〇可使用多種技術自培養基中回收並純化分泌至培養基中之本發明抗體以提供適用於預期用途之純度。舉例而言，如藉由還原性SDS-PAGE所測定，與包含本發明治療性抗體之培養基相比’在使用該等治療性抗體治療人類患者時通常需要至少95%之純度、更通常需要98%或99%之純度。在第一種情形中，通常藉由離心然後實施使用（例如）微孔過濾、超濾及/或深層過濾澄清上清液之步驟自培養 141892.doc -45- 201018482 基去除細胞碎片。或者，可藉由微孔過濾、超濾或深層過濾來收集抗體’而之前不實施離心。可使用多種其他技術，例如透析及凝膠電泳及層析技術，例如羥磷灰石層析 (HA)、親和層析（視情況涉及諸如聚組胺酸等親和加標籤系統）及/或疏水性交互作用層析（HIC，參見us 5,429,746)。在一實施例中，在實施各種澄清步驟後，使用以下方法來捕獲本發明抗體··蛋白質A或G親和層析，隨後實施其他層析步驟’例如離子交換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排除層析及硫酸銨沉澱》通常，亦採用各種病毒去除步驟（例如使用（例如）DV-20過濾器實施奈米過濾）。在實施該等不同步驟後，得到包含至少i 〇 mg/ml或更多（例如1 〇〇 mg/ml或更多）本發明抗體之純化（通常為單株）製劑’且由此形成本發明之一實施例。可藉由超速離心來獲得1 00 mg/ml或更高濃度之濃縮物。適當地，該等製劑實質上不含凝集形式之本發明抗體。細菌系統尤其適用於表現抗體片段。該等片段位於細胞内或周質内。可根據熟習此項技術者已知之方法提取不溶性周質蛋白並將其再摺疊以形成活性蛋白，參見sanchez 等人（1999)，J. Biotechnol. 72，13-20 及 Cupit PM 等人 (1999)，Lett Appl Microbiol, 29, 273-277。醫藥組合物可將上文所述之本發明抗體之純化製劑（尤其單株製劑）納入用於治療人類疾病或病症（例如上文所述之彼等）之醫藥組合物中◦通常該等組合物另外包含可接受醫藥實踐已 141892.doc • 46· 201018482 知及要未之醫藥上可接受之(即惰性)载劑例如參見

Remingtons Pharmaceutical ，第 16版（剛），

Mack㈣咖吨公司。該等載劑之實例包括無菌載劑，例如鹽水:林格氏溶液（Ringers s〇lmi〇n)或右旋糖溶液，其經諸如三水合乙酸鈉等適宜緩衝液緩衝至醫藥上可接受之 PH，例如在5至8範圍内之#。用於注射(例如藉由靜脈内、腹膜腔内、皮内、古下、HrJ由斗、皮下肌内或門脈内）或連續輸注 ❿ ❿ 之醫藥組合物適宜地不含可見微粒物質且可包含丨^^至⑺ g治療性抗體、通常5邮至丨g、更具體而言5邮至Μ邮或5〇 mg抗體。製備該等醫藥組合物之方法為熟習此項技術者所熟知。在一實施例中’醫藥組合物以單位劑型包含 i mg至H) g本發明治療性抗體，且視需要包含使用說明。可根據熟習此項技術者熟知或瞭解之方法將本發明醫藥組合物來乾（料乾物供在投與前重構。倘若本發明實施例包含具有IgGi同型之本發明抗體’則可將包括銅在内之金屬離子之螯合劑（例如檸檬酸鹽（例如桿樣酸納）或而A 或組胺酸）添加至醫藥組合物中以降低金屬介導之該同型抗禮之降解’參見EP 〇612251。醫藥組合物亦可包含諸如精胺酸驗等增溶劑、諸如聚山梨醋8〇等洗條劑/抗凝集劑，且包含諸如氮等惰性氣體以替代瓶頂部空間令之氧。投與本發明抗體之有效劑量及治療方案—般係根據經驗來確定且取決於諸如以下等因素：患者之年齡、體重及健康狀況α及欲/σ療疾病或病症。主治醫師可瞭解該等因素。例如，選擇適宜劑量之指導可參見^油等人（1977)， 141892.doc -47· 201018482

Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York 0 臨床應用本發明括抗劑可用於治療多發性硬化症及其他自身免疫或炎症性疾病，尤其涉及致病Th17細胞之彼等。該等疾病與高IL-17表現程度有關。已報導在ms患者血清及CSF中 (Matusevicius，D.等人；Mult. Scler. 5，101-104; 1999)及得自類風濕性關節炎患者之滑液中存在高IL_17含量。在銀屑病中亦涉及IL-17(H〇mey等人；j. lmmunol. 1 64(12):6621 -32 ; 2000)，而 Hamzaoui 等人報導在貝切特氏病（Behcet’s disease)中存在高 IL-17 含量（Scand. J. Rhuematol·; 31:4, 205-210 ; 2002)。在系統性紅斑狼瘡 (SLE)中亦觀察到高il-1 7含量（Wong等人；Lupus 9(8):589-93 ； 2000)= 對IL-7受體介導信號轉導之抑制亦可用於治療涉及高IL_ 17含量之炎症性（非自身免疫）疾病，例如哮喘。因此，本發明炎症性及/或自身免疫疾病包括炎症性皮膚病’包括銀屑病及特應性皮炎；系統性硬皮症及硬化症’炎症性腸病（IBD);克隆氏病（Crohn's disease);潰瘍性結腸炎；缺血再灌注病症，包括手術性組織再灌注損傷、心肌缺血病況（例如心肌梗塞、心搏驟停、心臟外科手術後再灌注及經皮腔内冠狀動脈成形術後收縮）、中風、及腹主動脈瘤；中風繼發腦水腫；顱部創傷、低血容量性休克；窒息；成人呼吸箸迫症候群；急性肺損傷；貝 141892.doc • 48- 201018482 切特氏病；皮肌炎；吝冬. 腦膜炎.腦* 性硬化症(MS);皮炎； m·葡萄膜炎；骨關節炎；狼瘡性腎炎免疫疾病，例如類風濕性關節炎（ra)、謝格爾氏症 ?:r’s syndr°me)、血管炎；涉及白細胞渗出之疾病； :樞神經系統（咖）炎症性病症、敗血症或料繼發官損傷症候群；酒精性肝炎；細菌性肺炎；抗原-抗體複口物介導之疾病’包括腎小球腎炎；猿毒症；、結節病；針

對組織/H官移植之免疫病理性反應；料炎症，包括胸膜炎、肺泡炎、i管炎、肺炎、慢性支氣管炎、支氣管擴張症、彌漫性全細支氣管炎、過敏性肺炎、idiopa飯肺纖維化⑽）、及囊性纖維化；银屑病關節炎；視神經脊趙炎格巴一氏症候群（Guillain-Barre syndrome) (GBS)、 COPD、1型糖尿病等。具體而s，本發明拮抗劑可用於治療所有形式之多發性硬化症，包括視神經脊髓炎。人們預測，當在活動性炎症疾病情況下投用時、即在用於治療臨床上孤立之症候群或 MS之復發形式時，使用本發明拮抗劑來治療最為有效。該等疾病階段可以臨床方式及/或藉由諸如釓強化等造影技術或其他更靈敏之技術來界定，及/或作為活動性疾病之其他未界定生物標記來界定。具體而言，當患者進入或處於復發階段時’可使用本發明拮抗劑來治療RRMS(經由靜脈内、皮下、經口或肌内遞送）。諸如CD 127表現及細胞内細胞因子染色（例如IL_丨7染色）等生物標記之使用為施用治療性抗CD 127結合蛋白提供規 141892.doc •49· 201018482 範。在CD4+ T細胞中具有高ΤΗ17之MS患者亞群係治療之首要候選者。在一實施例中，本發明治療方法係治療彼等在T細胞上表現高含量CD127之患者之方法，此可使其對抗CD127治療易感。用抗CD127治療可能會縮短復發時間並加快藉由EDSS或MRI可量測之臨床活性之衰減。一但患者進入緩解階段，則可停止治療以避免併發症，例如抑制正常T細胞發育及内穩態。使用抗CD127抗體亦可延長每次復發之間之時間段並改良患者之生活品質。說明 SEQ ID NO ：人類CD127胺基酸序列 1 9B7重鏈可變區 2 9B7輕鏈可變區 3 9B7CDRH1 4 9B7 CDR H2 5 9B7CDRH3 6 9B7CDRL1 7 9B7 CDR L2 8 9B7CDRL3 9 SB14 之表位(171-187 小鼠 CD127) 10 A7R34 之表位(80-95 小鼠 CD127) 11 9B7重鏈FR1序列 12 9B7重鏈FR2序列 13 9B7重鏈FR3序列 14 9B7重鏈FR4序列 15 9B7輕鏈FR1序列 16 9B7輕鏈FR2序列 17 9B7輕鏈FR3序列 18 9B7輕鏈FR4序列 19 141892.doc -50· 201018482 藉由肽ELISA測定之9B7表位 20 藉由肽ELISA測定之9B7表位 21 藉由肽ELISA測定之9B7表位 22 來自Ph.D-12噬菌體文庫之9B7共有肽 23-31 人類CD 127肽 32 來自Ph.D-12噬菌體文庫之9B7共有肽 33-42 人類CD 127肽 43 來自Ph.D-12噬菌體文庫之9B7共有肽 44-47 人類CD 127肽 48 來自fGWXlO噬菌體文庫之9B7共有肽 49-52 人類CD 127肽 53 來自fGWXlO噬菌體文庫之9B7共有肽 54-58 人類CD127肽 59 來自fGWXlO噬菌體文庫之9B7共有肽 60-63 人類CD127肽 64 來自fGWXlO噬菌體文庫之9B7共有肽 65-68 人類CD127肽 69 9B7噬菌體表位區1 70 9B7噬菌體表位區2 71 9B7噬菌體表位區3 72 9B7共有表位區1 73 9B7共有表位區2 74 9B7共有表位區3 75 6C5重鏈可變區 76 6C5輕鏈可變區 77 6C5 CDR H1 78 6C5 CDR H2 79 6C5 CDR H3 80 6C5 CDR L1 81 6C5 CDR L2 82 6C5 CDR L3 83 141892.doc -51 - 201018482 ，钒\ •.舆小鼠CD127結合之單株抗艟之表徵方法 1.1藉由使用FACS在pStat5檢測分析中對針對小鼠CD127 之市售小鼠抗艟實施之評償在此實例中，鑒定可抑制IL-7誘導Stat5礙酸化（pStat5) 之市售抗小鼠CD127抗體。簡言之，藉由標準方案自 C57B/6小鼠脾製備脾細胞；然後使用Miltenyi磁性分離套組（Cat編號130-049-201)自脾細胞純化CD4+ T細胞；首先在371下將一百萬CD4+ T細胞/ml與如下圖中所示濃度之 ® 所指示抗體一起培養30 min.;所用抗體為BD Biosciences 對照大鼠 IgG2a(編號 553926)、BD Biosciences 抗 CD127 (Clone SB/14，編號 550426)、eBiosciences 抗 CD127 (Clone:A7R34，編號 16-1271)、Abeam 抗 CD127(Clone SB199，編號 ab36428)、R&D 抗 CD127(MAB7471 及 7472); 然後使細胞保持未經處理或在37°C下用1 ng/ml小鼠IL-7處理60 min.;收集細胞並在IL-7處理後立即將其置於冰上；然後用冰冷PBS將細胞洗滌一次並在37°C下於1%低聚甲醛中固定10 min.;然後用PBS洗蘇細胞並將其與500 μΐ 90% 甲醇/PBS—起在冰上培養30 min.;再次在PBS中洗滌細胞並使細胞沉澱再懸浮於100 μΐ PBS中；在RT及暗條件下藉由 5 μΐ抗pStat5-Alexa Fluor 647抗體（BD Biosciences，編號612599)將細胞染色1 h;然後用PBS將細胞洗滌兩次並藉由流式細胞術使用BD Biosciences Facscalibur機器根據製造商說明書加以分析。結果示於圖1中。 141892.doc -52- 201018482 在各圖中，根據細胞内pStat5之平均螢光強度（MFI)來繪製細胞數。紅色直方圖展示未經處理CD4+ T細胞之MFI。用IL-7處理可使MFI向右遷移，且具有高pStat5之細胞係藉由直方圖中之棒狀圖所示之適宜門來定義。對照IgG不抑制pStat5。然而，A7R34強烈抑制pStat5。抗體純系SB/14 亦顯示抑制，但其抑制程度不如A7R34強。abeam純系 SB 199及R&D系統抗體僅能以高濃度部分抑制Stat5-p。亦測試抗體在小鼠胸腺細胞中對TSLP介導pStat5之抑制。胸腺細胞中之CD4-細胞表現功能性TSLP受體並在 FACS分析中對其設門。如圖1B中所示，SB14 (BD)及 A7R34 (eBio)抑制 IL-7 誘導之 pStat5 及 TSLP 誘導之 pStat5。因此，針對小鼠CD127之抗體（SB/14及A7R34)抑制IL-7及 TSLP介導之信號轉導二者。 1.2藉由肽ELISA鑒定表位由 Shanghai Science peptide Biology Technology 及 GL Biochem(上海）有限公司來合成小鼠IL7RECD中具有7個重疊肽之1 5聚體。所有肽皆係藉由連續流動固相肽合成來製備。然後在肽之N末端對肽實施生物素化，且在肽與生物素部分之間具有一間隔區Acp，即生物素-Acp-肽。

用100 pL 1 pg/mL存於碳酸鹽緩衝液（15 mM Na2C〇3、 35mMNaHCO3、0.2g/LNaN3，pH9.6)中之各種小鼠抗體塗佈96孔板中之各孔並在4°C下保持過夜。次日以200 μΐ/ 孔用洗滌緩衝液（含有0.05% Tween-20之IX PBS)將板洗滌三次，且在37。(：下將其與200 μΐ/孔封阻緩衝液（存於PBST 141892.doc -53- 201018482 中之10 mg/ml牛血清白蛋白（BSA))—起培養1小時。在將板洗滌三次後，在37°C下經1小時施用1〇〇 pL 2 pg/mL合成生物素化肽。洗滌三次後，以100 pL/孔添加1/2000稀釋之 HRP-SA且在37°C下培養30分鐘。在洗滌5次後使用100 pL/ 孔之ΤΜΒ基質溶液。在RT下培養2至5 min，之後用2Ν HC1 來終止。在450 nm下用適宜時間解析板讀取器對板實施讀取》 1.3藉由生物淘選噬菌體肽展示來預測表位人們一直使用在絲狀噬菌體M13上展示之隨機肽文庫作為標缯'單株抗體表位之工具（Scott及Smith ’ 1990, searching for peptide ligands with an epitope library, Science, 249:386-390)。吾人已使用市售噬菌體展示隨機肽文庫及自製噬菌體展示隨機肽文庫來鑒定與小鼠抗體結合之噬菌體肽。採用來自經鑒定噬菌體肽之濃集噬菌體展示肽共有序列或模擬表位來預測可能的小鼠抗體表位（噬菌體肽模擬表位：在抗原表面上藉由噬菌體肽或表位模擬物模擬之抗體交互作用位點）（Geysen等人，1986，a priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol., 23:709-715 ;

Luzzago等人，1993, mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides, Gene，128: 51-57)。自2個隨機文庫鑒定之噬菌體肽模擬表位預測2個可能的不連續小鼠抗體表位。 141892.doc -54- 201018482 隨機肽文庫： 1 · Ph.D-12禮菌體展示隨機肽文庫（得自New England Biolabs公司，編號 E8110S) 2. fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫（GSK自製文庫）使用Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選程序：針對固定化mAb 9B7對Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫實施之生物淘選基本上係根據製造商說明手冊來進行。簡言之： 1) 以100 pg/ml將各種小鼠抗體（存於0.1 M NaHC〇3中，pH 8.6)塗佈至12孔板之孔中且在4°C及緩慢攪拌下培養過夜。 2) 在4°C下將其與封阻緩衝液（0.1 M NaHC03，pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02 NaN3)—起培養1小時，且隨後用 TBST洗務六次（TBS + 0.1% [v/v] Tween-20)。 3) 將存於TBST中之經稀釋4 X 101G噬菌體施用至經塗佈板中並在室溫下緩慢振盪60分鐘。 4) 棄去未結合噬菌體並用TBST將板洗滌10次。 5) 用 300 μΐ 0.2 Μ甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA 洗脫已結合噬菌體且用45 μΐ 1 M Tris-HCl (pH 9.1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 6) 將洗脫物添加至接種大腸桿菌之ER2738培養物中且在 371及劇烈震盪下培養4.5小時。離心培養上清液然後在PEG/NaCl中及4°C下過夜沉澱。 7) 在LB/IPTG/Xgal板上滴定所得第三輪擴增洗脫物。使用 141892.doc -55- 201018482 來自滴定板之斑塊進行dna測序。使用fGWXlO噬菌艘展示隨機肽文庫之生物淘選程序：展示10聚體隨機肽序列之自製噬菌體文庫fGWXlO係根據先前文獻所述來構建（Deng等人，2004，Identification of peptides that inhibit the DNA binding, ira似-activator, and DNA replication functions of the human papillomavirus type 11 E2 protein，J. Virol·，78: 2637-2641)。簡言之， 1) 以100 pg/ml將各種小鼠抗體（存於0.1 M NaHC03中，pH 8.6)塗佈至12孔板之各孔中並在4°C及緩慢攪拌下培養過夜。 2) 在一含有1〇 ml LB培養基之試管中接種大腸桿菌K91。在37°C及劇烈震盪下培養培養物。 3) 在4°C下將其與封阻緩衝液（〇·1 M NaHC03，pH 8.6 ’ 5 mg/ml BSA，0.02 NaN3)—起培養1小時，且隨後用TBST 洗滌六次（TBS + 0.1% [v/v] Tween-20)。 4) 將經稀釋50 μΐ fGWXlO噬菌體（差異度lxl〇1G)與350 ml TBST —起施用至經塗佈板上且在室溫下緩慢振盪60分鐘並用TBST將板洗滌10次。 5) 用 300 μΐ 0.2 Μ甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA將已結合噬菌體洗脫至微量離心管中，且用45 μΐ 1 M Tris-HC1 (pH 9.1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 6) 在LB/Tet板上使用所接種大腸桿菌K91細胞滴定未擴增第三輪洗脫物。使用滴定後菌落來實施DNA測序。將剩餘洗脫物儲存在4°C下。 141892.doc -56- 201018482 1.4 小鼠抗體表位結合之測定使用Biacore T100系統（GE Healthcare)來評價針對小鼠 CD 127之抗小鼠CD 127抗體之結合表位。簡言之，使用標準胺偶合套組及程序以約100 RU(共振單位）之最終含量將抗小鼠CD 127抗體固定在CM5生物感受器晶片上。使用 HBS-EP 緩衝液（pH 7.4)(由 10 mM HEPES、0.15 Μ 氯化鈉、 3 mM EDTA及0.005% ν/ν表面活性劑Ρ20組成）作為運行緩. 衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺活化/鈍化之參照細胞實施感測圖（Sensogram)分析。IL7R ECD之具有7個重疊肽之15 聚體係由 Shanghai Science peptide Biology Technology及 GL Biochem(上海）有限公司來合成。經120s以30 pL/min之流速及不同；農度注入各種狀。使用Biacore評估軟體包來計算Kd值。分析係在25°C下運行。表1展示小鼠CD127 (NP—032398)針對兩種小鼠抗體bd Biosciences 純系 SB14 及 eBiosciences 純系 A7R34 之表位區域’該兩種抗體係藉由以下三種方法之組合來鑒定：嗤菌體肽文庫、肽ELISA及Biacore 抗體小鼠表位 BlAcore 噬菌體文庫肽 ELISA SB14 171-PARGESNWTHVSLFHTR-187 N/D V (SEQIDNO: 10) A7R34 80-VKCLTLNKLQDIYFIK-95 V N/D N/D (SEQIDNO:ll) 實例2 ··典乂癀CDi27.结含之革#犮费之立竑單株抗體（mAb) —般係根據E Harlow及D Lane, 141892.doc -57- 201018482

Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988中所述之方法自雜交瘤細胞產生。藉由腹膜腔内注射存於FCA或FIA(Sigma-Aldrich，編號F5881，編號F5506)(l:l ;體積：體積）中之二聚重組人類CD127細胞外結構域（ECD)-Fc(R&D系統編號306-IR)來對Balb/c小鼠實施初免及加強。自反應動物收穫脾且使其與SP/0骨髓瘤細胞融合以生成雜交瘤。使用半固體基質（甲基纖維素溶液）對目標雜交瘤實施單株選殖且人工將其收集至96孔板中。使用 ELISA、CHO-CD127 轉染細胞 FACS、pStat5 FACS及BIAcore 1'100篩選與€0127£€0結合之雜交瘤上清液材料（結果如下所示）。概言之，首先篩選與CD127 ECD蛋白結合之雜交瘤上清液，之後篩選彼等與過表現CD127之CHO細胞結合之陽性上清液，以及與PBMC細胞結合之上清液。然後針對抑制 CD127 ECD與固定在Biacore感受器晶片上之重組IL-7結合之能力來篩選陽性上清液。在基於細胞之IL-7/ IL-7Ra結合分析中單獨確認抗體結合中和活性。對CD127結合阻斷雜交瘤細胞實施亞選殖以獲得單株抗體。為表徵mAb之功能，擴增選殖雜交瘤細胞且對mAb實施表現及純化。在TH17擴增分析中測試純化mAb對STAT-5 磷酸化之抑制及對IL-7誘導IFN-γ與IL-17之抑制。在所獲得數千雜交瘤細胞中，發現極少數可結合在CHO 細胞表面表現之IL-7Ra及PBMC。在該等分析中較少數仍對pSTAT-5具有一定程度之抑制效應。其中，在該分析中 141892.doc •58· 201018482 mAb 6C5抑制pSTAT-5之1C5。為30 pg/ml，但在本文所述分析中其對TH17擴增之抑制很弱。在STAT-5分析中6A3之 IC5〇為0.25 pg/ml，且其強烈抑制Τη17擴增。方法 2.1藉由ELISA來選擇結合^^127之雜交瘤將5 Mg/ml重組人類CD127ECD塗佈至ELISA板上。在板上滴定來自測試雜交瘤上清液或純化材料之抗CD127抗體。藉由用辣根過氧化物酶（HRP)偶聯之山羊-抗小鼠IgG _ 抗體處理來檢測结合程度。使用TMB基質來建立ELISA。關於9B7雜交瘤上清液之結果展示於圖2中。 2.2螢光活化細胞分選（FACS)分析經1小時於具有4% FCS之PBS(FACS緩衝液）中用雜交瘤上清液或純化抗體以1叫/ml對空轉染€110或CHO-CD127 細胞（2 X 106細胞/ml)實施染色°亦在適宜陰性對照小鼠抗體及抗人類CD127陽性對照（R34.3 4 Dendritics公司’編號 • DDX0700)中對細胞實施染色。在FACS緩衝液中洗滌細胞，且隨後用抗小鼠1gG ALEXA488二級抗體1:2000 (Invitrogen公司，編號13-A11017)實施染色。在FACS緩衝液中洗蘇後，在LSR II(BD Biosciences公司）中分析細胞。關於9B7抗體之結果展示於圖3中。 2.3抑制經IL7刺激之IL7受«進行信號轉導之Stat5磷酸化在實驗前夜使冷凍PBMC解凍，且將其保持在含有10% FBS之RPMI 1640培養基中以供恢復。對於篩選針對CD 127 之功能性抗體，將2 pg/ml及0.2 pg/ml之雜交瘤培養基、陽 141892.doc -59· 201018482 性對照抗體（R34.34，Dendritics公司）或測試上清液樣品與 5xl05 PBMC細胞一起培養30 min，之後用1 ng/ml IL-7來刺激。分析未經處理細胞作為背景信號，同時將IL-7處理細胞設定為陰性對照。在與對照或測試樣品一起培養30 min後，在37°C下用1 ng/ml IL-7將細胞刺激1 5 min。然後在37°C下用1.6%低聚曱醛/PBS將細胞固定10 min，然後在 100%曱醇中對其實施20-30 min之可滲透化處理。然後在染色缓衝液（存於PBS中之1% BSA)中將細胞洗滌兩次，並用 7 μΐ Alexa-647 標記之抗 pStat5 抗體（BD Biosciences 公司，編號612599)對其實施1 hr之染色。在BD LSR II FACS 儀器上分析樣品。關於9B7之結果展示於圖4中。 2.4在人類Thl7擴增分析中抑制IL-7誘導之IL-17產生經三天刺激正常人類CD4+ T細胞群中之記憶性TH1 7細胞擴增。然後藉由PMA及離子黴素活化該等TH17細胞以刺激IL-17產生。在三天之培養階段中，藉由功能性抗CD127 抗體阻斷IL-7與CD127之間之交互作用應可阻止TH17細胞擴增，從而降低IL-17產生。使用市售套組（CD4+ T細胞分離套組II，編號130-091-1 55，Miltenyi Biotec)自人類外周血單核細胞分離CD4+ T 細胞。以1.5xl0E6/ml之濃度使CD4+ T細胞再懸浮於具有 10% FCS之RPMI培養基中。將細胞與對照或抗IL-7Ra抗體一起預培養30 min。然後在37°C下將細胞與1〇 ng/ml IL-7 一起培養或單獨培養72 h。在培養結束時，用50 ng/ml PMA及1 pg/ml離子黴素將細胞刺激5 h。然後收集細胞培 141892.doc -60- 201018482 養上清液並藉由Elisa (eBiosciences)測定IL-17濃度。對抗體9B7實施此分析。根據以下方案來分析抗體6C5、6A3及R34.34。根據手冊（編號/30-097-755,^/7/化《>^)來分離€〇4+細胞。將1〇〇卜1 約lxl06/ml之CD4+細胞與等體積2x Thl7分化培養基（2

pg/ml 抗 CD28+10 pg/ml 抗 IFN-γ+ΙΟ pg/ml 抗 IL-4 + 12.5 ng/ml IL-lp+20 ng/ml IL-23 + 50 ng/ml IL-6)混合且在37°C 及5% C02下培養5天。在Th 17培養基中用各種細胞因子及生長因子處理可優先將CD4+細胞分化為TH17細胞。在第5 天使用5D 50及戶Aria //來分選來自分化培養細胞之 CCR6 +細胞。然後將CCR6 +細胞調節至2xl06/ml以供IL-17 產生分析。為量測IL-17及IFN-γ含量，在4°C下將100 μΐ CCR6+細胞與測試抗體一起預培養1 h，且隨後將其與100 μΐ之川 «g/m/ IL-7混合。在37°C下將細胞培養24-40小時，其中補充有5% C02。分別在第24 h及40 h藉由流式細胞儀（5e«Ar 來量測IFN-γ及IL-17在100 μΐ培養上清液中之含量。 2.5藉由表面電漿共振測定結合動力學

使用 Biacore Τ100 系統（GE Healthcare)來評價抗 CD127 抗體與人類CD127之結合動力學。簡言之，使用標準胺偶合套組及程序以約100 RU(共振單位）之最終含量將重組人類 CD127 ECD固定在CM5生物感受器晶片上。使用HBS-EP 缓衝液（pH 7.4)(由 10 mM HEPES、0.15 Μ 氣化鈉、3 mM 141892.doc -61· 201018482 EDTA及0.005% v/v表面活性劑P20組成）作為運行緩衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺活化/鈍化之參照細胞實施感測圖分析。經120s以30 pL/min之流速及各種濃度注入分析物 (抗00127抗體）。用1〇111]\4甘胺酸-11(：1(?112.5)使抗原表面再生。使用Biacore評估軟體包來計算Kd值。分析係在 25°C下運行。表2 -9B7之上清液材料之動力學數據。分析係在37t下運行。抗體 Ka Kd KD(M) 9B7 8.09Ε+04 4.50E-05 5.56E-10 確定9B7之同型為具有κ輕鏈恆定區之IgGl。 2.6 9B7特徵人們發現9B7可以556 pM之解離常數與CD127緊密結合。其亦能部分阻斷IL-7與CD 127之結合，此與在人類 CD4細胞中部分阻斷IL-7誘導STAT-5磷酸化相關（圖4)。然而，在TH17擴增分析中，濃度與工具抗體（2 pg/ml之BD抗 hCD127)相當之9B7對IL-17產生之抑制程度相對較低。 2.7雜交瘤可變結構域之測序使用來自Qiagen之Oligotex Direct mRNA套組根據製造商說明書自2χ107 9B7純系細胞提取總RNA。用ImProm-ΠΤΜ反轉錄系統（Promega)根據製造商說明書以習用於小鼠 VH及VK基因之引物來將mRNA反轉錄為cDNA。對重鏈可變區實施7次反應並對輕鏈可變區實施6次反應以進行擴增。 141892.doc -62· 201018482 將純化RT-PCR片段選殖至pMD18-T載體（Takara)中，且藉由序列比對、數據庫搜索及與KABAT(Kabat, E.A.，Wu, T.T., Perry, H.H.，Gottesman, K.S., Foeller, C.，1991. Immunological Interest，第 5版，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH)中所列之已知免疫球蛋白可變序列比對來獲得每種雜交瘤之共有序列。共有序列為. mAb 9B7之CDR及FR序列： mAb 9B7之重排VH使用Igh-VQ52 VH2家族之V區段》 QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYNVHWVRQP PGKGLEWLGMIWDGGSTDYNSALKSRLSITKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAMYYCARNRYESGMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO.2) FR1序列：QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS (SEQ ID NO:12) CDR1序列：RYNVH (SEQ ID NO:4) FR2序列：WVRQPPGKGLEWLG(SEQIDNO:13) CDR2序列：MIWDGGSTDYNSALKS (SEQ ID NO:5) FR3 序列：RLSITKDNSKSQYFLKMNSLQTDDTAMYYCAR (SEQ ID NO:14) CDR3序列：NRYESG (SEQ ID NO:6) FR4序列：MDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:15) mAb 9B7之重排Vk使用IGKV8家族之V區段。 141892.doc -63- 201018482 DIVMTQTPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNRKNYL TWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTL IISSVQAEDLAVYYCQNDYTYPFTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO:3) FR1 序列：DIVMTQTPSSLTVTAGEKVTMSC (SEQ ID NO:16) CDR1序列：KSSQSLLNSGNRKNYLT (SEQ ID NO:7) FR2序列：WYQQKPGQSPKLLIY(SEQIDNO:17) CDR2序列：W'ASTRES (SEQ ID NO:8) FR3序列：GVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVQAEDLAVYYC(SEQ ID NO: 18) CDR3序列：QNDYTYPFTFGS (SEQ ID NO:9) FR 4序列：GTKLEIKR (SEQ ID NO:19) (CDR區為粗體。Ig基因：免疫球蛋白基因。VH:抗體重鏈可變區。VL:抗體輕鏈可變區。FR:框架區。 CDR :互補決定區） 2.8·-藉由肽ELISA鑒定9B7之表位 CD 127 ECD之具有7個重疊肽之15聚體係由Shanghai Science peptide Biology Technology及 GL Biochem(上海）有限公司合成。所有肽皆係藉由連續流動固相肽合成來製備。然後在肽之N末端對肽實施生物素化，且在肽與生物素部分之間具有一間隔區Acp，即生物素- Acp-肽。用100 μι 1 pg/mL存於碳酸鹽緩衝液（15 mM Na2C03、 35 mM NaHC03、0.2 g/L NaN3，pH 9.6)中之9B7抗體塗佈 141892.doc •64- 201018482 96孔板中之各孔並在4°C下保持過夜。次日以200 μΐ/孔用洗滌緩衝液（含有0.05% Tween-20之lx PBS)將板洗務三次，且在37°C下將其與200 μΐ/孔封阻緩衝液（存於PBST中之10 mg/ml牛血清白蛋白（BSA)) —起培養1小時。在將板洗滌三次後，在37°C下經1小時施用1〇〇 pL 2 pg/mL合成生物素化肽。洗滌三次後，以1〇〇 pL/孔添加1/2000稀釋之 HRP標記之抗生蛋白鏈菌素且在37°C下培養30分鐘。在洗滌5次後使用100 pL/孔之TMB基質溶液。在RT下培養2至5 min，之後用2 N HC1來終止。在450 nm下用適宜時間解析板讀取器對板實施讀取。表3，展示三個藉由肽ELISA鑒定之陽性區域區域1 35 LDDYSFSCYSQLEVN 49 SEQIDN0: 20 區域2 84 NFRKLQEIYFIETKKFLLIGKS 105 SEQIDN0-.21 區域3 171 QEKDENKWTH 180 SEQ ID NO: 22 2.9·-藉由生物淘選噬菌體肽展示來預測表位 ® 使用在絲狀噬菌« M13上展示之隨機肽文庫來預測mAb 9B7之表位人們一直使用在絲狀噬菌體M13上展示之隨機肽文庫作為標繪單株抗體表位之工具（Scott及Smith，1990, searching for peptide ligands with an epitope library, Science，249:386-390)。吾人已使用市售噬菌體展示隨機肽文庫及自製噬菌體展示隨機肽文庫來鑒定與mAb 9B7結合之噬菌體肽。採用來自經鑒定噬菌體肽之濃集噬菌體展 141B92.doc -65- 201018482 示肽共有序列或模擬表位來預測可能的mAb 9B7表位（噬菌體肽模擬表位：在抗原表面上藉由噬菌體肽或表位模擬物模擬之抗體交互作用位點）（Geysen等人，1986, a priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol., 23:709-715 ；

Luzzago等人，1993, mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides, Gene，128: 51-57)。自2個隨機文庫鑒定之噬菌體肽模擬表位預測2個可能的不連續mAb 9B7表位。隨機肽文庫： 1. Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫（來自New England Biolabs公司，編號E8110S) 2. fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫（GSK自製文庫）使用Ph.D-12噬菌艘展示隨機肽文庫之生物淘選程序：針對固定化mAb 9B7對Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫實施之生物淘選基本上係根據製造商說明手冊來進行。簡言之： 1) 將 100 pg/ml mAb 9B7(存於0.1 M NaHC〇3 中，pH 8.6)塗佈至12孔板之孔中且在4。(：及緩慢攪拌下培養過夜。 2) 在4°C下將其與封阻緩衝液（0.1 M NaHC03，pH 8.6，5 mg/ml BSA ’ 0.02 NaN3) —起培養1小時，且隨後用 TBST洗滌六次（TBS+0.1% [v/v] Tween-20)。 3) 將存於TBST中之經稀釋4χ1 噬菌體施用至經塗佈板中 141892.doc -66 - 201018482 並在室溫下緩慢振盪60分鐘。 4) 棄去未結合噬菌體並用TBST將板洗滌10次。 5) 用 300 μΐ 0.2 Μ甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA洗脫已結合噬菌體且用45 μΐ 1 M Tris-HCl (pH 9.1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 6) 將洗脫物添加至接種大腸桿菌之ER2738培養物中且在 ‘ 37°C及劇烈震盪下培養4.5小時。離心培養上清液然後在PEG/NaCl中及4°C下過夜沉澱。 ® 7)在LB/IPTG/Xgal板上滴定所得第三輪擴增洗脫物》使用來自滴定板之斑塊進行DNA測序。使用fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選程序：展示10聚體隨機肽序列之自製噬菌體文庫fGWXlO係根據先前文獻中所述來構建（Deng等人，2004，Identification of peptides that inhibit the DNA binding, iraw^-activator, and DNA replication functions of the human papillomavirus φ type 11 E2 protein，J. Virol.，78: 2637-2641)。簡言之， 1) W10〇eg/mlmAb9B7^K〇.iMNaHCOJ，pH8.6Vl：佈至12孔板之孔中且在4〇c及缓慢攪拌下培養過夜。 2) 在一含有10 ml LB培養基之試管中接種大腸桿菌K91。 ' 在37°C及劇烈震盪下培養培養物。 3) 在4°C下將其與封阻緩衝液（0.1 μ NaHC03，pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02 NaN3) —起培養1小時，且隨後用 TBST洗滌六次（TBS+0.1 % [v/v] Tween-20)。 4) 將經稀釋50 μΐ fGWXlO噬菌體（差異度ιχι〇10)及350 ml 141892.doc •67- 201018482 TBST施用至經塗佈板上且在室溫下將其緩慢振盪60分鐘，並用TBST將板洗滌10次。 5) 用 300 μΐ 0·2 Μ甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA將已結合噬菌體洗脫至微量離心管中，且用45 μΐ 1 M Tris-HC1 (pH 9.1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 6) 使用所接種大腸桿菌K91細胞在LB/Tet板上滴定未擴增第三輪洗脫物。使用滴定後菌落來實施DNA測序。在 4°C下儲存剩餘洗脫物。藉由mAb 9B7濃集之肽共有序列基元。在生物淘選後藉由mAb 9B7濃集之共有序列基元中之肽的推導胺基酸序列列於下文中。ECD肽A9、All及A21係衍生自人類IL7-R α鏈之合成肽。在單獨實施例中’在 ELISΑ結合分析中使用該等肽來評估其與mAb 9Β7之結合活性。自2個隨機肽文庫鑒定之噬菌體肽共有序列基元或模擬表位預測mAb 9B7之2個不連續表位。下文闡述選自Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選之實例：共有序列基元： VHWHHTKPPFKR (SEQ ID NO:23) AHHPHAWRHSHK (SEQ ID NO: 24) LPWHRTHHNHAH (SEQ ID NO:25 ) HPNWFKWRHMLA (SEQ ID NO:26 ) LPHWKHPHYPRP (SEQ ID NO:27 ) HWKHHTPFIRHG (SEQ ID NO:28) WHKHPSFSGRHN (SEQ ID NO:29 ) 141892.doc -68 - 201018482 AHHPHAWRHSHK (SEQ ID NO:30 ) WPPHYHKHRPTL (SEQ ID NO: 31) CD127ECD VKCLNFRKLQEIYFI (SEQ ID NO: 32) 共有序列基元： HSRHYHSTLPPP (SEQ ID NO: 33) SPPLYHKHHRHY (SEQ ID NO: 34) SPRHWHHVPNIT (SEQ ID NO:35) LPRHHHHFPHGI (SEQ ID NO:36)

QHHKWPHRHHTS (SEQ ID NO:37) VHRRHHHYHINH (SEQ ID NO:38) NPQLHHSHHYSC (SEQ ID NO:39) QPHGHHRHYHAS (SEQ ID NO:40) YPHSHHRYRFPP (SEQ ID NO:41) MPKHYFHHHSKT (SEQ ID NO:42) CD127ECD ETKKFLLIGKSNICV (SEQ ID NO:43) 共有序列基元： FPNHRTHIHWNH (SEQ ID NO:44) HIKHLSHWTPKP (SEQ ID NO:45)

Φ CD127ECD HTRIHLKPHYFN (SEQ ID NO:46) NAPMKHHTMRYS (SEQ ID NO：47) RQEKDENKWTHVNLS (SEQ ID NO：48) 下文闞述選自fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選之實例：共有序列基元： ALVELAWHKH (SEQ ID NO:49) WSVWGGMVHR (SEQ ID NO:50) ALVELAWHKH (SEQ ID NO:51)[舆 SEQ ID NO:49 141892.doc -69- 201018482 相同。請檢驗原始數據並進行確認/闡明j CD127ECD KAVRAWEWRK (SEQ ID NO:52) VKCLNFRKLQEIYFI (SEQ ID NO:53) 共有序列基元： WHHKLGWALR (SEQ ID NO:54) CD127ECD ERRLMWTRLP (SEQ ID NO:55) TGARKLHARW (SEQ ID NO:56) AQWAKRLLW (SEQ ID NO:57) LKRLGPRWTF (SEQ ID NO:58) VKCLNFRKLQEIYFI (SEQ ID NO:59) 共有序列基元： WYKRWAWAGY (SEQ ID NO:60) CD127ECD LKRWSWFWTP (SEQ ID NO:61) KRLILAHRWL (SEQ ID NO:62) LRWTRHWHW (SEQ ID NO:63) ETKKFLLIGKSNICV (SEQ ID NO:64) 共有序列基元： TGARKLHARW (SEQ ID NO:65) CD127ECD GRLCMHWWKV (SEQ ID NO:66) LRWTRHWHYV (SEQ ID NO:67) LKRLGPRWTF (SEQ ID NO:68) QEKDENKWTHVNLS (SEQ ID NO:69) 表4展示藉由噬菌體肽文庫鑒定之三個陽性區域區域1 80 VKCLNFRKLQEIYFI 94 (SEQ ID NO:70) 區域2 95 ETKKFLLIGKSNICV 109 (SEQ ID NO:71) 區域3 170 RQEKDENKWTHVNLS 184 (SEQ ID NO:72) 141892.doc -70- 201018482 對藉由噬菌體肽展示及肽ELIS A標繪之表位之總結有三個區域被鑒定為CD 127針對9B7單株抗體之潛在表位，如下所述：位置 35 LDDYSFSCYSQLEVN 49 (SEQ ID NO:73); 位置 84 NFRKLQEIYFIETKKFLLIGKS 105 (SEQ ID NO:74)；位置 139 YREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYR QEKDENKWTH 180 (SEQ ID NO:75)

假設該等區域在CD 12 7之重要效應子位點内係緊密相鄰之區域，其可能與IL-7結合位點密切相關。 2.10 抗體 6C5 6C5雜交瘤上清液含有具有以下重鏈及輕鏈可變區之抗體· 6C5之重鏈可變區： EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFAFSAYWMSWVRQ APGKGLEWIGEINPDSSTINCTPSLKDKFIISRDNAKNTLS LQMNKVRSEDTALYYCARRLRPFWYFDVWGAGTTVTVS S (SEQ ID NO:76) 6C5之輕鏈可變區： DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVQSNGNTYLEW YLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 77) 根據Kabat，6C5之CDR係以粗體來展示。 141892.doc -71 - 201018482 CRDH1序列：AYWMS (SEQ ID NO:78) CDRH2序列：EINPDSSTINCTPSLKD (SEQ ID NO:79) CDRH3序歹丨J : RLRPFWYFDVW (SEQ ID NO:80) CDRL1序列：RSSQSIVQSNGNTYLE(SEQIDNO:81) CDRL2序列：KVSNRFS (SEQ ID NO:82) CDRL3序列：FQGSHVPRT (SEQ ID ΝΟ··83) 人們確定6C5可阻斷IL7與IL7受體結合且可抑制pSTAT-5產生（IC5〇為 50 pg/ml)。 2.11藉由SPR(Biacore)測定6C5之結合動力學使用 Biacore T100 系統（GE Healthcare)以 25°C 之反應溫度來評價抗CD127抗體6C5與人類CD127之結合動力學。使用標準胺偶合套組及程序以約10000 RU(共振單位）之最終含量將兔-抗小鼠IgG抗艎固定在CM5生物感受器晶片上。使用 HBS-EP緩衝液（pH 7.4)(由 10 mM HEPES、0.15 Μ 氣化鈉、3 mM EDTA及0.005% ν/ν表面活性劑Ρ20組成）作為運行緩衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺空白固定之參照細胞實施感測圖分析。對於配體捕獲，經30 s以10 jL/min 將25 nM 6C5注入晶片表面上。然後經500 s以30 pL/min及各種濃度注入分析物（重組人類CD127 ECD)。用10 mM甘胺酸-HCl(pH 1.7)使感受器晶片表面再生。使用Biacore評估軟體包來計算Kd值。表5.關於6C5之動力學數據 ka (1/Ms) kd Π/s) KD (Μ) 1.79E+04 4.36E-04 2.44E-08 141892.doc -72- 201018482 2.12藉由Biacore實施之抗體結合中和分析使用 Biacore T100 系統（GE Healthcare)以 25。(：之反應溫度實施分析。使用標準胺偶合套組及程序以約500 RU(共振單位）之最終含量將重組人類IL-7固定在CM5生物感受器晶片上。使用HBS-EP緩衝液（pH 7.4)(由10 mM HEPES、 0.15 Μ氣化鈉、3 mM EDTA及0.005% v/v表面活性劑P20 組成）作為運行緩衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺空白固定之參照細胞實施感測圖分析。在單獨瓶中混合10 Kg/mL重組人類CD127 ECD與各種濃度之抗CD127抗體，且在4°C 下將其培養1 hr。然後經30 s以10 pL/min將該等混合物以及單獨的10μg/mL重組人類CD127ECD注入晶片表面上。在每次注入後，用10 mM甘胺酸-HC1 (pH 2.0)使感受器晶片表面再生。100 gg/ml之抗體6C5可完全抑制CD127-ECD 與感受器晶片上之IL-7結合。關於6C5之結果展示於圖13 中。在此分析中6C5能完全抑制IL-7結合。 2.13藉由FACS來分析IL-7競爭製備CHO-CD127細胞且用冷杜貝克氏（Dulbecco's)磷酸鹽缓衝鹽水（DPBS)洗滌3次，且隨後在單獨瓶中於4°C下將 2xl05細胞與2 gg/mL重組IL-7 —起培養30 min。培養後，添加抗€〇127抗體且在存於〇?88中之4%卩€8(卩人08緩衝液）中另外繼續培養30 min。隨後在FACS緩衝液中將細胞洗滌3次且用抗小鼠IgG ALEXA488二級抗體（Invitrogen公司，編號13-A11017)以1:2000之稀釋度實施染色。然後在 FACS緩衝液中將細胞洗滌3次並在LSR II(BD Biosciences 141892.doc 73· 201018482 公司）中加以分析。在2 pg/ml IL-7存在下，mAb 6C5不能與CHO-CD127細胞結合，此表明6C5與IL-7競爭結合在 CHO細胞上表現之CD127(圖14)。 2.14藉.由FACS實施抗艘結合交又競爭分析準備CHO-CD127細胞且用冷DPBS將其洗滌3次。將螢光標記之抗CD127抗體（BD Biosciences公司，編號552853)稀釋於FACS緩衝液中且將其與各種濃度之未標記相同抗體混合，或將其與測試抗CD127抗體R34.34及6C5混合。然後在4°C下將抗體混合物與CHO-CD127細胞一起培養30 min。在FACS緩衝液中洗滌3次後，在LSR II(BD Biosciences公司）中量測螢光標記BD抗體之結合。結果顯示，除未標記BD抗體外，mAb R34.34及6C5與經標記BD 抗體完全結合，表明抗體BD、R34.34及6C5識別位於在 CHO細胞上表現之CD 127上之類似表位。（圖15)。 2.15藉由表面電漿共振（BIAcore)測定6C5及R.34.34之抗艟結合表位 CD 127 ECD之具有7至8個重疊肽之15聚體係由Shanghai Science peptide Biology Technology及 GL Biochem(上海）有限公司來合成。所有肽皆係藉由連續流動固相肽合成來製備。然後在肽之N末端對肽實施生物素化，且在肽與生物素部分之間具有一間隔區Acp，即生物素-Acp-肽。使用 Biacore T100 系統（GE Healthcare)來評價抗 CD 127抗體與人類CD127之15聚體合成肽之結合。簡言之，使用標準胺偶合套組及程序以約1 〇〇〇 RU(共振單位）之最終含量 141892.doc -74- 201018482 將抗CD 127抗體固定在CM5生物感受器晶片上。使用HBS-EP緩衝液（pH 7·4)(由 10 mM HEPES、0.15 Μ氣化鈉、3 mM EDTA及0.005°/。ν/ν表面活性劑Ρ20組成）作為運行緩衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺活化/鈍化之參照細胞實施感測圖分析。以1 0 pL/min之流速經120 s注入1 μΜ肽。使用 Biacore評估軟體包來分析數據。分析係在25°C下運行。表6展示藉由BIAcore鑒定之R34.34抗體之陽性區域區域1 65 NTTNLEFEICGALVE 79 SEQ ID NO: 84 區域2 80 VKCLNFRKLQEIYFI 94 SEQ ID NO: 85 區域3 95 ETKKFLLIGKSNICV 109 SEQ ID NO: 86 區域4 155 LQKKYVKVLMHDVAY 169 SEQ ID NO: 87 區域5 162 VLMHDVAYRQEKDEN 176 SEQ ID NO: 88 表7展示藉由BIAcore鑒定之6C5抗體之陽性區域區域 1 | 65 NTTNLEFEICGALVE 79_ SEQIDNO: 89 2.16藉由生物淘選噬菌艟肽展示來預測表位使用在絲狀噬菌體M13上展示之隨機肽文庫來預測抗想之表位人們一直使用在絲狀噬菌體Ml 3上展示之隨機肽文庫作為標繪單株抗體表位之工具（Scott及Smith，1990, searching for peptide ligands with an epitope library, Science, 249-.386-390)。吾人已使用市售噬菌體展示隨機肽文庫及内部噬菌體展示隨機肽文庫來鑒定與前導抗體結合之噬菌體肽。採用來自經鑒定噬菌體肽之濃集噬菌體展示肽共有序列或模擬表位來預測可能的前導抗體表位（噬 141892.doc -75- 201018482 菌體肽模擬表位：在抗原表面上藉由噬菌體肽或表位模擬物模擬之抗體交互作用位點）（Geysen等人，1986，a priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol., 23:709-715 ;

Luzzago等人，1993，mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides, Gene，128: 51-57)。自2個隨機文庫鑒定之噬菌體肽模擬表位預測2個可能的不連續前導抗體表位。隨機肽文庫： 1. Ph.D-12嗤菌體展示隨機肽文庫（來自New England Biolabs公司，編號E8110S) 2. fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫（GSK自製文庫）使用Ph.D-12噬菌艘展示隨機肽文庫之生物淘選程序：針對固定化前導抗體對Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫實施之生物淘選基本上係根據製造商說明手冊來進行。簡言之： 8) 將 100 pg/ml 前導抗體（存於 0.1 M NaHC03 中，pH 8.6) 塗佈至12孔板之孔中且在及緩慢攪拌下培養過夜。 9) 在4°C下將其與封阻緩衝液（〇.1 M NaHC03，pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02 NaN3) —起培養1小時，且隨後用 TBST洗滌六次（TBS+0.1% [v/v] Tween-20)。 10) 將存於TBST中之經稀釋4x101G噬菌體施用至經塗佈板中並在室溫下緩慢振盪60分鐘。 141892.doc -76· 201018482 11) 棄去未結合噬菌體並用TBST將板洗滌10次。 12) 用 300 μΐ 0.2 Μ甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA洗脫已結合噬菌體且用45 μΐ 1 M Tris-HCl (pH 9.1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 13) 將洗脫物添加至接種大腸桿菌之ER2738培養物中且在 3 7°C及劇烈震盪下培養4.5小時。離心培養上清液然後在PEG/NaCl中及4°C下過夜沉澱。 14) 在LB/IPTG/Xgal板上滴定所得第三輪擴增洗脫物。使用來自滴定板之斑塊用於DNA測序。使用fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選程序：展示10聚體隨機肽序列之自製噬菌體文庫fGWXlO係根據先前文獻中所述來構建（Deng等人，2004，Identification of peptides that inhibit the DNA binding, ir<2«j-activator, and DNA replication functions of the human papillomavirus type 11 E2 protein, J. Virol., 78: 2637-2641)。簡言之， ❿7) 8) 9) 將 100 pg/ml 前導抗體（存於 0.1 M NaHC03 中，pH 8.6) 塗佈至12孔板之孔中且在4°C及緩慢攪拌下培養過夜。在一含有10 ml LB培養基之試管中接種大腸桿菌K91。在37°C及劇烈震盪下培養培養物。在4°C下將其與封阻緩衝液（〇·1 M NaHC03，pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02 NaN3) —起培養1小時，且隨後用 TBST洗滌六次（TBS + 0· 1% [v/v] Tween-20)。 10)將經稀釋50 μΐ fGWxlO噬菌體（差異度lxlO10)及350 ml TBST施用至經塗佈板上且在室溫下將其缓慢振盪60分 141892.doc -77- 201018482 鐘，並用TBST將板洗滌10次。 11) 用 300 μΐ 0.2 Μ甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA將已結合噬菌體洗脫至微量離心管中，且用45 μΐ 1 Μ Tris_HCl (pH 9·1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 12) 使用所接種大腸桿菌Κ91細胞在LB/Tet板上滴定未擴增第三輪洗脫物。使用滴定後菌落來實施DNA測序。在 4°C下儲存剩餘洗脫物。藉由前導抗體濃集之肽共有序列基元。在生物淘選後推導出之藉由前導抗體濃集之共有序列基元中的肽胺基酸序列列於下文中。在各單獨實驗中，在 ELIS A結合分析中使用該等肽來評估其與前導抗體噬菌體肽共有序列基元或模擬表位之結合活性，該等基元或模擬表位係自2個隨機肽文庫來鑒定，其可預測前導抗體之2個不連續表位。下文闡述選自Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選之實例：關於R34.34 共有序列基元··

QQNHHVRHHHTR (SEQ ID N0：93) VPRHTHHNNHLH (SEQ ID N0：94)

.•.GANDFWTFNTSHLQKKYVKVLMHD··. (SEQ ID N0:97) 5D8 5D9 5E6 5E8 5C7 5C11 CD127 共有序列基元： 5D7 5D8 ALVKHKHPHSHM (SEQ ID N0：98) WTPHHHHRATKT (SEQ ID N0：99) 141892.doc -78- 201018482

5D9 HSSHHYWKLRPL (SEQ ID NO：100) 5E1 5E6 NHLHKHPHYHAR (SEQ ID NO：101) QQMHHVRHHHTR (SEQ ID NO：102) 5E8 VPRHTHHNMHLH (SEQ ID N0：103) 5C2 HRHTKQRHTALH (SEQ ID NO：104) GHKHALHLMRHW (SEQ ID N0：105) 5C5 5C7 HFKHHHSKLAPP (SEQ ID NO：106) 5C10 WPHHHHTBLSTV (SEQ ID NO：107) 5C11 KLLHTPRHHQHF (SEQ ID NO：108) 5C12 SKLHHHRPTHTL (SEQ ID N0：109) 5D3 AVKHHYHRHPII (SEQ ID NO：110) 5D4 LPTHHHHSKPRP (SEQ ID NO：111) 5D6 CD127 IPFHKHPHHRGT (SEQ ID NO：112) ...DFWTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAY... (SEQ ID NO：113) 共有序列基元 5D7 ALVKHKHPHSHM (SEQ ID NO：114) 5D8 WVPHHHHRATKT (SEQ ID NO：115) 5E1 NHLHKHPHYHAR (SEQ ID NO：116) 5E2 FPFHKHDYPRHR (SEQ ID NO：117) 5E8 VPRHTHHNMHLH (SEQ ID NO:118) 5E11 IKHPSNSLHDMQ (SEQ ID NO：119) 5C2 HRHTKQRHTALH (SEQ ID NO：120) 5C5 GHKHALHLMRHW (SEQ ID NO：121) 5D4 LPTHHHHSKPBP (SEQ ID NO：122) CD127 . · •FRKLQEIYFIETKKFLLIGKSBICV·.. (SEQ ID N0:123) 共有序列基元 1 5E2 FPFHKHDYPRHR (SEXi ID N0：124) 5E4 AHRSRLKREQAR (SEQ ID NO：125) 5E6 QQMHHVRHHHTR (SEQ 10 N0：126) 5C1 HYIPWKHFKSPR (SEQ ID NO：127) 5C2 HRHTKQRHTALH (SEQ ID NO：128) 5C4 GHGWWAKHPRTL (SEQ ID NO：129) 5C8 FPWHTHDHKRYM (SEQ ID NO：130) 5D3 AVKHHYHHHPII (SEQ ID NO：131) 5D6 IPFHKHPHHRGT (SEQ ID NO：132) ...LEFEicGKLmmmaaj^m... (seq id no： 133) CD127 共有序列基元 I 5D9 HSSHHYUKLRPL (SEQ ID NO：134) SD10 HNSHQKHLSKYR (SEQ ID NO：135) 5C1 HYIPWKHFKSPR (SEQ ID NO：136) FKWPVHPFHVRS (SEQ ID NO：137) 5C9 141892.doc -79- 201018482 5D3 AVKHHYHRHPII (SEQ ID NO：138) CD127 ...AHYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPS... (SEQ ID NO：139) 關於6C5抗體共有序列基元： M0514138_PA3_20_ TPFDYWLAH6WE (SEQ ID NO：140) M0514136-PA3一18 TPFDYWLAH6WE (SEQ ID NO：141) H0514134_PA3_16 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：142) H0514137_PA3_19 TPFDYWLAHG?»E (SEQ ID NO： 143) M0514124 一PA3_6 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：144) M0514125_PA3_7 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：145) M0514123_PA3_5 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：146) M0514133_PA3_15 TPFDYWLAH6WE (SEQ ID NO： 147) M0514121_PA3_3 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：148) M0514122_PA3_4 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：149) M0514128_PA3JL0 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：150) M0514131_PA3_13 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：151) M0514127_PA3_9 TPFDYWLAHGWE (SEQ ID NO：152) CD127 . ..PAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWS... (SEQ ID NO：153) 共有序列基元： H0514130_PA3_12 KLDLTAAIPDDP (SEQ ID NO： 154) M0514119_PA3_1 KLDLTAAIPDDP (SEQ ID NO：155) M0514120_PA3_2 KLDLTAAIPDDP (SEQ ID NO：156) M0514129_PA3_11 KLDLTAAIPDDP (SEQ ID NO：157) CD127 ...YSQLEVNGSQHSLTCAFEn)PDVNTT... (SEQ ID NO：158) 下文闞述選自fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選之實例：關於R34.34 共有序列基元： M0514227_FA3_9 M0514229_FA3_11 M0514236_FA3_18 M0514225_FA3_7 M0514237_FA3_19 M0514220_FA3_2 M0514233_FA3_15 CD127 WWAITESVIT (SEQ ID NO：159) EiTIV (SEQ ID NO：160) GVI (SEQ ID N0：161) 3WIL (SEQ ID NO：162)

YWGLTSRT KNUQRTEGM WHSTTSGW KWNQRTE6V

3VI (SEQ ID NO KNNQRTEGVI (SEQ ID NO (SEQ ID NO ...CLNFRKLQE： KNNQRTEGVI (SEQ inFIETKKFLLI... 163) 164) 165) (SEQ ID N0：166) 共有序列基元： -80- 141892.doc 201018482 M0514236_FA3_18 M0514237_FA3_19 M0514220_FA3_2 M0514233_FA3_15 Cdl27 KWWQRTEGVI (SEQ ID HO：167) HWQRTEGVI (SBQ ID NO： 168) ranfORPEGTI (SEQ ID N0：169) KmiQBTEGVI (SEQ ID N0：170) • ..NDFWTFNTSHLQKmKVLM.·. {SBQ ID N0:171) 共有序列基元： H0514183_FA3_5 M0514187_FA3_9 M0514185_FA3_7 M0514188_FA3_10 H0514179_FA3_1 M0514181_FA3_3 CcLL27 RCHV61IGCIA (SEQ ID NO：172) RCMVGUGCIA (SEQ ID B0：173) YERGMHETQI (SEQ ID NO：174) LYCWAGWGCQ (SEQ ID NO：175) LYCWAGWGCQ (SEQ ID NO：176) LVCWVCfYGCM (SEQ ID NO： 177) ...IKVRSIPDHYFKaTiSEWSPS... (SEQ ID HO：178)

共有序列基元： M0514185_FA3_7 M0514180_FA3_2 M0514198JFA3_20 M0514190_FA3_12 Cdl27 YFRGWRETQI (SEQ ID NO：179) EYVSETYMRY (SEQ ID NO：180) WNRA0L6SVR (SEQ ID N0：181) WNBSF6EELA (SEQ ID N0：182) .EIKVRSIPDHYFKGFWSEWSP... (SEQ ID N0：183) 表6展示藉由噬菌體肽文庫鑒定之R34.34之陽性區域

區域1 65 NTTNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGK 104 (SEQIDNO:184) 區域2 153 SHLQKKYVKVLMH 165 (SEQ IDNO:185) 區域3 211 HYFK 214 (SEQ ID NO: 186) 表7展示藉由噬菌體肽文庫鑒定之6C5之陽性區域區域1 55 LTCAFEDPD 63 (SEQ ID NO: 187) 區域2 209 PDHYFKGFWSE 219 (SEQ ID NO: 188) 藉由噬菌體肽展示及肽BIAcore標繪之表位之概述：四個區域被鑒定為針對單株抗體（尺34.34及6€5)之潛在〇0127 表位，如下所示：位置 55 LTCAFEDPD 63 (SEQ ID NO:189); 141892.doc •81 - 201018482 位置 65 NTTNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETK KFLLIGK 104 (SEQ ID NO.190)；位置 153 SHLQKKYVKVLMH 165 (SEQ ID NO:191); 位置 209 PDHYFKGFWSE 219 (SEQ ID NO:192); 2.17 抗體 6A3 抗體6A3係如前所述來製造，但抗原（CD127之細胞外結構域）並未與Fc融合。6A3雜交瘤上清液含有具有以下重鏈及輕鏈可變區之抗體： 6A3之重鏈可變區： DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITTDYAWNWIRQ FPGNKLEWMGYIFYSGSTTYTPSLKSRISITRDTSKNQFFL QLNSVTTEDTATYYCARGGYDVNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:193) 6A3之輕鏈可變區： DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYQQKP GKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAE DFVSYYCQQFFSTPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID N0.194) 根據Kabat，6A3之CDR係以粗體來展示。 CRDH1序列：TDYAWN (SEQ ID NO:195) CDRH2序列：YIFYSGSTTYTPSLKS(SEQIDNO:196) CDRH3序列：GGYDVNYF (SEQ ID ΝΟ··197) CDRL1序列：LASQTIGAWLA(SEQIDNO:198) CDRL2序列：AATRLAD (SEQ ID NO:199) CDRL3序列：QQFFSTPWT (SEQ ID N0:200) 141S92.doc -82 - 201018482 人們確定6A3可阻斷IL7與IL7受體之結合且可抑制 pStat5信號轉導（IL17之誘導及IFN-γ之誘導）。 2.18藉由SPR (Biacore)測定6A3之結合動力學使用 Biacore T100 系統（GE Healthcare)以 25°C 之反應溫度來評價抗CD127抗體6A3與人類CD127之結合動力學。使用標準胺偶合套組及程序以約10000 RU(共振單位）之最終含量將兔-抗小鼠IgG抗體固定在CM5生物感受器晶片上。使用 HBS-EP緩衝液（pH 7.4)(由 10 mM HEPES、0.15 Μ 氣化鈉、3 mM EDTA及0.005% ν/ν表.面活性劑Ρ20組成）作為運行緩衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺空白固定之參照細胞實施感測圖分析。對於配體捕獲’經30 s以10 pL/min 將25 nM 6A3注入晶片表面上。然後經500 s以30 pL/min及各種濃度注入分析物（重組人類CD127 ECD)。用10 mM甘胺酸-HCl(pH 1.7)使感受器晶片表面再生。使用Biacore評估軟體包來計算Kd值。表8·關於6A3之動力學數據 ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M) 1.89E+04 1.46E-04 7.74E-08 2.19藉由Biacore實施之抗想結合中和分析使用 Biacore T100 系統（GE Healthcare)以 25°C 之反應溫度實施分析。使用標準胺偶合套組及程序以約500 RU(共振單位）之最終含量將重組人類IL-7固定在CM5生物感受器晶片上。使用HBS-EP缓衝液（pH 7.4)(由10 mM HEPES、 0.15 Μ氯化鈉、3 mM EDTA及0.005% ν/ν表面活性劑P20 141892.doc -83- 201018482 組成）作為運行緩衝液。對使用EDC/NHS/乙醇胺空白固定之參照細胞實施感測圖分析。在單獨瓶中混合1 〇 Kg/mL重組人類CD127 ECD與各種濃度之抗CD127抗體，且在4°C 下將其培養1 hr。然後經30 s以10 pL/min將該等混合物以及單獨的1〇0§/«^重組人類€〇127£〇〇注入晶片表面上。在每次注入後，用10 mM甘胺酸-HC1 (pH 2.0)使感受器晶片表面再生。10 pg/ml之抗體6A3可完全抑制CD127-ECD 與感受器晶片上之IL-7結合。結果展示於圖16A及16B中。如下所述來計算抑制率：抑制率=卜RU(樣品）/RU (ECD)。 2.20藉由FACS來分析IL-7競爭製備CHO-CD127細胞且用冷杜貝克氏（Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS)洗滌3次，且隨後在單獨瓶中於4°C下將 2xl05細胞與2 pg/mL重組IL-7—起培養30 min。培養後，添加抗CD127抗體且在存於DPBS中之4% FCS(FACS缓衝液）中另外繼續培養30 min。隨後在FACS緩衝液中將細胞洗滌3次且用抗小鼠IgG ALEXA488二級抗體（Invitrogen公司，編號13-A11017)以1:2000之稀釋度實施染色。然後在 FACS緩衝液中將細胞洗滌3次並在LSR II(BD Biosciences 公司）中加以分析。在2 pg/ml IL-7存在下，mAb 6A3不能與CHO-CD127細胞結合，此表明6A3與IL-7競爭結合在 CHO細胞上表現之CD127(圖17)。 2.21藉由生物淘選噬菌體肽展示來預測表位使用在絲狀噬菌體M13上展示之隨機肽文庫來預測mAb 6A3之表位 141892.doc -84- 201018482 人們一直使用在絲狀噬菌體M13上展示之隨機肽文庫作為標繪單株抗體表位之工具（Scott及Smith，1990, searching for peptide ligands with an epitope library, Science, 249:386-390)。吾人已使用市售噬菌體展示隨機肽文庫及自製噬菌體展示隨機肽文庫來鑒定與mAb 6A3結合之噬菌體肽。採用來自經鑒定噬菌體肽之濃集噬菌體展示肽共有序列或模擬表位來預測可能的mAb 6A3表位（噬菌體肽模擬表位：在抗原表面上藉由噬菌體肽或表位模擬物模擬之抗體交互作用位點）（Geysen等人，1986，a priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol., 23:709-715 ；

Luzzago等人，1993，mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides, Gene, 128: 51-57)。自2個隨機文庫鑒定之噬菌體肽模擬表位預測2個可能的不連續mAb 6A3表位。隨機肽文庫： 1. Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫（來自New England Biolabs公司，編號E8110S) 2. fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫（GSK自製文庫）使用Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選程序：針對固定化mAb 6A3對Ph.D-12噬菌體展示隨機肽文庫實施之生物淘選基本上係根據製造商說明手冊來進行。簡言之： 141892.doc -85- 201018482 15) 將 100 pg/ml mAb 6A3(存於 0·1 M NaHC03 中，pH 8.6) 塗佈至12孔板之孔中且在4°C及緩慢攪拌下培養過夜。 16) 在4°C下將其與封阻緩衝液（〇.1 M NaHC03，pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02 NaN3) —起培養1小時，且隨後用 TBST洗滌六次（TBS + 0.1% [v/v] Tween-20)。 17) 將存於TBST中之經稀釋4 X 101G噬菌體施用至經塗佈板中並在室溫下緩慢振盪60分鐘。 18) 棄去未結合噬菌體並用TBST將板洗滌10次。 19) 用 300 μΐ 0·2 Μ 甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA洗 ® 脫已結合噬菌體且用45 μΐ 1 M Tris-HCl (pH 9.1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 20) 將洗脫物添加至接種大腸桿菌之ER2738培養物中且在 37°C及劇烈震盪下培養4.5小時。離心培養上清液然後在PEG/NaCl中及4°C下過夜沉澱。 21) 在LB/IPTG/Xgal板上滴定所得第三輪擴增洗脫物。使

用來自滴定板之斑塊用於DNA測序。 A 使用fGWXlO噬菌«展示隨機肽文庫之生物淘選程序：展示10聚體隨機肽序列之自製噬菌體文庫fGWXlO係根據先前文獻中所述來構建（Deng等人，2004, Identification of peptides that inhibit the DNA binding, ira«5-activator, and DNA replication functions of the human papillomavirus type 11 E2 protein, J. Virol” 78: 2637-2641)。簡言之， 13)將 100 pg/ml mAb 6A3(存於 0.1 M NaHC03 中，pH 8.6) 塗佈至12孔板之孔中且在4°C及緩慢攪拌下培養過夜。 141892.doc -86- 201018482 14) 在一含有10 ml LB培養基之試管中接種大腸桿菌K91。在37°C及劇烈震盪下培養培養物。 15) 在4°C下將其與封阻緩衝液（〇·1 M NaHC〇3，pH 8.6，5 mg/ml BSA，0.02 NaN3) —起培養1小時，且隨後用 TBST洗滌六次（TBS+0.1% [v/v] Tween-20)。 16) 將經稀釋5〇 μΐ fGWXlO噬菌體（差異度lxlO1。）及35〇 ml TBST施用至經塗佈板上且在室溫下將其緩慢振盪60分鐘，並用TBST將板洗滌10次。 17) 用 300 μΐ 0·2 Μ 甘胺酸-HC1 (pH 2.2)、1 mg/ml BSA將已結合噬菌體洗脫至微量離心管中，且用45 μΐ 1 Μ Tris-HCl (pH 9·1)中和以實施另外兩輪生物淘選。 18) 使用所接種大腸桿菌Κ91細胞在LB/Tet板上滴定未擴增第三輪洗脫物。使用滴定後菌落來實施DNA測序。在 4°C下儲存剩餘洗脫物。藉由mAb 6A3濃集之肽共有序列基元》在生物淘選後推導出之藉由mAb 6A3濃集之共有序列基元中的肽胺基酸序列列於下文中。自2個隨機肽文庫鑒定之噬菌體肽共有序列基元或模擬表位預測mAb 6A3之2個不連續表位。下文闞述選自Ph.D_12噬菌艎展示隨機肽文庫之生物淘選之實例：共有序列基元：

TMKPPFYSGEPL CD127ECD ...DPDVNTTNLEFEICGALV... (SEQ ID NO:201) 141892.doc • 87 - 201018482 CD127ECD TMKPPFYSGEPL ... DFWTFNTSHLQKKYVKVLM... (SEQ ID NO:202) CD127ECD YMKPPFMSSEPN ...PDHYFKGFWSEWSPSY.. (SEQ ID NO:203) 下文闞述選自fGWXlO噬菌體展示隨機肽文庫之生物淘選之實例：共有序列基元：

IYTGRPPYWV CD127ECD • ..NFRKLQEIYF旧丁KKFLL.·· (SEQ ID NO:204) 參 CD127ECD IYTGRPPYWV ...FRKLQEIYFIETKKFLLIGK... (SEQ ID NO:205) CD127ECD IYTGRPPYWV ...FIETKKFLLIGKSNICVKVGE... (SEQ ID NO:206) 表9展示藉由噬菌體肽文庫鑒定之4個可能區域區域1 66 TTNLEFEICGAL 77 (SEQ ID NO:207) 區域2 91IYFIETKKFLLIGKSNICV 109 (SEQ IDNO:208) 區域3 152 TSHLQKKYVKVL 163 (SEQ ID NO:209) 區域3 212 YFKGFWSEWSP 222 (SEQ ID NO:210) 實例3 : 衣:禮在凡4五尹之治#放篇在小鼠EAE模型中評價實例1中所述鼠類抗體治療MS之潛力。重複實施6次此實驗，且下文闡述單一代表性實例。方法 ]4】892.doc -88- 201018482 3.1實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)之誘導及評估用髓磷脂少突角質細胞糖蛋白（MOG殘基35-55)之合成肽（300 Hg)對雄性 C57BL/6 小鼠（6-8 wk ； Shanghai Laboratory Animal Center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)實施皮下免疫。免疫係藉由在完全弗氏 (Freunds)佐劑（CFA，含有5 mg/ml結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)之熱殺滅 H37Ra 品系（Difco Laboratories))中混合MOG肽來實施。在實施免疫當天及48 h後靜脈内投與存於PBS中之200 ng百曰咳毒素（pertussis toxin) (List Biological Laboratories)。對於治療方案，使用市售抗小鼠CD127 mAb(BD Bioscience，大鼠抗小鼠 CD 127 SB 14，目錄號550426)，且亦測試可單獨中和IL-7之第二單株抗體（R&D系統）。自第 10天開始每隔一天以200 pg/小鼠經腹膜内投與測試抗體或對照IgG，直至總計注射5次為止。在某些實驗中，用PBS 替代對照IgG作為對照組。每天對小鼠進行稱重並檢查疾病症狀。使用EAE評分量表對小鼠之疾病嚴重性進行評分：0，無臨床跡象；1，尾虛弱症；2，輕截癱（虛弱，1 個或2個後肢之不完全癱瘓）；3，截癱（2個後肢完全癱瘓）；4，截癱，其中前肢虛弱或癱瘓；5，瀕死狀態或死亡。 3.2組織學及免疫組織化學在免疫後第21天自小鼠移出用於組織學分析之組織，且立即在4°/〇低聚曱醛中實施固定。用羅克沙爾固藍（Luxol 141892.doc -89- 201018482 fast blue)或H&E對經石蠟包埋之5-至10 μιη脊髓切片實施染色，且隨後藉由光學顯微術進行檢查。對於CD4+ Τ細胞及CD1 lb+單核細胞/巨噬細胞之免疫螢光染色，自小鼠移出脊髓，灌注PBS，且在30%蔗糖及4°C下培養過夜。隨後解剖組織且將其包埋於最適切割溫度（OCT)化合物中。以7 μιη在低溫恒溫器中將冷凍試樣切片，且將切片置於載玻片上，風乾，且用100%丙酮固定10 min。在用3% BSA 封阻後，將切片與第一大鼠抗小鼠CD4或CDllb Ab (BD Biosciences)—起培養過夜，然後用Cy3 AffiniPure驢抗大鼠 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories)進行標記並藉由免疫螢光顯微術（Nikon)實施檢查。使用同型匹配Ab 作為陰性對照。根據3個脊髓橫切片/小鼠之平均數據（每組總計5只小鼠）使用先前公開之程序來量化白細胞、CD4+ T 細胞及CDllb+單核細胞/巨噬細胞之脫髓鞘、浸潤程度。 3.3增殖及細胞因子分析在增殖分析中，一式三份在96孔板之RPMI 1640中培養得自£人£小鼠之脾細胞（5><105/孔）。在存在或不存在]\4〇〇肽（20 pg/ml)或Con A (2 pg/ml)時於 37°C 及 5% C02中將細胞培養72 h。在培養之最後16-18 h期間脈衝式添加1 pCi [311]胸苦，之後收穫細胞。藉由MicroB計數器（PerkinElmer) 以cpm量測[3Η]胸苦納入。對於細胞因子量測，在第48 h自細胞培養物收集上清液且將其稀釋以供根據製造商說明書藉由使用小鼠TH 1/Th2 流式細胞多重分析套組及小鼠IL-23流式細胞單重分析套 141892.doc -90- 201018482 組（Bender MedSystem)來量測 IL-Ια、IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-17、IFN-γ、IL-23。簡言之，在室溫及暗條件下將培養上清液與塗佈有捕獲抗體與偶聯生物素之第二抗體之混合物的珠粒混合物一起培養2小時，添加經PE標記之抗生蛋白鏈菌素且在室溫及暗條件下培養1小時。在BD LSR II (Becton Dickinson)中收集數據且用BMS流式細胞軟體（Bender MedSystem)來分析。根據製造商說明書藉由 Duoset ELISA 套組（R&D Systems)來量測小鼠TGF-β 及 IL-21。繪製各板之標準曲線且使用其來計算所指示細胞因子之絕對濃度。 3.4免疫印跡分析將蛋白質提取物載至10%或12% SDS聚丙烯醯胺凝膠上且對其實施電泳。藉由首先使用Mini Trans-Blot裝置（Bio-Rad) 將蛋白質轉移至穩定素 -P膜（Mmipore)上來實施免疫印跡分析。在封阻2 h後，在4°C下將膜與分別針對卩-JAK1、JAK1、P-AKT、AKT、P-Stat3、Stat3、P-Stat5、 Stat5、Bcl-2、Bcl-xL、Bim、Bad、P-Bad(上述所有抗體皆來自 Cell Signal)、MCL-1 (Bio-legend)、Bax (BD Bioscience) ' RORyt (Abeam)、Foxp3 (Santa Cruz Biotechnology)、Actin (Santa Cruz Biotechnology)之特異性第一 Ab—起培養過夜。進行洗滌，且隨後在室溫下與偶聯HRP之山羊抗兔（Sigma-Aldrich)或山羊抗大鼠Ab (Jackson ImmunoResearch)—起培養1 h並進行徹底洗滌，之後用ECL受質（Pierce)使信號可視化。 141892.doc •91 · 201018482 3.5 cDNA陣列分析藉由使用已驗證cDNA陣列系統（GEArray S系列， SuperArray Bioscience詳細基因列表可參見製造商網站： www.superarray.com/gene_array_product/HTML/MM-602.3.html)來分析所選與細胞凋亡及JAK-STAT信號轉導途徑相關之基因的表現譜。簡言之，自首次接受實驗之小鼠或經抗〇0127〇^1)或卩丑8處理21天之£入丑小鼠分離脾細胞。藉由磁珠分離（Mitenyi Biotec)來獲得CD4+ CD25 + Treg及CD4+CD25-非Treg細胞。使用三唑試劑（Trizol Reagent) (Invitrogen)來提取總 RNA。使用 AmpLabeling-LPR套組（SuperArray)將3 pg總RNA逆轉錄至生物素-16-去氧-UTP·標記單鏈cDNA中。在預雜交後，將膜與生物素標記之樣品cDNA雜交且與偶聯鹼性磷酸酶之抗生蛋白鏈菌素一起培養（Chemiluminescent Detection套組；SuperArray)以使信號可視化。使用GEArray表現分析套件（SuperArray)來分析結果。結果為三個使用獨立脾細胞製劑之實驗的代表性結果。 3.6細胞瑪亡分析使用膜聯蛋白V-FITC細胞凋亡檢測套組（BD Biosciences)實施對細胞凋亡之分析，洗滌得自EAE小鼠之脾細胞且在室溫下與5 μΐ膜聯蛋白V-FITC及5 μΐ 7-AAD — 起培養15 min。隨後使用FACS LSRII儀器（BD)在1 h内分析經染色細胞。 3.7自小鼠CNS组織分離單核細胞 141892.doc -92· 201018482 使用梯度離心自腦及脊髓製備單核細胞。簡言之，向小鼠灌注30 ml PBS以自内臟器官中移除血液。研磨所分離腦及脊髓組織且經由70 μιη細胞過濾網來過濾。在Percoll 梯度中離心所得細胞溶液。收集兩種梯度（37%及70% Percoll, Pharmaica)之間介面處的單核細胞，藉由與培養基一起離心來洗滌，且隨後對其實施FACS分析。 3.8 CD4+ T細胞之分離移出首次接受實驗之小鼠之脾，且將其分散為單細胞懸浮液。對於初始T細胞之純化，首先使用CD4微珠粒 (Miltenyi)自首次接受實驗之小鼠的脾及淋巴結純化CD4+ T細胞。隨後用CD44、CD62L及CD25抗體標記所得細胞，且針對CD44lc)CD62LhiCD25-細胞群藉由FACS分選 (FACSAria II，Becton Dickinson)進一步純化。為獲得 CD4+CD25hi&CD4+CD25· T細胞，在冰上將單細胞懸浮液與FITC標記之抗CD4抗體及PE標記之抗CD25抗體（BD Biosciences)— 起培養30 min。藉由FACSAria 儀器（Becton Dickinson)對 004+0025111及 CD4+CD25· T細胞實施分選。採用類似方法來分離人類CD4+CD25+及CD4+CD25· T細胞。首先使用CD4 +未接觸T細胞分離套組（Miltenyi Biotec) 自PBMC純化CD4+ T細胞，且CD4+CD25· T細胞係藉由使用抗CD25微珠粒（Miltenyi Biotec)實施陰性選擇來分離。 CD4+、CD4+CD25 +及CD4+CD25_ T細胞碎片之純度總是大於 95%。 3.9 TH17、TH1 及 Treg 之誘導 141892.doc -93· 201018482 以1 Χίο6細胞/ml之密度將首次接受實驗之小鼠CD4+ T細胞平鋪於96孔平底板（Costar)中。用存於完全培養基中之板結合抗CD3 Ab (5 pg/ml ; BD Bioscience)及抗CD28 Ab (5 pg/ml ; BD Bio science)來刺激細胞。在 TH1 條件{重組 IL-12 (10 ng/ml; eBioscience)加抗 IL-4 (10 pg/ml ; BD Bioscience)}、或 TH17 條件{TGF-pi(l ng/ml ; R&D系統）、IL-23(10 ng/ml ; R&D系統）及IL-6 (10 ng/ml ; eBioscience)加抗IFNy (10 pg/ml ; BD Bioscience) 及抗IL-4(10 pg/ml)}中將T細胞培養4天。為誘導/轉化來自CD4+CD25- T細胞之CD4+CD25+ Tree，在塗佈抗CD3抗體（5 pg/ml)及5 pg/ml抗CD28抗體存在下，以2χ106細胞/ml將純化人類或小鼠CD4+CD25- T細胞與 TGF-βΙ (10 ng/ml)及 IL-2(50 IU/ml ’ R&D 系統）一起培養 4天。在某些情況下，自上述培養系統中洗出培養基，且隨後在存在或不存在IL-7 (10 ng/ml)之情況下在新鮮培養基中將細胞培養1 h或48 h。為使人類TH17細胞分化，在抗 CD3及抗CD28中及在IL-Ιβ、IL-6、及IL-23存在下將總人類CD4+細胞刺激六天。在第3天將IL_7、IL_2及抗體添加至分化系統中。 3.10流式細胞分析對於CD4、CD25、CD8、B220及CD127之表面染色而言’使細胞再懸浮於含有1% BSA (Sigma_Aldrich)及〇 1% 疊氮化鈉之PBS中，且將其與偶聯螢光染料之針對所指示細胞表面標&己（BD Bioscience或eBioscience)之抗體在冰上 141892.doc •94- 201018482 一起培養30分鐘。對於細胞内細胞因子染色，在 GolgiPlug(l:1000稀釋；BD Bioscience)存在下用 PMA (20 ng/ml)及離子黴素（1 μΜ)將剛自EAE小鼠淋巴結、脾及 CNS分離之單核細胞或體外培養細胞再刺激5 h。用螢光標記抗體對細胞實施表面染色，使其再懸浮於固定/滲透化溶液（BD Bioscience)中，且根據製造商說明書對細胞内細胞因子實施染色。具體而言，對於IL-7細胞内染色，首先在4°C下將細胞與針對小鼠CD16/CD32 (BD Bioscience)之抗體一起培養30 min，且隨後使用BD Bioscience溶液實施固定/滲透化處理，然後用山羊抗小鼠IL-7 IgG(R&D系統）或山羊IgG(R&D系統）作為第一抗體且使用Alexa Fluor® 488驢抗山羊IgG (Jackson Immunol)作為第二抗體對細胞實施染色。以相同方案實施Bcl-2細胞内染色，但其中不實施PMA及離子黴素刺激。關於Foxp3之細胞内染色，用 Foxp3染色缓衝液（eBioscience)對細胞實施固定及可滲透化處理。用PE或偶聯FITC之抗人類或抗小鼠Foxp3 mAb(0.5 pg/106細胞；eBioscience)對滲透化細胞實施染色。對於麟酸化yes之細胞内染色，在37°C下用2% (wt/vol)低聚甲醒· 將細胞固定10 min，在冰上經30 min用90% (vol/vol)甲醇使其變得可滲透，且實施染色以進行抗磷酸化Stat5 (BD Bioscience)染色。用 BD LSR II (Becton Dickinson)儀器實施流式細胞分析，且使用FlowJo軟體（Tree Star公司）來分析結果。 3.11統計分析 141892.doc -95- 201018482 藉由Mann-Whitney U測試來分析各組之間基因表現之差異。使用雙尾司徒登氏t測試（Two-tailed Student's t test)來分析各組間之差異。首先實施單因子anova以確定是否存在總統計顯著性變化，之後實施雙尾配對或未配對司徒登氏t測試。若P值小於〇.05，則可視為統計上顯著。結果

3.12藉由IL-7R或IL-7抬抗來改善EAE 如圖5所示，當自第1〇天起投與三次時，與同型對照相比，抗CD127抗體治療藉由降低疾病嚴重度而顯著改變鬱 EAE之臨床過程（圖5A)。該治療方案使得疾病嚴重度較對照小鼠顯著降低’同時受影響脊髓中之炎症及脫髓鞘作用顯著降低。得自經治療小鼠之脾細胞表現出T細胞對m〇g 之反應性顯著降低，但由C〇nA誘導之非特異性τ細胞活化未顯著降低（圖5B)。應注意，在經治療EAE小鼠之脾及脊髓二者中，治療效果除與MOG反應性T細胞中之其他炎症相關細胞因子有關外’還尤其與7產生之選擇性降低有關（圖5C)，且與τΗ 1 7細胞及較低程度地與τΗ 1細胞之百分比有關（圖5D)。在經治療小鼠中CNS-浸潤ΤΗ17細胞之絕對數量與對照小鼠相比降低為十分之一，（1·3±0·2χ104對 — 13·7±3χ1〇4)。相反，Treg細胞隨εαε之進程呈負相關（圖 5D)。在三個亞組中差異性表現IL 7R(圖5E)。另外’顯而易見’在EAE發作後（免疫後第12天或第21 天）觀察到之TH17及TH1細胞僅具有CD44+CD62L·記憶性表型且對IL-7R抗體處理敏感（數據未顯示）。儘管在脊髓中 141892.doc •96· 201018482 CD4+ T細胞浸潤顯著降低’但外周cd4+及CD8+ T細胞及 Β220+ Β細胞之絕對數量及總組成並未顯著改變（數據未顯示）。結果表明’在Ε ΑΕ中具有記憶表型之CD4+ Τ細胞針對致病ΤΗ17及TH1亞組而高度濃集且對IL_7R拮抗敏感，此使得在經治療EAE小鼠中TH17/TH1與Treg之比移向新平衡。針對IL-7之抗體亦減小EAE臨床評分（圖5F)，但減小程度未達到使用抗CD 127抗體時所觀察到之程度。此外，如圖6所示’ CD 127在得自EAE小鼠脾或脊髓之活體外τΗ1及 TH17細胞中大量表現’而在F〇xp3+ Treg中CD127表現顯著降低。 3·13 IL-7在TH17分化中之作用致病TH17之體内產生及作用係包括分化及存活與擴增之二分枝過程。諸如IL-6、IL-Ιβ及IL-21等促炎細胞因子對於EAE中TH17分化及自身免疫性炎症之起始具有關鍵作用，而對TH17細胞之存活及擴增之瞭解較少且可能涉及 IL-23 。本發明發明者使用CD441()CD62LhiCD25-表型之純化初始 CD4+ T細胞來研究IL-7/IL-7R信號轉導是否與TH17分化相關。藉由在存在或不存在TGF-β時用CD3/CD28抗體刺激所得細胞來檢查IL-7之效應。儘管IL-7在與TGF-β組合時可促進TH17分化，但其效應與IL-6相比程度僅為中等且獨立於IL-6(圖7A)，此與IL-7邊緣誘導STAT-3磷酸化及表現有關（圖7Β，圖7C)。與IL-6類似，僅IL-7不能誘導τη17 141892.doc •97- 201018482 分化（數據未顯示）。由於比一對“丨？分化僅具有中等程声之效應，因此吾人論述所觀察到之效應在εαε中是否具= 體内顯著性。當在ΕΑΕ發作前投與（在第〇、2及4天注射時，IL-7R抗體治療並未影響疾病嚴重度儘管其與經對照抗體治療之小鼠相比使疾病之發作稍微有所延遲（圖 7D)。這些數據共同表日月，IL_胤_7R信號轉導在Τη17分化中僅具有次要作用而非關鍵作用。 3·14 ΤΗ17及TH1細胞在經治療ΕΑΕ小鼠中之選擇性抑制及 CD127拮抗在ΤΗ17分化中之作用然後在體内及體外兩種實驗設定下檢查CD127抗體在 TH17分化及維持/擴增中之作用。如圖8A所示，與對照小鼠相比，在經治療EAE小鼠中Th17細胞及γ_干擾素分泌 TH1細胞（程度較低）在脾細胞及CNS浸潤物中之百分比降低，而F〇Xp3+ Treg之含量顯著升高（p<〇〇1，圖8B)。 TH17、TH1及Treg百分比在經治療及對照兩種小鼠之EAE病程中之變化展示於圖8C中。在單獨體外實驗設定中， TH17、TH1及Treg係使用不同誘導方案在存在及不存在 CD 127抗體時分別分化自初始脾細胞。結果揭示，若在分化開始時添加CD 12 7抗體’則可顯著抑制Th丨7及Th〖（程度較低）而非Treg之分化（圖9A)。觀察到cd 127抗體對已分化 Th17而非TH1或Treg具有類似效應（圖9B)。 3·15 TH17存活及擴增需要IL-7 目標係研究Τη 17分化疋否需要IL-7。就此而言，最初結果表明，人們發現在EAE MOG特異性Τ細胞培養第9天 141892.doc •98· 201018482 時’單獨添加IL-7可促進ΤΗ17及TH1(程度較低）之分化，但不促進Treg中之F〇Xp3之分化（圖10)。如本文所述，其他工作揭示IL-7在TH17擴增及存活中之作用比在TH17分化中之作用顯著得多。. 3·16 TH17而非Treg對IL-7R拮抗誘導之細胞凋亡之易感性然後藉由抗CD 127抗體研究造成TH17之選擇性減少及易感性之機制。如圖11A中所示，在活體外得自經治療或對 _ 照EAE小鼠之CD4+ T細胞之免疫印跡分析揭示，抗cd 127 抗體處理導致與JAK-STAT及細胞调亡相關之信號轉導途徑之特異性改變’其特徵在於鱗酸化jAK_i及鱗酸化 STAT-5之下調及關鍵促細胞〉周亡分子BCL-2之含量顯著降低’以及抗細胞凋亡分子ΒΑΧ之活性提高》在經抗體處理小鼠中’對促-及抗細胞凋亡蛋白之調節與提高CD4+細胞之細胞/周亡程度相關。如圖11Β中所示，CD127抗體治療導致在CD4+CD127+ Τ細胞中膜聯蛋白_V+凋亡細胞百分比 φ 與得自經處理EAE小鼠之CD4+CD127- T細胞相比顯著提局0 似乎得自EAE小鼠之已分化TH17細胞發生主動起始或程式性細胞凋亡’此可藉由添加IL-7來復原。藉由將易感細胞與抗IL-7R抗體而非對照抗體一起預培養可取消該過程。IL-7顯著改變了 BCL-2之表現程度，其與膜聯蛋白_v+ 凋亡細胞之含量呈負相關（圖11C)。所觀察到IL-7之效應明顯係經由STAT-5來介導，且可藉由STAT-5特異性抑制劑而非STAT-3抑制劑或PI3_K抑制劑 141892.doc -99· 201018482 來阻斷（圖11D)。在得自經江-711抗體或對照IgG處理之 EAE小鼠之CD4 MOG反應性T細胞中進一步分析涉及抗_ 及促細胞凋亡蛋白之主要分子事件。CD4+IL_7R+ τ細胞群中膜聯蛋白-ν+ τ細胞之百分比相對於CD4+IL_7R- τ細胞而增加與經IL-7R抗體處理之EAE小鼠中Bcl-2、Bcl-XL及 Mcl-1之表現降低及促細胞凋亡蛋白Bax及Bak之含量升高有關（圖11A及11B)。該等發現為il-7作為藉由調節STAT-5 構酸化及抗-及促細胞凋亡蛋白之含量來擴增已分化Th 17 細胞之關鍵存活信號之作用提供其他支持。 3.17針對人類IL-7R之中和抗體對人類Th17分化之效應在人類實驗系統中進一步驗證CD127拮抗在τΗ17分化中之作用。吾人之研究顯示，TH17之發育係兩步式過程（圖 20) ’ 「步驟1」係TH前體細胞分化’且「步驟2」係Th17 存活/擴增。該兩個過程受不同細胞因子控制，其表現另外受不同轉錄因子調節。該兩個過程對自身免疫疾病之臨床結果皆具有關鍵作用。TH1 7分化主要係藉由IL_6經由 JAK/STAT-3途徑來誘導。IL_7在此過程中具有次要作用。吾人之結果顯示，在此兩步式細胞發育過程中IL_7/il_7R 信號轉導係在步驟2中發揮主要作用_致病Th17細胞之存活及擴增。在此第二步驟中，IL-7之作用優於IL_23經由 JAK/STAT-5途徑之作用。在使用本發明抗⑶⑴抗體阻斷 IL_7/IL-7R時，TH17分化所受影響最小，如圖12中所示。然而，若在細胞已定型為TH1 7細胞後給予IL-7R mAb，則細胞對細胞调亡局度易感，如圖19中所示。該研究為il_ 141892.doc -100- 201018482 7/IL-7R信號轉導在致病ΤΗ17細胞發育中之新穎作用及在 EAE中之功能提供可靠證據，且為IL-7R拮抗作為MS及其他自身免疫病況之潛在治療方法提供可信理論基礎。 3.18藉由經IL-7刺激之PBMC來抑制IFNy產生以2><105細胞/孔將新鮮或解凍？6]^1(：平鋪於96孔板中含有 10% FBS 之 RPMI 1640 中。在 37°C 下以 10 pg/ml及 100 gg/ml將純化測試抗體6C5、陽性對照抗體R34.34 (Dendritics公司）及抗人類IL-7 (R&D)、以及同型對照抗體小鼠IgGl (R&D)與細胞一起培養30分鐘，之後補充10 ng/ml IL-7。用IL-7作為陰性對照對細胞實施短暫處理，同時以未經處理細胞作為背景。在所有情況下添加2 pg/ml 可溶性抗 CD3 及抗 CD28 (eBiosciences)，且在 37°C 及 5% C02下將板另外培養24小時。藉由人類IFN-γ ELISA(人類 IFN-γ ELISA套組，eBiosciences)來分析IFN-γ在培養上清液中之含量。在該等情況下，mAb 6C5及抗體R34.34抑制 IL-7誘導之IFNy產生（圖18)。 3.19抑制經IL7刺激之IL7受體進行信號轉導之Stat5磷酸化為篩選能阻斷CD 127之信號轉導功能之抗體，在功能性測試前夜將冷藏保存之PBMC快速解凍且將其平鋪於含有 10% FBS之RPMI 1640培養基中。藉由自120 pg/ml之最高濃度實施連續稀釋3倍來製備測試樣品抗體及陽性對照抗體（R34.34，Dendritics 公司，編號 DDX0700 ; BD 抗 CD 127，BD Biosciences 公司，編號 552853)，且在 37°C 下 141892.doc -101 - 201018482 經30 min將其添加至2χ 1 05 PBMC細胞中，之後在37°C下用 IL-7以1 ng/ml刺激15 min。使用不含抗體且未經IL7處理之細胞作為背景對照。使用經IL7處理但不含抗體樣品之細胞作為完全活性對照。在處理後於37。(：下用溶胞緩衝液 (PerkinElmer編號TGRS5S500)經5 min溶解細胞，且在室溫下將溶胞產物與含有AScreen®受體珠粒（perkinElmer編號 676061 7C)之反應緩衝液及活化緩衝液混合物（PerkinElmer 編號TGRS5S500) —起培養2小時。此後，添加含有 AScreen®供體珠粒（PerkinElmer編號6760617C)之稀釋緩衝液（PerkinElmer編號TGRS5S500)且另外培養2小時。在 Envision上以其默認α屏幕模式（頂讀式；Ex 680 nm ; Em 570 nm)分析來自Ascreen珠粒之發光（RFU)。根據下式將測試樣品（6C5、1 Al 1)之結果轉化為相對活性：相對活性（％)=(RFU(樣品）-RFU(背景對照）)/ (RFU(完全活性對照）-RFU(背景對照））此計算結果展示於圖19中。在生長培養基（RPMI1640，10% FBS，100 U/ml青黴素，100 pg/ml鏈黴素，1 mM 丁酸鈉）中培養CCF-CEM細胞，且用 1 μΜ 地塞米松（Dexamethasone)(Sigma 編號 D4902) 處理過夜以在實驗前進行IL7受體誘導。藉由自120 pg/rnl 之最高濃度實施連續稀釋3倍來製備測試樣品抗體及陽性對照抗體（R34.34，Dendritics公司，編號DDX0700 ; BD抗 CD127，BD Biosciences 公司，編號 552853)，且在 37°C 下經30 min將其添加至2xl05 PBMC細胞中，之後在37°C下用 141892.doc •102· 201018482 IL-7以1 ng/ml刺激15 min。使用不含抗體且未經IL7處理之細胞作為背景對照。使用經IL7處理但不含抗體樣品之細胞作為完全活性對照。在處理後於37°C下用溶胞緩衝液 (PerkinElmer編號TGRS5S500)經5 min溶解細胞，且在室溫下將溶胞產物與含有AScreen®受體珠粒（PerkinElmer編號 6760617C)之反應緩衝液及活化緩衝液混合物（PerkinElmer 編號TGRS5S500) —起培養2小時。此後，添加含有 A Screen®供體珠粒（PerkinElmer編號6760617 C)之稀釋緩衝液（PerkinElmer編號TGRS5S500)且另外培養2小時。在 Envision上以其默認α屏幕模式（頂讀式；Ex 680 nm ; Em 570 nm)分析來自Ascreen珠粒之發光（RFU)。根據下式將測試樣品（6C5、1A11)之結果轉化為相對活性：相對活性（％)=(RFU(樣品）-RFU(背景對照）)/ (RFU(完全活性對照）-RFU(背景對照））結果展示於圖20中。以基本上相同之方式用杬體6A3重複實施實驗，如下所述。使新鮮PBMC懸浮於無血清RPMI 1640培養基中。稀釋測試樣品及陽性對照抗體（6A3及R34.34，Dendritics公司，編號DDX0700)以在培養物中獲得20 pg/ml至0.01 pg/ml之最終濃度，且添加至lxl〇6 PBMC細胞/樣品。在 37°C下將PBMC與抗體一起培養1 h，之後用IL-7以1 ng/ml 刺激15 min。對於鱗酸化STAT5之細胞内染色，在37°C下用2% (wt/vol)低聚曱搭將細胞固定1〇 min，在冰上經30 min用90% (vol/vol)曱醇使其變得可滲透，且實施染色以 141892.doc •103- 201018482 進行抗填酸化Stat5 (BD Bioscience)染色。用BD LSR II (Becton Dickinson)儀器實施流式細胞分析，且使用FlowJo 軟體（Tree Star公司）來分析結果。使用不含抗體且未經IL7處理之細胞作為背景對照。使用經IL7處理但不含抗體樣品之細胞作為完全活性對照。圖21展示與無抗體對照相比，濃度逐漸升高之R34.34及 6A3對IL-7誘導P-STAT5之抑制。 3.20在已分化T細胞中抑制IL-7誘導之IL-17產生根據手冊（編號以0-㈣7-755，來分離CD4+細胞。將100 μΐ約lxl06/ml之CD4+細胞與等體積2x TH17培養基（2 pg/ml 抗 CD28+10 pg/ml 抗 IFNy+lO pg/ml 抗几-4+12.5 ng/ml IL-ip + 20 ng/ml IL-23 + 50 ng/ml IL-6)混合，且在37°C及5% C02下培養5天。在TH17培養基中用各種細胞因子及生長因子處理優先將CD4+細胞分化為TH17細胞。在第5天使用5Z) FJCS 尸Jrk //對來自經分化培養細胞之CCR6 +細胞實施分選。然後將CCR6 +細胞調節至2x 106/ml以供IL-17產生分析。為量測IL-17含量，在4°C下將1〇〇 μΐ CCR6 +細胞與測試抗體一起預培養1 h，且隨後與100 μΐ 20 ng/ml之IL-7混合。在37°C及補充有5% C02之情況下將細胞培養過夜。藉由流式細胞儀來量測IL-17在100 μΐ過夜培養上清液中之含量。表10展示用於獲得圖22中之結果之IL-7及測試抗體（R34.34及6C5)濃度。表10針對CCR6+CD4細胞之抗CD127效應 141892.doc -104- 201018482 CM 10 ng/ml IL-7 10 pg/ml R34.34 50 pg/ml 6C5 50 pg/ml IgG 10 ng/ml IL-7 10 ng/ml IL-7 10 ng/ml IL-7 在IL-7誘導之分化T細胞中6C5及R34.34二者皆抑制IL-17產生。以基本上相同之方式用抗體6A3重複實施實驗。根據手冊（編號«少〇來分離CD4 +細胞。將100 μΐ 約lxl06/ml之CD4+細胞與等體積2χ ΤΗ17培養基（2 pg/ml 抗 CD28 + 10 pg/ml抗 IFNy+lO pg/ml抗11^-4+12.5 11§/111111^ ⑩ 1β + 20 ng/ml IL-23 + 50 ng/ml IL-6)混合，且在 37°C 及 5% C02下培養5天。在TH17培養基中用各種細胞因子及生長因子處理可優先將CD4+細胞分化為TH17細胞。在第5天使用 BD FdCS 5Ό/?尸//對來自經分化培養細胞之CCR6+ 細胞實施分選。然後將CCR6+細胞調節至2 xl06/ml以供 IL-17產生分析。為量測IL-17及IFN-γ含量，在4°C下將100 μΐ CCR6 +細胞與測試抗體一起預培養1 h，且隨後將其與100 μΐ之20 Φ IL-7混合。在37°C及補充有5% C02之情況下將細胞培養過夜。分別在第24 h及40 h藉由流式細胞儀 Med办siews)來量測IFN-γ及IL-1 7在100 μΐ過夜培養上清液中之含量。表11展示用於獲得圖23中之結果之IL-7及測試抗體濃度。表11針對CCR6+CD4細胞之抗CD127效應 CM 10 ng/ml IL-7 10 pg/ml R34.34 10 pg/ml 6A3 10 pg/ml IgG 10 ng/ml IL-7 10 ng/ml IL-7 10 ng/ml IL-7 141892.doc -105- 201018482 討論本文所述研究為IL_7& ^巧尺在多發性硬化症（MS)中之潛在作用提供第一免疫學證據。本發明發明者已提供可靠證據表明，IL-7/IL-7R信號轉導在小鼠及人類系統二者中之定型Th17細胞之存活及擴增中具有關鍵作用，而其在Th17分化中之作用不如131_6重要。在EAE發作後施用江一或化一尺拮抗可顯著影響疾病之臨床過程。因此本發明發明者顯示，IL_7或IL7R拮抗在涉及致病TH17細胞之自身免疫疾病及炎症性病症（具體而言MS，且更具體而言Ms之復發/緩解過程（1111]^8))之治療中提供有效治療潛力。在TH17之發育及功能中，Th17分化主要由il-6經由 JAK/STAT-3來控制，且Th17維持主要由比_7經由 JAK/STAT-5來控制。IL-7不僅為致病τΗ17細胞提供存活信號’且直接誘導體内TH17細胞擴增，此對於在e AE中維持自身免疫病理具有關鍵作用。如此研究中所示’具有記憶表型之定型Th17細胞代表體内致病T細胞亞組且對主動起始或程式性細胞凋亡易感。此過程似乎依賴於IL-7/IL-7R信號轉導在易感Th丨7細胞中對促-及抗細胞凋亡蛋白（例如Bcl_2及Bax)之調節。在本文中，IL - 7用作阻止已分化τ H1 7細胞發生程式性細胞〉周亡之關鍵存活信號。此外，如在自身免疫疾病之急性期中所觀察到之致病T細胞中增強之IL_7產生及大量表現之化一尺為維持τ細胞存活及擴增提供所需環境◎有人提出，IL_7與 141892.doc . ι〇ή. 201018482 其受體之交互作用可誘導α及鏈之凝集以及下游激酶之活化。因此，該過程可能改變激酶磷酸化級聯且產生 STAT-5磷酸化之停泊位點，Bcl-2及Mel-Ι之上調需要此位點且其可藉由阻斷Bim及Bad對Bax及B ak之活化來阻止線粒體介導之細胞凋亡。因此，其闡釋了 STAT-5之作用及其與致病TH1 7細胞中由IL-7誘導之抗細胞凋亡變化之關聯。

應注意，在ΕΑΕ中IL-7R拮抗對免疫系統之體内效應具有高度選擇性，其影響主要為記憶表型之ΤΗ17細胞及（程度較低）ΤΗ1細胞’且不影響Treg細胞。本發明發明者顯示’ TH17細胞維持受IL-7/IL-7R信號轉導之影響。在相同實驗條件下’ TH1細胞在體外而非在體内系統中發生改變。該差異可解釋為係因添加外源性IL-7之體外設定與涉及多種細胞因子相互影響之體内微環境之間之細胞因子環境不同所致。選擇TH1 7而非Treg之選擇性可容易地解釋為係由IL-7R之差異性表現所致，此賦予Th17細胞對仏一尺拮抗之易感性且賦予Treg細胞對IL-7R拮抗之抗性。此選擇性似乎在藉由IL-7R拮抗使EAE中之致病Th17細胞與Treg細胞之比再平衡中具有重要作用且因此具有治療效能。然而， TH17與TH1之間由IL_7所誘導針對IL_7R拮抗之反應性及易感性之差異不能簡單地用IL-7R之表現來解釋，此乃因兩種亞組皆大量表現I£_7R。之固有表現及活性係該等差異之主要原因。亦即，在Th1中天然表現或在Th17中藉由1FNl以實驗方式誘導之5OCS-/可降低對IL-7或IL-7R 141892.doc -107- 201018482 拮抗之易感性，此乃BSOCSW可用作IL_7信號轉導所需 STAT-5之阻遏基因。因此，對具有記憶表型之“η細胞之選擇性似乎涉及當在EAE病程中活化時該等致病細胞之存活對IL-7之固有需求。在經常影響多種免疫系統/功能之自身免疫疾病中，此治療特異性代表相對於所提出許多其他治療方法之顯著優勢。 IL-7/IL-7R信號轉導在τΗ17細胞存活及擴增中之作用之上述新穎機制為IL-7R拮抗在EAE中之治療效能及關於人類自身免疫疾病（例如MS)之治療意義提供有力闡釋^ IL_7 中和或IL-7R拮抗可能具有獨特治療優勢。一方面，該治療提供區分致病TH1及TH17細胞與Treg及無關免疫細胞之選擇性。另一方面，IL-7R拮抗之其他治療優勢涉及其對已分化TH17存活及擴增之選擇性效應，該效應與對Th17分化之效應相反。在治療背景下，用IL_7/IL_7R途徑之抑制劑相對於TH17分化來托向定型τΗ17之體内維持可能更有效。【圖式簡單說明】圖1(八）展示抗小鼠匚0127抗艘對11^_7介導卩8丁八丁5之抑制；圖1(B)展示抗小鼠CD127抗體對TSLP介導pSTAT5之抑制；圖2展示9B7之CD127ELISA結合曲線；圖3(入）顯示’厘八匕987(實線）能識別在經匸〇127轉染 CHO細胞系表面上表現之CD127。無關同型對照抗體係以虛線來展示； 141892.doc -108· 201018482 圖3(B)顯示，在空轉染CH〇細胞系中抗體9B7(實線）不能識別CD127-無關同型對照抗體係以虛線來展示；圖4展示藉由經純化鼠類mAb 9B7來抑制IL7介導F>Stat5 信號轉導之實例；圖5(A)顯示’抗CD127抗體改善MOG-EAE臨床評分；圖5(B)展示對M〇G肽誘導T細胞增殖之抑制；圖5(C)展示抗CD127抗體對細胞因子產生之抑制；圖5(D)及5(E)展示抗CD 127抗體治療對輔助T細胞亞型之 ® 選擇性效應；圖5(F)顯示，抗IL_7抗體改善MOG-EAE臨床評分；圖6展示在活體外得自EAE小鼠脾或脊髓之Treg、TH1及 TH17細胞中之CD127表現；圖7(A)顯示IL-7對促進TH17分化之效應與IL-6相比較低；圖7(B)顯示，STAT-3磷酸化之誘導主要係由獨立於IL-7 之IL-6來驅動；圖7(C)顯示，il-7對RORa表現之效應與IL-6相比亦較小；圖7(D)顯示，抗CD127抗體治療之效應在EAE疾病開始 •期間較小；圖8(A)展示τΗ17細胞、γ-干擾素分泌TH1細胞、及Treg細胞在CNS中之百分比；圖8(B)展示τΗ17細胞、γ-干擾素分泌TH1細胞、及Treg細胞在脾細胞中之百分比； 141892.doc 201018482 圖8(C)展示在經治療小鼠及對照小鼠中τΗ17、TH1及Treg 在EAE病程期間之百分比；圖9(A)顯示，若在分化開始時添加CD127抗體，則Th17 及TH1而非Treg之分化受到顯著抑制；圖9(B)展示CD127抗體對已分化TH17而非TH1或Treg具有與圖9(A)中類似之效應；圖1〇顯示，在將EAE MOG特異性T細胞培養至第9天時’添加IL-7促進TH17及TH1(程度較低）之分化，但不促進 Treg中之F〇xp3之分化；圖11(A)展示在活體外得自經治療或對照EAE小鼠之 CD4+ T細胞之免疫印跡分析，其顯示抗CD 127抗體治療改變與JAK-STAT及細胞凋亡相關之信號轉導途徑，其特徵在於磷酸化JAK-1及磷酸化STAT-5之下調、及關鍵促細胞凋亡分子BCL-2含量之顯著降低、及抗細胞凋亡分子ΒΑΧ 活性之增強；圖11(B)顯示，抗CD127抗體治療相對於得自經治療ΕΑΕ 小鼠之CD4+CD127- Τ細胞提高膜聯蛋白-V+凋亡細胞在 CD4+CD127+T細胞中之百分比；圖11(C)顯示，得自ΕΑΕ小鼠之已分化ΤΗ17細胞經歷可用IL-7來解救之細胞凋亡，但若將細胞與抗CD127抗體一起預培養則此過程減緩；圖11(D)顯示，IL-7之效應係經由JAK/STS-5途徑來介導；圖12展示mAb 9Β7對得自人類總CD4+細胞之ΤΗ17分化 141892.doc • 110· 201018482 之抑制；圖13展示mAb 6C5對CD127-ECD結合固定化IL-7之抑制；圖14顯示，mAb 6C5與IL-7競爭結合CD127 ; 圖15顯示，mAb 6C5與Dendritics抗體R.34.34競爭結合 CD127 ；圖16(入）展示111入5 6入3對0〇1274€〇結合固定化11^7之抑制；圖16(B)展示在不同抗體濃度下抗體6A3相對於R34.34之抑制率曲線；圖17顯示，mAb 6A3與IL-7競爭結合CD127 ; 圖18顯示，mAb 6C5及抗體R.34.34二者皆抑制經IL-7刺激之PBMC產生IFNy ; 圖19展示針對阻斷由經IL-7刺激PBMC誘導之Stat5信號轉導之能力來篩選抗體之結果；圖20展示針對阻斷由經IL-7刺激CCF-CEM細胞誘導之 Stat5信號轉導之能力來篩選抗體之結果；圖21展示在TH17擴增分析中mAb 6A3抑制IL-17及IFN-γ 產生之能力；圖22展示各種抗CD127抗體對hCD4細胞在IL-7刺激下產生IL-17之抑制效應；及圖23展示mAb 6A3對TH17細胞產生IFN-γ及產生IL-17之效應。 141892.doc -111 -

Claims

201018482 七、申請專利範圍： 1 ♦一種IL-7受體介導的ΤΗΠ擴增之桔抗劑在製造供治療人類個體自身免疫疾病或炎症性病症之藥物中之用途。 2. 如請求項1之治療用途，其中該仏-7受體介導的TH17擴增之拮抗劑抑制IL-7誘導TH17細胞產生IL-17。 3. 如請求項丄或之之用途，其中該IL-7受體介導的TH17擴增之拮抗劑抑制IL-7誘導TH17細胞產生IFN-γ。 4. 如請求項1或2之用途，其中該IL-7受體介導的TH17擴增之拮抗劑抑制IL-7受體介導的STAT-5磷酸化。 5·如請求項之用途，其中該比_7受體介導的Th17擴增之括抗劑係與IL-7或與CD127特異性結合之結合蛋白。 6.如明求項5之用途，其中該結合蛋白與cd 127特異性結合。如μ求項6之用途，其中該結合蛋白抑制11：^7與il_7R之結合。

°青求項5之用途，其中該結合蛋白結合至少一個肽内之至少一個胺基酸’該至少一個肽係由選自由以下組成之群之SEQIDNO:l中之胺基酸殘基組成： a) 41至63 ， b) 65至80 ， e) 84至1〇5 ， d) 148至169，及 e) 202至219 。 9·如請求項8之用途，其中該結合蛋白結合卿ι〇 N〇M 141892.doc 201018482 65至80、84至105、148至169、及202至2 19之各肽内的至少—個胺基酸。 1〇·如請求項1之用途’其中該結合蛋白在ELISA分析中競爭性抑制R34.34(Dendritics公司，第DDX0700號）與人類 CD127之結合，或在ELISA分析中抑制具有6A3重鏈及輕鍵可變區（分別為SEQ ID NO: 193及SEQ ID NO: 194)之抗體與人類CD127之結合。 Π·如請求項5之用途’其中該結合蛋白以1 nM或更低之親和力（KD)與CD127結合，如藉由表面電漿共振所量測。 12.如請求項丄’：或…之用途，其中該結合蛋白為抗體或其片段。 13·如凊求項12之用途，其中該抗體包含SEq id NO: 197之重鏈互補決定區3 (CDRH3)或其類似物。 14. 如請求項1、2或10之治療用途，其中該自身免疫或炎症性疾病係與高含量之IL-17有關。 15. 如请求項丄〜之或切之用途，其中已確定該人類個體可表現相對於健康人類個體較高含量之IL_丨7。 16. 如请求項14之用途’其中該拮抗劑之量可有效降低該患者中之IL-17含量。 17. 如請求項14之用途’其中該IL_17i量係在該患者血清中量測。 18. 如4求項1、2或10之用途，其中該自身免疫疾病係多發性硬化症。 T細胞群内具 19. 如請求項18之用途，其中該患者在其CD4 + 141892.doc 201018482 有i?iTh17計數。 20. 21. 22. ⑩23. • 24 一種IL-7或IL-7R拮抗劑在製造供治療人類個體自身免疫疾病之藥物中之用途，其中該IL-7或IL-7R拮抗劑之量可有效降低TH17細胞相對於TH1細胞之比。一種IL-7受體介導的STAT-5磷酸化之拮抗劑在製造供治療人類個體自身免疫疾病之藥物中之用途。如請求項20或21之用途，其中該IL-7或IL-7R拮抗劑係特異性結合CD127或IL-7之結合蛋白。如請求項20或21之用途，其中該結合蛋白結合至少一個由以下SEQ ID ΝΟ:1中之胺基酸殘基組成之肽内之至少一個胺基酸： a) 41至63 ， b) 65至80 ， c) 84至105 ， d) 148至169，及 e) 202至219。一種鑒定適用於治療自身免疫疾病或炎症性疾病之抗體之方法，該方法包含以下步驟：篩選複數個獨立抗體群以測定各抗體群之下述能力： i. 抑制IL-7與IL-7R之結合， ii. 中和IL-7誘導之STAT-5麟酸化，及/或 iii. 抑制TH17細胞產生IL-17; 及選擇彼等能抑制IL-7與IL-7R結合、抑制IL-7誘導之 STAT-5磷酸化、及/或抑制τΗ17細胞產生IL-17之抗體 141892.doc 201018482 群。 25· —種IL-7或CD127拮抗劑在製造供治療患有復發緩解型多發性硬化症之患者中之多發性硬化症之藥物中的用途。 26. —種經分離人類、人類化或嵌合抗體、或其片段，其中該抗體或片段結合人類CD127之表位，該表位含有以殘基編號80開始且以殘基編號190結束之區域内之至少一個胺基酸殘基。 27. —種經分離人類、人類化或嵌合抗體、或其片段，其結合人類CD 127之表位，該表位具有位於以下cdi27區域中至少一個區域中之胺基酸殘基：35-49、84-105及139· 180 ° 28. 如請求項26或27之經分離抗體或抗體片段，其中該結合蛋白結合以下線性肽中之至少一個：35-49、84-105、及 171-180 。 29. 如請求項26或27之經分離抗體或抗髏片段，其中該結合蛋白結合至少一個由SEQ ID ΝΟ:1之以下胺基酸殘基組成之肽内之至少一個胺基酸： a) 41 至 63， b) 65至 80， c) 84至105 ， d) 148至169，及 e) 202至219。 30. 如請求項26或27之經分離抗體或抗體片段，其中該結合 141892.doc 201018482 蛋白以低於10 nM之親和力（KD)結合人類CD 127，如藉由表面電漿共振所量測。 31. 如請求項30之經分離抗體或抗體片段，其中該親和力 (KD)低於5 nM，如藉由表面電漿共振所量測。 32. —種經分離抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合 CD127且包含SEQ ID NO: 197之重鏈互補決定區3 (CDRH3)或其類似物。 3 3.如請求項32之經分離結合蛋白，其中該抗原結合蛋白另外包含 SEQ ID NO:195 之 CDRH1 及 SEQ ID NO:196 之 CDRJH2中之至少一者或任一者之類似物。 34.如請求項33之經分離結合蛋白，其中該抗原結合蛋白另外包含選自以下之一或多個或所有CDR : SEQ ID NO:195 之 CDRH1、SEQ ID NO:196 之 CDRH2、SEQ ID NO:198 之 CDRL1、SEQ ID NO:199 之 CDRL2 或 SEQ ID N0:200之CDRL3或其類似物。 3 5.如請求項32、33或34中任一項之經分離結合蛋白，其係經分離人類化或嵌合抗體。 36. 如請求項32之經分離結合蛋白，其中該經分離結合蛋白係抗體或抗體片段，且其中該抗體或抗體片段包含具有以下互補決定區（CDR)或其類似物之重鏈可變區： CRDH1序列：TDYAWN(SEQIDNO:195) CDRH2序列：YIFYSGSTTYTPSLKS(SEQIDNO:196) CDRH3序列：GGYDVNYF (SEQ ID NO:197)。 37. 如請求項36之經分離結合蛋白，其中該經分離結合蛋白 141892.doc 201018482 係抗體或抗體片段，且其中該抗體或抗體片段包含具有以下互補決定區（CDR)或其類似物之輕鏈可變區： CDRL1序列：LASQTIGAWLA(SEQIDNO:198) CDRL2序列：AATRLAD (SEQ ID NO:199) CDRL3序列：QQFFSTPWT (SEQ ID N0:200)。 38. 如請求項36之經分離結合蛋白，其中該結合蛋白包含以下可變區序列：重鏈可變區： DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITTDYAWNWIR QFPGNKLEWMGYIFYSGSTTYTPSLKSRISITRDTSKNQ FFLQLNSVTTEDTATYYCARGGYDVNYFDYWGQGTTL TVSS (SEQ ID NO:193) 輕鏈可變區： DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYQQ KPGKSPQLLIYAATRLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSL QAEDFVSYYCQQFFSTPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 194)。 39. —種經分離結合蛋白，其中該結合蛋白係抗體或其片段，且其中該結合蛋白包含： i. 具有以下互補決定區之重鏈可變區： CDRH1 ： RYNVH (SEQ ID NO:4)； CDRH2 ： MIWDGGSTDYNSALKS (SEQ ID NO:5)； CDRH3 : NRYESG (SEQ ID NO:6);及包含以下互補決定區之輕鏈可變區： 141892.doc 201018482 CDRLl ： KSSQSLLNSGNRKNYLT (SEQ ID NO:7)； CDRL2 : WASTRES (SEQ ID NO:8);及 CDRL3 : QNDYTYPFTFGS (SEQ ID NO:9)，或 ii.具有以下互補決定區之重鏈可變區： CRDH1 ： AYWMS (SEQ ID NO:78) CDRH2 ： EINPDSSTINCTPSLKD (SEQ ID NO:79) CDRH3 ·· RLRPFWYFDVW (SEQ ID NO:80)及包含以下互補決定區之輕鏈可變區： CDRLl ： RSSQSIVQSNGNTYLE (SEQ ID NO：81) CDRL2 ： KVSNRFS (SEQ ID NO:82) CDRL3 ： FQGSHVPRT (SEQ ID NO:83) 〇 40.如請求項39之經分離結合蛋白，其中該抗體或抗體片段競爭結合人類CD127，其中該抗體並非R34.34 (Dendritics公司，第 DDX0700號）。 41_ 一種如請求項26至40中任一項之經分離結合蛋白之用途，其用於製造供治療患有多發性硬化症之患者中之自身免疫或炎症性病況之藥物。 42.如請求項26或27之經分離抗體或抗體片段，其用於治療自身免疫或炎疰性病況。 43_如請求項32至34及36至40中任一項之經分離結合蛋白’ 其用於治療自身免疫或炎症性病況。 141892.doc