TW201006517A - Filtration method - Google Patents
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201006517 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於蛋白製劑製造步驟中之病毒除去步驟中的 蛋白製劑中間製品之過濾方法以及該方法所使 ⑺疋除病毒 過濾器。 【先前技術】 ' 抗體藥物、重組蛋白藥物、血漿製劑以及血漿分餾製劑 #之蛋白製劑中’有可能混入有來自原料、來自步驟之病 4 ’因此必需於製造該等蛋白製劑之過程中使病毒純化或 者將其除去。 / 作為有可能混入蛋白製劑中之病毒之鈍化方法，通常進 行加熱處理或化學藥品處理等，但是僅單獨地進行該等處 理並不能使病毒充分地鈍化’並且採用該等方法時蛋白 製劑中之有用蛋白質本身亦有可能改性。由於上述背景， 作為不會伴有化學改性的物理性之病毒除去方法，業界正 • 在實施利用過濾膜來將病毒分離除去之方法。 作為病毒除去用之過遽膜，已知有由纖維素等天然原材 料所形成之膜，或者由聚偏二氟乙烯(pvDF，_―仙咖 版6)聚趟硬（PES，p〇lyethersuIfone)等合成高 分子原材料所形成之除病毒膜（非專利文獻叫。 ，用裝填有該等除病毒膜之除病毒裝置對蛋白製劑中間 时進灯的過,慮理想的是，可於短時間内過遽更多之量之 5白質’且可以足夠高之病麵絲㈣病毒㈣。但是 存在以下問題：例如若使用纖維素膜，則即便於20 139924.doc 201006517 mg/ml以上之蛋白質濃度下，亦不易引起膜堵塞，可進行 過濾，但其耐壓性較低，實際使用壓力僅可提高至 kPa左右，或者若使用合成高分子膜，則耐壓性較高，將 實際使用壓力提高至300 kPa左右亦不會出現問題，但蛋 白質濃度提高至20 mg/ml左右時膜會堵塞而無法進行過 濾。因此，通常係於1〇 mg/ml以下之低濃度下進行過瀘 (專利文獻1)。 由於該等原因，業界並未於在高壓下，使各種藉由層析 法或超過濾等之純化步驟而使蛋白質濃度提高的高蛋白質 濃度之蛋白製劑中間製品流入除病毒裝置中的過遽條件 下’對過濾方法展開研究，而且亦並未對適用於該方法之 除病毒過濾器進行開發。 而且，由於蛋白製劑中間製品係用以製造蛋白製劑之貴 重材料，因而要在製造規模下決定病毒除去步驟之過漶方 法、運轉條件，於時間方面、經濟方面均伴有困難，因 此’本發明者深刻認識到預先於小規模下決定病毒除去步 驟之過濾方法、蛋白製劑中間製品之蛋白質濃度、除病毒 過濾器之入口壓力、及/或過濾時間之運轉條件，然後將 該運轉條件應用於規模放大之蛋白製劑之製造步驟中的重 要性。 [專利文獻1]曰本專利特開2004-277323號公報 [非專利文獻 1] Manabe. S, Removal of virus through novel membrane filtration method., Dev. Biol. Stand., (1996) 88: 81-90. 139924.doc 201006517 [非專利文獻2] Brandwein Η等人，Membrane filtration for virus removal., Dev Biol (Basel)., (2000) 102: 157-63.
[非專利文獻 3] Aranha-Creado等人，Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter., Biologicals. (1998) Jun; 26 (2): 167-72.
[非專利文獻4] L. Moce-Llivina等人，Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions, Journal of Virological Methods, (2003) April, Vol. 109, Issue 1, Pages 99-101. 【發明内容】 [發明所欲解決之問題] 鑒於上述問題，本發明之課題在於提供一種於高壓力 下，使高蛋白質濃度之蛋白製劑中間製品流入除病毒過濾 器中之條件下的蛋白製劑製造步驟中之病毒除去步驟之過 濾方法，另外，提供該方法中所使用之除病毒過濾器。 [解決問題之技術手段] 本發明者等人為了解決上述課題而進行銳意研究，其結 果發現，藉由使用下述過濾方法，可決定工業規模上規模 放大時的蛋白製劑中間製品之蛋白質濃度、除病毒過濾器 之入口壓力、及/或過濾時間之運轉條件，且對於病毒除 去步驟之設備設計亦較為有用，從而獲得本發明：該過濾 方法中，使用下述除病毒過濾器，亦即，該除病毒過濾器 包含具有各自至少為一個之蛋白製劑中間製品之入口與出 139924.doc 201006517 口的容器、以及用以除去病毒之除病毒膜並且容器内 空間由除病毒膜分隔成蛋白製劑 衣剛平間製品之入口側空間與 出口側空間，蛋白製劑中間絮σ 取。口之入口、出口中至少入口 為具備600 kPa以上之耐壓神沾 整陡的嵌合結構之喷嘴，除病毒 膜之有效膜面積為0.000 1 m2 以上、0·03 m2以下，使藉由 純化步驟而將蛋白質漢声姑含^ 負/晨度棱鬲至20 mg/mi以上、100 mg/ml以下的蛋白製劑中間劁σ Π激。〇於蛋白製劑中間製品之 入口壓力為150 kPa以上、6〇η α 600 kPa以下，平均蛋白過濾速 度為1.0 kg/m /Hr以上之條件 τ卜以1小時以上、5小時以 下之過;慮時間流入該除病毒過漁哭由 挪脅·過属器中，獲得病毒除去率 LRV23之蛋白製劑中間製品之濾液。 亦即’本發明包括下述各項。 製品於特定之蛋白 ，並且，該過濾方 [1]一種過濾方法，其係使蛋白製劑中間 質濃度及壓力下流入除病毒過據器中者 法中， (1)使用包含具有各自至少為一個 u之蛋白製劑中間製品之入 口與出口的容器、以及用以险X在圭 除去病毒之除病毒膜，且容器 内空間由除病毒膜分隔成蛋白製劑 衣别干間製品之入口侧空間 與出口側空間，蛋白製劑中間製品之入口、出口中至少入 口為具備600 kPa以上之耐壓性的嵌合結構之喷嘴，除病 毒膜之有效膜面積為0.0001 1112以 毒過滤器， 0.03…的除病 至20 mg/ml以上、 於蛋白製劑中間製 (2)使藉由純化步驟而將蛋白質濃度提古 100 mg/ml以下的蛋白製劑中間製品， 139924.doc 201006517 品之入口壓力為15〇 kPa以上、6〇Λ α 工 〇〇 kPa以下，平均蛋白禍 滤速度為1 .〇 kg/m2/Hr以上之條株 <條件下，以1小時以上、5小 時以下之過濾時間流入該除病毒過濾器中， ⑽得病毒除去率L職3之蛋白製劑中間製品 [2]如[1]之過濾方法，其中 W使藉由純化步驟而將蛋白質濃度提高至2〇mg/mi以上、 100 mg/ml以下的蛋白製劑令間製品，於蛋白製劑中間製
品之入口壓力為15〇 kPa以上、6〇〇 kpa以下，平均蛋白過 濾速度為1.0 kg/m2/Hr以上之條件下，以3小時以上、5小 時以下之過濾時間流入[1]之除病毒過濾器中， (5)獲得病毒除去率LRVg 3之蛋白製劑中間製品之濾液。 [3]如[1]或[2]之過濾方法，其中病毒為選自小病毒 轉錄病毒科、黃病毒科、襄奥病毒科、副黏液病毒科、癌 疹病毒科、小核糖核酸病毒科、乳多泡病毒科中任一科之 病毒。 [4] 如[1]至[3]中任一項之過濾方法，其中蛋白製劑中間製 品中之蛋白質為免疫球蛋白。 [5] 如[4]之過濾方法，其中免疫球蛋白為免疫球蛋白〇。 [6] 如[1]至[5]中任—項之過濾、方法’其中除病毒膜係由親 水化之合成高分子形成。 [7] 如[1]至[6]中任一項之過濾方法，其中除病毒膜為中空 紗型除病毒膜。 [8]一種過濾方法，其採用如[1]至[7]中任一項之過濾方法 之蛋白質濃度及入口壓力條件’作為規模放大時之運轉條 139924.doc 201006517 件。 m如m之過攄方法，其進而採用如⑴至⑺中任 濾方法之過濾時間，作為規模放大時之運轉條件。 [10]-種除病毒過濾器，其係如⑴至⑺中任—項之 :所使用♦’其包含具有各自至少為一個之蛋白製劑二 製品之^與出π的容器、以及用以除去病毒之除病毒 膜，且容器内空間由除病毒膜分隔成蛋白製劑令間製品之 入口侧S間與出Π側空間，$白製劑中間製品之入口 〇、°出 口中至少入口為具備600 kpa以上之耐壓性的嵌合結構之
喷嘴，除病毒膜之有效膜面積為0 0001 m2以上、0 03 V 以下。 Π1]如[1G]之除病毒過瀘、器，其中除病毒媒為中空紗型除 病毒膜。 [12]如[1G]或[11]之除病毒過，其中除病毒膜為多層微 多孔膜，該多層微多孔膜係包含開孔率較大之粗大結構 層、與開孔率較小之細密結構層’且含有熱塑性樹脂的微 多孔膜，並且，該粗大結構層存在於至少一方之膜表面， 其厚度為5.0 μιη以上，該細密結構層之厚度為膜厚整體之 50%以上，且該粗大結構層肖該細密結構層形成為一體。 [發明之效果] 藉由使用本發明之過濾方法，可決定於高壓力下使高蛋 白質濃度之蛋白製齊!中間製品流入除病毒過濾器中之條件 下的蛋白製劑製造步驟中之病毒除去步驟之運轉條件。亦 即，可預先於小規模下決定病毒除去步驟之過濾方法、蛋 139924.doc 201006517 白製劑中間製品之蛋白質濃度、除病毒過濾器之入口壓 力、及/或過濾時間之運轉條件，然後將該運轉條件應用 於規模放大之蛋白製劑之製造步驟中。規模放大中與蛋 白製劑中間製品之體積增加比例成正比地增大除病毒過濾 器之膜面積即可。 而且’作為附帶效果，亦可使用本發明之過濾方法來進 一步改善蛋白製劑製造步驟中之病毒除去步驟，並且，可 用來設計出能夠於更短時間内，製造更大量之蛋白製劑的 病毒除去步驟。 【實施方式】 決定蛋白製劑製造步驟中之病毒除去步驟之運轉條件 時，蛋白製劑中間製品之平均蛋白過濾速度、及病毒除去 率係重要之項目。過濾速度通常與蛋白質濃度具有負的關 係’蛋白質濃度提高則過濾速度降低，從而要花費較長之 過濾時間，故而不佳。若為了降低蛋白質濃度而附加稀釋 步驟，則於設備方面亦較為耗費成本，故不佳。要保持蛋 白質/農度為尚濃度’且不降低過遽速度地進行過渡，前提 是除病毒過濾器自身之耐壓為6〇〇 kPa以上，可使用如下 除病毒過濾器來進行過濾，該除病毒過濾器包含具有各自 至少為一個之入口與出口的容器、以及用以除去病毒之除 病毒膜’容器内空間由除病毒膜分隔成蛋白製劑中間製品 之入口側空間與出口側空間，入口之結構為具有具備6〇〇 kPa以上之耐壓性的嵌合結構之喷嘴。 其中所言之具有具備600 kPa以上之耐壓性的嵌合結構 139924.doc 201006517 之喷嘴，例如有旋鎖式（Luer lock)噴嘴、單觸式（one-touch)連 接喷嘴 （例如 SMC 公司製 造之英 制尺寸 〇ne_t〇uch mini、英制尺寸單觸式管接頭、one_touch mini(以上均為 註冊商標）等）、耦合器式喷嘴、套管連接式喷嘴等，本發 明中可使用該等噴嘴。當然，除該等喷嘴以外，只要是可 不漏液地送入濾液的具有具備6〇〇 kPa以上之耐壓性的嵌 合結構之喷嘴，即可適用於本發明。 '、一π 一 叫 1 以上、 0.03 W以下。若大於〇 〇3 m2，則會產生由於過濾所需之 蛋白製劑中間製品之量變成大量，故而較為耗費評價成本 題3方面，若有效膜面積未滿及小於〇 〇〇〇1爪2， ^會產生由於過濾、量減少’用以評價病毒除去性能之蛋白 =丨中間製品之體積過少’因而難以對病毒定量。 因此，適當的是0.0001 m2以上、0.03 0.0003 m2以上、0 μ 2 「牧好的疋 〇〇] 2 .“以下，更好的是〇._5m2以上、 〇·〇 1 m以下，备拉αβ。 、 最好的疋〇.〇〇〇7m2以上、〇.〇〇2m2以下。 再者，所謂除病毒臈之有效 面積令，可讓'、扣除病毒膜之表 τ ]漢蛋白製劑中間製品通過 病毒膜為中空纖維之情形時，若自令: 。於除 進行過攄，則係指中空纖維_之表内側向外侧 劑中間製品通過之部分之面積维可^蛋白製 側進行過遽，則係指中空敏自中工纖維之外側向内 製刺中間製品通過之部分之面"之表面積中，可讓蛋白 板膜之情形時，係指流八蛋白製劑中另:;製=毒膜為平 J教。0之側之面的表 139924.doc 201006517 面積中’可讓蛋白製劑中間製品通過之部分之面積。 於調整除病毒膜之有效膜面積方面，中空紗型過渡器具 有以下特徵：可藉由辦減中
纖維之根數而容易地實現規 、規模縮小’且進行規模放大、規模縮小時亦不存 在大的干擾因素，因此容易獲得規模可伸縮性 ㈨alabmty)。亦即，可認為於中空紗型過漉器之情形時， 膜面積變化時僅會引起過漶體積變化，過遽性能維持不 變。=面積變化之影響，即係濾、液增減之影響。如上所 =右過少，則於病毒之定量方面產生不良影響，若過 多’則對操作之便祕或成本造成影響。本㈣者認為， 於平板膜之情形時，要實現顯著之規模放大需要改變膜之 形狀（自圓盤型變成筒型等），但亦僅存在相同之影響。可 不於實際生產規模下，而於小規模下實施蛋白製劑製造步 驟中的病毒除去步驟之步驟設計，係緣於上述規模可伸縮 性之可靠性。 除病毒過濾器可利用具有上述結構者。膜之形狀可利用 平板膜結構或中空纖維結構者，較好的是中空纖維結構 者。作為膜之材質，可利用具備6〇〇 kPa以上之耐壓性 者。例如，較好的是以聚偏二氟乙烯（PVdf)或聚醚颯 (PES)、聚砜（PS，Polysulf〇ne)等合成高分子作為原材料且 具有親水性的膜。要點在於具備6〇〇 kpa以上之耐壓性。 使以合成高分子作為原材料之膜具有親水性的方法已知 有：使具有1個乙烯基之親水性乙烯單體，以3%以上、 50%以下之接枝率接枝聚合於微多孔膜之微孔表面的方法 139924.doc 201006517 (國際公開第2004/03 51 80號說明書）；使由多官能度丙稀酸 醋或甲基丙稀酸醋所形成之高分子經由交聯劑而鍵結的方 法（曰本專利特開2000_1548號公報）；另外，使包含聚合起 始劑及親水性單體的溶液含浸於膜中，且於微孔中聚合的 方法（國際公開第91/16968號說明書）等多種方法。使膜具 有親水性的目的在於提高以疏水性合成高分子作為原材料 之膜對蛋白製劑中間製品之過濾性。因此，使膜具有親水 性的方法並不限定於此處所例示者。 再者，此處所謂之接枝率係以下式來定義。 帽 接技率（％)=100x{(接枝後之膜質量_接枝前之膜質量）/接枝 前之膜質量} 膜之結構較好的是如下所述之梯度結構：沿著蛋白製劑 中間製品之流動方向，上游側存在孔徑較大、孔隙率較高 之粗大結構層，下游側存在孔徑較小而適合於除去病毒之 細密結構層，且粗大結構層與細密結構層之連接部的孔徑 連續變化。 另外’膜之結構更好的是多層微多孔膜，其係包含開孔_ 率較大之粗大結構層、與開孔率較小之細密結構層且含有 熱塑性樹脂的微多孔膜’並且，該粗大結構層存在於至彡 -方之臈表面，其厚度為50㈣以上，該細密結構層之厚 ί為膜厚整體之5G%以上，且該粗大結構層與該細密結構 層形成為一體。 ^ 述粗大結構層較好的是具有部分開孔率自膜表 面朝向細密結構層連續地減小之傾斜結構，且僅存在於一 139924.doc -12. 201006517 。方之膜表面。該膜例如可利用日本專利特開平Μ㈣2 號公報、日本專利特開平9_169867號公報、國際公開第 2004/035 180號說明書中所揭示的方法進行製造。 作為用於評價之病毒’可自有可能混人蛋白製劑中之相 關病毒或特異性模式病毒、非特異性模式病毒中任意選 擇。此處所謂之相關病毒 '特異性模式病毒、非特異性模 式病毒之定義與曰美歐藥品規定協調國際會議
(International c〇nference 〇f Η3Γ_ίζ‘η，㈣）準則中 所記述之含義相同。亦即’相關病毒之定義為：與已知會 混合存在於蛋白製劑之製造步驟中所使用之細胞基材、其 他試劑類或各種物質φ Λ合裡物買中’或者有存在之可能性的病毒類同 一或同種之病毒。所謂特異性模式病毒，係指與已知存 在、或者疑似存在之病毒密切相關之病毒。亦即特昱性 模式病毒之定義為，與已檢測出之病毒或疑似存在之病毒 具有類似的物理、化學性質，且為同-屬或同—科者； 特J生模式病毒係定義為用於病毒清除步驟特性分析試驗 之病毒’進行該試驗之目的在於分析製造步驟關於除去或 使病毒鈍化一般具有多大程度之能力，亦即其目的在於分 析步驟在確實地發揮病毒清除能力方面之特性 (robustness) 〇 例如’於製劑係由單株抗體等來自小鼠之基材所製造之 情形時’作為相_毒或特異性模式病毒，可❹··小鼠 白血病病毒等之反轉錄病毒、小鼠最小病毒等之小病毒、 牛下病症病毒等之黃病毒。作為非特異性模式病毒，亦可 139924.doc •13- 201006517 使用豬小病毒等之小病毒作為最小尺寸之病毒模型。 另外，於製劑為血漿分餾製劑等由來自人類企漿之基材 製造之情形時，作為相關病毒，可使用人類小病毒B 19(小 病毒科）或HIV病毒（human immun〇deficiency virus，人類
免疫缺乏病毒）（反轉錄病毒科）等，作為Bl9之特異性模式 病毒，可使用豬小病毒（小病毒科）、作為c型肝炎病毒之 特異性模式病毒的牛下痢症病毒（黃病毒科）等。同樣地， 亦可自祕單純型病毒、假性狂犬病病毒等祕病毒科， 副流打性感冒病毒等副黏液病毒科，裏奥病毒第三型等裏 奥病毒科’脊趙灰白質炎病毒等小核糖核酸病毒科，SV40 病毒等乳多泡病毒科等中選擇使用。選擇所使用之病毒 時，應根據ICH等之公知要求事項而決定。 於蛋白製劑巾間製品中添加某—固定量之該等用於評價 之病毒’測疋利用除病毒過據器進行過濾前後之病毒量， 吞平價病毒除去性能。此碎张、务 此時所添加之病毒量可由所需之病毒 除去率倒算而求出。但是’由於有時會因混合存在於病毒
二液中之夾雜物(雜質)而引起過濾器堵塞，可能會對過濾 δ式驗產生不良影響，田士 因此添加病毒量理想的是根據該病毒 溶液之純度而進杆领敕η+ 士 整於病毒溶液經純化之情形時，相 對於蛋白製劑中間製品辦 表〇之體積’可添加10%體積以下、較 好的是5%體積以下、- 更好的疋1%體積以下之病毒溶液， 於病毒溶液未經純化而令右 a . 3有較多夾雜物之情形時，理想的 是添加1 %體積以下、較 β 較好的疋0.5%體積以下、更好的是 0.1%體積以下之少量病基。“ 灯町疋 其中’理想的是添加可檢測出 139924.doc -14· 201006517 LRV 2 3所需之最低限之量以上之體積的病毒溶液。 再者，其中所謂之病毒除去率LRV，係指以對數值所表 示的使用除病毒過濾器進行過濾後之溶液的病毒量相對於 過濾之前之溶液的病毒量的下降率。例如，可利用下式進 行計算。
LRV=logi〇A-logi〇B 其中，A=使用除病毒過濾器進行過濾之前之溶液的病 毒濃度 B=使用除病毒過濾器進行過濾之後之溶液的病 毒濃度 另外，根據病毒之製備方法之不同，有時病毒中會含有 大量之夾雜物，對過濾速度造成大的損害。於此情形時， 可對病毒進行純化而將夾雜物分離後使用。至於病毒之純 化方法，業已公知有使用超離心分離之方法等。 設定除病毒過濾器之病毒除去率LRV滿足3以上之條 件。尺寸大於除病毒過滤器之孔徑之病毒的除去率通常 LRV 2 3，另一方面，小於除病毒過濾器之孔徑之病毒的 除去率通常LRV<3(泉浩業等人，關於血漿分餾製劑之安 全性之研究II.關於單株抗體純化乾燥濃縮人類血液凝固第 VIII因子製劑（CROSS EIGHT Μ(註冊商標））以及肌内注射 用人類免疫球蛋白製劑（抗HBs人類免疫球蛋白「日赤」 (註冊商標）、人類免疫球蛋白「日赤（註冊商標）」）之製造 步驟中的除病毒膜之效果，Japanese Journal of Transfusion Medicine，（1999)，Vol.45. No.3, Pages 357-361.)。此時， 139924.doc -15- 201006517 除去率並不-定為LRV=〇,有時會獲得3以下之某一程度 之除去率，但是該除去率並非利用除病毒m來進行粒 徑筛分本來應當具有之除去率，而係由病毒分子之局部凝 聚或吸附所帶來者。因此，意圏將過遽器之孔徑以上之尺 寸的病毒除去時，可滿足LRV23以上之除去率。 作為用於本發明之過濾方法中之蛋白製劑中間製品可 應用抗體藥物中間製品'重組蛋白藥物中間製品、血漿製 劑中間製品、血漿分餾製劑中間製品等，特別好的是免疫 球蛋白製劑中間製^更好的是免疫球蛋白G製财間製 品，最好的是免疫球蛋白G之單株抗體製劑中間製品。 首先，並不添加病毒，而使用除病毒過濾器裝置對該等 蛋白製劑中間製品進行過濾，藉此評價蛋白製劑中間製品 之平均蛋白過濾速度。於蛋白質濃度為2〇 mg/ml以上、 100 mg/ml以下之高濃度，且蛋白製劑中間製品之入口壓 力為150 kPa以上、6〇〇 kpa以下之高壓條件下進行丨小時 以上、5小時以下過濾，藉此評價平均蛋白過濾速度 (kg/m2/Hrp確認到平均蛋白過濾速度為丨〇 kg/m2/Hr以上 的蛋白質濃度以及壓力之條件之後，於該蛋白質濃度及壓 力之範圍内，向蛋白製劑中間製品中添加特定量之病毒， 使用除病毒過濾器進行過濾，藉此評價病毒除去步驟之病 毒除去性能。 蛋白製劑之製造步驟中之1批次的製造量存在總重量擴 大化之傾向。對於蛋白製劑之1批次之總量（總重量），例如 抗體藥物製劑’隨著提高生產性之研究不斷推進，甚至出 139924.doc 201006517 現1批次顯示出50 kg以上之高生產能力的例子。就蛋白製 劑中間製品之穩定性、或製造步驟之效率方面而言，此種 咼生產能力之蛋白製劑理想的亦是在〗天内完成病毒除去 步驟之—步驟。因此，除病毒過濾器之平均蛋白過濾速度 必需為1.0 kg/mVHr以上。若為丨〇 kg/m2/Hr以上則對於 kg之蛋白製劑中間製兌，使用1個4 ^之過濾器可於 12·5小時以内完成過濾，使用2個該過濾器可於6.25小時以 内完成過濾。 確認到平均蛋白過濾速度為1.0 kg/m2/Hr以上的蛋白質 濃度以及壓力之條件之後，於該蛋白質濃度及壓力之範圍 内向蛋白製劑中間製品中添加特定量之病毒，使用除病 毒過濾器進行過濾，藉此評價病毒除去步驟之病毒除去性 月b。亦即，選擇滿足病毒除去率lrv^ 3的蛋白製劑中間 製°〇之蛋白質濃度條件以及入口壓力條件。於蛋白質濃度 為20 mg/ml以上、1〇〇 mg/ml以下之高濃度，且蛋白製劑 1製口α之入口壓力為uo kpa以上、kpa以下之高壓 下進行過濾的情形時，同樣地確認可獲得1.0 kg/m2/Hr以 上之平均蛋白過濾速度，且LRVg 3的病毒除去率，並預 想規模放大時之設備、操作條件等。再者，亦可省略於不 =加病毒溶液之情況下所㈣的平均蛋白過濾速度之測 疋，而於添加有病毒之系統中同時進行測定。 另外，於蛋白質濃度為高濃度下進行過濾，具有可防止 由於過濾裝置、容器、配管等之規模放大而引起成本上升 的優點。但是另一方面’若濃度過高’則會自穩定性方面 139924.doc 201006517 產生問題。因此’係於蛋白質濃度為2〇 mg/ml以上、1〇〇 mg/ml以下實施過濾，較好的是於25 mg/mi以上、100 mg/ml以下’更好的是於3〇 mg/mi以上、1〇〇 mg/ml以下， 最好的是於30 mg/ml以上、50 mg/ml以下實施過濾。 至於過遽時之入口壓力，高壓具有可於短時間内迅速過 濾之優點，但是若壓力過高，則壓力引起裝置損壞或洩漏 之風險增大，因此係於入口壓力為15〇 kPa以上、6〇〇 kpa 以下實施過濾。較好的是196 kPa以上、500 kPa以下，更 好的是245 kPa以上、400 kPa以下，更好的是294 kPa以 上、400 kPa以下，最好的是294〜300 kPa。較好的是，以 同時滿足蛋白質濃度及入口壓力在上述範圍内平均蛋白 過滅速度為1.0 kg/m2/Hr以上，且LRV為LRVS3之方式， 進行幾次評價。 另外，使蛋白製劑中間製品流入除病毒過濾器中之過濾 時間為1小時以上、5小時以下，對於規模放大時之蛋白製 劑製造步驟中之病毒除去步驟，於即便除病毒過據器之膜 面積增大亦要在短時間内結束該步驟之情形時，可設定為 短時間’於即便花㈣長之時間亦要縮小除病毒膜之有效 膜面積之情形時，可設定為長時間。另外，為了決定滿足 過濾開始後3小時後亦為LRV23之條件，合適的亦是以] 小時以上、5小時以下使蛋白製劑中間製品流入除病毒過 [實施例] 以下’藉由實施例’更詳細地說明本發明。 139924.doc 201006517 [實施例1] • 作為除病毒過濾器’係使用如下所述之除病毒過據器. 該過濾器以0.001 m2之有效膜面積而具有多層微多孔中* 纖維膜’該多層微多孔中空纖維膜係依據國際公開第 • 2004/035180號說明書實施例1所示之方法，亦即對由具備 600 kPa以上之耐壓性的聚偏二氟乙烯所形成之微多孔中 '空纖維膜，利用親水性乙烯單體（丙烯酸羥基丙醋）以接枝 率達到10%之方式進行接枝聚合而獲得的親水化微多孔中 籲 空纖維膜’並且，開孔率較大之粗大結構層存在於中空纖 維膜内表面，其厚度為7_0 μηι ’與其形成為一體的開孔率 較小之細密結構層之厚度為膜厚整體之80%，而且過濾器 入口具有具備600 kPa以上之耐壓性的旋鎖式噴嘴，容器 内空間被中空纖維膜分隔成入口側空間與出口側空間。作 為蛋白製劑中間製品之模型，使用濃度為30 mg/ml之人類 免疫球蛋白G溶液（以0.1 Μ之鹽水作為溶劑），於該溶液 Φ 中，以0.5體積％添加豬小病毒（PPV)液，使用具有35 nm之 孔徑的中空纖維過濾器（Asahi Kasei Medical公司製造， PLANOVA(註冊商標）35N)進行前過濾。前過濾後免疫球蛋 白濃度為 30 mg/ml，PPV之濃度為 6.1(TCID50/ml)。
’ 使用上述過濾、裝置’於294 kPa之壓力下，對該含有PPV 之30 mg/ml之人類免疫球蛋白G溶液實施5小時死端（Deadend)式過濾 。此時 ，平 均蛋白 過濾速 度於過 濾開始 3 小時 後、4小時後、5小時後分別為1.9、1.9、1.8 kg/m2/Hr。於 任一時間點，均可以1.0(kg/m2/Hr)以上之高速過濾之濾液 139924.doc -19. 201006517 來评價病毒除去率。 為止之濾液、5小 LRVg 5.6。 過濾開始後1小時為止之濾液、3小時 時為止之濾液的病毒除去率均為 作為病毒除去步驟之運轉條件，可決定為如下條件：蛋 白製劑中間製品之蛋白質濃度為3G mg/m卜除病毒過遽器 入口壓力為294 kPa，過濾時間為5小時以内。 [實施例2〜4] 作為除病毒過濾器，係使用如下所述之除病毒過濾器： 該過滤器以0.001 m2之有效膜面積而具有多層微多孔中空 纖維膜，該多層微多孔中空纖維膜係依據國際公開第 2〇〇4/035180號說明書實施例〖所示之方法’亦即對由二備 600 kPa以上之耐壓性的聚偏二氟乙烯所形成之微多孔中 空纖維膜，利用親水性乙烯聚合物（丙烯酸羥基丙酯）以接 枝率達到10%之方式進行接枝聚合而獲得的親水化微多孔 中空纖維膜，並且，開孔率較大之粗大結構層存在於中空 纖維膜内表面，其厚度為7.0 μιη，與其形成為一體的開孔 率較小之細密結構層之厚度為膜厚整體之8〇%，而且過濾 器入口具有具備600 kPa以上之耐壓性的旋鎖式喷嘴，容 器内空間被中空纖維膜分隔成入口側空間與出口側空間。 作為蛋白製劑中間製品之模型，使用濃度為3〇 mg/ml之人 類免疫球蛋白G溶液（以0.1 Μ之鹽水作為溶劑），於該溶液 中’分別以0.5體積％添加下述3種病毒液，製成3種溶液。 使用具有35 nm之孔徑的中空纖維過濾器（Asahi Kasei Medical公司製造，PLANOVA(註冊商標）3讯），對各溶液 139924.doc •20- 201006517 進行前過濾。 .病毒溶液1)小鼠白血病病毒（A-MuLV)(實施例2 病毒 濃度為5.0) 病毒溶液2)襄奥病毒第三型（Reo-3)(實施例3病毒濃度 為 5.6) 病毒溶液3)小鼠最小病毒（MVM)(實施例4病毒濃度為 .5.7) 對該等3種30 mg/ml之人類免疫球蛋白G溶液（含有病毒 洛液）’使用上述除病毒過濾器，於除病毒過濾器入口壓 力為294 kPa之壓力下實施5小時死端（Dead_end)式過濾。 結果’（實施例2)添加A-MuLV之情形時，過濾開始後工 小時、2小時、3小時、4小時、5小時為止之過濾速度分別 為 2.2、2.0、1.9、1.7、1·6 kg/m2/Hr。於任一時間點，均 可以1 ·0(1^/ιη2/Ηι·)以上之高速過濾之濾液來評價病毒除去 率。過濾開始後1小時為止之濾液、3小時為止之滤液、5 馨 小時為止之濾液的病毒除去率均為LRVg 4.5。作為病毒除 去步驟之運轉條件，可決定為如下條件··蛋白製劑中間製 品之蛋白質濃度為30 mg/ml，除病毒過濾器入口壓力為 294 kPa，過濾時間為5小時以内。 (實施例3)添加Reo-3之情形時，過濾開始後i小時、2小 時、3小時、4小時、5小時為止之過濾速度分別為25、 2.3、2.1、2.0、1.8 kg/m2/Hr。於任一時間點，均可以 1 .OCkg/m /Hr)以上之尚速過渡之濾液來評價病毒除去率。 過濾開始後1小時為止之濾液、3小時為止之渡液、$小時 139924.doc -21- 201006517 為止之遽液的病毒除去率均4LRV^5」。作為病毒除去步 驟之運轉條件，可決疋為如下條件：蛋白製劑中間製品之 蛋白質濃度為30 mg/m卜除病毒過濾器入口壓力為294 kPa，過濾時間為5小時以内。 (實施例4)添加MVM之情形時，過滤開始後i小時、2小 時3小時、4小時、5小時為止之過濾速度分別為24、 2·3、2·1、2·0、2.0 kg/m2/Hr。於任一時間點，均可以 1.0(kg/m /Hr)以上之高速過濾之濾液來評價病毒除去率。 過濾開始後1小時為止之濾液、3小時為止之濾液、5小時 為止之濾液的病毒除去率均為LRV^52。作為病毒除去步 驟之運轉條件，可決定為如下條件：蛋白製劑中間製品之 蛋白質濃度為30 mg/ml，除病毒過濾器入口壓力為294 kPa ’過濾、時間為5小時以内。 [比較例1] 作為除病毒過濾器，係使用下述過濾裝置（Asahi Kasei Medical公司製造，pianova(註冊商標）2〇N)，亦即，該過 遽裝置使用以具備100 kPa之耐壓性的纖維素作為材質且 不含熱塑性樹脂的中空纖維膜，並且，於中空纖維膜之入 口及出口具有不具備600 kPa以上之对壓性的筍型之喷 嘴’谷器内空間被有效膜面積為0.001 m2之中空纖維膜分 隔成入口侧空間與出口側空間。作為蛋白製劑中間製品之 模型’使用濃度為30 mg/ml之人類免疫球蛋白g溶液（以0.1 Μ之鹽水作為溶劑）’於該溶液中，以〇 5體積％添加豬小病 毒（PPV)液’使用具有35 nm之孔徑的中空纖維過濾器 139924.doc -22· 201006517 (Planova(註冊商標）35N)進行前過濾。前過濾後免疫球蛋 白濃度為30 mg/ml，PPV之濃度為5.9。 使用上述除病毒過濾器，於纖維素膜所能承受之上限壓 力98 kPa之壓力下，對該3〇 mg/ml之人類免疫球蛋白G溶 液（含有PPV)實施5小時死端（Dead_end)式過濾。 結果，過濾開始後1小時為止之濾液、5小時為止之濾液 的病毒除去率均為LRV2 5·4 ^於過濾開始1小時後、5小時 後’過濾速度分別為〇·8、〇.7 kg/m2/Hr，未滿1.0 kg/m2/Hr。其結果，無法決定蛋白製劑製造步驟中之病毒 除去步驟之運轉條件。 [比較例2] 作為除病毒過濾器，係使用如下所述之過濾裝 濾裝置係使用以具備600 kPa以上之耐壓性的親水化聚偏 二氟乙烯作為材質，且依據曰本專利特公平7-71624號公 報之例I中所記載之方法而製造的表面具有細密之表皮 層，相對於膜之厚度該細密結構層之厚度為2〇%以下的平 板膜’且於平板膜之入口具有旋鎖式之喷嘴有效膜面積 為〇侧3 _過慮器，並且，該過隸置之容器内空間被 分隔成入口側空間與出口側空間。作為蛋白製劑中間製品 之模型，使用濃度為30 mg/ml之人類免疫球蛋白g溶液（= 0.1 Μ之鹽水作為溶劑）’於該溶液中，以〇5體積％添加豬 小病毒㈣）液，使用具有35 nm之孔徑的中空纖維過渡器 (註冊商標⑽)進行前前過濾後免疫球蛋 白/辰度為30 mg/ml，PPV之濃度為5 2。 139924.doc •23· 201006517 使用上述除病毒過濾器，於294 kPa之壓力下，對該3〇 mg/ml之人類免疫球蛋白G溶液（含有PPV)實施5小時死端 (Dead-end)式過濾。結果過濾開始後1小時為止之濾液由於 過濾速度較慢故而過濾體積過少，無法測定病毒濃度。過 濾開始後3小時為止之濾液之病毒除去率LRV ^ 4 〇。此 時’過慮開始3小時後過瀘、量為〇.〇9 kg/m2，每1小時之平 均過遽速度為 0.03 kg/m2/Hr，未滿 1.0 kg/m2/Hr。 其結果’無法決定蛋白製劑製造步驟中之病毒除去步驟 之運轉條件。 [比較例3 ] 作為除病毒過j慮’係使用如下所述之除病毒過遽器： 該過濾器以0.001 m2之有效膜面積而具有微多孔中空纖維 膜’該微多孔中空纖維膜係依據國際公開第2〇〇4/〇3518〇 號說明書實施例1所示之方法，亦即對由具備6〇〇 kPa以上 之耐壓性的聚偏二氟乙烯所形成之微多孔中空纖維膜，利 用親水性乙烯聚合物（丙烯酸羥基丙酯）以接技率達到1〇% 之方式進行接枝聚合而獲得的僅由粗大結構層所構成者， 並且過遽器入口具有具備6〇〇 kP a以上之财壓性的旋鎖式 喷嘴，容器内空間被中空纖維膜分隔成入口側空間與出口 側空間。作為蛋白製劑中間製品之模型，使用濃度為3〇 mg/ml之人類免疫球蛋白g溶液（以〇.1 μ之鹽水作為溶 劑），於該溶液中，以0.5體積❶/❶添加豬小病毒（ρρν)液。 PPV之濃度為6.0。使用上述除病毒過濾器，於294 kpa之 壓力下對該30 mg/ml之人類免疫球蛋白G溶液（含有ppv)實 139924.doc • 24· 201006517 ' 施5小時死端（Dead-end)式過濾。平均蛋白過濾速度於過濾 開始1小時後、3小時後、5小時後分別為2 3、2 2、2.0 kg/m2/Hr。過濾開始後1小時為止之濾液、3小時為止之滤 液、5小時為止之濾、液的病毒除去率均為LRV=〇.5，不滿足 LRV 23。其結果’無法決定蛋白製劑製造步驟中之病毒 除去步驟之運轉條件。 * [產業上之可利用性] 本發明之過濾方法可於非常小之規模下，收集對於抗體 ® 藥物、重組蛋白藥物、血漿製劑、血漿分餾製劑等蛋白製 劑之製造步驟中之病毒除去步驟在規模放大時的實際運轉 條件設定、設備設計等有用的資訊，因此對蛋白製劑製造 產業十分有用^
139924.doc -25·
Claims (1)
- 201006517 七、申請專利範圍： h ί=Γ’其係使蛋白製劑中間製品於特定之蛋白 3 a力下流人除病毒過濾器者4於該過滤方法 ⑴使用—除病毒過淚器，其包含：具有各自至少為— 個之蛋白製劑中間製品之入口與出口的容器用 除去病毒之除病毒膜，且容器内办 i 及用以成蛋白裝劑中間製品之人口財間與出口側㈣，蛋白 製劑中間製品之入口、出口中至少入口為具備600 kPa以 上之耐壓性的嵌合結構之喷嘴，除病毒膜之有效膜面積 為0.0001 m2以上〇.〇3 m2以下， (2) 使藉由純化步驟而將蛋白質漠度提高至2〇 mg/如以 liOOmg/mi以下的蛋白製劑中間製品，於蛋白製劑中間 製品之入口壓力為bO kPa以上6〇〇 kpa以下且平均蛋 白過濾速度為1.0 kg/m2/Hr以上之條件下，以丨小時以上5 小時以下之過濾時間流入該除病毒過攄器， (3) 獲得病毒除去率LRV$3之蛋白製劑中間製品之渡 液。 2.如請求項1之過滤方法，其中 (4)使藉由純化步驟而將蛋白質濃度提高至2〇 ^^/如以 上100 mg/ml以下的蛋白製劑中間製品，於蛋白製劑中間 製品之入口壓力為150 kPa以上600 kPa以下、且平均蛋 白過濾速度為1.0 kg/m2/Hr以上之條件下，以3小時以上5 小時以下之過濾時間流入如請求項i之除病毒過遽器， 139924.doc 201006517 (5)獲得病毒除去率lrv^ 3之蛋白製劑中間製品之渡 液。 3. 如請求項1之過濾方法，其中病毒為選自小病毒科、反 轉錄病毒科、黃病毒科、裏奥病毒科、副黏液病毒科、 疱疹病毒科、小核糖核酸病毒科、乳多泡病毒科中任一 種之病毒。 4. 如印求項1之過濾方法，其中蛋白製劑中間製品中之蛋 白質為免疫球蛋白。 青求項4之過壚方法，其中免疫球蛋白為免疫球蛋白 G。 月求項1至5中任一項之過濾方法，其中除病毒膜係含 親水化之合成高分子。 7’如明求項1至5中任-項之過濾方法’其中除病毒膜為中 空紗型除病毒膜。 8.種方法’其採用如請求項1至7中任-項之過遽方法之 蛋白質濃度以及人口壓力條件，作為規模放大時之 條件》 月长項8之方法，其進而採用如請求項1至7中任一項 之過濾方法之過濾時間，作為規模放大時之運轉條件。 種除病毒㈣器，其係如請求項1至7中任-項之過遽 法所使用者’且其包含：具有各自至少為一個之蛋白 製劑中間製品之入口 I^ 與出口的容器、以及用以除去病毒 、病毒膜谷器内空間係由除病毒膜分隔成蛋白製劑 中間製品之入口側★門 J二間與出口側空間，蛋白製劑中間製 139924.doc 鴿 201006517 之 出口中至少入口為具備600 kPa以上之耐壓性 的敌合結構之噴嘴，除病毒膜之有效膜面積為0.0001 m2 以上0.03 m2以下。 11. 如研求項10之除病毒過濾器，其中除病毒膜為中空紗型 除病毒膜。 12. 如請求項10或11之除病毒過濾器，其中除病毒膜為多層 微多孔膜，該多層微多孔膜係包含開孔率較大之粗大結 構層、與開孔率較小之細密結構層且含有熱塑性樹脂的 微多孔膜，且該粗大結構層存在於至少一者之膜表面， 其厚度為5.0 μιη以上，該細密結構層之厚度為膜厚整體 之50%以上，且該粗大結構層與該細密結構層形成為一 體0139924.doc 201006517 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明：五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）139924.doc
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