MX2011001477A - Tratamiento de enfermedad autoimunitaria e inflamatoria. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona nuevos procedimientos de tratamiento de la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunitarias o trastornos inflamatorios, y antagonistas, que incluyen proteínas de unión aisladas para su uso en los nuevos procedimientos. Se proporciona un procedimiento de tratamiento de la esclerosis múltiple que comprende la neutralización de la actividad biológica de la IL-7 mediante la unión a CD127 o a IL-7. Las proteínas de unión aisladas también pueden neutralizar la actividad biológica de la TSLP.

Description

TRATAMIENTO DE ENFERM EDAD AUTOINMUNITARIA E I NFLAMATORIA La presente invención proporciona n uevos procedimientos de tratamiento de la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunitarias, y nuevas proteínas de unión aisladas para su uso en estos procedimientos. También se proporciona un procedimiento para el tratamiento de la esclerosis múltiple que comprende la neutralización de la actividad biológica de la I L-7 o el I L-7R.

Antecedentes de la invención La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad inflamatoria crónica desmielinizante que afecta al sistema nervioso central. En la MS, se cree que la infiltración de célu las inmunitarias inflamatorias está involucrada en la destrucción de los oligodendrocitos, que son las células responsables de la creación y mantenimiento de una capa grasa, conocida como vaina de mielina. La MS da como resultado el adelgazamiento o la pérdida completa de mielina. Cuando se pierde la mielina, las neuronas ya no pueden conducir eficazmente sus señales eléctricas, lo q ue da lugar a numerosas disfunciones neurológicas. Los individuos con MS producen células T autorreactivas que participan en la formación de lesiones inflamatorias a lo largo de la vaina de mielina de las fibras nerviosas. El fluido cerebroespinal de pacientes con MS activa contiene células T activadas, que se infiltran en el tejido cerebral y provocan lesiones inflamatorias características, destruyendo la mielina. Aunque los síntomas de la esclerosis múltiple y la evolución de la enfermedad pueden variar de persona a persona, existen tres formas de la enfermedad - MS recidivante-remitente, MS progresiva secundaria y MS progresiva primaria.

En las primeras fases de la MS, se producen ataques inflamatorios en intervalos cortos de actividad aguda intensificada de la enfermedad. Estos periodos son seguidos de periodos de recuperación y remisión. Durante el periodo de remisión, se resuelve la dilatación local en la lesión del sistema nervioso, las células inmunitarias se vuelven menos activas o inactivas, y las células que producen mielina vuelven a mielinizar los axones. La señalización nerviosa mejora, y la discapacidad provocada por la inflamación se vuelve menos grave o desaparece completamente. Esta fase de la enfermedad se denomina MS recidivante-remitente (RRMS). No obstante, las lesiones no se curan completamente. Algunas permanecen como lesiones "crónicas", que normalmente tienen una región central desmielinizada que carece de células inmunitarias. Con el transcurso del tiempo, las células en el centro de estas lesiones en su mayoría mueren, aunque a menudo la inflamación continúa en sus extremos. El cerebro se puede adaptar bien a la pérdida de algunas neuronas, y durante muchos años puede no producirse una discapacidad permanente. No obstante, más del 50% de los pacientes con MS eventualmente entran en una fase de deterioro progresivo, denominada MS progresiva secundaria (SPMS). En esta fase, la enfermedad ya no responde bien a los fármacos que modifican la enfermedad, y las discapacidades de los pacientes empeoran de manera constante. La destrucción de neuronas al comienzo de la progresión natural de la MS sugiere que las discapacidades progresivas de la SPMS podrían ser el resultado de una pérdida neuronal acumulada que eventualmente sobrepasa las capacidades compensatorias del cerebro. La MS progresiva primaria es un tipo de esclerosis múltiple en la que no hay recaídas, pero durante un período de años, hay una pérdida gradual de las funciones físicas y cognitivas.

El objetivo del tratamiento en pacientes con esclerosis múltiple recidivante-remitente es reducir la frecuencia y la gravedad de las recaídas (y prevenir de este modo las exacerbaciones) así como prevenir o posponer el comienzo de la fase progresiva de la enfermedad. Para conseguir este objetivo, en el pasado se han usado fármacos, especialmente inmunomoduladores o inmunosupresores, pero nunca han tenido una aceptación generalizada debido a una eficacia limitada y una toxicidad considerable. Por ejemplo, se han realizado con éxito un gran número de ensayos clínicos controlados aleatorios con interferón ß-1a, interferón ß- 1 , y acetato de glatirámero.

Tanto las respuestas de las células T autoinmunitarias alteradas como la disfunción de la red reguladora del sistema inmunitario desempeñan un papel importante en las patologías autoinmunitarias humanas, tales como la MS y la artritis reumatoide (Kuchroo y col., (2002) Annu. Rev. Immunol. 20: 101-123; Sospedra y Martin (2005) Annu. Rev. Immunol. 23: 683-747; Toh y Miossec (2007) Curr. Opin. Rheumatol. 19: 284-288).

Aunque la etiología y la patogénesis de la MS siguen siendo desconocidas, generalmente se considera una patología autoinmunitaria en la que se piensa que células T autorreactivas con potencial patógeno, tales como las células TH1 y TH17, desempeñan un papel importante. Existen evidencias de que estas células T efectoras se activan in vivo durante el proceso patológico y se les puede atribuir la inflamación del sistema nervioso central (SNC). También existen evidencias de que estas células T median en la destrucción de células que expresan mielina en lesiones de EAE y MS durante la fase activa de la enfermedad. Por otra parte, las células T reguladoras (Treg) que normalmente mantienen bajo control a las células TH1 y TH17 patógenas son deficientes en pacientes con MS, volviendo aún más propenso el sistema inmunitario a un estado pro-inflamatorio.

Recientemente tres grupos independientes han presentado los resultados del escaneo de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) de genomas silvestres en un total de 17.947 donantes con o sin MS. Después de escanear 334.923 SNPs, encontraron una asociación altamente significativa (P = 2,9 x 10~7 global) de un SNP codificante no sinónimo en la cadena a del receptor de la IL-7 humano (IL-7Ra) con susceptibilidad a la MS. El SNP corresponde a un cambio de T a C en el exón 6 de CD127 (también conocido como IL-7Ra). Este cambio aumenta las posibilidades de omisión del exón 6 durante el procesamiento alternativo del ARN, dando como resultado una forma soluble de CD127. Además, las expresiones de los ARN de CD127 e IL-7 en los fluidos cerebroespinales (CSFs) de pacientes con MS son significativamente superiores en relación con los CSFs de pacientes con otros trastornos neurológicos.

La IL-7 y el receptor de la IL-7 (IL-7R) son conocidos por desempeñar un papel importante en el desarrollo y la homeostasis de células T y células B, principalmente en un entorno tímico. De hecho, las células estromales tímicas, el timo fetal, y la médula ósea son los lugares dé producción de IL-7. El receptor de la IL-7 consta de dos subunidades, CD127 y una cadena común (cadena gamma o cy) que es compartida por los receptores de IL-2, IL-4, IL-9, IL-15, y IL-21.

El CD127 también es conocido como receptor a de la IL-7 (IL-7Ra) y p90 IL-7R. El CD127 humano (número de acceso de Swiss Prot P 16871 ) tiene un total de 459 aminoácidos (20 en la secuencia señal). Comprende una región extracelular de 219 aminoácidos, una región transmembrana de 25 aminoácidos y una región intracelular de 195 aminoácidos. La numeración de los residuos dentro de CD127, como se usa en el presente documento (por ejemplo, para la descripción de los epítopos de anticuerpos) está basada en la proteína de longitud completa, incluyendo los residuos de la secuencia señal. CD127 puede existir en cuatro isoformas, la isoforma H20 (número de acceso de Swiss Prot P16871-1) tiene la siguiente secuencia de aminoácidos (incluyendo la secuencia señal): MTILGTTFGM VFSLLQVVSG ESGYAQNGDL EDAELDDYSF SCYSQLEVNG SQHSLTCAFE DPDVNTTNLE FEICGALVEV KCLNF KLQE IYFIETKKFL LIGKSNICVK VGEKSLTCK IDLTTIVKPE APFDLSVIYR EGANDFVVTF NTSHLQ KYV KVLMHDVAYR QEKDENKWTH VNLSSTKLTL LQRKLQPAAM YEIKVRSIPD HYFKGFWSEW SPSYYFRTPE INNSSGEMDP ILLTISILSF' FSVALLVILA CVLWKKRIKP IVWPSLPDHK KTLEHLCKKP RKNLNVSFNP ESFLDCQIHR VDDIQARDEV EGFLQDTFPQ QLEESEKQRL GGDVQSPNCP SEDVVVTPES FGRDSSLTCL AGNVSACDAP ILSSSRSLDC RESGKNGPHV YQDLLLSLGT TNSTLPPPFS LQSGILTLNP VAQGQPILTS LGSNQEEAYV TMSSFYQNQ (SEQ ID NO : 1) El C D 1 27 también se encuentra en el receptor de la linfopoyetina derivada del estroma tímico (TSLP) . El receptor de la TSLP es un heterodímero de CD 1 27 y el factor 2 similar al receptor de citoquinas (CRLF2).

La unión de la I L-7 al I L-7R activa múltiples vías de señalización incluyendo la activación de las JAK cinasas 1 y 3 que da lugar a la fosforilación y la activación de Stat5. Esta vía es crucial para la supervivencia de los precursores de células T que se desarrollan en el timo debido a que la activación de Stat5 es necesaria en la inducción de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 y en la prevención de que la proteína pro-apoptótica Bax entre en la mitocondria . Otra vía mediada por el IL-7R es la activación de la cinasa PI 3, que da como resultado la fosforilación de la proteína pro-apoptótica Bad y su retención en el citoplasma . El CD1 27 se expresa en células T en reposo y de memoria periféricas. El mecanismo de regulación de la IL-7 en la supervivencia y la homeostasis de las células T y la fuente de IL-7 en la periferia no se entienden completamente. Además, su potencial papel en la diferenciación y función de células T patógenas en enfermedades autoinmunitarias ha sido poco estudiado y es en su mayor parte desconocido. Existen unos pocos informes que sugieren que la IL-7 puede contribuir a la patogénesis de enfermedades autoinmunitarias.

El CD127 se ha descrito en el documento WO9015870 y los antagonistas de IL-7 y CD127 en el tratamiento de la esclerosis múltiple se han descrito en los documentos WO2006052660 y US20060198822. Los antagonistas de TSLP se han descrito en, por ejemplo, l,os documentos US7304144 y WO2007096149.

Breve descripción de la invención Los presentes inventores han mostrado que el antagonismo de IL-7/CD127 es eficaz en la mejoría de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE). El tratamiento da como resultado una marcada reducción de las células TH17 y, en un menor grado, de TH1 tanto en bazo como en médula espinal de ratones tratados, que estuvo acompañada de un nivel incrementado de Treg Foxp3+. Los inventores también han demostrado que se requiere críticamente la IL-7 para la expansión y sobrevivencia de las células TH17, pero qué su requerimiento durante la diferenciación de las células T precursoras en una población de células TH17 es mínimo.

La restauración del equilibrio de la relación funcional de células TH 7 y TH1 inflamatorias autorreactivas y Treg con un antagonista de CD127 o de IL-7 proporciona un gran potencial como terapia para la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunitarias.

La susceptibilidad selectiva de las células TH1 7 y TH 1 era atribuible a la expresión elevada de C D127 en células T patógenas activadas y su requerimiento de I L-7 para diferenciarse y sobrevivir. El bloqueo de CD1 27 da lugar a eventos de señalización alterada caracterizados por la reg ulación hacia abajo de JAK-1 fosforilada y STAT-5 y BCL-2 y la actividad incrementada de BAX, volviendo a las células TH 1 7 y TH1 CD127+ susceptibles a la apoptosis. En contraste, las células Treg Foxp3+ (Treg inducibles) eran resistentes al antagonismo de CD 1 27 puesto que no expresaban , o expresaban a niveles inferiores, CD 1 27. Los eventos de señalización, incluyendo las vías apoptóticas , aguas abajo a la interacción de IL-7/I L-7R no se vieron afectados en Treg Foxp3+ por una neutralización del anticuerpo anti-CD 1 27. Además, se observaron efectos similares del antagonismo de CD127 en la diferenciación y supervivencia de TH 1 7 y TH 1 humanas, que no afectan a Treg. Estos hallazgos proporcionan nuevas evidencias que apoyan el papel de la I L-7 en la diferenciación y el mantenimiento de células T patógenas y tienen implicaciones terapéuticas importantes en la MS y otras enfermedades autoinmunitarias humanas.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la invención , se proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad autoinmu nitaria o de un trastorno inflamatorio en u n sujeto humano, que comprende la administración al sujeto de u n antagonista de cuando menos una de: la expansión de TH 1 7 mediada por el receptor de la IL-7, y la sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-7.

La expansión y/o sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-17 se puede observar por un incremento o mantenimiento del conteo de células TH17, o por un incremento en la relación de los números de células TH17 comparándose con los números de otras células T CD4+, o más específicamente por un incremento en la relación TH17 : TH1, en la relación TH17 : Treg, en la relación (TH17 más TH1) : Treg, y/o en la relación TH17 : (TH1 más Treg).

Al nivel molecular, la expansión y/o sobrevivencia de TH17 se puede observar por un incremento en la producción de la IL-17 por una población de células T CD4+ (o por una población de células TH17). En una modalidad, por consiguiente, el antagonista de la expansión de TH17 mediada por el receptor de la IL-7 y/o de la sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-7 reduce la producción de la IL-17 por una población de células T CD4+. La expansión y sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-7 también se puede observar por un incremento en la producción de IFN-? por una población de células T CD4+ (o por una población de células TH17). Por consiguiente, en una modalidad, el antagonista de la presente invención inhibe la producción de IFN-? por una población de células T CD4+. A un nivel molecular, el antagonista de la expansión y/o sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-7, puede inhibir la fosforilación de STAT-5 mediada por el receptor de la IL-7.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o de un trastorno inflamatorio, que comprende la administración a un paciente de un antagonista de IL-7 o de CD127, en una cantidad suficiente para reducir el conteo de células TH17 en el paciente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano, el cual comprende administrar al sujeto un antagonista de la fosforilación de STAT-5 mediada por el receptor de la IL-7.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de esclerosis múltiple en un paciente, el cual comprende administrar un antagonista de IL-7 o CD127 a este paciente, en donde el paciente está padeciendo de esclerosis múltiple recidivante-remitente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto humano, el cual comprende administrar al sujeto un antagonista de la IL-7 o del IL-7R, en una cantidad efectiva para reducir la proporción de las células TH17 en relación con las células TH1.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria en un sujeto humano, el cual comprende administrar al sujeto un antagonista de la IL-7 o del IL-7R, en una cantidad efectiva para reducir la proporción de las células TH en relación con las células Treg (Foxp3+).

En una modalidad de los métodos anteriores, el antagonista se selecciona a partir del grupo que consiste en (a) una proteína de enlace que se enlaza específicamente a CD127 (SEQ ID NO: 1); (b) una proteína de enlace que se enlaza específicamente a IL-7, (c) un polipéptido CD127 soluble; y (d) una combinación de dos o más de los antagonistas mencionados.

En una modalidad, la proteína de enlace que se enlaza específicamente a CD127 o a IL-7 es un anticuerpo aislado humano, humanizado, o quimérico. En una modalidad, la proteína de enlace que se enlaza específicamente a CD127 (una proteína de enlace anti-CD127) es un anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo. En algunas modalidades, la proteína de enlace anti-CD127 inhibe la unión de la IL-7 al complejo del receptor IL-7R.

Ciertos anticuerpos anti-CD127 útiles en los métodos de la presente invención se describen en la presente, e incluyen 9B7, 6C5, 6A3, R34.34, GR34 y 1A11, las versiones humanizadas o quiméricas de los mismos, los análogos de los mismos, y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos.

En una modalidad, la proteína de enlace que se enlaza específicamente a la IL-7 (una proteína de enlace anti-IL-7) es un anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo quimérico, humanizado, o completamente humano, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que se une a CD127 y el cual es capaz de inhibir la expansión de TH17 mediada por la IL-7.

Los presentes inventores han determinado que las proteínas de enlace anti-CD127 no son uniformemente efectivas para neutralizar funcionalmente la vía de la IL-7 o la señalización mediada por el IL-7R. Por el contrario, existen ciertas regiones del polipéptido CD127 humano que parecen desempeñar una función importante en la vía de señalización, hasta el grado en que un anticuerpo que sea capaz de unirse a una o más de estas regiones del CD127 humano, sea en particular efectivo para neutralizar la vía de la IL-7 o la señalización mediada por el IL-7R. Estas regiones se definen mediante los residuos de aminoácidos: (i) 41 SCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPD 63 (SEQ ID NO: 117), (ii) ' 65 NTTNLEFEICGALVEV 80 (SEQ ID NO: 118), (iii) 84 NFRKLQEIYFIETKKFLLIGKS 105 (SEQ ID NO: 119), (iv) 148 VTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAY 169 (SEQ ID NO: 120), y (v) 202 EIKVRSIPDHYFKGFWSE 219 (SEQ ID NO: 121) de la SEQ ID NO: 1.

Se postula que estas regiones contienen aminoácidos que desempeñan una función en la interacción entre el ligando IL-7 y el receptor de CD127. Se cree que los siguientes aminoácidos son de un significado particular en la interacción de IL-7/CD127: (a) 51 SQH 53 (SEQ ID NO: 122), (b) 77 LVE 79 (SEQ ID NO: 123), (c) 97 KKFLLIG 103 (SEQ ID NO: 124), (d) 158 KY 159 (SEQ ID NO: 125), y (e) 212 YF 213 (SEQ ID NO: 126).

El enlace de más de una de estas regiones puede ser significativo en la inhibición de la función del IL-7R.

En una modalidad, las proteínas de enlace de antígeno son capaces de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de, o un aminoácido que flanquea o es vecino estructuralmente a, cuando menos una o una pluralidad de regiones (i) a (iv), como se definen anteriormente. En otra modalidad, las proteínas de enlace de antígeno son capaces de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de, o un aminoácido de cuando menos una de las regiones (a) a (e), como se definen anteriormente.

En una modalidad, la invención proporciona proteínas de enlace de antígeno que son capaces de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de una región definida por los residuos de aminoácidos 202 a 219 de la SEQ ID NO: 1. La proteína de enlace de antígeno, de acuerdo con esta modalidad, es capaz adicionalmente de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de uno, dos, tres o todas las cuatro de las regiones definidas por los residuos de aminoácidos (i) 41 a 63, (ii) 65 a 80, (iii) 84 a 105,. y (iv) 148 a 169 de la SEQ ID NO: 1.

En una modalidad, la proteína de enlace de antígeno se une a cuando menos un aminoácido dentro de una región definida por los aminoácidos (v) 202 a 219 de la SEQ ID NO: 1, y cuando menos un aminoácido dentro de una región definida por los aminoácidos (iv) 148 a 169 de la SEQ ID NO: 1. La proteína de enlace de antígeno de acuerdo con esta modalidad es capaz adicionalmente de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de una región definida por los aminoácidos (ii) 65 a 80 y/o (iii) 84 a 105 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular, la proteína de enlace de antígeno se une a cuando menos un aminoácido dentro de cada uno de los péptidos (ii) 65 a 80, (iii) 84 a 105, (iv) 148 a 169, y (v) 202 a 219 de la SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, la invención proporciona proteínas de enlace de antígeno que son capaces de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de una región definida por los residuos de aminoácidos (e) 212 a 213 de la SEQ ID NO: 1, o un aminoácido de flanqueo o estructuralmente vecino. La proteína de enlace de antígeno de acuerdo con esta modalidad es capaz adicionalmente de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de, flanqueando a, o estructuralmente vecino de, uno, dos, tres o todas las cuatro de las regiones definidas por los residuos de aminoácidos (a) 51 a 53, (b) 77 a 79, (c) 97 a 103 y (d) 158 a 159 de la SEQ ID NO: 1.

En una modalidad, la proteína de enlace se une a cuando menos un aminoácido dentro de una región definida por los aminoácidos (e) 212 a 213 de la SEQ ID NO: 1, o un aminoácido de flanqueo o estructuralmente vecino, y cuando menos un aminoácido dentro de, flanqueando a, o estructuralmente vecino de una región definida por los aminoácidos (d) 158 a 159 de la SEQ ID NO: 1. La proteína de enlace de acuerdo con esta modalidad es capaz adicionalmente de unirse a cuando menos un aminoácido dentro de, flanqueando a, o estructuralmente vecino de una región definida por los aminoácidos (b) 77 a 79 y/o (c) 97 a 103 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad particular, la proteína de enlace se une a cuando menos un aminoácido dentro de cada uno de los péptidos (b) 77 a 79, (c) 97 a 103, (d) 158 a 159, y (e) 212 a 213 de la SEQ ID NO: 1.

Los anticuerpos de acuerdo con estos aspectos de la invención incluyen 6A3, 1 A 11 , 6C5 y 9B7, los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, y las variantes quiméricas o humanizadas de los mismos. Los anticuerpos adicionales de estos aspectos de la invención son las variantes quiméricas o humanizadas de R3434 o GR34, o un fragmento de enlace de antígeno de R3434 o GR34.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico, o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento se une a un epítopo del CD127 humano que contiene cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la región que empieza en el residuo número 80 y que termina en el residuo número 190.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo del CD127 humano (SEQ ID NO: 1), en donde este epítopo tiene residuos de aminoácidos que están presentes en cuando menos una de las regiones de CD127 de las SEQ ID NOs: 20-28, 45-50, 67-70, 87-89, y 106-116. Este enlace se puede medir, entre otras cosas, mediante ELISA de péptidos, resonancia de plasmón superficial (BIAcore), o exhibición de fagos.

En las modalidades particulares, el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a un epítopo del CD127 humano (SEQ ID NO: 1), en donde este epítopo tiene residuos de aminoácidos que están presentes en: una, dos, tres o cuatro de las regiones de las SEQ ID NOs: 66-70; una, dos o tres de las regiones de CD127 de las SEQ ID NOs: 87-89; o una, dos o tres de las regiones de CD127 de las SEQ ID NOs: 114-116.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo del CD127 humano, en donde este epítopo tiene un residuo de aminoácido presente en cuando menos una de las siguientes regiones de CD127: 35-49 (SEQ ID NO: 20), 84-105 (SEQ ID NO: 21) 171-180 (SEQ ID NO: 22), o un anticuerpo o fragmento que se une a cuando menos uno de los siguientes péptidos lineales: 35-49 (SEQ ID NO: 20), 84-105 (SEQ ID NO: 21) 171-180 (SEQ ID NO: 22). Este enlace se puede medir, entre otras cosas, mediante ELISA de péptidos, resonancia de plasmón superficial (BIAcore), o exhibición de fagos. En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo del CD127 humano (SEQ ID NO: 1), teniendo el epítopo un residuo de aminoácido presente dentro de, o estando el epítopo presente dentro de, las siguientes regiones de CD127 (SEQ ID NO: 1): 80-94 (SEQ ID NO: 23), 95-109 (SEQ ID NO: 24), 170-184 (SEQ ID NO: 25). En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un epítopo del CD127 humano (SEQ ID NO: 1), teniendo el epítopo un residuo de aminoácido presente dentro de, o estando el epítopo presente dentro de, las siguientes regiones de CD127 (SEQ ID NO: 1): 35-49 (SEQ ID NO: 26), 84-105 (SEQ ID NO: 27), 139-184 (SEQ ID NO: 28).

En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un péptido CD127 biotinilado C-terminal que comprende los residuos 35-49, 84-105, 171-180 del CD127 como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, enlazándose este péptido a un chip sensor de estreptavidina. En otra modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo adicionalmente requiere de cuando menos un residuo de flanqueo o un residuo estructuralmente vecino de dicho cuando menos un residuo en las regiones 35-49, 84-105 ó 171-180 de CD127 para el enlace.

La persona experta en la materia puede identificar fácilmente estos anticuerpos o fragmentos de los mismos utilizando, por ejemplo, exploración del reemplazo de alanina en ensayos ELISA. En este aspecto, el hecho de que el anticuerpo requiera o no de un residuo en las regiones anteriormente definidas de CD127, o un residuo de flanqueo o estructuralmente vecino, para el enlace, se puede determinar sustituyendo independientemente este residuo de CD127 con alanina y comparando la afinidad de enlace del anticuerpo al péptido CD127 sustituido por alanina, con la afinidad de enlace del anticuerpo al CD127 de tipo silvestre. El hecho de que se requiera o no un residuo en las regiones anteriormente definidas de CD127 es definido por una reducción en la afinidad de enlace del anticuerpo al CD127 sustituido por alanina, comparándose con el CD127 de tipo silvestre, en donde esta reducción es mayor de 1, 2, 3, 4 ó 5 veces, como se determina mediante las mediciones de afinidad Biacore o ELISA.

Además, un residuo estructuralmente vecino, en este contexto, es un residuo que está en estrecha proximidad, en el espacio tridimensional, al residuo en cuestión, y el cual es enlazado por el anticuerpo. La persona experta en la materia aprecia que los epítopos del antígeno pueden ser secuencias de péptidos ya sea lineales o no lineales. En el último caso no lineal, aunque los residuos sean a partir de diferentes regiones de la cadena peptídica, pueden estar en estrecha proximidad en la estructura tridimensional del antígeno. Estos residuos estructuralmente vecinos se pueden determinar a través de programas de modelación por computadora o por medio de las estructuras tridimensionales obtenidas a través de los métodos conocidos en la técnica, tales como cristalografía de rayos-X.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos terapéuticos y los fragmentos de enlace de antígeno de los mismos que sean específicos para CD127, y que sean útiles en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios. Los anticuerpos y los fragmentos de enlacé de antígeno pueden inhibir la expansión y sobrevivencia de TH17 y/o pueden inhibir pSTAT-5, en un ensayo como aquél definido en la presente. Estos anticuerpos y los fragmentos de enlace de antígeno pueden representar al antagonista útil en los métodos de la invención.

De una manera más particular, en un aspecto, se proporciona un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno y/o derivado del mismo, que se une a CD127 y que comprende cuando menos una tercera CDR de cadena pesada (CDRH3) seleccionada a partir del grupo que consiste en: 9B7-CDRH3 (SEQ ID NO: 6); 6C5-CDRH3 (SEQ ID NO: 33), 6A3-CDRH3 (SEQ ID NO: 55) o 1A11-CDRH3 (SEQ ID NO: 75).

En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno y/o derivado del mismo, comprende la CDRH3 de: anticuerpo 9B7 (SEQ ID NO: 6), y una, dos, tres, cuatro, o todas las cinco CDRs adicionales de 9B7 (SEQ ID NOs: 4, 5, 7, 8, 9); anticuerpo 6C5 (SEQ ID NO: 33), y una, dos, tres, cuatro, o todas las cinco CDRs adicionales de 6C5 (SEQ ID NOs: 31, 32, 34, 35, 36); anticuerpo 6A3 (SEQ ID NO: 55), y una, dos, tres, cuatro, o todas las cinco CDRs adicionales de 6A3 (SEQ ID NOs: 53, 54, 56, 57, 58); o anticuerpo 1A11 (SEQ ID NO: 75), y una, dos, tres, cuatro, o todas las cinco CDRs adicionales de 1A11 (SEQ ID NOs: 73, 74, 76, 77, 78). En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo terapéutico, el cual es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno y/o derivado del mismo, que se une a CD127 y que comprende las siguientes CDRs, o los análogos de las mismas: A: CDRH1: RYNVH (SEQ ID NO: 4); CDRH2: MIWDGGSTDYNSALKS (SEQ ID NO : 5); CDRH3: NRYESG (SEQ ID NO: 6); CDRL1: KSSQSLLNSGNRKNYLT (SEQ ID NO: 7); CDRL2: WASTRES (SEQ ID NO: 8); CDRL3: QNDYTYPFTFGS (SEQ ID NO: 9).

B: CRDH1: AYWMS (SEQ ID NO: 31) CDRH2: EINPDSSTINCTPSLKD (SEQ ID NO: : 32) CDRH3: RLRPFWYFDVW (SEQ ID NO: 33) CDRL1: RSSQSIVQSNGNTYLE (SEQ ID NO: 34) CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 35) CDRL3: FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 36) C: CRDH1: TDYAWN (SEQ ID NO: 53) CDRH2: YIFYSGSTTYTPSLKS (SEQ ID NO: 54) CDRH3: GGYDVNYF (SEQ ID NO: 55) CDRL1: LASQTIGAWLA (SEQ ID NO: 56) CDRL2: AATRLAD (SEQ ID NO: 57) CDRL3: QQFFSTPWT (SEQ ID NO: 58) D: CDRH1: GYTMN (SEQ ID NO: 73) CDRH2: LINPYNGVTSYNQKFK (SEQ ID NO: 74) CDRH3: GDGNYWYF (SEQ ID NO: 75) CDRL1: SASSSVTYMHW (SEQ ID NO: 76) CDRL2: EISKLAS (SEQ ID NO.77) CDRL3: QEWNYPYTF (SEQ ID NO: 78).

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo terapéutico, el cual es un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico, o un fragmento de enlace de antígeno y/o derivado del mismo, que se une a CD127, y que comprende las siguientes CDRs, o los análogos de las mismas: CDRH1: GYTMN (SEQ ID NO: 92) CDRH2: LINPYSGITSYNQNFK (SEQ ID NO: 93) CDRH3: GDGNYWYF (SEQ ID NO: 94) CDRL1: SASSSVSYMHW (SEQ ID NO: 95) CDRL2: EISKLAS (SEQ ID NO: 96) CDRL3: QYWNYPYTF (SEQ ID NO: 97).

A través de toda esta memoria descriptiva, los términos "CDR", "CDRL1 ", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1 ", "CDRH2", "CDRH3" siguen el sistema de numeración de Kabat, como se estipula en Kabat y colaboradores; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987. Por consiguiente, lo siguiente define las CDRs de acuerdo con la invención: CDR Residuos CDRH1 31-35, 35(A), 35(B) CDRH2 50-65 CDRH3 95-97 CDRL1 24-34 CDRL2 50-56 CDRL3 80-97 En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo monoclonal, el cual comprende: (i) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 3; (ii) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; (iii) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; o , (iv) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 71 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72.

La presente invención también proporciona las secuencias de dominio variable de anticuerpos que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad, o cuando menos el 95 por ciento de identidad, o cuando menos el 98 por ciento de identidad, o cuando menos el 99 por ciento de identidad, sobre toda la longitud de las secuencias de las SEQ ID NOs: 2, 3, 29, 30, 51, 52, 71, y 72.

La invención también proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o un trastorno inflamatorio, el cual comprende administrar a un paciente un anticuerpo anti-CD127, en donde el anticuerpo comprende: (i) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 2 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 3; (i¡) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 29 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 30; (iii) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 51 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; (iv) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 71 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72; o (v) la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 90 y/o la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91, o un anticuerpo monoclonal que tiene regiones variables de la cadena pesada y ligera que tienen cuando menos el 90 por ciento de identidad, o cuando menos el 95 por ciento de identidad, o cuando menos el 98 por ciento de identidad, o cuando menos el 99 por ciento de identidad, con estas regiones variables de la cadena pesada y/o ligera.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, que se une a CD127, y el cual es capaz de inhibir la expansión de TH17 mediada por la IL-7, en donde el anticuerpo no es R.34.34 (Dendritics Inc., #DDX0700).

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para identificar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos adecuados para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria, cuyo método comprende los pasos de: rastrear una pluralidad de poblaciones de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos independientes para determinar la capacidad de cada población de anticuerpos para: i. inhibir la unión de IL-7 a IL-7R, íi. neutralizar la fosforilación de STAT-5 inducida por la IL- 7, y/o iii. inhibir la producción de IL-17 por parte de las células TH17, y seleccionar las poblaciones de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpos que sean capaces de inhibir la unión de IL-7 a IL-7R, de inhibir la fosforilación de STAT- 5 inducida por la IL-7, y/o de inhibir la producción de IL- 17 por parte de las células TH17 in vivo.

La capacidad de una composición o sustancia (un agente de prueba) para actuar como un antagonista de la expansión de TH17 mediada por el receptor de la IL-7, o la sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-7, o para reducir el conteo de células TH17, se puede determinar mediante los métodos de rutina. Por ejemplo, las células CD4+ puras se pueden estimular para diferenciarse en TH17 con las condiciones apropiadas conocidas por los expertos en este campo (por ejemplo, TGF-&1, IL-23, IL-6, anti-IFN-? y anti-IL-4, o IL-1 ß, IL-6 e IL-23). Entonces se puede exponer una población de células TH17 al agente de prueba e IL-7, en seguida de lo cual, se puede determinar el conteo de células H17.

U na dism inució n en las células TH1 7 en relación con un control indicaría que el agente de prueba es capaz de inhibir la expansión o sobrevivencia de TH 1 7.

En otro aspecto de la invención , se proporciona un método para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, comprendiendo el método formular un anticuerpo anti-CD 1 27 o anti-IL-7 o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, y uno o más excipientes, en una formulación farmacéuticamente aceptable. Este método puede comprender los pasos preliminares de identificar un anticuerpo, como se define anteriormente en la presente, y/o de prod ucir de una manera recombinante este anticuerpo.

En las definiciones de los epítopos de CD127 que son enlazados por las proteínas de enlace y los anticuerpos de la presente invención , el sistema de numeración utilizado se refiere a la secuencia de longitud completa de CD127, que incluye la secuencia de señal. En una modalidad , los epítopos del CD127 humano se encuentran dentro de los residuos citados de la SEQ I D NO: 1 .

En una modalidad , las proteínas de enlace de la presente invención se enlazan al CD 1 27 humano con una afinidad (KD) , que es menor de 20 nM , menor de 15 nM , menor de 10 nM , menor de 5 nM , menor de 1 n M, o menor de 0.5 n M , como se mide mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore) .

En una modalidad, la proteína de enlace inhibe de una manera competitiva la unión de 9B7, 6C5, 3A6, 1 A1 1 o R34.34 (Dend ritics Inc. #DDX0700), o un fragmento de enlace de antígeno del mismo, al CD127 humano. La inhibición competitiva puede ser determinada por los expertos en la materia, por ejemplo, en un ensayo ELISA de competencia, mediante análisis BIAcore o Scatchard.

En un aspecto de la presente invención, se proporcionan proteínas de enlace aisladas que compiten con: i. anticuerpo R34.34 (Dendritics lnc.,#DDX0700); ii. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 2 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 3; iii. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 29 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 30; iv. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 51 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 52; v. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 71 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 72; o vi. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 90 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 91 , para enlazarse a CD127, en donde el anticuerpo no es R.34.34 (Dendritics Inc., #DDX0700).

En una modalidad particular, la proteína de enlace aislada de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento de enlace de antígeno del mismo que compite con: i. anticuerpo R34.34 (Dendritics Inc., #DDX0700); ii. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 51 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 52; iii. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 71 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 72; o iv. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 90 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 91 , para enlazarse a CD127, en donde el anticuerpo no es R.34.34 (Dendritics Inc., #DDX0700).

La presente invención también proporciona proteínas de enlace para utilizarse en el tratamiento de esclerosis múltiple, en donde las proteínas de enlace compiten para enlazarse al CD127 humano (SEQ ID NO: 1) con: i. anticuerpo R34.34 (Dendritics Inc., #DDX0700); ii. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 2 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 3; iii. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 29 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 30; iv. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 51 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 52; v. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 71 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 72; o vi. un anticuerpo que tiene una región de cadena pesada variable como se estipula en la SEQ ID NO: 90 y una región de cadena ligera variable como se estipula en la SEQ ID NO: 91 , para enlazarse a CD127.

La persona experta en la materia aprecia que, con el objeto de que un anticuerpo o fragmento (anticuerpo o fragmento A) compita con el anticuerpo R34.34, GR34, 6A3, 1 A 11 , 6C5 ó 9B7 (anticuerpo B) por un sitio de enlace específico (del CD127 humano), el anticuerpo A debe estar presente en una cantidad suficiente para tener un efecto en este ensayo. Por ejemplo, el anticuerpo A y el anticuerpo B pueden estar presentes en cantidades equimolares. Si el anticuerpo A es un anticuerpo competidor, la presencia del anticuerpo A puede reducir la unión del anticuerpo B al CD127 humano en un ensayo ELISA por más del 10 por ciento, del 20 por ciento, del 30 por ciento, del 40 por ciento ó del 50 por ciento. Un anticuerpo competidor (anticuerpo A) puede reducir la unión del anticuerpo B al CD127 humano enlazado a la placa, mientras que un control específico que no sea anti-CD127 no podrá hacerlo. En estos ensayos ELISA, el CD127 humano se puede enlazar a una placa de inmunoensayo. En otro sistema de ensayo, se puede utilizar la resonancia de plasmón superficial para determinar la competencia entre los anticuerpos. Las proteínas de enlace aisladas que sean capaces de competir para enlazarse al CD127 con el anticuerpo R34.34 o con los anticuerpos de la invención, una proteina de enlace aislada que tenga una VH de la SEQ ID NO: 2 y una VL de la SEQ ID NO: 3, una proteína de enlace aislada que tenga una VH de la SEQ ID NO: 76 y una VL de la SEQ ID NO: 77, o una proteína de enlace aislada que tenga una VH de la SEQ ID NO: 193 y una VL de la SEQ ID NO: 194, se puede utilizar en el tratamiento de MS y de otras enfermedades autoinmunitarias.

Las proteínas de enlace de la presente invención pueden comprender las CDRs de R34.34, GR34, 9B7, 6A3, 1A11 o 6C5, o pueden comprender los análogos de las mismas.

La presente invención también proporciona anticuerpos humanizados, en donde las CDRs de R34.34, GR34, 9B7, 6A3, 1A11 o 6C5 (o los análogos de las mismas) se injertan en una estructura de dominio variable de cadena pesada o de cadena ligera.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica las proteínas de enlace de la presente invención. En particular, se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo, la cual comprende una o todas las regiones determinantes de complementariedad encontradas en 9B7 (SEQ ID NOs: 4-9), 6C5 (SEQ ID NOs: 31-36), 6A5 (SEQ ID NOs: 53-58), 1A11 (SEQ ID NOs: 73-78) o GR34 (SEQ ID NOs: 92-97). En un aspecto relacionado de la presente invención, se proporciona una célula huésped transfectada con los polinucleótidos de la presente invención.

Las proteínas de enlace, anticuerpos, fragmentos de enlace de antígeno, sus variantes humanizadas, humanas, o quiméricas, y los análogos, de la presente invención, se pueden utilizar en un método para el tratamiento de esclerosis múltiple, cuyo método comprende administrar una dosis segura y efectiva de las proteínas de enlace de la presente invención, a un paciente que lo necesite. En este aspecto de la presente invención, la proteína de enlace puede ser un anticuerpo que comprenda una o todas las regiones determinantes de complementariedad encontradas en 9B7 (SEQ ID NOs: 4-9), 6C5 (SEQ ID NOs: 31-36), 6A5 (SEQ ID NOs: 53-58), 1A11 (SEQ ID NOs: 73-78) o GR34 (SEQ ID NOs: 92-97).

También se proporciona en este aspecto de la presente invención, un método en donde el paciente que necesita tratamiento, es un paciente con MS recidivante/remitente (RRMS), quien está a punto de entrar en, o ya está en, una fase de recaída.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, el cual comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de la IL-7 o del IL-7R y un agente terapéutico adicional.

El agente terapéutico adicional se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en: inmunomoduladores, tales como interferón beta (IFNB-1a o IFNB-1b), y acetato de glatirámero, inmunosupresores, tales como ciclofosfamida, metotrexato, azatioprina, cladribina, ciclosporina y mitoxantrona, otras terapias inmunitarias, tales como inmunoglobulina intravenosa (IVIg), reemplazo de plasma, y sulfasalazina. El agente terapéutico adicional se puede administrar de una manera (dosificación, tiempo, mecanismo) como sea prescrita por un médico. En una modalidad, el agente terapéutico adicional se puede administrar de una manera simultánea o en secuencia, o por separado del antagonista de la presente invención. En una modalidad, el agente terapéutico adicional y el antagonista se administran de tal manera que se traslapen sus efectos farmacológicos sobre el paciente; en otras palabras, que ejerzan sus efectos biológicos sobre el paciente al mismo tiempo.

En otra modalidad de la invención, el antagonista de IL7/IL7R es un polipéptido CD127 soluble. El polipéptido CD127 soluble puede comprender un polipéptido que es el 90 por ciento o más idéntico a un polipéptido seleccionado a partir del dominio extracelular de CD127 (SEQ ID NO: 1), o un polipéptido comprendido de los aminoácidos 21 a 219 de la SEQ ID NO: 1. En ciertas modalidades, el CD127 soluble comprende un polipéptido de los aminoácidos 21-219 de la SEQ ID NO: 1. En las modalidades adicionales, el polipéptido CD127 soluble se puede fusionar con una fracción que no sea el CD127. La fracción que no sea el CD127 puede ser un péptido heterólogo fusionado con el polipéptido CD127 soluble. En una modalidad, la fracción que no sea el CD127 se selecciona a partir del grupo que consiste en albúmina de suero, una proteína de dirección, un fragmento de inmunoglobulina, una proteína reportera, o una proteína facilitadora de la purificación. En una modalidad particular, el polipéptido CD127 soluble se fusiona con una región Fe de una inmunoglobulina.

Breve descripción de las figuras La Figura 1(A) muestra la inhibición de pSTAT5 mediada por IL-7 por anticuerpos anti-CD127 de ratón; La Figura 1(B) muestra la inhibición de pSTAT5 mediada por TSLP por anticuerpos anti-CD127 de ratón; La Figura 2 muestra una curva de unión ELISA de CD127 para 9B7; La Figura 3 (A) muestra que el MAb 9B7 (línea continua) es capaz de reconocer el CD127 expresado en la superficie de la línea celular CHO transfectada con CD127. Se muestra un anticuerpo control del isotipo irrelevante en forma de línea de puntos; La Figura 3(B) muestra que el anticuerpo 9B7 (línea continua) es capaz de reconocer el CD127 expresado en la superficie de la línea celular CHO transfectada simulada. Se muestra un anticuerpo control del isotipo irrelevante en forma de línea de puntos; La Figura 4 muestra un ejemplo de inhibición de la señalización de pStat5 mediada por IL-7 por el mAb murino 9B7 anti-CD127 purificado; La Figura 5(A) muestra que la puntuación clínica MOG-EAE mejora con el anticuerpo de rata SB/14 anti-CD127 murino; La Figura 5(B) muestra la inhibición de la proliferación de células T inducida por el péptido MOG, mediante SB/14; La Figura 5(C) muestra la inhibición de la producción de citoquinas por el anticuerpo anti-CD127, mediante SB/14; Las Figuras 5(D) y 5(E) muestran el efecto selectivo del tratamiento con anticuerpo anti-mCD127 (SB/14) sobre subtipos de células T ayudantes; La Figura 5(F) muestra que la puntuación clínica MOG-EAE mejora mediante el tratamiento con el anticuerpo anti- mCD127 (SB/14); La Figura 6 muestra la expresión de CD127 en células Treg, TH1 y TH1 obtenidas ex vivo del bazo o la médula espinal de ratones con EAE; La Figura 7(A) muestra que el efecto de la IL-7 sobre la promoción de la diferenciación de TH17 fue modesto comparado con el de la IL-6; La Figura 7(B) muestra que la inducción de la fosforilación de STAT-3 es conducida en su mayor parte por la IL-6 independientemente de la IL-7; La Figura 7(C) muestra que el efecto de la IL-7 sobre la expresión de RORa también es modesto comparado con el de la IL-6; La Figura 7(D) muestra que el efecto del tratamiento con anticuerpo anti-mCD127 (SB/14) fue modesto durante el comienzo de la enfermedad en EAE; La Figura 8(A) muestra el porcentaje de células TH17, células TH1 que segregan interferón-?, y células Treg en el SNC; La Figura 8(B) muestra el porcentaje de células TH17, células TH1 que segregan interferón-?, y células Treg en esplenocitos; La Figura 8 (C) muestra el porcentaje de células TH17, TH1 y Treg en el transcurso de la EAE tanto en ratones tratados como en ratones control; La Figura 9 (A) muestra que el efecto de un anticuerpo anti-CD127 (SB/14) sobre los conteos de células TH17 y TH1, pero no de Treg, se inhibió cuando se añadió anticuerpo CD127 al comienzo de la diferenciación; La Figura 9(B) muestra un efecto similar del anticuerpo anti- mCD127 (SB/14) al de la Figura 9(A), pero sobre células TH17 diferenciadas, pero no sobre TH1 o Treg.

La Figura 10 muestra que la adición de IL-7 promovió la expansión/sobrevivencia de TH17 y, en un menor grado, de TH1, pero no de Foxp3 en Treg, cuando el día 9 se cultivaron células T específicas para MOG- EAE; La Figura 11(A) muestra un análisis de una inmunotransferencia de células T CD4+ obtenidas ex vivo de ratones con EAE tratados o control, que muestra que el tratamiento con anticuerpo anti-CD127 cambia las vías de señalización relacionadas con JAK-STAT y la apoptosis, siendo esto caracterizado por la regulación hacia abajo de la JAK-1 fosforilada y la STAT-5 fosforilada y niveles notablemente reducidos de una molécula pro-apoptótica clave, la BCL-2, y una actividad incrementada de una molécula anti-apoptótica, la BAX; La Figura 11 (B) muestra que el tratamiento con anticuerpo anti- CD127 incrementó el porcentaje de células apoptóticas Anexina-V+ entre células T CD4 + CD127+ comparado con el de células T CD4 + CD127- procedentes de ratones con EAE tratados; La Figura 11(C) muestra que células TH17 diferenciadas procedentes de ratones con EAE experimentan apoptosis de la que pueden ser rescatadas con 7, pero este proceso se hace más lento si las células son pre-incubadas con un anticuerpo anti- CD127; La Figura 11(D) muestra que los efectos de la IL-7 son mediados a través de la vía de la JAK/STS-5; La Figura 12 muestra que los mAb 9B7 y R34.34 tienen un efecto inhibidor sobre la diferenciación de TH17 a partir de células CD4+ totalmente humanas; La Figura 13 muestra la inhibición mediante el mAb 6C5, de la unión de CD127-ECD a IL-7 inmovilizada; La Figura 14 muestra que el mAb 6C5 compite con la IL-7 por la unión a CD127; La Figura 15 muestra que el mAb 6C5 compite con el anticuerpo R.34.34 de Dendritics por la unión a CD127; La Figura 16(A) muestra la inhibición mediante el mAb 6A3, de la unión de CD127-ECD a IL-7 inmovilizada; La Figura 16(B) muestra una curva de la relación de inhibición de los anticuerpos 6A3, 6C5, y R34.34 a diferentes concentraciones de anticuerpo, que muestra el efecto de estos anticuerpos sobre la unión de CD127-ECD a la IL-7; La Figura muestra que el mAb 6A3 compite con la IL-7 por la unión a CD127 expresada en células CHO; La Figura 18 muestra que el mAb 6C5 y el anticuerpo R.34.34 inhiben ambos la producción de IFNy por las PBMCs estimuladas con IL-7; La Figura 19 muestra la capacidad de los anticuerpos BD, R34.34, 1A11, y 6C5 para bloquear la señalización de Stat5 inducida por las PBMCs estimuladas con IL-7; La Figura 20 muestra la capacidad de los anticuerpos BD, R34.34, 1A11, y 6C5 para bloquear la señalización de Stat5 inducida por células CCF-CEM estimuladas con IL-7; La Figura 21 muestra la capacidad del mAb 6A3 para inhibir la producción de IL-17 e IFN-? en un ensayo de expansión de TH17; La Figura 22 muestra el efecto inhibitorio de diversos anticuerpos anti-CD127 sobre la producción de IL- 17 por células hCD4+ bajo la estimulación de IL-7; La Figura 23 muestra el efecto inhibitorio del mAb 6A3 sobre la producción de IFN-? y la producción de IL-17 por células TH17.

Descripción detallada de la invención La invención se basa en el descubrimiento de que la señalización de I L-7/I L-7R es absolutamente necesaria para la supervivencia y expansión de células TH1 7 comprometidas tanto en sistemas h umanos como de ratón, mientras que su papel en la diferenciación de TH1 7 no es esencial comparado con el de la I L-6. Sorprendentemente, el efecto in vivo sobre el sistema inmunitario por el antagonismo del IL-7R es altamente selectivo en EAE, un modelo animal para la esclerosis múltiple, afecta a células TH1 7 y, en un menor grado, a células TH1 predominantemente del fenotipo de memoria, y no afecta a células Treg. Esta selectividad parece desempeñar un papel importante en el ' restablecimiento de la relación de células TH1 7 patógenas y células Treg por el antagonismo del I L-7R en EAE y es atribuible a la eficacia del tratamiento. El nuevo mecanismo de acción de la señalización de I L-7/I L-7R en la supervivencia y expansión de células TH 1 7 como se ha descrito anteriormente proporciona una explicación sólida de la eficacia del tratamiento del antagonismo del IL-7R en EAE y las implicaciones terapéuticas para enfermedades autoinmunitarias humanas, tales como la MS. Es probable que la neutralización de la I L-7 o el antagonismo del I L-7R tengan ventajas terapéuticas únicas. Por una parte, el tratamiento ofrece la selectividad que disting ue células TH 1 y TH 1 7 patógenas de células Treg y células inmu nitarias no relacionadas. Por otra parte, las ventajas terapéuticas adicionales del antagonismo del I L-7R implican su efecto selectivo sobre la supervivencia y expansión de células ,TH17 diferenciadas en oposición a la diferenciación de TH17. Es concebible que la focalización del mantenimiento in vivo de células TH17 comprometidas frente a la diferenciación de TH1 sea más eficaz en un contexto terapéutico.

La inhibición de la señalización mediada por el receptor de la IL-7 proporciona así una intervención terapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias.

El término señalización mediada por el IL-7R, como se usa en el presente documento, significa el efecto biológico instigado por el complejo receptor de la IL-7 cuando se une a su ligando, la IL-7. Por tanto la señalización mediada por el IL-7R incluye, pero no está necesariamente limitado a, una o más, o todas, de la fosforilación de STAT-5 inducida por IL-7, la expansión de células TH17 inducida por IL-7 y la supervivencia de células TH17 inducida por IL-7.

Antagonistas Un antagonista de la vía de la IL-7, como se usa en el presente documento, es cualquier entidad que bloquea funcionalmente los efectos biológicos de la IL-7, medibles por ensayos. A nivel molecular, uno puede observar y medir el efecto del bloqueo mediante ensayos tales como P-STAT5 o Bcl-2 inducida por IL-7. Ensayos p-STAT5 ejemplares se describen en el presente documento. A nivel celular, uno puede observar y medir el efecto del bloqueo mediante ensayos tales como la secreción sobre células TH17 de IL-17 o IFNy. En el presente documento también se describen ensayos ejemplares.

Los antagonistas de la vía de IL-7/IL-7R útiles en la presente invención son capaces de inhibir, parcialmente o por completo, la fosforilación de STAT-5 inducida por IL-7. La fosforilación de STAT-5 se puede determinar mediante los métodos de rutina en este campo, por ejemplo, en un ensayo tal como se describe en la presente (Ejemplo 2.3). En este ensayo, las PBMCs se estimulan con IL-7 en la presencia y en ausencia de un agente de prueba. Las células subsiguientemente se evalúan cuantitativamente para determinar el nivel de pSTAT-5, por ejemplo, mediante teñido para pSTAT-5 (por ejemplo, con un anticuerpo anti-pSTAT-5 marcado), seguido por selección de células activada por la fluorescencia. Los niveles de STAT-5 fosforilada también se podrían determinar mediante ELISA. Los agentes que reducen el nivel de STAT-5 fosforilada pueden ser candidatos terapéuticos potenciales para la enfermedad autoinmunitaria.

El antagonista puede ser capaz de reducir los niveles de STAT-5 fosforilada por cuando menos el 20 por ciento, el 50 por ciento, el 75 por ciento, el 80 por ciento, el 85 por ciento, el 90 por ciento, el 95 por ciento ó el 100 por ciento, cuando se compara con los niveles de STAT-5 en ausencia del antagonista, o cuando se compara con un control negativo, o con células no tratadas. El antagonista puede tener una IC50 de 50 pg/ml, de 25 microgramos/ mililitro o menos, de 10 g ml o menos, de 5 pg/ml o menos, o de 2 pg/ml o menos. En una modalidad, el antagonista tiene una IC50 menor o igual a 1 microgramo/mililitro, menor o igual a 0.75 Mg/ml, menor o igual a 0.5 Mg/ml, menor o igual a 0.25 Mg/ml, o menor o igual a 0.1 Mg/ml.

Los antagonistas de la invención son particularmente efectivos para inhibir la expansión de las células TH17. La expansión de las células TH17 se puede determinar en un ensayo de expansión de células TH17, el cual comprende estimular a una población de células T para expandirse en la presencia y en ausencia de un agente de prueba, seguido por la estimulación de las células para producir IL-17, y evaluar el nivel de IL-17 producida por las células en la presencia y en ausencia del agente de prueba.

En una modalidad, el antagonista es capaz de inhibir el 20 por ciento o más la secreción de la IL-17 en este ensayo, contra un control negativo. Más típicamente, el antagonista es capaz de inhibir desde el 50 por ciento, desde el 75 por ciento, desde el 85 por ciento, o desde el 90 por ciento o más, la inhibición de la secreción de la IL-17 contra el control. En algunas modalidades, el antagonista puede exhibir una IC5o menor o igual a 50 Mg/ml en el ensayo. En otras modalidades, la IC50 puede ser menor o igual a 20 [iglm\, 10 Mg/ml ó 5 microgramos/ mililitro.

En una modalidad de este ensayo, las células T CD4+ humanas son diferenciadas en TH17 mediante la estimulación con la activación del receptor de células T en la presencia de IL-1, IL-6, e IL-23. Después de 5 días de diferenciación, las células CCR6+ se seleccionan para producir una población de TH17 enriquecida. Esta población se estimula entonces con la IL-7 humana, y se determina el incremento en IL-17 e IFN-? en el sobrenadante. El bloqueo de la interacción entre la IL-7 y CD127 mediante un antagonista de la vía de IL-7/IL-7R funcional (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD127) en el período de incubación, debe prevenir la expansión de las células TH17 que conduzca a la reducción de la producción de IL-17 e IFN-?.

En esta modalidad, las células T CD4+ se pueden aislar a partir de las células mononucleares de sangre periférica humanas utilizando un kit comercial (por ejemplo, el Kit de Aislamiento de Células T CD4+ II, # 130-091-155, Miltenyi Biotec). Las células T CD4+ entonces típicamente se vuelven a suspender en un medio RPMI con suero fetal de becerro (FCS) al 10 por ciento, en una concentración de 1.5 x 10E6 / mililitro. Las células se incuban previamente con el control o con los anticuerpos anti-IL-7RY, típicamente durante 30 minutos. Las células entonces se cultivan con o sin 10 nanogramos/mililitro de IL-7 durante 72 horas a 37°C. Al final de la incubación, las células se estimulan con 50 nanogramos/ mililitro de PMA y 1 microgramo/mililitro de lonomicina durante 5 horas. Entonces se recolectan los sobrenadantes del cultivo celular, y se determina la concentración de la IL-17 mediante un ELISA (eBiosciences).

Proteína de Unión Las proteínas de unión aisladas de la presente invención pueden estar en forma de anticuerpo o inmunoglobulina, tal como un anticuerpo intacto, un anticuerpo humano, humanizado o quimérico, o fragmentos o dominios de dichos anticuerpos. Estos anticuerpos de la presente invención pueden comprender una o más, o todas las CDRs encontradas en 9B7 (SEQ ID NOs: 4-9), en 6C5 (SEQ ID NOs: 78-83) o 6A5 (SEQ ID NOs: 53-58), 1A11 (SEQ ID NOs: 73-78), ó GR34 (SEQ ID NOs: 92-97).

Mediante "unión" en este contexto esencialmente significa que la proteína de unión, tal como un anticuerpo, se une a (un epítopo de) CD127 por medio de un dominio de unión de antígeno, y que la unión implica algo complementario entre el dominio de unión de antígeno y (el epítopo de) CD127. Una proteína de unión por consiguiente une al CD127 o un epítopo de CD127 más fácilmente de lo que se uniría a un polipéptido aleatorio no relacionado o a un epítopo aleatorio no relacionado. En otras palabras, hay especificidad entre la proteína de unión y (el epítopo de) CD127.

Las proteínas de unión de la invención también puede estar en la forma de un polipéptido CD127 soluble.

Las proteínas de unión de la presente invención se pueden unir a CD127, tal como un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CD127. Las proteínas de unión también pueden ser entidades que reducen la unión de TSLP al receptor de la TSLP, y también reducen la unión de la IL-7 al receptor de la IL-7, para el tratamiento de la esclerosis múltiple, tal como una proteína de unión biespecífica que se une a los ligandos IL-7 y TSLP, o elementos del IL-7R y TSLPR que producirían este efecto, o combinaciones de ligandos y receptores. En este aspecto, los antagonistas de la TSLP se describen en, por ejemplo, los documentos US7304144 y WO2007096149, y como se ha indicado anteriormente, el receptor de TSLP comprende al CD127. Los antagonistas de la presente invención por tanto pueden ser útiles como antagonistas de la TSLP. Aislado El término "aislado", como se usa en el presente documento, significa que las proteínas de unión son extraídas del entorno en el que se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, se pueden purificar de sustancias con las que normalmente coexisten en la naturaleza. Estas proteínas de unión pueden estar sustancialmente puras, en las que la masa de proteína en una muestra estará constituida de al menos el 50% o al menos el 80% de proteína de unión.

Competición Se dice que una proteína de unión inhibe competitivamente la unión de una proteína de unión de referencia a CD127, a un fragmento de CD127, o a un epítopo dentro de CD127, si si se enlaza preferencialmente a ese epítopo, hasta el grado en que bloquee, hasta algún grado, la unión de la proteína de unión de referencia a CD127, o a ese fragmento de CD127, o epítopo dentro de CD127. La inhibición competitiva se puede determinar mediante cualquier método conocido en la materia, por ejemplo, ensayos ELISA de competición, resonancia de plasmón superficial (BIAcore), o análisis de Scatchard. Se puede decir que una proteína de unión inhibe competitivamente la unión de una proteína de unión de referencia a un epítopo dado si la unión del anticuerpo de referencia se reduce por cuando menos el 90 por ciento, por cuando menos el 80 por ciento, por cuando menos el 70 por ciento, por cuando menos el 60 por ciento o por cuando menos el 50 por ciento.

Anticuerpos intactos Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser "anticuerpos intactos". Los anticuerpos intactos normalmente son glicoproteínas heteromultiméricas que comprenden al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Aparte de la IgM, los anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas de 150 kDa aproximadamente, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Normalmente, cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un puente disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas varía. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de una serie de regiones constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) y una región constante en su otro extremo; la región constante de la cadena ligera está alineada con la primera región constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de la mayoría de especies de vertebrados se pueden asignar a uno de los dos tipos denominados Kappa y Lambda basados en la secuencia de aminoácidos de la región constante. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos humanos se pueden asignar a cinco clases diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. La IgG e IgA se pueden subdividir adicionalmente en subclases, IgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4; e Ig A 1 e lgA2. Existen variantes de especies de ratones y de rata que tienen al menos lgG2a, lgG2b. El dominio variable del anticuerpo confiere especificidad de unión al anticuerpo con ciertas regiones que presentan una variabilidad particular denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs). Las porciones más conservadas de la región variable se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada comprenden cada uno cuatro FR conectadas por tres CDRs. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas muy próximas mediante las regiones FR y con las CDRs de la otra cadena contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los anticuerpos. Las regiones constantes no están directamente involucradas en la unión del anticuerpo al antígeno pero presentan diversas funciones efectoras tales como la participación en la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), fagocitosis a través de la unión al receptor FCY, semi-vida/tasa de aclaramiento a través del receptor Fe neonatal (FcRn) y citotoxicidad dependiente del complemento a través del componente C1q de la cascada del complemento. Se ha informado de que la región constante de la lgG2 humana carece esencialmente de la capacidad para activar el complemento por la vía clásica o para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Se ha informado de que la región constante de la lgG4 carece de la capacidad para activar el complemento por la vía clásica y media sólo débilmente en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos que carecen esencialmente de estas funciones efectoras se pueden denominar anticuerpos "no Uticos". Anticuerpos humanos Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser "anticuerpos humanos". Los anticuerpos humanos se puede producir por una serie de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia. Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante el procedimiento de hibridoma usando líneas celulares de mieloma humano o de heteromieloma de ratón-humano, véase, Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) y Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Los procedimientos alternativos incluyen el uso de librerías de fagos o ratones transgénicos, ambos que -utilizan repertorios de la región V humana (véase, Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12.433-455, Green LL (1999), J. Immunol. Methods 231, 11-23).

Ahora están disponibles varias razas de ratones transgénicos en las que sus loci de inmunoglobulina de ratón han sido sustituidos con segmentos génicos de inmunoglobulina humana (véase, Tomizuka K, (2000) PNAS 97.722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14.845-851, Méndez MJ, 1997, Nature Genetics, 15.146- 156). Tras la exposición al antígeno esos ratones son capaces de prod ucir un repertorio de anticuerpos h um anos entre los que se pueden seleccionar los anticuerpos de interés.

Se puede usar la tecnología de presentación de fagos para produci r anticuerpos h um anos (y sus fragmentos), véase M cCafferty ; N atu re , 348, 552-553 (1 990) y G riffiths AD y col . ( 1 994) EM BO 1 3: 3245-3260.

Anticuerpos quiméricos y humanizados Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser anticuerpos "quiméricos" o "humanizados". El uso de anticuerpos no humanos intactos en el tratamiento de enfermedades o trastornos humanos comporta los problemas ahora bien establecidos de inmunogenicidad potencial , especialmente tras la administración repetida del anticuerpo: esto es que el sistema inmunitario del paciente puede reconocer el anticuerpo intacto no humano como no propio y desplegar una respuesta de neutralización . Además del desarrollo de anticuerpos completamente humanos (véase anteriormente), a lo largo de los años se han desarrollado diversas técnicas para superar estos problemas y generalmente suponen la red ucción de la composición de secuencias de aminoácidos no huma nas en el anticuerpo terapéutico intacto mientras se mantiene la relativa facilidad de obtención de anticuerpos no humanos a partir de un animal inmunizado, por ejemplo, ratón , rata o conejo. Para conseg uir esto se han usado dos aproximaciones generales. La primera son anticuerpos quiméricos, que generalmente comprenden un dominio variable no humano (por ejemplo, de roedor tal como ratón) fusionado a una región constante humana. Debido a que el sitio de unión del antígeno de un anticuerpo está localizado dentro de las regiones variables, el anticuerpo quimérico conserva su afinidad de unión por el antígeno, pero adquiere las funciones efectoras de la región constante humana y por tanto es capaz de realizar funciones efectoras. Los anticuerpos quiméricos normalmente se producen usando procedimientos de ADN recombinante. El ADN que codifica los anticuerpos (por ejemplo, ADNc) se aisla y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las regiones variables de la cadena H y L del anticuerpo de la invención, por ejemplo, ADN de la SEQ ID NO: 2 y 3 descrito anteriormente). El ADN se puede modificar sustituyendo la secuencia codificante para las cadenas L y H por las regiones constantes H y L no humanas correspondientes (por ejemplo, murinas), véase por ejemplo, Morrison; PNAS 81, 6851 (1984). Así, en otra forma de realización de la invención se proporciona un anticuerpo quimérico que comprende un dominio VH que tiene la secuencia: SEQ ID NO: 2 y un dominio VL que tiene la secuencia: SEQ ID NO: 3 fusionados a una región constante humana (que puede ser de un isotipo IgG, por ejemplo, lgG1).

La segunda aproximación supone la generación de anticuerpos humanizados en los que se reduce el contenido no humano del anticuerpo humanizando las regiones variables. Dos técnicas para la humanización han ganado popularidad. La primera es la humanización mediante injerto de CDR. Las CDRs forman bucles cerca del N-término del anticuerpo donde forman una superficie montada en un soporte proporcionado por las regiones marco. La especificidad de unión del antígeno del anticuerpo está definida principalmente por la topografía y por las características químicas de la superficie de su CDR. Estas características, a su vez, están determinadas por la conformación de las CDRs individuales, por la disposición relativa de las CDRs, y por la naturaleza y disposición de las cadenas laterales de los residuos que comprenden las CDRs. Se puede conseguir una gran reducción en la inmunogenicidad insertando solamente las CDRs de un anticuerpo (anticuerpo "donante") no humano (por ejemplo, murino) sobre un marco humano adecuado ("marco aceptor") y regiones constantes (véase, Jones y col. (1986) Nature 321.522-525 y Verhoeyen M y col. (1988) Science 239, 1534-1536). No obstante, el injerto de CDRs per se puede no dar como resultado la retención completa de las propiedades de unión del antígeno y frecuentemente se encuentra que es necesario preservar algunos residuos del marco del anticuerpo donador (a veces denominados "retromutaciones") en la molécula humanizada si se tiene que recuperar una afinidad de unión del antígeno significativa (véase, Queen C y col. (1989) PNAS 86, 10.029-10.033, Co, y col. (1991) Nature 351, 501-502). En este caso, se pueden seleccionar las regiones V humanas que presentan la homología de secuencia más alta (normalmente del 60% o superior) al anticuerpo donador no humano de una base de datos para proporcionar el marco humano (FR). La selección de FRs humanas se puede realizar entre consensos humanos o anticuerpos humanos individuales. Cuando sea necesario se sustituyen residuos clave del anticuerpo donador en el marco aceptor humano para preservar los conformaciones de la CDR. Se puede usar modelización por ordenador para ayudar a identificar esos residuos estructuralmente importantes, véase el documento W099/48523.

Alternativamente, la humanización se puede conseguir mediante un proceso de "resuperficialización". Un análisis estadístico de las regiones variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulinas humanas y murinas únicas reveló que los patrones precisos de residuos expuestos son diferentes en anticuerpos humanos y murinos, y la mayoría de posiciones superficiales individuales tienen una gran preferencia por un pequeño número de residuos diferentes (véase, Padlan E.A. y col.; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 y Pedersen J.T. y col. (1994) J. Mol. Biol.235; 959-973). Por tanto, es posible reducir la inmunogenicidad de una Fv no humana sustituyendo los residuos expuestos en sus regiones marco que difieren de los encontrados normalmente en anticuerpos humanos. Debido a que la antigenicidad de la proteína se puede correlacionar con la accesibilidad superficial, la sustitución de residuos superficiales puede ser suficiente para volver la región variable de ratón "invisible" al sistema inmunitario humano (véase también, Mark G.E. y col. (1994) en Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp 105-134). Este procedimiento de humanización se denomina " resuperficialización" puesto que sólo se altera la superficie del anticuerpo, los residuos de soporte permanecen inalterados. Aproximaciones alternativas adicionales incluyen aquellas expuestas en el documento WO04/006955 y el procedimiento de Humaneering™ (Kalobios) que hace uso de sistemas de expresión bacterianos y produce anticuerpos que están próximos en secuencia a la línea germinal humana (Alfenito-Advancing Protein Therapeutics Enero 2007, San Diego, California).

Será evidente para los expertos en la materia que se pretende que el término "derivado" defina no sólo la fuente en el sentido de ser el origen físico del material, sino que defina también el material que es estructuralmente idéntico al material, pero que no tiene su origen en la fuente de referencia. Así "los residuos encontrados en el anticuerpo donador" no tienen porqué haber sido necesariamente purificados a partir del anticuerpo donador.

Por tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a anticuerpos humanos que comprenden una o más, o todas, las CDRs encontradas en el anticuerpo de ratón 9B7 (SEQ ID NOs: 4-9).

Anticuerpos multi o biespecíficos Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser anticuerpos "multiespecíficos" o "biespecíficos". Un anticuerpo multiespecífico o biespecífico es un derivado de un anticuerpo que evita o reduce la unión tanto de IL-7 como de TSLP a sus receptores, el a nticuerpo que tiene especificidades de unión por al menos dos prote ínas seleccionadas entre I L-7 , TS LP, CD 1 27 , la cadena gam ma de I L-7 R o C RLF2 , tam bién forma pa rte de la invención . La proteína de unión de la invención también puede tener especificidad de unión por I L-23, q ue se expresa en la superficie celular de las células TH 1 7, por ejemplo, la proteína de unión puede tener especificidad tanto por I L-23R (O I L-23) como por CD127 , o IL-2R (o IL-23) e IL-7.

Los procedimientos de preparación de esos anticuerpos son conocidos en la materia. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena H-cadena L de la inmunoglobulina, en la que las dos cadenas H tienen especificidades de unión diferentes, véase, Millstein y col . , Nature 305 537-539 ( 1983), documento WO93/08829 y Traunecker y col. EM BO, 10, 1 991 , 3655-3659. Debido a la colección aleatoria de cadenas H y L, se produce una mezcla potencial de 10 estructuras de anticuerpo diferentes de las cuales sólo una tiene la especificidad de unión deseada. Una aproximación alternativa supone la fusión de los dominios variables con las especificidades de unión deseadas a la región constante de la cadena pesada que comprende al menos parte de la región bisagra, las regiones C H2 y CH3. Se prefiere tener presente la región CH 1 que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera en al menos una de las fusiones. El ADN que codifica estas fusiones, y si se desea la cadena L, se inserta en vectores de expresión separados y a continuación se co-transfectan en un organismo hospedador adecuado. No obstante es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas en un vector de expresión. En una aproximación preferida, el anticuerpo biespecífico está compuesto de una cadena H con una primera especificidad de unión en un brazo y un par cadena H-L, que proporciona una segunda especificidad de unión al otro brazo, véase el documento WO94/04690. Véase también Suresh y col. Methods in Enzymology 121, 210, 1986.

Una aproximación potencial es producir un anticuerpo biespecífico o un fragmento biespecífico tal como se describe anteriormente en el que una primera especificidad es hacia un epítopo de la IL-7 y una segunda especificidad es hacia TSLP. Otra aproximación potencial es producir un anticuerpo biespecífico o un fragmento biespecífico tal como se describe anteriormente en el que una primera especificidad es hacia un epítopo de la IL-7 y una segunda especificidad es hacia la IL-6.

Fragmentos de anticuerpo Las proteínas de unión de la presente invención pueden ser "fragmentos de anticuerpo". En ciertas formas de realización de la invención se proporciona un anticuerpo terapéutico que es un fragmento de unión del antígeno. Tales fragmentos pueden ser fragmentos de unión del antígeno funcionales de anticuerpos intactos y/o humanizados y/o quiméricos tales como fragmentos de Fab, Fd, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv de los anticuerpos descritos anteriormente. Los fragmentos también pueden ser anticuerpos de dominio variable único humanos, de camello o de tiburón u otras especies, o construcciones más grandes que los comprenden. Los fragmentos que carecen de la región constante carecen de la capacidad para activar el complemento por la vía clásica o para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. Tradicionalmente estos fragmentos se producen por digestión proteolítica de anticuerpos intactos mediante, por ejemplo, digestión con papaína (véase, por ejemplo, el documento WO 94/29348) pero se pueden producir directamente a partir de células hospedadoras transformadas de manera recombinante. Para la producción de ScFv, véase Bird y col.; (1988) Science, 242, 423-426. Además, se pueden producir fragmentos de anticuerpo usando una variedad de técnicas de ingeniería genética como se describen a continuación.

Los fragmentos Fv parecen tener una energía de interacción de sus dos cadenas inferior a la de los fragmentos Fab. Para estabilizar la asociación de los dominios VH y VL, se han unido a péptidos (Bird y col., (1988) Science 242, 423-426, Huston y col., PNAS, 85, 5879-5883), a puentes disuifuro (Glockshuber y col., (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) y a mutaciones "botón en ojal" (Zhu y col. (1997), Protein Sci., 6, 781-788). Los fragmentos ScFv se pueden producir mediante procedimientos muy conocidos por aquellos expertos en la materia, véase, Whitlow y col. (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 y Huston y col. (1993) Int. Rev. Immunol 10, 195-217. Los ScFv se pueden producir en células bacterianas tales como E. coli, pero más habitualmente se producen en células eucariotas.

Una desventaja de los ScFv es la monovalencia del producto, que excluye una avidez incrementada debida a la unión polivalente, y a su corta semi-vida. Los intentos para superar estos problemas incluyen (ScFv')2 bivalentes producidos a partir de ScFV que contienen una cisteína C-terminal adicional por acoplamiento químico (Adams y col. (1993) Can. Res 53, 4026-4034 y McCartney y col. (1995) Protein Eng. 8, 301-314) o copolimerización espontánea específica de sitio de ScFv que contiene un residuo cisteína C-terminal desapareado (véase, Kipriyanov y col. (1995) Cell. Biophys 26, 187-204). Alternativamente, el ScFv se puede forzar a formar multímeros acortando el enlazador peptídico entre 3 y 12 residuos para formar "diacuerpos", véase, Holliger y col. PNAS (1993), 90, 6444-6448. La reducción del enlazador aún puede dar como resultado trímeros ("triacuerpos", véase, Kortt y col. (1997) Protein Eng, 10, 423-433) y tetrámeros de ScFV ("tetracuerpos", véase, Le Gall y col. (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). La construcción de moléculas ScFV divalentes también se puede conseguir por fusión genética con motivos de dimerización de proteínas para formar "minianticuerpos" (véase, Pack y col. (1992) Biochemistry 31, 1579- 1584) y "minicuerpos" (véase, Hu y col. (1996), Cáncer Res. 56, 3055-3061). También se pueden producir tándemes de ScFv-Sc-Fv ((ScFV)2) uniendo dos unidades ScFv mediante un tercer enlazador peptídico, véase Kurucz y col. (1995) J. Immol. 154, 4576-4582. Se pueden producir diacuerpos biespecíficos mediante la asociación no covalente de los productos de fusión de dos cadenas sencillas que consta n del dom i nio VH de u n anticuerpo conectado por un enlazador corto al dominio VL de otro anticuerpo, véase, Kipriyanov y col. (1 998) , I nt. J . Can 77.763-772. La estabilidad de esos diacuerpos biespecíficos se puede mejorar mediante la introducción de puentes disulfuro o mutaciones "botón en ojal" como se ha descrito anteriormente o mediante la formación de diacuerpos de cadena sencilla (ScDb) en los que los fragmentos ScFv híbridos están conectados a través de un enlazador peptídico, véase, Kontermann y col . ( 1 999) J . I mmunol. Methods 226 1 79-1 88. Moléculas biespecíficas tetravalentes están disponibles mediante, por ejemplo, fusión de un fragmento ScFv al dominio CH3 de una molécula IgG o a u n fragmento Fab a través de la región bisagra, véase, Coloma y col. ( 1 997) Nature Biotechnol. 1 5, 1 59-1 63. Alternativamente, se han creado moléculas biespecíficas tetravalentes mediante la fusión de diacuerpos de cadena sencilla biespecíficos (véase, Alt y col. , ( 1 999) FEBS Lett 454, 90-94). También se pueden formar moléculas biespecíficas tetravalentes más pequeñas mediante la dimerización de los tándemes ScFv-ScFv con un enlazador que contiene un motivo hélice-bucle-hélice (minianticuerpos DiBi, véase, Muller y col. (1 998) FEBS Lett 432 , 45-49) o una molécula de cadena sencilla que comprende cuatro dominios variables de un anticuerpo (VH y VL) en una orientación que evita el apareamiento intramolecular (diacuerpo en tándem , véase, Kipriyanov y col . , (1999) J . Mol. Biol. 293, 41 -56) . Se pueden crear fragmentos F(ab')2 biespecíficos por acoplamiento químico de fragmentos Fab' o por heterodimerización a través de cremalleras de leucina (véase, Shalaby y col., (1992) J. Exp. ed. 175, 217-225 y Kostelny y col. (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553). También están disponibles dominios VH y VL aislados, véanse las patentes de EE.UU. 6.248.516; 6.291.158; 6.172.197.

Otras modificaciones Las proteínas de unión de la presente invención pueden comprender otras modificaciones para mejorar o cambiar sus funciones efectoras. La interacción entre la región Fe de un anticuerpo y diversos receptores Fe (FcyR) se cree que media en las funciones efectoras del anticuerpo que incluyen la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la fijación del complemento, la fagocitosis y la semi-vida/aclaramiento del anticuerpo. Se pueden introducir diversas modificaciones en la región Fe de los anticuerpos de la invención dependiendo de la propiedad efectora deseada. En particular, las regiones constantes humanas que carecen esencialmente de las funciones de a) activación del complemento por la vía clásica; y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incluyen la región constante de lgG4, la región constante de lgG2 y las regiones constantes de lgG1 que contienen mutaciones específicas, como por ejemplo, mutaciones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y/o 322 descritas en los documentos EP0307434 (WO8807089), EP 0629 240 (WO9317105) y WO 2004/014953. Se han descrito por separado las mutaciones en los residuos 235 ó 237 dentro del dominio CH2 de la región constante de la cadena pesada (numeración de Kabat; sistema de indexado de la EU) para reducir la unión a FCYRI, FCYRII y la unión a FcyR 111 y por tanto reducen la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Duncan y col. Nature 1988, 332; 563-564; Lund y col. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel y col. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton y Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan y col., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh y col., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Además, algunos informes también han descrito la implicación de algunos de estos residuos en el reclutamiento o la mediación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) (Morgan y col., 1995; Xu y col., Cell. Immunol. 2000; 200: 16-26; Hezareh y col., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Los residuos 235 y 237 por tanto han sido ambos mutados a residuos de alanina (Brett y col. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew y col. Immunology 1995, 85; 41-48; y el documento W09958679) para reducir tanto los efectos mediados por el complemento como los efectos mediados por el FcyR. Los anticuerpos que comprenden estas regiones constantes se pueden denominar anticuerpos "no líticos".

Se puede incorporar al anticuerpo un receptor de reciclaje que se une al epítopo para incrementar la semi-vida sérica, véase, patente de EE.UU. 5.739.277.

Los receptores Fcy humanos incluyen FcyR (I), FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa y FcRn neonatal. Shields y col., (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604 demostraron que un grupo común de residuos lgG1 está involucrado en la unión a todos los FcyRs, mientras que FCYRII y FCYRIII utilizan sitios distintos fuera de este grupo común. Un grupo de residuos I g G 1 redujo la unión a todos los FCYRS cuando se altera con alanina: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 y Pro-239. Todos están en el dominio CH2 de IgG y agrupados cerca de la unión bisagra CH1 y CH2. Aunque FCYRI utiliza solamente el grupo común de residuos lgG1 para la unión, FCYRII y FCYRIII interactúan con residuos distintos además del grupo común. La alteración de algunos residuos redujo la unión sólo a FCYRII (por ejemplo, Arg-292) o FCYRIII (por ejemplo, Glu-293). Algunas variantes mostraron una unión mejorada a FcyRII o FcyRIII pero no afectaron a la unión al otro receptor (por ejemplo, Ser-267Ala mejoró la unión a FCYRII pero la unión a FCYRIII se mantuvo inalterada). Otras variantes presentaron una unión mejorada a FCYRII O FcyRIII con la reducción de la unión al otro receptor (por ejemplo, Ser-298Ala mejoró la unión a FCYRIII y redujo la unión a FcyRII). Para FcyRIIIa, las mejores variantes IgG 1 de unión presentaban sustituciones de alanina combinadas en Ser-298, Glu-333 y Lys-334. El receptor FcRn neonatal se cree que está involucrado en la protección de la degradación de las moléculas de IgG y así mejora la semi-vida sérica y la transcitosis a través de los tejidos (véase, Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 y Ghetie y col. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766). Los residuos IgG 1 humanos determinados para interactuar directamente con el FcRn humano incluyen Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435.

El anticuerpo terapéutico de la invención puede incorporar cualquiera de las modificaciones de la región constante anteriores.

En una forma de realización particular, el anticuerpo terapéutico carece esencialmente de las funciones de a) activación del complemento por la vía clásica; y b) mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. En una forma de realización más particular, la presente invención proporciona anticuerpos terapéuticos de la invención con uno cualquiera (o más) de los cambios de residuos detallados anteriormente para modificar la semi-vida/aclaramiento y/o funciones efectoras tales como la ADCC y/o la citotoxicidad dependiente del complemento y/o la lisis del complemento.

En un aspecto adicional de la presente invención, el anticuerpo terapéutico tiene una región constante del isotipo IgG 1 humano con sustituciones de alanina (u otra interrupción) en las posiciones 235 (por ejemplo, L235A) y 237 (por ejemplo, G237A) (numeración según el esquema EU presentado en Kabat).

Otros derivados de la invención incluyen variantes de glicosilación de los anticuerpos de la invención. La glicosilación de anticuerpos en posiciones conservadas en sus regiones constantes es conocida por tener un efecto profundo sobre la función de los anticuerpos, particularmente en el funcionamiento efector, tales como aquellos descritos anteriormente, véase por ejemplo, Boyd y col. (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Están contempladas las variantes de glicosilación de los anticuerpos terapéuticos de la presente invención en las que se añade, se sustituye , se elim ina o se m odifica u no o m ás restos ca rbohidrato.

Análogos En este contexto de la presente invención , también se proporcionan análogos de los anticuerpos descritos. Por consiguiente, la invención proporciona análogos de las CDRs de R34.34, GR34, 9B7, 6A3, 1 A1 1 o 6C5 (análogos de R34.34, análogos de GR34, análogos de 9B7 , análogos de 6A3, análogos de 1 A1 1 , o análogos de 6C5). Los análogos de un anticuerpo progenitor (por ejemplo, 6A3 o 9B7) tend rán propiedades funcionales iguales o similares a aquéllas que contienen las CDRs del anticuerpo progenitor, respectivamente, en que los anticuerpos análogos de 9B7 o los anticuerpos análogos de 6A3 se enlazan a la misma proteína o epítopo objetivo con una afinidad de enlace igual o similar. Los análogos pueden comprender una o más sustituciones de aminoácidos dentro de cada una o de todas sus CDRs, y en una modalidad , cuando menos el 75 por ciento o el 80 por ciento de los residuos de aminoácidos en las CDRs del anticuerpo progenitor quedan sin alteraciones, en otra modalidad , cuando menos el 90 por ciento de las CDRs quedan sin alteraciones, y en otra modalidad , cuando menos el 95 por ciento de los resid uos de aminoácidos en las CDRs quedan sin alteraciones. En otra modalidad, la CDR H3 del anticuerpo progenitor queda sin alteraciones en su totalidad , mientras q ue las otras CDRs pueden ser iguales a las CDRs del anticuerpo progenitor correspondiente, o pueden ser análogas de las m ism as .

Procedimientos de producción Las proteínas de unión de la presente invención se pueden producir mediante procedimientos conocidos por la persona experta en la materia . Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir en organismos transgénicos tales como cabras (véase, Pollock y col. (1 999), J . Immunol. Methods 231 : 147-1 57), gallinas (véase, Morrow KJJ (2000) Genet. Eng . News 20: 1 -55), ratones (véase, Pollock y col. ibid) o plantas (véase, Doran PM , (2000) Curr. Opinión Biotechnol . 1 1 , 199-204, Ma JK-C (1998) , Nat. Med . 4; 601 -606, Baez J y col . , BioPharm (2000) 1 3: 50-54, Stoger E y col. ; (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590). Los anticuerpos también se pueden producir mediante síntesis química. No obstante, los anticuerpos de la invención normalmente se producen usando tecnología de cultivos celulares recombinantes bien conocida por aquellos expertos en la materia. U n polinucleótido que codifica el anticuerpo se a isla y se inserta en un vector replicable tal como un plásmido, para su posterior propagación o expresión en una célula hospedadora . Un sistema de expresión útil es un sistema glutamato sintetasa (tal como el vendido por Lonza Biologics) , particularmente aq uél en el que la célula hospedadora es CHO o NSO (véase a continuación) . El polinucleótido que codifica el anticuerpo se aisla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, sondas de oligonucleótidos). Los vectores que se pueden usar incluyen plásmidos, virus, fagos, trasposones, m'inicromosomas de los cuales los plásmidos son una forma de realización típica. Generalmente esos vectores además incluyen una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y secuencias terminadoras de la transcripción unidas de manera operable al polinucleótido de la cadena pesada y/o ligera para así facilitar su expresión. El polinucleótido que codifica las cadenas ligera y pesada se puede insertar en vectores separados y se puede introducir (por ejemplo, por transformación, transfección, electroporación o transducción) en la misma célula hospedadora simultánea o secuencialmente o, si se desea, tanto la cadena pesada como la cadena ligera se pueden insertar en el mismo vector antes de la introducción.

Secuencias señal Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir en forma de proteínas de fusión con una secuencia señal heteróloga con un sitio de escisión específico en el N-término de la proteína madura. La secuencia señal debe ser reconocida y procesada por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas, la secuencia señal puede ser una fosfatase alcalina, penicilinasa, o secuencias líder de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción en levaduras las secuencias señal pueden ser una secuencia líder invertasa, la secuencia líder del factor a o las secuencias líder de la fosfatasa ácida de levaduras, véase, por ejemplo, el documento WO90/13646. En sistemas celulares de mamífero, están disponibles secuencias secretoras virales tales como la señal gD del herpes simple y la secuencia señal de la inmunoglobulina nativa (tal como la cadena pesada de Ig humana). Normalmente la secuencia señal está ligada en el marco de lectura al polinucleótido que codifica el anticuerpo de la invención.

Marcador de selección Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina o (b) complementan deficiencias auxótrofas o suministran nutrientes no disponibles en el medio complejo o (c) una combinación de ambas. El esquema de selección puede suponer la detención del crecimiento de las células hospedadoras que contienen vectores o que no contienen ningún vector. Las células, que se han transformado con éxito con los genes que codifican el anticuerpo terapéutico de la presente invención, sobreviven debido a, por ejemplo, resistencia a fármacos conferida por el marcador de selección co-administrado. Un ejemplo es el sistema de selección DHFR en el que los transformantes se generan en cepas hospedadoras DHFR negativas (por ejemplo, véase, Page y Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). En este sistema el gen DHFR se co-administra con secuencias de polinucleótidos del anticuerpo de la invención y a continuación se seleccionan células DHFR positivas mediante la retirada de nucleósidos. Si fuera necesario, también se emplea el inhibidor del DHFR, el metotrexato, para seleccionar los transformantes con amplificación del gen DHFR.

Uniendo de manera operable el gen DHFR a las secuencias que codifican el anticuerpo de la invención o a sus derivados funcionales, la amplificación del gen DHFR da como resultado la amplificación simultánea de las secuencias del anticuerpo deseado de interés. Las células CHO son una línea celular particularmente útil para esta selección de DHFR/metotrexato y los procedimientos de amplificación y selección de células hospedadoras usando el sistema DHFR están bien establecidos en la materia, véase, Kaufman R. J. y col. J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, para una revisión, véase, Werner RG, Noe W, Kopp K, Schluter M, "Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8): 870-80, Agosto 1998. Un ejemplo adicional es el sistema de expresión glutamato sintetasa (Bebbington y col. Biotechnology 1992 Vol 10 p169). Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trp1; véase, Stinchcomb y col. Nature 282, 38, 1979.

Promotores Los promotores adecuados para la expresión de anticuerpos de la invención están unidos de manera operable a ADN/polinucleótidos que codifican el anticuerpo. Los promotores para hospedadores procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, triptófano y promotores híbridos tales como Tac. Los promotores adecuados para la expresión células de levadura incluyen la 3-fosfogliceratocinasa u otras enzimas glicolíticas, por ejemplo, enolasa, gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenase, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa y glucocinasa. Los promotores de levaduras inducibles incluyen la alcohol deshidrogenase 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, la metalotioneína y las enzimas responsables del metabolismo del nitrógeno o de la utilización de maltosa/galactosa.

Los promotores para la expresión en sistemas celulares de mamífero incluyen promotores de la ARN polimerasa II incluyendo promotores víricos tales como polioma, virus de la viruela aviar y adenovirus (por ejemplo, adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (en particular, el promotor del gen temprano inmediato), retrovirus, virus de la hepatitis B, actina, promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y los promotores tempranos o tardíos del virus 40 de simio y promotores no víricos tales como EF-1a (Mizushima y Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17): 5322). La elección del promotor puede estar basada en la compatibilidad adecuada con la célula hospedadora usada para la expresión.

Elemento potenciador Cuando sea apropiado, por ejemplo, para la expresión en eucariotas superiores, se pueden incluir elementos potenciadores adicionales en lugar de o junto con aquellos encontrados localizados en los promotores descritos anteriormente. Las secuencias potenciadoras de mamífero adecuadas incluyen elementos potenciadores de globina, elastasa, albúmina, fetoproteína, metalotionina e insulina. Alternativamente, se puede usar un elemento potenciador de un virus de una célula eucariota tal como el potenciador de SV40, el potenciador promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma, el potenciador de baculovirus o el locus lgG2a murino (véase el documento WO04/009823). Aunque tales potenciadores normalmente están localizados en el vector en una posición aguas arriba del promotor, también pueden estar localizados en cualquier parte, por ejemplo, dentro de la región sin traducir o aguas abajo de la señal de poliadenilación. La elección y colocación del potenciador puede estar basada en la compatibilidad adecuada con la célula hospedadora usada para la expresión.

Poliadenilación/terminación En sistemas eucariotas, las señales de poliadenilación están unidas de manera operable al polinucleótido que codifica el anticuerpo de esta invención. Esas señales normalmente están situadas en 3' del marco abierto de lectura. En sistemas de mamíferos, ejemplos no limitantes de señales incluyen aquéllas derivadas de hormonas del crecimiento, factor de elongación 1a y genes víricos (por ejemplo, SV40) o repeticiones terminales largas retrovirales. En sistemas de levadura, ejemplos no limitantes de señales de poliadenilación/terminación incluyen aquéllas derivadas de los genes de la fosfoglicerato cinasa (PGK) y la alcohol deshidrogenase 1 (ADH). En sistemas procariotas, las señales de poliadenilación normalmente no son necesarias y en su lugar es habitual emplear secuencias terminadoras más cortas y más definidas. La elección de las secuencias de poliadenilación/ terminación puede estar basada en la compatibilidad adecuada con la célula hospedadora usada para la expresión.

Otros procedimientos/elementos para resultados mejorados Además de lo anterior, otras características que se pueden emplear para mejorar los resultados incluyen los elementos de remodelación de la cromatina, intrones y modificación del codón específico de la célula hospedadora. El uso del codón del anticuerpo de esta invención se puede modificar para acomodar la tendencia del codón de la célula hospedadora de manera que aumenta el rendimiento del transcrito y/o producto (por ejemplo, Hoekema A y col. Mol Cell Biol 1987 7(8): 2914-24). La elección de los codones puede estar basada en la compatibilidad adecuada con la célula hospedadora usada para la expresión.

Células hospedadoras Las células hospedadoras adecuadas para la clonación o la expresión de vectores que codifican los anticuerpos de la invención son células procariotas, de levaduras o eucariotas superiores. Las células procariotas adecuadas incluyen eubacterias, por ejemplo, enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. Coli (por ejemplo, ATCC 31.446; 31.537; 27.325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (véase, DD 266 710), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. De las células hospedadoras de levadu ra , también están contempladas hospedadores Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (por ejemplo, ATCC 16.045; 12.424; 24.178; 56.500) , Yarrowia (EP 402.226), Pichia pastoris (EP 1 83.070, véase también Peng y col. J . Biotechnol. 1 08 (2004) 185-1 92) , Candida, Trichoderma reesia (EP 244.234) , Penicillin, Tolypocladium y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Aunque las células hospedadoras procariotas y de levadura están específicamente contempladas por la invención , sin embargo normalmente, las células hospedadoras de la presente invención son células de vertebrados. Las células hospedadoras de vertebrados adecuadas incluyen células de mamífero tales como COS-1 (ATCC No. CRL 1 650) COS-7 (ATCC CRL 1651 ), línea de riñón embrionario humano 293, PerC6 (Crucell) , células de riñón de cría de hámster (BHK) (ATCC CRL.1632) , BHK570 (ATCC NO : CRL 10314) , 293 (ATCC NO. CRL 1573) , células de ovario de hámster chino CHO (por ejemplo, CHO-K1 , ATCC NO : CCL 61 , línea celular CHO DHFR- tales como DG44 (U rlaub y col . , Somat Cell Mol Genet ( 1986) Vol 1 2 pp 555-566), particularmente aquellas líneas celulares CHO adaptadas para el cultivo suspensión , células de Sertoli de ratón, células de riñón de mono, células de riñón de mono verde africano (ATCC CRL- 1 587), células HELA, células de riñón caninas (ATCC CCL 34) , células de pulmón humanas (ATCC CCL 75) , células Hep G2 y células de mieloma o linfoma , por ejemplo, NS0 (véase patente de EE.UU. 5.807.715), Sp2/0, YO.

Así, en una forma de realización de la invención se proporciona una célula hospedadora transformada de manera estable que comprende un vector que codifica una cadena pesada y/o una cadena ligera del anticuerpo terapéutico como se describe en el presente documento. Normalmente esas células hospedadoras comprenden un primer vector que codifica la cadena ligera y un segundo vector que codifica dicha cadena pesada.

Esas células hospedadoras también se pueden tratar por ingeniería genética o se pueden adaptar para modificar la calidad, función y/o rendimiento del anticuerpo de esta invención. Ejemplos no limitantes incluyen la expresión de enzimas modificantes específicas (por ejemplo, glicosilación) y chaperonas para el pliegue de proteínas.

Procedimientos de cultivo de células Las células hospedadoras transformadas con vectores que codifican los anticuerpos terapéuticos de la invención se pueden cultivar mediante cualquier procedimiento conocido por aquellos expertos en la materia. Las células hospedadoras se pueden cultivar en matraces de agitación, matraces agitados, botellas de cultivo rotatorias, reactores Wave (por ejemplo, el System 1000 de wavebiotech.com) o sistemas de fibras huecas pero se prefiere que para la producción a gran escala se usen reactores de tanque agitado o reactores Bag (por ejemplo, Wave Biotech, Somerset, Nueva Jersey EE.UU.) particularmente para cultivos en suspensión.

Normalmente los tanques agitados se adaptan para su aireación usando, por ejemplo, burbujeadores, deflectores o impulsores a baja cizalladura. Para las columnas de burbujeo y los termentadores de agitación por aire se puede usar la aireación directa con burbujas de aire o de oxígeno. Cuando las células hospedadoras se cultivan en un medio de cultivo exento de suero, éste se puede suplementar con un agente protector celular tal como Pluronic F-68 para ayudar a prevenir daños celulares como resultado del proceso de aireación. Dependiendo de las características de la célula hospedadora, se pueden usar microvehículos como sustratos de crecimiento para líneas celulares que dependen del anclaje o las células se pueden adaptar para el cultivo en suspensión (que es típico). El cultivo de las células hospedadoras, particularmente células hospedadoras de vertebrado puede utilizar una variedad de modos operativos tales como procesamiento en discontinuo, semicontinuo, discontinuo repetido (véase Drapeau y col. (1994) Cytotechnology 15: 103-109), proceso discontinuo extendido o cultivo por perfusión. Aunque las células hospedadoras de mamífero transformadas de manera recombinante se pueden cultivar en medio que contiene suero, ese medio que comprende suero fetal bovino (FCS), se prefiere que esas células hospedadoras se cultiven en medio exento de suero tal como se describe en Keen y col. (1995) Cytotechnology 17: 153-163, o un medio disponible comercialmente tal como ProCHO-CDM o UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), suplementado cuando sea necesario con una fuente de energía tal como glucosa y factores de crecimiento sintéticos tales como insulina recombinante. El cultivo libre de suero de células hospedadoras puede requerir que esas células se tengan que adaptar al crecimiento en condiciones exentas de suero. Una aproximación para esa adaptación es cultivar esas células hospedadoras en medio que contiene suero e intercambiar repetidamente el 80% del medio de cultivo por medio exento de suero de manera que las células hospedadoras aprendan a adaptarse a condiciones exentas de suero (véase, por ejemplo, Scharfenberg K y col. (1995) en Animal Cell technology: Developments towards the 21 st century (Beuvery E.C. y col. eds), pp 619-623, Kluwer Academic publishers).

Los anticuerpos de la invención segregados al medio se pueden recuperar y se pueden purificar del medio usando una variedad de técnicas para proporcionar un grado de purificación adecuado para su uso previsto. Por ejemplo, el uso de anticuerpos terapéuticos de la invención para el tratamiento de pacientes humanos normalmente asigna una pureza de al menos el 95% según se determina mediante SDS-PAGE reductora, más habitualmente una pureza del 98% o del 99%, cuando se compara con el medio de cultivo que comprende los anticuerpos terapéuticos. En el primer caso, los restos celulares normalmente se eliminan del medio de cultivo usando centrifugación, seguido de una etapa de clarificación del sobrenadante usando, por ejemplo, microfiltración, ultrafiltración y/o filtración en profundidad. Alternativamente, el anticuerpo se puede recoger por microfiltración, ultrafiltración o filtración en profundidad sin centrifugación previa. Están disponibles una variedad de otras técnicas tales como diálisis y electroforesis en gel y técnicas cromatográficas tales como hidroxiapatita (HA), cromatografía de afinidad (opcionalmente que incluye un sistema de mareaje por afinidad tal como polihistidina) y/o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, véase, patente de EE.UU. 5.429.746). En una forma de realización, los anticuerpos de la invención, siguen diversas etapas de clarificación, se capturan usando cromatografía de afinidad con proteína A o G, seguido por etapas de cromatografía adicionales tales como cromatografía de intercambio iónico y/o cromatografía HA, intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de exclusión molecular y precipitación en sulfato de amonio. Normalmente, también se emplean diversas etapas de eliminación de virus (por ejemplo, nanofiltración usando, por ejemplo, un filtro DV-20). Después de estas diversas etapas, se obtiene una preparación purificada (normalmente monoclonal) que comprende al menos 10 mg/ml o superior, por ejemplo, 100 mg/ml o superior del anticuerpo de la invención y forma por tanto una forma de realización de la invención. La concentración a 100 mg/ml o superior se puede generar por ultracentrifugación. De manera conveniente esas preparaciones están sustancialmente exentas de formas agregadas de anticuerpos de la invención.

Los sistemas bacterianos son particularmente adecuados para la expresión de fragmentos de anticuerpo. Tales fragmentos están localizados intracelularmente o dentro del periplasma. Las proteínas peri plasmáticas insolubles se pueden extraer y se pueden volver a plegar para form ar prote ínas activas según procedim ientos conocidos por aquellos expertos en la materia, véase , Sánchez y col . ( 1 999) J . Biotech nol . 72, 1 3-20 y C upit PM y col . ( 1 999) Lett Appl icrobiol, 29 , 273-277.

Composiciones farmacéuticas Las preparaciones purificadas de anticuerpos de la inve n ción (particularmente preparaciones monoclonales) como se describe anteriormente, se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos humanos tales como aquellos indicados anteriormente. Normalmente esas composiciones adicionalmente comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable (es decir, inerte) como es conocido y denominado por la práctica farmacéutica aceptable , véase, por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 1 6th ed, (1980) , Mack Publishing Co. Los ejemplos de esos veh ículos incluyen vehículos esterilizados tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, tamponadas con tampones adecuados tales como acetato sódico trihidratado a un pH farmacéuticamente aceptable, tal como un pH dentro de un intervalo de 5 a 8. Las composiciones farmacéuticas para inyección (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraportal) o para infusión continua están convenientemente exentas de materia particulada visible y pueden comprender entre 1 mg y 1 0 g de anticuerpo terapéutico, normalmente entre 5 mg y 1 g , más específicamente entre 5 mg de 25 mg o 50 mg de anticuerpo. Los procedimientos para la preparación de esas composiciones farmacéuticas son muy conocidos por aquellos expertos en la materia. En una forma de realización, las composiciones farmacéuticas comprenden entre 1 mg y 10 g de anticuerpos terapéuticos de la invención en formas de dosificación unitarias, opcionalmente junto con instrucciones para su uso. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar liofilizadas (desecadas y congeladas) para su reconstitución antes de la administración según procedimientos bien conocidos o evidentes para aquellos expertos en la materia. Cuando las formas de realización de la invención comprendan anticuerpos de la invención con un isotipo Ig G 1 , se puede añadir un quelante de iones metálicos, incluyendo cobre, tales como citrato (por ejemplo, citrato sódico) o EDTA o histidina, a la composición farmacéutica para reducir el grado de degradación de los anticuerpos de este isotipo mediada por metales, véase el documento EP0612251. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender un solubilízante tal como una base de arginina, un agente detergente/anti-agregante tal como Polisorbato 80, y un gas inerte tal como nitrógeno para sustituir el oxígeno del espacio de cabeza del vial.

Las dosis eficaces y los regímenes de tratamiento para la administración del anticuerpo de la invención en general se determinan empíricamente y dependen de factores tales como la edad, peso y estado de salud del paciente y enfermedad o trastorno a tratar. Tales factores están dentro del competencia del facultativo que atiende. Se puede encontrar consejo en la selección de las dosis apropiadas en, por ejemplo, Smith y col. (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, Nueva York.

Usos clínicos Los antagonistas de la presente invención se pueden usar en la terapia de la esclerosis múltiple y en otras enfermedades autoinmunitarias inflamatorias, particularmente aquéllas en las que están implicadas células TH17 patógenas. Tales enfermedades están asociadas a niveles de expresión elevados de IL-17. Se ha informado de niveles elevados de IL-17 en suero y CSF de pacientes con MS (Matusevicius, D. y col.; Mult. Scler. 5, 101-104; 1999) y en el fluido sinovial obtenido de pacientes con artritis reumatoide. La IL-17 también se ha implicado en la psoriasis (Homey y col.; J. Immunol. 164(12): 6621-32; 2000), mientras que Hamzaoui y col. han informado de niveles elevados de IL-17 en la enfermedad de Behcet (Scand. J. Rheumatol.; 31: 4, 205-210; 2002). También se han observado niveles elevados de IL-17 en lupus eritematoso sistémico (SLE) (Wong y col.; Lupus 9(8): 589-93; 2000).

La inhibición de la señalización mediada por el receptor de la IL-7 también puede ser útil en el tratamiento de enfermedades inflamatorias (no autoinmunitarias) en las que se ha implicado niveles elevados de IL-17, tal como asma.

Por consiguiente, las enfermedades inflamatorias y/o autoinmunitarias de la invención incluyen enfermedades inflamatorias de la piel incluyendo psoriasis y dermatitis atópica; esclerodermia sistémico y esclerosis; enfermedad inflamatoria del intestino (IBD); enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa; trastornos de reperfusión isquémica incluyendo lesión de reperfusión tisular quirúrgica, dolencias isquémicas de miocardio tales como infarto de miocardio, paro cardiaco, reperfusión después de cirugía cardiaca y constricción después de angioplastía coronaria transluminal percutánea, ictus, y aneurismas aórticos abdominales; edema cerebral secundario a ictus; traumatismo craneal, choque hipovolémico; asfixia; síndrome de distrés respiratorio del adulto; lesión pulmonar aguda; enfermedad de Behcet; dermatomiositis; polimiositis; esclerosis múltiple (MS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveítis; artrosis; lupus nefritis; enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide (RA), síndrome de Sjorgen, vasculitis; enfermedades que implican la diapedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), síndrome de lesión multiorgánica secundario a septicemia o traumatismo; hepatitis alcohólica; neumonía bacteriana; enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo incluyendo glomerulonefritis; sepsis; sarcoidosis; respuestas inmunopatológicas al trasplante de tejidos/órganos; inflamaciones del pulmón, incluyendo pleurisía, alveolitis, vasculitis, neumonía, bronquitis crónica, bronquiestasis, panbronquiolitis difusa, hipersensibilidad a neumonitis, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), y fibrosis cística; artritis psoriática; neuromielitis óptica, síndrome de Guillain-Barre (GBS), COPD, diabetes tipo 1, etc.

En particular, los antagonistas de la presente invención pueden ser útiles en la terapia de la esclerosis múltiple, en todas sus formas, incluyendo la neuromielitis óptica. Se predice que el tratamiento con un antagonista de la presente invención será más eficaz cuando se administre en el contexto de una enfermedad inflamatoria activa, es decir, cuando se usa en el tratamiento del síndrome clínicamente aislado o formas de recaída de la MS. Estas fases de la enfermedad se pueden definir clínicamente y/o mediante criterios de toma de imágenes tales como contraste con gadolinio u otras técnicas más sensibles, y/o otros biomarcadores aún sin definir de la enfermedad activa. Particularmente, los antagonistas de la invención se pueden usar para tratar la RRMS (mediante administración intravenosa, subcutánea, oral o intramuscular) cuando los pacientes están entrando o están en fase de recaída.

El uso de biomarcadores tales como la expresión de CD127 y la tinción de citoquinas intracelulares (por ejemplo, tinción de IL-17) proporciona los criterios para la aplicación de la proteína de unión anti-CD127 terapéutica. Un subgrupo de pacientes con MS con TH17 incrementadas en sus células T CD4+ son candidatos primarios para el tratamiento. En una forma de realización los procedimientos de tratamiento de la presente invención son procedimientos para tratar aquellos pacientes que expresan niveles elevados de CD127 en sus células T, haciéndolos susceptibles al tratamiento con anti-CD127. El tratamiento con anti-CD127 probablemente puede acortar el tiempo de recaída y acelerar la atenuación de las actividades clínicas medibles mediante EDSS o MRI. Una vez que los pacientes entran en remisión, el tratamiento se puede detener para evitar complicaciones tales como la inhibición del desarrollo y la homeostasis de las células T normales. El uso del anticuerpo anti-CD127 también puede prolongar el período entre recaídas y mejorar la calidad de vida del paciente.

A menos que se definen de otra manera, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente tienen el mismo significado que es comúnmente empleado y entendido por los expertos ordinarios en este campo.

Los ejemplos y los materiales utilizados en la presente son solamente para propósitos de ilustración y no pretenden ser limitantes.

B7 CDR H3 6 9B7 CDR L1 7 9B7 CDR L2 8 9B7 CDR L3 9 Epítopo de SB/14 (171-187 de CD127 de ratón) 10 Epítopo de A7R34 (80-95 de CD127 de ratón) 11 9B7 secuencia FR1 de la cadena pesada 12 9B7 secuencia FR2 de la cadena pesada 13 9B7 secuencia FR3 de la cadena pesada 14 9B7 secuencia FR4 de la cadena pesada 15 9B7 secuencia FR1 de la cadena ligera 16 9B7 secuencia FR2 de la cadena ligera 17 9B7 secuencia FR3 de la cadena ligera 18 9B7 secuencia FR4 de la cadena ligera 19 9B7 epítopo por ELISA de péptidos 20 9B7 epítopo por ELISA de péptidos 21 9B7 epítopo por ELISA de péptidos 22 B7 región 1 del epítopo del fago 23 B7 región 2 del epítopo del fago 24 9B7 región 3 del epítopo del fago 25 9B7 región 1 del epítopo consenso 26 9B7 región 2 del epítopo consenso 27 9B7 región 3 del epítopo consenso 28 6C5 región variable de la cadena pesada 29 6C5 región variable de la cadena ligera 30 6C5 CDR H1 31 6C5 CDR H2 32 6C5 CDR H3 33 6C5 CDR L1 34 6C5 CDR L2 35 6C5 CDR L3 36 6C5 secuencia FR1 de la cadena pesada 37 6C5 secuencia FR2 de la cadena pesada 38 6C5 secuencia FR3 de la cadena pesada 39 C5 secuencia FR4 de la cadena pesada 40 C5 secuencia FR1 de la cadena ligera 41 6C5 secuencia FR2 de la cadena ligera 42 6C5 secuencia FR3 de la cadena ligera 43 6C5 secuencia FR4 de la cadena ligera 44 6C5 epítopo por BIAcore 45 6C5 región 1 del epítopo del fago 46 6C5 región 2 del epítopo del fago 47 6C5 región 1 del epítopo consenso 48 6C5 región 2 del epítopo consenso 49 6C5 región 3 del epítopo consenso 50 6A3 región variable de la cadena pesada 51 6A3 región variable de la cadena ligera 52 6A3 CDR H1 53 6A3 CDR H2 54 6A3 CDR H3 55 6A3 CDR L1 56 A3 CDR L2 57 A3 CDR L3 58 6A3 secuencia FR1 de la cadena pesada 59 6A3 secuencia FR2 de la cadena pesada 60 6A3 secuencia FR3 de la cadena pesada 61 6A3 secuencia FR4 de la cadena pesada 62 6A3 secuencia FR1 de la cadena ligera 63 6A3 secuencia FR2 de la cadena ligera 64 6A3 secuencia FR3 de la cadena ligera 65 6A3 secuencia FR4 de la cadena ligera 66 6A3 región 1 del epítopo del fago 67 6A3 región 2 del epítopo del fago 68 6A3 región 3 del epítopo del fago 69 6A3 región 4 del epítopo del fago 70 1A11 región variable de la cadena pesada 71 1A11 región variable de la cadena ligera 72 1A11 CDR H1 73 A11 CDR H2 74 A11 CDR H3 75 1A11 CDR L1 76 1A11 CDR L2 77 1A11 CDR L3 78 1 A 11 secuencia FR1 de la cadena pesada 79 1A11 secuencia FR2 de la cadena pesada 80 1A11 secuencia FR3 de la cadena pesada 81 1 A 11 secuencia FR4 de la cadena pesada 82 1A11 secuencia FR1 de la cadena ligera 83 1A11 secuencia FR2 de la cadena ligera 84 1A11 secuencia FR3 de la cadena ligera 85 1A11 secuencia FR4 de la cadena ligera 86 1 A 11 región 1 del epítopo del fago 87 1 A 11 región 2 del epítopo del fago 88 1A11 región 3 del epítopo del fago 89 GR34 región variable de la cadena pesada 90 GR34 región variable de la cadena ligera 91 GR34 CDR H1 92 GR34 CDR H2 93 GR34 CDR H3 94 GR34 CDR L1 95 GR34 CDR L2 96 GR34 CDR L3 97 GR34 secuencia FR1 de la cadena pesada 98 GR34 secuencia FR2 de la cadena pesada 99 GR34 secuencia FR3 de la cadena pesada 100 GR34 secuencia FR4 de la cadena pesada 101 GR34 secuencia FR1 de la cadena ligera 102 GR34 secuencia FR2 de la cadena ligera 103 GR34 secuencia FR3 de la cadena ligera 104 GR34 secuencia FR4 de la cadena ligera 105 R.34.34 región 1 del epítopo por BIAcore 106 R.34.34 región 2 del epítopo por BIAcore 107 R.34.34 región 3 del epítopo por BIAcore 108 R.34.34 región 4 del epítopo por BIAcore 109 R.34.34 región 5 del epítopo por BIAcore 110 R.34.34 región 1 del epítopo del fago 111 R.34.34 región 2 del epítopo del fago 112 R.34.34 región 3 del epítopo del fago 113 R.34.34 región 1 del epítopo consenso 114 R.34.34 región 2 del epítopo consenso 115 R.34.34 región 3 del epítopo consenso 116 CD127 región 1 del epítopo 117 CD127 región 2 del epítopo 118 CD127 región 3 del epítopo 119 CD127 región 4 del epítopo 120 CD127 región 5 del epítopo 121 CD127 región 1a del epítopo 122 CD127 región 2a del epítopo 123 CD127 región 3a del epítopo 124 CD127 región 4a del epítopo 125 CD127 región 5a del epítopo 126 Ejemplo 1: Caracterización de anticuerpos monoclonales que se unen a CD127 de ratón Procedimientos 1.1 Evaluación de anticuerpos de ratón para CD127 de ratón disponibles comercialmente usando FACS en un ensayo de detección de pStat5 En este ejemplo, identificamos anticuerpos anti-CD127 de ratón disponibles comercialmente que inhiben la fosforilación de Stat5 inducida por IL-7 (pStat5). Resumiendo, se prepararon esplenocitos a partir de bazos de ratón C57B/6 mediante un protocolo estándar; a continuación se purificaron células T CD4+ a partir de los esplenocitos usando un kit de aislamiento magnético Miltenyi (Cat# 130-049-201); primero se incubó 1 millón de células T CD4+ por mi con los anticuerpos indicados y concentraciones como se muestran en la figura a continuación durante 30 minutos a 37°C; los anticuerpos usados fueron lgG2a control de rata (#553926) de BD Biosciences, anti-CD127 (Clone SB/14, #550426) de BD Biosciences, anti-CD127 (Clone: A7R34, #16-1271) de eBiosciences, anti-CD127 (Clone SB199, #ab36428) de Abcam, anti-CD127 (MAB7471 y 7472) de R&D; a continuación las células se dejaron sin tratar o se trataron con 1 ng/ml de IL-7 de ratón durante 60 minutos a 37°C; las células se recogieron y se pusieron inmediatamente en hielo después del tratamiento con IL-7; a continuación las células se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo y se fijaron en paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a 37°C; las células se lavaron con PBS y se incubaron con 500 µ? de metanol/PBS al 90% durante 30 minutos en hielo; las células se lavaron de nuevo en PBS y los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 µ? de PBS; las células se tiñeron con 5 µ? de anticuerpo anti-pStat5-Alexa Fluor 647 (BD Biosciences, #612599) durante 1 h a temperatura ambiente en oscuridad; a continuación las células se lavaron dos veces con PBS y se analizaron por citometría de flujo con una máquina Facscalibur de BD Biosciences según las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan en la Figura 1.

En las gráficas, se representaron el número de células frente a la intensidad media de la fluorescencia (MFI) de pStat5 intracelular. Los histogramas rojos mostraban la MFI de células T CD4+ sin tratar. El tratamiento con IL-7 desplazó la MFI hacia la derecha y las células con pStat5 incrementada estaban definidas por el paso apropiado como se muestra mediante la barra en el histograma. La IgG control no inhibió a pStat5. No obstante, A7R34 inhibió fuertemente a pStat5. El clon del anticuerpo SB/14 también mostró inhibición aunque no fue tan fuerte como A7R34. El clon abcam SB199 y los anticuerpos de los sistemas R&D sólo pudieron inhibir parcialmente Stat5-p a concentraciones elevadas.

También se probó el SB/14 para determinar su inhibición de la expansión impulsada por IL-7 de TH17 diferenciadas in vitro. Se indujo encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en los ratones mediante la inmunización de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) como se describe en el Ejemplo 3 más adelante. Las células T CD4+ se cosecharon a partir de los bazos o los ganglios linfáticos de los ratones con EAE, y se cultivaron in vitro en ausencia o en la presencia de la IL-7 durante 3 días. Como se muestra en la Figura 11C, la IL-7 promovió la expansión de las células TH17, detectable mediante teñido intracelular de la IL-17. El anticuerpo SB/14 contra el IL-7Ra de ratón, pero no contra una IgG de control, inhibió la expansión impulsada por IL-7 de las células TH17.

Los anticuerpos también se probaron para determinar la inhibición de la pStat5 mediada por TSLP en timocitos de ratón. Las células CD4- en timocitos expresaban receptores TSLP funcionales y se controla en el análisis FACS. Como se muestra en la Figura 1B, la pStat5 inducida por IL-7 e inducida por TSLP se inhibió con SB/14 (BD) y A7R34 (eBio). Por tanto, los anticuerpos contra CD127 de ratón (SB/14 y A7R34) inhibieron tanto la señalización mediada por IL-7 como la señalización mediada por TSLP. 1.2 Identificación del epítopo por ELISA de péptidos Se sintetizaron 15-meros con 7 péptidos solapados de IL-7RECD de ratón por la Shanghai Science peptide Biology Technology, y por la GL Biochem (Shanghai) Ltd. Todos los péptidos se prepararon mediante síntesis de péptidos en fase sólida en flujo continuo. A continuación los péptidos se biotinilaron en el N-término del péptido con un espaciador Acp entre el péptido y el resto biotina , es deci r, bioti na-Acp-péptido.

Los pocilios de u na placa de 96 pocilios con 1 00 µ? de 1 g/m l de cada anticuerpo de ratón en tam pón carbonato (N a2C03 15 mM , NaHC03 35 mM , 0,2 g/l de NaN3, a pH 9,6) se cubrieron durante toda la noche a 4°C . El día siguiente de la placa se lavó tres veces con 200 µ?/pocillo de tampón de lavado (1 X PBS que contiene Tween 20 al 0,05%) y 200 µ?/pocillo de tampón de bloqueo (10 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA) en PBS y se incubó durante 1 h a 37°C . Después de lavar la placa tres veces, se aplicaron 1 00 µ? de 2 Mg/ml de péptido biotinilado sintético a 37°C durante 1 hora . Con los tres lavados, se añadieron 1 00 µ?/pocillo de H RP-SA diluido 1 /2000 y se incubó a 37°C d urante 30 minutos. Se usó 100 µ?/pocillo de disolución sustrato TMB después de cinco lavados. La incubación fue de 2 a 5 minutos a temperatura ambiente antes de detenerla con HCI 2 N . Se leyó la placa a 450 nm con un lector de placas de resolución temporal apropiado. 1 .3 Predicción de epítopos mediante ciclos de selección de fagos por afinidad por presentación de péptidos fágicos Se han usado librerías de péptidos aleatorios presentados sobre el bacteriófago filamentoso M 1 3 como herramienta para mapear los epítopos de anticuerpos monoclonales (Scott y Smith , 1 990, Searching for peptide ligands with an epitope library, Science, 249: 386-390). Hemos usado una librería comercial de péptidos aleatoria presentada en fagos y una librería de elaboración propia de péptidos aleatoria presentada en fagos para identificar los péptidos fágicos que se unen al anticuerpo de ratón. Se emplearon secuencias consenso o mimótopos de los péptidos presentados en fagos enriquecidos procedentes de péptidos fágicos identificados para predecir posibles epítopos del anticuerpo de ratón (mimótopos de péptidos fágicos: sitio de interacción del anticuerpo sobre la superficie del antígeno mimetizado por el péptido fágico o una mimetización de un epítopo) (Geysen y col., 1986, A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol., 23: 709-715; Luzzago y col., 1993, Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed peptides, I. Epitope mapping of human H ferritin using a phage library of constrained peptides, Gene, 128: 51-57). Los mimótopos de péptidos fágicos identificados a partir de 2 librerías aleatorias predijeron 2 posibles epítopos discontinuos del anticuerpo de ratón.

Librerías de péptidos aleatorios 1. Librería de péptidos aleatorios presentados en el fago Ph.D-12 (de New England Biolabs Inc., #E8110S) 2. Librería de péptidos aleatorios presentados en el fago fGWXIO (librería GSK de elaboración propia) Procedimiento de ciclos de selección de fagos por afinidad usando la librería de péptidos aleatorios presentados en el fago Ph.D-12 Los ciclos de selección de fagos por afinidad de una librería de péptidos aleatorios presentados en el fago Ph.D-12 frente a mAb 9B7 inmovilizado se llevó a cabo esencialmente seg ú n el manual de instrucciones del fa bricante . Resumiendo: 1 ) Recu brir con 1 00 Mg/m l de cada anticuerpo de ratón (en N aH C03 0, 1 M, pH 8,6) el pocilio de la placa de 1 2 pocilios e incubar durante toda la noche a 4°C con agitación suave. 2) I ncubar con tampón de bloqueo (NaHC03 0, 1 M , pH 8,6, 5 mg/ml de BSA, NaN3 0,02) durante 1 hora a 4°C y a continuación lavar con TBST seis veces (TBS + 0, 1 % [v/v] de Tween-20) . 3) Aplicar el fago diluido a 4 x 1 010 en TBST sobre la placa recubierta y agitar suavemente durante 60 minutos a temperatura ambiente. 4) Descartar el fago no unido y lavar las placas 10 veces con TBST. 5) Eluir el fago unido con 300 µ? de Glicina-HCI 0,2 M (pH 2 ,2) , 1 mg/ml de BSA y neutralizar con 45 µ? de Tris-HCI 1 M (pH 9, 1 ) durante dos rondas más de ciclos de selección de fagos por afinidad . 6) Añadir el eluido al cultivo ER2738 de E. coli inoculada e incubar a 37°C con agitación vigorosa durante 4,5 horas. Centrifugar el sobrenadante del cultivo y precipitar en PEG/NaCI a 4°C durante toda la noche. 7) Titular la tercera ronda resultante del eluido amplificado en placas LB/I PTG/Xgal. Se usaron placas procedentes de las placas de titulación para la secuenciación de ADN .

El procedim iento de ciclos de selección de fagos por afinidad usando la librería de péptidos aleatorios presentados en el fago fGWXIO: Se construyó la librería de fagos de elaboración propia, fGWXIO, que presenta secuencias de péptidos 10-meros aleatorios como se ha descrito previamente (Deng y col., 2004, Identification of peptides that inhibit the DNA binding, trans-activator, and DNA replication functions of the human papillomavirus type 11 E2 protein, J. Virol., 78: 2637-2641). Resumiendo, 1) Recubrir con 100 pg/ml de cada anticuerpo de ratón (en NaHC030,1 M, pH 8,6) el pocilio de la placa de 12 pocilios e incubar durante toda la noche a 4°C con agitación suave. 2) Inocular un tubo con 10 mi de medio LB con E. coli K91. Incubar el cultivo a 37°C con agitación vigorosa. 3) Incubar con tampón de bloqueo (NaHC030,1 M, pH 8,6, 5 mg/ml de BSA, NaN3 0,02) durante 1 hora a 4°C y a continuación lavar con TBST seis veces (TBS + 0,1% [v/v] de Tween-20). 4) Aplicar 50 µ? del fago fGWXIO diluido (diversidad 1 x 010) con 350 mi de TBST sobre la placa recubierta y agitar suavemente durante 60 minutos a temperatura ambiente y lavar las placas 10 veces con TBST. 5) Eluir el fago unido con 300 µ? de Glicina-HCI 0,2 M (pH 2,2), 1 mg/ml de BSA en un tubo de microcentrífuga y neutralizar con 45 µ? de Tris-HCI 1 (pH 9,1) durante dos rondas más de ciclos de selección de fagos por afinidad. 6) Titular la tercera ronda sin amplificar del eluido usando células de E. coli K91 inoculadas en placas LB/Tet. Se usó la colonia procedente de la titulación para la secuenciación del ADN. Almacenar el eluido restante a 4°C. 1.4 Determinación de la unión del epítopo del anticuerpo dé ratón mediante Biacore La unión del epítopo de anticuerpos anti-CD127 de ratón para CD127 de ratón se valoró usando un sistema Biacore ??00 (GE Healthcare). Resumiendo, se inmovilizaron anticuerpos anti-CD127 de ratón en un chip biosensor C 5 con un nivel final de ~100 RU (unidades de respuesta) usando el kit de acoplamiento de la amina y el procedimiento estándar. Se usó tampón HBS-EP a pH 7,4 (que consiste en HEPES 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, EDTA 3 mM y 0,005% v/v de tensioactivo P20) como tampón de carrera. Los sensogramas se corrieron contra una célula de referencia que se activó/desactivó usando EDC/NHS/etanolamina. Se sintetizaron 15-meros con 7 péptidos solapados de IL-7R ECD por la Shanghai Science peptide Biology Technology, y por la GL Biochem (Shanghai) Ltd. Cada péptido se inyectó a diversas concentraciones durante 120 s a un caudal de 30 µ?/min. Se calcularon los valores de Kd usando el paquete de software de evaluación de Biacore. Las carreras se llevaron a cabo a 25°C.

La Tabla 1 muestra las regiones de los epítopos del CD127 de ratón (NP_032398) para los anticuerpos de ratón, el clon SB14 de BD Biosciences y el clon A7R34 de eBiosciences que se identificaron por combinación de los tres procedimientos: librerías de péptidos fágicos, ELISA de péptidos y Biacore.

AntiLibrería ELISA de Epítopo de ratón BIAcore cuerpo de fagos péptidos 171 - PARGESNWTHVSLFHTR-187 SB14 N/D - (SEQ ID NO: 10) 80-VKCLTLNKLQDIYFIK-95 A7R34 N/D N/D (SEQ ID NO: 11) Ejemplo 2: Generación de anticuerpos monoclonales que se unen al CD127 humano Se produjeron anticuerpos monoclonales (mAbs) mediante células de hibridoma en general según el procedimiento expuesto en E Harlow y D Lañe, Antibodies a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

El antígeno utilizado para generar hibridomas, incluyendo 9B7 y 6C5, fue un dominio extracelular de CD127 humano recombinante dimérico (ECD)-Fc (R&D Systems #306-IR), el cual comprende los aminoácidos 21-262 del CD127 humano (SEQ ID NO: 1). El antígeno utilizado para generar hibridomas, incluyendo 6A3 y 1 A11, fue una construcción que contenía el ECD completo de CD127 (aminoácidos 21-219 de la SEQ ID NO: 1).

Los ratones Balb/c se vacunaron y se reforzaron mediante inyección intraperitoneal con Antígeno en FCA o FIA (Sigma-Aldrich, #F5881, #F5506) (1:1; vokvol). Los bazos de los animales que presentan una respuesta se recogieron y se fusionaron a células de mieloma SP/0 para generar hibridomas. Los hibridomas de interés se monoclonaron usando un medio semi-sólido (disolución de metilcelulosa) y se recogieron manualmente en una placa de 96 pocilios. El material sobrenadante del hibridoma se seleccionó para la unión a CD127ECD usando ELISA, FACS de células transfectadas CHO-CD127, FACS de pStat5 y BIAcore T100 (resultados presentados a continuación).

Los mAbs purificados seleccionados (aislados a partir de los sobrenadantes del hibridoma 9B7, 6C5, 6A3 y 1A11) se probaron para determinar la inhibición de IFN-? e IL-17 inducidos por la IL-7 en un ensayo de expansión de TH17. En adición, se demostró que el R34.34 anti-hCD127 comercialmente disponible inhibe el IFN-? y la IL-17 inducidos por la IL-7 en un ensayo de expansión de TH17, y también se seleccionó para su análisis adicional.

Procedimientos 2.1 Selección de hibridomas que se unen a CD127 por ELISA Una placa ELISA se recubrió con 5 yig/m\ de CD127ECD recombinante humano. Se titularon los anticuerpos anti-CD127 procedentes de los sobrenadantes del hibridoma de prueba o del material purificado en toda la placa. Se detectó el nivel de unión mediante el tratamiento con una peroxidasa de rábano (HRP) conjugada con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón. El ELISA se llevó a cabo usando el sustrato TMB. Los resultados del sobrenadante del hibridoma 9B7 se muestran en la Figura 2. 2.2 Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) Células CHO o CHO-CD127 (2 x 106 células/ml) transfectadas simuladas se tiñeron con los sobrenadantes del hibridoma o con anticuerpos purificados a 1 pg/ml durante 1 h con FCS al 4% en PBS (tampón FACS). Las células también se tiñeron en un anticuerpo de ratón control negativo y control positivo anti-CD127 humano adecuados (R34.34 Dendritics Inc. #DDX0700). Las células se lavaron en tampón FACS y a continuación se tiñeron con un anticuerpo secundario IgG ALEXA488 anti-ratón a 1: 2000 (Invitrogen Inc. #13-A11017). Después de lavar en tampón FACS, las células se analizaron en un LSR II (BD Biosciences Inc.). Los resultados del anticuerpo 9B7 se muestran en la Figura 3. 2.3 Inhibición de la fosforilación de Stat5 señalizada por el receptor de la IL-7 estimulada por IL-7 Se descongelaron PBMCs congeladas la noche anterior al experimento, y se dejaron en medio RPMI 1640 que contiene el 10% de FBS para su recuperación. Para la selección del anticuerpo funcional para CD127, se incubó medio de cultivo de hibridomas, anticuerpo control positivo (R34.34, Dendritics Inc) a 2 pg/ml y 0,2 pg/ml, o muestras de sobrenadante de prueba con 5 ? 105 células PBMC durante 30 minutos antes de estimularlas con 1 ng/ml de IL-7. Las células sin tratar se analizaron como señal de fondo, mientras que las células tratadas con IL-7 se pusieron como control negativo. Después de una incubación de 30 minutos con los controles o las muestras de prueba, las células se estimularon con 1 ng/ml de IL-7 durante 15 minutos a 37°C. A continuación las células se fijaron con el 1,6% de paraformaldehído/PBS durante 10 minutos a 37°C y se permeabilizaron en metanol al 100% durante 20-30 minutos. A continuación las células se lavaron dos veces en tampón de tinción (1% de BSA en PBS) y se tiñeron con 7 µ? de anticuerpo anti-pStat5 marcado con Alexa-647 (BD Biosciences Inc #612599) durante 1 h. Las muestras se analizaron en un instrumento BD LSR II FACS. Los resultados para 9B7 se muestran en la Figura 4.

Se utiliza un proceso optimizado para los anticuerpos R34.34, 6A3, 1 A 11 , y 6C5, como se describe en la Sección 3.19. 2.4 Inhibición de la producción de IL- 7 inducida por IL-7 en el ensayo de expansión de TH17 humanas Células TH17 de memoria en una población de células T CD4+ humanas normales se estimularon para expandirse durante tres días.

A continuación estas células TH17 se activaron con PMA e ionomicina para estimular la producción de IL-17. El bloqueo de la interacción entre la IL-7 y el CD127 mediante un anticuerpo anti- CD127 funcional en el periodo de incubación de tres días previno la expansión de las células TH17 dando lugar a la reducción de la producción de IL-17.

Se aislaron células T CD4+ a partir de células mononucleares sanguíneas periféricas usando un kit comercial (CD4+ T Cell Isolation Kit II, # 130-091-155, Miltenyi Biotec). Las células T CD4 + se resuspendieron en medio RPMI con el 10% de FCS a una concentración de 1,5 x 106/ml. Las células se incubaron previamente con control o anticuerpos anti-IL-7Ra durante 30 minutos. A continuación las células se cultivaron con o sin 10 ng/ml de IL-7 durante 72 h a 37°C. Al final de la incubación, las células se estimularon con 50 ng/ml de PMA y 1 pg/ml de ionomicina durante 5 h. A continuación los sobrenadantes del cultivo celular se recogieron y se determinó la concentración de IL-17 mediante ELISA (eBiosciences). Este ensayo se utilizó para un anticuerpo 9B7.

Los anticuerpos 6C5, 6A3 y R34.34 se sometieron a ensayo según el siguiente protocolo. Se aislaron células CD4+ según el manual (#130-091-155, Miltenyi). Se mezclaron 1x106/ml aproximadamente de las células CD4+ en 100 µ? con un volumen igual de medio de diferenciación 2x TH17 (2 pg/ml de anti-CD28 + 10 pg/ml de anti-IFN-? + 10 g/ml de anti-IL-4 + 12,5 ng/ml de I L-1 ß + 20 ng/ml de IL-23 + 50 ng/ml de IL-6) y se cultivó a 37°C con C02 al 5% durante 5 días. El tratamiento con las diversas citoquinas y factores de crecimiento en el medio TH17 diferenció de manera preferente las células CD4+ a células TH17. Las células CCR6+ procedentes del cultivo celular diferenciado se clasificaron a los 5 días usando BD FACS SORP Aria II. A continuación las células CCR6+ se ajustaron a 2 x 106/ml para el ensayo de producción de IL- 17.

Para medir el nivel de IL-17 e IFN-?, 100 µ? de células CCR6 + se pre-incubaron con el anticuerpo de prueba durante 1 h a 37°C, y a continuación se mezclaron con 100 µ? de 10 ng/ml de IL-7. Las células se cultivaron durante 24-40 horas a 37°C con suplemento de C02 al 5%. Se midieron los niveles de IFN-? e IL-17 en 100 µ? de sobrenadante del cultivo mediante FlowCytomix (Bender MedSystems) a las 24 h y a las 40 h, respectivamente. 2.5 Determinación de las cinéticas de unión mediante resonancia de plasmón superficial Se valoraron las cinéticas de unión de anticuerpos anti-CD127 para CD127 humano usando un sistema Biacore T100 (GE Healthcare). Resumiendo, se inmovilizó CD127 ECD recombinante humano sobre un chip biosensor CM5 con un nivel final de -100 RU (unidades de respuesta) usando el kit de acoplamiento de la amina y el procedimiento estándar. Se usó tampón HBS-EP a pH 7,4 (que consiste en HEPES 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, EDTA 3 mM y 0,005% v/v de tensioactivo P20) como tampón de carrera. Los sensogramas se corrieron contra una célula de referencia que se activó/desactivó usando EDC/NHS/etanolamina. Los analitos (anticuerpos anti-CD127) se inyectaron a diversas concentraciones durante 120 s a una velocidad de flujo de 30 µ?/min. Las superficies antigénicas se regeneraron con Glicina-HCI 10 mM, pH 2,5. Se calcularon los valores de Kd usando el paquete de software de evaluación de Biacore. Las carreras se llevaron a cabo a 25°C.

Tabla 2. - Datos cinéticos para el material sobrenadante de 9B7. La prueba se llevó a cabo a 37°C.

Se determinó que el isotipo de 9B7 era lgG1 con una región constante de la cadena ligera kappa.

El siguiente ensayo se utilizó para evaluar la cinética de unión de los anticuerpos anti-CD127 6C5, 6A3, 1A11 y GR34. La cinética de los anticuerpos se evaluó utilizando un sistema Biacore T100 (GE Healthcare) con una temperatura de reacción de 25°C. El anticuerpo de IgG de conejo anti-ratón se inmovilizó sobre un chip biosensor CM5 con un nivel final de -10,000 RU (unidades de respuesta) utilizando el kit y procedimiento de acoplamiento de amina convencional. Se utilizó el regulador de HBS-EP a un pH de 7.4 (consistente en HEPES 10 mM HEPES, cloruro de sodio 0.15 M, EDTA 3 m y tensoactivo P20 al 0.005 por ciento en volumen/volumen) como el regulador de ejecución. Los sensogramas se ejecutaron contra una célula de referencia que se inmovilizó como control utilizando EDC/NHS/etanolamina. Para la captura del ligando, se inyectaron 25 nM del 6C5 sobre la superficie del chip durante 30 segundos a 10 µ?/min. Entonces se inyectaron los analitos (ECD de CD127 humano recombinante) en diferentes concentraciones durante 500 segundos a 30 pL/m in . Las superficies del ch ip sensor se regeneraron con Glicina-HCI 10 mM , pH de 1 .7. Los valores Kd se calcularon utiliza ndo el paquete de software de evaluación Biacore.

Tabla 3. Datos cinéticos para 6C5 y 6A3 2.6 Compendio del Perfil de Anticuerpo Se encontró que 9B7 se une fuertemente a CD 127 con una constante de disociación de 556 pM. También era capaz de bloquear parcialmente la unión de I L-7 a CD1 27, correlacionando al bloqueo parcial de la fosforilación de STAT-5 inducida por I L-7 en células CD4 humanas (Figura 4) .

Se determinó que el anticuerpo 6C5 (lgG1 de ratón) inhibe la señalización de pSTAT5 con una IC50 de 50 g/ml. Se determinó que el anticuerpo 6A3 (IgG 1 de ratón) inhibe la señalización de pSTAT5 con una IC50 de 0.099 Mg/ml en el ensayo descrito en la presente.

Tuvo una afinidad por el EDC del IL-7Ra de 7.99 nM (KD), y una Kd de 3.34 x 10"4. Fue capaz de unirse a IL-7Ra expresado en CHO con una EC50 de 0.19 Mg/ml, y bloqueó el IL-7/IL-7Ra con una IC50 de 1.92 Mg/ml. Se determinó que el 6A3 se une a los aminoácidos dentro de las regiones 2, 3, 4 y 5 del epítopo de CD127 (SEQ ID NOs: 118-121).

Se determinó que el anticuerpo 1A11 (lgG1 de ratón) inhibe la señalización de pSTAT5 con una IC50 de 0.088 g/m I en el ensayo descrito en la presente. Tuvo una afinidad por el EDC de IL-7Ra de 3.44nM (KD), y una Kd de 2.51 x 10"4. Fue capaz de unirse a IL-7Ra expresado en CHO con una EC50 de 0.16 Mg/ml , y bloqueó el IL-7/IL-7Ra con una IC5o de 1.79 [ig/m\. Se determinó que el 1A11 se une a los aminoácidos dentro de las regiones 2, 3, 4 y 5 del epítopo de CD127 (SEQ ID NOs: 118-121).

Se determinó que el anticuerpo GR34 (lgG1 de ratón) inhibe la señalización de pSTAT5 con una IC50 de 0.22 en el ensayo descrito en la presente. Tuvo una afinidad por el EDC del IL-7Ra de 15.3 nM (KD), y una Kd de 8.75 x 10"4. Fue capaz de unirse a IL-7Ra expresado en CHO con una EC5o de 0.27 pg/ml, y bloqueó el IL-7/IL-7Ra con una IC50 de 2.29 ig/m\. Se determinó que el GR34 se une a los aminoácidos dentro de las regiones 2, 3, 4 y 5 del epítopo de CD127 (SEQ ID NOs: 118-121).

Se determinó que el anticuerpo comercial R.3434 (Dendritics) inhibe la señalización de pSTAT5 con una IC50 de 0.67 pg/ml en el ensayo descrito en la presente. Tuvo una afinidad por el EDC del IL- 7Ra de 7.74 nM ( D), y una Kd de 1.46 x 10"4. Fue capaz de unirse a IL-7Ra expresado en CHO con una EC50 de 0.01 g/ml, y bloqueó el IL-7/IL-7Ra con una IC5o de 1.38 pg/ml. Se determinó que el R.34.34 se une a los aminoácidos dentro de las regiones 2, 3, 4 y 5 del epítopo de CD127 (SEQ ID NOs: 118-121). 2.7 Secuenciación de dominios variables 2.7.1 9B7 Se extrajo el ARN total de sedimentos de clones de células 9B7 2x107 usando el kit de ARNm Oligotex Direct de Qiagen según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa de ARNm a ADNc se realizó con el sistema de transcripción inversa ImProm-ll™ (Promega) según las instrucciones del fabricante con cebadores convencionales para los genes VH y VK de ratón. Se amplificaron 7 reacciones para la región variable de la cadena pesada y 6 reacciones para la región variable de la cadena ligera.

Los fragmentos de la RT-PCR purificados se clonaron en el vector pMD18-T (Takara) y se obtuvo una secuencia consenso para cada hibridoma mediante alineamiento de secuencias, búsqueda en bases de datos y alineamiento con secuencias variables de inmunoglobulinas conocidas listadas en KABAT (Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.H., Gottesman, K.S., Foeller, C, 1991. Sequences of proteins of Immunological Interest, 5a Edición, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH).

La secuencia consenso de mAb 9B7 fue: La VH reordenada del mAb 9B7 usa un segmento V de la familia lgh-VQ52 VH2.

QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYNVHWVRQPPGKGLEW LGMIWDGGSTDYNSALKSRLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYC ARNRYESGMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 2) Secuencia FR1: QVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS (SEQ ID NO: 12) Secuencia CDR1: RYNVH (SEQ ID NO: 4) Secuencia FR2: WVRQPPGKGLEWLG (SEQ ID NO: 13) Secuencia CDR2: MIWDGGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 5) Secuencia FR3: RLSITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR (SEQ ID NO: 14) Secuencia CDR3: NRYESG (SEQ ID NO: 6) Secuencia FR4: MDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 15) La Vk reordenada del mAb 9B7 usa un segmento V de la familia IGKV8.

DIVMTQTPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNRKNYLTWYQQKPG QSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVQAEDLAVYYCQN DYTYPFTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO: 3) Secuencia FR1: DIVMTQTPSSLTVTAGEKVTMSC (SEQ ID NO: 16) Secuencia CDR1: KSSQSLLNSGNRKNYLT (SEQ ID NO: 7) Secuencia FR2: WYQQKPGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 17) Secuencia CDR2: WASTRES (SEQ ID NO: 8) Secuencia FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTLIISSVQAEDLAVYYC (SEQ ID NO: 18) Secuencia CDR3: QNDYTYPFTFGS (SEQ ID NO: 9) Secuencia FR 4: GTKLEIKR (SEQ ID NO: 19) (Las regiones CDR están en negrita. Gen Ig: gen de la inmunoglobulina. VH: región variable de la cadena pesada del anticuerpo. VL: región variable de la cadena ligera del anticuerpo. FR: región marco. CDR: región determinante de complementariedad). 2.7.2 6C5 Se determinó que el anticuerpo 6C5 tiene las siguientes regiones variables de la cadena pesada y ligera (las CDRs de 6C5, de acuerdo con Kabat, se muestran en negrillas): Región variable de la cadena pesada de 6C5 EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFAFSAYWMSWVRQAPGKGLE WIGEINPDSSTINCTPSLKDKFIISRDNAKNTLSLQMNKVRSEDTALYYC ARRLRPFWYFDVWGAGTTVTV SS (SEQ ID NO: 29) Secuencia FR1: EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFAFS (SEQ ID NO: 37) Secuencia CRDH1: AYWMS (SEQ ID NO: 31) Secuencia FR2: WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 38) Secuencia CDRH2: EINPDSSTINCTPSLKD (SEQ ID NO: 32) Secuencia FR3: KFIISRDNAKNTLSLQMNKVRSEDTALYYCAR (SEQ ID NO: 39) Secuencia CDRH3: RLRPFWYFDVW (SEQ ID NO: 33) Secuencia FR4: GAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 40) Región variable de la cadena ligera de 6C5 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVQSNGNTYLEWYLQK PGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FQGSHVPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30) Secuencia FR1: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC (SEQ ID NO: 41) Secuencia CDRL1: RSSQSIVQSNGNTYLE (SEQ ID NO: 34) Secuencia FR2: WYLQKPGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 42) Secuencia CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 35) Secuencia FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC (SEQ ID NO: 43) Secuencia CDRL3: FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 36) Secuencia FR4: FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 44) 2.7.3 6A3 Se determinó que el anticuerpo 6A3 tiene las siguientes regiones variables de la cadena pesada y ligera (las CDRs de 6A3, de acuerdo con Kabat, se muestran en negrillas): Región variable de la cadena pesada de 6A3 DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITTDYAWNWIRQFPGNKLEW MGYIFYSGSTTYTPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR GGYDVNYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 51) Secuencia FR1: DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIT (SEQ ID NO: 59) Secuencia CRDH1: TDYAWN (SEQ ID NO: 53) Secuencia FR2: WIRQFPGNKLEWMG (SEQ ID NO: 60) Secuencia CDRH2: YIFYSGSTTYTPSLKS (SEQ ID NO: 54) Secuencia FR3: RISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR (SEQ ID NO: 61) Secuencia DRH3: GGYDVNYF (SEQ ID NO: 55) Secuencia FR4: DYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 62) Región variable de la cadena ligera de 6A3 DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYQQKPGKSPQLLIY AATRLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQFFSTPWT FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 52) Secuencia FR1: DIQMTQSPASQSASLGESVTITC (SEQ ID NO: 63) Secuencia CDRL1: LASQTIGAWLA (SEQ ID NO: 56) Secuencia FR2: WYQQKPGKSPQLLIY (SEQ ID NO: 64) Secuencia CDRL2: AATRLAD (SEQ ID NO: 57) Secuencia FR3: GVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYC (SEQ ID NO: 65) Secuencia CDRL3: QQFFSTPWT (SEQ ID NO: 58) Secuencia FR4: FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 66) 2.7.41A11 Se determinó que el anticuerpo 1A11 tiene las siguientes regiones variables de la cadena pesada y ligera (las CDRs de 1A11, de acuerdo con Kabat, se muestran en negrillas): VH del mAb 1A11 EVQLQQSGPELLKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEW IGLINPYNGVTSYNQKFKGKATLTVAKSSSTAY ELLSLTSEDSAVYYC ARGDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 71) Secuencia FR1: EVQLQQSGPELLKPGASMKISCKASGYSFT (SEQ ID NO: 79) Secuencia CDRH1: GYTMN (SEQ ID NO: 73) Secuencia FR2: WVKQSHGKNLEWIG (SEQ ID NO: 80) Secuencia CDRH2: LINPYNGVTSYNQKFK (SEQ ID NO: 74) Secuencia FR3: GKATLTVAKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC AR (SEQ ID NO: 81) Secuencia CDRH3: GDGNYWYF (SEQ ID NO: 75) Secuencia FR4: DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 82) Vk del mAb 1A11 EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVTY HWYQQKSGTSPKPWIYEI SKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISS EAEDAAIYYCQEWNYPYTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 72) Secuencia FR1: EIVLTQSPAITAASLGQKVTITC (SEQ ID NO: 83) Secuencia CDRL1: SASSSVTYMHW (SEQ ID NO: 76) Secuencia FR2: YQQKSGTSPKPWIY (SEQ ID NO: 84) Secuencia CDRL2: EISKLAS (SEQ ID NO: 77) Secuencia FR3: GVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYC (SEQ ID NO: 85) Secuencia CDRL3: QEWNYPYTF (SEQ ID NO: 78) Secuencia FR4: GGGTKLEIK (SEQ ID NO: 86) 2.7.5 R.34.34 El R.34.34 está comercialmente disponible en Dendritics, Inc. El análisis de secuencia de elaboración propia de la proteína digerida en gel involucró el análisis de secuencia N-terminal utilizando la degradación de Edman en un secuenciador de proteínas automatizado ABI Procise 494 (Applied Biosystems, Foster City, Ca., EUA), huella de masa peptídica, y secuenciación MALDI-LI FT-MS/MS en un espectrómetro de masas Bruker Ultraflex III Maldi-TOF, y secuenciación adicional con LC-ESI-MS/MS en un espectrómetro de masas de trampa de iones Bruker HCT+ (ambos de Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). El clon inversamente diseñado se denominó como GR34, cuya secuencia es la siguiente.

VH reordenada del mAb GR34 EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEW IGLINPYSGITSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELLNLTSEDSAVYYCA RGDGNYWYFDVWGAGTTVTV SS (SEQ ID NO: 90) Secuencia FR1: EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFT (SEQ ID NO: 98) Secuencia CDR1: GYTMN (SEQ ID NO: 92) Secuencia FR2: WVKQSHGKNLEWIG (SEQ ID NO: 99) Secuencia CDR2: LINPYSGITSYNQNFK (SEQ ID NO: 93) Secuencia FR3: GKATLTVDKSSSTAYMELLNLTSEDSAVYY CAR (SEQ ID NO: 100) Secuencia CDR3: GDGNYWYF (SEQ ID NO: 94) Secuencia FR4: DVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 101) Vk reordenada del mAb GR34 EIILTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKPWIYEI SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQYWNYPYTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 91) Secuencia FR1: EIILTQSPAITAASLGQKVTITC (SEQ ID NO: 1 02) Secuencia C DR 1 : SASSSVSYMHW (SEQ ID NO : 95) Secuencia FR2: YQQ KSGTSPKPWIY (SEQ I D NO : 1 03) Secuencia CDR2: EISKLAS (SEQ I D NO: 96) Secuencia FR3: GVPARFSGSGSGTSYSLTISSM EAEDAAIYYC (SEQ I D NO : 104) Secuencia CDR3: QYWNYPYTF (SEQ I D NO: 97) Secuencia FR4: GGGTKLEI K (SEQ I D NO: 1 05) 2.8 Identificación del epítopo 9B7 por ELISA de péptidos El epítopo del anticuerpo 9B7 anti-hCD127 se determinó mediante ELISA de péptidos como se hizo anteriormente (1 .2). Los resultados de este mapeo se muestran en la Tabla 3.

Tabla 4. Muestra tres regiones positivas de hCD127 identificadas por ELISA de péptidos utilizado el clon de 9B7 2.9 Determinación del epítopo de unión del anticuerpo de 6C5 v R.34.34 mediante resonancia de plasmón superficial (BIAcore) Se sintetizaron 1 5-meros con 7 u 8 péptidos solapados de CD127 ECD por la Shanghai Science peptide Biology Technology, y por la GL Biochem (Shanghai) Ltd. Todos los péptidos se prepararon mediante síntesis de péptidos en fase sólida en flujo continuo. A continuación los péptidos se biotinilaron en el N-término del péptido con un espaciador Acp entre el péptido y el resto biotina, es decir, biotina-Acp-péptido.

La unión de anticuerpos anti-CD127 al péptido sintetizado en 15-meros del CD127 humano se valoró usando un sistema Biacore T100 (GE Healthcare). Resumiendo, se inmovilizaron anticuerpos anti-CD127 de ratón en un chip biosensor CM5 con un nivel final de ~1000 RU (unidades de respuesta) usando el kit de acoplamiento de la amina y el procedimiento estándar. Se usó tampón HBS-EP a pH 7,4 (que consiste en HEPES 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, EDTA 3 mM y 0,005% v/v de tensioactivo P20) como tampón de carrera. Los sensogramas se corrieron contra una célula de referencia que se activó/desactivó usando EDC/NHS/etanolamina. Los péptidos se inyectaron a 1 µ? durante 120 s a una velocidad de flujo de 10 µ?/min. Los datos se analizaron usando el paquete de software de evaluación de Biacore. Las carreras se llevaron a cabo a 25°C.

Tabla 5. Muestra regiones positivas para el anticuerpo R34.34 identificado con BIAcore 6C5 Región 1 65 NTTNLEFEICGALVE 79 SEQ ID NO: 45 R34.34 Región 1 65 NTTNLEFEICGALVE 79 SEQ ID NO: 106 Región 2 80 VKCLNFRKLQEIYFI 94 SEQ ID NO: 107 Región 3 95 ETKKFLLIGKSNICV 109 SEQ ID NO: 108 Región 4 155 LQKKYVKVLMHDVAY 169 SEQ ID NO: 109 Región 5 162 VLMHDVAYRQEKDEN 176 SEQ ID NO: 110 2.10 Predicción de epítopos mediante presentación de péptidos fágicos Para predecir el epítopo de un anticuerpo anti-hCD127, se puede llevar a cabo una presentación de fago como anteriormente (Sección 1.3) sobre los anticuerpos 9B7, 6C5, R3434, 6A3, y 1A11. 2.10.1 9B7 El motivo de la secuencia consenso del péptido fágico o los mimótopos identificados a partir de las 2 librerías de péptidos aleatorios, predijeron los epítopos discontinuos del mAb 9B7 (Tabla 4).

Tabla 6. Muestra tres regiones positivas de hCD127 identificadas por la librería de péptidos fágicos utilizando el clon 9B7 Región 1 80 VKCLNFRKLQEIYFI 94 (SEQ ID NO: 23) Región 2 95 ETKKFLLIGKSNICV 109 (SEQ ID NO: 24) Región 3 170 RQEKDENKWTHVNLS 184 (SEQ ID NO: 25) Resumen del mapeo de epítopos por presentación de péptidos fágicos y ELISA de péptidos: Se identificaron tres regiones como epítopos potenciales del CD127 para el anticuerpo monoclonal 9B7, que se muestran a continuación: Posición 35 LDDYSFSCYSQLEVN 49 (SEQ ID NO: 26); Posición 84 NFRKLQEIYFIETKKFLLIGKS 105 (SEQ ID NO: 27); Posición 139 YREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDE NKWTH 180 (SEQ ID NO: 28) 2.10.2 6C5 Los mimótopos de péptidos fágicos identificados a partir de las 2 librerías aleatorias predijeron 2 posibles epítopos discontinuos del anticuerpo 6C5.

Tabla 7. Muestra regiones de epítopo para 6C5 identificado con la librería de péptidos fágicos Resumen del mapeo de epítopos por presentación de péptidos fágicos y BIAcore de péptidos: Se identificaron tres regiones como epítopos potenciales del CD127 para los 6C5, como se muestran a continuación: Posición 55 LTCAFEDPD 63 (SEQ ID NO: 48); Posición 65 NTTNLEFEICGALVE 79 (SEQ ID NO: 49); Posición 209 PDHYFKGFWSEE 219 (SEQ ID NO: 50). 2.10.3 R.34.34 Tabla 8. Muestra regiones de epítopo para R34.34 identificado con la librería de péptidos fágicos Resumen del mapeo de epítopos por presentación de péptidos fágicos y BIAcore de péptidos: Se identificaron tres regiones como epítopos potenciales del CD127 para R34.34, como se muestran a continuación: Posición 65 NTTNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGK 104 (SEQ ID NO: 114); Posición 153 SHLQKKYVKVLMH 165 (SEQ ID NO: 115); Posición 211 HYFK 214 (SEQ ID NO: 116). 2.10.4 6A3 El motivo de la secuencia consenso del péptido fágico o los mimótopos identificados a partir de las 2 librerías de péptidos aleatorios predijeron los epítopos discontinuos del mAb 6A3.

Tabla 9. Muestra las regiones de epítopo de 6A3 identificadas mediante librerías de é tidos fá icos Se postula que estas regiones son regiones colindantes muy próximas dentro de un sitio efector importante de CD127, potencialmente involucrado en el sitio de unión de la IL-7. 2.10.5 1A11 El motivo de la secuencia consenso del péptido fágico o los mimótopos identificados a partir de las 2 librerías de péptidos aleatorios predijeron los epítopos discontinuos del mAb 1A11.

Tabla 10. Muestra las regiones de epítopo de 1A11 identificadas mediante librerías de péptidos fágicos Región 1 79 EVKCLNFRKLQEIYFIETKKF 99 (SEQ ID NO: 87) Región 2 150 FNTSHLQ 156 (SEQ ID NO: 88) Región 3 207 SIPDHYFKGFWSEW 220 (SEQ ID NO: 89) Se postula que estas regiones son regiones colindantes muy próximas dentro de un sitio efector importante de CD127, potencialmente involucrado en el sitio de unión de la IL-7. 2.11 Ensayo de neutralización de unión del anticuerpo con Biacore El ensayo se llevó a cabo usando un sistema Biacore T100 (GE Healthcare) con una temperatura de reacción de 25°C. Se inmovilizó IL-7 humana recombinante en un chip biosensor C 5 con un nivel final de ~500 RU (unidades de respuesta) usando el kit de acoplamiento de la amina y el procedimiento estándar. Se usó tampón HBS-EP a pH 7,4 (que consiste en HEPES 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, EDTA 3 mM y 0,005% v/v de tensioactivo P20) como tampón de carrera. Los sensogramas se corrieron contra una célula de referencia que era el blanco inmovilizado usando EDC/NHS/etanolamina. Se mezclaron 10 pg/ml de CD127 ECD humano recombinante con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD127 en viales separados y se dejó incubar durante 1 h a 4°C. A continuación estas mezclas, junto con los 10 pg/ml de CD127 ECD humano recombinante solo, se inyectaron sobre la superficie del chip durante 30 s a 10 µ?/min. Después de cada inyección las superficies del chip sensor se regeneraron con Glicina-HCI 10 mM, pH 2,0. A 10 pg/ml de anticuerpo 6C5 se inhibió completamente la unión de CD127 ECD a la IL-7 sobre el chip sensor. Los resultados para 6C5 se muestran en la Figura 13.

El ensayo se repitió para el 6A3, utilizando un sistema Biacore T100 (GE Healthcare) con una temperatura de reacción de 25°C. Se inmovilizó IL-7 humana recombinante en un chip biosensor CM5 con un nivel final de ~1,000 RU (unidades de respuesta) usando el kit de acoplamiento de la amina y el procedimiento estándar. Se usó tampón HBS-EP a pH 7,4 (que consiste en HEPES 10 mM, cloruro sódico 0,15 M, EDTA 3 mM y 0,005% v/v de tensioactivo P20) como tampón de carrera. Los sensogramas se corrieron contra una célula de referencia que era el blanco inmovilizado usando EDC/NHS/ etanolamina. Se mezclaron 10 pg/ml de CD127 ECD humano recombinante con diversas concentraciones de anticuerpos anti-CD127 en viales separados y se dejó incubar durante 1 h a 4°C. A continuación estas mezclas, junto con los 10 Mg/ml de CD127 ECD humano recombinante solo, se inyectaron sobre la superficie del chip durante 30 segundos a 10 µ?/min. Después de cada inyección las superficies del chip sensor se regeneraron con Glicina-HCI 10 mM, pH 2,0. A 10 Mg/ml de anticuerpo 6C5 se inhibió completamente la unión de CD127-ECD a la IL-7 sobre el chip sensor. Los resultados se muestran en las Figuras 16A y 16B. La relación de inhibición se calculó como sigue: Relación de inhibición = 1 - RU (muestra) / RU (ECD). 2.12 Competición de IL-7 mediante FACS Se prepararon células CHO-CD127 y se lavaron con tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS) frío tres veces y a continuación se incubaron 2 X 105 células con 2 Mg/ml de IL-7 recombinante en viales separados a 4°C durante 30 min. Después de la incubación, se añadieron anticuerpos anti-CD127 y se prosiguió con la incubación durante 30 min más en FCS al 4% en DPBS (tampón FACS). A continuación, las células se lavaron tres veces en tampón FACS y se tiñeron con anticuerpo secundario IgG ALEXA488 anti-ratón a una dilución de 1: 2000 (Invitrogen Inc. #13-A11017). Las células se lavaron tres veces en tampón FACS y se analizaron en LSR II (BD Biosciences Inc.).

Mientras se incrementa la concentración de IL7, se reduce la unión de 6A3, R34.34 ó 6C5 a CHO-CD127, indicando una competición por la unión de estos anticuerpos con IL-7 al CD127 expresado en células CHO (la Figura 14 muestra el resultado obtenido con 6C5, la Figura 17 muestra el resultado obtenido con 6A3). El efecto sobre la unión de 9B7 fue menos notorio, indicando que el 9B7 tuvo menos efecto sobre la competición de IL-7 en este ensayo. 2.13 Ensayo de competición cruzada por la unión del anticuerpo mediante FACS Se prepararon células CHO-CD127 y se lavaron con DPBS frío por 3 veces. El anticuerpo anti-CD127 marcado con fluorescencia (BD Biosciences Inc #552853) se diluyó en el regulador FACS, y se mezcló con diferentes concentraciones del mismo anticuerpo no marcado, o se mezcló con los anticuerpos de prueba anti-CD127, R34.34 y 6C5. Las mezclas de anticuerpos entonces se incubaron con las células CHO-CD127 durante 30 minutos a 4°C. Después de lavar en regulador FACS por 3 veces, se mide la unión del anticuerpo BD marcado fluorescente en LSR II (BD Biosciences Inc.). Los resultados mostraron que, en adición al anticuerpo BD no marcado, el mAb R34.34 y 6C5 compitió por la unión con el anticuerpo BD marcado, indicando que los anticuerpos BD, R34.34 y 6C5 reconocen un epítopo similar sobre el CD127 expresado en las células CHO. (Figura 15).

Ejemplo 3: Efecto del tratamiento del anticuerpo del IL-7R en la EAE El potencial de los anticuerpos murinos descritos en el Ejemplo 1, para tratar la MS, se valoró en un modelo de EAE de ratón. Este experimento se ha repetido en seis ocasiones y a continuación se describe un único ejemplo representativo.

Procedimientos 3.1 Inducción v evaluación de la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) Se inmunizaron subcutáneamente ratones macho C57BL/6 (6-8 semanas; Shanghai Laboratory Animal Center, Chínese Academy of Sciences, Shanghai, China) con un péptido sintético (300 µg) de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG residuos 35-55). La inmunización se llevó a cabo mezclando el péptido MOG en medio adyuvante completo de Freund (CFA, que contiene 5 mg/ml de la cepa H37Ra inactivada térmicamente de Mycobacterium tuberculosis (Difco Laboratories)). Se administraron intravenosamente 200 ng de toxina pertussis (List Biological Laboratories) en PBS el día de la inmunización y 48 horas después.

Para el protocolo de tratamiento, se usó un mAb CD127 anti- ratón disponible comercialmente (BD Bioscience, CD127 SB14 de rata anti ratón, Cat. #550426), también se probó un segundo anticuerpo monoclonal que neutralizó la IL-7 sola (R&D systems). Se administraron intraperitonealmente los anticuerpos de prueba o la IgG control a 200 pg por ratón cada día desde el día 10 en adelante hasta un total de 5 inyecciones. En algunos experimentos, la IgG control se sustituyó por PBS para el grupo control. Los ratones se pesaron y se examinaron diariamente para síntomas de enfermedad. Se puntuaron para la gravedad de la enfermedad usando la escala de puntuación de la EAE: 0, sin signos clínicos; 1, cola floja; 2, paraparesis (debilidad, parálisis incompleta de 1 o los 2 miembros traseros); 3, paraplejia (parálisis completa de los 2 miembros traseros); 4, paraplejia con debilidad de los miembros delanteros o parálisis; 5, estado moribundo o muerte. 3.2 Histología e inmunohistoquímica Se extrajeron los tejidos de los ratones para el análisis histológico 21 días después de la inmunización y se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4%. Secciones de 5 a 10 µ? de la médula espinal embebidas en parafina se tiñeron con azul rápido Luxol o H&E y se examinaron al microscopio óptico. Para la tinción de inmunofluorescencia de células T CD4+ y monocitos/macrófagos CD11b+, se extrajeron las médulas espinales de los ratones, se perfundieron con PBS, y se incubaron en sacarosa al 30% a ,4°C durante toda la noche. Posteriormente el tejido se diseccionó y se embebió en un compuesto a una temperatura de corte óptima (OCT). Los especímenes congelados se seccionaron a 7 µ? con un cryostat, y las secciones se montaron en portaobjetos, se secaron al aire, y se fijaron durante 10 minutos con acetona al 100%. Después de bloquear con BSA al 3%, las secciones se incubaron durante toda la noche con los Abs primarios de rata CD4 o CD11b (BD Biosciences) anti-ratón, y a continuación se marcaron con IgG de burro anti-rata Cy3 AffiniPure (Jackson ImmunoResearch Laboratories) y se examinaron mediante microscopía de inmunofluorescencia (Nikon). Se usaron Abs del mismo isotipo como controles negativos. El grado de desmielinización, la infiltración de leucocitos, células T CD4+ y monocitos/macrófagos CD11b+ se cuantificó en una media de 3 secciones transversales de la médula espinal por ratón para un total de 5 ratones por grupo usando un procedimiento publicado previamente. 3.3 Ensayos de proliferación y de citoquinas En los ensayos de proliferación, se cultivaron esplenocitos (5 *105 por pocilio) procedentes de ratones con EAE por triplicado en RPMI 1640 en placas de 96 pocilios. Las células se cultivaron en presencia o en ausencia del péptido MOG (20 pg/ml) o Con A (2 pg/ml) a 37°C en C02 al 5% durante 72 h. Las células se pulsaron con 1 Ci de [3H]-timidina durante las últimas 16-18 h de cultivo antes de recogerlas. La incorporación de [3H]-timidina se midió en cpm con un contador MicroBeta counter (PerkinElmer).

Para las mediciones de citoquinas, se recogieron los sobrenadantes de un cultivo celular a las 48 horas y se diluyeron para la medición de IL-1 a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17, IFN-?, IL-23 usando el kit Mouse TH1/TH2 Flowcytomix Multiplex y el kit Mouse IL-23 Flowcytomix Simplex (Bender MedSystem) según las instrucciones del fabricante. Resumiendo, los sobrenadantes del cultivo se incubaron con la mezcla de cuentas recubiertas con los anticuerpos de captura y la mezcla de los segundos anticuerpos conjugados con biotina a temperatura ambiente durante 2 horas en oscuridad, se añadió estreptavidina marcada con PE y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente en oscuridad. Los datos se recogieron en un BD LSR II (Becton Dickinson) y se analizaron con el software BMS FlowCytomix (Bender MedSystem). Se midió el TGF-ß y la IL-21 de ratón con el kit Duoset ELISA (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante. Se realizó una curva patrón para cada placa y se usó para calcular las concentraciones absolutas las citoquinas indicadas. 3.4 Análisis de inmunotransferencia Los extractos de proteína se cargaron sobre geles de SDS-poliacrilamida al 10% o al 12% y se sometieron a electroforesis. Los análisis de inmunotransferencia se llevaron a cabo mediante la transferencia inicial de proteínas sobre la membrana Immobilon-P (Millipore) usando un aparato Mini Trans-Blot (Bio-Rad). Después de 2 horas de bloqueo, las membranas se incubaron durante toda la noche a 4°C con Abs primarios específicos contra P-JAK1, JAK1, P-AKT, AKT, P-Stat3, Stat3, P-Stat5, Stat5, Bcl-2, Bcl-xL, Bim, Bad, P-Bad (todos los anticuerpos anteriormente mencionados son de Cell Signal), MCL-1 (Bio-legend), Bax (BD Bioscience), RORyt (Abcam), Foxp3 (Santa Cruz Biotechnology), Actina (Santa Cruz Biotechnology) respectivamente. Después de lavar y la posterior incubación con un Ab de cabra anti-conejo (Sigma-Aldrich) o Ab de cabra anti-rata (Jackson ImmunoResearch) se conjugó con HRP durante 1 h a temperatura ambiente y después de lavar abundantemente, las señales se visualizaron con el sustrato ECL (Pierce). 3.5 Análisis de biochips de ADNc Se analizó el perfil de expresión de genes seleccionados relacionados con la apoptosis y la vía de señalización JAK-STAT usando un sistema de biochips de ADNc validado (GEArray S Series, la lista de genes detallada de SuperArray Bioscience se puede encontrar en la página web del fabricante: www.superarray.com/ gene_array_product/HTML/MM-602.3.html). Resumiendo, se aislaron esplenocitos de ratones naif o ratones con EAE tratados el día 21 con un mAb anti-CD127 o PBS. Se obtuvieron células Treg CD4+ CD25+ y células no Treg CD4+CD25- mediante separación de las cuentas magnéticas (Mitenyi Biotec). El ARN total se extrajo usando reactivo Trizol (Invitrogen). 3 Mg de ARN total se sometieron a trascripción inversa en ADNc de cadena sencilla marcado con biotina-16-desoxi-UTP usando un kit AmpLabeling-LPR (SuperArray). Después de la prehibridación, las membranas se hibridaron con el ADNc de muestra marcado con biotina y se incubaron con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Chemiluminescent Detection kit; SuperArray) para visualizar la señal. Los resultados se analizaron usando GEArray Expression Analysis Suite (SuperArray). Los resultados son representativos de los tres experimentos usando preparaciones de esplenocitos independientes. 3.6 Análisis de la apoptosis El análisis de la apoptosis se llevó a cabo usando un kit de detección de la apoptosis anexina V-FITC (BD Biosciences), se lavaron esplenocitos procedentes de ratones con EAE y se incubaron con 5 µ? de anexina V-FITC y 5 µ? de 7-AAD durante 15 min a temperatura ambiente. Las células teñidas se analizaron posteriormente usando un instrumento FACS LSRII (BD) en el intervalo de 1 h. 3.7 Aislamiento de células mononucleares a partir del tejido del SNC de ratón Se prepararon células mononucleares a partir de cerebro y médula espinal usando centrifugación en gradiente. Resumiendo, los ratones se perfundieron con 30 mi de PBS para eliminar la sangre de los órganos internos. El tejido cerebral y de la médula espinal disociado se trituró y se filtró a través de un tamiz celular de 70 µ?. La disolución celular resultante se centrifugó en un gradiente de Percoll. Las células mononucleares en la interfase entre los dos gradientes (37% y 70% de Percoll, Pharmacia) se recogieron, se lavaron por centrifugación con el medio, y a continuación se sometieron a análisis FACS. 3.8 Aislamiento de células T CD4 + Se extrajeron los bazos de ratones naif y se dispersaron en suspensiones celulares únicas. Para la purificación de células T naif, primero se purificó las células T CD4+ usando microcuentas CD4 (Miltenyi) del bazo y los nodulos linfáticos de ratones naif. Las células resultantes se marcaron posteriormente con anticuerpos CD44, CD62L y CD25 y se purificaron posteriormente para la población CD44l0CD62LhiCD25" mediante clasificación FACS (FACSAria II, Becton Dickinson). Para conseguir células T CD4+CD25hl y CD4+CD25", se incubaron suspensiones celulares únicas con anticuerpo anti-CD4 marcado con FITC y anticuerpo anti-CD25 marcado con PE (BD Biosciences) en hielo durante 30 minutos. Las células T CD4+CD25hi y CD4+CD25" se clasificaron con un instrumento FACSAria (Becton Dickinson). Se emplearon aproximaciones similares para aislar las células T CD4+CD25+ y CD4+CD25" humanas. Las células T CD4+ primero se purificaron a partir de PBMCs usando un kit de aislamiento de células T CD4+ No-touch (Miltenyi Biotec), y las células T CD4+CD25" se aislaron por selección negativa usando microcuentas anti-CD25 (Miltenyi Biotec). La pureza de las fracciones de las células T CD4+, CD4+CD25+, y CD4+CD25" siempre fue superior al 95%.

Se cultivaron en placa células T CD4+ de ratón naif en placas de fondo plano de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 1* 106 células/ml. Las células se estimularon con Ab anti-CD3 unido a placa (5 g/ml; BD Bioscience) y Ab anti-CD28 (5 g/ml; BD Bioscience) en medio completo.

Las células T se cultivaron en condiciones TH1 {IL-12 recombinante (10 ng/ml; eBioscience) + anti-IL-4 (10 Mg/ml; BD Bioscience)}, o condiciones TH17 {TGF-p1 (1 ng/ml; R&D Systems), IL-23 (10 ng/ml; R&D Systems) e IL-6 (10 ng/ml; eBioscience) + anti-IFNy (10 g/ml; BD Bioscience) y anti-IL-4 (10 Mg/ml)} durante 4 días.

Para inducir/convertir las células Treg CD4+CD25+ a partir de células T CD4+CD25", se cultivaron células T CD4*CD25 purificadas de humano o de ratón a 2 * 106 células/ml con TGF-ß? (10 ng/ml) e IL-2 (50 lU/ml, R&D Systems) en presencia de anticuerpo anti-CD3 recubierto (5 g/ml) y 5 Mg/ml de anticuerpo anti-CD28 durante 4 días. En algunos casos, el medio se retiró de los sistemas de cultivo anteriormente mencionados y a continuación las células se cultivaron en medio fresco durante 1 h o 48 h en presencia o ausencia de IL-7 (10 ng/ml). Para diferenciar las células TH17 humanas, se estimularon las células CD4+ humanas totales en anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de I L- 1 ß , IL-6, e IL-23 durante 6 días. Se añadió IL-7, IL-2, y anticuerpos al sistema de diferenciación el tercer día. 3.10 Análisis de citometría de flujo Para la tinción superficial de CD4, CD25, CD8, B220 y CD127, se resuspendieron células en PBS que contienen el 1% de BSA (Sigma-Aldrich) y el 0,1% de azida sódica y se incubaron con anticuerpos conjugados con fluorocromo para los marcadores de la superficie celular indicados (BD Bioscience o eBioscience) durante 30 minutos en hielo. Para la tinción de las citoquinas intracelulares, se reestim u laron células monon ucleares recién aisladas de los nodulos linfáticos, bazo y S NC de ratones con EAE o células cultivadas ¡n vitro durante 5 h con PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 u M) en presencia de GolgiPlug (diluido a 1 : 1000; BD Bioscience). Las células se tiñeron en su superficie con anticuerpos marcados por fluorescencia, se resuspendieron en disolución de Fijación/ Permeabilización (BD Bioscience) , y se ti ñe ro n pa ra las citoquinas intracelulares según las instrucciones del fabricante. Particularmente , para la tinción intracelular de I L-7, las células se incubaron primeramente con anticuerpos contra CD 1 6/CD32 de ratón (BD Bioscience) durante 30 minutos a 4°C seguido de fijación/permeabilización usando la disolución de BD Bioscience, a continuación las células se tiñeron con IgG I L-7 de cabra anti-ratón (R&D Systems) o IgG de cabra (R&D Systems) como anticuerpos primarios e IgG Alexa Fluor® 488 de burro anti-cabra (Jackson I mmu nol) como anticuerpo secundario. La tinción del Bcl-2 intracelular se llevó a cabo con el mismo protocolo pero sin la estimulación con PMA e ionomicina. Como para la tinción intracelular de Foxp3, las células se fijaron y se permeabilizaron con tampón de tinción Foxp3 (eBioscience) . Las células permeabilizadas se tiñeron con mAbs Foxp3 anti-humano o anti-ratón conjugados con PE o FITC (0,5 pg/1 06 células; eBioscience) . Para la tinción intracelular de yes fosforilada , las células se fijaron durante 10 minutos a 37°C con paraformaldeh ído al 2% (p/vol), se volvieron permeables durante 30 minutos en hielo con metanol al 90% (vol/vol), y se tiñeron para la tinción de Stat5 anti-fosforilada (BD Bioscience). El análisis de citometría de flujo se realizaron sobre instrumentos BD LSR II (Becton Dickinson) y los resultados se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star Inc.). 3.11 Análisis estadístico Se analizaron las diferencias en la expresión de genes entre los grupos mediante la prueba de Mann-Whitney U. Se usó la prueba t de Student de dos colas para analizar las diferencias entre los grupos. Inicialmente se realizó un ANOVA de una vía para determinar si existió un cambio global significativamente estadístico antes de usar la prueba t de Student de dos colas apareadas o sin aparear. Un valor de A P inferior a 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Resultados 3.12 Mejora de la EAE por antagonismo del IL-7R o la IL-7 Como se muestra en la Figura 5, cuando se administra tres veces desde el día 10 en adelante, el tratamiento con el anticuerpo anti-CD127 altera notablemente la evolución clínica de la EAE reduciendo la gravedad de la enfermedad comparada con un control con un isotipo (Figura 5A). El régimen de tratamiento dio como resultado una reducción notable en la gravedad de la enfermedad acompañada con un descenso de la inflamación y de la desmielinización en médula espinal afectada comparada con la de los ratones control. Los esplenocitos obtenidos de ratones tratados presentaban una reactividad de las células T significativamente red ucida a M OG pero no a la activación no específica de las células T inducida por ConA (Figura 5B) . De manera nota ble , el efecto del tratam iento se correlaciona con una reducción selectiva en la producción de IL-1 7 entre otras citoquinas relacionadas con la inflamación en célu las T reactivas a M OG (Figura 5C), y en porcentaje de células TH17 y en un menor grado, de células TH 1 tanto de bazo como de médula espinal de ratones con EAE tratados (Figura 5D) . Los números absolutos de infiltración de células TH1 7 en el SNC se redujo 1 0 veces en ratones tratados comparado con los de los ratones control (1 , 3 ± 0,2 x 104 vs. 1 3,7 ± 3 x 104). En contraste, las células Treg se incrementaron de manera recíproca durante la evolución de la EAE (Figu ra 5D). Hubo una expresión diferencial del I L-7R en los tres subgrupos (Fig ura 5E) .

Fue más evidente que las células TH1 7 y TH1 observadas después del comienzo de la EAE (d ía 12 o día 21 después de la inmunización) eran exclusivamente del fenotipo de memoria CD44+CD62L" y susceptibles al tratamiento con el anticuerpo del I L-7R (datos no mostrados). Aunque la infiltración de células T CD4+ en la méd ula espinal se redujo notablemente, el número absoluto y la composición global de las células T CD4+ y C D8* y de células B B220+ periféricas no se alteró significativamente (datos no mostrados) . Los resultados indican que las células T CD4+ del fenotipo de memoria en EAE estaban muy enriquecidas para los subg rupos TH 17 y TH1 patógenos y eran susceptibles al antagonismo del I L-7R, que desplaza la relación de TH1 7/TH1 a Treg hacia un nuevo equilibrio en ratones con EAE tratados.

Un anticuerpo contra IL-7 también atenuó las puntuaciones clínicas de la EAE (Figura 5F), aunque no hasta el grado observado con el anticuerpo anti-CD127. Además, como se muestra en la Figura 6, el CD127 está muy expresado en células TH1 y TH17 procedentes del bazo o la médula espinal ex vivo de ratones con EAE mientras que la expresión de CD127 fue significativamente inferior en células Treg Foxp3+. 3.13 Papel de la IL-7 en la diferenciación de TH17 El desarrollo y la función in vivo de TH17 patógenas es un proceso dicotómico comprendido de diferenciación y supervivencia y expansión. Las citoquinas proinflamatorias tales como la IL-6, I L- 1 ß e IL-21 son críticas para la diferenciación de TH17 y la iniciación de la inflamación autoinmunitaria en la EAE, mientras que la supervivencia y expansión de las células TH17 se entiende mal y puede involucrar a la IL-23.

Los inventores investigaron si la señalización de IL-7/IL-7R estaba asociada a la diferenciación de TH17 usando células T CD4+ naif purificadas del fenotipo CD44l0CD62LhiCD25\ El efecto de la IL-7 se examinó estimulando las células resultantes con anticuerpos CD3/CD28 en presencia y ausencia de TGF-ß. Aunque la IL-7 promovió la diferenciación de TH17 cuando se combina con TGF-ß, el efecto fue de magnitud moderada comparado con el de la IL-6 e independiente de la IL-6 (Figura 7A), que se correlaciona con la inducción marginal de la fosforilación de STAT-3 y la expresión de RORa por IL-7 (Figura 7B, Figura 7C). Similar a la IL-6, la IL-7 sola no indujo la diferenciación de TH17 (datos no mostrados). Dado el efecto moderado de la IL-7 sobre la diferenciación de TH17, abordamos si el efecto observado tenía significación in vivo en EAE. Cuando se administra antes del comienzo de la EAE (inyecciones los días 0, 2 y 4), el tratamiento con el anticuerpo del IL-7R no afectó a la gravedad de la enfermedad aunque retrasó ligeramente el comienzo comparado con el de en ratones tratados con anticuerpo control (Figura 7D). Los datos sugieren colectivamente que la señalización de IL-7/IL-7R está involucrada marginalmente en, pero no es críticamente necesaria, para la difereñciación de TH17. 3.14 Inhibición selectiva de células TH17 y TH1 en ratones con EAE tratados v el papel del antagonismo de CD127 en el desarrollo de I Ia!Z A continuación examinamos el papel del anticuerpo CD127 en la diferenciación de TH17 y en el mantenimiento/expansión tanto en situaciones experimentales in vivo como in vitro. Como se muestra en la Figura 8A, el porcentaje de células TH17 y células TH1 que segregan interferón-?, en menor grado, se redujo en esplenocitos y en infiltrados del SNC en ratones con EAE tratados comparado con el de los ratones control mientras que los niveles de Treg Foxp3+ se incrementaron significativamente (p <0,01, Figura 8B). Los cambios en el porcentaje de TH17, TH1 y Treg en el transcurso de la EAE tanto en ratones tratados como control se presentan en la Figura 8C. En una situación experimental in vitro aparte, se diferenciaron TH17, TH1 y Treg, respectivamente, a partir de esplenocitos naif usando protocolos de inducción diferentes en presencia y ausencia de anticuerpos CD127.

Los resultados sugirieron que la diferenciación de TH17 y, en menor grado, de TH1 pero no Treg estaba inhibida cuando se añadió anticuerpo CD127 al comienzo de la diferenciación (Figura 9A). Se observó un efecto similar del anticuerpo CD127 sobre TH17 diferenciadas pero no sobre TH1 o Treg (Figura 9B). Sin embargo, las siguientes pruebas con este protocolo fueron incapaces de repetir este hallazgo inicial, sugiriendo que el papel de la señalización de IL-7/IL-7R es solamente marginal en la diferenciación de las células TH17. 3.15 La IL-7 es necesaria para la supervivencia y expansión de TH17 También se tuvo interés en investigar si la IL-7 era necesaria para la diferenciación de TH17. En este aspecto, los resultados iniciales sugerían que la adición de IL-7 sola incrementaba la diferenciación de TH17 y, en un menor grado, de TH1 pero no de Foxp3 en Treg cuando el día 8 se cultivaron células T específicas de MOG de la EAE (Figura 10).

Sin embargo, como se describe en el presente documento (Sección 3.17), el trabajo posterior reveló el proceso dicotómico del desarrollo de TH17, y sugirió que la promoción de las células TH17 no era primordialmente un resultado de un incremento en la diferenciación, sino un resultado de un incremento en la expansión y supervivencia de TH17, en donde la IL-7 tiene un papel mucho más significativo . 3.1 6 S usceptibilidad de TH1 7 pero no de Tr»n a la apoptosis ind ucida por el antagonismo del I L-7R A continuación investigamos el mecanismo que subyace en la reducción selectiva y en la susceptibilidad de TH17 con un anticuerpo anti-CD127. Como se ilustra en la Figura 1 1 A, el análisis de inmunotransferencia de células T CD4+ ex vivo procedentes de ratones con EAE tratados o control reveló que el tratamiento con anticuerpo anti-CD127 dio como resultado cambios específicos en las vías de señalización relacionadas con JAK-STAT y la apoptosis como se caracteriza por la regulación hacia abajo de la JAK-1 fosforilada y la STAT-5 fosforilada y redujo notablemente los niveles de u na molécula pro-apoptótica clave, la BC L-2, e incrementó la actividad de una molécula anti-apoptótica, la BAX. La modulación de proteínas pro- y anti-apoptóticas se correlaciona con un nivel de apoptosis incrementado en células CD4+ en ratones tratados con anticuerpo. Como se muestra en la Figura 1 1 B, el tratamiento con anticuerpo CD 127 condujo a un porcentaje notablemente incrementado de células apoptóticas Anexina-V+ entre células T CD4+CD1 27+ comparado con el de células T CD4+CD1 27- T derivadas de ratones con EAE tratados.

Parece que las células TH17 derivadas de ratones con EAE experimentaron una apoptosis auto-iniciada o programada que se pudo revertir con la adición de I L-7. El proceso se anuló con la pre- incubación de células susceptibles con un anticuerpo anti-I L-7R pero no con un anticuerpo control. La IL-7 alteró significativamente los niveles de expresión de BCL-2, que se correlaciona recíprocamente con los niveles de células apoptóticas de Anexina-V+ (Figura 11 C).

El efecto observado de la IL-7 estaba claramente mediado a través de la STAT-5 y se pudo bloquear con un inhibidor específico de la STAT-5 pero no con un inhibidor de la STAT-3 (Figura 11 D) o un inhibidor de la PI3-K (no se muestran los datos).

Los hallazgos proporcionan un apoyo adicional para el papel de la IL-7 como una señal de supervivencia crítica para la expansión de células TH17 diferenciadas regulando la fosforilación de STAT-5 y los niveles de proteínas anti- y pro-apoptóticas. 3.17 Efecto de un anticuerpo neutralizante para el IL-7R humano sobre las células TH17 humanas Nuestros estudios en el sistema experimental de ratón mostraron que el desarrollo de las TH17 es un proceso de dos pasos; el "Paso 1" es la diferenciación de células precursoras de TH, y el "Paso 2" es la supervivencia/expansión de las TH17. Estos dos procesos son controlados por diferentes citoquinas, cuya expresión es además regulada por diferentes factores de transcripción. Ambos procesos contribuyen críticamente al resultado clínico de la enfermedad autoinmunitaria.

Se validó adicionalmente el papel del antagonismo de CD127 en la diferenciación de TH17 en un sistema experimental humano. Cuando se bloquea IL-7/IL-7R usando un anticuerpo anti-CD127 según la invención, la diferenciación de TH17 se vio mínimamente afectada como se muestra en la Figura 12, indicando que la IL-7 desempeña un papel menor en este proceso. En contraste, nuestros resultados mostraron que el papel principal de la señalización de IL-7/IL-7R en este proceso de desarrollo celular en dos pasos es en el Paso 2 - la supervivencia y expansión de las células TH17 patógenas. En este segundo paso, el papel de la IL-7 es superior al de la IL-23 a través de la vía JAK/STAT-5. Cuando se administra el mAb anti-IL-7R humano después de que las células ya se hayan comprometido a células TH17, las células son susceptibles a la apoptosis, como se muestra en la Figura 22. El estudio proporciona evidencias constructivas para un nuevo papel de la señalización de IL-7/IL-7R en el desarrollo y las funciones de células TH17 patógenas en EAE y proporciona sólidas razones fundamentales para el antagonismo del IL-7R como tratamiento potencial para la MS y otras dolencias autoinmunitarias. 3.18 Inhibición de la producción de IFNv mediante PBMC estimuladas con IL-7 Las PBMCs se rastrearon inicialmente y se seleccionaron con base en un resultado positivo con el anticuerpo R34.34 (Dendritics Inc.). Se cultivaron en placa PBMCs frescas o descongeladas a 2 * 105 células/pocilio en placas de 96 pocilios en RPMI 1640 que contiene FBS al 10%. Se incubaron el anticuerpo 6C5 de prueba purificado, el anticuerpo R34.34 control positivo (Dendritics Inc) y la IL-7 anti-humano (R&D), más anticuerpo lgG1 de ratón control del isotipo (R&D) a 10 pg/ml y a 100 pg/ml con células a 37°C durante 30 minutos antes de suplementar con 10 ng/ml de IL-7. Las células se trataron brevemente con IL-7 que sirvió como control negativo mientras que las células no tratadas sirvieron como señal de fondo. Se añadieron 2 pg/ml de anti-CD3 y anti-CD28 solubles (eBiosciences) a todas las condiciones y la placa se incubó durante 24 horas más a 37°C con C02 al 5%. Se analizó el nivel de IFN-? en el sobrenadante en cultivo mediante ELISA para IFN-? humano (kit ELISA para IFN-? humano, eBiosciences). Bajo estas condiciones, el mAb 6C5 y el anticuerpo R34.34 inhibieron la producción de IFNY inducida por IL-7 (Figura 18). 3.19 Inhibición de la fosforilación de Stat5 señalizada por el receptor de la IL-7 estimulada por IL-7 Para seleccionar anticuerpos con la capacidad para bloquear las funciones de señalización de CD127, se descongelaron rápidamente PBMCs criopreservadas y se pusieron en placa en medio RPMI 1640 que contiene el 10% de FBS la noche antes de la prueba funcional. Los anticuerpos de la muestra de prueba y el anticuerpo control positivo (R34.34, Dendritics Inc #DDX0700; BD anti-CD127, BD Biosciences Inc #552853) se prepararon en diluciones seriadas de tres veces comenzando con una concentración máxima de 120 g/ml, y se añadió a 2 x 105 células PBMC durante 30 minutos a 37°C antes de la estimulación con IL-7 a 1 ng/ml durante 15 minutos a 37°C. Las células sin el anticuerpo y el tratamiento con IL-7 se usaron como control de fondo. Las células tratadas con IL-7, pero no las muestras de anticuerpo, se usaron como control de la actividad completa. Después del tratamiento las células se Usaron con tampón de lisis (PerkinElmer #TGRS5S500) durante 5 minutos a 37°C y los Usados se incubaron con la mezcla Reaction Buffer + Activation Buffer (PerkinElmer #TGRS5S500) que contiene las cuentas AlphaScreen® Acceptor (PerkinElmer #6760617C) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de eso, se añadió tampón de Dilución (PerkinElmer #TGRS5S500) que contiene las cuentas AlphaScreen® Donor (PerkinElmer #6760617C) y se incubó durante otras 2 horas. La luminiscencia (RFU) de las cuentas AlphaScreen se analizó en Envision con su modo de AlphaScreen por defecto (lectura más alta; Ex 680 nm; Em 570 nm). Los resultados para las muestras de prueba se convirtieron en actividad relativa basándose en la fórmula siguiente: Actividad relativa (%) = (RFU(muestra) - RFU(control de fondo))/ (RFU(control de la actividad completa)- RFU(control de fondo)) Los resultados de este cálculo se muestran en la Figura 19.

Se cultivaron células CCF-CEM en medio de crecimiento (RPMI 1640, 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, butirato sódico 1 mM) y se trataron con dexametasona 1 µ? (Sigma #D4902) durante toda la noche para la inducción del receptor de la IL-7 antes del experimento. Se prepararon los anticuerpos de la muestra de prueba y el anticuerpo control positivo (R34.34, Dendritics Inc #DDX0700; BD anti-CD127, BD Biosciences Inc #552853) en diluciones seriadas de tres veces comenzando con una concentración m áxima de 1 20 pg/m l, y se a ñadió a 2 x 1 05 células PB C durante 30 minutos a 37°C antes de la estimulación con I L-7 a 1 ng/ml durante 1 5 minutos a 37°C . Las células sin el anticuerpo y el tratamiento con I L-7 se usaron como control de fondo. Las células tratadas con I L-7, pero no las muestras de anticuerpo, se usaron como control de la actividad completa. Después del tratamiento las células se Usaron con tampón de lisis (Perkin Elmer #TGRS5S500) durante 5 minutos a 37°C y los lisados se incubaron con la mezcla Reaction Buffer + Activation Buffer (PerkinElmer #TGRS5S500) que contiene las cuentas AlphaScreen® Acceptor (PerkinElmer #676061 7C) durante 2 h a temperatu ra ambiente. Después de eso, se añadió tampón de Dilución (Perkin Elmer #TGRS5S500) que contiene las cuentas AlphaScreen® Donor (PerkinElmer #676061 7C) y se incubó durante otras 2 horas. La luminiscencia (RFU) de las cuentas AlphaScreen se analizó en Envision con su modo de AlphaScreen por defecto (lectura más alta ; Ex 680 nm; Em 570 nm). Los resultados para las muestras de prueba (6C5, 1 A1 1 ) se convirtieron en actividad relativa basándose en la fórmula siguiente: Actividad relativa (%) = (RFU (muestra) - RFU(control de fondo))/ (RFU (control de la actividad completa)- RFU(control de fondo)) Los resultados se muestran en la Figura 20.

El experimento esencialmente se repitió, para el anticuerpo 6A3, como sigue. Se suspendieron PBMCs en medio RPM I 1640 exento de suero. Los anticuerpos de la m uestra de prueba y el anticuerpo control positivo (6A3 y R34.34, Dendritics I nc #D DX0700) se diluyeron pa ra conseg u ir concentraciones finales entre 20 g/m l y 0 ,01 Mg/m l en el cultivo y se añadieron a 1 x 106 células PBMC por muestra . Las PBMCs se incubaron con anticuerpos durante 1 h a 37°C antes de la estimulación con IL-7 a 1 ng/ml durante 1 5 minutos. Para la tinción intracelular de STAT5 fosforilada, las células se fijaron durante 10 minutos a 37°C con paraformaldeh ído al 2% (p/vol) , se volvieron permeables durante 30 minutos en hielo con metanol al 90% (vol/vol), y se tiñeron para la tinción de Stat5 anti-fosforilada (BD Bioscience). El análisis de citometría de flujo se realizó sobre instrumentos BD LSR I I (Becton Dickinson) y los resultados se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star I nc.) .

Las células sin anticuerpo y el tratamiento con I L-7 se usaron como control de fondo. Las células tratadas con I L-7, pero no las muestras con anticuerpo, se usaron como control de la actividad completa. La Figura 21 muestra la inhibición de la P-STAT5 inducida por I L-7 en relación al control sin anticuerpo a concentraciones crecientes de R34.34 y 6A3. 3.20 I nhibición de la producción de I L-1 7 inducida por I L-7 en células T diferenciadas Se aislaron células CD4+ según el manual #1 30-091 -155, Miltenyi). Se mezclaron 1 x1 06/ml aproximadamente de las células CD4+ en 100 µ? con un volumen igual de medio de diferenciación 2x TH 1 7 (2 Mg/ml de anti-CD28 + 1 0 Mg/ml de anti-I FN-? + 10 Mg/ml de anti-IL-4 + 12,5 ng/ml de IL-?ß + 20 ng/ml de IL-23 + 50 ng/ml de IL-6) y se cultivó a 37°C con C02 al 5% durante 5 días. El tratamiento con las diversas citoquinas y factores de crecimiento en el medio TH17 diferenció de manera preferente las células CD4+ a células TH17. Las células CCR6+ procedentes del cultivo celular diferenciado se clasificaron a los 5 días usando BD FACS SORP Aria II. A continuación las células CCR6+ se ajustaron a 2 x106/ml para el ensayo de producción de IL-17.

Para medir el nivel de IL-17, 100 µ? de células CCR6+ se pre-incubaron con el anticuerpo de prueba durante 1 h a 37°C, y a continuación se mezclaron con 100 µ? de 20 ng/ml de IL-7. Las células se cultivaron durante 3 días a 37°C con suplemento de C02 al 5%. Se midieron los niveles de IL-17 en 100 µ? del sobrenadante del cultivo mediante FlowCytomix (Bender MedSystems). La tabla 11 muestra la concentración de IL-7 y del anticuerpo de prueba (R34.34 y 6C5) usados en la generación de los resultados de la Figura 22 (resultados de un solo donante). El R34.34 inhibió la producción de IL-17 en las células T diferenciadas inducidas por IL-7 en 6/6 donantes; 6C5 inhibió la producción de IL-17 en las células T diferenciadas inducidas por IL-7 en 4/6 donantes.

Tabla 11 CM 10 ng/ml de 10 g/ml de 50 pg/ml de 50 pg/ml de IL-7 R34.34 6C5 igG 10 ng/ml de 10 ng/ml de 10 ng/ml de IL-7 IL-7 IL-7 El experimento esencialmente se repitió para el anticuerpo 6A3. Se aislaron células CD4+ según el manual (#130-091-155, iltenyi). Se mezclaron 1x106/ml aproximadamente de las células CD4+ en 100 µ? con un volumen igual de medio 2x TH17 (2 Mg/ml de anti-CD28 + 10 pg/ml de anti-IFN-? + 10 pg/ml de anti-IL-4 + 12,5 ng/ml de IL-1 ß + 20 ng/ml de IL-23 + 50 ng/ml de IL-6) y se cultivó a 37°C con C02 al 5% durante 5 días. El tratamiento con las diversas citoquinas y factores de crecimiento en el medio TH17 diferenció de manera preferente las células CD4+ a células TH17. Las células CCR6+ procedentes del cultivo celular diferenciado se clasificaron a los 5 días usando BD FACS SORP Aria II. A continuación las células CCR6+ se ajustaron a 2 x 106/ml para el ensayo de producción de IL-17.

Para medir el nivel de IL-17 e IFN-?, 100 µ? de células CCR6+ de los donantes individuales se pre-incubaron con el anticuerpo de prueba durante 1 h a 37°C, y a continuación se mezclaron con 100 µ? de 20 ng/ml de IL-7. Las células se cultivaron durante 3 días a 37°C con suplemento de C02 al 5%. Se midieron los niveles de IFN-? e IL-17 en 100 µ? de sobrenadante del cultivo mediante FlowCytomix (Bender MedSystems) a las 24 h y a las 40 h, respectivamente. La tabla 12 muestra la concentración de la IL-7 y del anticuerpo de prueba usados en la generación de los resultados de la Figura 23. Los resultados son representativos de 5/7 donantes.

Tabla 12 Conclusiones El estudio descrito en el presente documento proporciona la primera evidencia inmunológica que apoya el papel potencial de la I L-7 y el I L-7R en la esclerosis múltiple ( S).

Los presentes inventores han proporcionado evidencias convincentes de que la señalización de I L-7/I L-7R es necesaria de forma crítica para la supervivencia y expansión de células TH 1 7 comprometidas tanto en sistemas de ratón como humanos, mientras que su papel en la diferenciación de TH1 7 no es esencial comparada con la de la I L-6. El antagonismo de la I L-7 o el I L-7R administrados después del comienzo de la EAE afecta significativamente a la evolución cl ínica de la enfermedad . Los inventores han demostrado por tanto q ue el antagonismo de la I L-7 o el I L-7R proporciona un potencial terapéutico real en el tratamiento de enfermedades autoinmu nitarias y trastornos inflamatorios en los que están implicadas las células TH17 patógenas, particularmente en la MS, y más particularmente todavía en la evolución de la recaída/remisión de la MS (RRMS).

El desarrollo y la función de TH17 están controlados principalmente por la IL-6 a través de JAK/STAT-3 por la diferenciación de TH1 y por la IL-7 a través de JAK/STAT-5 para el mantenimiento de TH17. La IL-7 no sólo proporciona una señal de supervivencia para células TH17 patógenas sino que induce directamente la expansión de las células TH1 in vivo, contribuyendo de forma crítica a una patología autoinmunitarias sostenida en la EAE.

Como se demuestra en este estudio, las células TH17 comprometidas del fenotipo de memoria representan un subgrupo de células T patógenas in vivo y son susceptibles a la apoptosis auto-iniciada o programada. Este proceso parece depender de la señalización de IL-7/IL-7R a través de la regulación de proteínas pro-y anti-apoptóticas, tales como Bcl-2 y Bax, en células TH17 susceptibles. En este contexto, la IL-7 sirve como señal de supervivencia crítica que evita la apoptosis programada de las células TH17. Además, la producción incrementada de IL-7 y el IL-7R muy expresado en células T patógenas, como se observa en la fase aguda de enfermedades autoinmunitarias, proporciona el ambiente necesario para la supervivencia y expansión de células T sostenidas. Se propone que la interacción de IL-7 con su receptor induce la agregación de las cadenas a y ye y la activación aguas abajo de las cinasas. Como resultado, es probable que el proceso altere la cascada de la fosforilación de las cinasas y creen un sitio de acoplamiento para la fosforilación de STAT-5, que es necesario para la regulación hacia arriba de Bcl-2 y Mcl-1 y evita la apoptosis mediada por las mitocondriales bloqueando a Bim y Bad para activar Bax y Bak. Así, se proporciona una explicación para la implicación de la STAT-5 y su asociación con los cambios anti-apoptóticos inducidos en células TH17 patógenas por la IL-7.

Es remarcable que el efecto in vivo sobre el sistema inmunitario por el antagonismo del IL-7R es altamente selectivo en la EAE, que afecta a las células TH17, y en menor grado, a las células TH1 predominantemente del fenotipo de memoria y que no afectan a las células Treg. Los inventores han demostrado que el mantenimiento de las células TH17 está afectado por la señalización de IL-7/IL-7R. Bajo las mismas condiciones experimentales, las células TH1 son alteradas in vitro, pero no en un sistema in vivo. Las discrepancias se pueden explicar por diferentes ambientes de citoquinas entre el composición in vitro cuando se añade la IL-7 exógena y un micro-ambiente in vivo que supone la interacción de múltiples citoquinas. La selectividad para TH17 sobre Treg se explica fácilmente por la expresión diferencial del IL-7R, que vuelve susceptibles a las células TH17 y a las células Treg resistentes al antagonismo del IL-7R. Esta selectividad parece desempeñar un papel importante en el reequilibrio de la relación de células TH17 y células Treg por el antagonismo del IL-7R en la EAE y se puede atribuir a la eficacia del tratamiento. No obstante, las discrepancias en la magnitud de la respuesta y susceptibilidad inducida por IL-7 al antagonism o del I L-7 R entre TH 1 7 y TH1 no se pueden explicar simplemente con la expresión de I L-7R puesto que ambos subgrupos expresar altas concentraciones de IL-7R. La expresión y la actividad intrínseca de SOCS-1 es responsable de las discrepancias. Esto es, SOCS-1 expresada de forma natural en TH1 o inducida experimentalmente en TH 17 mediante el I FN-? se puede atribuir a una susceptibilidad amortiguada al antagonismo de la IL-7 o el IL-7R puesto q ue SOCS-1 actúa como un gen represor para STAT-5 necesaria para la señalización de I L-7. Así, la selectividad por células TH1 7 del fenotipo de memoria parece implicar requerimientos intrínsecos de estas células patógenas por la I L-7 para sobrevivir cuando se activan en el transcurso de la EAE. Esta especificidad terapéutica representa una ventaja obvia sobre muchas otras modalidades de tratamiento propuestas en enfermedades autoinmunitarias que a menudo afectan a un amplio espectro de sistemas/funciones inmunitarias.

El nuevo mecanismo de acción de señalización IL-7/I L-7R en la supervivencia y expansión de células TH17 como se ha descrito anteriormente proporciona u na explicación sólida para la eficacia del tratamiento del antagonismo del I L-7R en EAE y las implicaciones terapéuticas para enfermedades autoinmunitarias humanas, tales como la MS. La neutralización de la I L-7 o el antagonismo del I L-7R es probable que tenga ventajas terapéuticas únicas. Por una parte, el tratamiento ofrece la selectividad que distingue células TH 1 y TH 1 7 patógenas de células Treg y células inmunitarias no relacionadas. Por otra parte, ventajas terapéuticas adicionales del antagonismo del IL-7R implican su efecto selectivo sobre la supervivencia y expansión de TH17 diferenciadas en oposición a la diferenciación de TH17. Tener como objetivo, con un inhibidor de la vía IL-7/IL-7R, el mantenimiento in vivo de TH17 comprometidas frente a la diferenciación de TH17 puede ser más eficaz en un contexto terapéutico.

Claims (37)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o de un trastorno inflamatorio en un sujeto humano, el cual comprende la administración al sujeto de un antagonista de 5 cuando menos una de la expansión de TH17 mediada por el receptor de la IL-7 y la sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de l IL-7.

2. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la reivindicación 1, en donde el antagonista inhibe la producción por las 0 células TH17 de IL-17 inducida por IL-7.

3. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la r reivindicación 1 ó 2, en donde el antagonista inhibe la producción por las células TH17 de IFN-? inducida por IL-7.

4. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la 5 reivindicación 1, 2 ó 3, en donde el antagonista inhibe la fosforilación de STAT-5 mediada por el receptor de la IL-7.

5. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en donde el antagonista es una proteína de unión que se une específicamente a IL-7 o a CD127. 0

6. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 5, en donde la proteína de unión se une específicamente a CD127 (SEQ ID NO: 1).

7. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 6, en donde la proteína de unión inhibe la unión de la IL-7 al IL-7R. 5

8. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 5, 6 ó 7, en donde la proteína de unión se une a cuando menos un aminoácido dentro de cuando menos un péptido que consta de residuos de aminoácidos seleccionados a partir del grupo constituido por: a) 41 a 63 (SEQ ID NO: 117), b) 65 a 80 (SEQ ID NO: 118), c) 84 a 105 (SEQ ID NO. 1 9), d) 148 a 169 (SEQ ID NO: 120), y e) 202 a 219 (SEQ ID NO: 121), de la SEQ ID NO: 1.

9. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 8, en donde la proteína de unión se une a cuando menos un aminoácido dentro de cada uno de los péptidos 65 a 80 (SEQ ID NO: 118), 84 a 105 (SEQ ID NO: 119), 148 a 169 (SEQ ID NO: 120), y 202 a 219 (SEQ ID NO: 121), de la SEQ ID NO: 1.

10. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la reivindicación 1, en donde la proteína de unión inhibe competitivamente la unión de cuando menos uno de: (i) R34.34 (Dendritics Inc. #DDX0700) (ii) un anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera de 6A3 (SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, respectivamente), y (iii) un anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera de 1A11 (SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, respectivamente), al CD127 humano en un ensayo ELISA.

11. El procedimiento como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en donde la proteína de unión se une a CD127 con una afinidad (KD) de 15 nM o inferior, medido por resonancia de plasmón superficial.

12. El procedimiento de tratamiento como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antagonista es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

13. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 12, en donde el anticuerpo comprende una región determinante de complementariedad 3 (CDRH3) de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 55 o uno de sus análogos, o una región determinante de complementariedad 3 (CDRH3) de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 75.

14. El procedimiento de tratamiento como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria está asociada con niveles elevados de IL-17.

15. El procedimiento de tratamiento como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se ha determinado que el sujeto humano expresa un nivel elevado de IL-17 comparándose con un individuo humano sano.

16. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 14 ó 15, en donde el antagonista se administra en una cantidad eficaz para reducir el nivel de IL-17 en el paciente.

17. El procedimiento como se reclama en la reivindicación 14, 15 ó 16, en donde el nivel de IL-17 se mide en el suero del paciente.

18. El procedimiento de tratamiento como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad autoinmunitaria es esclerosis múltiple.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el paciente tiene un recuento de TH17 incrementado en su población de células T CD4+.

20. Un procedimiento de tratamiento de esclerosis múltiple en un paciente, el cual comprende la administración al paciente de un antagonista de la IL-7 o del IL-7R, en donde el paciente padece esclerosis múltiple recidivante/remitente.

21. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano, el cual comprende la administración al sujeto de un antagonista de la IL-7 o del IL-7R en una cantidad eficaz para reducir la relación de células TH17 con respecto a las células TH1.

22. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano, el cual comprende la administración al sujeto de un antagonista de la IL-7 o del IL-7R en una cantidad eficaz para reducir la relación de células TH con respecto a las células Treg.

23. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto humano, el cual comprende la administración al sujeto de un antagonista de la fosforilación de STAT-5 mediada por el receptor de la IL-7.

24. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la reivindicación 20, 21, 22 ó 23, en donde el antagonista de la IL-7 o del IL-7R es una proteína de unión que se une específicamente a CD127 o a IL-7.

25. El procedimiento de tratamiento como se reclama en la reivindicación 24, en donde la proteína de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a cuando menos un aminoácido dentro de cuando menos un péptido que consta de los residuos de aminoácidos: a) 41 a 63 (SEQ ID NO: 117), b) 65 a 80 (SEQ ID NO: 118), c) 84 a 105 (SEQ ID NO: 119), d) 148 a 169 (SEQ ID NO: 120), y e) 202 a 219 (SEQ ID NO: 121), de la SEQ ID NO: 1.

26. Un anticuerpo humano, humanizado o quimérico aislado, o un fragmento de unión con antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a un epítopo del CD127 humano que contiene cuando menos un residuo de aminoácido dentro de la región que comienza en el residuo número 80 y que termina en el residuo número 190.

27. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo aislado como se reclama en la reivindicación 26, en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo se une a cuando menos un aminoácido dentro de cuando menos un péptido que consta de los residuos de aminoácidos: a) 41 a 63 (SEQ ID NO: 117), b) 65 a 80 (SEQ ID NO: 1 8), c) 84 a 105 (SEQ ID NO: 119), d) 148 a 169 (SEQ ID NO: 120), y e) 202 a 219 (SEQ ID NO: 121), de la SEQ ID NO: 1.

28. El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo aislado como se reclama en las reivindicaciones 26 ó 27, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión con antígeno del mismo, se une al CD127 humano con una afinidad (KD) que es inferior a 15 nM, medida por resonancia de plasmón superficial.

29. Una proteína de unión aislada, en donde la proteína de unión se une a CD127 y comprende una región determinante de complementariedad 3 (CDRH3) de la cadena pesada, seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 55, y SEQ ID NO: 75, y sus análogos.

30. La proteína de unión aislada como se reclama en la reivindicación 29, en donde la proteína de unión comprende: A: una cadena pesada que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CDRH1 : RYNVH (SEQ ID NO: 4); CDRH2: MIWDGGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 5); CDRH3: NRYESG (SEQ ID NO: 6); y una cadena ligera que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CDRL1: KSSQSLLNSGNRKNYLT (SEQ ID NO: 7); CDRL2: WASTRES (SEQ ID NO: 8); y CDRL3: QNDYTYPFTFGS (SEQ ID NO: 9); o una cadena pesada que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CRDH1: AYWMS (SEQ ID NO: 31), CDRH2: EINPDSSTINCTPSLKD (SEQ ID NO: 32), CDRH3: RLRPFWYFDVW (SEQ ID NO: 33), y una cadena ligera que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CDRL1 RSSQSIVQSNGNTYLE (SEQ ID NO: 34), CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 35), y CDRL3: FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 36), O una cadena pesada que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CRDH1: TDYAWN (SEQ ID NO: 53), CDRH2: YIFYSGSTTYTPSLKS (SEQ ID NO: 54), CDRH3: GGYDVNYF (SEQ ID NO: 55), y una cadena ligera que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CDRL1: LASQTIGAWLA (SEQ ID NO: 56), CDRL2: AATRLAD (SEQ ID NO: 57), y CDRL3: QQFFSTPWT (SEQ ID NO: 58), o D: una cadena pesada que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CDRH1: GYT N (SEQ ID NO: 73), CDRH2: LINPYNGVTSYNQKFK (SEQ ID NO: 74), CDRH3: GDGNYWYF (SEQ ID NO: 75), y una cadena ligera que comprende las siguientes CDRs o análogos de las mismas: CDRL1: SASSSVTYMHW (SEQ ID NO: 76), CDRL2: EISKLAS (SEQ ID NO: 77), y CDRL3: QEWNYPYTF (SEQ ID NO: 78).

31. La proteína de unión aislada como se reclama en la reivindicación 29 ó 30, la cual es un anticuerpo humanizado o quimérico aislado.

32. Un anticuerpo o fragmento de unión con antígeno del mismo que se enlaza específicamente a CD127, en donde el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo compite por la unión al CD127 humano con uno o más anticuerpos seleccionados a partir del grupo que consiste en: a. un anticuerpo que tiene la siguiente región variable de la cadena pesada: EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFAFSAYWMSWVRQAPGKGLE WIGEINPDSSTINCTPSLKDKFIISRDNAKNTLSLQM NKVRSEDTALYYC ARRLRPFWYFDVWGAGTTVTV SS (SEQ ID NO: 29), y la siguiente región variable de la cadena ligera: DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVQSNGNTYLEWYLQKPGQS P LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL ISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 30); b. un anticuerpo que tiene la siguiente región variable de la cadena pesada: DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITTDYAWN WIRQFPGNKLEW MGYIFYSGSTTYTPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCAR GGYDVNYFDYWGQGTTLTVS S (SEQ ID NO: 51), y la siguiente región variable de la cadena ligera: DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGAWLAWYQQKPGKSPQLLIY AATRLADG VPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQFFSTPWT FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 52); c. un anticuerpo que tiene la siguiente región variable de la cadena pesada: EVQLQQSGPELLKPGASM KISCKASG YSFTGYTM WVKQSHGKN LEW IGLINPYNGVTSYNQKFKGKATLTVAKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYC ARGDG YWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 71), y la siguiente región variable de la cadena ligera: EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVTYM HWYQQKSGTSPKPWIYEI SKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSM EAEDAAIYYCQEWN YPYTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 72); y d. un anticuerpo que tiene la siguiente región variable de la cadena pesada: EVQLQQSGPELVKPGASM ISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEW IGLINPYSGITSYNQNFKGKATLTVDKSSSTAYMELLNLTSEDSAVYYCA RGDGNYWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 90), y la siguiente región variable de la cadena ligera: EIILTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVSYMH WYQQKSGTSPKPWIYEI SKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAIYYCQYWNYPYTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 91); en donde el anticuerpo no es R34.34 (Dendritics Inc. #DDX0700).

33. Un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico, o un fragmento de unión con antígeno y/o derivado del mismo, que se une a CD127 y que comprende: una cadena pesada que comprende las siguientes CDRs o los análogos de las mismas: CDRH1: GYTMN (SEQ ID NO: 92), CDRH2: LINPYSGITSYNQNFK (SEQ ID NO: 93), CDRH3: GDGNYWYF (SEQ ID NO: 94), una cadena ligera que comprende las siguientes CDRs o los análogos de las mismas: CDRL1: SASSSVSYMHW (SEQ ID NO: 95), CDRL2: EISKLAS (SEQ ID NO: 96), y CDRL3: QYWNYPYTF (SEQ ID NO: 97).

34. Un procedimiento de tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o de una condición inflamatoria, el cual comprende administrar a un paciente que padezca de una enfermedad autoinmunitaria o de una condición inflamatoria, una proteína de unión, anticuerpo o fragmento del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33.

35. Un antagonista de la expansión y/o sobrevivencia de TH17 mediada por el receptor de la IL-7, para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o de un trastorno inflamatorio en un sujeto humano.

36. Una proteína de unión, anticuerpo o fragmento del mismo aislado, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 33, para el tratamiento de una condición autoinmunitaria o inflamatoria.

37. Un método para identificar anticuerpos adecuados para utilizarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria o de una enfermedad inflamatoria, cuyo método comprende los pasos de: rastrear una pluralidad de poblaciones de anticuerpos independientes para determinar la capacidad de cada población de anticuerpos para: i. inhibir la unión de la IL-7 al IL-7R, ii. neutralizar la fosforilación de STAT-5 inducida por la IL-7, y/o iii. inhibir la producción de IL-17 por las células TH17, y seleccionar las poblaciones de anticuerpos que sean capaces de inhibir la unión de la IL-7 al IL-7R, de inhibir la fosforilación de STAT-5 inducida por la IL-7, y/o de inhibir la producción de IL-17 por las células TH17. RES U M EN La presente invención proporciona n uevos procedimientos de tratamiento de la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunitarias o trastornos inflamatorios, y antagonistas, que incluyen proteínas de unión aisladas para su uso en los nuevos procedimientos. Se proporciona un procedimiento de tratamiento de la esclerosis múltiple que comprende la neutralización de la actividad biológica de la I L-7 mediante la unión a CD 127 o a IL-7. Las proteínas de unión aisladas también pueden neutralizar la actividad biológica de la TSLP.